Sposób wytwarzania biofermentu z odpadów owocowych Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biofermentu z odpadów owo cowych, przeznaczonego do zastosowania w przemysle spozywczym, przemysle ko smetycznym i w suplementach diety. Wedlug definicji podanej w Encyklopedii MDPI, biofermenty to innowacyjne skladniki ekstrahowane z naturalnych surowców, glównie z surowców roslinnych, w wyniku procesu fermentacji odpowiednimi szczepami mikroorganizmów. Wazna wlasciwoscia biofermentów jest biokompatybilnosc, gdyz proces fermentacji zwieksza aktywnosc biochemiczna i fizjologiczna substratu poprzez przeksztalcanie zwiazków wielkoczasteczkowych w struktury maloczasteczkowe i stad surowce po procesie sa bardziej dostepne i aktywne biochemicznie dla organizmów w porównaniu z surow cami niesfermentowanymi. Proces fermentacji zalezy od rodzaju surowca, uzytego szczepu mikroorganizmu i sposobu prowadzenia. Dobór mikroorganizmów jest istotny dla pozyskania oczekiwanej nowej matrycy zwiazków biologicznie czynnych. Z czasopisma Applied Microbiology International t. 66, wyd.2, luty 2018, s. 153- 160 wiadomo, iz 2-fenyloetanol (2-PE), alkohol stosowany w przemysle kosmetycznym jako zwiazek aromatyzujacy i/lub konserwant, mozna otrzymac w procesie fermentacji serwatki wzbogaconej produktami ubocznymi z przetwarzania buraków cukrowych (odpowiedni poziom zródla wegla), po uzupelnieniu L-fenyloalanina. Proces fermenta cji przeprowadzano na szczepach srodowiskowych z gatunków: Meyerozyma caribbica, Metschnikowia chrysoperlae, Meyerozyma guilliermondii, Pichia fermentans i Saccharomyces cerevisiae .. Z publikacji w czasopismie Mo/ecu/es 2019; 24(19): 3519 jest znany proces fer mentacji soku jagód goji przy uzyciu mieszanek szczepów bakterii SLV (Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri i Bacillus velezensis), SZP (Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum i Bacillus licheniformis) i SZVP (Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Bacillus velezensis i Bacillus licheniformis W opisie zgloszenia patentowego CN109757715A ujawniono proces pozyskania napoju zawierajacego bioferment z prawoslazu (Abelmoschus manihot {L.} Medicus) oraz izomaltooligosacharydu i probiotyków (Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium PL 444531 A1 2/11longum). Surowiec poddano dwukrotnie procesowi fermentacji. Do pierwszego roz tworu fermentacyjnego dodano oligomeryczna izomaltoze 900, probiotyki i wymie szano. Proces fermentacji prowadzono w temperaturze pokojowej przez 45-60 dni. Produktem fermentacji byl bioenzym zawierajacy oligomeryczna izomaltoze, wzboga eony o szczepy probiotyczne, co jest korzystne dla regulacji flory jelitowej czlowieka i wzmocnienia organizmu. W opisie zgloszenia patentowego CN107739270A opisano otrzymywanie bio fermentu przy wykorzystaniu brazowego cukru, swiezych odpadów lisci warzyw lub swiezej zgnilizny owoców, skórek owoców, skórek warzyw, wody do mycia ryzu i ryzu. Do wody z brazowym cukrem dodano wyszczególnione wyzej surowce i poddano fer mentacji spontanicznej. Proces prowadzono przez okres 7-30 dni, w temperaturze 20- 300C. Pozyskany bioferment poprawial wzrost roslin na obszarach skazonych ropa naf towa. Z opisu zgloszenia patentowego CN115517361A jest znana metoda