PL96621B1 - Urzadzenie do przeprowadzania analizy wielu probek plynu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest urzadzenie do przeprowadza¬ nia analizy wielu próbek plynu a zwlaszcza okreslania ilosci dowolnej substancji w próbce plynu, na przyklad serum przez poddawanie reakcji próbki plynu z jednym lub wiek¬ sza iloscia reagentów oraz odsrodkowe rozdzielanie skladni- 5 ków poreakcyjnych dla dokladnego okreslenia ilosci danej substancji.W czasie prowadzenia analizy plynów, na przyklad serum, czesto wazna sprawa jest okreslenie w próbce plynu ilosci substancji takich jak hormony tarczycowe, hormony plcio- 1() we, glikozydy sercowe, witaminy i antygeny rakowe. Po¬ nadto wyjatkowo wazna sprawa jest okreslenie ilosci tego typu substancji w sposób dokladny i szybki.Znane rozwiazania sluzace do prowadzenia analizy plynu sa bardzo pracochlonne, poniewaz polegaja na pojedynczych 15 operacjach mieszania, poddawania reakcji, rozdzielania i pomiaru i dotychczas nie sa znane urzadzenia do prowa¬ dzenia analizy wielu próbek plynu, umozliwiajace szybkie i dokladne okreslanie ilosci dowolnych substancji w ply¬ nach. 20 Przedmiotem wynalazku jest urzadzenie, w którym prowa¬ dzenie analizy wielu próbek plynu polega na tym, ze w wie¬ lu pojemnikach poddaje sie reakcji co najmniej dwie ciecze, dla wytworzenia cieczy zawierajacej co najmniej jeden pro¬ dukt reakcji, po czym z tymi pojemnikami laczy sie separa- 2s tory cieklej fazy, poddaje sie pojemniki i separatory cieklej fazy dzialaniu sily odsrodkowej, wystarczajacej do prze¬ mieszczenia cieklej zawartosci pojemników do polaczonych z nimi separatorami cieklej fazy oraz do zapewnienia po¬ dzialu cieczy doplywajacej do nich na co najmniej dwie fazy, 30 po czym mierzy sie co najmniej jedna wlasnosc oddzielonej fazy.Urzadzenie wedlug wynalazku do przeprowadzania analizy wielu próbek plynu, zawiera obrotowy czlon pod¬ trzymujacy majacy wiele kolowo rozmieszczonych pojem¬ ników, w których znajduje sie ciecz i wiele kolowo rozmiesz¬ czonych pojemników, w których znajduje sie druga ciecz oraz wiele separatorów cieklej fazy w kolowym ukladzie przy czym pojemniki jednej i drugiej cieczy oraz separatory cieklej fazy sa ustawione wspólsrodkowo wokól wspólnej osi. Separatory cieklej fazy sa tandemowo polaczone z po¬ jemnikami drugiej cieczy poddawanej reakcji, które to po¬ jemniki sa z kolei polaczone tandemowo z pojemnikami pierwszej cieczy, przy czym z separatorem cieklej fazy jest polaczony zbiornik na ciecz oddzielona przez ten separator.Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykladach wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia przy¬ rzad do przeprowadzania analizy w widoku z boku z czes¬ ciowym przekrojem, fig. 2 — czesc przyrzadu z fig. 1 w wi¬ doku z góry, fig. 2a — fragment przyrzadu pokazanego na fig. 2 w widoku perspektywicznym, fig. 3 — schemat ukladu pomiarowego, fig. 4 — wykres stosowany jako wzorzec odniesienia, fig. 5a, 5b, 5c przedstawiaja schematycznie dzialanie separatorów cieklej fazy w szczególnym przykla¬ dzie wykonania, fig. 6 i 6a — inny przyklad wykonania przyrzadu we fragmentarycznym widoku z góry i w pio¬ nowym przekroju.Urzadzenie wedlug wynalazku zawiera obrotowy utrzy¬ mujacy czlon 15, który przymocowany jest do walu .20 napedzanego silnikiem 30 o okreslonym zakresie predkosci, 96 62196 621 3 który to silnik sprzezony jest z „walem 20 w miejscu 18.Wszystkie wymienione wyzej elementy oparte sa na pod¬ stawowej plycie 40 i otoczone sa obudowa 50, na której znaj¬ duje sie zdejmowana pokrywa 60. Do obrotowego czlonu 15 w odlaczalny sposób przymocowany jest pierscien 70, który utrzymuje wiele odejmowanych rurek 65, które sa laczone z pierscieniem 70 za pomoca polaczen 80 z kulo¬ wymi gniazdami tak, ze rurki 65 maja swobode poruszania sie od spoczynkowego polozenia 90 do obrotowego poloze¬ nia 100 po odpowiednim obrocie czlonu 15. Na czlonie 15 jest zamocowana odejmowalnie za pomoca trzpieni 112 tarcza 110,której kazdy rzad 120promieniowo usytuowanych pojemników 130 i 140 jest ustawiony zasadniczo w jednej linii z rurka 65. Rurki 65 sa nieco przesuniete od dokladnie promieniowego ustawienia naprzeciwko pojemników 130 i 140 dla skompensowania sily bezwladnosci cieczy podczas jej przeplywu do rurek 65 i dla danego przyrzadu przesta¬ wienie to w prosty sposób moze byc okreslone i zrealizowane.Dla uzyskania danej zawartosci substancji w próbkach surowicy lub podobnego plynu, dokladnie odwazona ilosc reagenta 