Zwiazek - marker diagnostyczny raka jajnika, sposób wykrywania aktywnosci enzymatycznej, sposób diagnozowania raka jajnika, zestaw zawierajacy taki zwiazek oraz zastosowania takiego zwiazku i sposób leczenia raka jajnika Przedmiotem wynalazku jest nowy zwiazek chemiczny - marker diagnostyczny - do zastosowania medycznego, dokladniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególnosci w diagnostyce raka jajnika. Przedmiotem wynalazku jest takze sposób in vitro wykrywania aktywnosci enzymatycznej obecnej w plynie ustrojowym osobnika, w szczególnosci pochodzacej z komórek raka jajnika, z uzyciem takiego zwiazku, sposób in vitro diagnozowania raka jajnika, z uzyciem takiego zwiazku, zestaw zawierajacy taki zwiazek, zastosowanie takiego zwiazku do wykrywania aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika, zastosowanie takiego zwiazku do diagnozowania raka jajnika, taki zwiazek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka jajnika. Przedmiotem wynalazku ponadto sposób leczenia raka jajnika obejmujacy etap przeprowadzania sposobu diagnozowania raka jajnika jak okreslono powyzej. Stan techniki Rak jajnika jest 8 najczestszym nowotworem diagnozowanym u kobiet i trzecim nowotworem narzadów rodnych kobiet. W roku 2020 odnotowano ponad 300 tys. nowych przypadków. Kazdego roku na swiecie umiera ponad 114 OOO kobiet z rakiem jajnika. Do czynników ryzyka tego nowotworu zalicza sie: bezdzietnosc, wczesna lub pózna miesiaczke, pózna menopauze (po 55 roku zycia), terapie hormonalna i aktywne badz bierne palenie papierosów. W poczatkowych stadiach rozwoju rak jajnika zazwyczaj nie daje zadnych objawów, dopiero gdy choroba jest bardziej zaawansowana, pojawiaja sie objawy ze strony przewodu pokarmowego. Pomimo swej nazwy rak jajnika jest choroba nie tylko samych jajników - w wiekszosci przypadków obserwuje sie tzw. rozsiew otrzewnowy, czyli obecnosc guzów na innych narzadach jamy brzusznej. Zle wyniki leczenia sa spowodowane pózna diagnostyka oraz tym, ze nowotwór bardzo wczesnie rozprzestrzenia sie po calym brzuchu, zajmujac jelita, watrobe, sledzione i inne tkanki. Wynika to z faktu, ze jajniki sa narzadami lezacymi swobodnie w jamie brzusznej, w zwiazku z czym komórki raka maja duza latwosc przenoszenia sie na sasiadujace narzady. Dodatkowo bardzo czesto daje on przerzuty droga limfatyczna do wezlów chlonnych. Rak jajnika cechuje sie umiarkowanym badz zlym rokowaniem, które zalezy przede wszystkim od stopnia zaawansowania choroby oraz wieku i ogólnego stanu zdrowia pacjentki. Im wczesniej wykryty jest ten nowotwór, tym wieksza szansa na jego trwale wyleczenie. 5-letnie przezycie w przypadku wczesnie PL 442379 A1 2/37wykrytych przypadków przekracza 90%, natomiast w zaawansowanych stadiach wynosi jedynie 20%. Objawy raka jajnika nie sa specyficzne i maja najczesciej charakter ogólny takie jak wodobrzusze, bóle podbrzusza krwawienie z dróg rodnych. Rozpoznanie zostaje potwierdzone przez wynik badania ginekologicznego pacjentki, badania USG oraz badania markera CA-125 obecnego w krwi. Ca-125 jest uzyteczny w diagnostyce, monitorowaniu oraz prognozowaniu przebiegu choroby oraz rozpoznaniu jej nawrotu. U okolo polowy chorych we wczesnym stadium raka jajnika, objawia sie on podwyzszonym stezeniem CA- 125. Szacuje sie, ze ponad 80% kobiet chorych na raka jajnika ma podwyzszone stezenie markera CA-125. Czulosc i swoistosc CA-125 w przewidywaniu wystepowania nowotworu zlosliwego, a takze jego dodatnia wartosc przepowiadajaca, sa niewielkie, poniewaz przed operacja stezenie CA-125 jest prawidlowe u okolo 50% chorych na nowotwory nablonkowe jajnika w I stopniu zaawansowania. Ponadto na zwiekszenie stezenia CA-125 wplywa wiele uwarunkowan, w tym wystepowanie nowotworów zlosliwych innych narzadów jamy brzusznej oraz wielu schorzen lagodnych. Podejmowane sa próby stosowania markera CA- 125 jako markera predykcyjnego, natomiast nie zaleca sie stosowania tego markera do testów diagnostycznych do wykrywania, w tym wczesnego, raka jajnika ze wzgledu na niska selektywnosc tego testu. Do sprzedazy dopuszczono nowy jakosciowo test surowiczy ulatwiajacy przewidywanie rozpoznania raka jajnika u kobiet z guzem w obrebie miednicy. Badanie to, znane jako OVAl, polega na ocenie 5 markerów biologicznych: transtyretyny, apolipoproteiny A-1, mikroglobuliny ~2, transferyny i CA-125. Kolejnym dopuszczonym do stosowania markerem biologicznym jest oznaczanie HE4 (bialka 4 z komórek nablonkowych ludzkiego najadrza, human epididymis protein 4). HE4 jest inhibitorem proteazy wystepujacym w komórkach zlosliwych nowotworów nablonkowych jajnika. Mozna go wykryc w surowicy kobiet z rakiem jajnika. Skojarzone oznaczenie HE4 i CA-125 posiada parametry diagnostyczne lepsze niz oba wyniki interpretowane pojedynczo. Na podstawie modelu, który opiera sie na równoczesnym oznaczeniu w surowicy dwóch krazacych markerów nowotworowych: CA-125 i HE4, stworzono ROMA (Risk of ovarian malignancy algorithm), algorytm oceny ryzyka obecnosci raka nablonkowego jajnika oraz prawdopodobienstwa, ze istniejaca zmiana w miednicy malej o niejasnym statusie ma charakter zlosliwy. Pomimo postepów nie ma zadnego badania laboratoryjnego, w tym równiez markera nowotworowego, ani zestawu badan, które pozwalalyby na wczesne i pewne rozpoznanie raka jajnika. PL 442379 A1 3/37Podstawy dzialania przedmiotu wynalazku Wiadomo, ze proces inicjacji, wzrostu i przerzutowania komórek nowotworu zlosliwego przebiega przy udziale wielu czynników, w tym wielu enzymów, w szczególnosci enzymów hydrolitycznych, zwlaszcza proteolitycznych. Takie enzymy katalizuja rozpad enzymatyczny (hydrolityczny lub proteolityczny) bialek i peptydów na mniejsze ich fragmenty. Proces ten umozliwia komórkom nowotworowym rozrost przez kolonizacje nowych tkanek, wzmozenie procesu tworzenia naczyn krwionosnych (angiogenezy), co umozliwia efektywne dostarczanie substancji odzywczych do guza nowotworowego. Ponadto, enzymy te powstaja takze w wyniku obumierania komórek zdrowych na skutek procesu rozrostu guza. Wszystkie te procesy tworza charakterystyczny i swoisty profil aktywnosci enzymatycznej (proteolitycznej) komórek nowotworowych, charakterystyczny dla guza nowotworowego. Znane sa w dziedzinie chromogeniczne czasteczki peptydowe, które ulegaja rozpadowi enzymatycznemu na mniejsze fragmenty z powstaniem zmiany lub wzrostu zabarwienia badanego roztworu. Ten efekt chromogeniczny jest nastepstwem uwalniania chromoforu (np. 4-anilidu lub kwasu 2-amino-benzoesowego) z chromogenicznej czasteczki peptydowej. Tego typu chromogeniczne czasteczki peptydowe i ich zastosowania znane sa, przykladowo, z publikacji autorstwa Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W., "The preparation and properties of two new chromogenie substrates oftrypsin", Arch Biochem Biophys., listopad 1961; 95:271-8 oraz Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K. Amino acids and peptides. XXXV. "Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method", Chem Pharm Bull (Tokyo), listopad 2000; 48(11):1740-4. Jak dotad nie opisano jednak zastosowania tej klasy zwiazków w diagnostyce raka jajnika. W stanie techniki znane sa takze sposoby otrzymywania peptydów chromogenicznych polegajace na przylaczaniu poszczególnych elementów skladowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Taki proces przylaczania sklada sie z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) sa przylaczane, pozostalosci odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla kazdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od zywicy poprzez reakcje w warunkach kwasowych. Kolejno roztwór oddzielany jest od zywicy w procesie saczenia, a nastepnie z otrzymanego roztworu peptyd wytracany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym. PL 442379 A1 4/37W stanie techniki nie sa znane jednakze ani chromogeniczne zwiazki peptydowe odpowiednie do swoistego i wczesnego diagnozowania raka jajnika, ani sposoby ich otrzymywania. W dziedzinie istnieje zatem pilne