JPH06509462A - レセプターキメラ体による細胞性免疫の再設定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （「）マクロファージ、 （ｇ）肥ｌシ細胞、 （ｈ）ヘラ細胞、および （＋）胎児幹細胞（Ｅ　Ｓ） から成る群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。

８、　前記の感染因子が免疫不全症ウィルスである、請求の帖囲第１項に記載の 方法。

９、　前記の細胞外部分か、ＣＤ４のＨＩＶエンベロープ結合部またはその機能 性ＨＩＶエンベロープ結合部誘導体である、請求の範囲第８項に記載の方法。

１０　前記の細胞障害性Ｔリンパ球かＣＤ８＋細胞障害性Ｔ　ＩＪリンパ球ある 、請求の範囲第９項に記載の方法。

１１　タンパク質性膜に結合したキメラレセプターを発現する細胞であって、前 記のレセプターが、（ａ＞感染内「−１感染因ｒに感染した細胞、腫瘍若しくは 癌性細胞、または自己免疫によって生した細胞を特異的に認識し、結合すること かできる細胞外部分と、（ｂ）前記の細胞にシグナルを送り、レセプターに結合 した因子またはレセプターに結合した細胞を破壊することができるＴ細胞レセプ ター、ＦｃレセプターまたはＢ細胞レセプターに由来する細胞内部分またはトラ ンスメンブラン部分とから成る、細胞。

１２、　前記の結合がＭＨＣから独立している、請求の範囲第１１項に記載の細 胞。

１３、　前記のレセプタータンパク質がζ、η、γ、Ｃ，Ｄ３デルタ、Ｔ３ガン マ−１ｍｂｌまたはＢ２９である、請求の範囲第１１項に記載の細胞。

１４、　前記のキメラレセプターが、 （ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸４２１〜５３２、（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：６のアミノ酸４２３〜４５５．４３８〜４５５．４６１〜４９４または ４９４〜５２８、（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸４００〜４２０、（ ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４のアミノ酸４２１〜５７５、（ｅ）ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ＋４のアミノ酸４２３〜４５５．４３８〜４５５．４６１〜４９４または４ ９４〜５２８、（ｒ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の７ミ／酸４００〜４２０、（ｇ ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋５のアミノ酸４２１〜４６２、（ｈ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：５のアミノ酸４０２〜４１９、（＋）第１５Ａ図のアミノ酸Ｔ　ｙ　ｒ　２ ８２〜Ｔｙ　ｒ　２９８、（Ｄ第１６図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）のアミノ 酸１３２〜１７１、 （ｋ）第１７図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）のアミノ酸１４０〜１８２、 （１）第１８図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）のアミノ酸１６２〜２２０、 （ｓ）第１９図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）のアミノ酸１８３〜２２８ のアミノ酸から成る、請求の範囲第１３項に記載の細胞。

１５、　前記の治療細胞が、 （ａ）　Ｔリンパ球、 （ｂ）細胞障害性１９２６球、 （ｃ）ナチュラルキラー細胞、 （ｄ）好中性球、 （ｅ）顆粒細胞、 （ｆ）マクロファージ、 （ｇ）肥満細胞、 （ｈ）ヘラ細胞、および （１）胎児幹細胞（Ｅ　Ｓ） から成る群から選択される、請求の範囲第１１項に記載の細胞。

１６、　前記の細胞外部分が、ＣＤ４のＨＩＶエンベロープ結合部またはその機 能性ＨＩＶエンベロープ結合部誘導体である、請求の範囲第１１項に記載の細胞 。

１７、　前記の細胞障害性１９２６球が、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球である 、請求の範囲第１６項に記載の細胞。

１８、　前記の細胞外部分が、免疫グロブリン分子またはその抗原結合性フラグ メントである、請求の範囲第１１項に記載の細胞。

１９、　請求の範囲第１１項に記載のキメラレセプターをコードするＤＮＡ０ ２、特許請求の範囲第１９項に記載のキメラレセプターＤＮＡを含んで成るベク ター。

２１、　哺乳類に請求の範囲第１６項に記載の宿主細胞を投与することを特徴と する、免疫不全ウィルス感染症の治療法。

２、特許請求の範囲第１１項に記載のキメラレセプターを特異的に認識して、結 合する、実質的に純粋な抗体。

明　細　書 レセプターキメラ体による細胞性免疫の再設定発明の分野 本発明は、免疫系の機能を再設定することができる機能性Ｔ細胞レセプター、Ｆ ｃレセプターまたはＢ細胞レセプターに関する。更に詳細には、本発明は、キメ ラ体の、リンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞または顆粒球におけ る発現によってこれらの細胞を制御し、これらの細胞にキメラ体によって認識さ れる標的に対する応答を起こさせることに関する。本発明は、機能性Ｔ細胞レセ プター、ＦｃレセプターまたはＢ細胞レセプターキメラ体であって、治療細胞に 、特異的な感染性因子に感染した細胞、感染性因子自身、腫瘍細胞または自己免 疫によって生じる細胞を特異的に認識させて破壊させることができるものにも関 する。更に詳細には、本発明は、細胞障害性１９２６球に、ＨＩＶエンベロープ タンパク質を発現する細胞を特異的に認識させ、溶解させることができるＴ細胞 レセプターまたはＦｃレセプターキメラ体の生産に関する。したがって、本発明 は、ＨＩＶウィルスによって引き起こされるＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群） のような疾患の治療法を提供するものである。

発明の背景 Ｔ細胞レセプターによりＴ細胞が抗原を認識することは、ある領域における免疫 学的現象の基礎である。Ｔ細胞は、細胞性免疫と呼ばれるものを制御する。これ には、異種組織または感染細胞の免疫系の細胞による破壊が挙げられる。免疫応 答を調節する「ヘルパー」および「サプレッサー」細胞や異常細胞を直接的に殺 すことができる細胞障害性（または「キラー」）細胞のような各種のＴ細胞が存 在する。

別の細胞の表面上に示される特異抗原を認識して結合するＴ細胞か活性化した後 、増殖することができ、これか細胞障害性細胞である場合には、これは結合した 細胞を殺すことができる。

自己免疫疾患は、宿主組織と反応する抗体または自動反応性である免疫エフェク ターＴ細胞を産生ずることを特徴とする。場合によっては、体組織中の同様な化 合物と交差反応する抗原を含む異種物質または生物によって活性化される正常な ＴおよびＢ細胞応答によって自己抗体が生しることがある。臨床的に関連性のあ る自己抗体の例は、重症筋無力症におけるアセチルコリンレセプターに対する抗 体、および全身性エリテマトーデスにおける抗ＤＮＡ、抗赤血球および抗血小板 抗体である。

ＨＩＶおよび免疫病原性 １９８４年に、ＨＩＶはＡＩＤＳの病因物質であることが明らかにされた。それ 以来、ＡＩＤＳの定義は、どのような判定基準を診断に包含させるべきかという ことに関して幾度も変更されてきた。しかしながら、診断パラメーターは様々に 変動してきたが、ＡＩＤＳの単純な共通している基準はＨＩＶによる感染とそれ に続く一貫した体質的な症状および二次感染症、新生物および神経疾患のような ＡＩＤＳを画定する疾患の展開である。

１１ａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍ ｃｄｌｃｉｎｅ、　１２版、マノフグロウ・ヒル（１９９１年）。

ＨＩ　Ｖはレンチウィルス群のヒトレトロウィルスである。４種類の認知された ヒトレトロウィルスは、２種類の異なる群に属する。ヒトＴリンパ球親和性（ま たは白血病）レトロウィルス、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、およびヒト免 疫不全症ウィルス、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２゜前者は形質転換ウィルスであ り、後者は細胞変性ウィルスである。

ＨＩＶ−１は、世界中におけるＡＩＤＳの最も一般的な起因菌として同定されて いる。ＨＩＶ−２とＨＩＶ−１との間の配列の相同性は約４０％であり、ＨＩＶ −２はサル免疫不全症ウィルス（ＳＩＶ）の群の幾つかの方に一層緊密に関連し ている。Ｃｕｒｒａｎ、　Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ。

３２９：　１３５７−１３５９　（１９８５）；　冒ｅｉｓｓ、　Ｒ，ら、Ｎａ ｔｕｒｅ、　３２４：５７２−５７５　（１９８６）。

ＨＩ　Ｖは、ウィルスの複製および他の生物学的活性に関与した６個の追加の遺 伝子の外に、通常のレトロウィルス遺伝子（ｅ　ｎ　ｖ、　ｇ　ａ　ｇおよびｐ ｏｔ）を有している。前記のように、ＡＩＤＳに共通の特徴は、主に細胞によっ て媒介される免疫力の著しい免疫抑制である。この免疫抑制により、様々な日和 見的疾患、特にある種の感染症および腫瘍が起きる。

ＡＩＤＳにおいて免疫が欠損することのおもな原因は、胸腺由来の（Ｔ）リンパ 球のサブセット、１４個体数における定量的および定性的欠損として同定されて いる。

この細胞のサブセットは、ＨＩＶの細胞レセプターであることが示されているＣ Ｄ４表面分子の存在により表現形で定義される。Ｄａｌｇｌｅｉｓｈら、Ｎａｔ ｕｒｅ、　３１２：　７８３（１９８４）。Ｔ４細胞はＨＩＶに感染した主要な 細胞種であるか、表面でＣＤ４分子を発現する本質的に総てのヒト細胞がＨＩＶ に結合して、感染することができる。