150 umieszcza sie w pojemnikach 130 a dokladnie odwazona ilosc serum w formie próbki 160 wlewa sie do pojemników 140, przy czym reagent musi reagowac z sub¬ stancja w próbce, której okreslona ilosc powoduje wytwo¬ rzenie fizycznie oddzielanego produktu reakcji. Tak wiec pojemniki 130 i 140 moga byc wypelniane recznie za pomoca pipety lub za pomoca odpowiedniego przyrzadu. Zwieksza sie predkosc obrotowa silnika 30 do pierwszej predkosci, przy której sila odsrodkowa powoduje przedostawanie sie reagenta 150 z pojemników 130 do pojemników 140 oraz mieszanie sie i reagowanie z próbkami 160 w pojemnikach 140. Predkosc obrotowa silnika 30 jest regulowana w ten sposób, ze zawartosc pojemników 140 nie jest z nich wypy¬ chana na skutek dzialania sily odsrodkowej. Reagent 150 i próbki 160 reaguja ze soba w pojemnikach 140 i z czasem zwieksza sie ilosc produktu Reakcji w tych pojemnikach oraz powstaja w koncu warunki równowagi. Po tym okresie czasu mozna wykonywac analize zawartosci pojemników 140 dla okreslenia znanym sposobem ilosci okreslonej substancji w próbkach 160. Tego typu czynnosci w naj¬ lepszym przypadku sa nudne i wymagaja dlugiego okresu czasu, do godziny lub dluzej. Jednakze w urzadzeniu wedlug wynalazku nie ma potrzeby doprowadzania reakcji w pojem¬ nikach 140 do stanu równowagi lecz wystarczy tylko uzyskac dajaca sie zmierzyc ilosc produktu reakcji albo zmiane ilosci reagentu w pojemnikach 140, po czym zwieksza sie pred¬ kosc obrotowa silnika 30 do takiej, przy której zawartosc pojemników 140 na skutek dzialania sily odsrodkowej przedostaje sie poprzez kanaly 700 do separatorów 190 do oddzielania cieklej fazy, pokazanych na rysunku w postaci chromatograficznych zelowych kolumn 200 umieszczonych w otwartych szklanych oslonach 210, które sa umieszczone w rurkach 65 z mozliwoscia ich wyjmowania. Ciekly ma¬ terial stykajacy sie z zelowymi kolumnami 200 jest chroma¬ tograficznie oddzielony po zastosowaniu cieczy wymywaja¬ cej, przez dozowanie strumienia odpowiedniej cieczy, na przyklad roztworu buforowego, ze zbiornika 222 poprzez pompe 220 cieczy wymywajacej, dalej przez przewód 230 oraz dozownik 240 do pojemników 130 zaraz po przemiesz¬ czeniu zawartosci 160 pojemników 140 do zelowych kolum 200.Pokazana na fig. 1 pompa 220 jest uruchamiana za po¬ moca znanago ukladu 212 przekaznika czasowego w do¬ godnym okresie czasu, na przyklad w ciagu 15 sekund, po osiagnieciu zwiekszonej drugiej predkosci. Pompa "220 4 zapewnia ustalone natezenie przeplywu cieczy wymywajacej w ciagu ustalonego okresu czasu i calkowita ilosc cieczy wymywajacej jest automatycznie dzielona do pojemników 130. Ciecz wymywajaca przeplywa do zelowych kolumn 2Q0 poprzez pojemniki 130 i 140 na skutek dzialania sily od¬ srodkowej. Po dotarciu cieczy wymywajacej do zelowych kolumn 200 sila odsrodkowa powoduje chromatograficzne rozdzielanie skladników cieczy, która przeplynela z po¬ jemników 140. io Przy odpowiednim dobraniu zelowej kolumny 200 oraz wedlug ponizej opisanej procedury, poreakcyjny skladnik w materiale w zelowej kolumnie jest szybko oddzielany przez wymywanie i jest przemieszczany poprzez wyloty 215 oslony 210 do rurek 65, na skutek dzialania sily od- srodkowej. W przypadku zastosowania radioaktywnego reagenta kazda rurka 65 jest zdejmowana z pierscienia 70 a radioaktywnosc jej zawartosci 152 mierzy sie stosujac uklad pokazany na fig. 3, zawierajacy detektor 230 pro¬ mieniowania gamma, na przyklad kombinacje powielacza fotoelektrycznego z krysztalami jodku sodowego, wzmac¬ niacz 240, analizator 245 amplitudy impulsów, licznik 250 oraz urzadzenie obrazujace 260, na przyklad drukarke cyfrowa. W ten sposób uzyskana liczba impulsów dla kazdej rurki 65 moze byc odniesiona do zawartosci danej sub- stancji w próbce za pomoca obliczania lub porównywania z wzorcem.Jak pokazano w szczególnym przykladzie wykonania na fig. 2a pojemnik 130 wewnetrznego rzedu jest polaczony z pojemnikiem 140 zewnetrznego rzedu, z którym jest usytuowany w jednej linii dzieki korytkowemu przejsciu 500, które jest utworzone przez boczne powierzchnie oraz wznoszaca sie dolna powierzchnie wewnetrznego pojem¬ nika 130. Przy dostatecznej predkosci obrotowej i co za tym idzie sile odsrodkowej ciecz z pojemnika 130 przelewa S5 sie poprzez podwyzszona czesc 800 do usytuowanego w jednej linii z nim zewnetrznego pojemnika 140. Takze pojemnik 140 zewnetrznego rzedu jest polaczony z separa¬ torem 190 fazy cieklej, który jest ustawiony w jednej linii z