PL71591Y1 - Wielofunkcyjny mikrosystem przepływowy - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest wielofunkcyjny mikrosystem przepływowy, który składa się z dwóch połączonych trwale warstw: płytki szklanej oraz warstwy biozgodnego polimeru i w warstwie biozgodnego polimeru znajduje się sieć trzech, nie połączonych ze sobą mikrokanałów głównych (8a, 8b i 8c) posiadających na jednym końcu otwór wlotowy (3a, 3b i 3c) odpowiednio i zawiera sześć mikrokomór hodowlanych odpowiednio a na drugim końcu każdego mikrokanału głównego (8a, 8b i 8c) znajduje się mikrokanał z dwoma dodatkowymi mikrokomorami hodowlanymi odpowiednio. Mikrokanały schodzą się w jednym punkcie, a ponadto mikrokanały te są ze sobą połączone dwoma mikrokanałami poprzecznymi (9) o różnych długościach, przebiegającymi przez dodatkowe mikrokomory hodowlane. Od punktu zbiegu mikrokanałów biegnie mikrokanał wylotowy (10) zakończony otworem wylotowym (4) i na długości tego kanału (10) znajdują się ostatnie trzy mikrokomory hodowlane.

Description

Opis wzoru Przedmiotem wzoru u?ytkowego jest wielofunkcyjny mikrosystem przep?ywowy do hodowli linii komórkowych w monowarstwie, kontrolowanego warunkami mikroprzep?ywowymi tworzenia kokultury oraz bada? migracji i testowania dzia?ania cyto- czy fototoksycznego leków. Tego typu mikrosystem mo?e znale?? zastosowanie w in?ynierii komórkowej/tkankowej, a tak?e naukach materia?owych, gdzie potrzebne s? badania przesiewowe nowo zaprojektowanych systemów dostarczania leków.

Znany jest z polskiego opisu patentowego PL 214 546 mikrouk?ad do oceny skuteczno?ci procedur terapii fotodynamicznych, sk?adaj?cy si? z hydrofilowej p?ytki szklanej oraz p?ytki polimerowej z materia?u o w?asno?ciach hydrofobowych, przezroczystym, przepuszczalnym dla gazów, biokompatybilnym oraz umo?liwiaj?cym wykonanie w nim mikrostruktur. Obydwie p?ytki: szklana i polimerowa s? ze sob? trwale po??czone przy u?yciu plazmy tlenowej. W mikrouk?adzie, w p?ytce szklanej, znajduje si? macierz co najmniej 2 × 2 mikrokomór hodowlanych, natomiast w p?ytce polimerowej znajduj? si? mikrokana?y, przy czym mikrokana?y ??cz? mikrokomory wzd?u? mikrouk?adu, a ponadto mikrosystem zawiera wywiercone w p?ytce polimerowej otwory wlotowe w ilo?ci odpowiadaj?cej ilo?ci mikrokana?ów, a tak?e jeden otwór wlotowo-wylotowy. W opisanym mikrouk?adzie komórki mog? tworzy? agregaty, na co wp?ywa niska szeroko?? mikrokana?ów i powoduj? ich zatykanie w przypadku wprowadzania wysokiej g?sto?ci zawiesiny komórkowej.

Z publikacji Tomecka E., Tokarska K., Jastrz?bska E., Chudy M., Brzózka Z. - In?ynieria komórkowa w systemach lab-on-a-chip - Wiadomo?ci Chemiczne, 2015 [Z] 69, 9-10, 909-929 znane s? mikrouk?ady zawieraj?ce w swej geometrii miejsca przeznaczone do dokowania i wzrostu komórek (mikrokomory hodowlane), mikrokana?y doprowadzaj?ce komórki oraz sie? mikrostruktur umo?liwiaj?cych ci?g?e dostarczanie substancji od?ywczych i badanych zwi?zków. W publikacji tej ujawniono mikrouk?ady do prowadzenia testów cytotoksyczno?ci zwi?zków, badania chemotaksji oraz migracji komórek, ujawniono tzw. generatory gradientów st??e? (ang. Concentration Gradient Generator, CGG), w których mo?liwe jest wygenerowanie, w jednym etapie analizy, kilku st??e? wprowadzanych do mikrouk?adu roztworów. Do najprostszych generatorów nale?? mikrokana?y w kszta?cie litery T lub Y [19]. Zasada dzia?ania CGG polega na tym, ?e roztwory p?yn?ce w dwóch kana?ach wprowadzaj?cych ??cz? si? w jeden, gdzie na drodze dyfuzji nast?puje ich wymieszanie. Sterowanie gradientem mo?e odbywa? si? poprzez odpowiednio zaprojektowan? sie? kana?ów, której liczba wlotów i wylotów determinuje liczb? otrzymanych st??e? u?ywanego do bada? czynnika. Opisano równie? mikrosystem posiadaj?cy 576 mikrokomór hodowlanych, który wykorzystano do badania toksycznego dzia?ania takich zwi?zków jak: digitonina, saponina, CoCI2, NiCI2 oraz akroleina [21]. Mikrosystem wykonany w PDMS zawiera? w swej geometrii mikrokana?y ??cz?ce si? ze sob? prostopadle. Opisano tak?e struktur? mikrosystemu, w której zastosowano trzy mikrokana?y u?o?one równolegle, po??czone ze sob? mikrokanalikami.