伝統的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞にはヘルパー／インデューサーの役割が割り当てら れ、それらの機能はＢ細胞に活性化シグナルを供給し、または相互ＣＤ８マーカ ーを有するＴリンパ球を細胞障害性／サプレッサー細胞とすることであることが 示されている。Ｒｅ１ｎｈｅｒｚおよびＳｃｈ　ｌ　ｏｓｓｏ＋ａｎ、Ｃｅ１ｌ 、　１９：　８２１−８２７　（１９８０）；　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ら、Ｉｎ ｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、、　６８：　５−４２　（１９Ｂ）。

ＨＩＶは、ウィルスエンベロープのアミノ酸の伸張部（ｇｐ１２０）を介してそ のＮ−末端付近に位置するＣＤ４分子のＶ１領域の一部に特異的且つ高い親和性 で結合する。結合の後、ウィルスは標的細胞膜と融合し、インターナライズする 。一旦、インターナライズしたならば、ウィルスは酵素、逆転写酵素、を用いて そのゲノムＲＮＡをＤ　Ｎ　Ａに転写し、これが細胞ＤＮＡに組み込まれて、生 活し続けまたは「プロウィルス」としての細胞のために存在する。

このプロウィルスは潜伏したままであることかあり、または活性化してｍＲＮＡ およびゲノムＲＮＡを転写してタンパク質合成、アッセンブリ、新規なピリオン 形成、および細胞表面からのウィルスの発芽へと至ることもある。ウィルスか細 胞死を誘発する正確な機構は解明されていないか、主要な機構は細胞表面から多 量のウィルスが発芽して、血漿膜を破壊し、浸透圧を不安定にすることであると で、われる。

感染の経過中に、宿主生物は、主要なエンベロープ糖タシパク質ｇｐ１２０およ びｇｐ４１を含むウイルスタンベク質に対する抗体を発現する。この体液性免疫 にも拘らず、疾患は進行して、複合日和見感染症、寄生虫血症、痴呆および死を 特徴とする致死的免疫抑制を生しる。

宿主の抗ウイルス抗体によって疾をの進行を押さえることかできないことは、こ の感染症の最も論議されており且つ心配な側面の一つを表わしており１、従来の 方法に基つくワクチン法には見通しか暗い。

免疫不全症ウィルスに対する体液性応答の効力には、２つの要因か関与すること かある。第一に、他のＲＮＡウィルスと同様に（特に、レトロウィルスと同様に ）、免疫不全症ウィルスは宿主の免疫サーベイランスに応じて高い突然変異率を 示す。第二に、エンベロープ糖タンパク質自身は高度にグリコジル化された分子 であり、高親和性結合に好適なエピトープは少ない。ウィルス性エンベロープか 示す標的の抗原性が余り高くないため、宿主は特異的抗体産生によりウィルス感 染を制限する機会はほとんどない。

ＨＩＶウィルスに感染した細胞は、その表面上にｇｐ１２０糖タンパク質を発現 する。ｇｐ１２０は、ウィルスが未感染細胞に入り込む反応と同様な反応によっ てＣＤ４　細胞内での融合を媒介し、寿命の短い多核巨細胞を形成するようにな る。シンシチウムの形成は、ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質とＣＤ４タン パク質との直接的相互作用によって変化する。［）ａｌｇｌｅｉｓｈら、上記文 献；　ＫｌａｔＺｍａｎ、　Ｄ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１２：　７６３　（１ ９８４）；ＭｃＤｏｕｇａｌ、　Ｊ、Ｓ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３１：　３ ８２　（１９８Ｂ）；５ｏｄｒｏｓｋｉ、　Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２２： 　４７０　（１９８Ｂ）；　Ｌｉｒｓｏｎ。

ＪＤ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２３：　７２５　（１９Ｈ）；　５ｏｄｒｏｓｋ ｉ、　Ｊ、ら、〜ａｔｕｒｅ、　３２１：　４１２　（１９８［ｉ）。

ＣＤ４−ｇｐ１２０結合がＣＤ４抗原を有する細胞のウィルス感染に関与してい るという証拠には、特異的複合体がｇｐ１２０とＣＤ４との間に形成されるとい う知見が挙げられる。ＭＣＤＯｕｇａｌら、上記文献。他の研究者らは、ＨＩＶ に対して非感染性である細胞ラインが、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡ遺伝子トランスフエ クシヨンおよび発現の後に感染性細胞ラインに転換したことを示している。

Ｍａｄｄｏｎら、Ｃｅ１ｌ、４６：　３３３−３４８　（１９８Ｂ）。

ウィルス吸着やシンンチウムによって媒介される細胞伝達を妨げる受動因子とし ての可溶性ＣＤ４に基づく治療法が多数のグループによって提案され、イン・ビ トロで成功しく　Ｄｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３２１：　８２−８４　（１ ９Ｎ）；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：　７Ｇ−１８（ｌＨ８）；　 Ｈｕｓｓｅｙ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：　７８−８１　（１９８８）；　Ｓ ｍ１ｔｈら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３８：１７０４−１７０７　（１９８７）；　 Ｔｒａｎｓｎｅｃｋｅｒ　ら　、　Ｎａｔｕｒｅ、３３１：　８４−８６　＜１ ９８８）　）　、続いて半減期が伸び且つ適度な生物活性を有す５ＣＤ４免疫グ ロブリン融合タンパク質が開発された（　Ｃａｐｏｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３ ３７：　５２５−５３１　（１９８９）；Ｔｒａｎｓｎｅｃｋｅｒ　ら　、　Ｎ ｒ、ｔｕｒｅ、３３９．　ａｌｌ−７０（１９８９）；　Ｂｙｒｎ　ら、Ｎａｔ ｕｒｅ、３４４：　８Ｇ７−８７０　（１９９０）；　Ｚｅｔｔｌａ＋ｅｉｓｓ ｌら、ＤＮ＾Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　９：　３４７−３５３　（１９９０）　 ）。

ＣＤ４免疫毒素抱合体または融合タンパク質は、イン・ビトロで感染細胞に対し て強力な細胞毒性を示すか（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３５ ：　３６９−３７２　（１９８ｇ）；　Ｔｉ１ｌら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４２ ：　１１６６−１１６８　（１９８ｇ））　、免疫不全症候群は潜伏するので、 いずれかの単一処理による療法がウィルスの負荷を除去するのに有効であるとは 思われず、異種融合タンパク質の抗原性により反復投与を必要とする処理おける 許容度が限定されるものと思われる。

ＳＩＶに感染したサルでの試験では、可溶性ＣＤ４は、著しいＣＤ４血球減少な しに動物に投与すると、ＳＩＶタイターを減少させ、骨髄ポテンシャルのイン・ ビトロの尺度を向上させ得ることが示されている（　Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎａ ｔｕｒｅ、　３３７：　２６７−２７０　（１９８９）　）　、しかしながら、 処理を中断すると、ウィルスが速やかに再度出現することが観察されており、漸 進的な免疫系の衰弱を防止するには一生涯服用し続ける必要があることを示唆し ている。

■細胞およびＦｃレセプター Ｔ細胞抗原レセプター（Ｔ　ＣＲ）の最も多量に存在する形態の細胞表面での発 現には、少な（とも６種類の異なるポリペプチド鎖が同時発現することが必要で ある（　Ｗｅｉｓｓ　ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１８０：　１２８４− １２９９　（１９８４）；０ｒｌｏｒｒｈａｓｈｉ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３１ ６：　ＢＯＢ−６０９（１９８５）；Ｂｅｒｋｈｏｕｔら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｓ、、２８３＋　８５Ｈ−８５３６（１９８ｇ）；Ｓｕｓｓｍａｎら、Ｃｅ ｌ　ｌ　、　５２：　８５−９５　（１９８８））　ａ　／β抗原結合鎖、ＣＤ ３ＦＭ合体の３８！のポリペプチド、およびζ。これらの鎖のいずれかかなけれ ば、この複合体の残りの部分の安定な発現は起こらない。ζは完全な複合体の表 面発現のための制限ポリペプチドであり（５ｕｓｓｖａｎら、Ｃｅ１ｌ、　５２ ：　８５−９５　（１９８８））　、リガンドのレセプター認識により誘発され る細胞活性化プログラムの少なくとも１両分を媒介すると考えられる（　Ｗｅｌ ｓｓｍａｎら、ＥＭＢＯ）、５８：　３６５１−３６５６　（１９８９）；　Ｆ ｒａｎｋら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４９：　１７４−１７７　（１９９０））　、 　３２　ｋ　Ｄ　ａのＩ型内在性膜ホモニ量体であるζ（ラニーター或いはゼー タ）には、Ｎ−結合グリカン付加の部位を持たない９残基の細胞外ドメインと、 １１２残基（マウス）または１１３残基（ヒト）の細胞内ドメインがある（　Ｗ ｅｉｓｓｉａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３ｇ＋　１０１８−１０２０　（１９ ８８ａ）：　Ｗｅｉｓｓｗａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８５：　９７０９−９７１３　（１９８８ｂ））。η（エータ−）と 呼ばれるこのイソν１１　（Ｂａｎ１ｙａｓｈら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、、　２６３：９８７４−９８７８　（１９８ｇ）　：　０ｒｌｏｆＩら、Ｊ、 Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２６４：１４８１２−１４８１７　（１９８９）　）で あって、交互ｍＲＮＡスプラインング経路から生しるもの（Ｊｌｎら、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８７：　３３１９−３２３３　（１９９０）） は、抗原レセプターを発現する細胞中に少量含まれている。ζ−ηヘテロニ量体 は、イノントールリン酸の形成並びにアポブドーシスと呼ばれるレセプターで開 始されるプログラムされた細胞死を媒介すると考えられる（　Ｍｅｒｃｅｐら、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２４２：　５７１−５７４　（１９８８）＋　Ｍｅｒｃｅｐら 、５ｃｉｅｎｃｅ。

