PL442097A1 - Sposób wytwarzania 19-nortestololaktonu - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy sposobu wytwarzania 19-nortestololaktonu, o wzorze 2, na drodze mikrobiologicznego utlenienia typu Baeyera-Villigera grupy ketonowej w pierścieniu D substratu, którym jest 19-nortestosteron, o wzorze 1, przy użyciu systemu enzymatycznego grzyba strzępkowego Fusicoccum amygdali AM258.

Description

PL 442097 A1 2/8 Sposób wytwarzania 19-nortestololaktonu Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 19-nortestololaktonu, o wzorze 2, przedstawionym na rysunku. Sposobem, wedlug wynalazku, mozna otrzymac zwiazek, który jako steroidowy lakton moze znalezc zastosowanie jako terapeutyk lub prekursor nowych steroidowych pochodnych o potencjale terapeutycznym. Czasteczki steroidowe z ugrupowaniem laktonowym w pierscieniu D wykazuja aktywnosc przeciwnowotworowa, przeciwbakteryjna, antyhipercholesterolemiczna i antyandrogeniczna (Brodie A.M.H. and Njar V.C. O.,J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 1998, 66, 1-1 O; Bydal P. et al.,Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 632-644). Lakton 1-dehydrotestosteronu (testolakton) nalezy do inhibitorów aromatazy (Lane S. H. et al.,New J. Chem. 2018, 42, 4579-4589) - zwiazków, które hamuja rozwój hormono­ zaleznych nowotworów i stosowane sa w terapii dolegliwosci zwiazanych z zaburzeniami równowagi hormonalnej, np. w ginekomastii i przedwczesnym dojrzewaniu (Serafini G. E., Moslemi S., Mol. Cell. Endocrinol. 2001, 178, 117-131). 19-Nortestosteron jest syntetycznym steroidem o aktywnosci anabolicznej i androgennej. Zwiazek ten stymuluje wzrost tkanek miesniowych, dlatego znalazl zastosowanie m. in. w terapii rozleglych oparzen i osteoporozy. Wykorzystywany jest w leczeniu zaniku miesni spowodowanym przez schorzenia takie jak przewlekla obturacyjna choroba pluc (POChP), przewlekla niewydolnosc nerek czy AIDS. (Tatem A., et al., Transl. Androl. Uroi. 2020, 9, 186-194; Wu C. Kovac J. R., Curr Uroi Rep. 2016, 17, 72). Badania przeprowadzone na szczurach wykazaly, ze zwiazek ten moze równiez lagodzic stany lekowe (Kouvelas D. et al, Int. J. Neuropsychopharmacol. 2008, 11, 925-34). PL 442097 A1 3/8 Jedna z metod wprowadzenia do czasteczki ugrupowania laktonowego jest chemiczna reakcja Baeyera-Villigera, polegajaca na utlenianiu ketonów za pomoca nadkwasów albo nadtlenków. Utleniacze takie sa czesto toksyczne i niestabilne, dlatego ich stosowanie skutkuje zanieczyszczaniem srodowiska naturalnego. Dodatkowo w reakcjach, w których substratem jest zwiazek zawierajacy inne wrazliwe na utlenianie grupy funkcyjne, stosowanie metody chemicznej zwiazane jest z powstawaniem produktów ubocznych reakcji. Alternatywa wobec utleniania chemicznego jest otrzymywanie laktonów na drodze mikrobiologicznej, z wykorzystaniem aparatu enzymatycznego drobnoustrojów zdolnych do przeprowadzania reakcji utlenienia typu Baeyera-Villigera. Dodatkowa zaleta utleniania enzymatycznego jest wysoka selektywnosc reakcji i czesto brak produktów ubocznych. Znany jest sposób otrzymywania 19-nortestololaktonu jako jednego z pieciu produktów 72 godzinnej reakcji mikrobiologicznego utleniania 19-nortestosteronu przez Aspergillus tamarii. 19-Nortestololakton powstawal w tej reakcji z wydajnoscia 69% (McCurdy J. T. and Garrett R. D., J. Org. Chem. 1968, 33, 660-661 ). W innym znanym przykladzie, podczas kilkudniowej transformacji 19-nortestosteronu w kulturze Penicillium notatum uzyskano 19-nortestololakton z wydajnoscia 93% (Bartmanska A et al., Steroids 2005, 70, 193-198). Z kolei opis patentowy Pat.239842 ujawnia otrzymanie 19-nortestololakton z 19-nortestosteronu z wydajnoscia 90%, po szesciu dniach transformacji przy wykorzystaniu Penicillium vinaceum AM11 O. Aktywnosc biokatalityczna szczepu Fusicoccum amygdali AM258 w reakcji utlenienia