PL249873B1 - Koniugaty betuliny z estrami α-aminokwasów, sposób ich wytwarzania i zastosowanie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są koniugaty betuliny z estrami α-aminokwasów, o wzorze ogólnym 2, gdzie R=H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania koniugatów betuliny z estrami α-aminokwasów o wzorze ogólnym 2, gdzie R=H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH, który polega na tym, że 3,28-O,O'-bis(3'-karboksypropanoilo)betulinę o wzorze 1 w ilości 0.10 mmol kontaktuje się w środowisku gazu inertnego z estrem α-aminokwasu o wzorze ogólnym A, gdzie R=H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH, w stosunku molowym od 0.20 do 0.25 mmol A/0.10 mmol 1, w obecności N,N'dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) w ilości od 0.22 do 0.25 mmol DCC/0.10 mmol 1 i 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w ilości od 0.18 do 0.20 mmol HOBt/0.10 mmol 1, w rozpuszczalnikach organicznych, korzystnie w dichlorometanie (DCM) w ilości od 3.8 do 5 mL DCM/0.10 mmol 1, tak otrzymaną mieszaninę miesza się w temperaturze od 0°C do 5°C przez 30 minut, następnie w temperaturze pokojowej w czasie od 1 h do 2 h, po czym w temperaturze od 0°C do 5°C wkrapla się trietyloaminę (Et3N) w ilości od 0.22 do 0.3 mmol Et3N/0.1 mmol 1, dodaje się metanol (MeOH) w ilości od 0.3 do 0.8 mL MeOH/0.10 mmol 1, całość miesza się w temperaturze pokojowej w czasie od 3 dni do 10 dni, następnie odparowuje rozpuszczalnik organiczny pod ciśnieniem od 10 mmHg do 20 mmHg, ekstrahuje rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie octanem etylu, ponownie odparowuje rozpuszczalnik organiczny pod ciśnieniem od 10 mmHg do 20 mmHg, następnie oczyszcza metodą chromatografii kolumnowej. Przedmiotem zgłoszenia jest również zastosowanie koniugatów betuliny z estrami ww. α-aminokwasów i otrzymanych powyższym sposobem związków regulujących żywotność i/lub metabolizm komórkowy oraz do wytwarzania leków antynowotworowych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są koniugaty betuliny z estrami α-aminokwasów, sposób ich wytwarzania i zastosowanie.

Od kilkudziesięciu lat produkty naturalne są szeroko badane, a ich macierzyste szkielety są podstawą do projektowania i otrzymywania nowych potencjalnych środków terapeutycznych. Wśród szerokiej gamy substancji bioaktywnych pochodzenia naturalnego na uwagę zasługują pentacykliczne triterpeny typu lupanu, a zwłaszcza betulina (BN, 3-lup-20(29)-eno-33,28-diol) o wzorze sumarycznym C30H50O2, masie cząsteczkowej 442,72 g/mol i strukturze przedstawionej na Rysunku 1. BN pozyskiwana jest z zewnętrznej warstwy kory brzóz rodziny Betulaceae, m.in. Betula pendula Roth (brzoza brodawkowata), Betula pubescens Erth (brzoza omszona), Betula verrucosa Ehrh (brzoza wisząca), Betula rubescens Ehrh (brzoza puszysta), Betula alba (brzoza biała), skąd izoluje się ją na drodze ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi (m.in. dichlorometan, chloroform, aceton) (Krasutsky, P. A., Birch Bark Research and Development. Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 919). W zależności od gatunku czy wieku drzewa oraz miejsca jego występowania, zawartość betuliny w suchej masie kory stanowi ok. 35% (Hordyjewska, A. i wsp., Betulin and Betulinic Acid in Cancer Research. J. Pre-Clin. Clin. Res. 2018, 12 (2), 72-75; Krasutsky, P. A., Birch Bark Research and Development, Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 919).