２４６：　１１６２−１１［Ｈ５（１９８９）　）。

ζおよびηと同様に、Ｆｃレセプターに関連したγ鎖は付加的ポリペプチドとの 細胞表面複合体で発現し、その幾つかかりガント認工を媒介し、他のものは不確 定機能を有する。γ（ガンマ）は、ζに極めて類似したホモ二量体構造と全体的 構成を有し、肥満細胞／好塩基性細胞高親和性１ｇＥレセプター、ＦｃεＲ１で あって少なくとも３本の異なるポリペプチド鎖がら成るもの（＋３１ａｎｋ　ら 、Ｎａｔｕｒｅ、　３３７：　［１７−１８９（１９８９）；　Ｒａ　ら、Ｎａ ｔｕｒｅ、　２４１：　７５２−７５４　（１９８９）　）と、マウスではＦｃ ７ＲＩＩａと表わされ（ｆ？ａら、Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｔｓ、。

２６４：　１５３２３−１５３２７　（１９８９）　）　、ヒトではマクロファ ージおよびナチュラルキラー細胞によるＣＤ１６サブタイプ発現、ＣＤ１６ＴＭ （ＣＤ１６トランスメンブラン）と表わされ（Ｌａｎｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、 　３４２：　８０３−８０５　（１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８７：　２２７４−２２７８　（１９ ９０）　）　、機能が同定されていないポリペプチドを有する（Ａｎｄｅｒｓｏ ｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ。

８７：　２２７４−２２７８　（１９９０））　Ｉ　ｇ　Ｇに対する低親和性レ セプターの一つのいずれもの成分である。最近になり、γはマウスＴ細胞ライン ＣＴＬによって発現され、ホモ二量体並びにγ−ζおよびγ−ηヘテロニ量体を 形成することが報告されている（Ｏｒｌｏｆｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４７：　 １８９−１９１（１９９０））。

Ｆｃレセプターは免疫複合体の食作用、トランスサイトーシスおよび抗体依存性 細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する（　ＲａｖｃｔｃｈおよびＫｉｎｃｔ、　Ａｎ ｎｕ、　ｔ？ｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　９：４５７−４９２　（１９９１） ：　じｎｋｃｌｃｓｓら、　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｉ■ｕｎｏ１．、Ｇ：２５１− ２８１　（１９８８）；及びＭｅｌｌｓａｎ、　Ｃｕｒｒ、　０ｐｉｎ、　ＩＩ ｌｍｕｎｏｌ、。

１：　１Ｂ−２５（１９８ｇ）　）。最近になり、ネズミの低親和性ＦＣレセプ ターイソ型の一つ（ＦｃＲγＩＩＩＢＩ）はＩｇをコーティングした標的のクラ スリンをコーティングした核へのインターナリゼーションを媒介し、もう一方の 低親和性レセプター（ＦｃｒγＩＩＩＡ）は「トリが一分子」の小さな単位の１ 以上の成員との関連によりＡＤＣＣを媒介することが示されている（旧ｅｔｔｉ ｎｅｎら、Ｃｅ１ｌ、　５８：　３１７−３２７　（１９８９）；およびＨｕｎ ｚｉｋｅｒおよびＭｅｌｌｓａｎ、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　旧ｏｆ、、１０９：　３２９ １−３３０２　（１９８９）　）　。

これらのトリが一分子であるＴ細胞レセプター（Ｔ　ＣＲ）、ζ鎖、ＴＣＲη鎖 およびＦｃレセプターγ鎖は、異なる免疫系レセプターのリガンド認識ドメイン と相互作用し、集合の後に、細胞溶解のような細胞エフェクタープログラムを自 立的に開始することができる（ＳａｒＡｅｌｓｏｎら、Ｃｅ１１．４３：　２２ ３−２３１　（１９８５）；　Ｗｅｌｓｍａｎ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９ ：　１０１８−１０２０　（１９８８）＋　Ｊｉｎ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８７：　３３１９−３３２３　（１９９０）；　Ｂｌａｎｋら、Ｎａｔ ｕｒｅ、３３７：１８７−１８９　（１９８９）ＨＬａｎｃｅｒら、Ｎａｔｕｒ ｅ、３４２：　８０３−８０５（１９８９）；　ＫｕｒｏｓａｋｉおよびＲａｖ ｅｔｃｈ　、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４２：　８０５−８０７　（１９８９）、ｔ ｌｉｂｂｓら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４６：　１６０８−１６１１（１９８９）： 　Ａｎｄｃｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．　ＵＳＡ、８ ７：　２２７４−２２７８　（＋９９０）；　およびｌｒｖｉｎｇおよびＷｅｉ ｓｓ　、　Ｃｅ１ｌ、６４・８９１−９０１　（１９９１））。

しかしながら、ネズミおよびヒトの低親和性Ｆｃレセプター類を比較したところ 、ヒトＦｃＲγＩＩＡとＣイソ型にはネズミの対応物がないことが明らかになっ た。

一部はこのために、それらの機能は未だ画定されていない。

ＣＤ４に基づく体液性因子によりイン・ビボでの有用性が制限されることがある ので、本発明者らはＨＩＶに対する細胞性免疫の増加の可能性について検討を開 始した。その結果、本発明者らは、タンパク質キメラ体の調製であってＣＤ４の 細胞外ドメインをＴ細胞レセプター、ＩｇＧＦｃレセプターまたはＢ細胞レセプ ターシグナル形質導入要素のトランスメンブランおよび／または細胞内ドメイン に融合することを特徴とする調製を報告する。

細胞外ＣＤ４ドメインを含むキメラ体を発現する細胞溶解性Ｔ細胞は、ＨＩＶエ ンベロープタンパク質を発現する細胞標的の、強力なＭＭＣとは無関係の破壊を 示す。

この方法の極めて重要且つ新規な成分は、単−丁細胞しセブター、またはＦｃレ セプターおよびＢ細胞レセプター鎖であって、その集合が細胞の応答を開始する のに十分であるものを同定することであった。

この方法の一つの特に有用な応用は、細胞溶解性Ｔリンパ球にＨＩＶｇｐ１２０ を発現する細胞を認識させて殺すＣＤ４とζ、ηまたはガンマ−との間のキメラ 体の発明であった。

発明の要約 天然のＴ細胞、Ｂ細胞およびＦｃレセプターは、極めて複雑に多重結合した構造 をしており、操作に好都合ではないことかあるが、本発明は、標的の認識という 仕事を果たすことかできる様々な分子の任意のものの分子内ドメイン間てキメラ 体を作成することができることを明らかにする。特に、適当に設計された抗体分 子の分子外部分に結合したＴ細胞／　Ｆ　ｃレセブターツェーター、エータ−ま たはガンマ−鎖の分子内部分から成るキメラ体を形成することによって、免疫系 の標的認識力を細胞外抗体部分によって認識される抗原に特異的に再設定するこ 古かできる。したか−）で、病原体の表面上のある種の決定基を認識することか できる抗体部分を用いれば、キメラ体を備えている免疫系細胞はその配列に適す るエフＪクタープロクラムをｆ了する病原体の存在に応答し、例えばヘルパー下 リンパ球は標的に対する細胞障害活性によって応答し、Ｂリンパ球は活性化され て抗体を合成するようになる。マクロファージと顆粒球は、サイトカイシの放出 、食細胞および反応性酸素の発生などのエフエクタ−ブ【］クラｌ、を１ｊう。

同様に、腫瘍細胞を認識することかできる抗体部分ては、腫瘍に対する免疫系応 答は功！的に４二脣する。“」己決定基と不適当な反応性を有するＱ　＋−ｚ細 胞を認識ずＳことかできる抗体では、自動反応性細胞を選択的に標的設定して破 壊することができる。

これらの例は好都合な説明の道具として抗体キメラ体を用いたものによっている が、本発明は抗体キメラ体に範囲を限定するものではなく、実際に、特異的な非 抗体細胞外ドメインを用いることが極めて有利であることもある。例えば、ウィ ルス、細菌または寄生虫のレセプターである細胞外部分では、キメラ体を備えた 細胞はウィルス、細菌または寄生虫決定基を発現する細胞を特異的に標的とする 。抗体を使用することに比較してこの方法が有利である点は、病原体に対する天 然のレセプターは病原体に対して傑出した高選択性または親和性を有することが あり、得られる免疫応答の精度が高いことである。

同様に、自己抗原と不適当に反応する免疫系細胞を欠失させるには、（Ｂ細胞欠 失療法の場合には完全なタンパク質のような、またはＴ細胞欠失療法の場合には ＭＢＣ複合体のような）抗原を細胞内ラニーター、エータ−またはガンマ−鎖に 結合させることによって、自己決定基に不適当に応答する細胞の特異的標的設定 に影響を与えるだけで十分であることがある。

キメラ体のもう一つの用途は、他の形態の遺伝子工学の後にイン・ビボでの細胞 の個体数を制御することである。例えば、腫瘍に浸潤するリンパ球又はナチュラ ルキラー細胞を用いて細胞障害性因子を腫瘍部位に運ぶ方法が提案されている。

本発明は、これらのリンパ球および細胞を患者の体内から取り出してイン・ビト ロで増幅することなくこれらの数および活性を制御する好都合な手段を提供する 。例えば、キメラレセプターの細胞内ドメインは細胞の増殖性応答を媒介するの で、細胞外ドメインに特異的な各種の統合的刺激（例えば細胞外ドメインに特異 的な抗体）により細胞外ドメインを配位することによってキメラ体を有する細胞 を増殖する。

本発明の具体的な態様はラニーター、エータ−またはガンマ−鎖の間に又はこれ らの活性断片の間にキメラ体を有するが、例えば顆粒球または８９２８球におけ るこれらの分子と同様な機能を有する任意のレセプター鎖を用いて本明細書に開 示される提案を行うことができる。