Z publikacji Roman Szafran - Metodyka projektowania mikroaparatow lab-on-a-chip do bada? prze?ywów w naczyniach w?osowatych guzów nowotworowych opisano stworzon? wektorow? map? kana?ów w programie Autodesk AutoCAD, któr? nast?pnie uzupe?niono o sie? kana?ów doprowadzaj?cych oraz odprowadzaj?cych p?yn ze struktury sieci naczy? w?osowatych. Kana?y doprowadzaj?ce i odprowadzaj?ce mia?y po??czenie z portami umieszczonymi w p?ytce nakrywkowej chipa, umo?liwiaj?cymi przy??czenie kapilar zasilaj?cych mikrochip.

Z opisu patentowego US2008254997 znany jest zestaw analityczny zawieraj?cy: i) urz?dzenie analityczne zawieraj?ce kana? umo?liwiaj?cy przep?yw przez ni? cieczy, utworzone przez po??czenie ze sob? pierwszego elementu posiadaj?cego rowek, drugi element pokrywaj?cy rowek i pierwszy kwas nukleinowy (N1) maj?cy dowoln? sekwencj? zasad i unieruchomiony w strefie przechwytywania na pierwszym elemencie i/lub drugim elemencie przed zwi?zaniem pierwszego i drugiego cz?onu ze sob?; ii) odczynnik A zawieraj?cy koniugat (N2-L1) z?o?ony z drugiego kwasu nukleinowego (N2) o sekwencji co najmniej komplementarnej do sekwencji zasad pierwszego kwasu nukleinowego i (2) pierwszego ligandu (L1) zdolny do swoistego wi?zania z badan? substancj? biologiczn? (O); iii) odczynnik B zawieraj?cy koniugat (L2-M) powsta?y w wyniku wi?zania markera (M) z drugim ligandem (L2) zdolnym do swoistego wi?zania si? z badan? substancj? biologiczn? (O).

Znane ze stanu techniki rozwi?zania nie umo?liwiaj? prowadzenia hodowli w monowarstwie trzech dowolnych, zarówno nowotworowych, jak i prawid?owych, linii komórkowych w ró?nych konfiguracjach oraz na obserwowanie migracji komórkowych, co jest niezwykle istotne w procesie nowotworzenia. Istotna jest równie? potrzeba mo?liwo?ci obserwacji oddzia?ywa? mi?dzykomórkowych w kokulturze (np. komórka nowotworowa - prawid?owa), gdzie komórki mog? ze sob? oddzia?ywa? na drodze np. wysy?ania sygna?ów ?mierci oraz sterowanie pr?dko?ciami przep?ywu wprowadzanych strumieni i otrzymanie kokultur z?o?onych z dwóch oraz trzech linii komórkowych w ró?nych proporcjach.

