PL 442098 A1 2/8 Sposób wytwarzania 11 a-hydroksy-19-nortestosteronu Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 11 a-hydroksy-19- nortestosteronu, o wzorze 2, przedstawionym na rysunku. Sposobem, wedlug wynalazku, mozna otrzymac zwiazek, który ze wzgledu na swoja aktywnosc biologiczna moze znalezc zastosowanie w przemysle farmaceutycznym oraz stanowic prekursor nowych steroidów o potencjale terapeutycznym. 19-Nortestosteron (nandrolon) jest syntetycznym steroidem o aktywnosci anabolicznej i androgennej. Zwiazek ten znalazl zastosowanie w terapii osteoporozy oraz schorzen miesniowych spowodowanych przewlekla obturacyjna choroba pluc (POChP) i chorobami nerek (Tatem A., et al., Transl. Androl. Uroi. 2020, 9, 186-194). Badania przeprowadzone na szczurach wykazaly, ze zwiazek ten moze równiez lagodzic stany lekowe (Kouvelas D. et al, Int. J. Neuropsychopharmacol. 2008, 11, 925- 34). Wprowadzenie grupy hydroksylowej do czasteczki steroidowej moze skutkowac wzmocnieniem lub zmiana aktywnosci biologicznej czasteczki (Donova M.V., Egorova O.V., App. Microbiol. Biotechnol., 2012, 94, 1423- 1447; El Ki hel L., Steroids, 2012, 77, 10-26). Obecnosc grupy hydroksylowej powoduje jednoczesnie wzrost polarnosci zwiazku i ulatwia przeprowadzanie kolejnych przemian strukturalnych czasteczki. 11 a-Hydroksysteroidy sa jednymi z najwazniejszych produktów posrednich w swiatowej produkcji glukokortykoidów (Felpeto-Santero C. et al., Microb. Biotechnol. 2021, 14, 2514-2524). 11 a-Hydroksy-19- nortestosteron charakteryzuje sie niska aktywnoscia endokrynna i wykazuje silne wlasciwosci immunomodulacyjne. W badaniach dotyczacych leczenia drobiu wykazano, ze zwiazek ten znaczaco wplywa na ochrone przed PL 442098 A1 3/8 wystapieniem samoistnego autoimmunologicznego zapalenia tarczycy (Schuurs A. H. W. M. et al., Int. Arch. Allergy lmmunol. 1992, 97, 337-344). Chemiczna synteza leków steroidowych wymaga zwykle przeprowadzania licznych operacji technologicznych, zwiazanych m. in. Z koniecznoscia oslaniania niektórych grup funkcyjnych przed niespecyficznymi co do miejsca i konformacji reakcjami chemicznymi. W przeciwienstwie do metod chemicznych, transformacje mikrobiologiczne ze wzgledu na wysoka regio- oraz stereoselektywnosc reakcji pozwalaja modyfikowac strukture czasteczek jednoetapowo. Przykladowo, mikrobiologiczna 11 a-hydroksylacja progesteronu prowadzona w kulturze Rhizopus nigricans umozliwila redukcje liczby etapów procesu otrzymywania kortyzonu z 36 do 11, co znaczaco wplynelo na obnizenie ceny tego leku (Sarett L. H., 1947, U. S. Patent 2,462,133; Hogg, J. A. Steroids 1992, 57, 593-616). Z opisu US 2,686,792 znany jest sposób otrzymywania 11 a-hydroksy- 19-nortestosteronu jako jednego z dwóch produktów mikrobiologicznej hydroksylacji nortestosteronu przez Rizopus reflexus. W innym znanym przykladzie podczas transformacji 19-nortestosteronu w kulturze Beauveria bassiana AM446 uzyskano 11 a-hydroksy-19-nortestosteron z wydajnoscia 40,5% (Huszcza E. et al, Z. Naturforsch., C, J. Biosci. 2005, 60, 103-108). Po czternastu dniach transformacji nandrolonu przy wykorzystaniu Trichoderma hamatum 11 a-hydroksy-nandrolon otrzymywany byl z wydajnoscia 16% jako jeden z trzech produktów (Bartmanska A, Dmochowska - Gladysz J., Enzyme Microb. Technol. 