zapotrzebowanie na „marker nowotworowy" raka jajnika, który pozwalalby na wczesne, czule i swoiste rozpoznanie raka jajnika w sposób nieinwazyjny i wiarygodny oraz na sposoby diagnostyczne i sposoby leczenia wykorzystujace taki marker diagnostyczny. Celem wynalazku jest zatem dostarczenia nowego, swoistego markera diagnostycznego raka jajnika oraz sposobów diagnostycznych wykorzystujacych taki marker do bezinwazyjnego, szybkiego, czulego, swoistego, wczesnego wykrywania raka jajnika, który bylby odpowiedni takze do badan przesiewowych, a takze sposobów leczenia wykorzystujacych taki marker. Cele te zrealizowano dzieki wynalazkom zdefiniowanym w zalaczonych zastrzezeniach patentowych, przy czym korzystne ich warianty zostaly zdefiniowane w zastrzezeniach zaleznych. Krótki opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zwiazek o wzorze 1: Xl 1-Asp 2 -Thr'-Phe 4 -Ile -X2 6 (wzór 1), przy czym Xl zawiera czasteczke Cl lub sklada sie z takiej czasteczki, a X2 zawiera czasteczke C2 lub sklada sie z takiej czasteczki, przy czym pare czasteczek C 1 i C2 stanowi para donora fluorescencji akceptora fluorescencji, i przy czym zwiazek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty Xl-Asp-Thr-Phe Ile-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnalu optycznego poprzez separacje przestrzenna czasteczek Cl i C2. Taki wiazek wedlug wynalazku ulega korzystnie rozpadowi hydrolitycznemu, korzystniej proteolitycznemu. Korzystnie w zwiazku wedlug wynalazku para czasteczek C 1 i C2 jest wybrana jest z grupy skladajacej sie z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2- nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-N02), korzystniej pare Cl i C2 stanowi (ABZ)/pNA lub ABZ/ANB-NH2. Korzystnie zwiazek wedlug wynalazku stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA(wzór 3). PL 442379 A1 /37Korzystniej zwiazek wedlug wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem nastepujacego fragmentu 1: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób in vitro wykrywania aktywnosci enzymatycznej obecnej w plynie ustrojowym osobnika, w szczególnosci pochodzacej z komórek raka jajnika, obejmujacy: a) kontaktowanie próbki plynu ustrojowego ze zwiazkiem o wzorze 1: Xl 1-Asp 2 -Thr3-Phe 4 -Ile -X2 6 (wzór 1), przy czym Xl zawiera czasteczke Cl lub sklada sie z takiej czasteczki, a X2 zawiera czasteczke C2 lub sklada sie z takiej czasteczki, przy czym pare czasteczek C 1 i C2 stanowi para donora fluorescencji akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany zwiazek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty Xl-Asp Thr-Phe-Ile-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i b) wykrywanie mierzalnego sygnalu optycznego, który powstaje poprzez separacje przestrzenna czasteczek C 1 i C2. W takim sposobie wykrywania aktywnosci enzymatycznej wedlug wynalazku aktywnosc enzymatyczna stanowi korzystnie aktywnosc hydrolityczna, korzystniej aktywnosc proteolityczna. W takim sposobie wykrywania aktywnosci enzymatycznej wedlug wynalazku jako wspomniany zwiazek korzystnie stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA(wzór 3). W takim sposobie wykrywania aktywnosci enzymatycznej wedlug wynalazku jako wspomniany plyn ustrojowy stosuje sie mocz, korzystnie mocz ludzki. Przedmiotem wynalazku jest takze sposób in vitro diagnozowania raka jajnika, w którym wykrywa sie obecnosc lub nieobecnosc raka jajnika u osobnika poprzez pomiar w próbce plynu ustrojowego od osobnika badanego aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika, przy czym brak wspomnianej aktywnosci enzymatycznej wskazuje na nieobecnosc raka jajnika, zas obecnosc wspomnianej aktywnosci enzymatycznej wskazuje na obecnosc raka jajnika. W takim sposobie wykrywania/ diagnozowania raka jajnika wedlug wynalazku wykrywanie aktywnosci enzymatycznej przeprowadza sie sposobem wykrywania aktywnosci enzymatycznej jak okreslono powyzej. W takim sposobie wykrywania / diagnozowania raka jajnika wedlug wynalazku do pomiaru wspomnianej aktywnosci enzymatycznej stosuje sie zwiazek o wzorze 1: PL 442379 A1 6/37Xl 1 - Asp 2 -Thr3-Phe 4 -Ile -X2 6 (wzór 1), przy czym Xl zawiera czasteczke Cl lub sklada sie z takiej czasteczki, a X2 zawiera czasteczke C2 lub sklada sie z takiej czasteczki, przy czym pare czasteczek C 1 i C2 stanowi para donora fluorescencji akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany zwiazek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty Xl-Asp Thr-Phe-Ile-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnalu optycznego poprzez separacje przestrzenna czasteczek Cl i C2. W takim sposobie wykrywania / diagnozowania raka jajnika wedlug wynalazku wspomniana próbke plynu ustrojowego korzystnie inkubuje sie ze wspomnianym zwiazkiem w buforze pomiarowym o pH obojetnym lub pH zasadowym, korzystniej fizjologicznym, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10 korzystnie 1:5 próbki do buforu pomiarowego. W takim sposobie wykrywania / diagnozowania raka jajnika wedlug wynalazku wspomniany zwiazek korzystnie stosuje sie w stezeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególnosci 0,25- 7,5 mg/ml. W takim sposobie wykrywania / diagnozowania raka jajnika wedlug wynalazku jako wspomniany zwiazek korzystnie stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile ANB-NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA W takim sposobie wykrywania / diagnozowania raka jajnika wedlug wynalazku jako wspomniana próbke korzystnie stosuje sie próbke moczu, korzystniej moczu ludzkiego. W takim sposobie wykrywania / diagnozowania raka jajnika wedlug wynalazku pomiar wspomnianej aktywnosci enzymatycznej korzystnie obejmuje pomiar intensywnosci absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystniej 380-430 nm, w szczególnosci 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedzialu 25-40 °C, korzystniej 36-38 °C. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw zawierajacy dowolny zwiazek wedlug wynalazku jak okreslono powyzej i bufor pomiarowy. W takim zestawie wedlug wynalazku zwiazek korzystnie stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA Przedmiotem wynalazku jest takze zastosowanie dowolnego zwiazku wedlug wynalazku jak okreslono powyzej do wykrywania aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika. Przedmiotem wynalazku jest równiez zastosowanie dowolnego zwiazku wedlug wynalazku jak okreslono powyzej do diagnozowania raka jajnika. PL 442379 A1 7/37Korzystnie w takim zastosowaniu diagnozowanie raka jajnika obejmuje wykrywanie pierwotnego raka jajnika, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka jajnika i/lub wykrywanie wznowy raka jajnika. Korzystnie zwiazek w takich zastosowaniach wedlug wynalazku stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA. Przedmiotem wynalazku jest ponadto dowolny zwiazek wedlug wynalazku jak okreslono powyzej do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka jajnika. Korzystnie taki zwiazek do zastosowania jako marker diagnostyczny wedlug wynalazku stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób leczenia raka jajnika, w którym a) wykrywa sie obecnosc aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika dowolnym sposobem jak okreslono powyzej w próbce plynu ustrojowego od osobnika badanego, i b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi sie wystepowanie wspomnianej aktywnosci enzymatycznej, podejmuje sie leczenie raka jajnika u osobnika. Korzystnie w takim sposobie leczenia wedlug wynalazku po zakonczeniu leczenia zgodnie z punktem b ), przeprowadza sie monitorowanie wspomnianej aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika w okreslonych odstepach czasu. Korzystnie w takim sposobie leczenia wedlug wynalazku jako próbke stosuje sie próbke moczu, korzystnie moczu ludzkiego. Korzystnie w takim sposobie leczenia wedlug wynalazku jako wspomniany zwiazek stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ- Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ Asp-Thr-Phe-Ile-pNA. Szczególowy opis wynalazku Nalezy rozumiec, ze niniejszy wynalazek jest zdefiniowany w zalaczonych zastrzezeniach. Niniejszy opis ilustruje rózne, nieograniczajace, wykonania wynalazku i przyklady jego realizacji. Niniejszy wynalazek nie ogranicza sie do jakiejkolwiek konkretnej metodologii, protokolu czy odczynników stosowanych do jego realizacji, o ile nie wskazano inaczej. Zastosowane pojecia oraz okreslenia naukowe i techniczne maja znaczenia powszechnie znane i stosowane przez specjalistów w dziedzinie niniejszego wynalazku. Dla wyjasnienia jednak nastepujace okreslenia i skróty zastosowane w opisie i zastrzezeniach patentowych, nalezy rozumiec nastepujaco: PL 442379 A1 8/37Zwiazek chromogeniczny lub inaczej czasteczka chromogeniczna oznacza zwiazek posiadajacy wlasciwosci chromogeniczne. Wlasciwosci chromogeniczne oznaczaja zdolnosc zwiazku do tworzenia produktu barwnego. Zwiazek fluorescencyjny lub inaczej czasteczka fluorogeniczna oznacza zwiazek posiadajacy wlasciwosci fluorogeniczne. Wlasciwosci fluorogeniczne oznaczaja zdolnosc zwiazku do tworzenia produktu emitujacego fluorescencje. NMP to N-metylopirolidon; DMF to dimetyloformamid; DCM to chlorek metylenu, inaczej dichlorometan; pNA to 4-nitroanilina, inaczej para-nitroanilina; ABZ to kwas 2- aminobeznoesowy, ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego; Boc to grupa tert-butyloksykarbonylowa; Fmoc to grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa; zas TFA to kwas trifluorooctowy. W kontekscie niniejszego wynalazku p0Jec1e rak jajnika nalezy rozumiec jako rak (nowotwór zlosliwy) pierwotny jajnika rozwijajacy sie z tkanek znajdujacych sie w jajniku Rakiem jajnika jest najczesciej gruczolak endometrialny (ok. 90%); rzadziej rak surowiczy jasnokomórkowy. Stosowane tu pojecie rak jajnika obejmuje zatem wszelkie nowotwory zlosliwe jajnika rozwijajace sie z tkanek znajdujacych sie w jajniku. W kontekscie niniejszego wynalazku pojecie diagnozowanie raka jajnika nalezy rozumiec jako rozpoznanie tej choroby, w szczególnosci na jej wczesnym etapie, na którym inne metody diagnostyczne sa zbyt malo czule i/lub swoiste. W stosowanym tu znaczeniu diagnozowanie raka jajnika obejmuje takze wykrywanie choroby resztkowej po chirurgicznym wycieciu raka jajnika oraz wykrywanie wznowy raka jajnika po wczesniej zakonczonym leczeniu raka jajnika. W kontekscie niniejszego wynalazku pojecie leczenie raka jajnika nalezy rozumiec jako leczenie na wczesnym etapie rozwoju choroby, pozwalajace na istotne wydluzenie czasu przezycia oraz poprawe jakosci zycia chorych. W kontekscie niniejszego wynalazku pojecie monitorowanie nalezy rozumiec jako diagnostyke choroby resztkowej (ang. Minimal Residual Disease (MRD))- obecnosci malej liczby przetrwalych w organizmie (w trakcie leczenia lub w remisji) komórek nowotworowych, w ilosciach niewykrywanych standardowo stosowanymi metodami diagnostycznymi. W kontekscie niniejszego wynalazku pojecie osobnik nalezy rozumiec jako czlowieka lub ssaka, u którego podejrzewa sie wystepowanie raka jajnika, ewentualnie jako czlowieka lub ssaka nalezacego do grupy zwiekszonego ryzyka wystapienia raka jajnika, albo czlowieka PL 442379 A1 9/37lub ssaka po resekcji raka jajnika, lub po zakonczonym leczeniu raka jajnika. Osobnikiem jest korzystnie czlowiek. Zwiazki wedlug wynalazku maja wlasciwosci chromogeniczne dzieki obecnosci chromofora oraz fluorogeniczne, tj. zawieraja czasteczki donora i akceptora fluorescencji. Dzieki swojej budowie, opracowanej w taki sposób, ze obserwowany jest wzrost barwy w przedziale dlugosci fali 380-440 nm swoiscie w wyniku kontaktu badanej próbki plynu ustrojowego od osobnika badanego z rakiem jajnika, a jednoczesnie nie jest obserwowany taki efekt w reakcji z próbka plynu ustrojowego osobnika zdrowego lub z diagnoza innego typu nowotworu, zwiazki te pozwalaja na wykrywanie aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika, a w szczególnosci diagnozowanie raka jajnika w sposób swoisty i czuly, równiez na wczesnym etapie rozwoju tego raka. Osobnikiem badanym jest korzystnie czlowiek. Plynem ustrojowym jest korzystnie mocz, korzystniej ludzki. W pierwszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest nowy zwiazek chemiczny o wzorze 1: Xl 1 -Asp 2 -Thr'-Phe 4 -Ile -X2 6 (wzór 1), przy czym Xl stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierajacy czasteczke Cl lub Xl sklada sie z takiej czasteczki Cl, a X2 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierajacy czasteczke C2 lub Xl sklada sie z takiej czasteczki C2, przy czym pare czasteczek Cl i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji. Cyfry w indeksie górnym oznaczaja kolejne pozycje reszt w zwiazku wedlug wynalazku oraz kolejnosc ich dolaczania podczas syntezy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem mozna w tym kontekscie wymiennie stosowac takze zapis wzoru 1 bez podawania numeracji reszt. Rdzen wszystkich zwiazków wedlug wynalazku stanowi tetrapeptyd o wskazanej sekwencji 4 aminokwasów, tj. Asp-Thr-Phe-Ile (zapis w formacie trójliterowych skrótów aminokwasów równowazny z zapisem DTFI w formacie jednoliterowych skrótów aminokwasów), która to sekwencje przedstawiono takze w Wykazie sekwencji jako sekwencje nr 1. Zwiazek wedlug ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty Xl-Asp-Thr-Phe-Ile-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnalu optycznego poprzez separacje przestrzenna czasteczek Cl i C2. Taki mierzalny sygnal optyczny jest mierzony sposobem pomiaru zmiany absorpcji/fluorescencji po rozpadzie enzymatycznym zwiazku. Korzystnie czasteczki C 1 i C2 sa rozdzielone od siebie nie wiecej niz 1 O resztami aminokwasowymi, co zapewnia wydajne wygaszanie donora fluorescencji przez akceptor fluorescencji. Dla znawcy oczywistym jest, ze kluczowym czynnikiem jest odleglosc PL 442379 A1 /37pomiedzy donorem i akceptorem fluorescencji. Zatem, w przypadkach, gdy sekwencja aminokwasowa oddzielajaca czasteczke Cl i C2 jest zwinieta w skrecona lub skondensowana strukture drugorzedowa, skutkujaca zblizeniem czasteczek Cl i C2 w stosunku do struktury pierwszorzedowej, odleglosc miedzy czasteczkami C 1 i C2 moze byc wieksza niz 1 O reszt aminokwasowych. Taki zwiazek, dzieki swoim wlasciwosciom chromogenicznym oraz posiadaniu miejsca reaktywnego w pozycji 5 pozwalajacego na rozpad enzymatyczny (korzystnie proteolityczny) na mniejsze fragmenty, jest szczególnie odpowiedni do stosowania go jako marker diagnostyczny, w szczególnosci swoisty marker diagnostyczny raka jajnika, w szczególnosci do zastosowania we wczesnym wykrywaniu raka jajnika. W korzystnych wykonaniach zwiazek wedlug wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystniej proteolitycznemu. W korzystnych wykonaniach para czasteczek C 1 i C2 jest wybrana jest z grupy skladajacej sie z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), przy czym korzystniej pare czasteczek Cl i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2. W korzystnych wykonaniach zwiazek wedlug wynalazku stanowi: zwiazek o wzorze 2: ABZ 1 -Asp 2 -Thr3-Phe 4 -Ile -ANB 6 -NH2 (wzór 2), lub zwiazek o wzorze 3: ABZ 1 -Asp 2 -Thr3-Phe 4 -Ile -pNA 6 (wzór 3), w których ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5- amino-2-nitrobenzoesowego, zas pNA oznacza 4-aniline. Taki zwiazek ulega korzystniej rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem nastepujacego fragmentu 1: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2 w przypadku zwiazku o wzorze 2, zas w przypadku zwiazku o wzorze 3 z powstaniem nastepujacego fragmentu 1: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-OH oraz fragmentu 2: pNA. Fragmenty 2 stanowia zatem chromofory w postaci wolnej. Separacja przestrzenna czasteczek C 1 i C2 bedaca nastepstwem rozpadu enzymatycznego zwiazku wedlug wynalazku powoduje powstanie mierzalnego sygnalu optycznego, poniewaz fluorescencja emitowana z donora fluorescencji nie jest juz wygaszana przez akceptor fluorescencji. Taki mierzalny