PL89687B1 - Immunostimulant agent compositions thereof and methods for their preparation[gb1419969a] - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania roztworu iniekcyjnego, zawierajacego czynnik immunostymulujacy.W znanym stanie techniki roztwór iniekcyjny, zawierajacy czynnik immuróstymulujacy, przygotowuje sie przez ekstrakcje bakterii rozpuszczalnikami organicznymi, oddzielenie czesci nierozpuszczalnych od rozpuszczalnika, odrzucenie fazy cieklej i zmieszanie nierozpuszczonej fazy stalej z nosnrfitlem, nie wywolujacym reakcji ubocznych. Przygotowany w ten sposób roztwór iniek Celem wynalazku jest wytworzenie nietoksycznego rozporu iniekcyjnego.Stwierdzono, ze nietoksyczny roztwór iniekcyjny mozna wytwarzac bez wyodrebniania cpyrutika immunostymulujacego z rozpuszczalnika, przy uzyciu którago ekstrahuje sie czynnik imj»**#i0$tymulujacy z bakterii.Sposób wytwarzania roztworu iniekcyjnego, zawierajacego czynnik immunostymulujacy^ WJ^lug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze kontaktuje sie z obojetnym nosnikiem, nadajacym sie do iniekcji, fOZi||$* chloroformowy czynnika bakteryjnego, usuwa chloroforfn zwlaszcza przez odparowanie i homogenizuje roz^afclr iniekcyjny do uzyskania rozmiarów czastek sta Lych poRizej 20 /i.Roztwór Chloroformowy czynnika immunostymulujacego otrzymuje sie w znany sposób, przez zawieszenia bakterii w mieszaninie rozpuszczalników, zlozonych z weglowodoru chlorowcowanego takiego , jak chloroform i alkoholu np. matanolu, oddziela zwlaszcza przez wirowanie, frakcje nierozpuszczalne, frakcje ciekla odparowuje pod zmniejszanym cisnieniem i pozostalosc przenosi do chloroformu.Opis realizacji wynalazku i badania farmakologiczne roztworu iniekcyjnego, wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku podano w przykladach.Przyklad I. A. Przygotowanie roztworu chloroformowego2 89 687 Jako zródlo czynnika im mu nostymalujacego stosowano nastepujace materialy: komórki sledziony myszy, komórki sledziony myszy, zakazonej bakteriami Listeria monocytogenes (serotyp I nr 54 149 ze zbioru Instytutu Pasteura), Listeria monocytogenes (szczep jak wyzej), Salmonella typhimurium (szczep C 5 zbioru Instytutu Pasteura), Corynebacterium parvum) szczep nr 936 B ze zbioru Instytutu Pasteura), Eschericha coli K 12 (szczep nr C 600 ze zbioru Instytutu Pasteura), Mycobacterium tuberculosis (szczep BCG z Instytutu Pasteura), Vibro cholera (szczep z Instytutu Pasteura), Bacillus subtilis i Saccharomyces cerevisiae. Ekstrakcje przeprowadza sie w sposób nizej opisany lub podobny.Poszczególne próbki zadano dziesieciokrotna objetoscia mieszaniny 1 :1 chloroformu z metanolem i calosc homogenizowano przez rozcieranie w ciagu 2 godzin w temperaturze 4°C a nastepnie otwierano przy 3500 G w ciagu 20 minut. Supernatant odparowano w temperaturze 40°C, pod zmniejszonym cisnieniem przy uzyciu pompy wodnej, a pozostalosc zadano chloroformem w objetosci, równej dwukrotnej objetosci próby poczatkowej i w ciagu 30 minut wirowano z szybkoscia 40 obrotów/minute, a nastepnie przesaczono przez bibule Whatman nr 3. Przesacz, zawierajacy czynnik immunostymulujacy, przechowano w naczyniu szklanym w