PT100207B - Processo para o redireccionamento de imunidade celular por receptores quimericos - Google Patents

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Description

D-622
-DESCRIÇÃO —
"REDIRECCIONAMENTO DE IMUNIDADE CELULAR POR RECEPTORES
QUIMÉRICOS para que THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION pretende obter privilégio de invenção em Portugal. 0 presente invento refere-se a receptores funcionais de célula T ou a receptores quiméricos Fc que são capazes de reorientar uma função de sistema de imuninade. Mais particularmente, o presente invento refere-se à regulação de linfócitos, macrófagos, células assassinas ("natural killer cells") ou granulócitos através da expressão nessas células quiméricas que fazem com que as células respondam a alvos reconhecidos pelas quimeras. O presente invento também se refere a receptores de célula T ou a receptores quiméricos funcionais Fc que são capazes de orientar células terapêuticas para reconhecer e destruir especificamente tanto as células infectadas com um agente infeccioso específico, como o próprio agente infeccioso, uma célula de tumor, ou uma célula gerada por autoimunidade. Mais particularmente o invento refere-se à produção de receptores de célula T ou receptores quiméricos Fc, capazes de orientar linfócitos T citotóxicos para reconhecer e lisar especificamente células que expressam proteínas de invólucro HIV. Consequentemente o presente invento proporciona uma terapia para doenças tais como SIDA (Síndroma da Imunodeficiência Adquirida) que são provocadas pelo vírus HIV. O reconhecimento de antigene pela célula T através da célula T receptora é a base de uma gama de fenómenos imunológicos. As células T orientam aquilo a que se chama célula de imunidade celular. Isso envolve a destruição por células do sistema de imunidade de tecidos estranhos ou de células infectadas. Existe uma variedade de células T, incluindo células "auxiliadoras" e células "supressoras" que modulam a resposta de imunidade e as células citotóxicas (ou "assassinas"), que podem matar directamente células anormais.
Uma célula T que reconhece e se liga a um antigene único manifestado na superfície de outra célula torna-se activada; pode depois multiplicar-se e, se é uma célula citotóxica, pode matar a célula ligada. A doença de autoimuninadade é caracterizada pela produção tanto de anticorpos que reagem com tecidos hospedeiros como de células T efectoras de imunidade que são autoreactivas. Nalguns casos, os anticorpos podem surgir de uma resposta de célula T- e B- normal activada por substâncias estranhas ou organismos que contêm antigenes que reagem cruzadamente com compostos semelhantes em tecidos do corpo. Exemplos de anticorpos clinicamente relevantes são anticorpos contra
D-622 receptores de acetilcolina em mvasthenia qravis; e anticorpos anti-DNA, anti-eritrócito e anti-plaqueta em lupus erythematosus sistémico.
Em 1984 mostrou-se que o HIV era um agente etiológico da SIDA. Desde essa altura a definição de SIDA foi revista algumas vezes no que respeita aos critérios que deveriam ser incluídos no diagnóstico. No entanto, apesar da variação nos parâmetros de diagnóstico, o denominador comum simples da SIDA é a infecção com HIV e o desenvolvimento subsequente de sintomas constitucionais persistentes e doenças que definem a SIDA, tais como infecções secundárias, neoplasmas e doenças neurológicas.
Harrison's Principies of Internai Medicina. 12*. ed., McGraw Hill (1991). O HIV é um retrovírus humano do grupo lentivirus. Os quatro retrovírus humanos reconhecidos pertencem a dois grupos distintos: os retrovírus linfotrópicos T humanos (ou leucemia), HTLV-1 E HTLV-2, e os vírus de imunodeficiência humana HIV-1 e HIV-2. Os primeiros são virus de transformação enquanto que os últimos são vírus citopáticos. O HIV-l foi identificado como a causa mais vulgar da SIDA em todo o mundo. A sequência de homologia entre HIV-2 e HIV-1 é de cerca de 40% estando o HIV-2 relacionado mais de perto com -4 D-622 alguns elementos de um grupo de vírus de imunodeficiência em simios (SIV). Ver Curran, J. e outros, Science. 329:1357--1359 (1985); Weiss, R. e outros, Nature, 324:572-575 (1986) . O HIV possui os genes retrovirais habituais (env, gag. e pol) assim como seis genes extra envolvidos na replicação e noutras actividades biológicas do vírus. Tal como afirmado anteriormente, o denominador comum da SIDA é uma profunda imunosupressão, predominantemente de célula de imunidade celular. A supressão de imunidade leva a uma variedade de doenças oportunistas, particularmente certas infecções e neoplasmas. A causa principal do defeito de imunidade na SIDA foi identificada como uma deficiência qualitativa e quantitativa no subconjunto de linfócitos T derivados do timo, a população T4. Este subconjunto de células é definido fenotipicamente pela presença da molécula de superfície CD4, que se demonstrou ser o receptor celular para o HIV. Dalgleish e outros, Nature. 312:763 (1984). Embora a célula T4 seja o principal tipo de célula infectada com HIV, essencialmente qualquer célula humana que exprima a molécula CD4 na sua superfície é capaz de se ligar a e de ser infectada com HIV.
Tradicionalmente, às células T CD4+ foi designado o papel de -5 auxiliador/indutor, indicando a sua função ao proporcionar um sinal de activação a células B, ou que induzem linfócitos T que suportam o marcador CD8 recíproco a tornarem-se células citotóxicas/supressoras. Reinherz e Schlossman, Cell. 19.:821-827 (1980); Goldstein e outros, Immunol. Rev. . 68:5-42, (1982). 0 HIV liga-se especificamente e com elevada afinidade, através de uma extensão de amino ácidos no invólucro virai (gpl2 0) a uma zona da região VI da molécula CD4 localizada próximo do terminal N. A seguir à ligação, o vírus funde-se com a membrana de célula alvo e é interiorizado. Uma vez interiorizado utiliza a enzima transcriptase reversa para transcrever o seu RNA genomico para DNA, que é integrado no DNA celular em que ele existe durante a vida da célula como um "provirus". 0 "provirus" pode permanecer latente ou ser activado para transcrever RNAm e RNA genomicos, o que conduz à síntese de proteína, à formação de novos vírus e ao desenvolvimento de vírus provenientes da superfície celular. Embora não tenha sido determinado o mecanismo preciso, através do qual o vírus induz a morte da célula, tem-se a impressão de que o mecanismo principal é o desenvolvimento maciço de vírus da superfície celular, que conduz à disrupção da membrana de plasma e consequente desequilíbrio osmótico. -6- D-622
No decurso da infecção, o organismo hospedeiro desenvolve anticorpos contra as proteínas virais, incluindo as glicoproteínas principais de invólucro gpl20 e gp41. Apesar desta imunidade humoral, a doença progride, resultando uma imunosupressão, caracterizada pelas múltiplas infecções oportunistas, parasitemia, demência e morte. A incapacidade dos anticorpos anti-vírus hospedeiros para fazer cessar a progressão da doença representa um dos aspectos mais incómodos e alarmantes da infecção e vaticina fracos augúrios para os esforços de vacinação baseados em tentativas convencionais.
Dois factores podem desempenhar um papel na eficácia da resposta humoral a virus da imunodeficiência. Primeiro, tal como outros vírus RNA (e tal como retrovirus em particular), os vírus da imunodeficiência revelam uma elevada taxa de mutação em resposta à vigilância da imunidade dos hospedeiros. Segundo, as próprias glicoproteínas de invólucro são moléculas fortemente glicosiladas que apresentam poucos epitopos apropriados para ligação de anticorpos de alta afinidade. O alvo fracamente antigénico que apresenta o invólucro do vírus permite uma pequena oportunidade ao hospedeiro para restringir a infecção virai através da produção de anticorpos específicos.
As células infectadas pelo vírus HIV expressam a glicoproteina gpl20 na sua superfície. A gpl20 serve de υ-622 mediadora nos casos de fusão entre células CD4+ através de uma reacção semelhante àquela através da qual o vírus se introduz nas células não infectadas, conduzindo à formação de células gigantes multinucleadas de vida curta. A formação de sincicio depende de uma interacção directa da glicoproteína de invólucro gpl20 com a proteína CD4. Dalgleish e outros, supra; Klatzman, D. e outros, Nature. 312:763 (1984); McDougal, J.S. e outros, Science. 231:382 (1986); Sodroski, J. e outros, Nature. 322:470 (1986) ; Lifson, J.D. e outros, Nature. 323:725 (1986); Sodroski, J. e outros, Nature. 221:412 (1986). A prova de que a ligação CD4-gpl20 é responsável pela infecção virai das células que contêm o antigene CD4 inclui a descoberta de que entre gpl20 e CD4 se forma um complexo específico. McDougal e outros, supra. Outros investigadores demonstraram que as linhas de células, que para HIV eram não infecciosas, foram convertidas em linhas de células infectáveis, seguindo-se a transfecção e a expressão de genes humanos CD4 e DNAc. Maddon e outros, Cell. 46:333-348 (1986).
Programas terapêuticos baseados em CD4 solúvel, como um agente passivo para interferir com adsorpção virai e transmissão celular mediada por sincicio foram propostos e demonstrados com sucesso in vitro por vários grupos (Deen e outros, Nature. 3321:82-84 (1988); Fisher e outros, Nature. 331:76-78 (1988); Hussey e outros, Nature. 331:78-81 (1988);
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Smith e outros, Science. 238:1704-1707 (1987); Traunecker e outros, Nature. 331:84-86 (1988); e subsequentemente foram desenvolvidas proteínas de fusão de imunoglobulina CD4 com vidas médias prolongadas e modesta actividade biológica (Capon e outros, Nature. 337:525-531 (1989); Traunecker e outros, Nature. 339. 68-70 (1989) ; Byrn e outros, Nature, 344:667-670 (1990); Zettlmeissl e outros, DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990). Embora as imunotoxinas CD4 conjugadas ou as proteínas de fusão mostrem uma forte citotoxicidade para células infectadas in vitro (Chaudhary e outros, Nature. 335:369-372 (1988); Till e outros Science. 242:1166-1168 (1988)), a latência do síndroma a imunoeficiência torma pouco provável que qualquer terapia de tratamento único seja eficaz para eliminar sobrecargas de vírus, e a antigenicidade de proteínas de fusão estranhas seja apropriada para limitar a sua capacidade de aceitação em tratamentos que requerem doses repetitivas. Ensaios com macacos afectados com SIV mostraram que CD4 solúvel, se administrado a animais sem citopenia marcada CD4, podem reduzir a titulação de SIV e melhorar as medidas in vitro de mielóide potencial (Watanabe e outros, Nature, 337:267-270 (1989)). No entanto, observou-se uma pronta reemergência de vírus após se ter interrompido o tratamento, sugerindo que a administração durante toda a vida podia ser necessária para evitar a debilitação progressiva do sistema de imunidade. -9- D-622
Receptores de Célula T e receptores Fc A expressão da superfície celular da forma mais abundante do receptor antigénico de célula T (TCR) requer a coexpressão de, pelo menos, 6 cadeias diferentes de polipéptidos diferentes (Weiss e outros, J. Exp . Med. . 160:1284-1299 (1984); Orloffashi e outros, Nature, 316;606-609 (1985);
Berkhout e outros, J. Biol. Chem., 263:8258-8536 (1986) ; Sussman e outros, Cel 1 . 5.2.:85-95 (1988)), as cadeias de ligação de antigene oí //3 , os três polipéptidos do complexo CD3 e $ . Se qualquer das cadeias está ausente, não se sucede a expressão estável dos restantes elementos do complexo. í é o polipéptido de limitação para a expressão de superfície do complexo completo (Sussman e outros, Cell. 52.:85-95 (1988) e é suposto ser mediador de, pelo menos, uma fracção dos programas de activação celular activados pelo reconhecimento de receptor de ligando (Weissman e outros, EMBO J. , 8.: 3651-3656 (1989); Frank e outros, Science, 249:174-177 (1990)). Um homodímero de membrana integral 32kDa de tipo I, S (zeta) tem um domínio extracelular de resíduo 9 sem locais para adição de glicano N-ligado e um domínio intracelular de resíduo 112 (ratinho) ou de resíduo 113 (humano) (Weissman e outros, Science. 238:1018-1020 (1988a); Weissman e outros Natl. Acad. Sei. USA. 85:9709-9713 (1988b)). Uma forma iso de S chamada Ά (eta) (Baniyash e outros, J. Biol. Chem., 263:9874-9878 (1988); Orloff e outros, J. Biol, Chem.. 264:14812-14817 (1989), que surge de uma via alternativa de união de RNAm (Jin e outros, proc. -10- D-622
Natl. Acad. Sei. USA. 87:3319-3323 (1990)), encontra-se presente em quantidades reduzidas em células que expressam o receptor antigene. Supõe-se que o heterodímeros í - 71 sejam mediadores para a formação de fosfatos inositol, assim como a morte de célula programada iniciada por reepetor chamada apoptose (Mercep e outros, Sicence. 242:571-574 (1988);
Mercep e outros, Sicence. 246:1162-1165 (1989));
Tal como S e 7i , a cadeia T associada a receptor Fc é expressa em complexos de superfície celular com polipéptidos adicionais, alguns dos quais são mediadores do reconhecimento de ligando e outros têm uma função indefinida. T (gamma) contem uma estrutura homodimérica e uma organização global muito semelhante à de S e é um componente de ambos os receptores IgE de alta afinidade, FceRI das células mast e basófilos, que consiste em, pelo menos três cadeias de polipéptidos diferentes (Blank e outros, Nature. 337:187-189 (1989); Ra e outros, Nature. 241:752-754 (1989)) e um dos receptores de baixa afinidade para IgG, representado em murinos por Fc 7* Rllcí (Ra e outros, J. Biol. Chem. . 264:15323-15327 (1989)) e em seres humanos pela expressão de subtipo CD16 por macrófagos e células assassinas "natural killer cells", CD16TM (transmembrana CD16) (Lanier e outros, Nature. 342:803-805 (1989); Anderson e outros, Proc. Natl.
Acad. Sei. USA. 87.:2274-2278 (1990) e com um polipéptido de função não identificada (Anderson e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87.:2274-2278 (1990)). Foi relatado recentemente -11- D-622 que ^ é expresso por uma linha celular T de murinos, CTL, na qual forma homodimeros assim como heterodímeros Ί- S e *1 (Orloff e outros, Nature, 347:189-191 (1990)).
Os receptores Fc são mediadores de fagocitose de complexos de imunidade, transcitose e citoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless e outros, Annu. Rev. Immunol. 6:251-281 (1988); e Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Foi recentemente revelado que uma das forma iso de receptores de Fc de ratinhos de baixa afinidade (FcRTlIIBl) é mediadora de interiorização de alvos revestidos de Ig em concavidades revestidas de clatrina e que outros receptores de baixa afinidade (FcrTuiA) são mediadores de ADCC através da sua associação com um ou mais elementos de uma pequena família de "moléculas activadoras" (Miettinen e outros, Cell. 58:317-327 (1989); e Hunzikere Mellman, J. Cell. Biol.. 109:3291-3302 (1989)). Estas moléculas activadoras, cadeia •f de receptor de célula T (TCR) , cadeia 7? TCR e cadeia ^ de receptor Fc, interactuam com domínios de reconhecimento de ligando de diferentes receptores de sistema de imunidade e podem iniciar autonomamente programas efectores celulares, incluindo citólise, seguindo-se a agregação (Samelson e outros, Cell. 4.3:223-231 (1985) ; Weissman e outros, Science. 239:1018-1020 (1988); Jin e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:3319-3323 (1990); Blank e outros, Nature, 337:187-189 -12- D-622 (1989); Lanier e outros, Nature. 342:803-805 (1989);
Kurosaki e Ravetch, Nature. 342:805-807 (1989); Hibbs e outros, Science. 246:1608-1611 (1989); Anderson e outros,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2274-2278 (1990); e Irving e Weiss, Cell 64:891-901 (1991)).
Ao desenhar paralelas entre as famílias de receptores Fc de baixa afinidade de ratinhos e de seres humanos, tornou-se claro, no entanto, que as formas iso de FcR^IIA e C de seres humanos não têm contrapartida nos ratinos. Em parte por causa disto, a sua função não foi ainda definida.
Uma vez que os agentes humorais baseados em CD4 podem ter uma utilidade limitada in vivo, os inventores começaram a explorar a possibilidade de aumento da imunidade celular para HIV. Em consequência, relataram a preparação de proteínas quiméricas em que o domínio extracelular de CD4 é fundido com domínios transmembrana e/ou intracelulares de célula T e elementos transdutores de sinal de receptores Fc IgG. As células T citolíticas que exprimem as quimeras revelam uma potente destruição MHC-independente de alvos celulares que exprimem proteínas de invólucro HIV. Um componente novo e extremamente importante desta proximação foi a identificação de cadeias de receptores de célula T ou receptores Fc, cuja agregação é suficiente para iniciar a resposta celular.
Uma aplicação particularmente útil desta aproximação foi a invenção de quimeras entre CD4 e y , ?? , ou 7" qUe orientam -13- D-622 linfócitos T citoliticos para reconhecer e matar células que exprimem gpl20 HIV.
Embora os receptores nativos de célula T e Fc sejam ou possam ser estruturas multiméricas altamente complicadas que não se prestam a uma manipulação conveniente, o presente invento demonstra a exequibilidade de se criarem quimeras entre o domínio intracelular de qualquer uma de uma variedade de moléculas que são capazes de preencher a tarefa de reconhecimento do alvo. Em particular, a formação de quimeras que consistem numa zona intracelular de cadeias de célula T/receptores Fc zeta, eta ou gamma ligada à zona extracelular de moléculas anticorpo apropriadamente manipuladas permite o potencial reconhecimento do alvo de uma célula de sistema de imunidade para ser especificamente reorientada para o antigene reconhecido pela zona de anticorpo extracelular. Deste modo, com uma zona de anticorpo capaz de reconhecer alguma determinante na superfície de um patogene células de sistema de imunidade armadas com a quimera responderiam à presença do patogene com o programa efector apropriado para a sua estirpe, por exemplo, linfócitos T auxiliadores responderiam através de uma actividade citotóxica contra o alvo e os linfócitos B seriam activados para sintetizar anticorpos. Macrófagos e granulócitos suportariam os seus programas efectores, incluindo a libertação de citoquina, fagocitose e geração de oxigénio reactivo. De modo semelhante, com uma zona de L)-b22 -14 anticorpo capaz de reconhecer células de tumor, a resposta do sistema de imunidade ao tumor seria beneficamente elevada. Com um anticorpo capaz de reconhecer células de imunidade que possuem uma reactividade desapropriada com autodeterminantes, as células autoreactivas poderiam ser selectivamente tornadas alvo de destruição. Embora estes exemplos sejam baseados no uso de anticorpos quiméricos como um instrumento de exposição conveniente, o presente invento não está limitado, no seu âmbito, a anticorpos quiméricos e, com efeito, o uso de domínios extracelulares não anticorpo específicos pode ter importantes vantagens. Por exemplo, com uma zona extracelular que é o receptor para um vírus, para uma bactéria ou para parasitas, as células equipadas com quimeras alvejariam especificamente células que exprimem os determinantes virais, bacterianos ou parasiticos. A vantagem desta aproximação em relação ao uso de anticorpos é que o receptor nativo para patogene poderia ter unicamente alta selectividade ou afinidade com o patogene, permitindo um maior grau de precisão na resposta de imunidade resultante.
De modo semelhante, para eliminar células de sistema de imunidade que reajam não apropriadamente com um auto--antigene, pode ser suficiente juntar o antigene (tanto como uma proteína intacta, no caso de terapias de depleção de célula B, ou como um complexo MHC, no caso de terapias de depleção de célula T) para cadeias intracelulares zeta, eta, gamma e, que por esse motivo afecta o alvejamento específico -15- D-622 das células que respondem não apropriadamente a auto--determinantes.
Outro uso das quimeras é o control de populações de células in vivo subsequente a outras formas de manipulação genética. Por exemplo, foi proposto o uso de linfócitos de infiltração de tumor ou "natural killer cells" para suportar princípios citotóxicos para a localização dos tumores. 0 presente invento proporciona meios convenientes para regular o número e actividade desses linfócitos e células sem removê-las do corpo do paciente para amplificação "in vitro". Deste modo, uma vez que os domínios intracelulares dos receptores quiméricos são mediadores da resposta proliferativa das células, a coordenação dos domínios extracelulares por uma variedade de estímulos específicos de agregação para os domínios extracelulares (por exemplo, um anticorpo específico para o domínio extracelular) resultará na proliferação das células que suportam as quimeras.
Embora as formas de realização específicas do presente invento compreendam quimeras entre cadeias zeta, eta ou gamma, ou seus fragmentos activos (por exemplo, as que se discutirão abaixo), qualquer cadeia receptora tendo uma função semelhante para estas moléculas, por exemplo, em granulócitos ou linfócitos B, podia ser usada para o fim aqui descrito. Os distintos aspectos das desejáveis moléculas activadoras celulares de imunidade compreendem a capacidade -16- D-622 para serem expressas autonomamente (por exemplo, como uma cadeia única), a capacidade para serem fundidas num domínio extracelular de modo que a quimera resultante esteja presente numa superfície celular terapêutica e a capacidade para iniciar programas efectores celulares quando da agregação secundária para se encontrar com um ligando alvo.
Presentemente, o método mais conveniente para transportar quimeras às células de sistema de imunidade é através de alguma forma de terapia genética. No entanto, a reconstituição de células de sistema de imunidade com receptores quiméricos através da mistura das células com proteína quimérica purificada adequadamente solubilizada, também resultaria na formação de uma população de células manipuladas capazes de responder aos alvos reconhecidos pelo domínio extracelular das quimeras. Foram utilizadas aproximações semelhantes, por exemplo, para introduzir o receptor de HIV intacto, CD4, em eritrócitos para fins terapêuticos. Neste caso a população de células manipuladas não seria capaz de auto-renovação. O presente invento refere-se células T funcionais simplificadas e a receptores quiméricos Fc que são capazes de reorientar a função de sistema de imunidade. Mais particularmente, refere-se à regulação de linfócitos, macrófagos, células assassinas "natrural killer cells" ou granulócitos através da expressão nas referidas células de -17- D-622 quimeras que fazem com que as células respondam a alvos reconhecidos pelas quimeras. O presente invento refere-se também a um processo para orientar a resposta celular a um agente infeccioso, um tumor ou uma célula cancerosa, ou uma célula gerada por autoimunidade. 0 método para orientar a resposta celular num mamífero compreende a administração de uma quantidade eficaz de células terapêuticas a esse mamífero, sendo as referidas células capazes de reconhecer e destruir os referidos agente infeccioso, tumor, célula de cancro ou célula gerada por autoimunidade.
Noutra forma de realização, o processo para orientar a resposta celular para um agente infeccioso compreende a administração de células terapêuticas capazes de reconhecer e destruir o referido agente, em que o agente é um vírus específico, uma bactéria, um protozoário ou fungos. Ainda mais especificamente, o processo é dirigido contra agentes, tais como HIV e Pneumocvstis carnii.
Especificamente o invento proporciona um método de orientar a resposta celular para uma célula infectada com HIV. O método compreende a administração a um paciente de uma quantidade eficaz de linfócitos T citotóxicos, sendo os referidos linfócitos capazes de reconhecer e lisar especificamente células infectadas com HIV.
Deste modo, numa forma de realização, proporciona-se, de D-622 -18-
acordo com o presente invento, um método para orientar a resposta celular a células infectadas com HIV, compreendendo a administração a um paciente de uma quantidade eficaz de linfóctios T citotóxicos que são capazes de reconhecer e lisar especificamente células infectadas com HIV.
Ainda numa outra forma de realização proporcionam-se as proteínas receptoras quiméricas que orientam os linfócitos T citotóxicos para reconhecer e lisar a célula infectada com HIV. Ainda uma outra forma de realização do presente invento compreende células hospedeiras transformadas com um vector que compreende os receptores quiméricos.
Ainda numa outra forma de realização, o presente invento proporciona um anticorpo contra os receptores quiméricos do presente invento.
Para se obter linfócitos T citotóxicos que especificamente ligam e lisam células infectadas com HIV, os presentes inventores tentaram, por isso, as quimeras receptoras. Estes receptores quiméricos são funcionalmente activos e possuem a extraordinária aptidão de serem capazes de ligar e lisar especificamente células que exprimem gpl20. É um objecto do presente invento, por conseguinte, proporcionar um método de tratamento para indivíduos infectados com HIV. O presente invento proporciona, assim, um número de avanços importantes na terapia da SIDA.
Estas e outras formas de realização não limitativas do presente invento serão evidentes para os peritos do ramo da descrição pormenorizada do presente invento que se segue.
Na descrição pormenorizada que se segue, far-se-á referência a várias metodologias conhecidas dos peritos no ramo da biologia e imunologia molecular. As publicações e outra literatura que descrevem essas metodologias às quais se faz referência são aqui incorporadas a título de referência no seu conjunto como sendo totalmente descritos.
Trabalhos de referência padrão, descrevendo os princípios gerais da tecnologia de DNA recombinante, incluem Watson, J.D. e outros, Molecular Biology of the Gene. Volumes I e II, Editores - Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnell, J.E. e outros, Molecular Cell Biology, Editores - Scientific American Books, Inc., Nova Iorque, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II. Editores - John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.Y. (1985); Old, R.W. e outros, Principies of Gene Manipulation; An Introduction to Genetic Engineering, 2a. edição, University of Califórnia Press, Editores - Berkeley, CA (1981); Maniatis, T. e outros, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual. 2a. edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Editores, Cold Spring Harbor, NY (1989) ; e Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel e outros, Wiley Press, Nova Iorque, NY (1989). D-622 -20τ tf "Clonagem" significa o uso de técnicas de recombinação "in vitro" para inserir um gene particular ou outra sequência DNA numa molécula vector. Para se clonar com sucesso um gene desejado, é necessário empregar métodos para gerar fragmentos DNA para unir os fragmentos às moléculas vector, para introduzir a molécula DNA compósita numa célula hospedeira em que a mesma possa ser replicada e para seleccionar o clone que possui o gene alvo de entre as células hospedeiras receptivas. "DNAc" significa cópia de DNA ou DNA complementar produzido a partir de um RNA suportado pela acçâo de polimerase de DNA dependente de RNA (transcriptase inversa). Deste modo, um "clone DNAc" significa uma sequência DNA dupla complementar de uma molécula RNA de interesse, transportada num vector de clonagem. "biblioteca DNAc" significa uma colecção de moléculas recombinantes DNA contendo enxertos DNAc que compreendem cópias DNA de RNAm sendo expressas pela célula na altura em que a biblioteca DNAc foi feita. Uma tal biblioteca DNAc pode ser preparada pelos métodos conhecidos pelos peritos no ramo e descritas, por exemplo, em Maniatis e outros, Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, supra.
Em geral, o RNA é primeiro isolado das células de um organismo de cujo genoma se deseja clonar um gene particular. -21- D-622 São preferidos para os fins do presente invento linhas de células linfocíticas de mamíferos e, particularmente, de seres humanos. Um vector presentemente preferido para este fira é o vírus vaccinia de estirpe WR. "Vector" significa uma molécula DNA, derivada, por exemplo, de um plasmídio, bacteriófago, ou vírus de insecto ou de mamífero, no qual podem ser inseridos ou clonados os fragmentos de DNA. Um vector conterá uma ou mais localizações de restrição únicas e pode ser capaz de replicação autónoma num organismo hospedeiro ou veículo definido, de tal modo que a sequência clonada seja reprodutível. Deste modo, "vector de expressão DNA" significa um qualquer elemento autónomo capaz de orientar a síntese de um péptido recombinante. Esses vectores de expressão DNA incluem plasmídios bacterianos e fagos e plasmídios e vírus de insectos e de seres humanos. "Substancialmente puro" significa um composto, por exemplo, uma proteína, um polipéptido ou um anticorpo que é substancialmente isento dos componentes que naturalmente o acompanham.
Geralmente, um composto é substancialmente puro quando, pelo menos, 60%, mais preferivelmente, pelo menos, 7 5% e ainda mais preferivelmente, pelo menos, 90% do material total numa amostra é o composto de interesse. A pureza pode ser D-622 -22-
medida por qualquer método apropriado, por exemplo, cromatografia de coluna, electroforese de gel poliacrilamida, ou análise HPLC. No contexto de um ácido nucleico, "substancialmente puro" significa um fragmento um segmento ou uma sequência de ácido nucleico isento dos genes que o rodeiam no seu estado de ocorrência natural (por exemplo isento das sequências que rodeiam o ácido nucleico na sua posição genômica inata). "Derivado funcional" significa os "fragmentos", "variantes", "análogos" ou "derivados químicos" de uma molécula. Um "fragmento" de uma molécula, tal como qualquer uma das sequências DNAc do presente invento, significa fazer referência a qualquer subconjunto nucleótido da molécula. Uma "variante" dessa molécula significa fazer referência a uma molécula que surge naturalmente, substancialmente semelhante, tanto à molécula inteira, como a um seu fragmento. Um "análogo" de uma molécula significa fazer referência a uma molécula não natural substancialmente semelhante, tanto à molécula inteira, como a um seu fragmento. Diz-se que a molécula é "substancialmente semelhante" a outra molécula se a sequência de amino ácidos em ambas as moléculas é substancialmente a mesma. Moléculas de amino ácido substancialmente semelhante possuirão uma actividade biológica semelhante. Deste modo, desde que duas moléculas possuam uma actividade semelhante, são consideradas variantes, tal como esse termo é aqui utilizado, mesmo se uma das moléculas contem resíduos adicionais ou menos amino ácidos não encontrados na outra, ou se a sequência de -23- D-622 resíduos de amino ácidos não é idêntica. Tal como aqui utilizado, diz-se que uma molécula é um "derivado químico" de outra molécula quando contem metades químicas adicionais que não são normalmente uma parte da molécula. Essas metades melhoram a média de vida biológica, absorção e solubilidade da molécula, etc. As metades podem alternadamente diminuir a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar qualquer efeito secundário indesejável da molécula, etc. Metades capazes de serem mediadoras desses efeitos são descritas por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences. 16a. edição, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).
De um modo semelhante, pretende-se que um "derivado funcional" de um gene de célula T ou de receptor quimérico Fc de acordo com o presente invento inclua "fragmentos", "variantes" ou "análogos" do gene, que pode ser "substancialmente semelhante" em sequência nucleótida e que codifica uma molécula que possui uma actividade semelhante a, por exemplo, uma célula T receptora ou receptor quimérico Fc.
Deste modo, tal como aqui utilizado, uma proteína de célula T ou receptor quimérico Fc também significa que inclui quaisquer derivados funcionais, fragmentos, variantes, análogos ou derivados químicos que podem ser substancialmente semelhantes às quimeras de "tipo selvagem" que possuem uma actividade semelhante (isto é, como mais preferivelmente 90%, mais preferivelmente 70%, preferivelmente 40% ou, pelo menos, -24-
D-622 10% da actividade da quimera receptora de tipo selvagem). A actividade de um derivado funcional de receptor quimérico inclui a ligação especifica (com a sua zona extracelular) a um agente ou célula tornados alvo e a destruição resultante (dirigida pela sua zona extracelular ou de transmembrana) daquele agente ou célula, essa actividade pode ser testada, por exemplo, utilizando qualquer dos ensaios aqui descritos. -·.·. Uma sequência de DNA que codifica o receptor quimérico Fc e a í " célula T, de acordo com o presente invento, ou os seus derivados funcionais, pode ser recombinada com o DNA vector de acordo com técnicas convencionais, incluindo terminais para ligação com extremidades de fim bicudo ou arredondado, restrição de digestão de enzima para proporcionar terminais apropriados, que enchem as extremidades aderentes tal como é apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar união indesejável e ligação com ligases apropriadas. As técnicas para essas manipulações são descritas por Maniatis, 1 T. e outros, supra e são bem conhecidas na arte.
Diz-se que uma molécula de ácido nucleico, tal como DNA, é "capaz de expressar" um polipéptido se ela contiver sequências nucleótidas que contêm informação reguladora de tradução e de transcrição e essas sequências estão "ligadas operacionalmente" a sequências nucleótidas que codificam o polipéptido. Uma ligação operável é uma ligação -2b- D-622 na qual as sequências DNA reguladoras e a sequência de DNA que se procurou expressar estão ligadas de modo a permitir a expressão do gene. A natureza precisa das regiões reguladoras necessárias para a expressão de gene podem variar de organismo para organismo, mas devem, regra geral, incluir uma região promotora que, em procariotas, contem tanto o promotor (que orienta a iniciação de transcrição de RNA), assim como as sequências DNA que, quando transcritas pra RNA, trasnmitirão um sinal de iniciação da síntese de proteína. Essas regiões incluirão normalmente aquelas sequências 5'- -não-codificantes envolvidas na iniciação de transcrição e tradução, tal como caixa TATA, sequência de cobertura, sequência CAAT e semelhantes.
Se se desejar, a região de não codificação 3 ' para a sequência de gene codificante para a proteína pode ser obtida pelos métodos acima descritos. Esta região pode ser retida para as suas sequências reguladoras do fim da transcrição, tais como terminação e poliadenilação. Deste modo, ao reter--se a região 3' naturalmente contígua à sequência de DNA codificante para a proteína, podem proporcionar-se os sinais de terminação de transcrição. No caso de os sinais de terminação de transcrição não serem satisfatoriamente funcionais na célula hospedeira de expressão, então pode ser substituída uma região 3' funcional na célula hospedeira. -26- D-622
Diz-se que duas sequências DNA (tais como a sequência de região promotora ou a sequência codificante de célula T receptora ou de receptor quimérico Fc) estão operativamente ligadas se a natureza da ligação entre as duas sequências DNA (1) não resulta na introdução de uma mutação de comutação de estrutura, (2) não interfere com a aptidão da sequência de zona promotora para orientar a transcrição da sequência genética de receptores de célula T e de receptores quiméricos Fc, ou (3) não interfere com a aptidão da sequência de gene quimérico receptor Fc e de célula T receptora para ser transcrita pela sequência de zona promotora. Uma zona promotora estaria operativamente ligada a uma sequência DNA se a zona promotora fosse capaz de efectuar a transcrição daquela sequência DNA.
Deste modo, para expressar a proteína, são necessários sinais de transrição e de tradução reconhecidos por um hospedeiro apropriado. 0 presente invento contem a expressão de uma proteína de célula T receptora ou receptor quimérico Fc (ou um seu derivado funcional), tanto em células procarióticas como eucarióticas, embora a expressão eucariótica (e particularmente linfócito humano) seja preferível.
Os anticorpos de acordo com o presente invento podem ser preparados por qualquer um de uma variedade de métodos. Por -27- D-622 exemplo, as células que expressam a proteína quimérica receptora Fc ou célula T receptora, ou um seu derivado funcional, podem ser administradas a um animal para induzir a produção de anticorpos policlonais contendo soros que são capazes de ligar a quimera.
Num método preferido, os anticorpos de acordo com o presente invento, são anticorpos monoclonais. Esses anticorpos monoclonais podem ser preparados usando tecnologia de hibridoma (Kohler e outros, Nature 256:495 (1975); Kohler e outros, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler e outros, Eur. J. Immunol. 6 : 292 (1976); Hammerling e outros, Em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hvbridomas. Elsevier, N.Y., pp. 563-684 (1981)). Em geral, esses procedimentos envolvem a imunização de um animal com o antigene quimérico receptor Fc e célula T receptora. Os esplenócitos desses animais são extraídos e fundidos com uma linha celular mieloma apropriada. Qualquer linha celular de mieloma apropriada pode ser empregada de acordo com o presente invento. Após a fusão, as células de hibridoma resultantes são selectivamente mantidas em meio HAT e, em seguida, são clonadas limitando a diluição, tal como descrito por Wands, J.R. e outros (Gastroenteroloqv 80:225-232 (1981). As células de hibridoma obtidas através dessa selecção são, em seguida, ensaiadas para identificar os clones que segregam anticorpos capazes de ligar a quimera. D-622 -28-
Os anticorpos de acordo com o presente invento também podem ser policlonais ou, de preferência, anticorpos policlonais de zona específica.
Anticorpos contra a célula T receptora ou receptor quimérico Fc, de acordo com o presente invento, podem ser usados para controlar a quantidade de receptor quimérico (ou células que contêm receptores quiméricos) num paciente. Esses anticorpos são apropriados para uso num ensaio de imunodiagnóstico conhecido na arte, incluindo esses ensaios imunométricos ou ensaios "sandwich", tais como os ensaios de "forward sandwich", "reverse sandwich" e "simultaneous sandwich". Os anticorpos podem ser usados em qualquer número de combimações, tal como pode ser determinado pelos peritos sem a experimentação indevida para efectuar ensaios de imunidade de aceitável especificidade, sensibilidade e precisão.
Trabalhos de referência padrão que descrevem princípios gerais de imunologia, incluem Roitt, I., Essential Immunoloqy. sexta edição, Editores - Backwell Scientific Publications, Oxford (1988); Kimball, J.W., Introduction to Immunoloqy. Segunda edição, Editores - Macmillan Publishing Co. , Nova Iorque (1986); Roitt, I. e outros, Immunoloqy. Editores - Gower Medicai Publishing Ltd., Londres, (1985); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology", era Burdon, R. e outros, edições Laboratorv Techniques in Biochemistrv and Molecular Bioloqy. Volume 13, Editor - Elsevier, Amsterdam -29- D-622 (1984); Klein, J. , Inununoloqy: The Science of Self-Nonself Discrimination. Editores - John Wiley & Sons, Nova Iorque (1982); e Kennet, R., e outros, edições, Monoclonal Antibodies. Hvbridoma: A Nev Dimension In Biolocrical Analvses. Editores - Plenum Press, Nova Iorque (1980).
Por "detecção" pretende incluir-se a determinação da presença ou ausência de uma substância ou a quantificação da quantidade de uma substância. 0 termo refere-se ainda ao uso dos materiais, composições e métodos do presente invento para determinações qualitativas e quantitativas. 0 isolamento de outros hibridomas que segregam anticorpos monoclonais da mesma especificidade dos aqui descritos pode ser completado pela técnica de separação anti-idiotipico (Potocmjak e outros, Science 215:1637 (1982)). Em resumo, um anticorpo anti-idiotipico é um anticorpo que reconhece determinantes únicos presentes no anticorpo prouzido pelo clone de interesse. O anticorpo anti-idiotipico é preparado através da imunização de um animal da mesma estirpe utilizado como fonte do anticorpo monoclonal com o anticorpo monoclonal de interesse. O animal imunizado reconhecerá e responderá a determinantes idiotipicos do anticorpo de imunização produzindo um anticorpo para estes determinantes idiotipicos (anticorpo anti-idiotipico).
Para replicação, as células híbridas podem ser cultivadas
tanto in vitro" como in vivo. A elevada produção in vivo faz deste o método de cultura actualmente preferido. Em resumo, as células de estirpes híbridas individuais são injectadas intraperitonealmente em ratinhos BALB/c preparados em pristano para produzir fluido de ascites contendo altas concentrações dos anticorpos monoclonais desejados. Anticorpos monoclonais de isótopo IgM ou IgG podem ser purificados a partir de sobrenadantes de cultura utilizando métodos de cromatografia de coluna bem conhecidos para os peritos na arte.
Anticorpos de acordo com o presente invento são particularmente apropriados para uso em imunoensaios em que eles podem ser utilizados na fase líquida ou ligados a um veiculo de fase sólida. Além disso, os anticorpos nestes imunoensaios podem ser detectavelmente rotulados de vários modos. Há rótulos e métodos muito diferentes de rotulagem conhecidos na arte. Exemplos dos tipos de rótulos que podem ser usados no presente invento incluem, mas não estão limitados a enzimas, radioisótopos, compostos fluorescentes, compostos quimico-luminescentes, compostos bioluminescentes e queliferos metálicos. Os peritos no ramo saberão outros rótulos apropriados para ligação a anticorpos, ou serão capazes de determinar o mesmo através do uso de experimentação de rotina. Além disso, a ligação destes rótulos a anticorpos pode ser completada usando técnicas -31- D-622 padrão comummente conhecidas dos peritos no ramo.
Uma das formas pela qual os anticorpos de acordo com o presente invento podem ser detectavelmente rotulados é através da ligação do anticorpo a uma enzima. Esta enzima, por sua vez, quando é mais tarde exposta ao seu substrato, reagirá com o substrato de modo a produzir uma metade química que pode ser detectada, por exemplo, por meios fluorométricos ou espectrofotométricos. Exemplos de enzimas que podem ser usadas para rotular detectavelmente anticorpos, compreendem dehidrogenase de malato, nuclease de estafilococus, isomerase de esteróides delta V, dehidrogenase de álcool levedada, dehidrogenase de glicerofosfato-alfa, isomerase de fosfato triose, peroxidase de biotinavidina, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glucose, /} -galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, dehidrogenase de glucose-VI-fosfato, glucoamilase e estearase acetilconina. A presença de anticorpos rotulados de modo detectável, pode também ser detectada através da rotulagem de anticorpos com isótopo radioactivo que, em seguida, pode ser determinada por meios tais como contador gama ou um contador de cintilação. Isótopos que são particularmente úteis para a finalidade do presente invento são 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36C1, 57
Co, 58
Co, 59
Fe e 75
Se. -32- D-622 É também possível detectar a ligação de anticorpos detectavelmente rotulados através da rotulagem de anticorpos com um composto fluorescente. Quando um anticorpo rotulado fluorescentemente é exposto à luz do comprimento de onda apropriado, a sua presença pode, em seguida, ser detectada devido à fluorescência do corante. Entre os compostos de rotulagem fluorescente mais vulgarmente utilizados encontra--se a fluoresceina, isocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina.
Os anticorpos do presente invento podem também ser rotulados de modo detectável utilizando metais de emissão fluorescente, tais como 152Eu ou outros da série lantanida. Estes metais podem ser ligados à molécula do anticorpo utilizando grupos de quelação de metais como, por exemplo, ácido dietil-enteriaminopentaacético (DPTA) ou ácido etilenodiaminotetra--acético (EDTA).
Os anticorpos também podem ser detectavelmente rotulados através da sua acoplação a um composto quimicoluminescente. A presença do anticorpo rotulado-quimicoluminescente é então determinada detectando a presença de luminescência que surge no decurso da reacção química.
Exemplos de compostos de rotulagem de quimicoluminescência particularmente úteis são luminal, isoluminol, éster acridinio teromático, imidazola, sais de acridinio, éster oxalato e dioxetano. -33- D-622
Do mesmo modo, um composto bioluminescente pode ser utilizado para rotular os anticorpos de acordo com o presente invento. A bioluminescência é um tipo de quimicoluminescência encontrada em sistemas biológicos em que uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reacção de quimicoluminescência. A presença de um anticorpo bioluminescente é determinada através da detecção da presença de luminescência. Compostos bioluminescentes importantes para fins de rotulagem incluem luciferina, aequorina luciferase.
Os anticorpos e os antigenes substancialmente purificados do presente invento são idealmente apropriados para a preparação de um "kit". Esse "kit" pode compreender meios de veiculo que são compartimentados para receber em estreita confinidade com os mesmos um ou mais meios de contentor, tais como redomas, tubos e semelhante, compreendendo cada um dos referidos meios de contentor os elementos separados do ensaio a ser utilizado.
Os tipos de ensaios, que podem ser incorporados na forma "kit", são muitos e incluem, por exemplo, ensaios concorrentes e não concorrentes. Exemplos típicos de ensaios que podem utilizar os anticorpos do invento são radioimunoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA), ensaios imunosorventes de enzima ligada (ELISA) e imunoensaios de "sandwich" ou imunométricos.
Pelos termos "ensaio imunométrico" ou "ensaio de sandwich" pretende incluir-se os imunoensaios de "simultaneous sandwich", "forward sandwich" e "reverse sandwich". Estes termos são entendidos pelos peritos na arte. Esses peritos também apreciarão que os anticorpos de acordo com o presente invento serão úteis noutras variações e formas de ensaios que são presentemente conhecidos ou que podem ser desenvolvidos no futuro. Pretende-se que esses sejam incluídos no âmbito do presente invento.
Num modo preferido para realizar os ensaios é importante que certos "bloqueadores" estejam presentes no meio de incubação (habitualmente adicionado com o anticorpo rotulado solúvel). Os "bloqueadores" são adicionados para assegurar que proteínas não específicas, protease ou anticorpos humanos para imunoglobulinas de ratinho presentes na amostra experimental não se liguem cruzadamente ou destruam os anticorpos no suporte de fase sólida, ou anticorpo indicador radiorotulado, para dar falsos resultados positivos ou negativos. A selecção de "bloqueadores", por isso, auxilia substancialmente à especificidade dos ensaios descritos no presente invento.
Verificou-se que um número de anticorpos não relevante (isto é, não específicos) da mesma classe ou subclasse (isotipo) tal como os utilizados nos ensaios (por exemplo, IgG-^, IgG2a, IgM, etc.) pode ser usaso como "bloqueadores". a U-b22 -òó-
concentração de "bloqueadores" (normalmente 1-100 jjg/μΐ) é importante, para manter a sensibilidade própria e que ao' mesmo tempo inibe qualquer intereferência não desejada através da ocorrência de proteínas reactivas mutuamente cruzadas em soro humano. Além disso, o sistema de tampão que contem os "bloqueadores" tem de ser optimizado. Os tampões preferidos são os que são baseados em ácidos orgânicos fracos, tais como imidazola, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS e semelhantes segundo gamas fisiológicas de pH. Tampões um pouco menos preferidos são tampões inorgânicos, tais como fosfato, borato ou carbonato. Finalmente, inibidores de protease conhecidos deveriam ser adicionados (normalmente a 0,01-10 /ig/ml) ao tampão que contem os "bloqueadores".
Estes são muitos dos imunoadsorventes de fase sólida que foram empregados e que podem ser usados no presente invento. Imunoadsroventes bem conhecidos incluem vidro, polistireno, polipropileno, dextran, nylon e outros materiais, na forma de tubos, cordões e placas de microtitulo formadas a partir de ou revestidas com esses materiais e semelhantes. Os anticorpos imobilizados tanto podem ser ligados covalentemente como fisicamente ao imunoadsorvente de fase sólida através de técnicas, tais como ligação covalente por meio de uma ligação de amida ou de éster ou por absorção. Os peritos na arte conhecerão muitos outros imunoadsorventes de fase sólida apropriados e métodos para neles imobilizar os -3b- D-622 anticorpos, ou serão capazes de verificar tal facto, utilizando não mais do que experimentação de rotina.
Para a diagnose in vivo, in vitro ou in situ rótulos, tais como radionuclites podem ser ligados a anticorpos de acordo com o presente invento, tanto directamente, como utilizando um grupo funcional intermediário. Um grupo intermediário que é muitas vezes utilizado para ligar radioisótopos que existem como catiões metálicos para anticorpos é o ácido dietilenotraiaminopentaacético (DTPA). Exemplos típicos de catiões metálicos que são ligados deste modo, são: 9ftnTc, 123I, 111IN, 131I, ^Ru, 67Cu, 67Ga e ^Ga. Os anticorpos do invento podem também ser rotulados com isótopos não radioactivos para efeitos de diagnose. Elementos que são particularmente úteis deste modo são 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr e KFe. 0 antigene do presente invento pode ser isolado numa forma substancialmente pura empregando anticorpos de acordo com o presente invento. Deste modo, uma forma de realização do presente invento proporciona uma célula T receptora ou receptor quimérico Fc substancialmente puros, sendo o referido antigene caracterizado por ser reconhecido por e se ligar a anticorpos de acordo com o presente invento. Noutra forma de realização, o presente invento proporciona um método para isolar ou para purificar o antigene de célula T receptora ou receptor quimérico Fc, através da formação de um -37- D-622 coiuplexo do referido antigene com um ou mais anticorpos orientado contra a célula T receptora ou receptor quimérico Fc. A célula T receptora substancialmente pura ou os antigenes receptores quiméricos Fc de acordo com o presente invento podem, por sua vez, ser usados para detectar ou para medir um anticorpo na quimera numa amostra, tal como soro ou urina. Assim, uma forma de realização do presente invento compreende um método de detectar a presença ou quantidade de anticorpo para a célula T receptora ou de antigene receptor quimérico Fc numa amostra, que compreende o fazer contactar a amostra contendo o anticorpo para o antigene quimérico com uma célula T receptora ou receptor quimérico Fc, rotulada de modo detectável e que detecta o referido rótulo. Verificar-se-á que também podem ser usadas as fracções imunoreactivas e os análogos imunoreactivos da quimera. Pelo termo "fracção imunoreactiva" entende-se qualquer porção do antigene quimérico que demonstra uma resposta de imunidade equivalente a um anticorpo dirigido contra a quimera receptora. Pelo termo "análogo imunoreactivo" entende-se uma proteína que difere da proteína de quimera receptora por um ou mais amino ácidos, mas que demonstra uma resposta de imunidade equivalente a um anticorpo do invento.
Por "liga-se e reconhece especificamente" pretende significar-se um anticorpo que reconhece e se liga um polipéptido receptor quimérico mas que não reconhece e não se -38 D-622 liga substancialmente a outras moléculas numa amostra, por exemplo, numa amostra biológica, que inclui o polipéptido receptor.
Por "célula gerada por autoimunidade" pretende significar-se células que produzem anticorpos que reagem com um tecido hospedeiro ou células T efectoras de imunidade que são autoreactivas; essas células incluem anticorpos contra receptores de acetilcolina (que conduzem, por exemplo, a myasthenia gravis) ou anti-DNA, anti-eritrócito e anticorpos anti-plaqueta (que conduzem, por exemplo, a lupus erythematosus).
Por "célula terapêutica" pretende significar-se uma célula que foi transformada por uma quimera de acordo com o presente invento de modo que seja capaz de reconhecer e destruir um agente infeccioso especifico, uma célula infectada por um agente específico, um tumor ou uma célula cancerosa, ou uma célula gerada por autoimunidade; de preferência essas células são células do sistema hematopoiético.
Por "extracelular" pretende significar-se que tem, pelo menos, uma zona de molécula exposta na superfície celular. Por "intracelular" pretende significar-se que tem, pelo menos, uma zona de molécula exposta ao citoplasma da célula terapêutica. Por "transmembrana" pretende significar-se que tem, pelo menos, uma zona de molécula que se estende sobre a -39- D-622 membrana de plasma. Uma "zona extracelular", uma "zona intracelular" e uma "zona de transmembrana", tal como aqui utilizados, podem incluir o flanqueamento de sequências de amino ácidos que se prolongam para compartimentos celulares contíguos.
Por "oligomerizar" pretende significar-se que efectua um complexo com outras proteínas para formar dímeros, trímeros, tetrameros, ou outros oligómeros mais elevados. Esses oligómeros podem ser homo-oligómeros ou hetero-oligómeros. Uma "zona de oligomerização" é aquela zona da molécula que orienta a formação de um complexo (por exemplo, um oligómero).
Por "citolitico" pretende significar-se ser capaz de destruir uma célula (por exemplo, uma célula infectada com um patogene, um tumor ou uma célula cancerosa ou uma célula gerada por autoimunidade) ou ser capaz de destruir um agente infeccioso (por exemplo um vírus).
Por "vírus de imunodeficiência", pretende significar-se um retrovírus que, na forma de tipo-selvagem, é capaz de infectar células T4 de um hospedeiro primata e possui uma morfogenes de vírus e características morfológicas da subfamília lentivírus. O termo inclui, sem limitação, todas as variantes de HIV e SIV, incluindo HIV-1, HIV-2, SlVmac, SlVagm, SlVmnd, SlVsmn, SlVman, SlVmand e SIVcpz. -40- JJ-622
Por "MHC-independente" pretende significar-se que a resposta citolitica celular não necessita da presença de um antigene' MHC de classe II na superfície celular alvejada.
Por "derivado citolítico funcional transdutor de sinal" pretende significar-se um derivado funcional (tal como acima definido) que é capaz de dirigir, pelo menos, 10%, de preferência 40% e, mais preferentemente 70% ou, ainda mais preferentemente 90% de actividade biológica da molécula de tipo selvagem. Tal como aqui se utiliza, um "derivado funcional transdutor de sinal citolítico" pode actuar sinalizando directamente a célula terapêutica para destruir um agente ou célula ligado ao receptor (por exemplo, no caso de uma zona receptora quimérica intracelular) ou pode actuar indirectamente promovendo a oligomerização com proteínas transdutoras de sinal citolítico da célula terapêutica (por exemplo, no caso de domínio de transmembrana). Esses derivados podem ser testados quanto a eficácia, por exemplo, utilizando os ensaios in vitro aqui descritos.
Por um "derivado funcional ligado ao invólucro HIV" pretende significar-se um derivado funcional (tal como acima definido) que é capaz de ligar qualquer proteína de invólucro HIV.
Os derivados funcionais podem ser identificados utilizando, por exemplo, os ensaios in vitro aqui descritos. -41- D-622 administraçâo terapêutica
As células transformadas do presente invento podem ser usadas para a terapia de um grande número de doenças. Os métodos correntes de administração dessas células transformadas envolvem imunoterapia adoptiva ou terapia de transferência de célula. Estes métodos permitem o retorno das células de sistema imunizado transformadas em corrente sanguínea. Rosenberg, S.A., Scientific American. 62 (Maio de 1990); Rosenberg e outros, The New Enqland Journal of Medicine. 323 (9) : 570 (1990) .
As composições farmacêuticas do presente invento podem ser administradas a qualquer animal que pode experimentar os efeitos benéficos dos compostos do invento. Em primeiro lugar, entre esses animais estão os seres humanos, embora não se pretenda a eles limitar o invento.
Descrever-se-ão a seguir os desenhos anexos. A Figura 1 representa a caracterização de quimeras CD4. A Figura IA apresenta a sequência de amino ácido na zona de fusão entre CD4 (resíduos 1-369) e as diferentes cadeias receptoras. As sequências sublinhadas mostram a posição dos amino ácidos codificados na localização BamHI utilizada para construção por fusão. O começo do domínio de transmembrana está marcado com uma barra vertical. A sequência 71 é igual -42- D-622 à sequência S no terminal amino, mas diverge do terminal carboxilo (Jin e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87:3319--3323 (1990)). A Figura 1 B apresenta a análise de fluxo citométrico de expressão de superfície de CD4: ζ, CD4: Τ' e CD4:/? em células CVl. As células foram infectadas com virus que expressam quimeras CD4 ou CD16p(, incubadas durante 9 horas a 37°C e coloridas com Leu3A Mab anti-CD4 conjugado com ficoeritrina. A Figura 1C apresenta imunoprecipitação de 004:5% 004:7% ou CD4 naturais rotulados expressos em células CVl. Foram processadas faixas com agente redutor (R) ou sem agente redutor (NR). Os padrões de massa molecular em KD estão ilustrados à esquerda. A Figura 2 representa a expressão de superfície de CD16^ seguindo-se coinfecção de CD16m isoladamente (pontos cheios) ou coinfectados com vírus que expressam 004:^ (traços) ou 004:5* (linha contínua). Pontos esparsos, células infectadas com CD4:$ isoladamente, coloridos com 3G8 (Fleit e outros, Soc. Natl. Acad. Sei. USA. 79:3275-3279 (1982)) (Mab anti- -CD16).
Figura 3. Receptores quiméricos de mutante CD4:f a que falta Asp-15£ não suportam a expressão de CD16™.
TM -43- D-622 A Figura 3A é um autoradiograma de quimeras mutantes imunoprecipitadas sujeitas a electroforese, tanto com redução' (R) como sem redução (NR). A Figura 3B representa a expressão de superfície em pormenor de CD16th seguida de coinfecção por vírus que expressam CDlõ^ e as quimeras J seguintes: CD4:£ (linha cheia), CD4:Ç Cl 1G (linha contínua); CD4: £ (linha tracejada); CD4 :Ç Cl1G/D15G (pontos cheios) ; nenhuma coinfecção (CD16TH isoladamente, pontos esparsos). As células foram incubadas com 3G8 MAb anti-CD16 e anticorpos de cabra Fab1 2 conjugados com ficoeritrina para ratinhos IgG. 0 nível de expressão das quimeras S foi essencialmente idêntico para os diferentes mutantes analisados e a coinfecção de células com vírus que expressam CD16m e quimeras $ não alterou consideravelmente a expressão de superfície das quimeras (dados não ilustrados).
Figura 4 - Ao ião intracelular aumentado isento de cálcio segue-se a ligação cruzada das quimeras Ç mutantes numa linha celular T. Células Jurkat E6 (Weiss e outros, J. Immunol.. 133:123-128 (1984)) foram infectadas com vírus de vaccinia e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados mostrados são para a população circunscrita a CD4+ de modo que apenas são analisadas células que expressam a proteína quimérica relevante. A proporção média de fluorescência Indo-I de violeta a azul reflecte a concentração intracelular isenta de D-622 -44-
cálcio na população como um todo e a percentagem de células que respondem reflecte a fracção das células que excede uma proporção limite predeterminada (colocada de modo que 10% de células não tratadas são positivas).
Figura 4A e Figura 4B ilustram células Jurkat que expressam CD4: Ç (linha a cheio) ou 0016:$" (linha a tracejado) que foram expostas a Leu3a mab anti-CD4 (ficoeritrina conjugada), seguida de ligação cruzada com anticorpo de cabra e IgG de ratinho. A linha ponteada mostra a resposta de células não infectadas a OKT3 Mab anti-CD3.
As Figuras 4C e 4 D ilustram células Jurkat que expressam CD4: ζ D15G (linha a cheio); 004:5" C11G/D15 (traços); ou CD4:$ C11G (pontos) que foram tratadas e analisadas como nas Figuras 4A e 4B.
Figura 5 - Os receptores CD4: S, CD4:7? e CD4:^ permitem que os linfócitos T citoliticos (CTL) matem os alvos que expressam gpl20/41 HIV-1.
Figura 5A - Os círculos a cheio CTL que expressam CD4: f incubadas com células HeLa que expressam gpl20/41; círculos abertos CTL que expressam CD4: £ incubadas com células HeLa não infectadas; quadrados a cheio, CTL não infectados incubadas com célula HeLa que expressam gpl20/41; quadrados abertos, CTL não infectados incubadas com células HeLa não infectadas. -45- D-622
Figura 5B - círculos a cheio, CTL que expressam CD4 incubadas com células HeLa que expressam gpl20/41? círculos abertos, CTL que expressam CD4: Τ' incubadas com células HeLa que expressam gpl20/41; quadrados abertos, CTL que expressam a quimera de mutante duplo C11G/D15G CD4:S incubadas com células HeLa que expressam gpl20/41.
Figura 5C - Análise de fluxo citométrico da expressão CD4 pelas CTL usadas na Figura 5B. Para corrigir o alvo para proporções efectoras a percentagem de células que expressam a quimera CD4 foi determinada subtraindo a população negativá (não infectada) medida por sobreposição de histograma; para fins comparativos nesta figura foi designado um limiar arbitrário às células não infectadas que dá, grosso modo, a mesma fracção positiva para as outras populações de células que daria a subtracção de histograma.
Figura 6 - Especificidade da citólise de CD4-dirigida.
Figura 6A - Círculos a cheio, CTL que expressam CD4:S incubadas com células HeLa que expressam CD16pI; círculos abertos, CTL que expressam CD4 incubadas com células HeLa que expressam gpl2 0; quadados a cheio; CTL que expressam CD16:Í" incubadas com células HeLa que expressam gpl20/41; quadrados abertos, CTL que expressam CD16pi incubadas com células HeLa que expressam gpl20/41. -46- D-622
Figura 6B - Círculos a cheio, CTL que expressam CD4 :.f incubadas com células Raj i (MHC classe II + ) ; círculos abertos, células CTL não infectadas incubadas com células RJ2.2.5 (mutante Raji da MHC classe II- ); quadrados a cheio, CTL não infectadas incubadas com células Raji (MHC class II+); quadrados abertos, CTL que expressam CD4: S incubadas com RJ2.2.5 (MHC class II-). A escala ordenada é expandida.
Figura 7 - Caracterização do receptor quimérico CD16:S.
Figura 7A - É um diagrama esquemático da proteína de fusão CD16: ζ . A zona extracelular da forma de CD16 monomérico ligado ao fosfatodilinositol foi ligada ao S dimérico imediatamente externo ao domínio da transmembrana. A sequência de proteína na junção de fusão é ilustrada no fundo.
Figura 7B - Ilustra uma análise citometria de fluxo de mobilização de cálcio seguida da ligação cruzada da quimera CD16:f tanto numa linha celular TCR positiva como TCR negativa. Ilustra-se a proporção média de fluorescência violeta a azul (uma medição da concentração relativa de ião de cálcio) em populações de células tratadas com anticorpos no momento 0. Quadrados a cheio, a resposta de células Jurkat a OKT3 MAb anti-CD3; triângulos a cheio, a resposta de CDl6:Ç à ligação cruzada de 3G8 MAb anti-CD16 no mutante -47- D-622 quadrados abertos, a resposta à ligação cruzada CD16:Í na JRT3.T3.5 de linha mutante Jurkat TCR~; triângulos abertos, a resposta à ligação cruzada de CD16:jT em células Jurkat; cruzes, a resposta a CD16 não quiméricas em células Jurkat; e pontos, a resposta a CD16 não quiméricas na linha celular REX33A TCR".
Figura 8 - Análise de anulação de potencial citolítico.
Figura 8A ilustra as localizações dos pontos extremos de anulação S . Aqui como noutros locais as mutações em í são representadas pela convenção original residuo-localização--mutante, de modo a que, por exemplo, D66* denote a substituição de Asp-66 por um codão terminal.
Figura 8B - ilustra os resultados do ensaio de citólise de CDlôií' não anulados e anulações Ç salientes. As células Hibridoma que expressam anticorpo de superfície para CD16 foram carregadas com 51Cr e incubadas com números crescentes de linfócitos citoliticos humanos (CTL) infectados com recombinantes vaccinia que expressam quimeras CD16: $ . A percentagem 51Cr libertado é registado como uma função efectora (CTL) para a proporção de célula para o alvo (hibridoma) (e/t). Círculos a cheio, citólise mediada por células que expressam CD16:Í (mfi 18.7); quadrados a cheio, citólise mediada por células que expressam CD16:5Asp66* (mfi 940.2); quadrados abertos, citólise mediada por células que D—622 -4tí- expressam CDieiS" Glu60* (mfi 16.0); círculos abertos, citólise mediada por células que expressam CD16:^Tyr51* (mfi 17.4); triângulos a cheio, citólise mediada por células que expressam CD16:S” Phe34* (mfi 17.8); e triângulos abertos, citólise mediada por células que expressam CD16 não quimérico (mfi 591). Embora nesta experiência a expressão de CD16: Ç Asp66* não tenha igualado a de outras proteínas de fusão, a citólise por células que expressam CDIôjS' em níveis equivalentes na mesma experiência deram resultados essencialmente idênticos aos ilustrados pelas células que expressam CD16:fAsp66* (não ilustrado).
Figura 9 - Eliminação do potencial para interacções de transmembrana revela um pequeno segmento í capaz de mediar a citólise.
Figura 9A é um diagrama esquemático das quimeras monoméricas bipartidas e tripartidas. No topo está a construção CD16:Í truncada no resíduo 65 e a que falta a transmembrana Cys e os resíduos Asp. Por baixo estão as construções CDlôiCDS:? e CD16:CD7:Í> e os correspondentes controlos. As sequências péptidas dos domínios intracelulares são ilustrados em baixo.
Figura 9B - mostra a actividade citolitica dos mutantes de anulação de quimera monomérica. A Actividade citolitica de células que expressam CD16:Ç (círculos a cheio; mfi 495) foi -49- D-622 comparada à das células que expressam CD16:^Asp66* (quadrados a cheio; mfi 527) ou os mutantes CD16:$ CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*, (quadrados abertos; mfi 338) e CD16:ÇCysllGly/Aspl5Gly/Glu60* (triângulos cheios; mfi 259) .
Figura 9C mostra a actividade citolitica mediada pelas proteínas de fusão tripartidas. Triângulos a cheio, CD16:ÇAsp66*; quadrados abertos, CD16:5: S"(48-65) ; quadrados a cheio CD16:7:f(48-65); triângulos abertos, 0ϋ16:7:Γ(48--59); círculos abertos, CD16:5; círculos a cheio, CD16:7.
Figura 9D - ilustra a mobilização de cálcio por mutantes e quimeras tripartidas na linha de células mutantes Jurkat JRT3.T3.5 TCR negativo. Círculos abertos, resposta das células que expressam CD16:ÍAsp66* diméricas; quadrados a cheio, resposta das células que expressam CD16:^ Cysll/Gly/Aspl5Gly/Asp66*; quadrados abertos, resposta das células que expressam CDlôrí- CysllGly/Aspl5Gly/Glu60*; triângulos a cheio, resposta de células que expressam CD16:7:f(48-65); e triângulos abertos, resposta das células que expressam CD16:f(48-65).
Figura 10 - Contribuição de amino ácidos individuais para a actividade do motivo transdutor de sinal citolitico do resíduo 18.
Figurass 10A e 10B mostram a actividade citolitica e -50- D-622
Figura 10C - ilustra a mobilização de ião de cálcio mediada por quimeras que possuem mutações de ponto próximo da triosina terminal carboxilo (Y62). As Figuras 10A e 10B representam os dados recolhidos em células que expressam altas e baixas quantidades, respectivamente, das proteínas de fusão CD16: S . São usados símbolos idênticos para os ensaios de mobilização de cálcio e citólise e são mostrados num código de letra à direita. Círculos a cheio, células que expressam CD16:f (mfi in A, 21; B, 376); quadrados a cheio, células que expressam CD16: 7 : 5\ (48-65) (mfi A, 31; B, 82); quadrados abertos, CD16:7: f (48-65)Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92), cruzes, CD16:7:í(48-65)Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); triângulos a cheio, CD16:7:Ç(48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24, B, 88); círculos abertos, CD16:7:Ç (48-65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62); e triângulos abertos, CD16:7;Ç (48-65)Tyr62Ser (mfi B, 64) .
Figuras 10D e 10E ilustram actividade citolítica, e
Figura 10E ilustra a mobilização de ião de cálcio através de quimeras que têm mutações de ponto próximo de tirosina de terminal amino (Y51).
Utilizam-se símbolos idênticos para os ensaios de mobilização de cálcio e citólise e estão ilustrados à direita. Círculos a cheio, células que expressam CD16:f (mfi em D, 21.2; em E, -51- D-622 672) ; quadrados a cheio, células que expressam CD16:7i (48--65) (mfi D, 31.3; E, 179); triângulos a cheio, CD16:7?(48--65)Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); quadrados abertos, CD16:7:í (48-65) Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142); e triângulos abertos, CD16;7:í(48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32.3? E, 294).
Figura 11 - Alinhamento de repetições internas de £ e comparação da sua capacidade para suportar citólise.
Figura 11A é um diagrama esqumático de quimeras formadas dividindo o domínio intracelular S em terços e anexando-os ao domínio da transmembrana de uma quimera CD16:7. As sequências dos domínios intracelulares são ilustrados abaixo, com resíduos divididos compartimentados e resíduos relacionados designados por asteriscos.
Figura 11B ilustra a potência citolítica dos três subdomínios S . Círculos a cheio, células que expressam CD16: í(mfi 476); quadrados a cheio, CD16: 7 : í" (33-65) (mfi 68); quadrados abertos, CD16:7:S (71-104) (mfi 114); e triângulos a cheio, CD16:7:f(104-138) (mfi 104).
Figura 12 é um diagrama esquemático das quimeras CD16:FcRTlI.
Figura 13 - Mobilização de cálcio seguida de ligação cruzada de quimeras 004:ΓσΕ7Ίΐ e~ CD16': FcR'/ll. -52- D-622
Figura 13A - ilustra a proporção de fluorescência de violeta a azul emitida por células carregadas com o fluoroforo Indo-1 sensitivo de cálcio mostrado como uma função de tempo a seguir à ligação cruzada do domínio extracelular CD16 com anticorpos.
Figura 13B ilustra uma análise semelhante do aumento em proporção de fluorescência de violeta a azul das células que suportam quimeras CD4:Fcr7ii, seguindo-se a ligação cruzada com anticorpos.
Figura 14 - Ensaio de citólise de quimeras CD4:FcRTlI e CD16:FcRHl.
Figura 14A ilustra a percentagem de 51Cr libertado de células (alvo) hibridoma anti-CD16 quando as células são expostas a números crescentes de linfócitos T citotóxicos que expressam quimeras CD16:FcR7lI (células efectoras).
Figura 14B ilustra uma análise semelhante de citotoxicidade mediada por quimeras CD4:FcR'fII contra células alvo que expressam glicoproteinas de invólucro HIV.
Figura 15 - Identificação de resíduos na cauda FcR/lI A que são importantes para a citólise.
Figura 15A é um diagrama esqumático de construções de anulação. -53- D-622
Figuras 15B e 15C ilustram a citólise e mobilização de cálcio por variantes de anulação de terminal carboxilo de CD16:FcRTlI A.
Figuras 15D e 15E ilustram a citólise e mobilização de cálcio por quimeras tripartidas que suportam progressivaraente menos do terminal amino da cauda intracelular de CD16:FcR7lI A.
Figura 16 ilustra a sequência amino ácido de CD3 delta; a zona compartimentada representa uma zona preferida transdutora de sinal citolítico.
Figura 17 ilustra a sequência amino ácido de T3 gamma; a zona compartimentada representa uma zona preferida transdutora de sinal citolítico.
Figura 18 ilustra a sequência amino ácido de mbl; a zona compartimentada representa uma zona preferida transdutora de sinal citolítico.
Figura 19 ilustra a sequência amino ácido de B29; a zona compartimentada representa uma zona preferida transdutora de sinal citolítico. υ-ΟΖΖ -
EXEMPLO I
Construção de quimeras receptoras:IgGl humano
Prepararam-se sequências de cadeias reforçadas de IgGl humano através da união de sequências no domínio CH3 a um fragmento DNAc derivado da extremidade 3' da forma transmembrana do anticorpo RNAm. 0 fragmento de extremidade 3· foi obtido por reacção de cadeia polimerase utilizando uma biblioteca DNAc de amígdala como substrato e oligonucleótidos que possuem as sequências: CGC GGG GTC ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO: 7) e CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID NO: 8), que correspondem respectivamente a extremidades 5' e 3' dos fragmentos DNA desejados. 0 oligo 5' é complemetar de uma localização no domínio C^l de IgGl humano e o oligo 3' é complementar de uma localização próxima de 5' das sequências que codificam o domínio de espalhamento da membrana. 0 produto PCR foi digerido com BstXI e BamHI e ligado entre localizações BstXI e BamHI de um gene anticorpo IgGl semisintético que contem regiões variáveis e constantes. A seguir à inserção do fragmento BstXI no fragmento BamHI, as zonas ampliadas da construção foram substituídas na localização Smal em CH3 por intermutação do fragmento de restrição, de modo que apenas a zona entre a localização Smal -55- D-622 e o oligo 3' tenha sido derivada da recacção de PCR.
Para criar um receptor quimérico IgGl:£ humano, o gene de cadeia pesada que termina numa localização BamHI foi unida à localização BamHI da quimera £ descrita abaixo, de modo que as sequências anticorpo formassem a zona extracelular. O fluxo citométrico de células COS transfectadas com um plasmidio que codifica a quimera, revelou um alto nível de expressão de determinates anticorpo quando um plasmidio de expressão codifica um DNAc de cadeia leve foi cotransfectado e revelou uma expressão modesta de determiantes anticorpo quando o plasmidio de expressão de cadeia leve se encontrava ausente.
Quimeras semelhantes incluindo IgGl humano fundidas com 7? ou 1 (ver abaixo), ou com qualquer zona transdutora de sinal de uma proteína receptora Fc ou de célula T podem ser manipuladas, regra geral, tal como se descreveu acima utilizando técnicas padrão de biologia molecular.
Para criar uma unidade de transcrição única que permitiria a qualquer das cadeias fracas ou fortes ser expressa a partir de um promotor único, foi criado um plasmidio que codifica um RNAm bicistrónico a partir de cadeias fracas e fortes de codificação de sequências e a zona não traduzida 5' do RNAm de codificação da proteína regulada glucose 78kD, também conhecida como grp78 ou BiP. Obtiveram-se sequências grp78 -56- D-622 através de DNA genômico humano utilizando iniciadores que possuem as sequências: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID NO. 9) e CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO. 10) respectivamente nas extremidades 51 e 3' . Foram efectuadas reacções de cadeias polimerase com estes oligos na presença de dimetil sulfóxido a 10%. O fragmento obtido por PCR foi digerido com Notl e HincII e inserido entre localiações Notl e Hpal a jusante de sequências de codificação de IgGl humano. Sequências de codificação de DNAc de cadeia leve kappa de IgG humano foram então inseridas a jusante do líder grp78, utilizando a localização HincII e outra localização no vector. 0 plasmídio de expressão resultante destas manipulações consistiu no gene de cadeia pesada semisintético, seguido das sequências líder grp78 seguido de sequências DNAc de cadeia leve kappa, seguido dos sinais de poliadenilação derivados de um fragmento DNA SV40. A transfecção de células COS com o plasmídio de expressão deram uma expressão marcadamente aperfeiçoada de determinantes de cadeia pesada, comparada com a transfectação de plasmídio que codifica determinantes de cadeia pesada isoladamente.
Para criar um gene bicistrónico compreendendo uma cadeia pesada/receptor quimérico e uma cadeia leve, as sequências de cadeia pesada a montante podem ser substituídas por qualquer gene receptor quimérico de cadeia pesada aqui descrito. D-622 -57-
EXEMPLO II
Construção de Quimeras receptoras CD4
Isolaram-se DNAcs humanos í (Weissman e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85:9709-9713 (1988b)) e '/(Kuster e outros, J. Biol. Chem.. 265:6448-6452 (1990) por reacção de cadeia polimerase a partir de bibliotecas preparadas a partir da linha celular de tumor HPB-ALL (Aruffo e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:8573-8577 (1987b)) e a partir de "natural killer cells" humanas, enquanto o DNAc U (Jin e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87:3319-3323 (1990)) foi isolado a partir de uma biblioteca de timócitos de ratinho. Juntaram-se DNAcs Γ, 71 e V ao domínio extracelular de uma forma obtida por manipulação de CD4 que possui uma localização BamHl imediatamente a montante do domínio de extensão da membrana (Aruffo e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 84:8573-8577 (1987b); Zettlmeissl e outros, DNA Cell Biol.. 9347-353 (1990)) que foi unido à localização BamHl naturalmente presente nos DNAcs S e 77 numa localização semelhante poucos resíduos a montante do domínio de expansão da membrana (SEQ ID NOS: 1, 3, 4 e 6) . Para formar uma proteína de fusão com?' foi manipulada uma localização BamHl na sequência aproximadamente na mesma localização (Figura 1, SEQ ID NO: 2 e 5). As fusões de gene foram introduzidas num plasmídio de expressão de vírus vaccinia contendo o gene E. coli crpt como um marcador seleccionável (M. Amiot e B.S., não publicado) e inseridas no genoma da estirpe WR vaccinia por recombinação D-622 -58-
homóloga e selecção para cultura em ácido micofenólico (Falkner e outros, J. Virol.. 62:1849-1854 (1988); Boyle e outros Gene, 65:123-128 (1988)). A análise citométrica de
fluxo mostrou que os recombinantes de vaccinia orientam a produção abundante de proteínas de fusão CD4: S e CD4:7 na superfície celular, ao passo que a expressão CD4: tl é substancialmente menor (Figura 1) . A última descoberta é consistente com um recente relatório em que a transfecção de um plasmídio de expressão DNAc U numa linha celular hibridoma de ratinho deu substancialmente menos expressão do que a transfecção de um plasmídio de expressão S comparável (Clayton e outros, J. Exp. Med.. 172:1243-1253 (1990)). A imunoprecipitação de células infectadas com recombinantes vaccinia revelou que as proteínas de fusão formam dímeros covalentes, ao contrário do antigene CD4 que ocorre naturalmente (Figura 1). Verificou-se que as massas moleculares das proteínas de fusão de CD4:Ç e 004:7" monoméricas e CD4 naturais eram respectivamente 63, 55 e 53 KD. As maiores massas de fusão são aproximadamente consistentes com o maior comprimento da zona intracelular, que excede o das CD4 naturais em 75 resíduos (CD4:f) ou 5 resíduos (CD4:7).
EXEMPLO III
Quimeras CD4 podem associar-se com outras quimeras receptoras A expressão de superfície celular da forma células assassinas -59- D-622 "natural killer cell"/macrófago de FC/RIII humano (CDlõ^) em transfectantes é facilitada pela cotransfecção com murinos (Kurosaki e outros, Nature. 342:805-807 (1989)) ouThumano (Hibbs e outros, Science. 246:1608-1611 (1989)), assim comof por humano (Lanier e outros, Nature. 342:803-805 (1989)).
Em conformidade com estes relatórios, a expressão de quimeras também permitiu expressão de superfície de CD16TO quando distribuída à célula alvo tanto por cotransfecção como por coinfecção com vírus vaccinia recombiantes (Figura 2) . A promoção de expressão de superfície (CD16m) por Ç foi mais pronunciada do que a promoção por Y(Figura 2) nas linhas de célula examinadas, ao passo que os CD4 naturais (dados não mostrados) não aumentaram a expressão de superfície CDlõ^.
EXEMPLO IV
Mutantes f Asp não se coassociam com receptores Fc
Para criar quimeras que não se associam com antigenes existentes ou receptores Fc, foram preparadas proteínas de fusão í mutante a que faltavam tanto o resíduo Asp intramembranoso, como o resíduo Cys intramembranoso ou ambos. A citometria de fluxo mostrou que a intensidade de expressão de superfície celular pelas diferentes quimeras mutantes não foi apreciavelmente diferente do presursor não mutado (dados não revelados) e as experiências de imunoprecipitação mostraram que a expressão total pelas quimeras foi semelhante -60- D-622 (Figura 3). Tal como esperado, verificou-se que as quimeras mutantes a que falta o resíduo cisteína de transmembrana não formam dímeros ligados de disulfito (Figura 3) . As duas quimeras mutantes a que falta Asp foram incapazes de suportar a expressão de superfície de CD16™, ao passo que as quimeras monoméricas a que falta o Cis mas que possui Asp permitiram que fosse coexpresso o CDlõ^, mas com menor eficiência do que o dímero parental (Figura 3) .
EXEMPLO V
Receptores Mutantes retêm a capacidade para iniciar uma resposta de cálcio.
Para determinar se a ligação cruzada das proteínas de fusão permitiriam a acumulação de cálcio intracelular livre de um modo semelhante ao que se sabe que ocorre com o receptor antigene de célula T, células da linha de leucemia de célula T humana, Jurkat E6 (ATCC Número de acesso TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD), foram infectadas com os recombinantes vaccinia e mediu-se a concentração relativa de cálcio citoplásmico a seguir à ligação cruzada do domínio extracelular com anticorpos. As medições de fluxo citométrico foram efectuadas com células carregadas com a matriz sensível ao cálcio Indo-1 (Grynkiewicz e outros, J. Biol. Chem.. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch e outros, J. Immunol.. 137;952-961 (1986)). A Figura 4 mostra os resultados das experiências de fluxo de cálcio com células D-622 .-61-
infectadas com CD4: f e os mutantes Asp- e Cis- de í . A ligação cruzada de quimeras aumentou de modo reprodutível o cálcio intracelular. Do mesmo modo CD4:7? e 004 7 perimitiram a acumulação de cálcio intracelular em células infectadas (dados não mostrados). As células Jurkat expressam níveis baixos de CD4 na superfície celular, mas a ligação cruzada dos CD4 naturais na presença ou na ausência de CD16:Í (C.R. e B.S. não publicado) (Figura 4 e dados não mostrados) não altera os níveis de cálcio intracelular.
EXEMPLO VI
As quimeras CD4iS r K , e Y são mediadoras de citólise de alvos que expressam gpl20/41 HIV.
Para determinar se os receptores quiméricos aprisionariam programas de efeito citolítico, foi criado um modelo alvo:sistema efector baseado no reconhecimento de CD4 do complexo gpl20/gp41 de invólucro HIV. Infectaram-se céluas HeLa com vírus vaccinia recombinantes que expressam gpl20/gpl41 (Chakrabarti e outros, Nature. 320:535-537 (1986); Earl e outros, J. Virol.. 64:2448-2451 (1990)) e rotulados com 51Cr. As células rotuladas foram incubadas com células provenientes de uma linha de linfócito T citotóxico (CD8+, CD4~) alloespecifico humano que tinha sido infectada com recombinantes vaccinia que expressam as quimeras CD4:i", CD4:n, ou CD4:/, ou a quimera de mutante duplo CD4 :f CisllGly:Aspl5Gly. A Figura 5 mostra que as células HeLa que -62“ D-622 expressam gpl20/41 foram especificamente lisadas por linfócitos T citotóxicos (CTL) que expressam quimeras CD4. As células HeLa não infectadas não foram alvejadas por CTL armadas com quimeras CD4:J e as céluas HeLa que expressam gpl20/41 não foram reconhecidas pelos CTL não infectados. Para comparar a eficácia das várias quimeras, as proporções de efector para alvo foram corrigidas para a fracção de CTL que expressam quimeras CD4 e para a fracção de células HeLa que expressam gpl20/41, tal como medido por citometria de fluxo. A Figura 5C mostra uma análise citométrica de expressão CD4 pelos CTL utilizados na experiência de citólise mostrado nas Figuras 4A e 4B. Embora a densidade média de superfície de CD4:.T exceda grandemente a densidade média de CD4:/7, a eficácia citolitica de células que expressam ambas as formas foi semelhante. A correcção para a fracção de alvos que expressam gpl20, a eficácia de citólise mediada por proteínas CD4: f e CD4:7? é comparável às melhores eficácias registadas para alvo específico receptor de célula Trpares de efectores (a proporção média de efector para alvo para libertação de 50% por células T que expressam CD4:f foi de 1,9 +- 0,99, n=10. A fusão de CD4:f foi menos activa, tal como foi a fusão de CD4:S· a que faltam os resíduos Asp e Cys de transmembrana. No entanto, em ambos os casos se observou uma citólise significativa (Figura 5).
Para controlar a possibilidade de que a infecção de vaccinia -63- D-622 pudesse promover um reconhecimento artefactual por CTL, foram realizadas experiências de citólise semelhantes com células alvo infectadas com recombinantes vaccinia que expressam a forma ligada de fosfatodilinositol de CD16 (CD16pI) e rotulada com 51Cr e com CTL infectados com recombinantes de controlo que expressam tanto CD16pi ou CD16:f . A Figura 6A mostra que as células T que expressam quimeras não CD4 não reconhecem células HeLa naturais ou células HeLa que r,·. expressam gpl2 0/41 e, do mesmo modo, que células T que expressam quimeras CD4 não reconhecem células HeLa que expressam outras proteínas de superfície vaccinia-codifiçada. Além disso, os CTLs que expressam CD4 não quiméricas não lisam significativamente células HeLa que expressam gpl20/41 (Figura 6A).
EXEMPLO VII Células que contêm MHC de classe II não são alvejadas pelas ( quimeras. É suposto as CD4 interactuarem com uma sequência não polimórfica expressa por antigene MHC de classe II (Gay e outros, Nature. 328:626-629 (1987); Sleckman e outros,
Nature. 328:351-353 (1987)). Embora nunca tenha sido documentada uma interacção específica entre CD4 e antigene de class II com proteínas purificadas, sob determinadas condições pode ser demonstrada a adesão entre células que expressam CD4 e células que expressam moléculas de classe II (Doyle e outros, Nature. 330:256-259 (1987); Clayton e -64- D-622
outros, J. Exp. Med.. 172:1243-1253 (1990); Lamarre e outros, Science. 245:743-746 (1989)). O exame seguinte foi se a morte podia ser detectada relativamente a células que contêm classe II. A Figura 6B mostra que não há citólise específica dirigida por CD4: S- contra a linha celular B Raji, que expressa abundantes antigenes de classe II. Embora seja observada uma modesta citólise (~5%), um mutante de classe II-negativo de Raji, RJ2.2.5 (Accolla, R.S., J. Exp. Med. . 157:1053-1058 (1983)) ilustra uma susceptibilidade semelhante, tal como a das células Raji incubadas com células T não infectadas.
EXEMPLO VIII
Requisitos de sequência para Indução de Citólise pela cadeia zeta Antigene de célula T/Receptor Fc.
Embora as quimeras entre CD4 e ζ possam armar linfócitos T citotóxicos (CTL) para matar células alvo que expressam gpl20 HIV, foi pensada uma alternativa a CD4 para comparar de modo não ambíguo as propriedades de quimeras zeta introduzidas em linhas de células T humanas. Essas linhas podem expressar CD4, tornando difícil definir especificamente a relação entre o tipo ou grau de mobilização de cálcio e potencial citotóxico das diferentes quimeras. Para rodear isto, foram criadas quimeras entre f e CD16 em que o domínio extracelular de CD16 é ligado às sequências intracelular e de transmembrana de S (Figura 7A) . As fusões de gene foram -65- D-622
introduzidas num plasmídio de expressão de vírus vaccinia que contem o gene E. coli qpt como um marcador seleccionável e inseridas no genoma da estirpe vaccinia WR por recombinação homóloga e selecção para cultura em ácido micofenólico (Falkner e Moss, J. Virol, 62:1849 (1988); Boyle e Coupar, Gene 65:123 (1988)).
Linhas de célula T foram infectadas com os recombinantes vaccinia e a concentração citoplásmica relativa de ião isento de cálcio foi medida a seguir à ligação cruzada de domínios extracelulares com anticorpos. Foram efectuadas ambas as medições, espectrofluorométrica (população global) e citométrica de fluxo (célula única) com células carregadas com a matriz Indo-1 (Grynkiewicz e outros, J. Biol. Chem. 260:3440 (1985); Rabinovitch e outros, J. Immunol. 137:952 (1986)). A Figura 7B mostra uma análise de dados recolhidos de células da linha leucemia de célula T humana Jurkat infectada com recombinantes vaccinia que expressam proteína de fusão CD16:S . A ligação cruzada das quimeras aumentou de modo reprodutível o cálcio intracelular, enquanto um tratamento semelhante de células que expressam CD16 não quiméricos tiveram pouco ou nenhum efeito. Quando a quimera foi expressa em linhas de células mutantes a que faltava o antigene receptor, tanto REX33A (Breitmeyer e outros J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho e outros J. Biol. Chem. 264:20760 (1989)), ou mutante Jurkat JRT3.T3.5 (Weiss e outros, J. Immunol. 135: 123 (1984)); verificou-se uma -66- D-622 ligação cruzada ou uma resposta forte ao anticorpo CD16. Foram recolhidos dados semelhantes na linha celular mutante REX20A (Breitmeyer e outros, supra. 1987; Blumerg e outros, J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)) e um mutante CD3/TÍ negativo da linha celular Jurkat estabelecida neste laboratório (dados não mostrados). A infecção com recombinantes que expressam CD16:X não repõem a resposta ao anticorpo anti-CD3, que mostra que a proteína de fusão não actua por libertação de cadeias complexas de CD3 intracelular (dados não representados).
Para avaliar a capacidade de as quimeras reorientarem a imunidade mediada por célula, os CTLs foram infectados com recombiantes vaccinia que expressam quimeras CD16 e utilizadas para lisarem especificamente células hibridoma que expressam anticorpos anti-CD16 ligados à membrana (ver abaixo) . Este ensaio é uma extensão de um ensaio de citotoxicidade de hibridoma originalmente desenvolvido para analisar mecanismos efectores de células que contêm receptores Fc (Graziano e Fanger, J. Immunol. 138:945. 1987; Graziano e Fanger, J. Immunol. 139:35-36. 1987; Shen e outros, Mol. Immunol. 26;959. 1989 ; Fanger e outros, Immunol. Today 10:10: 92, 1989). A Figura 8B mostra que a expressão de CD16:_f em linfócitos T citotóxicos permite que os CTL armados matem células de hibridoma 3G8 (anti-CD16; Fleit e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:3275. 1982), ao passo que os CTL que expressam a forma do fosfatodilinositol- -67- D-622 -ligado de CD16 são inactivos. Os CTL armados com CD16: X também não matam células hibridoma que expressam um anticorpo irrelevante (dados não mostrados).
Para identificar as sequências S mínimas necessárias para a citólise, preparou-se uma série de mutantes de anulação em que foi removida sucessivamente a maioria do domínio intracelular S do terminal carboxilo (Figura 8A) . A maioria do domínio intracelular zeta podiam ser removidos com poucas consequências para o potencial citolítico; o comprimento total da quimera CDl6:f era essencialmente igual em eficácia à quimera anulada para o resíduo 65, CD16:Í Asp66* (Figura 8B). Observou-se uma substancial diminuição em citotoxicidade na anulação do resíduo S 59 (quimera CD16:5 Glu60*) e ainda a anulação do resíduo 50 que resultou numa actividade ligeiramente menor. No entanto, não se observou uma completa perda de actividade, mesmo quando o domínio intracelular foi reduzido a uma fixação transmembrana de três resíduos (Figura 8B).
Porque X é um dímero ligado dissulfito, uma explicação para a retenção de actividade citolitica foi a de que f endógeno estava a formar heterodímeros com a anulação quimérica S , reconstituindo por isso a actividade. Para testar esta ideia, os resíduos X 11 e 15 foram alterados de Asp e Cys respectivamente para GLy (CysllGly/AsplSGly) e efectuaram-se imunoprecipitações, como se segue. -68- D—622
Aproximadamente 2 x 106 de células CV1 foram infectadas durante uma hora em meio DME isento de soro com recombinante vaccinia numa multiplicidade de infecção (moi) de pelo menos dez. Seis a oito horas após a infecção, as células foram separadas das placas com EDTA PBS/lmM e a superfície rotulada com 0,2 mCi 125I por 2 x 106 de células que utilizam lactoperoxidase e H202. As células rotuladas foram recolhidas por centrifugação e lisadas em NP-40 a 1%, SDS a 0,1%, NaCl 0,15M, Tris 0,05M, pH 8,0, MgCl2 5mM, KC1 5mM, iodoacetamida 0,2M e PMSF lmM. Removeram-se os núcleos por centrifugação e as proteínas CD16 foram imunoprecipitadas com 3G8 anticorpo (Fleit e outros, supra. 1982; Medarex) e agarose IgG anti-ratinho (Cappel, Durham, NC). Submeteram-se amostras a electroforese através de um gel poliacrilamida/SDS a 8% sob condições não redutoras ou através de um gel a 10% sob condições redutoras. Estas imunoprecipitações confirmaram que a quimera CD16:f CysllGly/AsplSGly não se associou estruturas dímero ligadas ao dissulfito.
Foi também testada a actividade citolítica dos receptores mutantes. A quimera mutada anulada no resíduo 65 (CD16: S CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*) foi, dependendo das condições de ensaio, duas a oito vezes menos activa no ensaio citólise do que a quimera não mutada comparável (Οϋ16:5Άερ66*) , que se encontrava habitualmente num factor de dois de, ou indistintamente em actividade a partir de 0016:5" (Figura 9B) . A redução em actividade das quimeras mutantes é comparável à D-622 -69-
redução observada com as quimeras CD4 de estrutura semelhante (ver atrás) e, mais provavelmente é atribuível à menor eficácia de monómeros S comparados com dímeros. Em contraste, as quimeras mutadas Asp-, Cys- anuladas no resíduo 59 não tinham actividade citolítica (Figura 9B) para suportar a hipótese de que a associação com outras cadeias mediadas pelos resíduos de transmembrana Cys e/ou Asp fosse responsável pela fraca persistência de actividade citolítica em anulações mais terminal amino do que resíduo 65.
Estudos de fluxo citométrico revelaram que os mutantes de anulação a que faltam os resíduos de transmembrana Asp e Cys poderiam ainda promover um aumento em ião de cálcio intracelular livre em resposta a uma ligação cruzada de anticorpo numa linha celular Jurkat de mutante TCR- (Figura 9D) . Resultados semelhantes foram obtidos para quimeras expressas em linha Jurkat parental (não mostradas) . No caso de (CD16: ΓCysllGly/Aspl5Gly/Glu60*) , estes dados demonstram que a capacidade para mediar uma resposta de cálcio pode ser mutacionalmente separada da capacidade para apoiar a citólise.
Para eliminar definitivamente a possível contribuição de resíduos transmembrana 5* , a transmembrana e os primeiros resíduos citoplásmicos 17 de 5 foram substituídos por sequências que codificam a extensão de membrana e os primeiros 14 ou os primeiros 17 resíduos citoplásmicos dos -70- D-622 antigenes CD5 ou CD7, respectivamente (Figura 9A) . As proteínas de fusão tripartidas resultantes CD16:5:f(48-65) e CD16:7X (48-65) não formaram dimeros ligados ao dissulfito como sucedeu com as quimeras CD16:f mais simples porque lhes faltava o resíduo cisteína no domínio transmembrana S. Ambas as quimeras tripartidas foram capazes de mobilizar cálcio em linhas de células Jurkat e TCR negativas (Figura 9D) e de montar uma resposta citolitica em TCL (Figura 9C e dados não mostrados) . No entanto, a truncagem da zona 5" pelo resíduo 59 na quimera CD16:7:Í (48-65) anulou a capacidade de a fusão tripartida orientar uma resposta de cálcio em células Jurkat de TCR positivo ou negativo ou a citólise em CTL maduros (Figura 9C e 9D e dados não mostrados).
Para examinar as contribuições de resíduos individuais no motivo resíduo 18, preparou-se um número de variantes de mutante por mutagenese dirigida e avaliou-se a sua capacidade para mediar receptores dirigidos para aniquilar sob condições de baixa (Figuras 10A e 10D) ou alta (Figuras 10b e 10E) expressão de receptor quimérico. A Figura 10 mostra que enquanto um número de substituições relativamente moderadas (isto é, substituindo resíduos acídicos pelos seus amidos cognatos, ou tirosina por fenilanalina), cujos resíduos extendidos 59 a 63 deram um compromisso moderado de eficácia citolitica, em geral as variantes retiveram a capacidade para mobilizar cálcio. No -71- D-622 entanto, colectivamente estes resíduos compreendem um importante submotivo uma vez que a sua anulação elimina a actividade citolítica. A conversão de Tyr 62 tanto em Phe como em Ser eliminou tanto a resposta citotóxica como a resposta de cálcio. No terminal amino do segmento de resíduo 18, a substituição de Tyr 51 por Phe aboliu tanto a mobilização de cálcio como a actividade citolítica, enquanto que a substituição de Leu por Ser na posição 50 eliminou a resposta de cálcio embora apenas parcialmente prejudicasse a citólise. Embora sem ligação a uma hipótese particular, suspeita-se que a incapacidade do mutante Leu50Ser para mobilizar cálcio em ensaios citométricos de fluxo de curta duração não reflectem totalmente a sua capacidade para mediar um aumento substancial em ião intracelular isento de cálcio sobre a extensão de maior duração de ensaio de citólise. No entanto, a actividade citolítica cálcio-insensível foi relatada para algumas linhas de células T citolíticas e a possibilidade de um fenómeno semelhante estar na base dos resultados aqui descritos não foi excluída. A substituição de Asn48 por Ser prejudicou parcialmente a citotoxicidade nalgumas experiências enquanto teve pouco efeito noutras.
Para investigar o papel potencial de elementos de sequência redundantes, o domínio intracelular de S foi dividido em três segmentos, resíduos de extensão 33 a 65, 71 a 104 e 104 a 138. Cada um destes segmentos foi ligado a uma quimera CD16:CD7 por meio de uma localização MluI introduzida -72- D-622 imediatamente distai à membrana básica que fixa as sequências do domínio intracelular de CD7 (ver abaixo; Figura 11A). A comparação da eficácia citolítica dos três elementos mostrou que estes eram substancialmente equipotentes (Figura 11B). A comparação de sequência (Figura 11A) mostra que o segundo motivo comporta onze resíduos entre tirosinas, ao passo que o primeiro e terceiro motivos comportam dez.
Embora não tenha sido efectuada uma contagem precisa do processo de activação de célula T, é claro que a agregação do receptor antigene, ou das quimeras receptoras que comportam sequências intracelulares Ç , origina a mobilização de cálcio, citoquina e libertação de grânulo e o aparecimento de marcadores de superfície celular de activação. A localização activa de S, uma curta sequência péptida linear, provavelmente demasiado pequena para possuir a inerente actividade enzimática, interactua do mesmo modo com um ou, no máximo, umas poucas proteínas para mediar a activação celular. É também claro que a mobilização de cálcio livre não é, por si só, suficiente para activação celular, uma vez que a capacidade para mediar citólise pode ser separada de modo mutacional da capacidade para mediar a acumulação de cálcio.
Tal como aqui mostrado, a adição de 18 resíduos do domínio intracelular de S para o domínio intracelular e de transmembrana de duas proteínas não relacionadas permite que D-622 -73-
as quimeras resultantes reorientem a actividade citolítica contra células alvo que se ligam à zona extracelular das proteínas de fusão. Embora as quimeras que comportam o motivo de resíduo 18 sejam ,aproximadamente oito vezes menos activas do que as quimeras baseadas em S de comprimento total, a reduzida actividade pode ser atribuída à perda de interacções de transmembrana que permitem normalmente que Γ de tipo largo formem dimeros de ligação dissulfito. Isto é, construções de anulação í que possuem o mesmo terminal carboxilo como motivo e a que faltam os resíduos Cis e Asp de Transmembrana mostram ligeiramente menos actividade do que quimeras que comportam apenas o motivo de resíduo 18. O elemento de competência citolítica sobre que nos debruçámos possui duas tirosinas e não possui serinas nem treoninas, restringindo as possivéis contribuições da fosforilação para a actividade. A mutação de qualquer das tirosinas destrói a actividade, no entanto, e embora as experiências preliminares não apontem para uma fosforilação substancial de tirosina a seguir à ligação cruzada de antigenes de superfície quimérica que suportam o próprio motivo de resíduo 18, não pode ser excluída a possível participação dessa fosforilação a um baixo nível. Além dos efeitos notados nos dois resíduos de tirosina, um certo número de substituições de amino ácidos nos terminal amino e carboxilo do motivo enfraquecem a actividade sob condicções de baixa densidade de receptor.
Sequências semelhantes aos motivos activos Γ podem ser encontradas nos domínios citoplásmicos de várias outras proteínas de transmembrana, incluindo as moléculas CD3 £ e Y, as proteínas de superfície IgM associadas mbl e B29 e as cadeias β e Ύ do receptor IgE de alta afinidade, FcERI (Reth, Nature 338:383. 1989). Embora a função destas sequências seja incerta, se eficientemente expressa, cada uma pode ser capaz de activação autónoma de célula T e essa actividade pode explicar a resposta TCR residual vista numa linha celular mutante zeta-negativa (Sussman e outros, Cell 52:85. 1988) . A própria í suporta três dessas sequências, aproximadamente espaçadas de modo igual e uma trissecção irregular do domínio intracelular mostra que cada uma é capaz de iniciar uma resposta citolítica. Falta a 7? , uma forma iso de união de f (Jin e outros, supra. 1990; Clayton e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5202. 1991) a metade carboxilo do terceiro motivo. Por que a remoção da metade carboxilo do primeiro motivo retira a actividade, parece que do mesmo modo a maioria da eficácia biológica de n pode ser atribuída aos dois primeiros motivos. Embora por diferentes medições n seja tão activa como Ç na promoção de libertação de citoquina mediada por antigene (Bauer e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:3842. 1991) ou na citólise reorientada (ver acima) , f\ não é fosforilada em resposta à estimulação de receptor (Bauer e outros, supra. 1991). Deste modo, tanto a presença D-622 -7 5- de qualquer dos três motivos é necessária para a fosforilação, como o terceiro motivo representa um substrato favorecido por uma quinase de tirosina não identificada.
EXEMPLO IX
Transdução de Sinal Citolítica por Receptor Fc Humano
Para avaliar as acções de diferentes subtipos de receptor Fc humano, foram criadas moléculas quiméricas em que o domínio extracelular dos antigenes humanos CD4, CD5 e CD16 foram unidos aos domínios de transmembrana e intracelular dos subtipos Bl, B2 e C de FcRIlTA (nomenclatura de Ravtech e Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9:457. 1991). Especificamente, as sequências DNAc correspondentes aos domínios citoplásmico e de transmembrana de FcRIIA previamente descritas das formas iso Bl e B2, foram amplificadas do clone PC23 preexistente ou de uma biblioteca DNAc de amígdala humana (obtida por técnicas padrão) usando condicionadores oligonucleótidos: CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID NO: 18; de FcRIIA "forward") CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID NO: 19; de FcRIIA inverso) GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID NO: 20; de FcRIIBl e FCRIIB2 "forward"); e GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID NO: 21; de FcRIIBl e FcRIIB2 inverso). -76- D-622
Estes condicionadores continham localizações de clivagem para as enzimas BamHI e Notl, respectivamente, recortaram os resíduos 6 da extremidade 5'. A localização Notl foi imediatamente seguida de um codão de paragem de sentido inverso, tanto CTA como TTA. Todos os condicionadores continham 18 ou mais resíduos complementares às extremidades 5' e 3' dos fragmentos pretendidos. O fragmento DNAc correspondente ao domínio citoplásmico FcRII^C, que difere da forma iso IIA num único resíduo amino ácido (L para P no resíduo 268) foi gerado por mutagenese orientada de localiação por sobreposição de PCR utilizando os condicionadores de sequência: TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID NO: 22) e TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID NO: 23).
Os fragmentos PCR foram inseridos em vectores de expressão vírus vaccinia que continha respectivamente os domínios extracelulares CD16 ou CD4 e subsequentemente inseridos no tipo extraordinário de vaccinia por recombinação no locus da timidina-kinase, utilizando selecção para a cointegração de E coli qpt para facilitar a identificação dos recombinantes desejados. As identidades de todas as formas iso (ilustradas na Figura 12) foram confirmadas por sequenciação dideoxi. A produção de proteínas receptoras quiméricas foi ainda confirmada por estudos de imunoprecipitação. Aproximadamente 107 de células JRT3.T3.5 foram infectadas durante uma hora em D-622
meio IMDM isento de soro com vaccinia recombinante numa multiplicidade de infecção de, pelo menos dez. Doze horas após a infecção, as células foram colhidas e a superfície rotulada com 0,5mCi 125I por 107 de células utilizando o método lactoperoxidase/oxidase de glucose. As células rotuladas foram recolhidas por centrifugação e lisadas com NP—40 a 1%, 0,lmM MgCl2, 5mM KCl, 0,2M iodoacetamida e lmM PMSF. Os núcleos foram removidos por centrifugação e as proteínas de fusão CD16 imunoprecipitadas com 4G8 anticorpo e agarose IgG anti-ratinho. As amostras foram sujeitas a electroforese sob condições de redução. Todas as moléculas receptoras quiméricas imunoprecipitadas eram das massas moleculares esperadas.
Para testar a capacidade dos receptores quiméricos mediarem um aumento em ião citoplásmico isento de cálcio, foram utilizados os vírus recombinantes para infectar o mutante TCR~ de linha celular Jurkat JRT3.T3.5 (tal como aqui descrito) e o cálcio livre citoplásmico foi medido nas células (tal como aqui descrito) seguindo-se a ligação cruzada dos domínios extracelulares receptores com anticorpo monoclonal 3G8 ou Leu-3A (tal como aqui descrito) . Estas experiências revelaram que os domínios intracelulares de FcR^ II A e C foram capazes de mediar um aumento no ião de cálcio livre citoplásmico após ligação cruzada dos domínios extracelulares, ao passo que os domínios intracelulares de FcR/ll BI e B2 foram inactivos sob condições comparáveis -78- D-622 (Fgura 13A e 13B) . Os híbridos CD4, CD5 e CD16 de Fcr/II A partilharam igual capacidade para promover a resposta de cálcio (Figura 13 e dados não mostrados). Outras linhas de células, tanto de linhagens linfócitas como monócitas, foram capazes de responder ao sinal iniciado pela ligação cruzada dos domínios extracelulares (dados não mostrados).
Para explorar o envolvimento dos diferentes domínios intracelulares FcR 7ll em citólise, os linfócitos T citotóxicos humanos (CTL) foram infectados com recombinantes vaccinia que expressam quimeras CD16:FcRTlI A, Bl, B2 e C. As células infectadas foram então cocultivadas com células hibridoma carregadas com 51Cr (isto é, células 3G8 10-2) que exprimiram anticorpos de suerfície celular para CD16. Neste ensaio os CTLs que comportam a quimera CD16 mataram as células alvo de hibridoma (permitindo a libertação de Cr livre) se o domínio extracelular CD16 da quimera tivesse sido ligado a um segmento intracelular capaz de activar o programa de efeitos linfócito; este ensaio de citólise é descrito pormenorizadamente a seguir. A Figura 14A mostra que o CTL armado com CDlôrFcRTTlA e C, mas não FcRTlI Bl ou B2, é capaz de lisar as células alvo que expressam superfície celular anticorpo anti-CD16.
Para eliminar a possibilidade de que a citólise específica fosse, de algum modo, atribuível à interacção com metade de CD16, foram efectuadas experiências de citólise em que os -79- D-622 domínios intracelulares FcRII foram anexados a um domínio extracelular CD4. Neste caso as células alvo foram células HeLa expressando proteínas gpl20/41 de invólucro HIV (especificamente, células HeLa infectadas com o VPE6 de vector vaccinia (disponível no National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD) . Tal como no sistema CD16, as células alvo expressando invólucro HIV foram susceptíveis de serem lisadas por células T expressando a quimera CD4:FcRl'lI A, mas não FcRTlI BI ou B2 (Figura 14B).
Os domínios intracelulares de FcR^H A e C não partilharam uma homologia de sequência apreciável com qualquer outra proteína, incluindo os membros da família alargada FcRT^TCR-S*. Para definir os elementos de sequência responsáveis pela indução de citólise, prepararam-se anulações 5' e 3' dos domínios intracelulares de codificação de sequências (descritas a seguir e mostrads na Figura 15A) e avaliaram-se quanto à eficácia em ensaios de mobilização de cálcio e de citólise (tal como aqui descrito). Nas experiências em que a zona terminal amino do domínio intracelular foi removida, o domínio de transmembrana de FcRTlI foi substituído pelo domínio de transmembrana do antigene CD7 não relacionado para eliminar a possível contribuição de interacções mediadas pelo domínio de extensão de membrana.
As Figuras 15B e 15C mostram que a remoção dos resíduos de -80- D-622 terminal carboxilo 14, incluindo tirosina 298, resultaram numa completa perda de capacidade citolitica e numa substancial redução em potencial mobilização de cálcio. Ainda uma anulação imediatamente antes da tirosina 282 deu um fenótipo idêntico (figuras 15B e 15C) . A anulação do terminal N do domínio intracelular do resíduo 268 não teve efeito substancial tanto no perfil cálcio como na potência citolitica, ao passo que a anulação do resíduo 275 prejudicou vincadamente a libertação de cálcio livre, mas teve pouco efeito na citólise (Figuras 15D e 15E). Uma outra anulação do resíduo 282, deu caudas FcRyiI a que faltava a capacidade tanto para mobilizar cálcio como para armar a citólise (Figuras 15D e 15E). 0 'elemento activo' definido por estas medições é relativamente grande (amino ácidos 36) e contem duas tirosinas separadas por resíduos 16.
EXEMPLO X
Encontram-se outros domínios transdutores de sinal intracelular e de transmembrana de acordo com o presente invento nas proteínas receptoras delta CD3, gamma T3, mbl e B29. As sequências de amino ácido destas proteínas são mostradas na Figura 16 (delta CD3; SEQ ID NO: 24), Figura 17 (gamma T3, SEQ ID NO: 25), Figura 18 (mbl; SEQ ID NO: 26) e Figura 19 (B29; SEQ. ID NO: 27). As zonas das sequências suficientes para transdução de sinal citolítico (e, por isso, preferivelmente incluídas num receptor quimérico do presente invento) são mostradas entre parêntesis. -81- D-622
EXEMPLO XI Métodos Experimentais
Infecção de Vaccinia e Radioimunoprecipitação
Aproximadamente 5 x 106 de células CVI foram infectadas durante uma hora em meio DME isento de soro com recombinante vaccinia numa multiplicidade de infecção (moi) de, pelo menos, dez (titulo medido em células CVI). As células foram colocadas em meio fresco após infecção e rotuladas , , TC ,
metabolicamente com 200 JUCi/ml JJS-metionina mais cisteina (Tran35rótulo-S, ICN; Costo Mesa, CA) em metionina e DMEM isento de e cisterna (Gibco; Grand Island, NY) durante seis horas. As células rotuladas foram separadas com PBS contendo EDTA lmM, recolhidas por centrifugação e lisadas em NP-40 a 1%, SDS a 0,1%, NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M ph 8,0, EDTA 5mM e PMSF lmM. Os núcleos foram removidos por centrifugação e as proteínas CD4 imunoprecipitadas com anticorpo 0KT4 e agarose IgG anti-ratinho (Cappel, Durham, NC) . Submeteram-se amostras a electroforese por meio de geles poliacrilamida/SDS a 8% sob condições não redutoras (NR) e redutoras (R). Geles contendo amostras rotuladas 35S foram impregnadas com En3Hance (New England Nuclear, Boston, MA) antes de autoradiografia. A expressão facilitada da forma transmembrana de CD16, CD16m foi medida comparando-se a sua expressão em células CVI unicamente infectadas com CD16m com expressão em células coinfectadas com vírus que codificam CD16m e quimeras 5“ ou T . Após a infecção e incubação -82- D-622 durante seis horas ou mais, separaram-se células de placas com PBS, EDTA lmM e a expressão de CD16TM ou as quimeras foram medidas por imunofluorescência indirecta e citometria de fluxo.
Ensaio de Fluxo de Cálcio Células E6 de sublinha Jurkat (Weiss e outros, J. Immunol. 133;123-128 (1984) foram infectadas com vírus vaccinia recombinantes durante uma hora em IMDM isento de soro a um moi de 10 e incubadas durante três a nove horas em IMDM, FBS a 10%. As células foram recolhidas por centrifugação e resuspensas a 3 x lo6 células/ml em meio completo contendo acetometoxiester Indo-1 lmM (Grynkiewicz e outros, J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985)) (Molecular Probas) e incubadas a 37°C durante 45 minutos. As células carregadas com Indo-1 foram borbulhadas e resuspensas a 1 x 106/ml em IMDM isento de soro e armazenadas à temperatura ambiente com ausência de luz. As células foram analisadas quanto a ião de cálcio por medição simultânea da emissão de fluorescência violeta e azul por citometria de fluxo (Rabinovitch e outros, J. Imunol.. 137:952-961 (1986)). Para iniciar o fluxo de cálcio, adicionou-se (anti-CD4) Leu-3A ficoeritrina (PE)-conjugada (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) a l//g/ml à suspensão de célula seguida de 10>ig/ml de IgG de cabra anti-ratinho não conjugada no momento 0 ou adicionou-se anticorpo monoclonal não conjugado 3G8 (anti-CD16) à suspensão de célula a l/tg/ml seguido por 10 jug/ml de IgG anti-ratinho de cabra Fab2' PE- U~b2Z -tí J- conjugado no momento 0. Recolheram-se histogramas da proporção de emissão de violeta/azul da população de células t (infectadas) positiva PE, que tipicamente representavam 4 0--80% de todas as células. A resposta de receptor antigene de célula T em células não infectadas foi armada por 0KT3 anticorpo, sem ligação cruzada. Para experiências que envolvem receptores quiméricos CD16, foram excluídas da análise amostras que mostram uma formação errática de linha de base em direcção ao cálcio intracelular inferior (sem anticorpo). Analisaram-se subsequentemente dados de histograma por conversão dos dados de binário para ASCII utilizando "software" Write Hand Man (Cooper City, FL) , seguido de análise com uma colecção de programas FORTRAN. A proporção de emissão violeta/azul antes da adição dos segundos reagentes anticorpo foi utilizada para estabelecer a proporção inicial normalizada, colocada igual à unidade e a proporção limiar restante colocada de modo que 10% da população restante não exceda o limiar.
Ensaio de Citólise WH3 de linha celular T humana, uma linha citolítica restricta CD8+ CD4- HLA B44 foi mantida em IMDM, soro humano a 10% com 100 U/ml de IL-2 e foi periodicamente estimulada tanto não especificamente com linfócitos de sangue periférico HLA não igualado irradiados (3000 rad) e lAg/ml de fitohemaglutinin, como especificamente com células mononucleares irradiadas -84- D-622 comportando B44. Após um dia de estimulação não específica, o PHA foi diluído para 0,5 ^g/ml por adição de meio fresco e, após três dias mudou-se o meio. Deixaram-se as células crescer durante, pelo menos, 10 dias seguindo-se estimulação antes do uso em ensaios citotóxicos. As células foram infectadas com vaccinia recombinante numa multiplicidade de infecção de pelo menos 10 durante uma hora em meio isento de soro, seguindo-se a incubação em meio completo durante três horas. As células foram colhidas por centrifugação e resuspensas a uma densidade de 1 x 10' células/ml. Adicionou-se ΙΟΟχΙ a cada recipiente de placa de microtítulo de fundo em U contendo lOOjul/recipiente de meio completo. As células foram diluídas em fases de duas séries. Dois recipientes por cada amostra não continham linfócitos, para permitir a libertação espontânea de cromo e a tomada total de cromo a ser medida. As células alvo da sublinha HeLa S3, foram infectadas em placas de 6,0 ou 10,0 cm num moi aproximado de 10 durante uma hora em meio isento de soro, seguindo-se incubação em meio completo durante três horas. Foram depois separadas dos pratos com PBS, EDTA lmM e contadas. Uma parte aliquota de 10 de células alvo (células HeLa, Raji, ou RJ2.2.5 para as experiências de receptor quimérico CD4 e células 10-2 3G8; Shen e outros Mol. Immunol. 26:959 (1989) para as experiências de receptor quimérico foi centrifugada e resuspensa em 50 >il de cromato estéril 51Cr- -sódio (lmCi/ml, Dupont Wilmington, DE) durante uma hora a 37 aC com mistura intermitente, em seguida lavada três vezes D-622 -85- / com PBS. Adicionou-se a cada recipiente 100 /*.1 de células rotuladas resuspensas em meio a 10^ células/ml. Células alvo Raji e RJ2.2.5 foram rotuladas do mesmo modo que as células HeLa. A placa de microtitulo foi feita girar a 750 x g durante 1 minuto e incubada durante 4 horas a 37BC. No fim do período de incubação, as células em cada recipiente foram resuspensas por pipetamento suave, uma amostra removida para determinar as contagens totais incorporadas e a placa de microtitulo foi feita girar a 750 x g durante 1 minuto. 100 zaI de uma parte alíquota de sobrenadante foi removida e contada num contador de cintilação de raio gamma. A percentagem de morte foi corrigida para a fracção de células alvo infectadas (habitualmente 50-90%) medida por citometria de fluxo. Para células efectoras infectadas a proporção de efeito:alvo foi corrigida para a percentagem de células infectadas (habitualmente 20-50% para as experiências de receptor quimérico CD4 e 70% para as experiências de receptor quimérico CD16).
Mutagenese In Vitro da sequência S
Para criar mutações de ponto em resíduos amino ácidos 11 e ou 15 da sequência £ , prepararam-se condicionadores oligonucleótidos sintéticos que se prolongam da localização BamHI a montante do domínio de transmembrana S e que. convertem o £ nativo do resíduo 11 de Cys em Gly (C11G) ou resíduo 15 de Asp em Gly (D15G) ou ambos (C11G/D15G) e usaram-se em reacções PGR para gerar fragmentos mutados que -86- D-622 foram reinseridos nas construções de tipo extraordinário CD4:.f
Para criar anulações S , as sequências DNAc Γ foram amplificadas por. PCR usando condicionadores oligonucleótidos sintéticos designados para criar um codão de paragem (UAG) após os resíduos 50, 59 ou 65. Os condicionadores continham a localização de clivagem para a enzima Notl dotada de cinco ou seis resíduos da extremidade 5 ' , habitualmente numa sequência da forma CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ ID NO: 11) , em que os últimos três resíduos correspondem ao anticodão de paragem. As sequências anticodão Notl e de paragem foram seguidas por 18 ou mais resíduos complementares à desejada extremidade 3' do fragmento. As quimeras resultantes foram designadas respectivamente CD16:Í“Y51*, Οϋ16:/Ε60* e CD16:-f D66*. A localização BamHI a montante do domínio de transmembrana e a localização Notl foram utilizadas para gerar fragmentos que foram reintroduzidos na construção de CD 16:f de tipo extraordinário. As quimeras $ monoméricas foram criadas pela libertação das sequências intracelulares próximas de membrana e de transmembrana por digestão de BamHI e Saci da construção CD4: J* Asp- e Cys” acima descrita e pela inserção do fragmento respectivamente na construção CD16:i“ E60* e CD16:5" D66* .
Construção de quimera tripartida CD16:7:J· (48-65) e CD16:75(48-59) -87- D-622
Para preparar a construção CDlôiíDõõ*, a sequência DNAc £ correspondente ao domínio de transmembrana e os resíduos 17 seguintes do domínio citoplásmico foram substituídos pelo correspondente domínio citoplásmico e de transmembrana de DNAc CD5 e CD7. Os fragmentos CD5 e CD7 foram gerados por uma reacção PCR utilizando oligonucleótidos anteriores incluindo uma localização de clivagem de restrição BamHI e correspondentes à zona imediatamente a montante respectivamente do domínio de transmembrana de CD5 e de CD7 e os seguintes oligonucleótidos inversos sobrepuseram respectivamente as sequências CD5 e CD7 e a sequência Γ que continha a localização de clivagem de restrição Saci. CD5: ? : CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID NO: 12)
CD7:S: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID NO: 13).
Os produtos PCR CD5 e CD7 foram digeridos com BamHI e Saci e ligados a CD16:ÍE60* digeridos BamHI e Saci e substituiu-se a sequência/ de BamHI a Saci pelo fragmento CD7. Para fazer as construções CD16:CD5 e CD16:CD7, os fragmentos CD5 e CD7 foram obtidos por PCR usando um oligonucleótido contendo uma localização de clivagem de restrição Notl e codificando um codão de paragem (UAA) respectivamente após o resíduo Gln416 e Ala 193 de CD5 e CD7. 0 fragmento PCR de CD5 e CD7 foi digerido com BamHI e Notl e inserido na construção CD16;/ Asp66*. -88- D-622
Mutagenese In Vitro dos Resíduos de Terminal N no Motivo de Transdução de Sinal Citolítico S.
Os condicionadores oligonucleótidos sintéticos que se prolongam da localização Saci no interior do motivo S e que convertem o resíduo natural 48 de Asn em Ser (N48S) , o resíduo 50 de Leu em Ser (L50S) e o resíduo 51 de Tyr em Phe (Y51F) foram sintetizados e usados numa reacção de PCR para gerar fragmentos que foram introduzidos na construção CD16:7:J* (48-65) de tipo extraordinário.
Mutagenese In Vitro dos Resíduos de Terminal C no Motivo de Transdução de Sinal Citolítico f .
Os condicionadores oligonucleótidos sintéticos que se prolongam da localização Notl 3 1 para o codão de paragem e que convertem o resíduo natural 60 de Glu em Gin (E60Q) , o resíduo 61 de Glu em Gin (E61Q) , o resíduo 62 de Tyr em Phe ou ser (Y62F ou Y62S) e o resíduo 63 de Asp em Asn (D63N) foram sintetizados e usados em PCR para gerar fragmentos que foram subclonados na construção Cdl6:í' D66* da localização BamHI para a localização Notl.
Construções de Quimeras CD16:7 S(33-65), ¢016:7:^(71-104), CD16:7:^(104-137)
Um fragmento de transmembrana CD7 que comporta localizações
MluI e Notl na união entre os domínios intracelular e de transmembrana foi obtido por PCR utilizando um
oligonucleótido com a sequência seguinte: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 14). 0 fragmento de PCR resultante foi digerido com BamHI e Notl e reinserido na construção CD16:7:S(48-65). Os fragmentos Sque codificam os resíduos 33 a 65, 71 a 104 e 104 a 137 foram obtidos por reacção de PCR utilizando pares de condicionadores contendo localizações MluI na extremidade 5' dos condicionadores anteriores e codões de paragem seguido por localizações Notl na extremidade 5' dos condicionadores inversos. Em cada caso as localizações de restrição foram introduzidas seis resíduos a partir do terminal 5' do prímero para assegurar a clivagem da enzima de restrição. X 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG.CAC ACA (SEQ ID NO: 15); f 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID NO: 16) ; e S 104 : CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID NO: 17).
Construção de Mutantes de Anulação FcR/IIA
Os mutantes de anulação FcRIIA de terminal carboxilo foram construídos por PCR do mesmo modo que para as construções de comprimento total, convertendo as sequências que codificam 1J-622 -yu- tirosina nas posições 282 e 298 em codões de paragem (TAA) . As anulações de terminal N foram geradas amplificando os fragmentos que codificam sucessivamente menos do domínio intracelular por PCR, usando oligonucleótidos que permitiram que os fragmentos resultantes fossem inseridos entre as localizações de restrição MluI e Notl num plasmídio de expressão previamente construído que codifica o domínio extracelular CD16 fundido ao domínio de transmembrana CD7, terminando o último numa localização MluI e a união entre o domínio intracelular e de transmembrana.
OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO
Os exemplos acima descritos demosntraram que a agregação de quimeras 77, ou Y é suficiente para para iniciar a resposta de célula efectoras citolíticas em células T. A gama conhecida de expressão de /, 7} , e Y , que inclui linfócitos T, "natural killer cells", granulófitos basofilicos, macrófagos e células mast, sugere que motivos de sequência conservados pode interactuar com um aparelho sensor comum a células de origem hematopoiética e que um importante componente de defesa hospedeira no sistema de imunidade pode ser mediado por eventos de agregação de receptor. A potência da resposta citolítica e a ausência de uma resposta a células alvo que comportam receptores MHC de classe II demonstra que as quimeras baseadas em Ç, n , ou Y, -91- D-622 formam a base para uma intervenção genética para SIDA através da imunoterapia adoptiva. A ampla distribuição de íe Y endógeno e a prova de que os receptores Fc associados a citotoxicidade mediada t em diferentes tipos de células (Fanger e outros, Imuno. Today. .10:92-99 (1989)) permite que uma variedade de células seja considerada para esta finalidade. Por exemplo, os granulócitos neutrofílicos, que possuem um tempo de vida muito curto ( £ 4 horas) em circulação e são intensamente citolíticos, são células alvo atractivas para a expressão das quimeras. A infecção de neutrófilos com HIV parece não resultar em libertação de vírus e a abundância destas células (as mais prevalentes dos leucócitos) deveriam faciltar a defesa do hospedeiro. Outra possibilidade atractiva para as células hospedeiras são células T desenvolvidas, uma população presentemente acessível a construção genética retroviral (Rosenberg, S.A. Sei. Am. . 262 : 62-69 ( 1990). Com o auxílio de IL-2 recombinante, as populações de células T podem ser expandidas em cultura com relativa facilidade e as populações expandidas possuem tipicamente um tempo de vida limitado quando reinfundidas (Rosenberg e outros, N. Enql. J. Med.. 323:570--578 (1990)).
Sob condições apropriadas, o reconhecimento de HIV por células que expressam quimeras CD4 proporcionariam também estímulos mitogénicos, que dão a possibilidade de a população de células armadas poderem responder dinamicamente ao tema do vírus. Embora se tenha aqui centrado no comportamento das proteínas de fusão em linfócitos T citolíticos, a expressão das quimeras em linfócitos de auxílio podiam proporcionar uma fonte de HlV-mobilizada de citoquinas que podiam actuar contra o colapso do subconjunto de células auxiliares na SIDA. A recente descrição de vários esquemas para construir a resistência à infecção noutras fases para além da penetração de vírus (Friedman e outros, Nature, 335:452-454 (1988); Green e outros, Cell. 58:215-223 (1989); Malim e outros, Cell. 58.:205-214 (1989); Trono e outros, Cell. 59.:113-120 (1989); Buonocore e outros, Nature, 345:625-628 (1990)) sugere que as células que suportam as quimeras CD4 podiam ser designadas para contrariar a produção de vírus através da expressão de agentes apropriados que possuem uma localização intracelular de acção. A capacidade para transmitir sinais a linfócitos T através de quimeras autónomas também proporciona a capacidade para a regulação de linfócitos construídos retroviralmente in vivo. Os estímulos de ligação cruzada, mediada por exemplo por anticorpos IgM específicos construídos para remover domínios de complemento de ligação, podem permitir que esses linfócitos aumentem de número in situ, enquanto o tratamento com anticorpos IgG específicos semelhantes (por exemplo o reconhecimento de uma variação de amino ácido construída na cadeia quimérica) podia selectivamente exaurir a população construída. Adicionalmente os anticorpos IgM anti-CD4 não -93- D—622 requerem uma ligação cruzada adicional para mobilizar cálcio em células Jurkat que expressam quimeras CD4: S" (dados não mostrados). A capacidade para regular populações de células sem recurso a repetida amplificação extracorporal pode prolongar substancialmente a gama e a eficácia de usos correntes propostas para células T manipuladas geneticamente.
Para criar outras quimeras que consistem em sequências intracelulares S, 7> ou Ύ as sequências genômicas ou de DNAc que codificam um domínio extracelular do receptor podem ser dotadas de uma localização imediatamente precedente ao domínio de transmembrana de escolha. O fragmento de domínio extracelular que termina na localização de restrição pode então ser unida nas sequências S t 7\ , ou Y . Domínios extracelulares típicos podem ser feitos derivar de receptores que reconhecem complemento, carbohidratos, protéinas virais, bactérias, parasitas protozoários ou metazoários ou proteínas induzidas por eles. De modo semelhante os ligantes ou receptores expressos por patogenes ou células de tumor podem ser anexadas a sequências Ç, r?, ou Ύ para orientar respostas de imunidade contra células que comportam receptores que reconhcem aqueles ligandos.
Se bem que o invento tenha sido descrito em conexão com as suas formas de realização específicas, compreender-se-á que é capaz de outras modificações e pretende-se que este pedido possa cobrir variações, utilizações ou adaptações do presente -94- D-622 invento e incluindo desenvolvimentos da presente descrição na técnica a que o invento pertence e como pode ser aplicado aos aspectos essenciais a seguir referidos como se segue no âmbito das reivindicações anexas.
-95- D-622
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Nfl.:l: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1728 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Dupla hélice (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N8.:l: AXGAACCGGG GAGICCCXXX XAGGGACXIG CXXCXGGIGC IGCAACXGGC 50 GCXCCXCCCA GCAGCCACXC AGGGAAACAA AGIGGXGCXG GGCAAAAAAG 100 GGGAXACAGT GGAACXOACC XGXACAaCXX CCCAGAAGAA GAGCAIACAA 150 XXCCACXQGA AAAACXCCAA CCAGATAAAO AIXCXGGGAA AXCAGGGCTC 200 CTXCXXAACX AAAGOTCCAX CCAAGCIQAA TOAXCGCOCX GACTCAAOJUV 250 GAAGCCXXXG GGACCAAGGA AACXXCCCCC XGAXCAXCAA GAAXCXTAAO 300 AIAGAAGACX CAGAXACIXA CAXCIGXGAA GXGGAGCACC AOAAGGAGGA 350 GGXOCAAXXG CXAGXGXXCO GAIXGACXGC CAACXCXCAC ACCCACCXGC 400 TrCAGGGGCA GAGCCXGACC CXGACCXXGG AGAGCCCCCC IGGIAGIAGC 450 CCCXCAGXGC AAXGIAGGAG ICCAAGGGCT AAAAACAXAC AGGGGGGGAA 500 GACCCXCXCC GXGICXCAGC XGGAGCXCCA GGAXAOXGGC ACCXGGACAI 550 GCACXOTCXX GCAQAACCAG AAGAAGGXGG AGXXCAAAAX AGACAICGXO 600 OXGCXAGCXX XCCAGAAGGC CXCCAGCAXA GXCXAXAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGXGGAG IXCXCCXXCC CACXCGCCTT XACAGXXGAA AAGCIGACGG 700 GCAGXGGCGA GCTGTGGXGO CAGGCGGAGA GGGCXXCCXC CXCCAAGICT 750 XGGAICACCX XXOACCXGAA GAACAAGGAA OIGICXGTAA AACGGGXXAC 800 CCAGGACCCX AAGCXCCAGA XGGGCAAGAA GCXCCCGCXC CACCICACCC 850 XQCCCCAQOC CXXGCCXCAa XAXGCXGGCX CIGGAAACCX CACCCIGGCC 900 CXXGAAGCOA AAACAGGAAA GXXGCATCAO GAAOXGAACC TGGIGGIGAX 950 D-622 ,-yb-
GAQAGCCACX CAQCXCCAGA AAAATTXGAC CXGTGAGGXO IGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCXGAXGCIG AGCXIGAAAC XGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GXCXCGAAGC GOGAOAAGCC GGXGTGGGTG CIOAACCCXG AGGCGGGGAX 1100 QXQGCAGXGX CXOCXGAGIO ACXCGGGACA GOTCCXGCXO GAAXCCAACA 1150 XCAAGOITCI GCCCACAXGG ICCACCCCGO TGCACGCQGA TCCCAAACTC 1200 IGCIACXTGC XAGAIGGAAT CCXCXXCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC 1250 CCTOTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAOAGACT GCTGCCAACC 1300 TGCAGGACÇC CAACCAGCXC TACAAIGAOC XCAAICXAGG GCGAAGAGAG 1350 OAATATGACG ICIXGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGAXCCAG AGAXGGGAGG 1400 CAAACAGCAO AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGXATAC AAIGCACTGC 1450 AGAAAOACAA GAXGCCAGAA GCCIACAGXG AGAICGGCAC AAAAGGCGAG 1500 AGOCOGAGAG GCAAGGGGCA CGAIGGCCXX XACCAGGACA GCCACIXCCA 1550 AGCAGXGCAG IXCGOGAACA GAAGAOAGAG AGAAGGIXCA GAACICACAA 1600 GGACCCTXaO GTIAAGAGCC CGCCCCAAAG GXGAAAGCAC CCAGCAGAGX 1650 AGCCAAICCX GXGCCAGCGI CTXCAQCATC CCCACICIGX GGAOTCCAXG 1700 GCCACCCAOX AGCAGCXCCC AGCXCXAA 1728 -91- D-622
INFORMAÇAO SOBRE SEQ ID Na.:2: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1389 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Dupla hélice (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:2: AIGAACCGGG GAGXCCCTTX TAGGCACTTG CTXCTGGTGC IGCAACIGGC 50 GCXCCXCCCA GCAGCCACIC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGAXACAGX GGAACTGACC IGXACAGCXX CCCAGAAGAA OAOCAXACAA 150 TXCCACTGGA ΛAAACTCCAA CCAGAXJUUIO aixcigggaa AICAGGGCTC 200 CIXCXXÍUVCX AAAGOTCCAT CCAAGCXGAA TGAXCGCGCT GACXCAAGAA 250 GAAGCCTTTO GGACCAAGGA AACIXCCCCC XGATCAXCAA GAAXCXTAAG 300 AXAQAAQACX CAGATACTTA CAXCXGXGAA GIGGAGOACC AGAAGGAGGA 350 GOTOCAAXXO CTAOTGXTCO GATTGACTGC CAACXCIGAC ACCCACCXGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTXGG AGAGCCCCCC XGGIAGTAGC 450 CCCXCAGIGC AATGXAGGAG XCCAAGGGGX AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCICXCC OTGTCTCAGC XGGAGCXCCA GGAXAGXGGC ACCXGGACAT 550 GCACXGTCTX OCAGAACCAG AAGAAGGIGO AGTXCAAAAT AGACATCGIG 600 GTOCTAGCTT TCCAGAAGGC CXCCAGCAXA GXCXATAAGA AAGAGGGOGA 650 ACAGGTGGAO TXCICCTXCC CACTCGCCTT XACAGXXGAA AAGCXGACGO 700 GCAGTGGCGA OCTGXGGXGG CAGGCGGAGA GGGCXTCCXC CXCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TXGACCTGAA GAACAAGGAA GXGXCXOXAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA IGGGCAAGAA GCICCCGCTC CACCXCACCC 850 IGCCCCAGOC CXTOCCXCAO TATGCTGGCT CXGGAAACCX CACCCXGGCC 900 CTTGAAOCGA AAACAG G ΛΛΛ GXXGCATCAG GAAOIGAACC TGGTOGTGAI 950 D-622 .-ya- 4 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTQTGAGGTO TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA OCTOAXGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAOGCAAAG 1050 QXCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGOAT 1100 GTGGCAOTGT CTGCTGAOTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGOA TCCGCAGCTC 1200 TOCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTO TATGGTATTG TCCTTACCCT 1250 GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAOCC 1300 GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG 1350 ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG 1389 -33- υ-tzz
INFORMAÇAO SOBRE SEQ ID Na.:3: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1599 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Dupla hélice (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genômico) (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUENCIA: SEQ ID NB.:3: AXOAACCGGO GAGICCCXTX TAGGCACTTG CXICXGGXGC XGCAACIGGC 50 GCXCCICCCA GCAQCCACTC AGGGAAACAA AGIGGTGCXO GGCAAAAAAG 100 OGGATACAGT GGAACTGACC TGXACAGCTT CCCAGAAGAA GAG CAXACAA 150 XTCCACXGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAO AXXCXGGGAA ATCAGGGCIC 200 CTTCXXAACX AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGAXCGCGCX GACICAAOAA 250 GAAGCCXTXQ GGACCAAGGA AACXXCCCCC IGAICAXCAA GAATCTTAAG 300 ATAOAAOACX CAGATACTTA CAXCXGIOAA CXGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 G GTG CAAXXG CXAOXGXXCG GATTGACXGC CAACXCXGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC IGGIAGXAGC 450 CCCXCAGTGC AAXGTAGGAG TCCAAGGGax AAAAACAIAC AGGGGGGGAA 500 GACCCXCTCC GXGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAOXGOC ACCIGGACAI 550 OCACIOXCTT GCAOAACCAO AAGAAGGTGG AGTTCAAAAX AGACATCGXG 600 GTGCXAGCTT XCCAGAAGOC CXCCAOCATA OXCXAXAAOA AAGAGOGGGA 650 ACAGOTGGAG TXCTCCTTCC CACTCGCCTI TACAGTXGAA AAGCXGACGO 700 OCAGXGGCGA GCXGIGGXGG CAGGCGGAGA GGGCXXCCXC CXCCAAGICX 750 TGGAXCACCX TTGACCXGAA GAACAAGGAA GICICXGIAA AACGGCIXAC 800 CCAGGACCCX AAGCXCCAGA XGGGCAAGAA GCXCCCGCTC CACCXCACCC 850 XGCCCCAGGC cttoccicag TATGCTGOCT CIGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CXXGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGXGAACC XGGXGGIGAT 950 D-622 —ι υ u - OAGAGCCACI CAGCXCCAGA AAAAXXTGAC CIGIGAGGIG TGOGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCXGAXGCXG AG CXXG7UVAC XGGAGAACAA GGAGGCAAAO 1050 OXCXCGAAGC GGOAOAAGCC GGXGIGGGTG CXGAACCCXG AGGCGQGGAT 1100 GXOGCAGTOT CXGCXGAGXO ACTCGGOACA OGICCXGCIO GAAXCCAACA 1150 XCAAGGXTCX GCCCACAXGO XCCACCCCGO IGCACGCGGA XCCCAAACTC 1200 XGCXACCXGC IGGAXGCAAI n n H n 3 n s n XAXGGXGXCA XXCTCACTGC 1250 cTrai-rccTa AGAOIGAAGI XCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCOXACC 1300 AGCAGGGCCA OAACCAGCXC ΧΛΙΛΛ CGAG C XCAAXCTAGG ACGAAGAGAG 1350 GAGXACGATG XTXXGGACAA GAGACGIGGC CGGGACCCIO AGAXGGGGGG 1400 AAAGCCCAGA AGGAAGAACC CXCAGGAAGO CCXGXACAAT GAACTGCAGA 1450 AAGAXAAGAX GGCQGAGGCC XACAGXGAGA TXGGGAXGAA AGOCGAGCaC 1500 CGGAGGGGCA AGGGGCACGA XGCCCXXXAC CAGGGXCXCA GXACAGCCAC 1550 CAAGGACACC XACGACGCCC XXCACAIGCA GGCCCXGCCC CCXCGCXAA 1599 -101 D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:4: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 575 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:4:
Het Ληη Arg Gly Vai Pro Phe Arg Ilis Lou Leu Leu Vai Leu Oln Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Oln Oly Asn Lys Vai Vai Lou Gly Lys 20 25 30 Lyo Gly Λβρ Thr Vai Glu Leu Thr Cys Thr Ala Sor Gin Lys Lye Ser 35 40 45 Ile Gin Pho nie Trp Lye Asn Sor Asn Oln Ilo Lys Ilo Leu Gly Asn 50 55 60 Gin Gly Ser Pho Leu Thr Lys Gly Pro Sor Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Λβρ Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Pho Pro Leu Ile Ile 85 90 95 Lye Asn Leu Ly e Ile Glu Asp Sor Asp Thr Tyr Ilo Cys Glu Vai Glu 100 105 110 Λβρ Gin Ly 8 Glu GlU Vai Gin Leu Lou Vai Pho Oly Leu Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Λβρ Thr nin Leu Lou Gin Gly Gin Sor Leu Thr Leu Thr Lou Glu 130 135 140 Ser Pro Pro Oly Sor Sor Pro Sor Vai Cln Cys Arg Ser Pro Arg Oly 145 150 155 160 Ly π Λβη Ilo Oln Oly Gly Lys Thr Lou Sor Vai Sor Gin Lou Glu Lou 165 170 175 Gin Asp Sor Gly Thr Trp Thr Cys Thr Vai Lou Gin Asn Gin Lys Lys 180 185 190 Vai Glu Pho Lyo Ilo Aop Ilo Vai Vai Lou Ala Pho Gin Lys Ala Sor 195 200 205 Ser Ilo Vai Tyr Lye Lys Glu Gly Glu Gin Vai Glu Pho Sor Phe Pro 210 215 220 Leu Ala Phe Thr Vai Glu Lye Lou Thr Gly Sor Gly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Gin Ala Glu Arg Ala Ser Sor Sor Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu 245 250 255 Ly e Asn Ly e Glu Vnl Ser Vai Ly π Arg Vai Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265 270 Gin Met Gly Lys Lys Lou Pro Lou nis Lou Thr Leu Pro Oln Ala Lou 275 200 285 Tro Oln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Lou Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 Thr Gly Lys Leu His Oln Glu Vai Asn Leu Vai Vai Met Arg Ala Thr 305 310 315 320 Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu Vai Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 -αο2 D-622
Lyo Leu Met Lou Sor Leu Lys Leu Olu Asn Lys Olu Ala Lys Vai Se r 340 345 350 Ly* Arg Olu Ly s Pro Vai Trp Vai Leu Asn Pro Olu Ala Oly Met Trp 355 360 365 Oln Cys Lou Leu Sor Asp Sor Gly Oln Vai Leu Leu Olu Ser Asn Ile 370 375 380 Lyo Vai Lou Pro Thr Trp Sor Thr Pro Vai Ilis Ala Asp Pro Lys Leu 305 390 395 400 Cy o Tyr Lou Lou Aap Oly Ilo Leu Phe Ilo Tyr Oly Vai Ile Ile Thr 405 410 415 Ala Leu Xyr Lou Arg Ala Lys Phe Sor Arg Ser Ala Olu Thr Ala Ala 420 425 430 Asn Lou Oln Asp Pro Λαη Gin Leu Tyr Asn Olu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Olu Olu Tyr Acp Vai Lou Olu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Olu 450 455 460 Met Oly Oly Lys Oln Oln Arg Arg Arg Asn Pro Oln Olu Oly Vai Tyr 465 470 475 480 Abu Aln Lou Oln Lye Aap Lys Met Pro Olu Ala Tyr Ser Olu Ile Oly 485 490 495 Thr L7S Oly Olu Arg Arg Arg Oly Lys Oly' His Asp Oly Leu Tyr Oln 500 505 510 Asp Ser II is Pho Oln Ala Vai Gin Phe Oly Asn Arg Arg Olu Arg Olu 515 520 525 Oly 5or Olu Lou Thr Arg Thr Leu Oly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Oly 530 535 540 aiu Sor Thr Oln Oln Sor Ser Gin Ser Cys Ala Ser Vai Phe Ser Ilo 555 550 565 560 Pro Thr Lou Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gin Leu 565 570 575
-1UJ D—622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 462 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N=.:5:
Mot Aon Arg Oly Vai Pro Pho Arg Hie Lou Lou Leu Vai Lou Gin Lou 1 5 10 15 Ala Lou Lou Pro Ala Ala Thr Gin Oly Asn Lys Vai Vai Lou Gly Lys 20 25 30 Ly o Oly Asp Thr Vnl Olu Leu Thr Cya Thr Ala Ser Gin Lys Lys Sor 35 40 45 lie Oln ΓΙιο His Trp Lys Asn Sor As ii Gin Ilo Lys Ilo Lou Gly Asn 50 55 60 Oln Oly Sor Pho Lou Thr Ly c Gly Pro Sor Lys Leu Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Asp Sor Arg Arg Sor Lou Trp Asp Oln Oly Asn Pho Pro Leu Ilo Ilo 85 90 95 Ly o Asn Lou Lys Ilo Olu AEp Sor Asp Thr Tyr Ilo Cys Olu Vai Olu 100 105 110 Asp Gin Ly o Olu GlU Vnl Gin Leu Lou Vai Pho Gly Lou Thr Ala Asn 115 120 125 Sor Anp Thr Ilia Lou Lou Oln Gly Gin Sor Lou Thr Lou Thr Leu Olu 130 135 140 Sor Pro Pro Oly Sor Sor Pro Sor Vai Glu Cys Arg Ser Pro Arg Oly 145 150 155 160 Lys Anu Ilo Oln Oly Oly Lys Thr Leu Sor Vai Sor Oln Lou Olu Lou 165 170 175 Oln Aep Sor Oly Thr Trp Thr Cys Thr Vai Leu Olu Asn Oln Lys Lys 180 185 190 Vai Qlu rhe Ly b Ilo Asp 11o Vnl Vai Lou Ala Pho Oln Lys Ala Sor 195 200 205 Bar Ilo Vai Tyr Lys Lys Glu Oly Olu Oln Vai Olu Pho Sor Pho Pro 210 215 220 Leu Ala Pho Thr Vai Olu Lys Lou Thr Oly Ser Oly Olu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Oln Ale Olu Arg Ala Sor Sor Sor Ly H Sor Trp Ilo Thr Pho Asp Lou 245 250 255 Ly» Aon Ly n Olu Vai Sor Vnl Lys Arg Vnl Thr Gin Ssp Pro Lys Lou 260 265 270 Oln Mot Oly Ly β Ly 3 Lou Pro Lou His Lou Thr Leu Pro Oln Ala Lou 275 200 285 Pro Oln Tyr Aln Oly Sor Oly Ann Leu Thr Lou Ala Lou Olu Ala Lys 290 295 300 Thr Oly Ly π Leu His Oln Olu Vai Asn Leu Vai Vai Mot Arg Ala Thr 305 310 315 320 Oln Lou Gin Lys Asn Lou Thr Cyc Glu Vai Trp Gly Pro Thr Ser Pro 325 330 335 -104 D-622
Ly g Lou Mot Leu Ser Lou Ly c Lou Glu Acu Ly s Glu Aln Ly g Vai Sor 340 345 350 Ly 3 Arg Glu Ly o Pro Vai Trp Vai Lou A cu Pro Glu Ala Gly Met Trp 355 360 365 01:i Cy b Lou Lou Sor Asp Ser Gly Glu Vai Lou Lou Glu Ser Asn Ilo 370 375 380 Ly o Vai Lou Pro Thr Trp Sor Thr Pro Vai His Ala Asp Pro Gin Leu 385 390 395 400 Cy a Tyr 11« Lou Aop Ala I lo Lou Phe Lou Tyr Gly Ila Vai Lou Thr 405 410 415 Lou Lou Ty r Cy b Arg Lou Ly c I lo Gin Vnl Arg Ly o Ala Λερ Ilo Ala 420 425 430 Sor Arg Glu Ly a Sor Asp Ala Vai Tyr Thr Gly Lou Asa Thr Arg Asn 435 440 445 Oln Olu Thr Tyr Olu Thr Lou Ly ε Ilis Glu Ly ε Pro Pro Gin 450 455 460 462 -ιυο υ-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID N8.:6: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 532 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:6:
Hot Λ3ΙΙ Arg Oly Vai Pro Pho Arg II is Lou Leu Lou Vai Leu Oln Lou 1 5 10 15 Ala Lou Lou Pro Aln Aln Thr Cln Oly Acn Lyo Vai Vnl Lou Oly Lys 20 25 30 Lys Oly Asp Thr Vai Olu Leu Thr Cyo Thr Ala Sor Oln Lye Lys Ser 35 40 45 11« Oln Pho nis Trp Ly s Asu Sor Asu Oln Ilo Ly s Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Oln Gly Sor Pho Lou Thr Lya Oly Pro Sor Lyo Lou Asn Asp Arg Ala 65 70 75 80 Anp Sor Arg Arg Sor Lou Trp Asp Oln Gly Asn Pho Pro Leu Ilo Ilo 05 90 95 Lys Aon Lou Ly π Ilo Olu Asp Sor Asp Thr Tyr Ilo Cya Olu Vai Olu 100 105 110 Asp Oln Ly o Olu Olu Vai Oln Lou Lou Vai Pho Oly Lou Thr Ala Asn 115 120 125 Ser Asp Thr nis Lou Lou Gin Gly Gin Sor Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140 Sor Fro Pro Gly Sor Sor Pro Sor Vai Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly 145 150 155 160 Lyp Aon Ile Oln Oly Oly Lyo Thr Lou Sor Vai Sor Gin Leu Olu Lou 165 170 175 Oln Aop Sor Gly Thr Trp Thr Cy o Thr Vai Lou Oln Asn Gin Lys Lye 180 185 190 Vai Olu Pho Lys Ilo Asp Ilo Vai Vai Leu Ala Pho Oln Lya Ala Sor 195 200 205 Sor Ilo Vai Ty r Lyn Lyo Olu Gly Olu Oln Vai Olu Pho Sor Pho Pro 210 215 220 Lou Ala Pho Thr Vai Olu Ly s Leu Thr Gly Sor Cly Glu Leu Trp Trp 225 230 235 240 Oln Ala Olu Arg Aln Sor Ser Sor Lyo Ser Trp Ilo Thr Phe Asp Lou 245 250 255 Lye Asn Ly a Olu Vai Ser Vai Lyo Arg Vai Thr Gin Asp Pro Lya Lou 260 265 270 Oln Hat Oly Lys Lye Lou Pro Lou Ilis Lou Thr Lou Pro Gin Ala Leu 275 200 285 Pro Oln Xyr Aln Gly Sor Oly Asn Lou Thr Lou Ala Leu Glu Ala Lys 290 295 300 -106- D-622
Xhr Gly Lys Lou Mn Oln Olu Vai Asn Leu Vai Vai Mot Arg Ala Thr 305 310 315 320 Oln Leu Oln Lys Asn Lou Thr Cys Olu Vai Trp Oly Pro Thr Sor Pro 325 330 335 Lys Lo u Mot Lou Sor Leu Lys Lou Olu Asn Lys Olu Ala Lys Vnl Sor 340 345 350 Lyn Arg Olu Lys Pro Vai Trp Vnl Leu Asn Pro Olu Aln Gly Met Trp 355 360 365 Ola Cyn Leu Leu Sor Asp Scr Oly Oln Vai Lou Lou Olu Sor Asn Ile 370 375 380 Lyn Vnl Lou Pro Thr Trp Sor Thr Pro Vai uis Ala Asp Pro Lyo Leu 305 390 395 400 Cy u Tyr Leu Lou Asp Oly I lo Lou Pho Ilo Tyr Oly Vai Ilo Lou Thr 405 410 415 Ala Leu Fho Lou Arg Vai Lys Pho Sor Arg Sor Ala Olu Pro Pro Ala 420 425 430 Tyr Oln Oln Oly Oln Asn Oln Leu Tyr Asn Glu Lou Asn Leu Oly Arg 435 440 445 Arg Olu Glu Ty r Asp Vai Lou Asp Lys Arg Arg Oly Arg Asp Pro Olu 650 455 460 Met Oly Oly Lyo Pro Arg Arg Lya Asn Pro Oln Olu Oly Leu Tyr Asn <165 470 475 480 Glu Leu Oln Ly* Asp Lya Mot Ala Glu Ala Tyr Sor Glu Ile Oly Met 485 490 495 Lyo Oly Olu Arg Arg Arg Oly Lys Oly His Asp Oly Lou Tyr Oln Oly 500 505 510
Lou Ser Thr Ma Xhr Lys Asp Tbr Tyr Asp Ala Leu Hia Mot Oln Ala 515 520 525
Leu Pro Pro Arg 530 -107 D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID N°.:7: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:7: CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:8: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:8: CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:9: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°.:9: 33
CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:10: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°.:10: CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID N°.:ll: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°.:ll: CGCGGGCGGC CGCTA 15 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:12: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:12: 42 -108
CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG D-622 -109-
INFORMAÇAO SOBRE SEQ ID Ns.:13: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUENCIA: SEQ ID Na.:13:
CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Ne.:14: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUENCIA: SEQ ID Nfl.:14: CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA 33 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:15: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUENCIA: SEQ ID N°.:15: 36 48
CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA -110 D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID NB.:16: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUENCIA: SEQ ID Na.:16: CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG 33 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID N°.:17: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUENCIA: SEQ ID Na.:17: CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC 33 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:18: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUENCIA: SEQ ID Na.:18: 26
CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:19: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:19: CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 42 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:20: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°.:20: GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG 30 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:21: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:21: 32 -111
GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC -112 D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:22: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°.:22: TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:23: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUENCIA: SEQ ID Na.:23: 31
TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A -113 D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID N°.:24: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 171 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: amino ácido (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NQ.:24:
Mot aiu Ilis Sor Thr Pho Leu Scr Gly Lou Vai Lou Ala Thr Lou Lou 5 10 15 Sor aiu Vnl Sor Pro Pho Ly π Ilo Pro Ilo Glu Glu Lou Glu Asp Arg 20 25 30 Vnl Pho Vai Asn Cy π As ii Thr Ser Ilo Thr Trp Vnl Glu Gly Thr Vai 35 40 45 Oly Thr Lau Lou Sor Acp I lo Thr Arg Leu Asp Lou Oly Lys Arg Ilo 50 55 60 Lou Asp Pro Arg Gly I lo Tyr Arg Cys Asa Gly Thr Asp Ilo Tyr Lys 65 70 75 80 Λπρ Ly n Olu Sor Thr Vai Gin Vai Ilin Tyr Arg Mot Cys Oln Ser Cys 85 90 95 Vnl Olu Leu Λερ Pro Ala Thr Vai Ala Gly Ilo Ilo Vai Thr Asp Vai 100 105 110 Aln .11 o Thr Lou Lou Lou Ala Leu Gly Vnl Pho Cys Pho Ala Oly His 115 120 125 Glu Thr Oly Arg Lou Sor Gly Ala Ala Acp Thr Gin Ala Leu Lou Arg 130 135 140 Λ311 Λορ Gin Vnl Tyr Olu Pro Lou Arg Acp Arg Asp Asp Ala Gin Tyr 145 150 155 160 Sor nin Lou Gly Oly Acn Trp Ala Arg Asn Ly s 165 170 -114 D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:25: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 182 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: amino ácido (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N®.:25:
Mot Olu Olu Oly Ly s Gly Lou Ala 5 Lou Olu 01 y Thr Lou Ala Gin Sor 20 Vnl Ty r Ar»p Ty r Oln Olu Acp Gly 35 40 Glu Ala Ly o Asn Ilo Thr Trp Pho 50 55 Lou Thr Olu Asp Ly s Ly o Ly s Trp 65 70 Pro Arg Oly Mot Ty r Oln Cy b Ly o 85 Lou Olu Vai Ty r Ty r Arg Mot Cy s 100 Ala Thr Ilo Ser Oly Phc Leu Pho 115 120 Lou Aln Vnl Oly Vnl Ty r Phe Ile 130 135 Ser Arg Aln Sor Acp Ly s Gin Thr 145 150 Olu Pro Lou Ly a Asp Arg Olu Asp 165 Aon Gin Lo»» Arg Arg Asn 180
Vai Lou 10 Ilo Leu Ala Ilo Ilo 15 Lou Ilo 25 Ly s Gly Asn Iiis Lou 30 Vai Lys Sor Vai Lou Leu Thr 45 Cye Asp Ala Ly n Acp Gly Lyo 60 Mot Ile Oly Pho Asn Lou Oly 75 Sor Asn Ala Lys Asp 80 Oly Sor 90 Oln Asn Ly s Sor Ly s 95 Pro Cln 105 Acn Cyc Ilo Olu Lou 110 Asn Ala Ala Olu Ilo Vai Sor 125 Ilo Pho Vai Ala Oly Oln Asp 140 Oly Vnl Arg Oln Lou Lou Pro 155 Asn Acp Oln Lou Tyr 160 Asp Oln Tyr 170 Sor His LOU Oln Oly 175 D-622 -JL-L3 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID N°.:26: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 220 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: amino ácido (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°.:26:
Mot Pro Gly Gly Lou Glu Aln Lou Arg Ala Lou Pro Lou Leu Lou Pho 5 10 15 Lou Sor Tyr Alo Cye Lou Gly Pro Gly Cya Gin Ala Lou Arg Vai Olu 20 25 30 Gly Gly Pro Fro Ser Lou Thr Vnl Asn Leu Gly Olu Olu Ala Arg Lou 35 40 45 Thr Cy a Glu Aon Aon 01 y Arg Asn Pro Asn Ilo Thr Trp Trp Pho Sor 50 55 60 Lou Gin Sor Asn Ilo Thr Trp Pro Pro Vai Pro Leu Gly Pro Gly Oln 65 70 75 80 Gly Thr Thr Gly Gin Lou Pho Pho Pro Glu Vai Asn Ly s Asn Thr Gly 85 90 95 Ala Cy o Thr Gly Cya Gin Vai Ilo Glu Asn Asn Ile Lou Lyo Arg Ser 100 105 110 Cy 7i Gly Thr Tyr Lou Arg Vai Arg Asn Pro Vnl Pro Arg Pro Pho Lou 115 120 125 Anp Mot Gly Glu Gly Thr Ly n Asn Arg Ilo Ilo Thr Ala Olu Oly Ilo 130 135 140 I lo Lou Lou Pho Cyo Aln Vai Vnl Pro Gly Thr Lou Lou Lou Pho Arg 165 150 155 160 Ly n Arg Trp Gin Asn Glu Ly o Pho Gly Vnl Asp Hot Pro Asp Asp Tyr 165 170 175 Glu A*p Olu Asn Lou Tyr Olu Gly Lou Asn Lou Asp Asp Cys Sor Mot 100 105 190 Ty r Glu Ar.p Ilo Sor Arg Gly Lou Gin Gly Thr Tyr Oln Asp Vai Oly 195 200 205 Aon Lou nin I lo Gly Asp Ala Gin Lou Glu Ly s Pro 210 2 15 220 τ116 D-622 INFORMAÇÃO SOBRE SEQ ID Na.:27: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 228 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) Hélice simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: amino ácido (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Na.:27:
Mot Aln Thr Lou Vai Lou Sor Sor Mot Pro Cy s nis Trp Lou Lou Pho 5 10 15 Leu Lou Lou Lou Pho Ser Gly Glu Pro Vnl Pro Aln Met Thr Ser Ser 20 25 30 Asp Lou Pro Lou Acu Pho Gin Gly Ser Pro Cys Sor Gin Ilo Trp Glu 35 40 45 His Pro Arg Phe Ala Aln Ly s Ly s Arg Sor Sor Mot Vai Lye Pho His 50 55 60 Cy a Tyr Thr Aon His Sor Oly Ala Lou Thr Trp Phe Arg Lyo Arg Oly 65 70 75 80 Sor Gin Olu Pro Oln Olu Lou Vnl Ser Glu Glu Gly Arg Ilo Vai Gin 05 90 95 Thr Oln Anu Oly Sor Vnl Tyr Thr Lou Thr Ilo Oln Asn Ilo Oln Tyr 100 105 110 Olu Asp Anu Oly Ilo Tyr PhQ Cyn Lys Gin Lys Cy s Asp Sor Ala Asn 115 120 125 His Asn Vai Thr Anp Sor Cy g Gly Thr Olu Leu Leu Vai Leu Gly Pho 130 135 140 S «χ· Thr Lou Anp Oln Lou Ly s Arg Arg Asn Thr Lou Lys Asp Oly Ilo 165 150 155 160 Ilo Lou Ilo Olu Thr Lou Leu Ilo Ilo Lou Pho Ilo Ilo Vai Pro Ilo 165 170 175 Fho Lou Lou Lou Asp Ly s Asp Λερ Oly Ly a Ala Gly Mot Glu Glu Asp 180 185 190 His Thr Ty r Olu Oly Lou Asn Ilo Asp Oln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp 195 200 205 Ilo Vnl Thr Lou Arg Thr Gly Clu Vnl Ly π Trp Sor Vai Gly Olu □is 210 215 220 Pro Oly Olu Olu 2 2.5

Claims (4)

  1. i D-622 -117-
    Λ ft\/r -RE \:\ V N D S - /lf. - Processo para orientar uma resposta celular para um agente infeccioso, para uma célula infectada com o referido agente, para um tumor ou para uma célula cancerosa, ou para uma célula gerada autoimunizada num mamífero, caracterizado por compreender a administração ao mamífero defuma quantidade eficaz de células terapêuticas, sendo as células capazes de reconhecerem e destruírem especificamente o referido agente ou a referida célula.
  2. 2*. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a resposta celular ser MHC-independente.
  3. 3*. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas células terapêuticas exprimirem um receptor quimérico proteico ligado à membrana, caracterizado por compreender (a) uma zona extracelular que é capaz de reconhecer e ligar especificamente o agente ou a célula e, (b) uma zona intracelular ou de transmembrana que é capaz de transmitir um sinal à referida célula terapêutica para destruir um agente ligado ao receptor ou uma célula ligada ao receptor.
  4. 4 *. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida zona intracelular ou zona de transmembrana ser D-622 -119- 7a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas células terapêuticas serem escolhidas do grupo que consiste em: (a) linfócitos T; (b) linfócitos T citotóxicos; (c) nkc "natural killer cells"; (d) neutrófilos; (e) granulócitos; (f) macrófagos; (g) "mast cells"; (h) HeLa cells; e (i) células indiferenciadas embrionárias (ES). 8a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido agente infeccioso ser um vírus de imunodeficiência. 9a. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a referida zona extracelular compreender uma zona de ligação ao invólucro HIV de CD4 ou um seu derivado funcional de ligação ao invólucro HIV. 10a. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido linfócito T citotóxico ser um linfócito T citotóxico CD8+. 11a. - Célula que exprime um receptor quimérico proteico D-622 -120- ligado à membrana, caracterizada por o referido receptor compreender (a) uma zona extracelular que é capaz de reconhecer e de ligar especificamente um agente infeccioso, uma célula infectada com o referido agente, um tumor ou uma célula cancerosa ou uma célula gerada autoimunizada e, (b) uma zona de transmembrana ou uma zona intracelular derivada de um receptor de célula T, de um receptor Fc ou de um receptor de célula B que é capaz de transmitir um sinal à referida célula para destruir um agente ligado ao receptor ou uma célula ligada ao receptor. 12a. - Célula de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a referida ligação ser MHC-independente. 13°. - Célula de acordo com a reivindicarão li, caracterizada por a referida proteína receptora ser í*, Ή , Y , CD3 delta, T3 gamma, mbl ou B29. 14a. - Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o referido receptor quimérico compreender amino ácidos: (a) amino ácidos 421-532 de SEQ ID NO: 6; (b) amino ácidos (a) 423-455; (b) 438-455; (c) 461- -494; (d) 494-528 de SEQ ID NO: 6; (c) amino ácidos 400-420 de SEQ ID NO: 6; (d) amino ácidos 421-575 de SEQ ID NO: 4; (e) amino ácidos (a) 423-455; (b) 438-455; (c) 461- -494; (d) 494-528 de SEQ ID NO:4; D-622 -121- (f) amino ácidos 400-420 de SEQ ID' NO: 5; (g) amino ácidos 421-462 de SEQ ID NO: 5; (i) amino ácidos 402-419 de SEQ ID NO:5; (j) amino ácidos Tyr282-' Tyr298 inclusive da Fig. 15A; (k) amino ácidos 132-171 da Fig . 16; (1) amino ácidos 140-182 da Fig . 17; (m) amino ácidos 162-220 da Fig . 18; (n) amino ácidos 183-228 da Fig . 19; ou (o) um seu fragmento citolitico de transdução de sinal. 15-. - Célula de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por as referidas células terapêuticas serem escolhidas de um grupo constituído por: (a) linfócitos T; (b) linfócitos T citotóxicos; (c) nkc "natural killer cells"; (d) neutrófilos; (e) granulócitos; (f) macrófagos; (g) "mast cells"; (h) HeLa cells; e (i) células indiferenciadas embrionárias (ES). 16«. - Célula de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a zona extracelular compreender uma zona de ligação ao invólucro HIV de CD4 ou um seu derivado funcional de ligação D-622 -122-
    ao invólucro HIV. 17a. - Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o referido linfócito T citotóxico ser um linfócito T citotóxico CD8+. 18a. - Célula de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a referida zona extracelular ser uma molécula de imunoglobulina ou um seu fragmento de ligação antigene. 19a. - ADN caracterizado por codificar um receptor quimérico de acordo com a reivindicação 11. 20a. - Vector caracterizado por compreender o ADN receptor quimérico de acordo com a reivindicação 19. / 21a. - Processo para o tratamento de uma infecção de vírus de imunodeficiência, caracterizado por compreender a administração a um mamífero da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 16. 22a. - Anticorpo substancialmente puro, caracterizado por reconhecer e ligar especificamente um receptor quimérico de acordo com a reivindicação 1. D-622 -123- A requerente declara haver depositado o primeiro pedido desta patente em 7 de Março de 1991, nos Estados Unidos da América, sob o ns. 07/665.961.
    /
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