2007, 40, 1615- 1621 ). Biotransformacje steroidów z udzialem szczepów nalezacych do gatunku Beauveria bassiana prowadza do otrzymania hydroksylowych i polihydroksylowych pochodnych (Kozlowska E. et al., Sci. Rep., 2018, 8, 1- 11; Gonzalez R et al., Biocatal. Biotransformation, 2017, 35, 103-109, Kollerov V. et al. Phytochemistry, 2019, 169, 112160; Hussain Z. et al., RSC Advances 2020, 1 O, 451-460). Hydroksylacje te zachodza najczesciej w PL 442098 A1 4/8 pozycjach C-11 oraz C-7 szkieletu steroidowego. Szczep Beauveria bassiana KCH 1065 byl ujawniony w literaturze jako biokatalizator w syntezie steroidowych 11 a-hydroksy-O-laktonów. Istota wynalazku polega na tym, ze do podloza odpowiedniego dla wzrostu grzybów strzepkowych wprowadza sie zawiesine komórek Beauveria bassiana KCH 1065 i inkubuje sie ja przez kilka dni przy stalym wstrzasaniu w temperaturze 24-27°C. Po uplywie co najmniej 48 godzin dodaje sie substrat: nortestosteron, o wzorze 1, jako zawiesine w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda. Transformacje prowadzi sie przy ciaglym wstrzasaniu co najmniej przez 24 godziny w warunkach typowych dla hodowli mikroorganizmu. Uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje sie trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda, osusza i odparowuje rozpuszczalnik. W ten sposób otrzymuje sie surowy produkt, który nastepnie oczyszcza sie chromatograficznie. Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi 0,25 g : 1 L. Korzystnie jest, gdy transformacje prowadzi sie przez 24 godziny. Korzystne jest, gdy jako ekstrahent stosuje sie chloroform. Korzystne jest takze, gdy jako eluent stosuje sie mieszanine heksan:aceton, w proporcji objetosciowej skladników 2: 1. Zasadnicza zaleta wynalazku jest otrzymanie 11 a-hydroksy-19- nortestosteronu jako jedynego produktu reakcji z wydajnoscia 92%, w temperaturze pokojowej i pH bliskim obojetnemu. Wynalazek jest blizej objasniony na przykladzie wykonania. Do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 300 ml, w której znajduje sie 100 ml sterylnej pozywki zawierajacej 3 g glukozy i 1 g aminobaku, wprowadza sie 2 cm 3 zawiesiny komórek Beauveria bassiana KCH 1065. Hodowle prowadzi sie przez kolejne trzy dni przy stalym wstrzasaniu w temperaturze 24-27°C. Nastepnie do hodowli mikroorganizmu dodaje sie 25 mg 19-nortestosteronu, o wzorze 1, w postaci zawiesiny w 0,5 cm 3 acetonu. PL 442098 A1 /8 Transformacje prowadzi sie przy ciaglym wstrzasaniu przez 24 godziny w warunkach, w których prowadzona byla hodowla mikroorganizmu. Nastepnie uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje sie trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Po oczyszczeniu surowego produktu za pomoca chromatografii kolumnowej, stosujac jako eluent mieszanine heksan:aceton w proporcji objetosciowej skladników 2: 1, otrzymuje sie 23 mg 11 a hydroksy-19-nortestosteronu (wydajnosc izolowana 92% mol.), o wzorze 2. Uzyskany produkt 11 a-hydroksy-19-nortestosteron charakteryzuje sie nastepujacym i danym i spektralnymi: 1 H NMR (CDCb) ó (ppm): 0,82 (s, 3H, 18-H); 3.69-3,72 (m, 1 H, 17a-H); 3,87-3.91 (m, 1 H, 11 [3-H); 5,83 (s, 1 H, 4-H); 13 C NMR (CDCl3) ó (ppm): 200,6 (C-3); 167,2 (C-5); 124,5 (C-4); 81, 1 (C- 17); 72,1 (C-11); 54,8 (C-9); 48,9 (C-14); 48,1 (C-12); 44,0 (C-10); 43,7 (C- 13); 40,1 (C-8); 36,2 (C-2); 36,0 (C-6); 31,5 (C-7); 30,5 (C-16); 29,7 (C-1); 23,1 (C-15); 12,0 (C-18). PL 442098 A1 6/8 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania 11 a-hydroksy-19-nortestosteronu na drodze transformacji mikrobiologicznej znamienny tym, ze do podloza odpowiedniego dla grzybów strzepkowych wprowadza sie zawiesine komórek Beauveria bassiana KCH 1065, nastepnie po uplywie co najmniej 48 godzin do hodowli dodaje sie 19-nortestosteron o wzorze 1, jako zawiesine w rozpuszczalniku organicznym mieszajacym sie z woda, transformacje prowadzi sie w temperaturze od 24°C do 27°C, przy ciaglym wstrzasaniu co najmniej 24 godziny, po czym produkt ekstrahuje sie trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszajacym sie z woda, ekstrakt osusza odparowuje rozpuszczalnik, otrzymujac surowy produkt, który oczyszcza sie chromatograficznie. 