^Rłl' Szkielet betuliny zbudowany z czterech pierścieni sześcioczłonowych (A-D) i jednego pięcioczłonowego (E), posiada w pozycjach C-3 i C-28 miejsca aktywne w postaci grup hydroksylowych (drugorzędowej C³-OH, pierwszorzędowej H2C²⁸-OH). Modyfikacje strukturalne tych grup pozwalają na otrzymywanie różnorodnych półsyntetycznych pochodnych BN, które często charakteryzują się korzystniejszymi niż BN właściwościami biologicznymi, m.in. działanie przeciwzapalne, przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe czy antybakteryjne (Amiri, S. i wsp. Betulin and Its Derivatives as Novel Compounds with Different Pharmacological Effects. Biotechnol. Adv. 2020. 38, 107409; Jonnalagadda S.C. i wsp., Recent Developments on the Synthesis and Applications of Betulin and Betulinic Acid Derivatives as Therapeutic Agents. Stud Nat Prod Chem. 2017, 53, 45-84).

Z polskiego opisu patentowego PL211589 znany jest sposób otrzymywania mono- i diestrów, w reakcji betuliny z N-Boc zabezpieczonymi α-aminokwasami, takimi jak glicyna, L-alanina, L-leucyna, L-lizyna, L-fenyloalanina lub L-metionina wobec czynnika sprzęgającego w postaci 1,1 ’-karbonylodiimidazolu (CDI), w temperaturze wrzenia tetrahydrofuranu (THF).

W amerykańskim opisie patentowym US9556221 ujawniono koniugaty betuliny i /V-acetylo-a-aminokwasów (/V-OAc-glicyna, /V-OAc-alanina, /V-OAc-walina, /V-OAc-leucyna, /V-OAc-prolina) oraz sposób ich otrzymywania wobec/V-etylodiizopropyloaminy (EtPr2N), chlorowodorku 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu i 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt).

Z innych polskich opisów patentowych PL216418 i PL216420 znane są pochodne betuliny w postaci mieszaniny estrów sprzężonych kwasów linolowych z betuliną w pozycji C-3 (reszta kwasu 9c, 111-oktadekadienowego lub 10t,12c-oktadekadienowego). Ponadto opis patentowy PL214914 ujawnia ester kwasu 1,2-diacylofosfatydowego z betuliną oraz sposób otrzymywania tego związku, polegający na tym, że kwas 1,2-di-O-acylo-sn-glicero-3-fosfatydowy poddaje się estryfikacji z betuliną wobec chlorku mezytylenosulfonowego, jako czynnika sprzęgającego i 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) w środowisku pirydyny. Istotą opisu patentowego PL217966 jest fosfolipidowa pochodna betuliny (28-O-(L-1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfatydylo)-betulina), której sposób otrzymywania polega na tym, że kwas L-1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfatydowy poddaje się estryfikacji z betuliną, wobec chlorku kwasu p-toluenosulfonowego jako czynnika sprzęgającego, w obecności DMAP.

Z literatury niepatentowej (Drag-Zalesinska. M. i wsp. Esters of Betulin and Betulinic Acid with Amino Acids Have lmproved Water Solubility and Are Selectively Cytotoxic toward Cancer Cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19 (16). 4814-4817; Drag-Zalesinska. M. i wsp Anticancer properties of ester derivatives of betulin in human metastatic melanoma cells. Cancer Celi Int 2017, 17, 4) znany jest spo sób modyfikacji betuliny poprzez utworzenie grupy estrowej w reakcji z N-Boc zabezpieczonymi «.-aminokwasami, takimi jak alanina (Boc-L-Ala-OH), lizyna (Boc-Lys(Boc)-OH) oraz trzy jej nienaturalne pochodne (Boc-L-Dap(Boc)-OH, Boc-L-Dab(Boc)-OH i Boc-LOrn(Boc)-OH).

Cytowane przez zgłaszającego stany techniki mają na celu wyłącznie pomoc dla czytającego, nie stanowią części dokumentu zgłoszeniowego, pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie.