fermentacji plynnej biologicznego fermentu spozywczego i sposobu jego przygotowania. Otrzy many bioferment spozywczy to zlozony preparat fermentacyjny bogaty w skladniki od zywcze pochodzace z róznych owoców i warzyw - wolne aminokwasy, polipeptydy, bialka, bogaty w probiotyki, enzymy bioaktywne i inne substancje bioaktywne powsta jace podczas procesu. Produkt ma zwiekszona bioaktywnosc i biokompatybilnosc z organizmem czlowieka. Jagoda kamczacka to roslina owocodajna, pochodzaca od gatunków Lonicera kamtschatica oraz Lonicera caerulea, Lonicera altaica, pochodzacych z Rosji oraz Loni cera caerulea var. emphyllocalyx z Japonii. Owoce wyrózniaja sie niezwykle wysoka ak tywnoscia przeciwutleniajaca i jednoczesnie wysoka koncentracja polifenoli, w tym an tocyjanów. Dotychczas sa spozywane w postaci surowej lub w niewielkim stopniu przetwarzane w dzemy, soki badz nalewki alkoholowe. Glówne zastosowanie to pozy skiwanie soków, gdzie produktem ubocznym sa wytloki stosowane obecnie jako nawóz organiczny w rolnictwie. Wykazano, iz w wytlokach jagody kamczackiej pozostaje duza ilosc polifenoli, takich jak kwas 3-O-kawoilochinowy, kwas 5-O-kawoilochinowy, kwas p-kumarowy, pochodne kwasu kawowego, kwas 3,4-di-O-kawoilochinowy. Ponadto PL 444531 A1 3/11odpady zawieraja duza ilosc antocyjanów, takich jak cyjanidyno-3,5-O-diglukozyd, cyja nidyno-3-O-glukozyd, cyjanidyno 3-O-rutinozyd, peonidyno 3-O-glukozyd, a takze sa zródlem witamin takich jak B1, B2, B3, B6 oraz C. Z opisu zgloszenia patentowego P. 443438 jest znany sposób wytwarzania bio aktywnego preparatu, przeznaczonego do zastosowania w przemysle spozywczym, przemysle kosmetycznym i w suplementach diety, polegajacy na liofilizacji wytloków z przetwórstwa owoców jagody kamczackiej, swiezych lub zamrozonych. W pierwszym etapie liofilizacji wytloki zamraza sie do temperatury -15°C, przy czym temperature wytloków juz zamrozonych doprowadza sie najpierw do -15°C, nastepnie zamrozone wytloki poddaje sie dzialaniu obnizonego cisnienia 0,15 Pa w temperaturze 10°C i po wyrównaniu w tych warunkach temperatury wytloków z temperatura otoczenia, poddaje sie wytloki suszeniu w temperaturze 30°C. W opisie patentowym PL 242139 ujawniono zastosowanie ekstraktów z owo ców jagody kamczackiej z gatunku Lonicera caerulea L var. Kamtschatica, zawieraja cych irydoidy, antocyjany, kwasy fenolowe, flawonole, w odpowiednich stezeniach, do wytwarzania produktów farmaceutycznych obnizajacych poziom trójglicerydów, a takze suplementu diety, srodka zywieniowego lub skladnika zywnosci obnizajacego poziom trójglicerydów. Z opisu patentowego PL 187311 jest znany preparat zwiazków polifenolowych pochodzenia roslinnego, w którym jako jedna z substancji czynnych wykorzystuje sie antocyjanozydy izolowane miedzy innymi z owoców jagody kamczackiej, przeznaczony do wprowadzania do mieszaniny skladników wyrobów kosmetycznych badz farmaceu tycznych lub wyrobów spozywczych. Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania biofermentu z su rowca owocowego stanowiace odpad utylizowany dotychczas jako nawóz w rolnictwie. Sposób wytwarzania biofermentu z odpadów owocowych, przeznaczonego do zastosowania w przemysle spozywczym, przemysle kosmetycznym i w suplementach diety, w drodze fermentacji z udzialem szczepów srodowiskowych, wedlug wynalazku polega na tym, ze fermentacji poddaje sie wytloki uzyskane z przetwórstwa owoców jagody kamczackiej, swiezych lub zamrozonych do temperatury od -30°C do -70°C, przy PL 444531 A1 4/11czym surowiec poddaje sie, bezposrednio lub po rozmrozeniu, rozcienczeniu woda uzyta w stosunku wagowym do surowca 1:1, po czym zaszczepia sie rozcienczony suro wiec wyhodowanym inokulum jednego ze szczepów mikroorganizmów srodowisko wych stanowiacych naturalna mikroflore stosowanych wytloków lub mieszanina wyho dowanych inokulów jednego ze szczepów bakterii mlekowej i jednego ze szczepów drozdzy takze zawartych w tej mikroflorze srodowiskowej, zapewniajacych uzyskanie zalozonej zawartosci okreslonych antocyjanin w matrycy biofermentu, stosujac 1,5 ml inokulum lub inokulów o liczbie komórek 10 6 - 10 8 jtk/ml i poddaje fermentacji w temperaturze 30°C w czasie 5-6 dni, po czym otrzymany w ten sposób pre-bioferment odwirowuje sie z szybkoscia 4200 rpm w czasie 10 minut, a uzyskany w wyniku odwi rowania supernatant stanowi bioferment wlasciwy. Sposobem wedlug wynalazku uzyskuje sie bioferment o znacznie wiekszej ilosci zwiazków chemicznych i o wyzszej biodostepnosci dla organizmu czlowieka niz wyj sciowa matryca, o potencjalnym zastosowaniu w przemysle spozywczym, farmaceu tycznym lub kosmetycznym. Preparat otrzymany sposobem wedlug wynalazku, w postaci plynu, charakteryzuje sie zwiekszona biodostepnoscia oraz podwyzszona, w porównaniu z wytlokami przed fermentacja, zawartoscia mniejszych czasteczek zwiazków bioaktywnych, co jest istotne dla biodostepnosci skladników preparatu. Wprowadzenie jednego ze szczepów lub mieszaniny szczepu bakterii i drozdzy, stano wiacych mikroflore wytloków powoduje zmiane skladu w produktach bioaktywnych matrycy biofermentu, przy czym mieszanina wykazuje dzialanie synergiczne. Sposób wedlug wynalazku umozliwia zagospodarowanie wytloków z przetwórstwa owoców jagody kamczackiej, stanowiacych dotychczas produkt odpadowy. Supernatant moze byc stosowany w formie surowej badz poddany procesowi liofilizacji i przechowywany w ampulkach lub w mikrokapsulkach. Sposób wedlug wynalazku ilustruja ponizsze przyklady. Przyklad 1. 75 g swiezych wytloków uzyskanych z przetwórstwa owoców jagody kamczac kiej umieszczono w zdezynfekowanej, szklanej butelce laboratoryjnej o pojemnosci 200 ml, z zakretka i dodano 75 g wody o temperaturze w zakresie 25-30°C oraz okreslono PL 444531 A1 /11pH. Za pomoca techniki MALDI-TOF MS zidentyfikowano jako szczep srodowiskowy wy tloków szczep bakterii Lacticaseibacillus paracasei o liczbie komórek 10 8 jtk/ml. Wyho dowano inokulum tego szczepu bakterii na pozywce MRS w hodowli plynnej, po czym 1, 5 ml wyhodowanego inokulum o liczbie komórek 10 7 jtk/ml zaszczepiono przygoto wana uprzednio mieszanine wytloków z woda. Zaszczepione medium umieszczono w cieplarce Memmert UF160 o temperaturze 30°C na okres 5 dni. Nastepnie otrzy many pre-bioferment rozlano do sterylnych probówek typu Falcon o pojemnosci 50 ml i umieszczono w wirówce stolowej Eppendorf™ Centrifuge 5804 R obracajacej sie z szybkoscia 4200 rpm na okres 10 minut. Otrzymany po tym czasie supernatant zlano znad osadu do sterylnych probówek typu Falcon o pojemnosci 25 ml i okreslono zawar tosc w nim polifenoli, antocyjanin, cukrów i witamin oraz dokonano pomiaru pH. Przyklad 2. 