temperaturze 4°C.B. Wytworzenie roztworu iniekcyjnego Substancje, stanowiace czynnik immunostymulujacy, sa rozpuszczalne w chloroformie, a nie rozpuszczaja sie w wodzie. Roztwór chloroformowy przeprowadzono w zawiesine wodna, nadajaca sie do iniekcji, postepujac w nastepujacy sposób: do chloroformowego roztworu dodano obliczonej ilosci apirogennego (nie wywolujacego goraczki) 0,85% roztworu wodnego chlorku sodu. Przez rurke, wprowadzona do warstwy chloroformowej, przepuszczano obojetny gaz taki, jak azot lub mieszanina 95% powietrza i 5% dwutlenku wegla, az do calkowitego odpedzenia chloroformu. Czynnik immunostymulujacy, znajdujacy sie poczatkowo w roztworze chloroformowym, przyjal postac wodnej zawiesiny, która celem zmniejszenia rozmiarów zawieszonych czastek, homogenizowano. Homognizacje celem zmniejszenia czastek zawiesiny do wymiarów ponizej 20 mikronów, przeprowadzano za pomoca strzykawki i igvy o srednicy wewnetrznej 0,4 mm przez wielokrotne wciaganie i wytlaczanie rzeczonej zawiesiny przez rzeczona igle.Przyklad II. Badania farmakologiczne roztworu iniekcyjnego. Badania przeprowadzono na myszach NCS Patologii Doswiadczalnej Instytutu Pasteura (Service du Pathologie Experimentale de Mnstitut Pasteur (oraz z hodowli CNRS d' Orleans la Source, obu pl*ci, wieku 3—5 tygodni, wagi 15—20 gramów.Opisane ponizej wyniki otrzymano, wprowadzajac myszom 0,5 ml dawki wyzej opisanej zawiesiny dozylnie, podskórnie lub dootrzewnowe Iniekcje nie powodowaly widocznych objawów zatrucia — zarówno natychmiastowego, jak i po uplywie 5 miesiecy.A. Uodpornianie myszy na zakazenie bakteriami Listeria monocytogenes i Salmonella typhimurium. < Myszy zakazono bakteriami Listeria monocytogenes serotyp I nr 54 149 i Salmonella typhimurium, szczep C 5, oba ze zbiorów Instytutu Pasteura. Zakazono zwierzeta, uprzednio potraktowane dozylna lub dootrzewna dawka 0,5 ml zawiesiny czynnika immunostymulujacego, otrzymanego z wyzej wymienionych zródel i zwierzeta kontrolne.Myszy, uprzednio potraktowane wprowadzona dootrzewnono dawka czynnika immunostymulujacego, wykazaly w stosunku do Listeria monocytogenes opornosc, równa dziesieciokrotnej dawce, dajacej 50% smiertflnosci (LD 50) zwierzat kontrolnych, a potraktowane dozylnie opornosc, 75 krotnie przewyzszajaca LD 50 czynnika chorobotwórczego w próbkach kontrolnych.W przypadku zakazenia bakteriami Salmonella typhimurium opornosc wzrastala okolo 20 krotnie, jezeli czynniki immunostymulujace wprowadzono dozylnie, a w przypadku wprowadzenia doustnego nawet 100 krotnie. < Skuteczne uodpornienie myszy osiagano, wprowadzajac czynnik immunostymulujacy na 3 godziny przed iniekcja, a dzialanie ochronne trwalo w ciagu 30 dni.B. Wplyw dootrzewnej iniekcji czynnika immunostymulujacego, wyodrebnionego z Listeria monocytogenes na wage sledziony, na wage grasicy i na komórki otrzewnej.Badania przeprowadzono na pieciotygodniowych myszach NCS. 1. Waga sledziony: iniekcja czynnika nie wywolala zmian wagi sledziony w czasie od 2 godzin do 4 dni po zabiegu. 2. Waga grasicy: nie stwierdzono zmian. 