Zagadnieniem technicznym wymagającym rozwiązania jest opracowanie nowych, innowacyjnych pochodnych betuliny o korzystnych właściwościach farmakokinetycznych oraz opracowanie efektywnego i ekonomicznego sposobu ich wytwarzania.

Niedogodnością powyższych rozwiązań znanych ze stanu techniki jest trudność w dostarczaniu BN i jej pochodnych do miejsc docelowych w organizmie. BN znana ze swojej rozbudowanej pentacyklicznej struktury stwarza problemy związane z rozpuszczalnością w środowisku wodnym. Ponadto wykazuje ograniczoną zdolność do akumulacji wewnątrz komórek oraz słabą biodostępność.

Autorzy rozwiązania według wynalazku zaprojektowali nowe, nieopisane dotąd w literaturze naukowej koniugaty betuliny z estrami «-aminokwasów o wzorze ogólnym 2, gdzie R = H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H2OH, a następnie opracowali prosty i efektywny sposób ich wytwarzania, poprzez dobudowanie do szkieletu betuliny w pozycji C-3 i C-28 linkera typu (CO)CH2CH2COOH, a następnie sprzęganie reaktywnej grupy karboksylowej linkera z wolną grupą aminową, należącą do estru «-aminokwasu.

Koniugaty betuliny z estrami «-aminokwasów według wynalazku charakteryzują się tym, że karboksyacylowa pochodna betuliną o wzorze ogólnym 1, połączona jest ugrupowaniem amidowym z estrem metylowym «-aminokwasu o wzorze ogólnym A, wybranym z grupy obejmującej takie aminokwasy jak glicyna, L-alanina, L-walina, L-seryna, L-tyrozyna.

Koniugaty betuliny z estrami «-aminokwasów, o wzorze ogólnym 2, gdzie R = H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH.

Sposób wytwarzania koniugatów betuliny z estrami «-aminokwasów o wzorze ogólnym 2, gdzie R = H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH, polega na tym, że 3,28-O,O’-bis(3’-karboksypropanoilo)betulinę o wzorze 1 w ilości 0,10 mmola kontaktuje się w środowisku gazu inertnego z estrem «-aminokwasu o wzorze ogólnym A, gdzie R = H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH, w stosunku molowym od 0,20 do 0,25 mmol A/0,10 mmol 1, w obecności N,N’-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) w ilości od 0,22 do 0,25 mmol DCC/0,10 mmol 1 i 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w ilości od 0,18 do 0,20 mmol HOBt/0,10 mmol 1, w rozpuszczalnikach organicznych, korzystnie w dichlorometanie (DCM) w ilości od 3,8 do 5 mL DCM/0,10 mmol 1, tak otrzymaną mieszaninę miesza się w temperaturze od 0°C do 5°C przez 30 minut, następnie w temperaturze pokojowej w czasie od 1 do 2 godzin, po czym w temperaturze od 0°C do 5°C wkrapla się trietyloaminę (Et3N) w ilości od 0,22 do 0,3 mmol Et3N/0,1 mmol 1, dodaje się metanol (MeOH) w ilości od 0,3 do 0,8 mL MeOH/0,10 mmol 1, całość miesza się w temperaturze pokojowej w czasie od 3 do 10 dni, następnie odparowuje rozpuszczalnik organiczny pod ciśnieniem od 10 mm Hg do 20 mm Hg, ekstrahuje rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie octanem etylu, ponownie odparowuje rozpuszczalnik organiczny pod obniżonym ciśnieniem od 10 mm Hg do 20 mm Hg, następnie oczyszcza metodą chromatografii kolumnowej.

Korzystnie w sposobie wytwarzania koniugatów betuliny według wynalazku jako estry «-aminokwasów stosuje się ester metylowy glicyny, ester metylowy alaniny, ester metylowy waliny, ester metylowy leucyny, ester metylowy seryny, ester metylowy treoniny, ester metylowy metioniny, ester metylowy tyrozyny.