sygnal optyczny mozna wykrywac korzystnie przy dlugosci fali 300-500 nm, korzystniej 380-430 nm. PL 442379 A1 11/37Zwiazki wedlug wynalazku mozna otrzymywac znanymi sposobami. Przykladowo mozna je otrzymac z zastosowaniem sposobu otrzymywania peptydów chromogenicznych polegajacego na prowadzeniu procesu na nosniku w postaci zywicy, posiadajacej grupe Fmoc, która usuwa sie w trakcie prowadzenia reakcji. Przykladowo moze to byc zywica amidowa, np. TentaGel S RAM lub RinkAmide, ale mozna takze zastosowac dowolna inna zywice dostepna na rynku. Uzywana zywica do prowadzenia tego procesu powinna zostac odpowiednio przygotowana. Przygotowanie tej zywicy polega na zwiekszeniu jej objetosci poprzez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi. Korzystnie stosuje sie zywice o osadzeniu 0,23 mmol/g. Z zywicy tej nalezy usunac grupe ochronna Fmoc poprzez przemywanie 20% roztworem rozpuszczalnika. Nastepnie, znane procesy otrzymywania peptydów chromogenicznych obejmuja przylaczanie poszczególnych elementów skladowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Ten proces przylaczania sklada sie z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) sa przylaczane, pozostalosci odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla kazdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od zywicy poprzez reakcje w warunkach kwasowych. Nastepnie roztwór oddzielany jest od zywicy w procesie saczenia, a nastepnie z otrzymanego roztworu peptyd wytracany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym. Uzyskany w ten sposób osad peptydu jest wirowany. Przykladowy, szczególowy ale nieograniczajacy, sposób syntezy zwiazków wedlug wynalazku opisano ponizej i w Przykladzie 1 ponizej. Sposób syntezy zwiazków wedlug wynalazku polega na tym, ze proces prowadzi sie na nosniku w postaci zywicy, korzystnie posiadajacej grupe Fmoc, przy czym nosnik przed rozpoczeciem procesu przygotowuje sie poprzez zwiekszenie jego objetosci przez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi, korzystnie dimetyloformamidem, chlorkiem metylenu lub N-metylopirolidonem, i usuniecie grupy ochronnej Fmoc, korzystnie poprzez przemywanie 10 - 30 % roztworem piperydyny, w rozpuszczalnikach, takich jak dimetyloformamid, chlorek metylenu lub N-metylopirolidon. Nastepnie przeprowadza sie sposób w kolejnych etapach: a) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego ANB (lub innego chromoforu odpowiedniego do zastosowania zgodnie z wynalazkiem jak zdefiniowano w zastrzezeniach) na zywicy poprzedza sie przemyciem nosnika 3-6% roztworem N metylomorfoliny (NMM) w DMF, a nastepnie DMF, po czym przygotowuje sie roztwór ANB w DMF, do którego dodaje sie kolejno TBTU, DMAP, a na koniec PL 442379 A1 12/37diizopropyloetyloamine (DIPEA) w nastepujacych nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3 :3 :2:6, tak przygotowana mieszanine dodaje sie do zywicy i miesza sie do uzyskania jednorodnosci, po czym zywice odsacza sie pod zmniejszonym cisnieniem i przemywa rozpuszczalnikami, takimi jak DMF, DCM i izopropanolem, a nastepnie kontynuuje sie przylaczanie ANB do zywicy poprzez zastosowanie heksafluorofosforanu O-(7-azabenzotriazol-l -ilo )-N,N,N ',N - tetrametylouroniowego (HATU), a potem heksafluorofosforanu O-(benzotriazol-l-ilo) N,N,N'N'-tetrametylouroniowego (HBTU) w ilosciach nadmiarowych, a po zakonczeniu przemywa sie nosnik kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i lagodnie suszy sie; b) przylaczanie reszty aminokwasowej do ANB prowadzi sie poprzez reakcje z pochodna aminokwasowa Fmoc-Ile-OH, przy czym co najmniej pieciokrotny nadmiar molowy pochodnej aminokwasowej w stosunku do zywicy rozpuszcza sie w bezwodnej pirydynie i kontaktuje sie z zywica z osadzonym ANB, po czym calosc chlodzi sie do temperatury nie nizszej niz -20°C, a nastepnie dodaje sie POCb w stosunku 1: 1 do uzytej ilosci pochodnej aminokwasowej i calosc miesza sie, po czym proces mieszania prowadzi sie w temperaturze pokojowej, a nastepnie w podwyzszonej temperaturze, zas po zakonczeniu reakcji zywice odsacza sie pod zmniejszonym cisnieniem, przemywa sie DMF oraz MeOH i lagodnie suszy sie, po czym uzyskany zwiazek przejsciowy poddaje sie procesowi acylowania przylaczajac kolejno fragment Asp-Thr-Phe; c) acylowanie uzyskanego zwiazku przejsciowego prowadzi sie przy zastosowaniu pochodnej aminokwasowej, korzystnie Fmoc-Phe-OH, i kolejno Fmoc-Thr(tBu)-OH, nastepnie Fmoc-Asp(OtBu)-OH i w koncowym etapie syntezy Boc-Abz-OH, przy czym acylowanie prowadzi sie etapowo od reszty 6 do 1 z wykorzystaniem diizopropylokarbodiimidu jako srodka sprzegajacego, który stosuje sie w nadmiarze, a po zakonczeniu kazdego etapu zywice przemywa sie DMF, i korzystnie podaje testowi chloroanilowemu (test na obecnosc wolnych grup aminowych), w którym monitoruje sie przylaczenia pochodnej aminokwasowej; d) usuniecie grupy ochronnej Fmoc prowadzi sie poprzez przemywanie roztworem 1 O - % piperydyny w DMF i kolejnymi przemywaniami kazdym z rozpuszczalników: DMF, izopropanolem i chlorkiem metylenu, e) odszczepianie peptydu od zywicy przeprowadza sie stosujac mieszanine TFA:fenol:woda:TIPS przy zachowaniu stosunków odpowiednio 88:5:5:2 v/v/v/v, przy czym mieszanine miesza sie przez okres co najmniej jednej godziny, korzystnie trzy PL 442379 A1 13/37godziny, a uzyskany osad odsacza sie pod zmniejszonym cisnieniem, po czym przemywa sie eterem dietylowym i uzyskany peptyd odwirowuje sie; f) przygotowanie gotowego produktu przeprowadza sie poprzez rozpuszczenie peptydu w wodzie przy pomocy ultradzwieków, a nastepnie poddaje liofilizacji. W drugim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro wykrywania aktywnosci enzymatycznej, korzystnie proteolitycznej, obecnej w plynie ustrojowym osobnika, w szczególnosci pochodzacej z komórek raka jajnika, obejmujacy a) kontaktowanie próbki plynu ustrojowego ze zwiazkiem wedlug wynalazku i b) wykrywanie mierzalnego sygnalu optycznego, który powstaje poprzez separacje przestrzenna czasteczek obecnych w zwiazku wedlug wynalazku C 1 i C2. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem badanym jest w takim przypadku czlowiek. W innym korzystnym wykonaniu tego aspektu plynem ustrojowym jest mocz, w szczególnosci ludzki. W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe Ile-ANB-NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA. W trzecim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro diagnozowania raka jajnika, w którym wykrywa sie obecnosc lub nieobecnosc raka jajnika u osobnika poprzez pomiar w próbce plynu ustrojowego od osobnika badanego aktywnosci enzymatycznej, swoistej dla raka jajnika, przy czym brak wspomnianej aktywnosci enzymatycznej wskazuje na nieobecnosc raka jajnika, zas obecnosc wspomnianej aktywnosci enzymatycznej wskazuje na obecnosc raka jajnika. Takie wykrywanie aktywnosci enzymatycznej korzystnie przeprowadza sie z zastosowaniem sposobów wykrywania aktywnosci enzymatycznej jak omówiono powyzej. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem jest czlowiek. W korzystnym wykonaniu tego aspektu plynem ustrojowym jest mocz, w szczególnosci ludzki. W korzystnym wykonaniu tego aspektu aktywnosc enzymatyczna swoista dla raka jajnika stanowi aktywnosc proteolityczna. W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile ANB-NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA. Ponadto, w korzystnym wykonaniu tego aspektu pomiar wspomnianej aktywnosci enzymatycznej w sposobach wedlug wynalazku obejmuje pomiar intensywnosci absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwlaszcza 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40 °C, korzystnie 36-38 °C. Dzieki, czemu otrzymuje sie maksymalnie intensywny mierzalny sygnal optyczny wynikajacy ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji. PL 442379 A1 14/37Ponadto, w korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów wedlug wynalazku prowadzi sie pomiar wspomnianej aktywnosci enzymatycznej z zastosowaniem zwiazku wedlug wynalazku w zakresie stezen O, 1-1 O mg/ml, korzystniej w stezeniu 1 mg/ml. W korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów wedlug wynalazku badana próbke inkubuje sie ze zwiazkiem wedlug wynalazku w buforze pomiarowym o pH obojetnym lub zasadowym, korzystnie fizjologicznym, z próbka plynu ustrojowego, korzystnie ludzkiego moczu, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10, korzystnie 1:5 próbki (np. moczu) do buforu pomiarowego. Próbka korzystnie pochodzi od osoby skierowanej do diagnozy raka jajnika. Korzystnie mierzy sie intensywnosc absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380- 430 nm, zwlaszcza 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40 °C, korzystnie 36-38 °C. W powyzszych warunkach otrzymujemy maksymalnie intensywny mierzalny sygnal optyczny wynikajacy ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji. W czwartym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zestaw zawierajacy dowolny zwiazek wedlug wynalazku i bufor pomiarowy. Bufory pomiarowe znane sa w dziedzinie, przy czym odpowiedni do zastosowania w zestawie wedlug wynalazku bufor to na przyklad, ale nieograniczajaco, bufor Tris-HCL W korzystnym wykonaniu w takim zestawie wedlug wynalazku wspomniany zwiazek stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA. W piatym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zastosowanie zwiazku wedlug wynalazku do wykrywania aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika. W szóstym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zastosowanie zwiazku wedlug wynalazku do diagnozowania raka jajnika. Korzystnie diagnozowanie raka jajnika obejmuje zgodnie z wynalazkiem wykrywanie pierwotnego raka jajnika, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka jajnika i/lub wykrywanie wznowy raka jajnika po zakonczonym wczesniej leczeniu raka jajnika. W siódmym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zwiazek wedlug wynalazku do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka jajnika. W korzystnych wykonaniach tego aspektu takim zwiazkiem jest zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe Ile-ANB-NH2 lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA. W ósmym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza sposób leczenia raka jajnika, w którym a) wykrywa sie obecnosc aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika dowolnym sposobem wedlug wynalazku jak okreslono powyzej w próbce plynu ustrojowego od osobnika badanego, i PL 442379 A1 /37b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi sie wystepowanie wspomnianej aktywnosci enzymatycznej, podejmuje sie leczenie raka jajnika u osobnika. W korzystnym wykonaniu takiego sposobu leczenia po zakonczeniu leczenia zgodnie z punktem b ), przeprowadza sie monitorowanie wspomnianej aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika w okreslonych odstepach czasu jak wiadomo w dziedzinie, np. co tydzien, co kilka tygodni, co miesiac, co kilka miesiecy, co rok lub w dowolnych innych odstepach uznanych przez specjaliste za stosowne, celem wykrywania choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka jajnika lub pojawienia sie wznowy. Ponadto, w korzystnym wykonaniu takiego sposobu leczenia jako próbke do badania stosuje sie próbke moczu, korzystnie moczu ludzkiego. W korzystnym wykonaniu takiego sposobu leczenia jako wspomniany zwiazek stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA (wzór 3). Zalety niniejszego wynalazku polegaja na dostarczeniu nowego zwiazku chemicznego o wlasciwosciach sprawiajacych, ze nadaje sie on do zastosowania do czulego i swoistego wykrywania aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika, do zastosowania jako biomarker diagnostyczny do wykrywania raka jajnika, do zastosowania do szybkiego, bezinwazyjnego diagnozowania raka jajnika, pozwalajacego przy tym na wykrywanie raka jajnika na wczesnym etapie jego rozwoju. Kolejna zaleta jest to, ze sposoby diagnostyczne wedlug wynalazku moga byc z powodzeniem stosowane w badaniach przesiewowych. Daje to mozliwosc wykonania pelnej diagnostyki na wczesnym etapie rozwoju nowotworu i w konsekwencji skuteczniejszego leczenia. Wczesne rozpoznanie daje mozliwosc leczenia operacyjnego, które znaczaco wydluza przezycie pacjenta. Jest to takze istotne w przypadku monitorowania skutecznosci przeprowadzonego leczenia chirurgicznego i/lub chemioterapeutycznego raka jajnika, dzieki mozliwosci wykrywania choroby resztkowej lub ewentualnej wznowy. Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany na ponizszych figurach i w ponizszych przykladach, które jednak nie maja na celu ograniczenia w zaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzezeniach patentowych. Krótki opis figur Fig. 1 przedstawia wyniki analizy chromatograficznej rozpadu substratu, tj. ABZ- Asp-Thr Phe-Ile -ANB-NH2, w próbce moczu od osobnika z rakiem jajnika. Fig. 2 przedstawia stopien hydrolizy substratu - ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile ANB-NH2 - w próbkach moczu pochodzacych od osób ze zdiagnozowanym rakiem jajnika (próbki 1-20) i PL 442379 A1 16/37moczu pochodzacych od osób zdrowych (Z21-Z40). Cyfry arabskie oznaczaja numer wybranej próbki moczu. Fig. 3 przedstawia selektywnosc hydrolizy substratu - ABZ 1 -Asp 2 -Thr3-Phe 4 -Ile -ANB 6 - NH2 (tj. zwiazku o wzorze 2) w próbkach moczu pochodzacych od osób ze zdiagnozowanym rakiem jajnika (próbka 1) i moczu pochodzacych od osób z diagnoza innej choroby nowotworowej (próbki 2-9). Cyfry arabskie oznaczaja numery poszczególnych rodzajów nowotworów. Badane próbki dla kazdego rodzaju nowotworu pochodzily od 20 róznych pacjentów dla kazdego z badanych nowotworów. Wyniki oznaczaja srednie wartosci dla poszczególnych rodzajów nowotworów. Wyniki te wykazuja selektywnosc rozpadu substratu wobec moczu pacjentów z rakiem jajnika wzgledem próbek moczu od pacjentów chorych na inne nowotwory. Fig. 4 przedstawia zaleznosc stopnia hydrolizy substratu, tj. ABZ 1 - Asp 2 -Thr3-Phe 4 -Ile - NH2, od srodowiska pH. Przyklady Wynalazek ilustruja nastepujace przyklady wykonania, niestanowiace jednak jego ograniczenia. O ile nie wskazano inaczej, w ponizszych przykladach stosowano znane i/lub komercyjnie dostepne urzadzenia, metody, warunki reakcji, odczynniki i zestawy, takie jakie powszechnie stosuje sie w dziedzinie, do której nalezy niniejszy wynalazek i jakie sa zalecane przez wytwórców odpowiednich odczynników i zestawów. Przyklad 1: Synteza zwiazku wedlug wynalazku W przykladzie tym przedstawiono synteze reprezentatywnego zwiazku wedlug niniejszego wynalazku, mianowicie zwiazku: ABZ 1 -Asp 2 -Thr3-Phe 4 -Ile -ANB 6 -NH2. Pozostale peptydy wedlug wynalazku mozna zsyntetyzowac w analogiczny sposób. Cyfry w indeksie górnym oznaczaja kolejne pozycje reszt w zwiazku wedlug wynalazku oraz kolejnosc ich dolaczania podczas syntezy. Zwiazki wedlug wynalazku mozna zamiennie przedstawiac analogicznym wzorem bez podawania pozycji reszt, co nie zmienia kolejnosci reszt w zwiazkach wedlug wynalazku, gdyz pozostaje ona bez zmian. 