Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatów farmaceutycznych z zastosowaniem srodka inaktywujacego przy wytwarzaniu substan¬ cji immunizujacych (antygenów wzglednie immu- nogenów) dla preparatów farmaceutycznych, na przyklad szczepionek wirusowych i bakteryjnych.Wiadomo, ze do wytwarzania wyzej wymienionych preparatów farmaceutycznych potrzebne sa sposo¬ by, wzglednie srodki inaktywujace, które skutecz¬ nie niszcza zakaznosc stosowanych wirusów lub bakterii, lecz pozostawiaja calkowicie nienaruszone ich wlasnosci antygenowe.Celem wytworzenia skutecznie zinaktywowanych preparatów, proces ten musi przebiegac jako reakcja pierwszego rzedu, aby mozna bylo z cala pewno¬ scia ustalic moment calkowitej utraty zakaznosci.Nie ma to miejsca przy licznych stosowanych spo¬ sobach inaktywowania (za pomoca ciepla, swiatla nadfioletowego) wzglednie przy srodkach inakty- wujacych (formaldehyd, nadtlenek wodoru, (3— —propiolakton). Inne znane substancje, nie posia¬ dajace tej wady, sa chemicznie nietrwale, jak na przyklad acetyloetylenoiminy (opis patentowy RFN nr 1 041648) lub tez wymagaja dluzszego czasu dzialania i/lub wyzszych stezen, jak na przyklad w przypadku etyloetylenoiminy (zgloszenie paten¬ towe RFN P 19 24 303.9).Stwierdzono, ze do wytwarzania substancji immu¬ nizujacych (antygenów wzglednie immunogenów) dla preparatów farmaceutycznych mozna stosowac 2 znana etylenoimine o wzorze podanym na rysunku.Niespodziewanie etylenoimina nie wykazuje wy¬ zej wymienionych wad znanych srodków inakty- wujacych. Etylenoimina jest technicznie bardzo la- two dostepna, jest bardzo trwTala i daje sie dobrze skladowac i umozliwia w reakcji pierwszego rzedu szybkie i pewne inaktywowanie zakaznych drobno¬ ustrojów, nie wplywajac ujemnie na ich wlasciwosci antygenowe, wzglednie immunizujace. W ciagu io krótkiego czasu reakcji przy porównywalnie niskim stezeniu inaktywowanie przebiega szczególnie la¬ godnie w stosunku do inaktywowanego materialu.Zastosowanie etylenoiminy jako srodka inaktywu¬ jacego przy wytwarzaniu substancji immunizuja- cych dla preparatów farmaceutycznych stanowi wiec wzbogacenie farmacji.Etylenoimine dodaje sie do inaktywowanych za¬ wiesin wirusów, wzglednie bakterii do osiagniecia stezenia koncowego 0,005—2% (obj/obj), zwlaszcza 0,01—0,5% (obj/obj). Czas trwania reakcji wynosi, w zaleznosci od warunków doswiadczenia, kilka godzin do dwóch dni. Stosuje sie temperatury 0— —45°C, zwlaszcza 20—37°C.Szczepy wirusów i bakterii inaktywowane etyle- noimina mozna stosowac do zapobiegania i leczenia zakazen wirusami, i bakteriami zarówno w medy¬ cynie, jak i w weterynarii. Antygeny wirusowe lub bakteryjne, wytworzone sposobem wedlug wynala¬ zku, mozna przerabiac na leki w znany sposób i sto- sowac w postaci roztworu, syropu, emulsji, zawie- 88 703i WToa siny, spray'u, masci, pasty, kremu, plynu do zmy- wan, aerozolu, tabletki itp.Preparaty wytwarza sie w znany sposób, na przy¬ klad przez rozcienczanie preparatów wirusowych lub bakteryjnych, inaktywowanych sposobem we¬ dlug wynalazku, odpowiednimi rozpuszczalnikami i /lub obojetnymi, nietoksycznymi, stalymi, pólsta¬ lymi lub cieklymi nosnikami, stosujac ewentualnie srodki emulgujace i/ lub dyspergujace rozpylajace i pedne oraz przy zastosowaniu odpowiednich sta- tylicatorów. ' }akp rozpuszczalniki, ftosniki, srodki emulgujace, wzglednie dyspergujace mozna wymienic wode, nie¬ toksyczne organiczne rozpuszczalniki wzglednie roz¬ cienczalniki takie, jak parafiny, na przyklad frak¬ cje ropy naftowej, oleje roslinne, na przyklad olej z orzeszków ziemnych, olej sezamowy, alkohole, na przyklad alkohol etylowy, gliceryna, glikole, na