Korzystnie w sposobie wytwarzania koniugatów betuliny według wynalazku jako rozpuszczalniki organiczne stosuje się dichlorometan, metanol, octan etylu.

Korzystnie w sposobie wytwarzania koniugatów według wynalazku jako gaz inertny stosuje się argon, azot.

Zastosowanie koniugatów betuliny z estrami «-aminokwasów określonych w zastrz. 1 i otrzymanych sposobem określonym według zastrz. 2 do wytwarzania związków regulujących żywotność i/lub metabolizm komórkowy oraz do wytwarzania leków antynowotworowych.

Opis ujawnienia rozwiązania ma jedynie charakter przykładowy i w związku z tym warianty, które nie odchodzą od istoty ujawnienia są w zamierzeniu objęte zakresem ujawnienia.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest zastosowanie betuliny - łatwo dostępnej, powszechnie występującej w przyrodzie, naturalnej substancji biologicznie aktywnej o wysokim profilu bezpieczeństwa. W grupie znanych, opisanych w literaturze koniugatów pentacyklicznych triterpenoidów typu lupanu z aminokwasami, dominują pochodne kwasu betulinowego (BA). Zarówno BN, jak i BA są powszechne w królestwie roślin, jednak to betulina jest zdecydowanie łatwiej dostępna (zawartość BN w postaci białego proszku, stanowi od 167 do 340 g na 1 kg suchej masy kory, natomiast dla porównania zawartość BA nie przekracza 20 g/kg (Achrem-Achremowicz, J. Cytotoksyczność Półsyntetycznych Pochodnych Betuliny, UJ, Kraków, 2007)). Wykorzystanie szkieletu betuliny do modyfikacji strukturalnych, może być więc bardziej opłacalne z punktu widzenia analizy ekonomicznej metod pozyskiwania potencjalnych środków terapeutycznych.

Ponadto, dobudowanie do szkieletu BN w pozycji C-3 i C-28 linkera typu (CO)CH2CH2COOH zakończonego reaktywną grupą karboksylową pozwala na wykonanie dalszych modyfikacji chemicznych, np. sprzęganie z aminokwasami i utworzenie ugrupowania amidowego. Liczne doniesienia literaturowe sugerują, że wprowadzenie do szkieletu betuliny w pozycji C-3 i/lub C-28 ugrupowania 3-karboksypropanoilowego lub 3-karboksy-3’,3’-dimetylopropanoilowego korzystnie wpływa na właściwości biologiczne tego triterpenu (Kashiwada, Y. i wsp. 3,28-Di-O-(Dimethylsuccinyl)-Betulin Isomers as AntiHIV Agents. Bioorg Med Chem Lett 2001, 11, 183-185; Chrobak, E. i wsp., New Phosphorus Analogs of Bevirimat: Synthesis, Evaluation of Anti-HIV-1 Activity and Molecular Docking Study, Int. J. Mol. Sci. 2019, 20 (5209), 1-20).

Zaproponowana przez autorów rozwiązania metoda otrzymywania koniugatów BN z aminokwasami pozwala na otrzymywanie ich z wysokimi wydajnościami. Substrat, 3,28-O, O’-bis(3’-karboksypropanoilo)betuIina o wzorze 1 jest łatwa do otrzymania w reakcji betuliny z bezwodnikiem bursztynowym, jak zostało to opisane w pracach (Komissarova, N. G. i wsp. New Conjugates of Betulin with 2-Aminoethanesulfonic Acid. Chem Nat. Compd 2019, 55, 300-304; Strobykina, I. Yu. i wsp. Synthesis and Antimicrobial Activity of Dihydrobetulin N-Acetylglucosaminides. Chem. Nat. Compd. 2017, 53 (6), 1101-1106; Grymel, M, i wsp., Design, Synthesis and Preliminary Evaluation of the Cytotoxicity and Antibacterial Activity of Novel Triphenylphosphonium Derivatives of Betulin, Molecules, 2022, 27, 5156-5176).