所望な免疫細胞トリガー分子の顕著な特徴は、自律的に（すなわち、−木鎖とし て）発現することができること、細胞外ドメインに融合して生成するキメラが治 療細胞の表面に含まれるようにすることができること、および標的リガンドとの 遭遇に続く集合の際に細胞エフェクタープログラムを開始することができること である。

現在のところ、キメラ体を免疫系細胞へ伝達する最も好都合な方法は、ある種の 遺伝子療法によるものである。

しかしなから、キメラ体レセプターをＨする免疫系細胞を適当に可溶化し精製し たキメラタンパク質と混合することによるこの細胞の再構成では、キメラ体の細 胞外ドメインによって認識される標的に応答することができる遺伝子操作を行っ た細胞群も形成される。同様な方法を、例えば完全なＨＩＶレセプター、ＣＤ４ を赤血球に導入して治療が行われている。この場合には、遺伝子操作を行った細 胞個体群は自己再生を行うことができない。

本発明は、機能的な単純化したＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターおよびＦｃ レセプターキメラ体であって免疫系の機能を再設定することができるものに関す る。

更に詳細には、本発明は、リンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞ま たは顆粒球中でキメラ体を発現させ、これらの細胞がキメラ体によって認識され る標的に応答するようにすることによりこれらの細胞を制御することに関する。

本発明は、細胞性応答を感染性因子、腫瘍または癌性細胞、または自己免疫によ って生じた細胞に向ける方法にも関する。哺乳類における細胞性応答を指示する 方法は、この哺乳類に治療細胞の有効量を投与し、この細胞が前記の感染性因子 、腫瘍、癌細胞または自己免疫によって生した細胞を認識して破壊することがで きるようにすることから成る。

もう一つの態様では、細胞性応答を感染性因子に向ける方法は、この因子を認識 して破壊することができる治療細胞を投与することからなり、ここで因子は特異 的ウィルス、細菌、原生動物またはカビである。更に具体的には、この方法はＨ ＩＶおよびＰｎｅｕｓｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｌのような因子に対して向 けられる。

具体的には、本発明はＨＩＶに感染した細胞に対する細胞性応答を指示する方法 を提供する。この方法は、細胞障害性１９２６球の有効量を患者に投与すること からなり、このリンパ球はＨＩＶに感染した細胞を特異的に認識して溶解するこ とができることを特徴とするものである。

したがって、一つの態様では、本発明によればＨＩＶに感染した細胞に対して細 胞性応答させる方法であって、患者にＨＩＶに感染した細胞を特異的に認識して 溶解することかできる細胞障害性１９２６球の有効量を投与することから成る方 法か提供される。

更にもう一つの態様では、細胞障害性１９２６球にＨＩＶに感染した細胞を認識 させて溶解させるキメラレセプタータンパク質か提供される。更にもう一つの本 発明の態様は、キメラレセプターを含んで成るベクターで形質転換した宿主細胞 から成る。

更にもう一つの態様では、本発明は、本発明のキメラレセプターに対する抗体を 提供する。

ＨＩＶに感染した細胞に特異的に結合して溶解する細胞障害性下リンパ球を得る ために、本発明者らはレセプターキメラ体を試みた。これらのキメラレセプター は機能的に活性であり、ｇｐ１２０を発現する細胞に特異的に結合して溶解する ことかできる顕著な能力を有する。

次に、本発明の［−１的は、ＨＩ　Ｖに感染した患者の治療法を提供することで ある。したがって、本発明はＡＩＤＳの療法に多くの重要な進歩を提供する。

本発明のこれらおよび他の非制限的態様は、下記の本発明の詳細な説明から当業 者には明らかになるであろう。

下記の詳細な説明では、分子生物学および免疫学の分野における技術者に知られ ている各種の方法論を参照する。参照する既知の方法論に記載されている刊行物 および他の材料は、それらを全部完全に記載されているものとして本明細書に開 示の一部として引用するものである。

組換えＤＮＡ技術の一般的原理を記載している標準的な参考書には、Ｗａｔｓｏ ｎ、　Ｊ、Ｄ、ら、「遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ）、Ｊ第１および１１巻・ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍｉ ｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、出版 社、メン口・パーク、カリフォルニア州（１９８７年）；Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ 、Ｅ、ら、「分子細胞生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ） Ｊ　、５ｅｊｃｎｔｉｒｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｉｎｃ、出版 社１ニユーヨーク、ニューヨーク州（１９８６年）；Ｌｅν１ｎ。

Ｂ、Ｍ、　、ｒ遺伝子１１　（Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ）Ｊ　、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｃｙ 　＆５ｏｎｓ出版社、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８５年）　；　Ｏｌ ｄ、　ＲＪ、ら、［遺伝子操作の原理。

遺伝子工学入門（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｒＧＣｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉ ｏｎ：Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅ ｅｒｉｎｇ）Ｊ　％　第　２版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｒＣａｌｉｒｏｒｎ ｉａ　Ｐｒｅｓｓ出版社、バークレイ、カリフォルニア州（１９８１年）　；　 Ｍａｎｌａｔｌｓ、　Ｔ、ら、［分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ第２版、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ出版社、コールド ・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州（１９８９年）；及び「分子生物学に おける最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）ＪＡｕｓｕｂｅｌ　ら、ｌ／１ｌｅｙ　Ｐｒｅｓｓ 　ｓ−ニー　Ｅ−り、ニューヨーク州（１９８９年）が挙げられる。

定義 「クローニング」とは、ベクター分子へ特定の遺伝子または他のＤＮＡ配列を挿 入するイン番ビトロでの組換え技術の使用を意味する。所望な遺伝子のクローニ ングを成功させるためには、ＤＮＡフラグメントを生成させてこのフラグメント をベクター分子に結合させる方法、複製することができる宿主細胞に複合ＤＮＡ 分子を導入する方法、および感受性のある宿主細胞の中から標的遺伝子を有する クローンを選択する方法を用いる必要がある。

ｒｃＤＮＡＪとは、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用に よってＲＮＡ鋳型から産生される相補的またはコピーＤＮＡを意味する。したが って、ｒｃＤＮＡクローン」とは、クローニングベクター中で行われる目的のＲ ＮＡ分子に相補的な二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。

ｒｃ　ＤＮＡライブラリー」とは、ｃ　ＤＮＡライブラリーが作成される時点て 細胞によって発現されるｍＲＮＡのＤＮＡコピーを有するｃＤＮＡインサートを 含む組換えＤＮＡコピーのコレクションを意味する。このようなｃＤＮＡライブ ラリーは、当業者に知られている方法によって作成することができ、例えばＭａ ｎｉａｔｌＳら、［分子りＣＦ　−ニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｆｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ　、上記引用、に 記載されている。

一般的には、最初に、ゲノムから特定の遺伝子をクローニングすることが所望な 生物の細胞がらＲＮＡを単離する。本発明の目的に好ましいものは哺乳類、特に ヒトのリンパ球細胞ラインである。この目的に現在のところ好ましいベクターは 、ワクシニアウィルスＷＲ株である。

「ベクター」とは、例えばＤＮＡのフラグメントをインサートまたはクローニン グすることができるプラスミド、バクテリオファージまたは哺乳類若しくは昆虫 のウィルスに由来するＤＮＡ分子を意味する。ベクターは１個以上のユニークな 制限部位を有し、定義された宿主または媒体生物中で自律複製を行い、クローニ ングされる配列が再現性を有するようにすることができる。したがって、ｒＤＮ Ａ発現ベクター」とは、組換えペプチドの合成を命令することができる任意の自 律要素を意味する。

このようなりＮＡ発現ベクターには、細菌性プラスミドおよびファージ、および 哺乳類および昆虫プラスミドおよびウィルスが挙げられる。

「実質的に純粋」とは、自然の状態ではそれに伴う成分を実質的に含まない化合 物、例えばタンパク質、ポリペプチドまたは抗体を意味する。一般的には、試料 中の全材料の少なくとも６０９６、更に好ましくは少なくとも７５％、最も好ま しくは少なくとも９０％が目的の化合物であるときには、化合物は実質的に純粋 である。純度は任意の適当な方法、例えばカラムクロマトグラフィ、ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によってＡＰＩ定することができる。

核酸の場合には、「実質的に純粋」とは、核酸配列、セグメントまたはフラグメ ントであって天然に存在する状態ではこれの側面にある遺伝子を持たない（例え ば、元のゲノム位置では核酸の側面にある配列を持たない）ものを意味する。「 機能性誘導体」とは、分子の「フラグメント」、「変異体」、「類似体」または 「化学的誘導体」を意味する。分子の「フラグメント」、例えば本発明のｃ　Ｄ ＮＡ配列の任意のものとは、分子の任意のヌクレオチドサブセットを指すことを 意味する。分子の「変異体」とは、分子全体またはそのフラグメントに実質的に 類似している天然に存在する分子を表わすことを意味する。分子の「類似体」と は、分子全体またはそのフラグメントに実質的に類似している天然に存白ニしな い分子を表わすことを意味する。

両ノＪの分子のアミノ酸配列か実質的に同しであるときには、−万の分子は他方 の分子に「実質的に類似している」といわれる。実質的に類似しているアミノ酸 分子同士は、同様な生物活性を有する。したがって、２つの分子が同じ活性を有 している場合には１、これらの分子の一方が他方の分子には見られない追加のま たは若干数のアミノ酸残基をたとえ有していても、またはアミノ酸残基の配列が 同一ではないときであっても、本明細書で用いられている用語の変異体であると 考えられる。本明細書で用いられる分子とは、これが通常は分子の一部ではない 追加の化学的残基を含むときには、もう一方の分子の「化学的誘導体」であると いわれる。このような残基は分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを向上さ せることができる。これらの残基は、分子の毒性を減少させ、分子のあらゆる好 ましくない副作用を除去または少なくすることなどもてきる。このような作用を 媒介することができる残基は、例えば「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔ ｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｌｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　Ｊ　、１６版 、Ｈａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　、イーストン、ペンシルバニア州 （１９８０年）に開示されている。

同様に、本発明のレセプターキメラ体の「機能性誘導体」とは、ヌクレオチド配 列が「実質的に同様」であることができ且つ例えばＴ細胞、Ｂ細胞またはＦｃレ セプターキメラ体に対して同様な活性を有する分子をコードする遺伝子の「フラ グメント」、「変異体」または「類似体」を包含することを意味する。

したかって、本明細書で用いられるＴ細胞、Ｂ細胞またはＦｃレセプターキメラ 蛋白質とは、「野生型」キメラ体に実質的に同様であることができ且つ同様な活 性（すなわち、最も好ましくは野生型レセプターキメラ体の活性の９０％、更に 好ましくは７０％、好ましくは４０％、または少なくとも１０％）を有する任意 の機能性誘導体、フラグメント、変異体、類似体または化学的誘導体を包含する ことを意味する。機能性キメラレセプター誘導体の活性には、（その細胞外部分 による）標的とした因子または細胞への特異的結合と（その細胞内またはトラン スメンブラン部分によって指示される）その結果としてのその因子または細胞の 破壊が挙げられ、これらの活性は、例えば本明細書に記載の分析法のいずれかを 用いて試験することができる。

本発明のＴ細胞、Ｂ細胞またはＦｃレセプターキメラ体をコードするＤＮＡ配列 またはその機能性誘導体は、連結のためのプラント末端または付着端、適当な末 端を提供するための制限酵素による消化、適宜付着端の充填、好ましくない連結 を防止するだめのアルカリホスファターゼ処理および適当なりガーゼによる連結 などの従来の手法によりベクターＤＮＡと組換えを行うことができる。

このような操作の手法は、Ｍａｎｌａｔｉｓら、上記引用文献に開示されており 、当業者には周知である。

ＤＮＡのような核酸分子は、転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を 有し且つこれらの配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可 能に連結」している場合には、ポリペプチドを「発現することができる」といわ れる。作動可能な連結は、制御ＤＮＡ配列と発現させようとするＤＮＡ配列を遺 伝子発現を行うことができるように接続している結合である。

遺伝子の発現に要する制御領域の正確な性状は、生物毎に変化してもよいが、一 般的にはプロモーター領域を有し、これは原核生物では（ＲＮＡ転写の開始を指 示する）プロモーターとＤＮＡ配列であってＲＮＡに転写されるときタンパク質 合成の開始のシグナルを送るものとを含んでいる。これらの領域は、通常は転写 および翻訳の開始に関与する５′−非コード配列、例えばＴＡＴＡボックス、キ ャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などがある。

所望ならば、タンパク質をコードする遺伝子配列に対する非コード領域は前記の 方法によって得ることができる。この領域は、その転写終止制御配列、例えば終 止およびポリアデニル化のために保持することができる。よって、通常はタンパ ク質をコードするＤＮＡ配列に隣接する３′−領域を保持することにより、転写 終止シグナルを供給することができる。転写終止シグナルが発現宿主細胞では十 分に機能しないときには、宿主細胞中で機能する３′領域に置換することができ る。

２個のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配列およびＴ細胞レセプター、Ｂ 細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラコード配列）は、これらの２個のＤ ＮＡ配列の間の性質が（１）フレームシフト変異を導入せず、（２）レセプター キメラ遺伝子配列の転写を指令するプロモーター領域配列の能力を妨げず、また は（３）プロモーター領域配列により転写されるレセプターキメラ遺伝子配列の 能力を妨げない場合には、作動可能に連結されているといわれる。もしプロモー ターがＤＮＡ配列の転写を行うことかできるならば、プロモーター領域はこのＤ ＮＡ配列に作動可能に連結されるだろう。したがって、タンパク質を発現するに は、適当な宿主によって認識される転写および翻訳シグナルが必要である。

本発明は、原核または真核細胞のいずれかでのＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプ ターまたはＦｃレセプターキメラタンパク質（またはその機能性誘導体）の発現 を包含するか、真核細胞（特にヒトのリンパ球）での発現が好ましい。

本発明による抗体は、様々な方法のいずれによって調製することもてきる。例え ば、レセプターキメラタンパク質を発現する細胞またはその機能性誘導体を動物 に投性抗体を３む血清の産生を誘導することができる。

好ましい方法−Ｃは、本発明による抗体はモノクローン性抗体である。このよう なモノクローン性抗体は、ノλイブリトーマ手法を用いて調製することができる （Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　２５Ｇ：　４９５　（１９７５）ＨＫｏｈ ｌｅｒ　ら、Ｅｕｒ、　Ｊ。

ＩＩＩｌｍｕｎｏｌ、、　６：　５１１　（１９７６）ＨＫｏｈｌｅｒ　ら、Ｅ ｕｒ、　Ｊ。

ｌｍ５ｕｎｏ１．、６：　２９２　（１９７Ｂ）；　Ｈａｓｍｅｒｌｌｎｇ　ら 、「モノクローン性抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）　Ｊ　、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、５６３〜６８４頁（１９８１年））。総体的 には、これらの手法はＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃレセプタ ーキメラ抗原により動物を免疫することから成っている。これらの動物の牌細胞 を抽出し、適当なミエローマ細胞ラインと融合する。任意の好適なミエローマ細 胞ラインを本発明に準じて用いることができる。融合した後、生成するハイブリ ドーマ細胞を選択的にＨＡＴ培地に保持した後、Ｗａｎｄｓ、　Ｊ、Ｒ，らが報 告した方法により希釈を制限することによってクローニングする（Ｇａｓｔｒｏ ｅｎｔｃｒｏｌｏｇｙ、　８０：　２２５−２３２　（１９８１））　、次に、 このような選定によって得られるハイブリドーマ細胞を分析して、キメラ体に結 合することができる抗体を分泌するクローンを同定する。

本発明による抗体はポリクローン性抗体（ポリクローナル抗体）でよいか、好ま しくは領域特異的ポリクローン性抗体である。

本発明によるＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃレセプターキメラ 体を用いて、患者のキメラレセプター（キメラレセプターを有する細胞）の量を 観察することができる。これらの抗体は、免疫学的または「サンドイッチ」アッ セイ、例えば前進サンドイッチ、逆サンドイッチおよび同時サンドイッチアッセ イのような当該技術分野に既知の標準的な免疫診断法で使用するのに極めて好適 である。これらの抗体は、許容可能な特異性、感度および精度を有するイムノア ッセイを行うため過度の実験を行うことなく技術者が測定を行うことができるよ うな任意の数の組み合わせで用いることができる。

免疫学の一般的原理を記載している標準的参考書には、Ｒｏｉｔｔ、　１．　、 ｒ免疫学要論（Ｅｓｓｅｎｔｌａｌ　１ｍｓｕｎｏｌｏｇｙ）Ｊ、第６版、Ｂｌ ａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｌｅｎｔＩｆｌｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ出版社、０ ｘｆｏｒｄ　（１９８８年）　；　Ｋｌｍｂａｌｌ、　Ｊ、Ｗ、　、ｒ免疫学入 門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｉｍａｕｎｏｌｏｇｙ）、第２版、Ｍａ Ｃ＠　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ａｎＰｕｂｌｔｓ旧ｎｇ　Ｃｏ、出版社、ニューヨーク（１ ９８６年）；ＲｏｉＬｔ、　１．ら、［免疫学（ｌｉｓｕｎｏｌｏｇｙ）Ｊ　、 ＧｏｖｅｒＭｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｌｔｄ、出版社、ロンドン （１９８５年）　；　Ｂｕｒｄｏｎ、　Ｒ，ら監修「生化学および分子生物学の 実験室技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｌｏｃｈ ｅｍｌｓｔｒｙ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　Ｊ第１３巻、 Ｅｌｓｃｖｉｅｒ出版社、アムステルダム（１９８４年）中の［モノクローン性 抗体テクノロジー（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ）Ｊ　；に！ｅｉｎ、　Ｊ、、「免疫学：自己−非自己識別の科学（Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ：　Ｔｈｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　５ｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌ ｆ　Ｄｉｓｃｒｉｍｌ−ｎａｔｉｏｎ）　Ｊ　Ｊｏｈｎ　Ｖｉｌｅｙ　＆　５ｏ ｎｓ出版社、ニューヨーク（１９８２年）；およびＫｅｎｎｅｔｔ、　Ｒ，ら監 修、「モノクローン性抗体（モノクローナル抗体）、ハイブリドーマ：生物学的 分析における新たな次元（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　）Ｉ ｙｂｒｌｄｏｍａ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｌｓｅｎｓｌｏｎ　ＩｎＢｌｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｊ　、ＰＩｅｎｕ＋＊　Ｐｒｅｓｓ出版社、ニューヨ ーク（１９８０年）が挙げられる。

「検出する」とは、ある物質の存在または非存在の決定または物質の量の定量を 包含することを意図する。したがって、この用語は、本発明の材料、組成物およ び方法を用いて定性的および定量的測定を行うことを表わす。

本明細書に記載したのと同じ特異性を有するモノクローン性抗体を分泌する他の ハイブリドーマを単離することは、抗イデイオタイプスクリーニングの手法によ って行うことができる（　ＰＯｔＯＣＩｊａｋら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２１５： 　ＬＢ３７（１９８２）　）。簡単に説明すれば、抗イデイオタイプ抗体は、目 的とするクローンによって産生される抗体上に存在するユニークな決定基を認識 する抗体である。抗イデイオタイプ抗体は、目的とするモノクローン性抗体で、 モノクローン性抗体の源として用いられる同じ株の動物を免疫することによって 作成する。免疫下動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗イデ イオタイプ抗体）を産生ずることによって免疫抗体のイディオタイプ決定基を認 識して、応答する。