przyklad glikol propylenowy, glikol polietylenowy % wode. Jako stale nosniki stosuje sie na przyklad naturalne' maczki mineralne, na przyklad kwafe krzemowy o wysokim stopniu dyspersji, krzemiany, cukry, na przyklad cukier trzcinowy, mlekou y i gro¬ nowy, wodorotlenek glinowy, wielocukry, na przy¬ klad dekstryny, agar.Jako srodki emulgujace stosuje sie emulgatory nie- Jonotwórcze i anionowe, na przyklad estry polioksy- etylenowe kwasów tluszczowych, estry polioksyety- lenowe alkoholi tluszczowych, sulfoniany alkilowe i sulfoniany arylowe, jako srodki dyspergujace sto¬ suje sie na przyklad lignine, lugi posiarczynowe, metyloceluloze, skrobie i poliwinylopirolidon, a ja¬ ko srodki zwiekszajace poslizg na przyklad steary¬ nian magnezowy, tak, kwas stearynowy i laurylo- siarczan sodowy.Jako stabilizatory mozna wymienic aminokwasy, cukry, bialka, wielocukry, glikole pohalkilenowe.Stabilizatory te mozna dodawac zarówno w roz¬ tworze wodnym, jak tez liofilizowane, Inaktywo- wane sposobem wedlug wynalazku szczepy wiru¬ sów lub bakterii* wzglednie wytworzone z nich ipo- fobem wedlug wynalazku srodki lecznicze mozna stosowac w znany sposób, na przyklad doustnie, do- mie^niowo, dootrzewnowo, podskórnie, miejscowo, zwlaszcza na wszelkie blony sluzowe ciala ludzkie* go i zwierzecego. Ponizsze przyklady wyjasniaja bliiej sposób wedlug wynalazku.Przyklad l. tk roztworu wirusa choroby py* aka i rade (MKS), typ C, wartosc pH~8,*, w postaci odwirowanej cieczy hodowlanej z zakazonej ciaglej hodowli komórek jader . cielecych, dodaje sie 2% (obj/obj) zobojetniony roztwór etylenoiminy do ste¬ zania koncowego 0,03% (obj/obj). Mieszanine utrzy¬ muje sie, mieszajac, w temperaturze 3T€. Po uply¬ wie okreslonych odstepów czasu pobiera sie z tego roztworu próbki. Reakcje inaktywowania zatrzy¬ muje sie za kazdym razem przez dodanie 10% objetosciowych 20% roztworu tiosiarczanu sodo¬ wego.Pobranymi próbkami, nierozcienczonymi i roz¬ cienczonymi dziesieciostopniowo, zaszczepia sie po Id probówek z hodowla tkankowa pierwotnych komó¬ rek nerki cielecej w ilosci 0,1 ml. Oznaczone przy tym miana wirusowe wykazuja z uplywem czasu spadek, odpowiadajacy reakcji pierwszego rzedu.Po uplywie 3 godzin dzialania nie mozna bylo jui- wykazac zakaznosci, nawet po zaszczepieniu 0,5 ml.Rysunek pokazuje przebieg inaktywacji wirusa MKS, typ C w temperaturze 37°C i przy wartosci pH *= 8,0.Na osi rzednych odklada sie logarytm jednostek za¬ kaznych, na osi odcietych czas oddzialywania w godzinach. Krzywa 1 pokazuje przebieg inaktywo¬ wania przy stezeniu koncowym 0,03% (obj/obj).Roztwór wirusów, traktowany w ten sposób w ciagu 4 godzin, zaszczepia sie w ilosci 0,1 ml 20j myszom w wieku 3—4 dni dootrzewnowo i w ilosci 1,5 ml 5 swinkom morskim podskórnie. Zadne ze zwierzat nie wykazalo jakichkolwiek objawów cho¬ roby. Po uplywie.3: tygodni po szczepieniu mozna bylo wykazac w surowicy wszystkich swinek mor¬ skich zobojetniajace przeciwciala przeciw nietrak- towanemu uprzednio zakaznemu wirusowi wyjscio¬ wemu'; ;;. \ Roztwór wirusów, inaktywowany w ten sposób, wykazal równie wysoka zdolnosc wiazania- dopel-* niacza, jak nietraktowany, aktywny wyjsciowy roz¬ twór wirusów.Przyklad II. Równolegle i w bezposrednim porównaniu ze sposobami, opisanymi w przykladzie I stosuje sie zamiast 0,03% (obj/obj) etylenoiminy nastepujace substancje i stezenia: a) 0,05% (obj/obj) etylenoiminy (patrz rysunek,, krzywa 2) b) 0,05% (obj/obj) etyloetylenoiminy patrz rysunek^ krzywa 3) c) 0,05% (obj/obj) N-acetyloetylenoiminy (patrz, rysunek, krzywa 4) d) 0,05% (obj/obj) 2,2,-dwumetyloetylenoiminy (patrz, rysunek, krzywa 5) e) 