23.11.1966 Niemiecka Republika Federalna Opublikowano: 31.111.1970 59396 KI. 30 h, 2/04 M.KP A 61 k UKD wlot Twórca wynalazku: Fritz Schultz Wlasciciel patentu: Farbenfabriken Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen (Niemiecka Republika Federalna) Sposób otrzymywania inaktywatora kalikreiny w postaci krystalicznej Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia inaktywatora kalikreiny w postaci krystalicznej.Inaktywator kalikreiny jest polipeptydem o cie¬ zarze czasteczkowym okolo 6500. Znany jest równiez pod nazwa inhibitora pankreatynowego trypsyny Kunitza i Northrop a.Inaktywator kalikreiny jest silna zasada. Dotych¬ czas nie udalo sie otrzymywac go jako takiego w po¬ staci krystalicznej, natomiast wydzielenie inaktywa¬ tora kalikreiny przeprowadza sie na drodze jego krystalizacji z wodnego roztworu siarczanu magne¬ zu lub siarczanu amonu o slabo kwasnym odczy¬ nie (F. Schultz, H. Kraut i N. Bhargava, Naturwis- senschaften 50, 375/1963). Otrzymuje sie przy tym krysztaly w postaci graniastoslupów szesciobocz- nych, zawierajace okolo 50% wagowych siarczanu magnezu, wzglednie siarczanu amonu. W celu uzy¬ skania czystej substancji biologicznie czynnej na¬ lezy te siarczany usunac, co udaje sie jedynie po ich ponownym rozpuszczeniu. Powyzszy sposób po¬ stepowania zgodny jest z danymi literaturowymi, które nie przewiduja mozliwosci otrzymania w po¬ staci krystalicznej polipeptydu o tak duzym (6500) ciezarze czasteczkowym, a poza tym zalecaja zobo¬ jetnianie roztworu inaktywatora jako rzekomo nie¬ trwalego w roztworze alkalicznym.Stwierdzono, ze czysty inaktywator kalikreiny* w postaci krystalicznej otrzymuje sie w ten sposób, ze jego wodny roztwór nastawia sie na wartosc pH w granicach 9 — 12,5 za pomoca dodawania zasad 10 15 20 25 lub za pomoca wymiany anionów na jony wodoro¬ tlenowe na anionicie, nastepnie wymieniony roz¬ twór zateza sie do uzyskania stezenia co najmniej 5000 KIE, przy którym nastepuje wykrystalizowanie inaktywatora (1 KIE jest iloscia inaktywatora deza- ktywujaca w 50% 2 jednostki kalikreiny z trzustki swin).Nastawienie na odpowiednia wartosc pH osiaga sie korzystnie za pomoca amoniaku. Mozna tez uzyc do tego celu i inne nieorganiczne lub orga¬ niczne zasady. Szczególnie wysokie wydajnosci osia¬ ga sie przy stosowaniu amoniaku i wartosci pH=ll i powyzej. Wieksza czesc wykrystalizowuje juz po uplywie 1 godziny, a maksymalna wydajnosc za¬ zwyczaj osiaga sie po uplywie 10 godzin. Krystali¬ zacja korzystnie przebiega przy chlodzeniu.Najdogodniejsze stezenie dla przeprowadzenia krystalizacji wynosi 1 g do 5 g inaktywatora kali¬ kreiny na 100 ml roztworu. Przy nizszych steze¬ niach wydajnosc spada.Przy uzyciu innych zasad zamiast amoniaku zmienia sie optimum wartosci pH, które latwo moz¬ na ustalic na drodze doswiadczalnej. Jezeli konco¬ we stezenie wynosi 1 g inaktywatora na 100 ml roztworu to dla lugu sodowego, lugu potasowego, wodorotlenku wapniowego i wody barytowej, naj¬ dogodniejsza dla krystalizacji jest