3. Ilosciowe i jakosciowe zmiany komórek otrzewnej: ocene komórek przeprowadzono po wykrwawieniu myszy i iniekcji do jamy otrzewnej 5 ml mieszaniny, zawierajacej 2% albuminy krowiej i heparyne w stezeniu 5 jednostek w ml, sposobem opisanym w Science 160, 795 (1968).Zaobserwowano nastepujace zmiany liczby makrofagów, komórek wielojadrzastych i limfocytów w funkcji czasu:89 687 3 a) makrofagi: po poczatkowym okolo 50% obnizeniu, poczawszy od dwudziestej czwartej godziny liczba makrofagów utrzymywala sie na poziomie wyzszym, niz u zwierzat kontrolnych.Rozmaz makrofagów (% makrofagów w rozmazie): wzrasta do czterdziestej ósmej godziny po iniekcji czynnika immunostymulujacego i pozostaje podwyzszony w ciagu 4 dni. b) komórki wielojadrzaste: w dwudziestej czwartej godzinie stwierdzono wystepowanie w jamie otrzewnej w niewielkich ilosciach. c)limfocyty: po poczatkowym nieznacznym spadku ilosci znaczny wzrost trzeciego dnia po iniekcji.Nalezy podkreslic, ze w trakcie badan nie stwierdzono zmniejszenia procentu makrofagów w rozmazie i ze nawet czwartego dnia po iniekcji makrofagi otrzewne nie wykazaly zauwazalnego wzrostu liczby ich lizozomów.Równiez zwiekszenie liczby komórek jest stosunkowo nieznaczne (ponizej 100%). Te wyniki wyraznie odrózniaja badany czynnik immunostymulujacy od klasycznych: BCG i endotoksyn.Powyzsze wyniki przedstawiono graficznie na figurach 1 i la. Na figurze 1 zmiany procentu makrofagów w rozmazie funkcji czasu, uplywajacego od iniekcji czynnika immunostymulujacego zwierzetom doswiadczalnym (krzywa C) i plynu fizjologicznego zwierzetom kontrolnym (krzywa T). Na figurze 1a zmianyw czasie, uplywajacym od iniekcji liczby makrofagów w ml u zwierzat doswiadczalnych (krzywa Ci) i kontrolnych (krzywa Tx) oraz liczby limfocytów u zwierzat doswiadczalnych (krzywa C2) i kontrolnych (krzywa T2).C, Wplyw iniekcji dozylnej czynnika immunostymulujacego, wyekstrahowanego z Listeria monocytogenes na wage sledziony i wage garasicy oraz na komórki otrzewnej. 1. Waga sledziony i grasicy: podobnie, jak porzednio, nie notowano zmian wagi 2. Cechy krwi: iniekcja nie powodowala leukopenii i leukocytozy, 3. Ilosciowe i jakosciowe zmiany komórek otrzewnej. a) makrofagi: poczawszy od dwudziestej czwartej godziny po iniekcji, az do czwartego dnia liczba makrofagów byla nieco wyzsza u myszy doswiadczalnych, niz u zwierzat kontrolnych. Procent makrofagów w rozmazie ulegal u zwierzat doswiadczalnych natychmiastowemu zwiekszaniu, w porównaniu zwartoscia znaleziona dla zwierzat kontrolnych i utrzymywal sie na podwyzszonym poziomie wciagu calego okresu obserwacyjnego. * ;,b) limfocyty: po poczatkowym zmniejszeniu nastepuje wzrost, szczególnie zaznaczony w czterdziestej ósmej godzinie; po dalszych 24 godzinach powrót do normalnego poziomu.Powyzsze wyniki przedstawiono graficznie na figurach 2 i 2a, w sposób, podobny do omawianego w nawiazaniu do figur 1 Ma. Tak wiec zmiany % makrofagów w rozmazie w funkcji czasu u zwierzat doswiadczalnych przedstawia krzywa C3, a u zwierzat kontrolnych krzywa T3. Zmiane liczby makrofagów ilustruja krzywe C4 (zwierzeta doswiadczalne) i Cs (zwierzeta kontrolne).D. Wydalanie Salmonella typhimurium z krwi Myszom uprzednio potraktowanym zawiesina czynnika immunostymulujacego, otrzymana sposobem' wedlug