1. Otrzymanie peptydu chromogenicznego a) Pierwszym etapem syntezy bylo otrzymanie peptydu chromogenicznego który otrzymano metoda syntezy w fazie stalej - na nosniku stalym - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z uzyciem oslon. Zwiazek o sekwencji ABZ 1 - Asp 2 -Thr3-Phe 4 -Ile -ANB 6 -NH2, gdzie ABZ oznacza kwas 2- aminobenzoesowy, a ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zas ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stalej z PL 442379 A1 17/37wykorzystaniem nastepujacych pochodnych aminokwasowych: Boc-ABZ, Fmoc Asp(OtBu), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Ile. Synteze zwiazku wedlug wynalazku, który moze byc stosowany jako marker diagnostyczny do wykrywania raka jajnika, prowadzono na nosniku stalym umozliwiajacym przeksztalcenie kwasu 5-amino-2-beznoesowego w amid ANB-NH2, mianowicie zywicy amidowej TentaGel SRAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) o osadzeniu 0,23 mmol/g. Mozna jednakze zastosowac dowolna inna zywice amidowa, np. Rink Amide (Niemcy). Synteze zwiazku prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrzasarki laboratoryjnej. Przez wiekszosc etapów reaktorami byla strzykawka zakonczona spiekiem do syntezy w fazie stalej o pojemnosci 25 ml. Wszystkie otrzymywane koncowe zwiazki zawieraly w swojej sekwencji w pozycji 1, czyli na N-koncu, kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ), zas w pozycji 6, czyli na C-koncu, czasteczke kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB). ABZ pelni tu role donora fluorescencji, natomiast ANB - kwas 5-amino-2-benzoesowy pelni role wygaszacza fluorescencji i jednoczesnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawieraly co najmniej i korzystnie jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiedzy reszta aminokwasowa Ile ANB-NH2, tj. w pozycji 5 zwiazku. Synteze polegajaca na przylaczaniu pochodnych aminokwasowych prowadzi sie od reszty 6 do 1, czyli od konca C do N. b) Osadzenie ANB na zywicy TentaGel S RAM: Synteze peptydów wykonano na zywicy TentaGel SRAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie przygotowano zywice, w tym dokonano spulchnienia zywicy poprzez cykl przemywan. Kolejno przystapiono do usuniecia z nosnika oslony grupy aminowej Fmoc za pomoca 20% roztworu piperydyny w NMP. Nastepnie przeprowadzono cykl przemywan rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecnosci wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy. Cykl przemywan rozpuszczalnikami: DMF 1 x 1 O minut; IsOH 1 x 1 O minut; DCM 1 x 1 O minut. Usuniecie oslony Fmoc: DMF 1 x 5 minut; 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut. Cykl przemywan rozpuszczalnikami: DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty. c) Test chloranilowy: PL 442379 A1 18/37Test chloranilowy polegal na przeniesieniu, za pomoca lopatki, kilku ziaren zywicy z reaktora - strzykawki - do szklanej ampulki, do której nastepnie dodano 100 µl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 µl swiezego aldehydu octowego. Po uplywie 1 O minut przeprowadzono kontrole zabarwienia ziaren. N a tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które swiadczylo o obecnosci wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usuniecia oslon 9- fluorenylometoksykarbonylowych z zywicy mozna bylo przystapic do kolejnego etapu, przylaczania pochodnej ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenozesowego ). d) Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nosniku stalym: Pierwszym etapem syntezy peptydu bylo osadzenie ANB na 1 g zywicy. Przed przylaczeniem chromoforu przemyto zywice uzywana do reakcji nastepujacymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunieto oslone Fmoc- z grupy funkcyjnej nosnika. Jeden cykl usuwania oslony Fmoc- obejmowal nastepujace etapy: Usuniecie oslony Fmoc-: % piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut. e) Przemywanie DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty. f) Test chloranilowy: Zywice z wolna grupa aminowa przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a nastepnie DMF. Procedure usuwania oslony Fmoc- oraz cykl przemywan przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodalano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloamine (DIPEA) w nastepujacych nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6 v/v/v/v. Tak przygotowana mieszanine dodano do zywicy i mieszano przez 3 godziny. Zywice odsaczono pod zmniejszonym cisnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a cala procedure acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przylaczania ANB do zywicy zastosowano heksafluorofosforan-O-(7- azabenzotriazol-l-ilo )-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan-O-(benzotriazol-l-ilo )-N,N,N'N'-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie zywice przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu. g) Przylaczenie C-koncowej reszty aminokwasowej (Fmoc-Ile-OH) do ANB: Odpowiednia pochodna aminokwasowa (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia zywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierajacej zywice PL 442379 A1 19/37z osadzonym ANB. Calosc chlodzono do uzyskania temperatury-15°C (laznia lodowa: 1 cz. wagowa NH4Cl, 1 cz. wagowa NaNO3, 1 cz. wagowa lodu). Po osiagnieciu zadanej temperatury dodano POCh (w stosunku 1: 1 do uzytej ilosci pochodnej aminokwasowej) i calosc mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (laznia olejowa). Po zakonczeniu reakcji zywice odsaczono pod zmniejszonym cisnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia. W kolejnym etapie przylaczono reszte w pozycji P2(Fmoc-Phe(tBu)). Wszystkie przylaczania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem zywicy za pomoca DMF przez 5 minut. W kolejnych przylaczaniach stosowano diizopropylokarbodiimidjako srodek sprzegajacy. Procedure powtarzano dwukrotnie. Po kazdym z acylowan rozpoczynano cykl przemywan zywicy, a nastepnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przylaczania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych zywicy. Cykl przemywan rozpuszczalnikami: DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty. Test chloranilowy: W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzeganiach zabarwienie ziaren najpierw bylo zielone, a nastepnie szare, wiec konieczne bylo przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna zywicy badanej testem chloranilowym byly bezbarwne. Swiadczylo to o przylaczeniu ANB do zywicy TentaGel S RAM, co pozwolilo przejsc do nastepnego etapu syntezy peptydu. h) Przylaczanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych: Zywice wraz z przylaczonym fragmentem ANB-Ile - znajdujaca sie w reaktorku przemyto za pomoca DMF, a nastepnie przystapiono do deprotekcji oslony Fmoc z grupy aminowej w celu przylaczenia chronionej pochodnej aminokwasowej Phe. Usuniecie oslony Fmoc: DMF 1 x 5 minut; 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty; 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut. Cykl przemywan rozpuszczalnikami: DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty. Test chloranilowy: W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym swiadczylo zielone zabarwienie ziaren zywicy. Pozwolilo to na rozpoczecie kolejnego etapu - przylaczania reszty aminokwasowej Fmoc-Thr(tBu)-OH. PL 442379 A1 /37Przylaczanie pochodnej aminokwasowej: Wykonywane sprzegania poprzedzono przemywaniem zywicy w DMF. Podczas przylaczania chronionej reszty seryny sklad mieszaniny sprzegajacej pozostawal bez zmian. Po zakonczeniu kazdego z acylowan stosowano cykl przemywan rozpuszczalnikami wedlug podanej procedury, a nastepnie przeprowadzono test chloranilowy na obecnosc wolnych grup aminowych w roztworze. Cykl przemywan rozpuszczalnikami: DMF 3 x 2 minuty; IsOH 3 x 2 minuty; DCM 3 x 2 minuty. Test chloranilowy: Ziarna zywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu byly bezbarwne, co pozwolilo na przejscie do kolejnego etapu syntezy, jakim bylo wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - Fmoc-Asp(OtBu) i czasteczki kwasu 2- aminobenzoesowego. Procesy sprzegania odbyly sie zgodnie z procedura omówiona wczesniej. Testy przeprowadzone po przylaczeniu wyzeJ wymienionych reszt wykazaly wyniki pozytywne, ziarna zywicy byly bezbarwne. 