Mikrosystem wed?ug wzoru u?ytkowego sk?ada si? z dwóch po??czonych trwale warstw: p?ytki szklanej oraz warstwy poli(dimetylosiloksanu) (PDMS). Materia? ten zosta? wybrany ze wzgl?du na korzystne w?a?ciwo?ci w odniesieniu do prowadzenia bada? biologicznych. Jest on transparentny w szerokim zakresie fal elektromagnetycznych, nietoksyczny, przepuszczalny dla gazów oraz umo?liwia odwzorowywanie mikrostruktur z du?? dok?adno?ci?. Szk?o jako materia? hydrofilowy zapewnia podstaw? do adhezji i proliferacji komórek. Natomiast hydrofobowy PDMS zawiera w swojej strukturze sie? mikrokana?ów i mikrokomór hodowlanych otrzymanych przy u?yciu metody replikacyjnej. W warstwie poli(dimetylosiloksanu) znajduje si? sie? trzech, nie po??czonych ze sob? mikrokana?ów g?ównych. Ka?dy mikrokana? g?ówny posiada na jednym ko?cu otwór wlotowy i zawiera sze?? mikrokomór hodowlanych do hodowli komórek w monokulturze. Na drugim ko?cu ka?dego mikrokana?u g?ównego znajduje si? mikrokana? z dwoma dodatkowymi mikrokomorami hodowlanymi ka?dy dla hodowli poszczególnej linii komórkowej, przy czym mikrokana?y te schodz? si? w jednym punkcie, a ponadto mikrokana?y te s? ze sob? po??czone dwoma mikrokana?ami poprzecznymi o ró?nych d?ugo?ciach, przebiegaj?cymi przez dodatkowe mikrokomory hodowlane do tworzenia kokultury komórkowej oraz obserwacji migracji. Od punktu zbiegu mikrokana?ów biegnie mikrokana? wylotowy zako?czony otworem wylotowym i na d?ugo?ci tego kana?u znajduj? si? ostatnie trzy mikrokomory hodowlane, gdzie otrzymuje si? wymieszanie w ró?nym stopniu trzech linii komórkowych na etapie wprowadzania zawiesin komórkowych.

Korzystnie szeroko?? i wysoko?? mikrokana?ów wed?ug wzoru u?ytkowego wynosi odpowiednio 150 ?m oraz 100 ?m, natomiast ?rednica okr?g?ych mikrokomór wynosi 1 mm.

Trzy mikrokana?y g?ówne wraz z otworami wlotowymi s?u?? do wprowadzania zawiesin komórkowych oraz ?wie?ego medium hodowlanego w celu zapewnienia komórkom niezb?dnych w?a?ciwo?ci od?ywczych. Na ko?cu mikrowzoru znajduje si? kana? wylotowy wraz z otworem, umo?liwiaj?cym odprowadzenie przep?ukiwanych p?ynów z mikrouk?adu.

Ponadto, geometria sieci mikrokana?ów w opracowanym mikrosystemie dostosowana zosta?a do uk?adu pomiarowego czytnika p?ytek wielodo?kowych i odpowiada ona rozmieszczeniu do?kom na komercyjnie dost?pnej p?ytce 384-do?kowej. Dlatego, przy u?yciu specjalnego holderu mo?liwe s? bezpo?rednie pomiary spektrofluorymetryczne w czytniku p?ytek wielodo?kowych, co w znacz?cy sposób zwi?ksza efektywno?? prowadzonych bada?. Dzi?ki zastosowaniu warunków mikroprzep?ywowych, fizjologiczne ?rodowisko wzrostu komórek jest znacznie lepiej odwzorowane w porównaniu z hodowlami komórkowymi prowadzonymi w klasycznej skali laboratoryjnej (makroskali).

Istot? mikrouk?adu wed?ug wzoru jest mo?liwo?? prowadzenia hodowli w monowarstwie trzech dowolnych, zarówno nowotworowych, jak i prawid?owych, linii komórkowych w ró?nych konfiguracjach. Pozwala to na obserwowanie migracji komórkowych, co jest niezwykle istotne w procesie nowotworzenia. Mikrouk?ad wed?ug wzoru u?ytkowego daje równie? mo?liwo?? obserwacji oddzia?ywa? mi?dzykomórkowych w kokulturze (np. komórka nowotworowa - prawid?owa), gdzie komórki mog? ze sob? oddzia?ywa? na drodze np. wysy?ania sygna?ów ?mierci. Utworzenie takiej kokultury jest mo?liwe dzi?ki zjawisku hydrodynamicznego ogniskowania w mikroskali. Istot? wzoru jest to, ?e steruj?c pr?dko?ciami przep?ywu wprowadzanych strumieni mo?liwe jest otrzymanie kokultur z?o?onych z dwóch oraz trzech linii komórkowych w ró?nych proporcjach. Mikrosystem przep?ywowy wed?ug wzoru mo?e mie? zastosowanie na etapie bada? przedklinicznych przesiewowego testowania leków.

Mikrosystem zosta? przedstawiony na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia mikrosystem w widoku perspektywicznym z?o?eniowym, Fig. 2 przedstawia p?ytk? doln?, Fig. 3 przedstawia mikrosystem w przekroju wzd?u? kana?u 8b.