Przedmiot wynalazku w przykładowym, lecz nieograniczającym wykonaniu przedstawiono na poniższych przykładach wykonania, produkty wykonanych przykładowych syntez przedstawiono wzorami (2a-3c).

Przykład 1 Koniugat 3,28-O,O’-bis-SAGly(OMe)BN (związek o wzorze 2a)

Do kolby okrąglodennej wprowadzono 3,28-O,O’-bis(3’-karboksypropanoilo)betulinę (0,10 mmol, 64,2 mg), ester metylowy glicyny (GlyOMe-HCL, 0,25 mmol, 31,3 mg), 1-hydroksybenzotriazol (HOBt, 0,20 mmol, 30.6 mg), N,N-dicykloheksylokarbodiimid (DCC, 0,25 mmol, 51,6 mg) i dichlorometan (4 mL). Zawiesinę mieszano w środowisku argonu w temperaturze od 0°C do 5°C przez 30 minut oraz w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, po czym do mieszaniny, ochłodzonej do temperatury 0°C, wkroplono trietyloaminę (EtsN, 0,3 mmol, 0,042 mL), dokładnie wymieszano, po czym dodano metanol (0,5 mL). Reakcję prowadzono w środowisku argonu, w temperaturze pokojowej przez 10 dni, następnie rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem (10 mm Hg), a pozostałość ekstrahowano octanem etylu. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej (octan etylu/metanol, 50:1, v/v), otrzymując koniugat 3,28-O,O’-bis(SAGIy(OMe))BN 2a z wydajnością 46%.

Przykład 2 Koniugat 3,28-O,O ’- bis (SAAla(OMe)BN (związek o wzorze 2b)

Postępując jak w przykładzie 1, z 3,28-O,O’-bis(3’-karboksypropanoilo)betuliny (0,10 mmol, 64.2 mg) i estru metylowego alaniny (AlaOMe-HCL, 0,25 mmol, 34,9 mg) w obecności 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt, 0,20 mmol, 30,6 mg), N,N’-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC, 0,25 mmol, 51,6 mg) trietyloaminy (Et3N, 0,25 mmol, 0,035 mL) w dichlorometanie (5 mL) i metanolu (0,3 mL), po 7 dniach prowadzenia reakcji w temperaturze pokojowej, oczyszczeniu surowego produktu metodą chromatografii kolumnowej (octan etylu), otrzymano 3,28-O,O’-bis(SAVal(OMe))BN 2b z wydajnością 68%.

Przykład 3 Koniugat 3,28-O,O’-bis(SAVal(OMe)BN (związek o wzorze 2c)

Postępując jak w przykładzie 1, z 3,28-O,O-bis(3’-karboksypropanoilo)betuliny (0,10 mmol, 64,2 mg) i estru metylowego waliny (ValOMe-HCL, 0,25 mmol, 41,9 mg), w obecności 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt, 0,20 mmol, 30,6 mg), N,N’- dicykloheksylokarbodiimidu (DCC, 0,25 mmol, 51,6 mg) i trietyloaminy (EtsN, 0,25 mmol, 0,035 mL) w dichlorometanie (3,8 mL) i metanolu (0,5 mL), po 4 dniach

PL 249873 Β1 prowadzenia reakcji w temperaturze pokojowej, odparowaniu rozpuszczalnika pod obniżonym ciśnieniem (20 mm Hg), oczyszczeniu surowego produktu metodą chromatografii kolumnowej (octan etylu/metanol, 50:1. v/v), otrzymano 3,28-0,0 -b/s(SAVal(OMe))BN 2c z wydajnością 82%.

Przykład 4 Koniugat 3,28-O,O’-£»/s(SASer(OMe)BN (związek o wzorze 2d)

Postępując jak w przykładzie 1, z 3,28-0,0’b/s(3’-karboksypropanoilo)betuliny (0,10 mmol, 64,2 mg) i estru metylowego seryny (SerOMe-HCL, 0,20 mmol, 31,1 mg), w obecności 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt, 0,18 mmol, 27,6 mg), Λ/,Λ/’-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC, 0,22 mmol, 45,4 mg) i trietyloaminy (Et₃N, 0,22 mmol, 0,031 mL) w dichlorometanie (4 mL) i metanolu (0,3 mL), po 4 dniach prowadzenia reakcji w temperaturze pokojowej, w środowisku azotu, oczyszczeniu surowego produktu metodą chromatografii kolumnowej (dichlorometan/metanol, 1:10, v/v), otrzymano 3,28-0,0’-b/s(SASer(OMe))BN 2d z wydajnością 39%.

Przykład 5 Koniugat 3,28-0,0’-bis(SATyr(OMe)BN (związek o wzorze 2e)

Postępując jak w przykładzie 1, z 3,28-0,0’b/s(3’-karboksypropanoilo)betuliny (0,10 mmol, 64,2 mg) i estru metylowego tyrozyny (TyrOMe-HCL, 0,25 mmol, 57,9 mg), wobec 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt, 0,20 mmol, 30,6 mg), Λ/,Λ/’-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC, 0,25 mmol, 51,6 mg) i trietyloaminy (Et₃N, 0,25 mmol, 0,035 mL) w dichlorometanie (3,8 mL) i metanolu (0,8 mL), po 3 dniach prowadzenia reakcji w temperaturze pokojowej, oczyszczeniu surowego produktu metodą chromatografii kolumnowej (octan etylu), otrzymano 3,28-0,0-b/s(SATyr(OMe))BN 2e z wydajnością 60%.

Wyniki badań biologicznych

Aktywność biologiczna pochodnych betuliny o wzorze ogólnym 2 oceniono przy użyciu trzech linii komórkowych: linii komórkowej raka jelita grubego HCT-116 (ATCC CCL-247), linii komórkowej raka piersi MCF-7 (ATCC HTB-22) oraz prawidłowych fibroblastów NHDF (Lonza CC-2509) z zastosowaniem testu CCK-8. Siłę działania cytotoksycznego wyrażono jako stężenie hamujące (ICso). Wyniki oznaczeń przedstawiono w Tabeli 1.

Procedura·. W celu określenia aktywności biologicznej badanych związków na płytkę 96-dołkową wysiewano po 7500-10000 komórek/dołek, tak by w momencie dodania badanych związków pokrycie dołków komórkami wynosiło ok. 80%. Komórki inkubowano w warunkach standardowych (37°C, 5% CO₂, atmosfera nasycona parą wodną), w medium DMEM/F12 z dodatkiem 10% FBS i antybiotyków (penicylina/streptomycyna). Po 24 godzinach medium hodowlane usuwano, a do dołków hodowlanych dodawano 100 μί świeżego medium z dodatkiem 0,05% Tween 80, zawierającego badane związki w stężeniach od 12,5 μΜ do 150 μΜ. Kontrolę stanowiły komórki rosnące w medium z dodatkiem 0,05% Tween 80 niezawierającym badanych związków. Po 24 godzinnej inkubacji komórek z badanymi związkami do każdego dołka dodawano 10 μί odczynnika CCK-8 (Bimake). Absorbancję próbek przy długości fali 450 nm odczytywano po 1-godzinnej inkubacji komórek z odczynnikiem CCK-8. Oznaczenia wykonywano w trzech powtórzeniach biologicznych, każde powtórzenie biologiczne zawierało 3 powtórzenia techniczne.