2. U suwanie peptydu z nosnika Po zakonczeniu syntezy amid peptydu ABZ- Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 usunieto z nosnika wraz z jednoczesnym usunieciem oslon bocznych za pomoca mieszaniny: TFA:fenol:woda:TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v) w kolbie okraglodennej na mieszadle magnetycznym. Po uplywie 3 godzin zawartosc kolby odsaczono pod zmniejszonym cisnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywajac eterem dietylowym. Powstaly osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszczano w wodzie przy pomocy ultradzwieków, a nastepnie poddano liofilizacji. W analogiczny sposób mozna przeprowadzic otrzymywanie pozostalych zwiazków wedlug niniejszego wynalazku. Potwierdzenie tozsamosci/charakterystyke nowego zwiazku wedlug wynalazku przeprowadzono z zastosowaniem analizy HPLC. Warunki tej analizy HPLC byly nastepujace: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8, 250 mm 4 mm, uklad faz A O, 1 % TF A w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przeplyw 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. Przeprowadzona analiza potwierdzila otrzymanie zwiazku wedlug wynalazku. PL 442379 A1 21/37Przyklad 2: Badanie wlasciwosci zwiazku wedlug wynalazku jako markera nowotworowego Badanie aktywnosci nowych zwiazków wedlug wynalazku wykonano na grupie 20 chorych z diagnoza raka jajnika z wykorzystaniem reprezentatywnego zwiazku wedlug wynalazku. Mechanizm dzialania zwiazków wedlug wynalazku, w tym reprezentatywnego zwiazku o wzorze 2, polega na swoistym rozpadzie enzymatycznym, dokladniej hydrolizie enzymatycznej, w takim miejscu, które prowadzi do uwolnienia wolnych czasteczek chromoforów, odpowiednio, ANB-NH2 (amidu kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego) w przypadku zwiazku o wzorze 2 lub pNA (para nitro anilidu) w przypadku zwiazku o wzorze 3, które wykazuja absorbancje przy dlugosci fali 320-480 nm, zwlaszcza 380-430 nm, w szczególnosci 405 nm. Pozostale zwiazki wedlug wynalazku cechuja sie analogicznym mechanizmem dzialania. W tym celu reprezentatywny zwiazek wedlug wynalazku, ABZ 1 - Asp2-Thr3-Phe4-Ile5-ANB6-NH2, rozpuszczono w dimetylosuflotlenku (w stezeniu 0,5 mg/ml), a nastepnie 50 µl takiego roztworu zmieszano z 120 µl buforu (200 mM Tris-HCl, pH 8,0) i 80 µl moczu osoby chorej na raka jajnika. Pomiar wykonano w plytce 96 dolkowej przeznaczonej do pomiaru absorbancji, a kazda próbke analizowano w trzech powtórzeniach w temperaturze 37 °C. Czas trwania pomiaru wynosil 60 minut. W czasie pomiaru monitorowano dlugosc fali charakterystyczna dla uwalniajacego sie chromoforu (ANB NH2) przy dlugosci fali 405 nm (zakres 380-430 nm). Jak pokazano na Fig. 1 analiza RP HPLC losowo wybranego systemu zawierajacego mocz pochodzacy od osoby z diagnoza raka jajnika wskazuje na to, ze zwiazek wedlug wynalazku rozpada sie na fragment peptydowy ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-OH i grupe chromoforowa zwiazku (ANB-NH2). W wyniku pomiaru wzrost zabarwienia roztworu w czasie zaobserwowano we wszystkich próbkach moczu pochodzacych od osób z diagnoza raka jajnika. Obserwowana wielkosc wzrostu absorbancji w czasie jest rózna dla kazdej z badanych próbek. Odmienny efekt uzyskano dla 20 próbek osób zdrowych, gdyz w zadnej z 20 badanych próbek moczu nie zaobserwowano wzrostu absorbancji w zakresie diagnostycznym. Przeprowadzane badania wskazuja, ze wszystkie próbki 1-20 od osób chorych na raka jajnika ulegly rozpadowi, lecz w przypadku próbek 3 i 17 rozpad substratu, tj. ABZ-Asp Thr-Phe-Ile-ANB-NH2, zachodzil mniej wydajnie niz w przypadku próbek 1 czy 13 (Tabela 1, Fig. 2). Taki rezultat moze byc spowodowany róznica w aktywnosci, jak i ilosci enzymów odpowiedzialnych za rozpad enzymatyczny (proteolize). Ponadto wyniki przedstawione w ponizszej Tabeli 1 wskazuja, ze inkubacja roztworu substratu- zwiazku wedlug wynalazku - z próbkami moczu pochodzacymi od osób zdrowych (bez zdiagnozowanego nowotworu, PL 442379 A1 22/37oznaczone cyframi arabskimi kolejno od Z21 do Z40) nie prowadzi do wzrostu absorbancji, a zatem nie zachodzi hydroliza badanego zwiazku. Rezultat wskazuje na brak obecnosci enzymów proteolitycznych swoistych/ charakterystycznych dla raka jajnika. Tabela 1. Wyniki analizy absorbancji 1 0,006600 0,006000 0,006500 2 0,052000 0,042000 0,051000 3 0,008700 0,008800 0,008600 4 0,006900 0,005100 0,006700 0,044000 0,038000 0,042000 6 0,037000 0,022000 0,028000 7 0,003000 0,007000 0,005200 8 0,014000 0,022000 0,015000 9 0,008800 0,010100 0,009200 0,009000 0,009300 0,008500 11 0,012300 0,011200 0,014500 12 0,021600 0,021000 0,019900 13 0,004500 0,005200 0,004800 14 0,005000 0,006100 0,005800 0,001700 0,001500 0,002100 16 0,007900 0,008400 0,007200 17 0,000550 0,006500 0,005900 18 0,007300 0,006800 0,007500 19 0,055000 0,051000 0,048000 0,007700 0,007500 0,008100 Z21 0,000000 0,000000 0,000000 Z22 0,000000 0,000000 0,000000 Z23 0,000000 0,000000 0,000000 Z24 0,000000 0,000000 0,000000 Z25 0,000000 0,000000 0,000000 Z26 0,000000 0,000000 0,000000 Z27 0,000000 0,000000 0,000000 Z28 0,000000 0,000000 0,000000 Z29 0,000000 0,000000 0,000000 PL 442379 A1 23/37Z30 0,000000 0,000000 0,000000 Z31 0,000000 0,000000 0,000000 Z32 0,000000 0,000000 0,000000 Z33 0,000000 0,000000 0,000000 Z34 0,000000 0,000000 0,000000 Z35 0,000000 0,000000 0,000000 Z36 0,000000 0,000000 0,000000 Z37 0,000000 0,000000 0,000000 Z38 0,000000 0,000000 0,000000 Z39 0,000000 0,000000 0,000000 Z40 0,000000 0,000000 0,000000 Ponadto, przeprowadzano badania selektywnosci rozpadu substratu, tj. zwiazku wedlug wynalazku, w zaleznosci od badanego typu raka. Wyniki przeprowadzonych badan przedstawiono na Fig. 3 i wskazuja one, ze badany substrat, tj. ABZ 1 - Asp 2 -Thr 3 -Phe 4 -Ile - ANB6-NH2, inkubowany z próbkami pochodzacymi od pacjentów z diagnoza poszczególnych nowotworów: raka jelita, nerki, prostaty, trzustki, zoladka, pluca, trzonu macicy i watroby nie rozpada sie i nie powoduje wzrostu absorbancji we wskazanym zakresie. Badane próbki kazdorazowo stanowily mieszanine 20 próbek otrzymanych dla kazdego z badanych nowotworów. Wskazuje to na selektywnosc rozpadu zwiazków wedlug wynalazku, która sprawia, ze nadaja sie one do swoistego wykrywania aktywnosci enzymatycznej swoistej wobec raka jajnika oraz swoistego diagnozowania raka jajnika. W tabeli 2 ponizej przedstawiono wyniki pomiarów uzyskane dla trzech powtórzen kazdej z próbek. Tabela 2. Wyniki analizy selektywnosci rozpadu jajnik 1 0,05416 0,06476 0,0487 nerka 2 o o o pluco 3 o o o jelito 4 o o o prostata 5 o o o zoladek 6 o o o trzustka 7 o o o trzon macicy 8 o o o PL 442379 A1 24/37I watroba 9 Ponadto przeprowadzono pomiary zaleznosci aktywnosci proteolitycznej reprezentatywnego zwiazku wedlug wynalazku od odczynu srodowiska reakcji. W wyniku tego eksperymentu stwierdzono, ze w badanym materiale wystepuje co najmniej jeden enzym wykazujacy maksimum aktywnosci w pH zasadowym (Fig. 4). Przeprowadzone analizy potwierdzily przydatnosc zwiazków wedlug wynalazku w czulym i swoistym wykrywaniu aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika, a tym samym ich przydatnosci takze do swoistego diagnozowania raka jajnika, jak równiez jako markera diagnostycznego raka jajnika. Mechanizm dzialania zwiazków wedlug wynalazku polega na ich swoistym rozpadzie enzymatycznym w takiej pozycji, która prowadzi do uwolnienia wolnych czasteczek chromoforów, co powoduje powstanie mierzalnego sygnalu optycznego, który mozna wykorzystywac do celów diagnostycznych, w szczególnosci w diagnozowaniu raka jajnika zgodnie z niniejszym wynalazkiem. PL 442379 A1 /37WYKAZ SEKWENCJI W FORMACIE WIPO STANDARD ST.25 <110 URTESTE S.A. <120 Nowy marker diagnostyczny raka jajnika <130 17P51015PL00 <160 1 <170 BiSSAP 1.3.6 <210 1 <2114 <212PRT <213 Homo sapiens <400 1 Asp Thr Phe Ile 1 PL 442379 A1 26/37WYKAZ SEKWENCJI W FORMACIE WIPO STANDARD ST.26 17P510 15PL00 URTESTE S.A. URTESTE S.A. Zwiazek - marker diagnostyczny raka jajnika, sposób wykrywania aktywnosci enzymatycznej, sposób diagnozowania raka jajnika, zestaw zawierajacy taki zwiazek oraz zastosowania takiego zwiazku i sposób l eczenia raka jajnika l 4 AA PAT source l .. 4 PL 442379 A1 27/37 mol type protein organism Homo sapiens DTFI PL 442379 A1 28/37Zastrzezenia patentowe 1. Zwiazek o wzorze 1: Xl 1-Asp 2 -Thr 3 -Phe 4 -Ile -X2 6 (wzór 1), przy czym Xl zawiera czasteczke Cl lub sklada sie z takiej czasteczki, a X2 zawiera czasteczke C2 lub sklada sie z takiej czasteczki, przy czym pare czasteczek C 1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym zwiazek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty Xl-Asp-Thr-Phe Ile-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnalu optycznego poprzez separacje przestrzenna czasteczek Cl i C2. 