複製には、ハイブリッド細胞を、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方で培養す ることができる。イン・ビボての生産が高いことから、これが現在のところ好ま しい培養法となっている。簡単に説明すれば、個々の７１４７９１１株からの細 胞をプリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内投与して、所望なモノク ローン性抗体を高濃度で含む腹水を生成させる。イソ型１ｇＭまたはＩｇＧのモ ノクローン性抗体は、当業者に周知のカラムクロマトグラフィ法を用いて培養し た上澄液から精製することができる。

本発明による抗体はイムノアッセイに用いるのに特に好適であり、それらは液相 に用いることもまたは固相担体に結合させることもてきる。また、これらのイム ノアッセイにおける抗体を各種の方法で検出可能に標識することかできる。

多くの異なる標識および当該技術分野で知られている標識法がある。本発明に用 いることができる標識の種類の例には、酵素、放射性同位元素、螢光化合物、化 学発光化合物、生物発光化合物および金属キレートがある。

当該技術分野で通常の技術を有する者であれば、抗体に結合するための他の好適 な標識については知るであろうし、あるいは１］常的実験を用いることによって 同じことを確かめることもてきるであろう。更に、これらの標識の抗体への結合 は、当該技術分野における通常の技術を有する者に普通に知られている標準的な 手法を用いて行うことができる。

本発明による抗体を検出可能に標識化することができる方法の一つは、抗体を酵 素に連結することによる方法である。また、この酵素は、後でその基質に暴露す ると、例えば分光光度法または螢光法によって検出することができる化学的部分 を生じるように該基質と反応する。抗体を検出可能に標識するのに用いることが できる酵素の例には、マレエートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレ アーゼ、デルタ−■−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナー ゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソ メラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、 アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガ ラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−Ｖ ｌ−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエ ステラーゼが挙げられる。

検出可能に標識された抗体の存在は、抗体を放射性同位元素で標識した後、これ をガンマ−カウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段に よりＯｆ定することによって検出することができる。本発明の目的に特に台用な 同位体は、　Ｈ，Ｉ、　ＰＳ　Ｓ。

１４Ｃ，５１Ｃｒ、ＣＩ、　Ｃｏ、Ｆｅおよび７５Ｓｅである。

抗体を螢光化合物で標識することによって、検出可能に標識した抗体の結合を検 出することも可能である。標識した抗体を適当な波長の光に暴露すると、その存 在は染料の螢光によって検出することができる。最も普通に用いられる螢光標識 化合物はフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン 、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタルデヒドおよびフルオレスカ ミンである。

本発明の抗体は、Ｅｕのような螢光放射金属またはランタニド系列の他の金属を 用いて検出可能に標識することもてきる。これらの金属を、ジエチルエンテリア ミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金 属キレート化剤を用いて抗体分子に結合させることができる。

抗体は、それらを化学発光化合物にカップリングさせることによって検出可能に 標識することもできる。化学発光標識をした抗体の存在を、次に化学反応の経過 中に生しる発光の存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光化 合物合物の例は、ルミナール、イソルミナール、セロマチックアクリジニウムエ ステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、オキザレートエステルおよびジオキ セタンである。

同様に、生物発光化合物を用いて本発明による抗体を標識することができる。生 物発光は、生物系において見られる化学発光の一種であり、触媒タンパク質が化 学発光反応の効率を増加させる。生物発光抗体の存在は、発光の存在を検出する ことによって測定される。標識の目的に重要な生物発光化合物には、ルシフェリ ン、ルシフェラーゼニーフォリンがある。

本発明の抗体および実質的に精製した抗原は、理想的にはキットの調製に好適で ある。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１種類以上の容器手段を とじた区画に収容するための区画に分けたキャリヤ一手段を有しており、前記の 容器手段のそれぞれには用いるアッセイの別々の要素を入れる。

キットの形態で組み込むことができるアッセイの種類は多く、例えば競合および 非競合アッセイが挙げられる。

本発明の抗体を用いることができるアッセイの典型的な例は、ラジオイムノアッ セイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）　、酵素結合イムノソーペ ントアッセイ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、および免疫学的、またはサンドイッチ、イ ムノアッセイである。

「イムノメトリックアッセイ」或いは「サンドイッチイムノアッセイ」という用 語には、同時サンドイッチ、前進サンドイッチおよび逆サンドイッチイムノアッ セイが含まれることとする。これらの用語は当業者により充分理解されている。

当業者は又、本発明の抗体が現在知られている或いは将来開発されうるアッセイ の他の変法や形式において有用であることを認識するであろう。これらは本発明 の範囲に属すると意図されている。

分析を行う好ましい方式では、インキュベーション媒質（連系は標識した可溶性 抗体を加えたもの）にある種の「ブロッカ−」が含まれていることが重要である 。この［プロテアーゼは、非特異的タンパク質、プロテアーゼまたは実験試料に 含まれるマウス免疫グロブリンに対するヒト抗体が交差したり、固相担体上の抗 体や放射能標識したインディケータ−抗体を破壊して間違った陽性または間違っ た陰性の結果を生じることがないようにするために加えられる。それ故、「ブロ ッカ−」の選択は、本発明に記載されるアッセイの特異性に実質的に加える。

アッセイに用いるのと同しクラスまたはサブクラス（イソ型）の多数の関連性の ない（すなわち非特異的）抗体（例えば、ＩｇＧ　、ＩｇＧ　、ＩｇＭなと）を ブ１　２ａ ロッカーとして用いることかできることが見出だされている。「ブロッカ−」の 濃度（通常は１〜１００μｇ／μｌ）は、適１［な感度を保持し且つヒト血清中 で交差反応性タノバク質を相互に生しることによる好ましくないトｌＳを抑制す る上で重要である。更に、「ブロッカ−」を含む緩衝剤系を最適にする必要があ る。好ましい緩衝剤は、イミダゾール、ＨＥＰＰＳ、　ＭＯＰｓＳＴＥＳ。

ＡＤＡＳ　ＡＣＥＳＳ　ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＲｌ５などの弱有機酸を基 剤とする生理的ｐＨ範囲のものである。好ましさは若干落ちる緩衝剤は、ホスフ ェート、ボレートまたはカーボネートのような無機緩衝剤である。

最後に、既知のプロテアーゼインヒビターを、「ブロッカ−」を含む緩衝剤に加 えるべきである（通常は０．０１〜１０μｇ／ｍｌ）。

これまでに用いられてきており且つ本発明に用いることができる多くの固相免疫 吸着剤がある。周知の免疫吸着剤には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン 、デキストラン、ナイロンおよび他の材料のチューブ、ピースおよびこれらの材 料から形成されるまたはこれらの材料をコーティングしたマイクロタイタープレ ートなどの形態をしたものが挙げられる。固定化抗体を、アミドまたはエステル 結合を介する共有結合のような手法によってまたは吸収によって、固相免疫吸着 剤に共有結合的にまたは物理的に結合させることができる。当該技術分野であれ ば、抗体を固定する多くの他の好適な固相免疫吸着剤および方法を知るであろう し、または日常的実験だけを用いてこれを確かめることができるであろう。

イン・ビボ、イン・ビトロまたは現場での診断のために、放射性核種のような標 識を本発明による抗体に直接または媒介の機能性基を用いることによって結合す ることができる。金属カチオンとして存在する放射性同位元素を抗体に結合する のにしばしば用いられる媒介基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で ある。この９ｍ 方法で結合される金属カチオンの典型的例は、Ｔｃ。

■、■ｎ、　１％　Ｒｕｓ　Ｃｕ、６７Ｇａおよび６８Ｇａである。本発明の抗 体は、診断の目的で非放射性同位元素で標識することもできる。この方法に特に 有用な元素は、Ｇｄ、Ｍｎ、　Ｄｙ、５２Ｃｒお純粋な形態で単離することがで きる。例えば、本発明の一つの態様は実質的に純粋なＴ細胞レセプター、Ｂ細胞 レセプターまたはＦｃレセプターキメラ体を提供し、前記の抗原は、本発明の抗 体によって認識され、これに結合することを特徴としている。もう一つの態様で は、本発明はレセプターキメラ抗原とレセプターキメラ体に向けられた１種類以 上の抗体との複合体を形成することによって、前記の抗原を単離しまたは精製す る方法を提供する。

逆に、本発明の実質的に純粋なＴ細胞レセプター、Ｂ細胞レセプターまたはＦｃ レセプターキメラ抗原を用いて、血清または尿のような試料のキメラに対する抗 体を検出またはδＰ１定することもできる。したがって、本発明の一つの態様は 、試料中のレセプターキメラ抗原に対する抗体の存在または量を検出する方法で あって、キメラ抗原に対する抗体を含む試料を検出可能に標識したレセプターキ メラと接触させ、その標識を検出することから成る方法である。キメラの免疫反 応性画分と免疫反応性類似体を用いることもできることが理解されるであろう。

「免疫反応性画分」という用語は、レセプターキメラに対して向けられる抗体に 対して同等な免疫応答を示すキメラ抗原の任意の部分を意味する。「免疫反応性 類似体」という用語は、１種類以上のアミノ酸がレセプターキメラタンパク質と は異なるが、本発明の抗体に対して同等な免疫応答を示すタンパク質を意味する 。

「特異的に認識し、結合する」とは、キメラレセプターポリペプチドを認識し結 合するが、試料、例えばレセプターポリペプチドを含む生物試料中の他の分子を 実質的に認識して結合することがない抗体を意味する。