wartosc pH = 11.Dla zasad organicznych optimum wartosci pH znaj¬ duje sie równiez w poblizu 11. Najlepsza krystali¬ zacje osiaga sie przy uzyciu etylenodwuaminy. Do- 593963 59396 4 bre wydajnosci daja tez metyloamina, trójmetylo- amina, trójetyloamina, piperydyna itp.Przy zatezaniu pod próznia obojetnego lub kwas¬ nego roztworu inaktywatora kalikreiny nie otrzy¬ muje sie krysztalów substancji biologicznie czynnej nawet przy najwiekszym stezeniu. Natomiast przy powolnym przepuszczeniu roztworu przez kolumne wypelniona silnie zasadowym wymieniaczem anio¬ nowym, otrzymuje sie silnie alkaliczny roztwór, z którego podczas zatezania przy wartosci pH po¬ miedzy 9 i 10 wykrystalizowuje inaktywator z wy¬ soka wydajnoscia w swojej zasadowej postaci.Jako material wyjsciowy najlepiej nadaja sie preparaty inaktywatora kalikreiny uwolnione od towarzyszacych mu substancji. Im dalej posuniete jest oczyszczanie, tym wyzsza jest wydajnosc pod¬ czas krystalizacji, a krystalizacja w postaci zasa¬ dy ulatwia uwolnienie inaktywatora od obcych protein i innych zwiazków towarzyszacych.Inaktywator kalikreiny krystalizuje w postaci czterokatnych slupów, wykazujacych czasem jedna lub wiecej krawedzi ukosnie scietych. Analiza rent¬ genowska krysztalów inaktywatora kalikreiny kry¬ stalizowanych z roztworu siarczanu amonu przy wartosci pH = 6 wykazuje strukutre jednoskosna oraz grupe przestrzenna P21? zas krysztalów otrzy¬ mywanych wedlug wynalazku strukture rombowa i grupe przestrzenna P2i 2^. Podobnie stwierdzo¬ no wyrazne róznice widm w nadfiolecie obu rodza¬ jów krysztalów.Krysztaly otrzymywane wedlug wynalazku . sa trudno rozpuszczalne w wodzie, jednakze rozpusz¬ czaja sie latwo przy obnizeniu wartosci pH. Tak wiec na przyklad wprowadzenie gazowego C02 do wodnej zawiesiny krysztalów powoduje ich roz¬ puszczenie. W zwiazku z tym konieczne jest wy¬ kluczenie C02 zawartego w powietrzu przy ozna¬ czaniu rozpuszczalnosci. W tych warunkach w 100 ml wody o temperaturze 20°C rozpuszcza sie 1 g krysztalów. Natomiast rozpuszczalnosc krysztalów uzyskanych z roztworów siarczanu magnezu lub siarczanu amonu w temperaturze 20°C wynosi 30 g w 100 ml wody.Specyficzna aktywnosc substancji wysuszonej nad pieciotlenkiem fosforu wynosi okolo 7000 KIE/mg.Zawiesina krysztalów w wodzie posiada wartosc pH okolo 10. Jezeli sie doda do niej troche kwasu, wówczas krysztaly przechodza do roztworu przy wartosci pH 9 i ponizej.Wszystkie wskazania lecznicze odnoszace sie do niekrystalicznego inaktywatora kalikreiny odnosza sie takze do nowych krystalicznych produktów. Po¬ nadto dla tych krysztalów istnieje nowa mozliwosc zastosowania. Dzieki ich trudnej rozpuszczalnosci, mozna je mianowicie równiez zastosowac w postaci zasypki. Taka zasypka jest pozyteczna jako srodek zapobiegawczy przed zrostami pooperacyjnymi. Po wprowadzeniu podczas operacji do jamy brzusznej pozostaje ona w niej dluzszy czas dzieki trudnej rozpuszczalnosci. Zasypke przygotowuje sie znany¬ mi sposobami.Przyklad I. 4,48 g liofilizowanego preparatu inaktywatora kalikreiny o stopniu czystosci 0,16 gamma/KIE = 28 mega KIE rozpuszcza sie w 56 cm3 wody redestylowanej. 