Mikrosystem wed?ug wzoru u?ytkowego sk?ada si? z dwóch po??czonych trwale warstw: p?ytki szklanej 1 o wymiarach 80 × 50 mm oraz warstwy poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) 2. Materia? ten zosta? wybrany ze wzgl?du na korzystne w?a?ciwo?ci w odniesieniu do prowadzenia bada? biologicznych. Jest on transparentny w szerokim zakresie fal elektromagnetycznych, nietoksyczny, przepuszczalny dla gazów oraz umo?liwia odwzorowywanie mikrostruktur z du?? dok?adno?ci?. Szk?o jako materia? hydrofilowy zapewnia podstaw? do adhezji i proliferacji komórek. Natomiast hydrofobowy PDMS zawiera w swojej strukturze sie? mikrokana?ów i mikrokomór hodowlanych otrzymanych przy u?yciu metody replikacyjnej. W warstwie polimerowej znajduje si? sie? trzech, nie po??czonych ze sob? mikrokana?ów g?ównych 8a, 8b i 8c. Ka?dy mikrokana? g?ówny posiada na jednym ko?cu otwór wlotowy 3a, 3b i 3c odpowiednio i zawiera sze?? mikrokomór hodowlanych 5a, 5b i 5c odpowiednio, do hodowli komórek w monokulturze. Na drugim ko?cu ka?dego mikrokana?u g?ównego 8 znajduje si? mikrokana? 8’ z dwoma dodatkowymi mikrokomorami hodowlanymi 6a, 6b i 6c odpowiednio, ka?dy dla hodowli poszczególnej linii komórkowej, przy czym mikrokana?y te schodz? si? w jednym punkcie, a ponadto mikrokana?y te s? ze sob? po??czone dwoma mikrokana?ami poprzecznymi 9 o ró?nych d?ugo?ciach, przebiegaj?cymi przez dodatkowe mikrokomory hodowlane 6 do tworzenia kokultury komórkowej oraz obserwacji migracji. W mikrokomorach 6b mo?liwe jest otrzymanie kokultury poprzez wymieszanie w ró?nym stopniu trzech linii komórkowych, natomiast w mikrokomorach 6a oraz 6c dwóch linii, na etapie wprowadzania zawiesin komórkowych. Od punktu zbiegu mikrokana?ów 8’ biegnie mikrokana? wylotowy 10 zako?czony otworem wylotowym 4 i na d?ugo?ci tego kana?u 10 znajduj? si? ostatnie trzy mikrokomory hodowlane 7, gdzie otrzymuje si? wymieszanie trzech linii komórkowych na etapie wprowadzania zawiesin komórkowych. Szeroko?? i wysoko?? wszystkich mikrokana?ów wynosi odpowiednio 150 ?m oraz 100 ?m, natomiast ?rednica wszystkich okr?g?ych mikrokomór wynosi 1 mm.

Trzy mikrokana?y g?ówne 8 wraz z otworami wlotowymi 3 s?u?? do wprowadzania zawiesin komórkowych oraz ?wie?ego medium hodowlanego w celu zapewnienia komórkom niezb?dnych w?a?ciwo?ci od?ywczych. Na ko?cu mikrowzoru znajduje si? kana? wylotowy 10 wraz z otworem 4, umo?liwiaj?cym odprowadzenie przep?ukiwanych p?ynów z mikrouk?adu.

Wytworzenie mikrosystemu wed?ug wzoru u?ytkowego polega na zaprojektowaniu mikrowzoru w programie np. SolidWorks, z dok?adno?ci? odwzorowania wymiarów wynosz?c? 1 ?m. Nast?pnie, model ten t?umaczony jest na j?zyk maszynowy z u?yciem modu?u CAM - SolidCAM. Mikrosystem wytworzono w poli(dimetylosiloksanie) (PDMS) metod? replikacyjn?. Metoda ta polega na usieciowaniu prepolimeru PDMS (mieszaniny monomeru z czynnikiem sieciuj?cym) w odpowiedniej formie b?d?cej negatywowym odzwierciedleniem ko?cowego elementu. Istnieje wiele metod wytwarzania form, w?ród których przewa?aj? metody oparte na fotolitografii, gdy? zapewniaj? one bardzo du?? rozdzielczo??, a tak?e umo?liwiaj? wytwarzanie struktur o rozmiarach mniejszych ni? 1 ?m. Niew?tpliw? wad? tych metod jest jednak ich wieloetapowo??, a tak?e trudno?? w uzyskiwaniu struktur o ró?nych wysoko?ciach.