75 g rozmrozonych wytloków uzyskanych z przetwórstwa owoców jagody kam czackiej umieszczono w zdezynfekowanej, szklanej butelce laboratoryjnej o pojemnosci 200 ml, z zakretka i dodano 75 g wody o temperaturze w zakresie 25-30°C oraz okre slono pH. Za pomoca techniki MALDI-TOF MS zidentyfikowano jako szczepy srodowi skowe wytloków szczep bakterii Lacticaseibacillus paracasei o liczbie komórek 8 jtk/ml oraz szzcep drozdzy Saccharomyces cerevisiae. Wyhodowano inokulum tego szczepu bakterii na pozywce MRS w hodowli plynnej, zas szczep drozdzy na pozywce YPG w hodowli plynnej, po czym 0,75 ml wyhodowanego inokulum bakterii o liczbie komórek 10 7 jtk/ml oraz 0,75 ml inokulum drozdzy o liczbie komórek 10 7 jtk/ml za szczepiono przygotowana uprzednio mieszanine wytloków z woda. Zaszczepione me dium umieszczono w cieplarce Memmert UF160 o temperaturze 30°C na okres 6 dni. Nastepnie otrzymany pre-bioferment rozlano do sterylnych probówek typu Falcon o pojemnosci 50 ml i umieszczono w wirówce stolowej Eppendorf™ Centrifuge 5804 R obracajacej sie z szybkoscia 4200 rpm na okres 10 minut. Otrzymany po tym czasie su pernatant zlano znad osadu do sterylnych probówek typu Falcon o pojemnosci 25 ml i okreslono zawartosc w nim polifenoli, antocyjanin, cukrów i witamin oraz dokonano pomiaru pH. PL 444531 A1 6/11Wyniki badan wytloków stosowanych w przykladach (jako wytloki 1 i wytloki 2) oraz biofermentów otrzymanych w przykladach (jako bioferment 1 i bioferment 2) przedstawiono w ponizszych tablicach 1-5: w tablicy 1 zawartosc polifenoli, w tablicy 2 zawartosc antocyjanin, w tablicy 3 zawartosc cukrów, w tablicy 4 zawartosc witamin, zas w tablicy 5 pH. Tablica 1. Próba CA nie wyka- Wytloki 1 zano nie wyka- Wytloki 2 zano Bioferment 1 wykazano Bioferment 2 wykazano W tablicy oznaczaja: CA - kwas kawowy, 3-CQA - kwas 3-0- kawoilochinowy, -CQA - kwas 5-O-kawoilochinowy, pCuA - kwas p-kumarowy, 3-CQA wykazano wykazano wykazano wykazano CA derivative - pochodna kwasu kofeinowego, 3,4-DiCQA - kwas 3,4-Di-O-kawoilochinowy. Zawartosc [mg/100 g] CA -CQA pCuA 3,4-DiCQA derivative nie wyka- wykazano wykazano wykazano zano wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano PL 444531 A1 7/11Tablica 2. Zawartosc [mg/100 g] Próba Cy-3,5-diglu Cy-3-glu Wytloki 1 wykazano wykazano Wytloki 2 wykazano wykazano Bioferment 1 nie wykazano wykazano Bioferment 2 wykazano wykazano W tablicy oznaczaja: Cy-3,5-diglu - cyjanidyno-3,5-O-diglukozyd, Cy-3-glu - cyjanidyno-3-O-glukozyd, Cy-3-rut - cyjanidyno-3-O-rutinozyd, Pe-3-glu - peonidyno-3-O-glukozyd. Tablica 3. Cy-3-rut wykazano wykazano nie wykazano wykazano Zawartosc cukrów [g/100 g] Próba Fruktoza Glukoza Wytloki 1 1,91 ± 0,50 0,84 ± 0,50 Wytloki 2 1,87 ± 0,50 1,13 ± 0,50 Bioferment 1 0,02 ± 0,50 0,00 Bioferment 2 0,72 ± 0,50 0,00 Pe-3-glu wykazano wykazano nie wykazano wykazano Suma 2,74 ± 0,50 2,99 ± 0,50 0,02 ± 0,50 0,72 ± 0,50 PL 444531 A1 8/11Tablica 4. Zawartosc witamin [mg/100 g] Próba Wit.C Wit. B1 Wit. B2 Wit. B3 Wit. B6 Wytloki 1 wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano Wytloki 2 wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano Bioferment 1 wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano Bioferment 2 wykazano wykazano wykazano wykazano wykazano Tablica 5. Próba pH [-] Surowiec 1 przed fermentacja 4,22 ± 1,50 Bioferment 1 4,34 ± 0,93 Surowiec 2 przed fermentacja 4,18 ± 1,50 Bioferment 2 4,25 ± 0,87 PL 444531 A1 9/11Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania biofermentu z odpadów owocowych, przeznaczonego do zastosowania w przemysle spozywczym, przemysle kosmetycznym i w suplementach diety, w drodze fermentacji z udzialem szczepów srodowiskowych, znamienny tym, ze fermentacji poddaje sie wytloki uzyskane z przetwórstwa owoców jagody kamczac kiej, swiezych lub zamrozonych do temperatury od -30°C do -70°C, przy czym surowiec poddaje sie, bezposrednio lub po rozmrozeniu, rozcienczeniu woda uzyta w stosunku wagowym do surowca 1:1, po czym zaszczepia sie rozcienczony surowiec wyhodowa nym inokulum jednego ze szczepów mikroorganizmów srodowiskowych stanowiacych naturalna mikroflore stosowanych wytloków lub mieszanina wyhodowanych inokulów jednego ze szczepów bakterii mlekowej i jednego ze szczepów drozdzy takze zawartych w tej mikroflorze srodowiskowej, zapewniajacych uzyskanie zalozonej zawartosci okre slonych antocyjanin w matrycy biofermentu, stosujac 1,5 ml inokulum lub inokulów o liczbie komórek 10 6 - 10 8 jtk/ml i poddaje fermentacji w temperaturze 30°C w czasie -6 dni, po czym otrzymany w ten sposób pre-bioferment odwirowuje sie z szybkoscia 4200 rpm w czasie 10 minut, a uzyskany w wyniku odwirowania supernatant stanowi bioferment wlasciwy. PL 444531 A1 /11al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt. 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI DO ZGLOSZENIA NRP.444531 Klasyfikacja zgloszenia: A23L 2/02, A23L 33/135, A23L 33/14, A61K 35/74 Podklasy w których prowadzono poszukiwania: A23L2 A23L33 A61K35 Bazy komputerowe w których prowadzono poszukiwania: EPODOC WPI bazy UPRP STN Kategoria dokumentu A A A Dokumenty - z podana identyfikacja PL242139 B (Uniwersytet Przyrodniczy we Wroclawiu, Wroclaw; Uniwersytet Medyczny im. Piastów Slaskich, Wroclaw) 23-01-2023 zastrzezenia patentowe. CNI 15444099 A (SHENZHEN P ANDALULU BIOTECHNOLOGY CO LTD [CN]) 09-12-2022 abstrakt, zastrzezenia CN10594244 7 A (PENG CHANG' AN [CN]) 21-09-2016 abstrakt, zastrzezenia. D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A- dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stanowiacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, Odniesienie do zastrz. zastrz. zastrz. zastrz. L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszenstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia daty publikacji innego cytowanego dokumentu lub z innego szczególnego powodu, O - dokument odnoszacy sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, P - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia zasad lub teorii lezacych u podstaw wynalazku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za nowy lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, Y - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Ewa Waszkowska Ekspert Data: 24.01.2024 Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o zastrz. z dnia 24.04.2023r. Podpis: /podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym/ Pismo wydane w formie dokumentu elektronicznego PL 444531 A1 11/11 PL PL