2. Sposób wedlug zastrz. 1., znamienny tym, ze stosunek masy dodawanego substratu do objetosci hodowli wynosi 0,25 g: 1 L. 3. Sposób wedlug zastrz.1., znamienny tym, ze transformacje prowadzi sie przez 24 godziny. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako ekstrahent stosuje sie chloroform. . Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako eluent stosuje sie mieszanine heksan:aceton, w proporcji objetosciowej skladników 2: 1. PL 442098 A1 7/8 OH Wzór 1 Beauveria bassiana KCH 1065 OH HO,,. Wzór2 PL 442098 A1 8/8 al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 OS 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-rnail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O ST ANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.442098 Klasyfikacja zgloszenia: CI2P .B/10_ Cl2R 1/645 Podklasy w których prowadmno pos1.ukiwania: CI 2P Cl 2R BaLy komputerowe\\ których pro\\ adLono posmkiwania: STNcxL EPODOC WPI (,ia EPOQUENET). baLy UPRP (c-wyszuki,rnrka), zasoby Internetu (via googlc.com) Kategoria dokumentu Dokwncnty - L podaill) idcnly fikacja Odniesienie do zastrz. A Huszcza E. et al., .. Transformations ofsteroids by Beauveria bassiana.··, Z 1-5 Nalurforsch C J Biosci. 2005. 60(1-2). pp. 103-108 doi: 10.1515/Lnc-2005-1-219 A SwiLdor A cl al., ·'Microbial Bacycr-Villigcr oxidation of 5a-stcroids using 1-5 Bcauvcria bassiana. A stcrcochcmical rcquircmcnt for the 11 a-hydro,:·lation and the lactonization pathway .... Steroids 201-L 82. pp. -IA-52 doi: 10.1016/j.stcroids.201.J..0 1.006 A Hussain Z. et aL „Seven new metabolites of drostanolone heptanoale by using 1-5 Bcam cria bas siana, and Macrophomina phascolina cell suspcnsion culturcs.". RSC AdYances 2020. IO_ pp. 451-460 doi: IO. l039/c9ra05878h A WO20040l l663 A2 (SCHERING AG: ZORN LUDWIG: BOHLMANN ROLF: 1-5 GALL US NORBERT: KUENZER HERMANN: MUHN HANS-PETER; NUBBEMEYER REINHARD) 05-02-2004 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie --\ -rlokm11ent ol-:reslnjacy ogólny stan tech11iki. który nie jest mYn7.any 7.n posincbjacy S7.Czególne 7,rn1cze11ie E - dokument stanOY\·iacy '-YC7csnicjszc zgfoc;zcnic h1b patent. ;ile opublil..::cn:v~my ,v hib po d;iclc zgloszcnl;i, L - doL.umcnL L.tór)' moL.c podda\\ ac w \vatpli\\ osc zastrzegane picnv1:izci1St\\ o(-\va). lub prz)'toczon) w celu u1:italc1Lia dat)' publil .... acji innego C)' low~mcgo doL.umcnlu lub z innego 1:izczcgólncgo pO\\ odu, O - doh.umenl odnoszacy sie do uJa½nieuia uslnegu przez ·zaslosuv\ ;.mie, v. ystaw1eme lub uJa½nieuie w inny sposób, P - dokumem opubhkowanv przed data zgloszema. ale po,me1 mz zastrze.~ana data p1envsze11stwa. T- dokument póznie_ls7y. opublik.ow3UV po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i mebedacy ,v konflikcie 7.e z_s:10s1,enienL ale c~·towany ''" celu nozumienia zas:::id lub teorii le7.[!cych ll podstaw v;yn3la7kll. X - dokmncnt o s1.c1ególn~-m 1.nncze11lu: 7:lStf7egnn:v wym1fa1.ck nlc mo7.c hyc mYn7:::iny 1.n HOY\":V lub 11lc m07.c byc uw37.nn:v zn posi:::idn_iricy p01.10m 1Yy113fazc7~-. jc7.cli ten dokument brnny jest p0d 11wn;;c; s;imod?ielnic, Y - dokumclll o c.zca,góht} m Lltaczcniu; &Slra,gany wy naluck nic moze byc u11 aL.llt} za posiadajacy poziom W} natucLy, Jezeli len dol,wncnl LOSlanic polacLony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonal/-a: Jolanta Gajewska Ekspert Data: 28.04.2023 Uwagi do zgloszenia Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen z dnia 26 sierpnia 2022 roku. PL PL