2. Zwiazek wedlug zastrzezenia 1, który to zwiazek ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystnie proteolitycznemu. 3. Zwiazek wedlug zastrzezenia 1 albo 2, w którym to zwiazku para czasteczek Cl i C2 jest wybrana z grupy skladajacej sie z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu -amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-N02), korzystnie pare Cl i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2. 4. Zwiazek wedlug jednego z zastrzezen 1 do 3, który to zwiazek stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA (wzór 3). . Zwiazek wedlug zastrzezenia 4, który to zwiazek ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem nastepujacego fragmentu 1: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2. 6. Sposób in vitro wykrywania aktywnosci enzymatycznej obecnej w plynie ustrojowym osobnika, w szczególnosci pochodzacej z komórek raka jajnika, obejmujacy: a) kontaktowanie próbki plynu ustrojowego ze zwiazkiem o wzorze 1: Xl 1-Asp 2 -Thr 3 -Phe 4 -Ile -X2 6 (wzór 1), przy czym Xl zawiera czasteczke Cl lub sklada sie z takiej czasteczki, a X2 zawiera czasteczke C2 lub sklada sie z takiej czasteczki, przy czym pare czasteczek C 1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, PL 442379 A1 29/37i przy czym wspomniany zwiazek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty Xl-Asp Thr-Phe-Ile-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i b) wykrywanie mierzalnego sygnalu optycznego, który powstaje poprzez separacje przestrzenna czasteczek CI i C2. 7. Sposób in vitro wedlug zastrzezenia 6, w którym aktywnosc enzymatyczna stanowi aktywnosc hydrolityczna, korzystnie aktywnosc proteolityczna. 8. Sposób in vitro wedlug zastrzezenia 6 albo 7, w którym jako wspomniany zwiazek stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA (wzór 3). 9. Sposób wedlug jednego z zastrz. 6 do 8, w którym jako wspomniany plyn ustrojowy stosuje sie mocz, korzystnie mocz ludzki. . Sposób in vitro diagnozowania raka jajnika, w którym wykrywa sie obecnosc lub nieobecnosc raka jajnika u osobnika poprzez pomiar w próbce plynu ustrojowego od osobnika badanego aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika, przy czym brak wspomnianej aktywnosci enzymatycznej wskazuje na nieobecnosc raka jajnika, zas obecnosc wspomnianej aktywnosci enzymatycznej wskazuje na obecnosc raka jajnika. 11. Sposób wedlug zastrz. 10, w którym wykrywanie aktywnosci enzymatycznej przeprowadza sie sposobem jak okreslono w jednym z zastrz. 6 do 9. 12. Sposób wedlug zastrz. 10 albo 11, w którym do pomiaru wspomnianej aktywnosci enzymatycznej stosuje sie zwiazek o wzorze I: XI 1 -Asp 2 -Thr 3 -Phe 4 -Ile -X2 6 (wzór 1), przy czym XI zawiera czasteczke Cl lub sklada sie z takiej czasteczki, a X2 zawiera czasteczke C2 lub sklada sie z takiej czasteczki, przy czym pare czasteczek CI i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany zwiazek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty Xl-Asp Thr-Phe-Ile-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnalu optycznego poprzez separacje przestrzenna czasteczek Cl i C2. 13. Sposób wedlug jednego z zastrz. 10 do 12, w którym wspomniana próbke plynu ustrojowego inkubuje sie ze wspomnianym zwiazkiem w buforze pomiarowym o pH obojetnym lub pH zasadowym, korzystnie fizjologicznym, w zakresie proporcji I :2 do I: I O korzystnie I :5 próbki do buforu pomiarowego. PL 442379 A1 /3714. Sposób wedlug jednego z zastrz. 10 do 13, w którym wspomniany zwiazek stosuje sie w stezeniu O, 1-1 O mg/ml, w szczególnosci 0,25-7,5 mg/ml. . Sposób wedlug zastrz. 10 do 14, w którym jako wspomniany zwiazek stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ- Asp-Thr-Phe-Ile -pNA (wzór 3). 16. Sposób wedlug jednego z zastrz. 10 do 15, w którym jako wspomniana próbke stosuje sie próbke moczu, korzystnie moczu ludzkiego. 17. Sposób wedlug jednego z zastrz. 1 O do 16, w którym pomiar wspomnianej aktywnosci enzymatycznej obejmuje pomiar intensywnosci absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, w szczególnosci 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedzialu 25-40 °C, korzystnie 36-38 °C. 18. Zestaw zawierajacy zwiazek jak okreslono w jednym z zastrz. 1 do 5 i bufor pomiarowy. 19. Zestaw wedlug zastrz. 18, w którym zwiazek stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile pNA (wzór 3). . Zastosowanie zwiazku jak okreslono w jednym z zastrz. 1 do 5 do wykrywania aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika. 21. Zastosowanie zwiazku jak okreslono w jednym z zastrz. 1 do 5 do diagnozowania raka jajnika. 22. Zastosowanie wedlug zastrzezenia 21, w którym diagnozowanie raka jajnika obejmuje wykrywanie pierwotnego raka jajnika, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka jajnika i/lub wykrywanie wznowy raka jajnika. 23. Zastosowanie zwiazku jednego z zastrz. 21 do 23, w którym zwiazek stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile -ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ- Asp-Thr-Phe-Ile pNA (wzór 3). 24. Zwiazek jak okreslono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka jajnika. . Zwiazek do zastosowania wedlug zastrz. 24, który to zwiazek stanowi zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA (wzór 3). 26. Sposób leczenia raka jajnika, w którym PL 442379 A1 31/37a) wykrywa sie obecnosc aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika sposobem jak okreslono w jednym z zastrzezen 6 do 9 w próbce plynu ustrojowego od osobnika badanego, i b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi sie wystepowanie wspomnianej aktywnosci enzymatycznej, podejmuje sie leczenie raka jajnika u osobnika. 27. Sposób wedlug zastrzezenia 26, w którym po zakonczeniu leczenia zgodnie z punktem b ), przeprowadza sie monitorowanie wspomnianej aktywnosci enzymatycznej swoistej dla raka jajnika w okreslonych odstepach czasu. 28. Sposób wedlug zastrzezenia 26 albo 27, znamienny tym, ze jako próbke stosuje sie próbke moczu, korzystnie moczu ludzkiego. 29. Sposób wedlug jednego z zastrz. 26 do 28, w którymjako wspomniany zwiazek stosuje sie zwiazek o wzorze 2: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-ANB-NH2 (wzór 2) lub zwiazek o wzorze 3: ABZ-Asp-Thr-Phe-Ile-pNA (wzór 3). PL 442379 A1 32/37Fig.1 ,u ,v, o C 10000 [5000 C (!) ..._ C ABZ-Asp-Thr-Phe-lle-ANB-NH 2 l 12 O-+----------~------------ 60000 30000 o.o 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 Czas retencji [min] ABZ-Asp-Thr-Phe-lle-AN B-N H 2 tR=17.12 ABZ-Asp-Thr-Phe-lle-0 tR=l4.76 o.o 5.0 1 o.o 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 retencji [min] PL 442379 A1 33/37Fig. 2 PL 442379 A1 34/37Fig. 3 PL 442379 A1 /37Fig. 4 0.10 PL 442379 A1 36/37al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NR P.442379 Klasyfikacja zgloszenia: G0lN 33/574, Cl2Q 1/37, G0lN 33/542, G0lN 33/533, G0lN 33/58, C07K 5/10 Podklasy w których prowadzono poszukiwania: G0lN, Cl2Q, C07K Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: Epoquenet (Epodoc, Wpi, Embase, Medline, X-full); STN (Registry, CAplus, Biosis), bazy UPRP, Google Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie do dokumentu zastrz. A S.S. Murgan et al.:, "Ovarian Cancer: Tumor-Specific Urinary 1-29 Micro-Peptides Profiling as Potentia! Biomarkers for Early Diagnosis", Proteomes, 2020, 8(4):32, caly document A WO2009099561 A2 (Brigham and Womens' Hospital INC [US] et al.) 13-08-2009 1-29 caly dokument A WO2020262429 Al (Medical Corp. Saneikai et al. [JP]) 30-12-2020 1-29 caly dokument (tlumaczenie maszynowe) D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A- dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Malgorzata Kozlowska Ekspert Koordynator Data: 07.02.2023 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 28.09.2022 r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL 442379 A1 37/37 PL PL PL PL PL