Tabela 1

Porównanie wartości IC50 pochodnych betuliny 3 uzyskanych dla trzech linii komórek (HCT-116, MCF-7, NHDF).^ab

Nr	Aminokwas	Aktywność cytotoksyczna in ritro IC», μΜ
HCT-116	MCF-7	A7/DF
betulina	-	>150	>150	>150
2»	Gly	>150	>150	>150
2b	Ala	>150	>150	>150
2c	Val	>150	>150	>150
2d	Ser	83.0±2.9	>150	84.7±2.4
2c	lyr	>150	>150	>150

’Cytotoksyczność oceniano za pomoci) testu CCK-8; ^hCzas inkubacji: 24 h.

Przeprowadzone badania wykazały, że obserwowany efekt biologiczny badanych koniugatów betuliny z estrami α-aminokwasów o wzorze ogólnym 3 jest komórkowo-specyficzny, co czyni te związki interesującymi ze względu na ich potencjalne zastosowanie.

Koniugaty zmniejszające żywotność komórek mogą, po potwierdzeniu ich właściwości w dalszych badaniach, znaleźć zastosowanie jako leki antynowotworowe. Pozostałe pochodne BN, po poznaniu mechanizmu ich działania w komórkach, mogą zostać wykorzystane w badaniach aktywności metabolicznej komórek.

Claims (6)

1. Koniugaty betuliny z estrami α-aminokwasów, o wzorze ogólnym 2, gdzie R = H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH.

2. Sposób wytwarzania koniugatów betuliny z estrami α-aminokwasów o wzorze ogólnym 2, gdzie R = H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH, znamienny tym, że 3,28-O,O’-bis(3’-karboksypropanoilo)betulinę o wzorze 1 w ilości 0,10 mmola kontaktuje się w środowisku gazu inertnego z estrem α-aminokwasu o wzorze ogólnym A, gdzie R = H, CH3, CH(CH3)2, CH2OH, CH2C6H4OH, w stosunku molowym od 0,20 do 0,25 mmol A/0,10 mmol 1, w obecności N,N’-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) w ilości od 0,22 do 0,25 mmol DCC/0,10 mmol 1 i 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w ilości od 0,18 do 0,20 mmol HOBt/0,10 mmol 1, w rozpuszczalnikach organicznych, korzystnie w dichlorometanie (DCM) w ilości od 3,8 do 5 mL DCM/0,10 mmol 1, tak otrzymaną mieszaninę miesza się w temperaturze od 0°C do 5°C przez 30 minut, następnie w temperaturze pokojowej w czasie od 1 h do 2 h, po czym w temperaturze od 0°C do 5°C wkrapla się trietyloaminę (Et3N) w ilości od 0,22 do 0,3 mmol Et3N/0,1 mmol 1, dodaje się metanol (MeOH) w ilości od 0,3 do 0,8 mL MeOH/0,10 mmol 1, całość miesza się w temperaturze pokojowej w czasie od 3 do 10 dni, następnie odparowuje rozpuszczalnik organiczny pod ciśnieniem od 10 mm Hg do 20 mm Hg, ekstrahuje rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie octanem etylu, ponownie odparowuje rozpuszczalnik organiczny pod obniżonym ciśnieniem od 10 mm Hg do 20 mm Hg, następnie oczyszcza metodą chromatografii kolumnowej.

3. Sposób wytwarzania koniugatów betuliny z estrami α-aminokwasów według zastrz. 2 znamienny tym, że jako estry α-aminokwasów stosuje się ester metylowy glicyny, ester metylowy alaniny, ester metylowy waliny, ester metylowy seryny, ester metylowy tyrozyny.

4. Sposób wytwarzania koniugatów według zastrz. 2 znamienny tym, że jako rozpuszczalniki organiczne stosuje się dichlorometan, metanol, octan etylu.

5. Sposób wytwarzania koniugatów według zastrz. 2 znamienny tym, że jako gaz inertny stosuje się argon, azot.

6. Zastosowanie koniugatów betuliny z estrami α-aminokwasów według zastrz. 1 i otrzymanych sposobem określonym według zastrz. 2 do wytwarzania związków regulujących żywotność i/lub metabolizm komórkowy oraz do wytwarzania Ieków antynowotworowych.