1 cm3 zawiera zatem 500 000 jednostek KIE. Nastepnie dodaje sie 56 cm3 czystego 25% amoniaku. Wartosc pH wynosi wte¬ dy 11. Po 24 godzinnym staniu w temperaturze 20°C 5 wytraca sie gesta krystaliczna breja, która odsacza sie, przemywa 12 cm3 wody redestylowanej i suszy w prózniowym eksykatorze nad pieciotlenkiem fo¬ sforu. Otrzymuje sie 3,096 krysztalów = 22,12 mega KIE o czystosci 0,14 gamma, co odpowiada 79% io wydajnosci.Przyklad II. 20 cm3 = 2 mega KIE o stop¬ niu czystosci 0,16 gamma/KIE zadaje sie 0,63 cm3 nasyconej wody barytowej. Wartosc pH wynosi wtedy 11. Po 10 godzinnym staniu w temperaturze 15 4°C powstale krysztaly odsacza sie, przemywa wo¬ da i suszy pod próznia nad pieciotlenkiem fosforu.Otrzymuje sie 129 mg krysztalów = 920 000 jed¬ nostek KIE, co odpowiada wydajnosci 46% przy czystosci 0,14 gamma/KIE. 20 Przyklad III. 0,48 g inaktywatora kalikreiny o czystosci 0,16 gamma KIE rozpuszcza sie w wo¬ dzie i zadaje 0,39 cm3 etylenodwuaminy. Wartosc pH wynosi wtedy 11,2. Juz po uplywie 15 minut 25 rozpoczyna sie krystalizacja. Po 24 godzinach otrzy¬ mana krystaliczna breje oddziela sie, przemywa mala iloscia wody i suszy. Otrzymuje sie 239 mg krysztalów o czystosci 0,142 gamma/KIE, co odpo¬ wiada wydajnosci 56%. 30 Przyklad IV. Ig liofilizowanego preparatu inaktywatora kalikreiny o czystosci 0,2 gamma/ /KIE = 5 mega KIE rozpuszcza sie w 10 cm3 wo¬ dy redestylowanej. Nastepnie dodaje sie 0,6 cm3 amoniaku. Wartosc pH wynosi wtedy 10. Po 24 go- 35 dzinnym staniu w temperaturze +4°C odfiltrowuje sie krysztaly; przemywa i suszy. Otrzymuje sie 210 mg krysztalów o czystosci 0,15 gamma/KIE, co odpowiada wydajnosci 28%.Przyklad V. 3,4 g liofilizowanego inaktywa¬ tora kalikreiny o czystosci 0,17 gamma/KIE roz¬ puszcza sie w 150 cm3 wody. Roztwór wykazuje wartosc pH = 6,5. Nastepnie dodaje sie 50 cm8 silnie zasadowego wymieniacza anionowego Am- mm berlit IR A 410. Zawiesine miesza sie w ciagu 10 45 minut i pozostawia w spokoju w ciagu 24 godzin.Zawiesina wskazuje wówczas wartosc pH = 10,5.Przez przeszlamowanie i sitowanie zawiesina kry¬ staliczna zostaje oddzielona od wymieniacza, kry¬ sztaly odfiltrowuje sie, przemywa mala iloscia wo¬ dy i suszy. Otrzymuje sie 2,03 g krysztalów o czy¬ stosci 0,145 gamma/KIE, co odpowiada 70% wy¬ dajnosci.Przyklad VI. 15,4 litra silnie kwasnego roz- 55 tworu inaktywatora kalikreiny, zawierajacego 295 milionów jednostek KIE o czystosci 0,16 gamma/ /KIE, przepuszcza sie w ciagu 6 godzin przez ko¬ lumne wymieniacza wypelniona 5 litrami silnie za¬ sadowego wymieniacza anionowego Amberlit IRA 60 410. Otrzymany mocno alkaliczny roztwór zostaje zatezony do objetosci 1,5 litra w prózniowym cyr- kulacyjnym aparacie wyparnym. Juz w czasie zate¬ zania roztwór zaczyna metniec po czym wydziela sie inaktywator w postaci krystalicznej z wydaj no- 65 scia 71%.59396 PL PL PL PL PL PL PL PL