wynalazku, wprowadzono dozylnie zawiesine Salmonella typhimurium C5 w ilosci 1,3 • 107 — 1. *107 zywych bakterii. W 2 minuty i w 2 godziny po iniekcji myszy usypiano eterem i pobierano z nich krew, która po odpowiednim jej rozcienczeniu posiewano zelatynowa pozywke, w celu oznaczenia ilosci obecnych w niej bakterii. » Na figurze 3 przedstawiono graficznie zmniejszanie liczby zywych bakterii w funkcji czasu, przy stosowaniu czynników immunostymulujacych, ekstrahowanych z materialów, uprzednio wymienionych. Krzywa A odnosi sie do ekstraktu z komórek nowotworu Ehrlicha, krzywa L do ekstraktu z Listeria monocytogenes, krzywa S do ekstraktu z Salmonella typhimurium, krzywa E do ekstraktu z Escherichia coli K 12, a krzywa T do kontroli.Przyspieszone wydalanie z krwi bakterii SalmoneMa zaznacza sie juz przy stosowaniu ekstraktu z komórek nowotworu Ehrlicha (odchylenie w stosunku do zwierzat kontrolnych = 1 log 10),, a przybiera znaczne wartosci przy uzyciu ekstraktów z Listeria monocytogenes, Escherichia coli K 12 i Salmonella typhimurium (odchylenie w stosunku do zwierzat kontrolnych 3 log 10). Podobne przyspieszenie wydalania daje stosowanie ekstraktów z Vibrio cholera i BCG. Jest godneuwagi, ze odchylenie nie przekracza wartosci 4 log 10 u myszy, specyficznie uodpornionej na Salmonella typhimurium.Przeprowadzono badania, majace na celu stwierdzenie, czy istnieje powiazanie miedzy iloscia wstrzyknietego czynnika immunostymulujacego, a szybkoscia wydalania bakterii z krwi. W tym celu 20 myszom, podzielonym na 4 grupy po 5 sztuk, wstrzyknieto dozylnie po 0,5 ml zawiesiny, zawierajacej odpowiednio 1, 10, 100 i 1000 /ig rzeczonego czynnika. Grupie zwierzat kontrolnych wstrzyknieto dozylnie plyn fizjologiczny. Po uplywie 15 godzin wszystkim zwierzetom wstrzyknieto dozylnie po 5 • 107 bakterii Salmonella typhimurium.Po uplywie 2 godzin pobrano zwierzetom krew i oznaczono w niej ilosc bakterii. Na figurze 4 przedstawiono graficznie liczbe bakterii, znalezionych we krwi w funkcji stezenia czynnika immunostymulujacego. Jak wynika z powyzszej figury, istnieje regularna zaleznosc miedzy stezeniem czynnika immunostymulujacego, a szybkoscia wydalania bakterii z krwi.4 89 687 Stwierdzono, ze podskórne wstrzykniecie na 15 godzin przed iniekcja zelu fosforanu wapnia, zawierajacego ekstrakt z Salmonella(,typhimurium, powoduje przyspieszenie wydalanie bakterii, co wskazuje na wysoka aktywnosc czynnika immunostymulujacego. Stwierdzono równiez, ze czynnik immunostymulujacy nie traci aktywnosci w wyniku ogrzewania w ciagu 15 minut w temperaturze 100°C.E. Okreslenie liczby bakterii Listeria monocytogenes w sledzionie i watrobie myszy Jak ustalono, iniekcja czynnika immunostymulujacego, wyekstrahowanego z Listeria monocytogenes lub z komórek nowotworu Ehrlicha uodparnia na zakazenie Listeria monocytogenes. Mozliwe jest scislejsze obliczenie reakcji myszy na te iniekcje, przez obliczenie ilosci bakterii w sledzionie i watrobie zwierzat, gdyz, jak wiadomo, Listeria rozwija sie jedynie w makrofagach tych organów.Powyzsze badania przeprowadzono na szesciu grupach myszy, którym uprzednio wstrzyknieto po 0,5 ml zawiesiny