pojemnikiem 140, za pomoca korytkowego przejscia 600, 40 które jest utworzone przez boczne powierzchnie i wznoszaca sie dolna powierzchnie zewnetrznego pojemnika 140 oraz przez kanal 700. Przy dostatecznej predkosci obrotowej i co za tym idzie sile odsrodkowej ciecz z zewnetrznego pojemnika 140 przeplywa do ustawionego w jednej linii 45 separatora. Jednakze pochylenie 145 zewnetrznych pojem¬ ników 140 jest bardziej strome od pochylen 147 wewnetrz¬ nych pojemników 130 tak, ze ciecz jest utrzymywana w ze¬ wnetrznym wglebieniu 140 na skutek dzialania podwyz¬ szonej czesci 600 tworzacej zapore az do zwiekszenia sily 50 odsrodkowej do wielkosci wiekszej od wymaganej do istnie¬ nia przeplywu cieczy z wewnetrznego pojemnika 130 do zewnetrznego pojemnika 140.Wedlug wynalazku jak opisano powyzej dla danej reakcji i dla danych konkretnych ilosci reagentów teoretycznie 55 mozliwe jest obliczenie koncentracji produktu reakcji lub reagenta w dowolnym okreslonym okresie czasu po roz¬ poczeciu reakcji i uzyskanie wykresu zaleznosci koncen¬ tracji od czasu, w stosunku do której moga byc porównywa¬ ne koncentracje mierzone w konkretnych okresach czasu. 60 Dla prostego przypadku procedura jest nastepujaca.Dla hipotetycznej, dwuczasteczkowej, nieodwracalnej re¬ akcji A + B ? C, gdzie równe ilosci A i B miesza sie w czasie t = 0 oraz przy t '= 0 stezenia C = 0, okazuje sie, ze stezenie w dowolnym momencie po czasie t okreslone 65 jest wzorem:96 Ao2Klt 1 + AoKit gdzie: Aq oznacza poczatkowe stezenie reagentów A i B, Ki = A. (-Ea/RT) — równanie Arrheniusa, w którym A oznacza wspólczynnik czestotliwosci, Ea — energie akty¬ wacji, T — temperature reakcji i R — uniwersalna stala gazowa.Przy pomocy tego wzoru i wynikajacego z niego wykresu dla danej reakcji stezenie zmierzone po uplywie stosunkowo krótkiego czasu reakcji moze byc przeksztalcone w calko¬ wite stezenie lub ilosc danej substancji.W szczególnym przykladzie wykonania wynalazku za¬ stosowano wzorzec, dzieki któremu unika sie niedogodnosci powyzej opisanych prób. W rozwiazaniu tym (fig. 1 i 2) ogólnie umieszcza sie przeciwcialo jako reagent w wewnetrz¬ nych pojemnikach 130 tarczy 110 a próbki serum zawieraja¬ ce nieznana ilosc dowolnej substancji, na przyklad tyroksyne (T-4) razem z radioaktywnym odczynnikiem T-4 oraz odczynnikiem podstawieniowym umieszcza sie w zewnetrz¬ nych pojemnikach 140. Zwieksza sie gwaltownie predkosc obrotowa tarczy 110 do pierwszej predkosci, podczas której przeciwcialo z wewnetrznych pojemników 130 jest wypy¬ chane przez sile odsrodkowa od zewnetrznych pojemników 140, gdzie przeciwcialo i T-4 mieszaja sie i reaguja ze soba.Podczas reakcji, T-4 w próbkach serum jest przemiesz¬ czane do jego nosnika i ma mozliwosc kontynuowania z radioznacznym T-4 dla ograniczonej liczby miejsc po¬ laczen w reagencie przeciwcialowym.W dowolnym momencie "po zmieszaniu i podczas reakcji w pojemnikach 140 stosunek radioznakowego T-4 w po¬ jemnikach 140 okresla pomiar poczatkowej ilosci T-4 w próbkach serum. Tak wiec reakcja przebiega przy po¬ czatkowej predkosci w ciagu krótkiego okresu czasu wy¬ starczajacego dla zapewnienia widocznych radioaktywnych sygnalów i duzo wczesniej przed osiagnieciem równowagi reakcji zwieksza sie predkosc obrotowa tarczy 110 do wiekszej wartosci, przy której zawartosci zewnetrznych pojemników 140 sa wyrzucane przez sile odsrodkowa do polaczonych z nimi separatorów, przez które przechodzi kompleks przeciwcial T-4, zawierajacy radioaktywny i nie- radioaktowny T-4, wraz z nieprzereagowanym przeciw¬ cialem, przy czym niekompleksowy T-4, radioaktywny i nieradioaktywny jest absorbowany w separatorach. Czy- nosc ta wstrzymuje reakcje tworzenia kompleksów przez usuwanie co najmniej jednego reagenta, przeciwciala, ze strefy reakcji, która stanowia zelowe kolumny 200 i w kon¬ sekwencji wskaznik radioaktywnosci oddzielonego kom¬ pleksu T-4 przeciwciala w porównaniu z wzorcem daje pomiar poczatkowej zawartosci T-4 w badanej próbce.Wzorzec moze byc okreslony przez stosowanie serum lub materialu podobnego do serum o znanym lecz innym T-4 i stosujac te same warunki reakcji co w przypadku badanych próbek oraz rysujae wykres wskazników radioaktywnosci lub stosunki wskazników uzyskanych dla kazdego materialu w zaleznosci od znanego w nim poziomu T-4. Korzystnie wzorcowe materialy umieszcza sie w odpowiednich pojem¬ nikach 140 tej samej tarczy 110 stosowanej do badanych próbek o nieznanej ilosci T-4 i wzorcowe dane oraz badane .dane