typu Baeyera-Villigera byla wczesniej ujawniona w literaturze. Szczep ten wykorzystany byl do otrzymywania steroidowego laktonu (313-hydroksy-17a-oksa-D-homo-androst-5-en-7, 17-dionu) z 7-okso-DHEA. PL 442097 A1 4/8 Istota wynalazku polega na tym, ze do podloza odpowiedniego dla wzrostu grzybów strzepkowych wprowadza sie zawiesine komórek Fusicoccum amygdali AM258 i inkubuje sie ja przez kilka dni przy stalym wstrzasaniu w temperaturze 24-27 °C. Po uplywie co najmniej 4 dni dodaje sie substrat: 19-nortestosteron, jako zawiesine w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda. Transformacje prowadzi sie przy ciaglym wstrzasaniu co najmniej przez 24 godziny w warunkach typowych dla hodowli mikroorganizmu. Uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje sie trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda, osusza i odparowuje rozpuszczalnik. W ten sposób otrzymuje sie surowy produkt, który nastepnie oczyszcza sie chromatograficznie. Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi 0,25 g : 1 I. Korzystnie jest, gdy transformacje prowadzi sie przez 24 godziny. Korzystne jest, gdy jako ekstrahent stosuje sie chloroform. Korzystne jest takze, gdy jako eluent stosuje sie mieszanine heksan:aceton, w proporcji objetosciowej skladników 2: 1. Zasadnicza zaleta wynalazku jest otrzymanie 19-nortestololaktonu jako jedynego produktu w krótkim czasie reakcji z wydajnoscia 92%, w temperaturze pokojowej i pH bliskim obojetnemu. Wynalazek jest blizej objasniony na przykladzie wykonania. Do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 300 ml, w której znajduje sie 100 ml sterylnej pozywki zawierajacej 3 g glukozy i 1 g aminobaku, wprowadza sie 2 cm 3 zawiesiny komórek Fusicoccum amygdali AM258. Hodowle prowadzi sie przez kolejne cztery dni przy stalym wstrzasaniu w temperaturze 24-27°C. Nastepnie do hodowli mikroorganizmu dodaje sie mg 19-nortestosteronu, o wzorze 1, w postaci zawiesiny w 0,5 cm 3 acetonu. Transformacje prowadzi sie przy ciaglym wstrzasaniu przez 24 godziny w warunkach, w których prowadzona byla hodowla mikroorganizmu. Nastepnie uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje sie trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu PL 442097 A1 /8 i odparowuje rozpuszczalnik. Wydajnosc otrzymania surowego produktu wedlug danych chromatograficznych (GC) wynosi 96%. Po oczyszczeniu surowego produktu za pomoca chromatografii kolumnowej, stosujac jako eluent mieszanine heksan:aceton w proporcji objetosciowej skladników 2:1, otrzymuje sie 23 mg 19-nortestololaktonu (wydajnosc izolowana 92% mol.), o wzorze 2. Uzyskany produkt 19-nortestololakton charakteryzuje sie nastepujacymi danymi spektralnymi: 1 H NMR (CDCb) ó (ppm): 1,36 (s, 3H, 18-H); 2,60 (m, 1 H, 16a-H); 2,69 (m, 1 H, 1613-H); 5,84 (s, 1 H, 4-H); 13 C NMR (CDCb) ó (ppm): 199, 1 (C-17); 171,2 (C-3); 164,8 (C-5); 124,9 (C- 4); 83 (C-13); 48,4 (C-9); 45,0 (C-14); 42,6 (C-12); 42,1 (C-10); 38,6 (C-8); 36,4 (C-2); 35,2 (C-6); 29,4 (C-7); 28,5 (C-16); 26,7 (C-11); 26,2 (C-1); 20,1 (C-15); 19,7 (C-18). PL 442097 A1 6/8 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania 19-nortestololaktonu na drodze transformacji mikrobiologicznej znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie zawiesine komórek Fusicoccum amygdali AM258, nastepnie po uplywie co najmniej 4 dni do hodowli dodaje sie 19-nortestosteron o wzorze 1, jako zawiesine w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 24°C do 27°C, przy ciaglym wstrzasaniu co najmniej 24 godziny, po czym produkt ekstrahuje sie trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda, ekstrakt osusza sie i odparowuje rozpuszczalnik, w wyniku tych operacji otrzymuje sie surowy produkt, który oczyszcza sie chromatograficznie. 2. Sposób wedlug zastrz. 1., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi 0,25 g: 1 L. 3. Sposób wedlug zastrz.1., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 24 godziny. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako ekstrahent stosuje sie chloroform. . Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako eluent stosuje sie mieszanine heksan:aceton, w proporcji objetosciowej skladników 2:1. PL 442097 A1 7/8 o Wzór 1 OH Fusicoccum amygdali AM258 o o Wzór2 PL 442097 A1 8/8 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIK.I DO ZGLOSZENIA NR P . ..J.42097 I-.:.lasyfikacja zgloszenia: Cl2P 33/20. Cl2P 33/12. Cl2R 1/6"1-5 Podklasy w których prmrndzono poszukiwania: C 12P Cl 2R Bazy kompulero,,e w klóf\ eh prowadzono poszuki\\ ania: EPODOC WPL Xfull (NPL). Palenlscope. STNexl: REGISTRY. bazy UPRP Kategoria dokumentu Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie do zaslrz. A PL239842 81 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 17-01- 1-5 2022 A Judith T. McCnrdy. Ronald D. Garrett. "Microbiological transfom1ation of 1-5 slcroids. I. Synlhcsis of 19-norlcslololaclonc", J. Org. Chcm. 1968. 33, 2. 660-GGL Publication Date: Febmarv I. I 968: https://doi.org/1 O. I 021 /jo0 l 266a039 A Agnieszka Barlma11ska. Jadwiga Dmochowska-Gladysz. Ewa Huszcza. ''Sleroids · 1-5 transfonnations in Pcnicillium notatum culturc'·, Stcroids 70(3): 193-8; April 2005; DOI: IO. IO !61'.j.steroids.200-1-.1 I.O 11 A PL235286 B 1 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 15-06- 1-5 2020 D Dalszy ciag Yvyknzn dokmnentó" m nastepnej stronie A- dotumcnt ol....rcslajac: ogóln} stan tcclmiL.i, Uó1)' 1Lic jest u,.vaLan} za posiadaiac: szcLc~ólnc z1iacLc1Uc, :C - dol-, .. umcnt slaHO\\ iac: vn.:zc~nicjszc z.slo~Lcnic lub patent, ale opubli.h.o\\ an: \\ lub pu dacie Lgluszcnia. 1 dol-, .. umcnt, h..tóry moLc poddav\ ac \\ VI atphvvusc LW5Lr:,.:i.:ganc p1cn\ szoi1,Lwu{_-V\ a), lub prLy tocwny w celu uslalcma dat: publihac_11 innego c: towancgu duJ...umcntu lub z innego szczególnego powodu. O - dokument oduos,qc: sie du ujawmema ustnego przez Lastosowanie. w: stawienie lub ujawmeme \\ inny sposób. P - dokument opubhkowam przed daq z_zloszema. ale pózme1 mz zastrze~ana data p1emszenstwa. T - dokument pózme1sz,. opubl!kowany po dac1e z_zloszema lub w dac1e p1erwszenstwa 1 mebedac, w konfllkc1e ze z~loszemem. ale c,towam w celu zrozum1ema zasad lub teori1 lez~c,ch u podstaw wrnalazku. X - dokument o S7Czególnym znaczeniu: zastl7.e_gm1~' ,Yymtla7ek nie mo7.e byc mY87.any 7a now~- lub nie mo7e b~-c uwa7.an~- z:::i. posiadaj:::i.cy po7iom w~·nalazc7.y. _je7eli ten dok11ment hrany jest pod m;.,-;;ige smnodzielnie. Y - dokument o S7Czególn:vm 7nf!C7.cnin: 7.f!Stl7.cgm1~' v;:vn;1fa7ck nic mo7.c byc mY87.mrv 7.fl posi;idnjac~- po7.iom ,yy11;1fa7.c~ je7.cli ten dokument zost;inic polac7on~- z jednym lub kilkomn tego typu dokmncntami, ;i t;ikic po lac7C~nie bed7ic oczy,:vi;;tc db 7.na,vc~ [<.:., - dol\11111e11t nalc"i'.~Jcy do tej samej rocViny patentn,:vcj. Sprawozdanie wykonal/-a: Agnieszka Ucinska Ekspert Koordynator Data: 29.05.2023 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 26.08.2022 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL PL

Claims (5)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania 19-nortestololaktonu na drodze transformacji mikrobiologicznej znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie zawiesine komórek Fusicoccum amygdali AM258, nastepnie po uplywie co najmniej 4 dni do hodowli dodaje sie 19-nortestosteron o wzorze 1, jako zawiesine w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 24°C do 27°C, przy ciaglym wstrzasaniu co najmniej 24 godziny, po czym produkt ekstrahuje sie trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda, ekstrakt osusza sie i odparowuje rozpuszczalnik, w wyniku tych operacji otrzymuje sie surowy produkt, który oczyszcza sie chromatograficznie.