czynnikasimmunostymulujacego, wyekstrahowanego z: Listeria monocytogenes (L), Corynebacterium parvum (CP), Salmonella typhimurium (S), komórek nowotworu Ehrlicha (A) i sledziony myszy, a szóstej grupie (T) wstrzyknieto po 0,5 ml roztworu chlorku sodowego o stezeniu 0,85%.Po uplywie 18 godzin wszystkim myszom wprowadzono dozylnie bakterie Listeria monocytogenes w ilosci po 8 *104. Zwierzeta usmiercono przez rozciecie mózgu, po uplywie odpowiednio 2, 24 i 72 godzin po iniekcji.Wyciete watroby i sledziony roztarto i po rozcienczeniu posiano na zelatynie, okreslajac w ten sposób liczbe bakterii Listeria w momencie pobrania.Na figurach 5 i 5a przedstawiono zmiany ilosci bakterii Listeria monocytogenes w sledzionie i watrobie w funkcji czasu, wyrazonego w godzinach. Jak wynika z wykresów, w 2 godziny po infekcji liczba bakterii byla we wszystkich szesciu grupach jednakowa. To samo zaobserwowano w 24 godziny po infekcji, natomiast znaczne róznice wystapily w 72 godziny po infekcji. Watroby i sledziony zwierzat kontrolnych zawieraly ponad 107 bakterii. W sledzionie zwierzat, traktowanych czynnikiem immunostymulujacym, wyekstrahowanym z Listeria, Salmonella typhimurium i komórek nowotworu Ehrlicha liczba bakterii byla stokrotnie, a w watrobie tysiackrotnie nizsza. Dzialanie czynnika, wyekstrahowanego z Corynebacterium parvum aczkolwiek slabsze, równiez bylo wyrazne.Podobne wyniki uzyskano z czynnikami immunostymulujacymi, wyekstrahowanymi z Vibrio cholera i Mycobacterium tuberculosis szczep BCG. Ponadto stwierdzono istnienie zaleznosci miedzy dawka czynnika immunostymulujacego, a wywolanym efektem. » F. Wrazliwosc na endotoksyny bakteryjne.Zawiesiny czynników immunostymulujacych, otrzymane sposobem wedlug wynalazku, zwiekszaja wrazliwosc myszy na endotoksyny bakteryjne, co wykazano w nastepujacych badaniach: Trzem grupom po 5 myszy wstrzyknieto dozylnie po 0,5 ml zawiesiny czynnika immunostymulujacego, wyekstrahowanego z Listeria monocytogenes. Trzem grupom kontrolnym wstrzyknieto dozylnie po 0,5 ml 0,85% roztworu chlorku sodu. Po uplywie 24 godzin myszy inokulowano w grupach odpowiednio 10, 100 i 500 mikrogramami endotoksyn bakteryjnych. Smiertelnosc w grupach traktowanych czynnikiem immunostymulujacym byla taka sama, jak w grupach kontrolnych.G. Zwiekszenie opornosci myszy, traktowanych czynnikiem immunostymulujacym, na Streptolizyne O Myszom w trzech grupach po 5 sztuk wstrzyknieto dozylnie po 05 ml zawiesiny, zawierajacej 100/jg czynnika immunostymulujacego, wyekstrahowanego z Salmonella typhimurium C5. W trzech grupach kontrolnych wstrzyknieto zwierzetom po 0,5 ml 0,85% roztworu chlorku sodu. Po uplywie 24 godzin zwierzeta w poszczególnych grupach inokulowano streptolizyna 0 w ilosci równej odpowiednio 2, 3 i 4 LD 50. Wszystkie zwierzeta kontrolne padly w czasie krótszym, niz 1 godzina. Wsród zwierzat, traktowanych czynnikiem immunostymulujacym, przezyly te, którym wstrzyknieto streptolizyne 0 w ilosci 2 LD 50, te którym wstrzyknieto 3 LD 50 przezyly 6 godzin, a zwierzeta którym wstrzyknieto 4 LD 50 padly w tym samym czasie, co zwierzeta kontrolne.Jak wynika z powyzszych doswiadczen oraz uprzednio omówionych wyników badania