uzyskuje sie równoczesnie.Fig. 4 bezposrednio dotyczy konkretnego przykladu opisanego ponizej i przedstawia wzorcowy wykres uzyskany dla stosowania w powyzej opisany sposób i ukazuje wskazni¬ ki radioaktywnosci na minute, uzyskane przy zastosowaniu 621 6 wzorcowych poczatkowych materialów o znanej ilosci T-4.Dla przykladu fig. 4 wskazuje dla zastosowanych konkret¬ nych warunków, ze gdy wskaznik 4000 uzyskuje sie z próbki serum badanej jednoczesnie z wzorcowymi materialami, 3 wówczas poczatkowa ilosc T-4 w próbce serum wynosi 6,2 mikrogramów T-4 na 100 ml próbki. Oczywista jest sprawa, ze wedlug wynalazku uzywa sie odpowiednich i dokladnie kontrolowanych ilosci reagentów a wynalazek ogólnie stosuje sie do wszystkich reakcji ciecz-ciecz, zwlasz- io cza stosowanych w znanych metodach klinicznej analizy serum krwi lub materialów podobnych do serum stosujac znane odczynniki.Wynalazek nadaje sie do stosowania zwlaszcza do analizy szerokiego zakresu waznych fizjologicznie czasteczek, na przyklad jak opisano w Clinical Chemistry, tom 19, nr 2 1973, artykul D. S. Kelley, L. P. Brown i P.K. Beach na stronie 146.Przedstawiony przyklad dokladnie ilustruje przedmiot wynalazku.Przyklad. Kliniczne próbki serum poddano analizie dla okreslenia ilosci zawartej w nich tyroksyny (T-4) sto¬ sujac przyrzad pokazany na fig. 1, 2 i 3 oraz wzorcowa krzywa pokazana na fig. 4. Jednoczesnie badano dwie grupy po dziewiec klinicznych próbek serum o nieznanej ilosci T-4 oraz dwie grupy po piec wzorcowych roztworów, z których kazdy ma inna lecz znana ilosc T-4. Analize rea¬ lizowano w ten sposób, ze kazde dwa zewnetrzne pojemniki 140 tarczy 110 wypelniono 35 mikrolitrami konkretnej klinicznej próbki serum. Tak wypelniono osiemnascie zewnetrznych Wglebien oznaczonych na fig. 2 odnosnikami 1, 1', 2, 2', 3, 3', 9 9'. Takze kazde dwa zewnetrzne pojemniki 140 tarczy 110 wypelniono 35 mikrolitrami kon¬ kretnego jednego z pieciu wzorcowych roztworów. Tak wypelniono dziesiec zewnetrznych pojemników 140 ozna- czonych. na fig. 2 przez odnosniki a, a', b, b', e, e'.Ilosci T-4 we wzorcowych roztworach wytworzonych w po¬ nizej opisany sposób podano w tablicy 1.Tablica 1 1 Wzorzec a b c d 1 e T-4 //g/100 ml 0 2 6 12 W czasie napelniania zewnetrznych pojemników 140 w opisany powyzej sposób kazda 35 mikrolitrowa ilosc mieszano z 65 mikrolitrami destylowanej wody. Dodatkowo do kazdego zewnetrznego pojemnika 140 wypelnionego w wyzej opisany sposób dodawano 50 mikrolitrów roz¬ tworu radioaktywnego T-4-125j, którego sposób jego wy¬ twarzania opisano ponizej. Kazde wewnetrzne wglebienie , 10', 90, 90' i A, A' E, E' napelniono odczyn¬ nikiem przeciwciala (opisanym ponizej). Predkosc obrotowa tarczy 110 w przyrzadzie gwaltownie zwiekszono do pier¬ wszej predkosci takiej, przy której zawartosci wewnetrznych wglebien 10, 10', 90, 90' i A, A', E, E' w ciagu 3 sekund sa przemieszczane na skutek dzialania sily od¬ srodkowej do odpowiednich polaczonych z nimi zewnetrz¬ nych wglebien 1, 1', 9, 9' i a, a', ... e, e', w których rozpoczyna sie nastepujaca reakcja trwajaca trzydziesci minut.T4 + AB -5=^ ABT4 T4R + AB 3=t ABT4R96 621 7 Po uplywie trzydziestu minut predkosc obrotowa tarczy 110 gwaltownie zwieksza sie do drugiej predkosci a dzialaja¬ ca sila odsrodkowa powoduje przemieszczanie zawartosci wglebien 1,1', ... 9, 9' i a, a', ... e, e' do odpowiednich polaczonych z nimi chromatograficznych kolumn 200.Pietnascie sekund po zwiekszeniu predkosci tarczy 110 do drugiej predkosci pompa 220 plynu wymywajacego zostala uruchomiona za pomoca znanego ukladu przekaznika cza¬ sowego 212 dla dozowania 2 mililitrów roztworu buforo¬ wego, opisanego ponizej, ze zbiornika 222 do kazdego z wewnetrznych pojemników 130 za pomoca dozownika 240. Calkowity przeplyw 60 ml zapewniono dozujac 30 ml na minute w ciagu dwóch minut. Byl on rozdzielany do trzydziestu pojemników po 2 ml na kazde wglebienie.W ten sposób wprowadzony za pomoca dozownika 240 roztwór na skutek dzialania sily odsrodkowej byl prze¬ mieszczany z wglebien 10,10', ... 90,90' i A, A', ... E, E' do 1,1' ... 9,9' i a, a',... e, e' do odpowiednich chromato¬ graficznych kolumn 200, w których reagenty i produkty reakcji poddawano wymywaniu na skutek dzialania sily odsrodkowej na plyn wymywajacy. W nastepstwie kompleks przeciwcial T-4, zawierajacy zarówno radioaktywny jak i nieradioaktywny T-4, wraz z nieprzereagowanym przeciw¬ cialem zostaly szybko wymyte na przyklad w ciagu 1 minuty, z pojedynczych chromatograficznych kolumn 200 i na skutek dzialania sily odsrodkowej byly wtlaczane do rurek 65 jak pokazano odnosnikiem 152 na fig. 1 i 2. Nieprzerea- gowany roztwór T-4125I i skladniki serum o malej masie czasteczkowej pozostaly w chromatograficznych kolumnach 200. W przykladzie tym po oddzieleniu przeciwciala za pomoca wymywania, powyzej podana reakcje zasadniczo nalezy konczyc w czasie oddzielania w kazdej z chromato¬ graficznych kolumn 200. W dowolnym momencie po wy¬ myciu, rurki 65 sprowadza sie do ukladu pokazanego na fig. 3 a zawartosc 152 kazdej rurki 65 jest mierzona w ciagu 1 minuty jak pokazano w tablicy 2.Tablica 2 Rurka odpowiadajaca polozeniu 1 a 0 " a' 0' b 1 b' r c 2 c' 2' d 3 a' 3' . ¦c 4 e' 4' 1 5 1' 5' 2.6 2' 6' 3 7 3' T 4 8 4' 8' 9 ' 5' | 6 10 Jednostki na min. 2 7625 7468 5398 5496 3194 3307 2235 2325 1299 1336 4544 4408 3009 2956 3919 4051 4092 3899 3415 3627 4500 T4 w % ug 3 0 ; 0 wzorcowe ilosci 2 naniesione na wy- 2 kresie na fig. 4 6 wzorcowe ilosci 6 naniesione na wy- 12 kresie na fig. 4 12 4,7 ,1 8,9 9.0 Ilosc w nieznanyCh 6,4 klinicznych próbkach 6.1 okreslone z wykresu 6,0 na fig. 4 6,4 7,7 7,1 4#. 8 1 1 6' 10' 7 11 7' 11' 8 12 8' 12' 9 12 | 9' 13' 2 4389 4092 3899 3225 3192 3501 4052 3 ' 5,2 6,0 6,4 8,4 8,2 7,4 6,0 Znane ilosci T-4 w pig T-4 na 100 ml próbki wzroców a, a', ... e, e' zostaly naniesione na wykres wzgledem uzyska¬ nych sygnalów na minute dla sporzadzenia wykresu poka¬ zanego na fig. 4 stosujac zmierzone ilosci jednostek w ta- blicy 2 odpowiadajace próbkom. Okreslone w tablicy 2 ilosci dla klinicznych próbek otrzymano z wykresu pokaza¬ nego na fig. 4.Ponizej przedstawiono szczególowy opis materialów i procedury opisanego powyzej przykladu. Analizie pod- dawano kliniczne próbki serum. Zastosowano nastepujace materialy: tyroksyne (T-4 surowiec), wolny kwas kat. nr 2376 Sigma Chemical Co., St. Louis, Moj tyroksyne -125I (T-4^125) kat. nr 6751 „Tetramet— 125", Abbott Labs, North Chicago, Illinois; serum antytyroksyny (królik): Wien Labs., Succasunna, New Jersey; kwas chlorowodoro¬ wy kat. nr A-144, Fisher Scientific, New York; wodoro¬ tlenek sodu 0,1 N kat. nr SO-S-276, Fisher Scientific; barbital sodu kat. nr B-22, Fisher Scienfitic; azydek sodu kat. nr S-227, Fisher Scientific; normalne serum królika; kwas S-anilino-1-naftaleno/sulfoniowy, sól sodu (ANS) kat. nr 9041, K fi K Labs, Plainview, New York; normalna zebrana ludzka plazma, Plasma Products; aktywowany wegiel drzewny, Daroo G-60, Mafheson, Coleman fi Bell, Rutherford, New Jersey; sofadeks G-25, drobny chróma- tograficzny zel, Pharmacia Fine Chemicale, Piscataway, N. J.; kolumny dla chromatograficznego zelu kat. nr 102/2, Walter Sarstedt, Inc., Princeton, N. J.; badawcze rurki 12 x 75 mm i 17 x 100 mm.Ponizej opisano zastosowane odczynniki. Kwas 6 N chlo- 40 rowodorowy w ilosci 1 litra i buforowy barbital, 0,075M, pH 8,6, 1 litr.Rozpuszczono 15,54 g barbitalu sodu i 100 mg azydku sodu w 800 ml destylowanej wody. Stosujac wzorcowany pehametr doprowadza sie pH roztworu do 8,6 dodajac 45 kroplomierzem 6N HC1, caly czas mieszajac starannie barbital. W przyblizeniu potrzeba 2 ml 6N HC1. Uzupelnia sie do 1 litra woda destylowana. Ten buforowy roztwór jest dobry w ciagu jednego miesiaca przy przechowywaniu go w chlodziarce. Nastepnie stosuje sie 2% normalny roz- 50 twór buforowy serum królika — barbital w ilosci 100 ml.Dodaje sie 2 ml normalnego serum królika do 98 ml bufo¬ rowego barbitalu starannie mieszajac. Roztwór ten jest dobry w ciagu 2 tygodni przy przechowywaniu go w chlo¬ dziarce. Poza tym stosuje sie plazme ludzka bez tyroksyny 55 w ilosci 20 ml. Starannie mieszajac dodaje sie 3 g aktywowa¬ nego wegla drzewnego do 20 ml zebranej ludzkiej plazmy w bedacej do dyspozycji 50 ml stozkowej wirówkowej rurce starajac sie zwilzyc calosc wegla drzewnego. Przy¬ krywa sie mieszanine i umieszcza na noc w chlodziarce. 60 Nastepnego dnia mieszanine poddaje sie wirowaniu z pred¬ koscia 8000 obr/min w ciagu 10 minut. Wówczas stosujac ml strzykawke wyposazona w 25 mm uchwyt z filtrem miliporowym i nasadka Swinnex, filtruje sie sklarowana ciecz kolejno przez filtr papierowy filtr 0,45 mikronowy 65 i filtr 0,22 mikronowy. Przygotowuje sie tygodniowo i wsta-96 621 9 wia do chlodziarki lub po zamrozeniu nadaje sie do stoso¬ wania w ciagu co najmniej 3 miesiecy.Przygotowanie wzorców tyroksyny (T-4) jest opisane ponizej.Surowiec T-4 w ilosci 0,6 mg/ml, otrzymuje sie w ten sposób, ze rozpuszcza sie 6,00 mg surowca T-4 w minimal¬ nej objetosci 0,1 N wodorotlenku sodu. Dopelnia sie desty¬ lowana woda do objetosci 10 ml. Otrzymany roztwór moze byc rozdzielony*na 0,2 ml ampulki i magazynowany w sta¬ nie zamrozonym w ciagu 3 miesiecy.Jako robocze wzorce przygotowuje sie próbkowe rurki o wymiarach 12x75 mm i oznacza od 1 do 5. Robocze wzorce T-4 przygotowuje sie wedlug ponizszej tablicy 3.Tablica 3 Rurka nr 1 1 2 3 4 1 5 Dodatek bufo¬ rowego barbi- talu 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml Usuwanie roz¬ tworu buforo¬ wego 0|il ul Ml Ml 50 Ml Dodatek surow¬ ca T-4 0m1 m! Surowiec T-4 rozpusz¬ czony w 3 Ml Ml 50 Ml Koncowa koncentracja 0 Mg/ml 2 Mg/ml 6 Mg/ml 12 Mg/ml Ml/ml | Stosowane wzorce, wykonuje sie w ten sposób, ze oznacza sie próbkowe rurki o wymiarach 17x100 mm liczbami od 1 do 5 i dodaje sie do kazdej z nich 5,0 ml plazmy bez T-4. Usuwa sie 50 mikrolitrów odpowiedniego roboczego wzorca opisanego powyzej. Dobrze miesza sie. Koncowe wyniki podano w tablicy 4.Tablica 4 Rurka nr 1 . a 2 b 3 c 4 d e T-4 Mg/ml 0 60 120 300 T-4 Ug/35 Ml 0 0,7 2,1 4,2 ,5 T-4 Mg/100 ml 0 2 6 12 Zamraza sie w 0,5 ml ohjetosciach.Roztwór tyroksyny I125 zlozony jest z roztworu.ANS, dla otrzymania którego rozpuszcza sie 60 mg kwasu 8-anilino- -1-naftalenosulfonowego w "10 ml 2% normalnego roz¬ tworu buforowego serum królika oraz z roztworu izotopo¬ wego.Amin dla Tetramet-125 wynosi 500 mikrokiurów. Roz¬ twór jest dobry w ciagu szesciu tygodni. Data waznosci jest podana na nalepce Abbotta. Aktywnosc, to jest liczba mikrokiurów na milimetr, zmiena sie zaleznie od partii. 14000 jednostek na minute (CPM) dodaje sie do kazdej próbkowej rurki w 50 mikrolitrach, przy czym 14 000 opm w przyblizeniu odpowiada 0,014 mikrokiurów. Okresla sie calkowita liczoe próbkowych rurek, wzorców i nieznanych, zwieksza sie ich ilosc o 10%, które oznacza wspólczynnik bezpieczenstwa i mnozy sie koncowa liczbe przez 0,014.Otrzymana liczba stanowi calkowita potrzebna liczbe mikro¬ kiurów. Nastepnie mnozy sie calkowita liczbe rurek lacznie z 10% nadwyzka przez 50. Otrzymuje sie calkowita po¬ trzebna liczbe mililitrów ANS. Odejmuje sie ilosc mikro¬ litrów Tetramet — 125 odpowiednio do liczby mikrokiu¬ rów i dodajesie do prawidlowej objetosci ANS. Przygotowuje sie do stosowania na dany dzien.Odczynnik przeciwciala pochodzi w Wien Lab i jest liofilizowany w ampulkach z nalepkami „1.00 Test". Kazda ampulka jest potraktowana 14,0 ml 2% normalnego roz¬ tworu buforowego serum królika. Jest ono dobre w ciagu io 2 tygodni przy przechowywaniu go w chlodziarce.Warunki reakcji sa ponizej opisane. 50 mikrolitrów roztworu T-4-125I, 35 mikrolitrów wzorca lub próbki serum i 65 mikrolitrów destylowanej wody zmieszane razem.Nastepnie dodano 200 mikrolitrów odczynnika przeciw- ciala. Reakcja przebiegala w ciagu 30 minut w temperaturze pokojowej przy pierwszej predkosci zestawu inkubator- -separator i po zwiekszeniu predkosci do drugiej predkosci calkowita objetosc poreakcyjna przemieszczono do kolumny z drobnego sefadeksu G-25. Kompleks wymywano 2,0 ml buforowego barbitalu. Kompleks badano w ciagu 1 minuty licznikiem promieni gamma. Kazda próbke i kazdy wzorzec brano podwójnie. Wzorce 1—5 zajmowaly wiec 10 polozen.Wzorce uwzgledniono na wykresie nastepujaco: wskaz¬ niki na minute na osi y, a log ilosci w Mg/100 ml na osi x.Wzorcami przygotowanymi w powyzej opisany sposób byly: 0, 2, 6, 12, 30 Mg tyroksyny na 100 ml. Nieznane próbki okreslano z krzywej wzorcowej przez znalezienie wartosci Mg tyroksyny na 100 ml odpowiadajacej wskazni¬ kom nieznanych-próbek. Substancja poddawana analizie byly kliniczne próbki serum.W przykladzie wykonania wynalazku przedstawionym powyzej szczególne korzysci uzyskuje sie zasadniczo dzieki przerwaniu opisanej reakcji tworzenia kompleksu po szyb¬ kim oddzialeniu skladników produktu reakcji w regulowa- nych warunkach w chromatograficznych kolumnach 200.Dla rozwazenia ogólnego przypadku, w którym reagenty A i B wprowadza sie odpowiednio do wewnetrznych i ze¬ wnetrznych pojemników 130 i 140 i powoduje sieich miesza¬ nie i reagowanie ze soba w zewnetrznych pojemnikach dla 40 wytworzenia zwiekszajacych sie ilosci produktu reakcji C przez rozdzielanie mieszaniny A, B i C w chromatograficz¬ nych kolumnach 200 na fazy, z których jedna zawierajaca co najmniej jeden reagent, A lub B zbiera sie w rurkach 65, reakcje wytwarzania C zasadniczo zatrzymuje sie w zbie- 45 rajacych chromatograficznych kolumnach i nawet przy kontynuowaniu obracania nie wytwarza sie dalsza ilosc C a wiec jest wymywana i mierzony parametr wymywanej fazy, na przyklad radioaktywnosc, kolor, fluorescencja, zawartosc enzymów, jest staly w tym samym okresie czasu 50 dla wszystkich analizowanych próbek. Ten przyklad wyko¬ nania jest szczególnie korzystny w kinetycznych analizach dla okreslenia" w próbce ilosci hormonów tarczycowych, hormonów plciowych, glikozydów sercowych, witamin antygenów rakowych przy zastosowaniu wzorcowych od- 55 pornych na radioaktywnosc odczynników.Powyzsze rozwazania beda bardziej zrozumiale w odnie¬ sieniu do fig. 5a, która schematycznie przedstawia moment, w którym nieprzereagowana czesc reagentów A i B oraz produktu reakcji C zostala przemieszczona do chromato- 60 graficznego zelu 200' lecz przed przemieszczeniem cieczy wymywajacej do tego samego zelu 200'. W takich warunkach A i B moga nadal reagowac ze soba i wytwarzac dodatkowe ilosci C. Jednakze po przeplywie cieczy wymywajacej do chromatograficznego zelu 200', który jest dobrany w tym 65 przykladzie tak, zeby oddzielal reagent B wraz z produktem96 621 11 reakcji C, B i A zostaja gwaltownie oddzielone od A w fazie, która porusza sie wzdluz chromatograficznego zelu 200', jak pokazano na fig. 5b, i wstrzymuje tworzenie sie dodatko¬ wych ilosci produktu reakcji C. Faze 152 zawierajaca usta¬ lone udzialy B i C przemieszcza sie za pomoca sily od¬ srodkowej do rurki 65', jak pokazano na fig. 5c i mozna wówczas mierzyc w odpowiednim momencie ustalona wartosc interesujacego parametru albo B albo C.W innych zastosowaniach urzadzenia wedlug wynalazku, w których nie ma decydujacego znaczenia wstrzymywanie reakcji w chromatograficznej kolumnie 200 a warunki reakcji i rozdzielania sa zasadniczo takie same dla wszyst¬ kich próbek, chromatograficzny zel tak sie dobiera, zeby wymywac i oddzielac produkt reakcji od reagentów, zwlasz¬ cza w przypadkach, gdzie dalsze formowanie produktu reakcji w zelu i jego wymywania jest kompensowane przez stosowanie równoczesnie traktowanego wzorca.W zastosowaniach wynalazku interesujacym parame¬ trem moze byc radioaktywnosc, jak szczególnie opisano powyzej, kolor, fluorescencja lub dowolna inna fizyczna wlasnosc. Odpowiednio zamiast ukladu licznika radio¬ aktywnosci mozna stosowac inne znane czujnikowe urza¬ dzenia.W innym przykladzie wykonania urzadzenia wedlug wynalazku pokazanym na fig. 6 przyrzad zawiera tarcze 510 majaca wiele pojedynczych wglebien 520 zamiast par promieniowo ustawionych pojemników 130 i 140 w urza¬ dzeniu pokazanym na fig. 1.W przyrzadzie pokazanym na fig. 6 dokladne ilosci dwóch lub wiecej reagentów, na przyklad serum oraz odczynnik 525 umieszcza sie we wglebieniach 520, w których odbywa sie reakcja, w wyniku której powstaje produkt reakcji dajacy sie oddzielac fizycznie. Napelnianie wglebien 520 moze byc realizowane pipeta jak opisano powyzej. Jedno lub wiecej wglebien 520 wypelnia sie wzorcowymi reagentami w po¬ przednio opisany sposób i tak wypelniona tarcze 510 ustawia sie na utrzymujacym czlonie 15 w takie sam sposób jak tarcze 110 na fig. 1 i obraca sie z predkoscia wystarczajaca do przemieszczenia zawartosci wglebien 520 do polaczonych z nimi separatorów 190 w wyniku dzialania sily odsrodkowej.Od tego momentu postepuje sie w ten sam sposób jak w przy¬ padku opisanego powyzej w odniesieniu do przyrzadu # pokazanego na fig. 1 i wzorca przykladowo zilustrowanego na fig. 4.W praktyce w tym przykladzie wykonania poniewaz tarcza 510 zawiera wglebienia 520, a wiec moga byc one wypelniane reagentami a reakcja moze byc doprowadzona do stanu równowagi. Oznacza to, ze tarcze 510 mozna wy¬ pelniac i przechowywac w dlugich okresach czasu, na przy¬ klad w ciagu godzin lub dluzej, po czym tarcze 510 mozna umieszczac na miejscu tarcz 110 w przyrzadzie pokazanym na fig. 1 i mozna prowadzic analize jak opisano powyzej.Ten przyklad wykonania efektywnie nadaje sie do zastoso¬ wania do powolnych reakcji, na przyklad okreslania w se¬ rum krwi hormonu wzrostu, które w przypadku uzycia poprzednio opisanego podwójnego ukladu wglebien wyma¬ gaja bardzo dlugiego okresu wirowania z wieksza predkoscia obrotowa, na przyklad 1 godziny lub dluzej.Alternatywnie w przypadku gdy tarcze 510 napelnia sie w takim okresie czasu aby przeprowadzic szczególnie po¬ wolna reakcje, wówczas istotna sprawa jest, zeby reakcje w róznych pojedynczych wglebieniach rozpoczynaly sie w tym samym czasJe, napelniana tarcza 510 byla obracana a zawartosc wglebien 520 byly