Forma mikrosystemu wytworzona jest metod? mechaniczn? przy pomocy mikrofrezowania. Form? wytworzono w polimetakrylanie metylu) (PMMA). Jako materia? bazowy wykorzystano formatk? z PMMA o wymiarach 100 mm × 100 mm i grubo?ci 5 mm. W pierwszym etapie, w centralnej cz??ci bazowej p?ytki wytworzono prostok?tn? kiesze? o wymiarach (80 × 50 mm) i g??boko?ci 3,9 mm. Kiesze? zosta?a wykonana przy pomocy frezu czo?owo-walcowego obracaj?cego si? z pr?dko?ci? 10 000 obr/min oraz poruszaj?cego si? po osi wzd?u?nej z pr?dko?ci? 500 mm/min. Nast?pnie, bezpo?rednio na dnie wykonanej uprzednio kieszeni wyfrezowano w?a?ciw? piecz?tk? poprzez usuni?cie warstwy materia?u o grubo?ci 100 ?m. Piecz?tk? t? wykonano frezem o ?rednicy 500 ?m, wiruj?cym z pr?dko?ci? 12 000 obr/min i poruszaj?cym si? w p?aszczy?nie równoleg?ej do frezowanej powierzchni z liniow? pr?dko?ci? 500 mm/min. Zachodzenie frezu przy s?siednich przejazdach nastawiono na 70%. W wyniku tych dzia?a? powsta? wypuk?y model mikrokana?ów i komór o wysoko?ci 100 ?m. Na tak wytworzon? form?, po usuni?ciu wiórów, umyciu i osuszeniu, wylano prepolimer i pozostawiono do usieciowania w temperaturze 70°C przez 1 h. Nast?pnie oddzielono form? od bloku PDMS otrzymuj?c gotowy element z wiernie odwzorowanymi mikrokana?ami. Po zmro?eniu warstwy PDMS w ciek?ym azocie, wywiercono otwory wlotowe i wylotowy. Nast?pnie po oczyszczeniu i osuszeniu, p?ytka PDMS zosta?a po??czona z p?ytk? szklan? przy zastosowaniu techniki niskotemperaturowej plazmy tlenowej.

Po umieszczeniu w otworach wlotowych i wylotowym w??yków, mikrouk?ad poddany zosta? sterylizacji promieniowaniem UV oraz dzia?aniem 70% etanolu. Do tak przygotowanego mikrouk?adu, przez otwory wlotowe wprowadzono trzy odr?bne zawiesiny komórkowe: A375, HaCaT oraz MeWo. Po 24 godzinach otworami wlotowymi wprowadzono fotouczulacz - lek stosowany w przeciwnowotworowej terapii fotodynamicznej i zbadano jego dzia?anie cyto- oraz fototoksyczne. W tym celu do mikrouk?adu wprowadzono barwnik fluorescencyjny AlamarBlue i dokonano pomiaru fluorymetrycznego z wykorzystaniem czytnika p?ytek wielodo?kowych.

Claims (1)

1. Wielofunkcyjny mikrosystem przep?ywowy sk?adaj?cy si? z dwóch po??czonych trwale warstw: p?ytki szklanej oraz warstwy poli(dimetylosiloksanu), przy czym jedna z p?ytek zawiera sie? mikrokana?ów z mikrokomorami hodowlanymi oraz otwory wlotowe i wylotowe, znamienny tym, ?e w warstwie poli(dimetylosiloksanu) (2) znajduje si? sie? trzech, nie po??czonych ze sob? mikrokana?ów g?ównych (8a, 8b i 8c) posiadaj?cych na jednym ko?cu otwór wlotowy (3a, 3b i 3c) odpowiednio i zawiera sze?? mikrokomór hodowlanych (5a, 5b i 5c) odpowiednio, ana drugim ko?cu ka?dego mikrokana?u g?ównego (8a, 8b i 8c) znajduje si? mikrokana? (8’) zdwoma dodatkowymi mikrokomorami hodowlanymi (6a, 6b i 6c) odpowiednio, przy czym mikrokana?y (8’) schodz? si? w jednym punkcie, a ponadto mikrokana?y te s? ze sob? po??czone dwoma mikrokana?ami poprzecznymi (9) o ró?nych d?ugo?ciach, przebiegaj?cymi przez dodatkowe mikrokomory hodowlane (6), a od punktu zbiegu mikrokana?ów (8’) biegnie mikrokana? wylotowy (10) zako?czony otworem wylotowym (4) i na d?ugo?ci tego kana?u (10) znajduj? si? ostatnie trzy mikrokomory hodowlane (7). Mikrosystem wed?ug zastrz. 1, znamienny tym, ?e szeroko?? i wysoko?? wszystkich mikrokana?ów wynosi odpowiednio 150 ?m oraz 100 ?m, natomiast ?rednica wszystkich okr?g?ych mikrokomór wynosi 1 mm.