wplywu na komórki otrzewnej i komórki krwi myszy, zawiesiny czynników immunostymulujacych otrzymywane sposobem wedlug wynalazku nie wykazuja toksycznosci.Znaczne przyspieszenie, pod dzialaniem czynnika immunostymulujacego szybkosci wydalania dozylnie wprowadzonego inokulum bakteryjnego, wprowadzonego zaledwie po uplywie 15 godzin po wprowadzeniu rzeczonego czynnika, jak równiez znaczne zwiekszenie opornosci myszy na infekcje Listeria monocytogenes, swiadcza o duzej skutecznosci zapobiegania infekcjom, wykazywanej przez te czynniki. Zwierzeta uodpornione na infekcje, wykazuja równiez opornosc na infekcje bakteriami lub pasozytami, rozmnazajacymi sie wmakrofagach (brucelle, salmonelle, mykobakterie, toksoplazmy). Stwierdzono równiez, ze czynnik immunostymulujacy wyekstrahowany z Salmonella typhimurium, uodparnia myszy na 1000 dawek smiertelnych wstrzyknietego dozylnie bakcyla dzumy.89 687 5 H. Wplyw czynnika immunostymulujacego na przemiane blastyczna in vitro Limfocytów sledziony myszy Zawiesine sledziony myszy w plynie Hanksa przesaczono przez filtr o srednicy porów 60 mikronów. Do mikroprobówek do hodowli tkankowej wprowadzono po 0,5 ml zawiesiny komórkowej w pozywce 199, zawierajacej 0,5 • 106—1 *107 .komórek, 0,05 ml osocza krwi ludzkiej i 0,05 ml wodnej zawiesiny czynnika immunostymulujacego. Zawartosc rzeczonego czynnika w zawiesinie wahala sie od 10 do 500 //g/ml.Po uplywie 42 godzin dodano 0,05 ml roztworu, zawierajacego trytowana tymidyne w ilosci10 mikrokiurów wsi ml. Po uplywie dalszych 8 godzin probówki wirowano przy 1500g, wciagu 10 minut.Odwirowany produkt zawieszono w 0,5 ml plynu fizjologicznego, dodano 0,5 ml 10% kwasu chlorooctowego, a wytracony osad odsaczono na filtrze Whatman GS/C pod cisnieniem 60 mm slupa wody. Probówke i filtr przeplukano 5% roztworem kwasu trójchlorooctowego, a nastepnie 1 ml 90% alkoholu etylowego, osad wysuszono i wprowadzono do naczynia do liczenia. Liczenie przeprowadzono za pomoca cieczkowego licznika scyntylacyjnego. Z otrzymanych danych obliczono stosunek liczby rozpadów, zaobserwowanych w kulturach w obecnosci czynnika immunostymulujacego, do rozpadów, zaobserwowanych w kulturach kontrolnych.Krzywa I na figurze 6 przedstawia zmiany rzeczonego stosunku w funkcji stezenia czynnika immunostymulujacego (w/i g/ml). Jak wynika zdanych przedstawionych na tej figurze, czynnik immunostymulujacy wykazuje znaczna aktywnosc w stezeniach 10—500 jug/ml. /snl ^ ^ V89 687 JT\ iA joJ\ jfi\ 7721/1 1C'3"- -Fig.z. yU&nf' fi) .<•' FisjA Jrc.Óct. 7J89 687 / 1\ Jlu/.6. / / / 10 y' . .s' 50 JOO \ \ \ \ \ \ MO JOOO Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120 + 18 Cena 10 zl PL PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania roztworu iniekcyjnego, zawierajacego czynnik immunostymulujacy, znamienny tym, ze kontaktuje sie z obojetnym nosnikiem, nadajacym sie do iniekcji, roztwór chloroformowy czynnika bakteryjnego, usuwa chloroform, zwlaszcza p-zez odparowanie i homogenizuje roztwór iniekcyjny, do uzyskania rozmiarów czastek stalych ponizej 20 ju.89 687 /o 100 so Jfig-l. ~T Jf 9 Si Z8 _Z? 96 \ X10*/jnZ _Ey?.2cl \% 300\ m 3ftff2 x *S Bi id Z? 96 X10* PL PL PL PL PL