przemieszczane do polaczo¬ nych z nimi separatorów 190 w takim okresie czasu, aby 12 we wglebieniach 520 powstala dajaca sie zmierzyc ilosc oddzielanego skladnika. Procedura ta jest uzyteczna w przy¬ padkach, w których zmniejszenie dokladnosci analizy wy¬ nikajace z róznych okresów czasu reakcji w róznych wgle- bieniach nie ma duzego znaczenia wobec oszczednosci czasu.Szczególna zaleta mechanicznego i chemicznego ciaglego sposobu tandemowego jest to, ze zasadniczo eliminuje sie reczna lub mechaniczna interwencje w czasie prowadzenia analizy, co minimalizuje znaczenie zmiennych parametrów innych niz potrzebnych oraz ze stosuje sie krótki czas reakcji i jej kinetyke reguluje sie poprzez regulacje czasu.Dla celów wynalazku reagujace skladniki obejmuja sub¬ stancje reagujace chemicznie dla wytworzenia innego che- micznie produktu lub produktów reakcji a takze substancje reagujace fizycznie, na przyklad wykorzystujac zjawiska adsorpcji, dla wytworzenia jednego lub wiekszej ilosci ma¬ terialów rózniacych sie fizycznie.Separatorem cieklej fazy moze byc dowolne urzadzenie chromatograficzne, na przyklad zapewniajace oddzielanie na bazie wymiaru czastek, zjawiska fizycznej adsorpcji, chemisorpcji, wymiany jonowej, wlasciwego czastkowego powinowactwa (powinowactwo chromatograficzne) i in¬ nych znanych sposobów, w których stosuje sie na przyklad zele, ciala stale i zywice. PL PL PL PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Urzadzenie do przeprowadzania analizy wielu próbek plynu, znamienne tym, ze zawiera obrotowy czlon pod¬ trzymujacy (15) majacy wiele zasadniczo kolowo rozmiesz¬ czonych pojemników (130), w których znajduje sie ciecz i wiele zasadniczo kolowo rozmieszczonych pojemników (140), w których takze znajduje sie ciecz, oraz wiele sepa¬ ratorów (190) cieklej fazy ustawionych zasadniczo kolowo, przy czym pojemniki (130), (140), oraz separatory (190) cieklej fazy sa ustawione zasadniczo wspólsrodkowo wokól wspólnej osi, a separatory (190) cieklej fazy sa promieniowo oddalone od pojemników (140) a pojemniki (140) sa pro¬ mieniowo oddalone od pojemników (130), zas separatory (190) cieklej fazy sa tandemowo polaczone z pojemnikami (140), które z kolei sa tandemowo polaczone z pojemnikami (130), przy czym z separatorem (190) cieklej fazy jest po¬ laczony zbiornik na ciecz zbierajacy ciecz oddzielona przez ten separator (190).

2. Urzadzenie, wedlug zastrz. 1, znamienne tym, ze na czlonie obrotowym (15) osadzona jest tarcza (110) obracaja¬ ca sie w zasadniczo poziomej plaszczyznie wokól swej osi srodkowej za pomoca tego czlonu (15), która to tarcza (110) zawiera pierwszy rzad wglebien stanowiacych pojemniki (130) na ciecz usytuowane w równej promieniowej odleglosci od srodkowej osi tarczy (110) oraz drugi rzad wglebien, stanowiacych pojemniki (140) na ciecz usytuowane w wie¬ kszej jednakowej promieniowej odleglosci od pierwszego rzedu, przy czym pojemniki (130) pierwszego rzedu leza zasadniczo w jednych promieniowych liniach z pojemnikami (140) drugiego szeregu a ponadto pomiedzy ustawionymi w jednej linii pojemnikami (130) i (140) znajduja sie ko¬ rytkowe przejscia (500) dla cieczy przeplywajacej z pojem¬ ników (130) do pojemników (140) w wyniku dzialania sily odsrodkowej, przy czym w jednej linii z pojemnikami (140) umieszczone sa separatory (190) cieklej fazy, obracajace sie wraz z obrotowym czlonem (15), a ponadto w jednej linii z pojemnikami (140) i separatorami (190) cieklej fazy znajduja sie drugie korytkowe przejscia (600) dla przeplywu 25 30 35 40 45 50 55 6096 621 13- cieczy wyplywajacej z pojemników (140) w wyniku dzia¬ lania sily odsrodkowej, przy czym przejscia korytkowe (600) maja wieksza pochylosc od przejsc korytkowych (500) aby sila odsrodkowa wymagana do spowodowania przeplywu cieczy z pojemników (140) drugiego rzedu byla wieksza od sily odsrodkowej wymaganej do spowodowania przeplywu cieczy z pojemników (130) pierwszego rzedu. 14

3. Urzadzenie, wedlug zastrz. 1, znamienne tym, ze separatory (190) cieklej fazy stanowia pojedyncze kolumny (200) zamocowane obrotowo i odchylnie az do polozenia (100) w wyniku dzialania sily odsrodkowej, przy czym os podluzna kazdej kolumny (200) ustawiona jest zasadniczo promieniowo wzgledem osi srodkowej tarczy (110). f i g. i F I G. 2 l70096 621 „65 -150 -230 F I G. 3 240 JT if 200' H 200' „ „ 1 * r200' ^i I Sl 250 -)— 260 .65' FIG. 5 a 65' FIG. 5b 65' FIG. 5c 151 7» F I G. 6 529 v52096 621 FIG. 4 i 1 I I II III A 6 8 10 12 20 30 PL PL PL PL