0,05% (obj/obj) izopropyloetylenoiminy patrz rysunek, krzywa 6) Rysunek pokazuje przebieg inaktywacji. Przy ety- lenoiminie (krzywa 2) nie mozna bylo po uplywie 1,5 godziny wykazac obecnosci wirusa, zdolnego do wywolania zakazenia* przy pozostalych substancjach osiagana ten stan dopiero po 7-*8 godzinach, wzgle* dnie po U godzinach.Przyklad UL Sposób, opisany w przykladzie- I, powtarza sie w temperatura* reakcji WC zmmiast STC 31 uplywem euro stwierds* sit Hwnie* Unio* wy spadek zakainoseL Po uptywi* lii godzin nie mozna bylo juz wykazac obecnosci sakainego wi- w Przyklad IV. Sposób, opisany w przykladzie I, przeprowadza sie, stosujac roatwór wirusa MKS typ Oj. Po okresie reakcji wynoszacym 4 godziny, nie mozna jui bylo stwierdzic aakaznosci Przyklad V. Roztwory wirusa MKS typ C 55 i typ Ot inaktywuje sie w kazdym przypadku spo¬ sobem, opisanym w przykladzie I, w ciagu 5 lub 6 godzin. Znanym sposobem za pomoca glikolu poli¬ etylenowego wytwarza sie z nich koncentraty wi*- rusowe, którymi zaszczepia sie w kazdym przypadku eo domiesniowo po 1 ml 5 wrazliwym, prosietom. Gdy wiec w okresie 10 dni nie pojawily sie zadne ob¬ jawy chorobowe, miesza sie w kazdym przypadku równe czesci inaktywowanych koncentratów wiru¬ sowych z adjuwantem i wstrzykuje domiesniowe- §5 20 swiniom. Wszystkie zwierzeta wytworzyly zobo*-«tw jetniajace przeciwciala w stosunku do obydwu ak¬ tywnych typów wirusów. Po uplywie 8 tygodni po zaszczepieniu 10 zwierzat sposród 10 byto zimmuni- zowanych w stosunku do aktywnego wirusa MKS typ C, a w stosunku do aktywnego wirusa MKS typ 0i bylo zimmunizowanych 9 na ?0 zwierzat, jedno z nich zachorowalo, jednakze w stopniu zna¬ cznie lzejszym, niz zwierzeta kontrolne, nie trak¬ towane uprzednio.Przyklad VI. Sposób, opisany w przykladzie 1, stosuje sie do inaktywowania zakaznej bydlecej Rhinotracheitis (IBH)-przedstawicjela wirusów za¬ wierajacych kwas desoksyrybonukleinowy — zamiast wirusa MKS, zawierajacego kwas rybonukleinowy.Równiez w tym przypadku stwierdza sie liniowy spadek miana zakaznosci tak, ze po 6 godzinach . trwania reakcji nie mozna bylo wykazac zakaznosci. swinkom morskim wstrzykuje sie domiesniowo po 2 ml roztworu wirusa, traktowanego w ciagu 6 godzin. Po uplywie 3 tygodni po szczepieniu wy¬ kazano w surowicy tych zwierzat przeciwciala zo¬ bojetniajace w stosunku do wirusa IBR.Przyklad VII. Do zawiesiny bakterii Pasteu- rella haemolitica, zawierajacej okolo 1010 bakterii (ml, dodaje sie analogicznie do sposobu, opisanego w przykladzie I, etylonoimine do stezenia konco¬ wego 0,05% (obj/obj). Po uplywie 14 godzin w tem¬ peraturze 37°C odwirowuje sie mase bakteryjna i ponownie zawiesza w jalowym roztworze soli ku¬ chennej, zawierajacym bufor fosforanowy.Próbka tak wytworzonego preparatu zaszczepia sie 3 rozmaite pozywki z bakteriami i inkubuje w temperaturze 37°C. W ciagu 6 dni nie stwierdza sie wzrostu bakterii.Inna próbe wstrzykuje sie w dawkach po 0,1 ml dootrzewnowo 20 myszom. Po uplywie 24 i 48 go¬ dzin zwierzeta nie wykazaly zadnych objawów cho- i* robowych, podczas gdy z 20 zwierzat, którym wstrzyknieto te sama, lecz nie traktowana zawie¬ sine bakterii, zginelo 15 zwierzat w ciagu 16 godzin i 5 zwierzat w ciagu 24 godzin.¦ Inna próbke miesza sie z taka sama obojetnoscia adjuwanta. Zaszczepia sie podskórnie po 1,5 ml tej szczepionki 5 królikom. Szczepienie powtarza sie po 14 dniach. U zadnego z tych zwierzat nie stwierdza sie bakteremii. W surowicy tych zwierzat mozna bylo ustalic za pomoca testu aglutynacyjnego miano przeciwciala w stosunku do tych samych bakterii, przy czym po szczepieniu przypominajacym miano to uleglo wyraznemu podwyzszeniu. PL PL