2. Sposób wedlug zastrz. 1., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi 0,25 g: 1 L.

3. Sposób wedlug zastrz.1., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 24 godziny.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako ekstrahent stosuje sie chloroform.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako eluent stosuje sie mieszanine heksan:aceton, w proporcji objetosciowej skladników 2:1./8 o Wzór 1 OH Fusicoccum amygdali AM258 o o Wzór2/8 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIK.I DO ZGLOSZENIA NR P . ..J.42097 I-.:.lasyfikacja zgloszenia: Cl2P 33/20. Cl2P 33/12. Cl2R 1/6"1-5 Podklasy w których prmrndzono poszukiwania: C 12P Cl 2R Bazy kompulero,,e w klóf\ eh prowadzono poszuki\\ ania: EPODOC WPL Xfull (NPL). Palenlscope. STNexl: REGISTRY. bazy UPRP Kategoria dokumentu Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie do zaslrz. A PL239842 81 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 17-01- 1-5 2022 A Judith T. McCnrdy. Ronald D. Garrett. "Microbiological transfom1ation of 1-5 slcroids. I. Synlhcsis of 19-norlcslololaclonc", J. Org. Chcm. 1968. 33, 2. 660-GGL Publication Date: Febmarv I. I 968: https://doi.org/1 O. I 021 /jo0 l 266a039 A Agnieszka Barlma11ska. Jadwiga Dmochowska-Gladysz. Ewa Huszcza. ''Sleroids · 1-5 transfonnations in Pcnicillium notatum culturc'·, Stcroids 70(3): 193-8; April 2005; DOI: IO. IO !61'.j.steroids.200-1-.1 I.O 11 A PL235286 B 1 (UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCLAWIU) 15-06- 1-5 2020 D Dalszy ciag Yvyknzn dokmnentó" m nastepnej stronie A- dotumcnt ol....rcslajac: ogóln} stan tcclmiL.i, Uó1)' 1Lic jest u,.vaLan} za posiadaiac: szcLc~ólnc z1iacLc1Uc, :C - dol-, .. umcnt slaHO\\ iac: vn.:zc~nicjszc z.slo~Lcnic lub patent, ale opubli.h.o\\ an: \\ lub pu dacie Lgluszcnia. 1 dol-, .. umcnt, h..tóry moLc poddav\ ac \\ VI atphvvusc LW5Lr:,.:i.:ganc p1cn\ szoi1,Lwu{_-V\ a), lub prLy tocwny w celu uslalcma dat: publihac_11 innego c: towancgu duJ...umcntu lub z innego szczególnego powodu. O - dokument oduos,qc: sie du ujawmema ustnego przez Lastosowanie. w: stawienie lub ujawmeme \\ inny sposób. P - dokument opubhkowam przed daq z_zloszema. ale pózme1 mz zastrze~ana data p1emszenstwa. T - dokument pózme1sz,. opubl!kowany po dac1e z_zloszema lub w dac1e p1erwszenstwa 1 mebedac, w konfllkc1e ze z~loszemem. ale c,towam w celu zrozum1ema zasad lub teori1 lez~c,ch u podstaw wrnalazku. X - dokument o S7Czególnym znaczeniu: zastl7.e_gm1~' ,Yymtla7ek nie mo7.e byc mY87.any 7a now~- lub nie mo7e b~-c uwa7.an~- z:::i. posiadaj:::i.cy po7iom w~·nalazc7.y. _je7eli ten dok11ment hrany jest pod m;.,-;;ige smnodzielnie. Y - dokument o S7Czególn:vm 7nf!C7.cnin: 7.f!Stl7.cgm1~' v;:vn;1fa7ck nic mo7.c byc mY87.mrv 7.fl posi;idnjac~- po7.iom ,yy11;1fa7.c~ je7.cli ten dokument zost;inic polac7on~- z jednym lub kilkomn tego typu dokmncntami, ;i t;ikic po lac7C~nie bed7ic oczy,:vi;;tc db 7.na,vc~ [<.:., - dol\11111e11t nalc"i'.~Jcy do tej samej rocViny patentn,:vcj. Sprawozdanie wykonal/-a: Agnieszka Ucinska Ekspert Koordynator Data: 29.05.2023 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 26.08.2022 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego