6-Metyleno-O-j3-D-( 4" -0-m etylog luko pi ranozylo )-8-n itroflawan-4-ol i sposób wytwarzania 6-metyleno-0-j3-D-(4"-0-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu Przedmiotem wynalazku jest 6-metyleno-0-j3-0-(4"-0- metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-ol o wzorze 2 przedstawionym na rysunku. Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wytwarzania 6-m etyleno-0-j3-0-( 4" -0-m etylog lukopi ranozylo )-8-n itroflawan-4-olu. 6-Metyleno-0-j3-0-( 4" -0-metyloglukopiranozylo )-8-nitroflawan-4-ol moze znalezc zastosowanie jako preparat chemoprewencyjny, hepatoprotekcyjny, bakteriostatyczny czy substancja zapobiegajaca peroksydacji lipidów w preparatach farmaceutycznych. Znany jest szczep lsaria fumosorosea KCH J2 uJawniony w zgloszeniu patentowym o numerze P.416996. W ostatnich latach, w leczeniu róznych chorób i ich zapobieganiu, coraz wieksze znaczenie zyskuja zwiazki pochodzenia naturalnego oraz ich odpowiedniki uznawane za naturalne, które uzyskano na drodze przeksztalcen mikrobiologicznych. Dlatego istotne jest opracowywanie nowych metod wytwarzania zwiazków aktywnych biologicznie na drodze biotransformacji, uzytecznych dla przemyslu farmaceutycznego, kosmetycznego i spozywczego. W dostepnej literaturze brak jest informacji na temat otrzymywania 6-m etyl eno-0-13-D-( 4" -0-m etylog I ukopiranozylo )-8-n itroflawan-4-o lu. PL 440865 A1 2/10Istota wynalazku jest 6-metyleno-O-[3-D-( 4" -0- metyl ogi u kopi ranozylo )-8-n itroflawan-4-ol. Istota sposobu polega na tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2. Po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 6-metylo-8-nitroflawanon, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda Transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, przez co najmniej 96 godzin. Nastepnie produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda oraz oczyszcza chromatograficznie. 6-metyleno-O-[3-D-(4"-O-metyloglukopiranozylo)-8- nitroflawan-4-ol znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w trzecim pasmie od linii startu. Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3. Korzystnie takze jest, gdy proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformacje prowadzi sie przez 1 O dni. Korzystnie równiez jest, gdy oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym z chloroformem i metanolem w stosunku objetosciowym 9: 1. Postepujac zgodnie z wynalazkiem, w wyniku dzialania ukladu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu /saria fumosorosea KCH J2, nastepuje redukcja grupy karbonylowej do grupy hydroksylowej przy C-4 oraz przylaczenie 4-metoksy-,B-D-glukozy do grupy CH3 przy C-6. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela sie z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcje rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda Zasadnicza zaleta wynalazku jest otrzymanie 6-metyleno-O-,B-D-(4"- PL 440865 A1 3/10O-metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu oraz wykorzystujac mikroorganizm niebedacy patogenem ludzkim. Wykorzystanie biotransformacji, zamiast syntezy chemicznej, umozliwia, w sposób przyjazny dla srodowiska, uzyskanie zwiazków o wiekszej biodostepnosci i aktywnosci biologicznej, niz uzyte substraty. Wynalazek jest blizej objasniony na przykladzie wykonania. Przyklad. Do kolby stozkowej o pojemnosci 2000 cm3, w której znajduje sie 500 cm 3 sterylnej pozywki zawierajacej 1 O g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza sie szczep /saria fumosorosea KCH J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje sie 50 mg 6-metylo-8-nitroflawanonu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm 3 dimetylosulfotlenku. Transformacje prowadzi sie w 25 stopniach Celsjusza przy ciaglym wstrzasaniu przez 1 O dni. Nastepnie mieszanine poreakcyjna ekstrahuje sie dwukrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza sie chromatograficznie z zastosowaniem jako eluentu mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku objetosciowym 9: 1. Produkt znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w trzecim pasmie od linii startu. Na tej drodze otrzymuje sie 12,5 mg 6-metyleno-O-,B-D-(4"-O metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu o wzorze(wydajnosc 14,8%) oraz pozostalosc, w sklad, której wchodzi 6-metylo-8-nitro-4-O-,B-D-(4"-O metyloglukopiranozylo )-flawanon. Stopien konwersji substratu wedlug HPLC 87%. Uzyskany produkt charakteryzuje sie nastepujacymi danymi spektralnymi. Opis sygnalów pochodzacych z widma 1 H NMR (601 MHz, Aceton-d6) PL 440865 A1 4/10Sygnaly pochodzace od szkieletu Sygnaly pochodzace od jednostki flawonoidowego cukrowej ó [ppm] J [Hz] H ó [ppm] J [Hz] H ,49 (dd) 11,8; 2,1 2 4,41 (d) 7,8 1" 2,37 (m) 3ax 3,28 (m) 2", 5" 2,20 (ddd) 11,7; 7,6; 3eq 3,51 (d) 9,0 3" 2,0 4,90 (s) 4-H 3,10(m) 4" 4,99 (s) 4-OH 3,83 (d) 11,6 6" 3,66 (m) 7,87 (d) 2, 1 5 4,29 (s) C2"-OH 7,71 (d) 2,0 7 3, 73 (m) C6"-OH 7,54 (d) 1,6 2' 3,53 (s) C4"-O- CH3 7,43 (m) 3', 5' 4,90 (d) 12, 1 C6-CH2- 4,68 (d) 12, 1 o 7,36 (m) 4' 7,53 (d) 0,6 6' Modelowanie aktywnosci biologicznych przy uzyciu programu PASS online, wykazalo ze zwiazek 6-metyleno-O-,6-O-( 4" -O- metyl ogi ukop i ranozylo )-8-n itroflawan-4-ol z najwyzszym prawdopodobienstwem 86,9% moze byc inhibitorem glicerofosfotransferazy CDP-glycerol. Enzym ten odpowiada za tworzenie kwasów tejchojowych (TA) w scianie komórkowej bakterii gram dodatnich. Kwasy tejchojowe wiaza kationy metali jedno- i dwuwartosciowych. Sieci kationów skoordynowanych przez TA wplywaja na ogólna strukture polimerów, a to z kolei wplywa na porowatosc i sztywnosc otoczki komórki. Sugeruje sie, ze kwasy tejchojowe sa wazne dla homeostazy kationów w organizmach gram-dodatnich. Inhibicja glicerofosfotransferazy PL 440865 A1 /10COP-glicerol uniemozliwia prawidlowe tworzenie kwasów tejchojowych. Brak kwasów tejchojowych moze zaklócic prawidlowe funkjonowanie bakterii gram dodatnich (Swoboda, J. G., Campbell, J., Meredith, T. C., & Walker, S. (201 O). Wall teichoic acid function, biosynthesis, and inhibition. Chembiochem, 11(1 ), 35-45.). Dzieki temu 6-metyleno-O-,8-O- ( 4" -O-metyloglukopiranozylo )-8-nitroflawan-4-ol wlasciwosci bakteriobójcze wobec patogenów. moze posiadac Wedlug symulacji in silico wykazano, ze z prawdopodobienstwem 65, 7% 6-metyleno-O-,8-O-( 4"-O-metyloglukopiranozylo )-8-nitroflawan-4-ol moze byc stosowany jako zwiazek chemoprewencyjny. Chemoprewencja polega na stosowaniu naturalnych lub syntetycznych zwiazków chemicznych, które moga chronic przed nowotworami. Dzieki temu zwiazek moze posiadac szereg aktywnosci antykancerogennych skladajacych sie na profilaktyke (chemoprewencje), miedzy innymi: wlasciwosci przeciwzapalne, inhibicja angiogenezy, inhibicja wzrostu oraz indukcja apoptozy komórek rakowych, czy zmiatacz wolnych rodników (ROS) (Forni, C., Rossi, M., Borromeo, I., Feriotto, G., Platamone, G., Tabolacci, C., ... & Beninati, S. (2021 ). Flavonoids: A Myth or a Reality for Cancer The rapy?. Mo/ecu/es, 26( 12), 3583.). Wykazano takze, ze z prawdopodobienstwem 68,7% zwiazek moze byc stosowany jako substancja hepatoprotekcyjna. Yoshikawa i wspólracownicy wyizolowali z metanolowego ekstraktu z Anastatica hierochuntica L Anastatyne A i Anastatyne B. Wykazali, ze te zwiazki flawonoidowe maja dzialanie hepatoprotekcyjne na cytotoksycznosc indukowana przez O-galaktozamine w pierwotnie hodowanych mysich hepatocytach, a ich aktywnosc byla silniejsza w porównaniu z pokrewnymi flawonoidami i handlowa sylibina - znana i stosowana komercyjnie substancja hepatoprotekcyjna (Adewusi, E. A., & Afolayan, A. J. (2010). A review of natural products with hepatoprotective activity. Journal of Medicinal Plants Research, 4(13), 1318-1334.). Badania in silico wykazaly równiez, ze zwiazek moze byc inhibitorem PL 440865 A1 6/10peroksydacji lipidów (prawdopodobienstwo 62,9%). Peroksydacja lipidów blonowych znaczaco zmienia fizyczne wlasciwosci dwuwarstw lipidowych. Udzial peroksydacji lipidów oraz ogólnego stresu oksydacyjnego ma ogromny wplyw na rozwój choroby Alzheimera. Alzheimer jest postepujaca choroba neurodegeneracyjna charakteryzujaca sie pozakomórkowa akumulacja amyloidu-13 (A13) oraz wewnatrzkomórkowa akumulacja splatków neurofibrylarnych skladajacych sie z bialka tau. Wiadomo, ze wstawienie Al3 do blon komórkowych generuje nadtlenek wodoru oraz nadtlenki lipidów i produkty degradacji, takie jak MDA. Inhibicja peroksydacji lipidów, moze stanowic jedna z metod leczenia choroby Alzheimera (Gaschler, M. M., & Stockwell, B. R. (2017). Lipid peroxidation in cell death. Biochemica/ and biophysica/ research communications, 482(3), 419- 425. ). Odnosnie grupy nitrowej przedmiotowego 6-metyleno-O-/3-O-(4"-O- metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu, badania Mughal wspólpracowników potwierdzily, ze grupa nitrowa albo siarkowa zwieksza wlasciwosci przeciwbakteryjne, co za tym idzie, dziala negatywnie na wzrost E. coli, S. flexneri, P aeruginosa and S. typhi. (Mughal, E. U., Ayaz, M., Hussain, Z., Hasan, A., Sadiq, A., Riaz, M., ... & Choudhary, M. I. (2006). Synthesis and antibacterial activity of substituted flavones, 4-thioflavones and 4-iminoflavones. Bioorganic & medicinal chemistry, 14(14), 4704- 4711.) PL 440865 A1 7/10Zastrzezenia patentowe 1. 6-Metyleno-O-,6-D-(4" -O-metyloglukopiranozylo )-8-nitroflawan-4-ol o wzorze 2. 2. Sposób wytwarzania 6-metyleno-O-,6-D-(4"-O- metyloglukopiranozylo)-8-nitroflawan-4-olu znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie szczep lsaria fumosorosea KCH J2, nastepnie po uplywie co najmniej 72 godzin do hodowli wprowadza sie substrat, którym jest 6-metylo-8-nitroflawanon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciaglym wstrzasaniu, co najmniej 96 godzin, po czym produkt ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda i oczyszcza chromatograficznie, przy czym 6-metyleno-O-,6-D-( 4"-O-metyloglukopiranozylo )-8- nitroflawan-4-ol o wzorze 2 znajduje sie we frakcji o posredniej polarnosci, w trzecim pasmie od linii startu. 3. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi O, 1 mg: 1 cm 3. 4. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze proces prowadzi sie w temperaturze 25 stopni Celsjusza. . Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 1 O dni. 6. Sposób wedlug zastrz. 2., znamienny tym, ze oczyszczanie prowadzi sie wykorzystujac cienkowarstwowa chromatografie preparatywna w ukladzie eluujacym chloroform:metanol w stosunku objetosciowym 9: 1. PL 440865 A1 8/103' H 3 C ~5' /sana fumosorosea KCH J2 6" OH H 4" - ( -,::;,. 3C-o~o F-10~ " yO /2" OH 1" OH o wzór1 wzór2 PL 440865 A1 9/10al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa. skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.-1--1-0865 Klasyfikacja zgloszenia: C07H 15/26 (2006.01) Cl2P 19/-1--1- (2006.01) Cl2R 1/6-1-5 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: C07H Cl2P C 12R Bazy komputcrmYc w któr: eh prowadzono poszuki,, ania: EPODOC, WPI. Patcntscopc, STNcxt: REGISTRY, bazy UPRP Kategoria dokumentu A A Dokumenty - z podana idcnty fikacja PL-1-35321 Al (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 2022- 03-21 PL238785 Bl (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 2021- -0-1- D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastc,:pncj stronic A - clol,11111cnt ol.rcsl;ljacy o~ól11y stan techniki, Uóry nic jest 11,.v;i;i.a11y 'la posi:1claiac:· S'/.C/.C~ólnc ·1nac/.c11ic, E - dokument stm1owi1c:· wczesniejs7e zp:los7.e11ie lub patent. ;ile opublikmnrn:· w h1h po dacie zglos7eni8 Odniesienie do zastrz. 1-6 1-6 L - dokument. którv moze poddawac" watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo1-wa). lub przvtoczony w celu ustalenia datv publikacji imiego cvtowanego dokumentu lub z 1m1ego szczególnego powodu. O dokument od11osL.ac: sic do ujawmcma ustnego przez Lastosuwauic. w: stawienie lub ujawmcmc \\ inny sposób. P - dol-, .. umcnt opublito,.\ an: pILcd data z~lm,Lcnia, ale póLnicj 1tiL zastrLcgana data picn\ szclistwa. T - dokument pó7111Cjszy op11blikc_n:vany po dacie 7.;2I0~7.c11ia 111b ,v dacie pien:rsze1istYva i nieb(;'clacy ''" konflikcie ze zglos7cniem. ale cytm:rany ,v celu zro7.mnieni;1 7.::rnr1cl l11h teorii le7~c}·ch 11 poclsrnw wynr1l<17l11. X- dokument o szczególnym znaczeniu: zastrze_gan:' wynalazek nie moze byc uwazany za now:· lub nie moze byc uwazan:· za posiadajacy poziom w:·nalazczy. _jezeli ten dokument brany Jest pod uwage samoclz1elme. Y dokument o sn.::zegóhty m znacLcmu; LastrLcgany \\ y nalazch. nic moLc byc u½azany La posiadaJac: poLiom \\ y nalaLcz:, jcLch ten dul"-umcnt zustanic polaczony- z jcd11y-111 lub kilko111a lego typu clok11111c11tami, a takie po lau.c11ic bcd/iC llC'/.}- w istc dla /.lla\VC}-, & - dokument n;ilc7.qcy clo tej s;imej roc17illy p;itentowci. Sprawozdanie wykonal/-a: Agnieszka Ucinska Ekspert Koordynator Data: 21.12.2022 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 06.04.2022 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL 440865 A1 /10 PL