「自己免疫によって生成した細胞」とは、宿主組織または自己反応性である免疫 エフェクターＴ細胞と反応する抗体を産生ずる細胞を意味し、このような細胞に はアセチルコリンレセプター（例えば、重症筋無力症を引き起こす）または抗− ＤＮＡ、抗−赤血球および抗−血小板自己抗体（例えば、全身性エリテマトーデ スを引き起こす）に対する抗体を含む。

「治療細胞」とは、本発明のキメラによって形質転換された細胞であって、特異 的な感染因子、特異的因子に感染した細胞、腫瘍または癌性細胞、または自己免 疫によって生じた細胞を認識して、破壊することができる細胞を意味し、好まし くはこのような治療細胞は造血系の細胞である。

「細胞外」とは、少なくとも分子の一部が細胞表面に露出していることを意味す る。「細胞内」とは、少なくとも分子の一部が治療細胞の細胞質に露出している ことを意味する。「トランスメンプラン」とは、少なくとも分子の一部か血漿膜 に股がっていることを意味する。本明細書に用いられる「細胞外部分」、「細胞 内部分」および「トランスメンプラン部分」は、隣接の細胞区画に伸びているフ ランクアミノ酸配列を含むことができる。

「オリゴマー化する」とは、他のタンノスク質と複合体を形成して、二量体、二 量体、四量体、または他の高級オリゴマーを形成することを意味する。これらの オリゴマーは、ホモオリゴマーであることもヘテロオリゴマーであることもてき る。「オリゴマー化する部分」は、複合体（すなイ）ち、オリゴマー）形成を命 令する分子の領域である。

「細胞溶解性」とは、細胞（例えば、病原体に感染した細胞、腫瘍または癌性細 胞、または自己免疫によって生成した細胞）を破壊することかできること、また は感染外因ｊ１（例えば、ウィルス）を破壊することかできることを意味する。

「免疫不全症ウィルス」とは、霊長類の宿主のＴ４細胞に感染することができ且 つレンチウィルス亜科のウィルスの形態形成および形態学的特性を有する野生型 のレトロウィルスを意味する。この用語は、制限なしでＨＩＶおよびＳＩＶの総 ての変異体、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｓ　ＩＶｍａｃ、Ｓ　ＩＶａｇｍ 。

ＳＩＶｍｎｄ、ＳＩＶｓｍｍＳＳＩＶｍａｎ。

ＳＩＶｍａｎｄおよび５ＩＶｃｐｚを包含する。

ｒＭＨＣ独立」とは、細胞の細胞溶解性応答が標的となる細胞表面上にＭＨＣク ラスＩＩ抗原が存在することを必要としないことを意味する。

「機能性の細胞溶解性シグナル形質導入誘導体」とは、（前記に定義した通りの ）機能性誘導体であって、野生型分子の生物活性の少なくとも１０％、好ましく は４００６、更に好ましくは７０％、或いは最も好ましくは少なくとも９０％を 指示することができる誘導体を意味する。

本明細書に用いられる、「機能性の細胞溶解性シグナル形質導入誘導体」は、治 療細胞に直接シグナルを送り、レセプターに結合した因子または細胞を破壊する ことによって作用することができ（例えば、細胞内キメラレセプタ一部分の場合 ）、または治療細胞の細胞溶解性シグナル形質導入タンパク質でオリゴマー化を 促進することにより間接的に作用することができる（例えばトランスメンブラン ドメインの場合）。これらの誘導体の効力を、例えば本明細書に記載のイン・ビ トロでのアッセイを用いて、試験することができる。

「機能性のＨＩＶエンベロープに結合する誘導体」とは、任意のＨＩＶエンベロ ープタンパク質に結合することができる（前記に定義した通りの）機能性誘導体 を意味する。機能性誘導体は、例えば本明細書に記載のイン・ビトロアッセイを 用いて同定することができる。

治療薬の投与 本発明の形質転換細胞を用いて、多数の疾病を治療することができる。このよう な形質転換細胞の現在の投与法には、養子免疫療法または細胞転移療法がある。

これらの方法では、形質転換した免疫系細胞を血流に戻すことがてきる。Ｒｏｓ ｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ａ、　、５ｃｉｅｎｔｉｒｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ。

ｆｌｉ２（１９００年５月）　＋　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｔｈｅ　ＮｅｗＥｎ ｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３２３　（９）：　５ ７０　（１９９０）。

本発明の薬学組成物は、本発明の化合物の有益な効果を経験することができる任 意の動物に投与することができる。このような動物のうちで一番最初に挙げられ るのはヒトであるが、本発明はこれに限定することを意図するものではない。

詳細な説明 最初に、図面について説明する。

図面の簡単な説明 第１図　ＣＤ４キメラ体の特性決定。第１Ａ図は、ＣＤ４　（残基１〜３６９） と異なるレセプター鎖との間の融合部位についてのアミノ酸配列を表わす。下線 を付けた配列は、融合の構成に用いられるＢａｍＨ１部位内でコードされるアミ ノ酸の位置を示す。トランスメンブランドメインの始まりは、垂直の棒で示す。

η配列はアミノ末端におけるζ配列と同じであるが、カルボキシル末端では異な っている（　Ｊｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８１：　３３１９−３３２３　（１９９０））。第１Ｂ図 は、ＣＶ１細胞中（７）ＣＤ４、ＣＤ４　：　ζ、ＣＤ４　：　７及びＣＤ４二 ηの表面発現のフローサイトメトリー分析を表わしている。細胞をＣＤ４キメラ またはＣＤ１６Ｐ、を発現するウィルスに感染させ、３７℃で９時間インキュベ ーションし、フィコエリトリン抱合抗〜ＣＤ４ＭＡｂＬｅｕ３Ａで染色した。第 １Ｃ図は、ＣＶＩ細胞中で発現する標識したＣＤ４：ζ、ＣＤ４：γまたは天然 のＣＤ４の免疫沈澱を表わす。レーンは、還元性因子を用いて（Ｒ）、または還 元性因子なしで（ＮＲ）行った。ｋＤでの分子質量の基準を左側に示す。

第２図　ＣＤ１６Ｔ−独（密な点線）の同時感染の後のＣＤ１６ＴＨの表面発現 、またはＣＤ４：γ（破線）またはＣＤ４　：ζ（実線）を発現するウィルスで 同時感染したＣＤ１６丁−表面発現。疎らな点線は、ＣＤ４：ζ単独で感染した 細胞を示し、３Ｇ８で染色した（　Ｐｌａｉｔら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９：　３２７５−３２７９　（１９８２）） （抗−ＣＤ１６□８ｂ）。

第３図　ζＡｓｐ−１５を欠く突然変異体ＣＤ４　：ζキメラレセプターはＣＤ 　１６７Ｈの同時発現を支持しない。

第３Ａ図は、還元しくＲ）または還元せずに（Ｎ　Ｒ）電気泳動した免疫沈澱し た突然変異体キメラのオートラジオグラムである。第３Ｂ図は、ＣＤ１６ＴＭを 発現するウィルスと下記のζキメラとによる同時感染の後のＣＤ１６．−表面発 現を詳細に表わしたものである。

ＣＤ４　ζ（太線）、ＣＤ４：ζＣ１１Ｇ（実線）、ＣＤ４　ζ（破線）；ＣＤ ４：ζＣＩＩＧ／Ｄ１５Ｇ（密な点線）、同時感染なしくＣＤ１６．Ｍ単独、疎 らな点線）。細胞は、抗−ＣＤ　１６ＭＡｂ　３Ｇ８およびマウスＩｇＧに対す るフィコエリトリン抱合Ｆ　ａ　ｂ　’　２ヤギ抗体と共にインキュベーション した。ζキメラの発現の程度は、分析を行った他の突然変異体と本質的に同一で あり、ＣＤ１６□８を発現するウィルスとζキメラとを用いる細胞同時感染はキ メラの表面発現を余り変化させなかった（データーは示していない）。

第４図　細胞内の遊離カルシウムイオンが増加するとＴ細胞ライン中の突然変異 体ζキメラの架橋が起こる。

ンユルカノトＥ６細胞（Ｗｅｉｓｓ　ら、Ｊ、　Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．、１３３： １２３−１２８　（＋９８４））を、組換えワクシニアウィルスで感染させ、フ ローサイトメトリーによって分析した。図示した結果は、ゲー　トしたＣＤ４　 の個数に対するものであり、関連するキメラタンパク質を発現する細胞たけを分 析する。紫色／青色１ｎｄｏ−１螢光の平均比率は個体群全体における細胞内の 遊離カルシウム濃度を反映しており、応答する細胞の割合は、予め決定した閾値 比（未処理細胞の１０％が陽性となるように設定）を超過する細胞の画分を反映 している。第４Ａ図および第４Ｂ図はＣＤ４：ζ（実線）またはＣＤ１６：ζ（ 破線）を発現するジュルカット細胞であって、抗−ＣＤ４ＭＡｂＬｅｕ３ａ　（ フィコエリトリン抱合体）に暴露した後、マウスＩｇＧに対するヤギ抗体で架橋 したものを示している。

点線は、抗−ＣＤ３ＭＡｂＯＫＴ３に対する未感染細胞の応答を示す。第４Ｃ図 および第４Ｄ図は、ＣＤ４：ζＤ１５Ｇ（実線）；ＣＤ４：ζＣＩＩＧ／Ｄ１５ Ｇ（破線）、またはＣＤ４　：ζＣＩＩＧ（点線）を発現するジュルカノト細胞 を示し、これらは第４Ａ図および第４Ｂ図と同様に処理して、分析した。

第５図　ＣＤ４　：ζ、ＣＤ４　：ηおよびＣＤ４：γレセプターにより、細胞 溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がＨＩＶ−１ｇｐ１２０／４１を発現する標的を殺 すことかできる。第５Ａ図：黒丸、ｇｐ　１２０／４１を発現するヘラ細胞と共 にインキュベーションしたＣＤ４：ζを発現するＣＴＬ　、白丸、未感染ヘラ細 胞とインキュベーションしたＣＨ２：ζを発現するＣＴＬ　、黒画角、ｇｐｌ　 ２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションした未感染ＣＴＬ　、 自回角、未感染ヘラ細胞とインキュベーションした未感染ＣＴＬ、第５Ｂ図：黒 丸、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ４ ：ηを発現するＣＴＬ；白丸、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にイン キュベーションしたＣＤ４：γを発現するＣＴＬ　；白四角、ｇｐ１２０／４１ を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＩＩＧ／Ｄ１５Ｇ二重突然 変異体ＣＤ４：ζキメラを発現するＣＴＬ、第５Ｃ図：　第５Ｂ図に用（またＣ ＴＬによるＣＤ４発現のフローサイトメトリーによる分析。標的／エフェクター 比を補正するため、ＣＤ４キメラを発現する細胞比率を、ヒストグラムを重ね合 わせることによって概算した陰性（未感染）個体数を差し引くことによって測定 した。この図で比較の目的で、未感染細胞にヒストグラムの引き算とほぼ同じ他 の細胞個体数に対して陽性の両分を与える任意閾値を指定した。

第６図　ＣＤ４に対する細胞溶解の特異性。

第６Ａ図：　黒丸、ＣＤ　１６　ｐ　＋を発現するヘラ細胞と共にインキユベー シヨンしたＣＤ４：ζを発現するＣＴＬ　；白丸、ｇｐ１２０を発現するヘラ細 胞と共１こインキュベーションしたＣＤ４を発現するＣＴＬ　、黒四角、ｇｐ１ ２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュベーションしたＣＤ１６：ζを発 現するＣＴＬ　；白四角、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞と共にインキュ ベーションしたＣＤ１６．、を発現するＣＴＬ０第６Ｂ図：　黒メし、ラジ（Ｍ ＨＣクラスＩＩ”）細胞でインキュベーションしたＣＤ４：ζを発現するＣＴＬ 　、白丸、ＲＪ２．２゜５　（ＭＨＣクラスＩＩ　フジ突然変異体）細胞でイン キュベーションした未感染ＣＴＬ細胞；黒四角、ラジ（ＭＨＣクラスＩＩ　）で インキュベーションした未感染ＣＴＬ、白四角、ＲＪ２．２．５　（ＭＨＣクラ ス！■−）でインキュベーションしたＣＤ４：ζを発現するＣＴＬ。

縦軸の尺度は拡大している。

第７図　ＣＤ１６：ζキメラレセプターの特性決定。

第７Ａ図はＣＤ１６：ζ融合タンパク質を模式的に表わしたものである。モノマ ー性ＣＤ１６のホスファチジルイノシトール結合した形態をトランスメンブラン ドメインの直ぐ外側の二量体性ζに連結した。融合接合部のタンパク質配列を一 番下に示す。第７Ｂ図は、ＴＣＲ陽性またはＴＣＲ陽性またはＴＣＲ陰性細胞ラ インにおけるＣＤ１６：ζキメラの架橋の後のカルシウム起動のフローサイトメ トリー分析を示す。時間０における抗体で処理した細胞個体数の中の紫色／青色 螢光の平均比率（相対的カルシウムイオン濃度の尺度）を示す。黒四角、抗−Ｃ Ｄ３ＭＡｂＯＫＴ３に対するジュルカット細胞の応答：黒三角、ＲＥＸ３３ＡＴ ＣＲ−突然変異体における抗−ＣＤ１６ＭＡｂ　３Ｇ８架橋に対するＣＤ１６： この応答、自四角、ジュルカットＴＣＲ−突然変異体ラインＪＲＴ３．Ｔ３．５ におけるＣＤ１６：この架橋に対する応答、白三角、ジュルカット細胞における ＣＤ１６：ζ架橋に対する応答、十文字、ジュルカット細胞における非キメラＣ Ｄ１６に対する応答；および点線、ＲＥＸ３３ＡＴＣＲ−細胞ラインにおける非 キメラＣＤ１６に対する応答。

第８図　細胞溶解力の欠失分析。

第８Ａ図は、ζ欠失末端点の位置を示す。ここでは、他の場合と同しく、ζにお ける突然変異は元の残基−位置−突然変異体残基の慣習によって表わされている ので、例えばＤ６６＊は終止コドンによるＡｓｐ−６６の置換を表わしている。

第８Ｂ図は、未欠失ＣＤ１６：ζおよび顕著なζ欠失の細胞溶解分析の結果を示 している。ＣＤＩ６に対する表面抗体を発現するハイブリドーマ細胞に５１Ｃｒ を加え、ＣＤ１６・ζキメラを発現するワクシニア組換体て感染した多数のヒト 細胞溶解性リン＜球（ＣＴＬ）と共にインキユベーシヨンした。放出された５１ Ｃｒの比率を、エフェクター（ＣＴＬ）対標的（）・イブリドーマ細胞の比率（ ｅ　／　ｔ　）の関数としてプロ・ソトする。黒丸、ＣＤ１６：ζ（ｍｆ　ｉ　 １８．７）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解、黒四角、ＣＤ１６：ζ Ａｓｐ６６　（ｍｆｉ９４屹　２）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解 ；白四角、ＣＤ１６：ζＧ　ｌ　ｕ６０＊（ｍｆ　ｉ　１６．Ｏ）を発現する細 胞によって媒介される細胞溶解；白丸、ＣＤ１６：ζＴｙｒ５１　（ｍｆｉ１７ ．４）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解：黒三角、ＣＤ１６：ζＰｈ ｅ３４　（ｍｆ　ｉ１７．８）を発現する細胞によって媒介される細胞溶解、白 三角、非キメラＣＤ１６（ｍｆｉ５９１）を発現する細胞によって媒介される細 胞溶解。この実験では、ＣＤ１６：ζＡｓ　ｐ６６”の発現は他の融合タンパク 質の発現に匹敵しなかったが、同し実験で同等な水準でＣＤ１６：ζを発現する 細胞による細胞溶解はＣＤ１６二ζＡｓｐ６６　を発現する細胞によって示され たのと（図示せず）本質的に同一な結果を得た。

第９図　トランスメンブラン相互作用の力の除去により細胞溶解を媒介すること ができる短いζセグメントが明らかになる。第９Ａ図は、モノマー性の２文節系 および３文節系キメラを模式的に表わしたものである。−容土には、残基６５で 切形し、トランスメンブランＣｙＳおよびＡｓｐ残基を欠＜ＣＤ１６：ζ構成物 がある。その下に、ＣＤ１６：ＣＤ５：ζおよびＣＤ１６：ＣＤ７：ζ構成物お よび関連したコントロールが示されている。

細胞内ドメインのペプチド配列を、下の方に示す。第９Ｂ図は、モノマー性キメ ラ欠失突然変異体の細胞溶解活性を示す。ＣＤＩ　：ζを発現する細胞の細胞溶 解活性（黒丸；ｍｆｉ４９５）を、ＣＤ１６：ζＡｓ　ｐ６６＊を発現する細胞 （黒四角；ｍｆｉ５２７）または突然変異体ＣＤ１６：ζＣｙｓｌｌＧ１ｙ／Ａ ｓｐ１５Ｇ１ｙ／Ａｓｐ６６　（白画角；ｍｆｉ３３８）およびＣＤ１６：　ζ ＣｙｓｌｌＧｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／Ｇ１ｕ６０　（黒三角；ｍｆｉ２５９） の細胞溶解活性と比較した。第９Ｃ図は、３文節系融合タンパク質によって媒介 される細胞溶解活性を示す。黒三角、ＣＤ１６：＊。

ζＡｓｐ６６　、白画角、ＣＤ１６：５：ζ（４８−６５）；黒画角、ＣＤ１６ ：７：ζ（４８−６５）；白三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−５９）；白丸、Ｃ Ｄ１６：５；黒丸、ＣＤ１６　：　７゜第９Ｄ図は、ＴＣＲ陰性のジュルカット ＪＲＴ３．Ｔ３．５突然変異細胞ラインにおける突然変異体および３文節系キメ ラによるカルシウム起動を示す。白丸、二量体性ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６　を発 現する細胞の応答；黒画角、ＣＤ１６：ζＣｙｓ　１１Ｇ１ｙ／Ａｓｐ１５Ｇ１ ｙ／Ａｓｐ６６　を発現する細胞の応答；白画角、ＣＤ１６：ζＣｙｓ　１１Ｇ Ｉ　Ｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／ＧＩｕ６０＊を発現する細胞の応答、黒三角、ＣＤ １６：７：ζ（４８−６５）を発現する細胞の応答；およびＣＤ１６：ζ（４８ −５９）を発現する細胞の応答。

第１０図　１８残基の細胞溶解性シグナル形質導入モチーフの活性に対する個々 のアミノ酸の寄与。第１０Ａ図および第１０Ｂ図は、細胞溶解活性を示し、第１ ０Ｃ図は、カルボキシル末端のチロシン（Ｙ６２）付近の点突然変異を有するキ メラによって媒介されるカルシウムイオンの起動を示す。第１０Ａ図および第１ ０Ｂ図は、ＣＤ１６：ζ融合タンパク質をそれぞれ少量および多量に発現する細 胞について集められたデーターを表わす。

カルシウム起動および細胞溶解分析については同じ記号を用い、右側に１文字コ ードで示されている。黒丸、ＣＤ１６：ζ（ｍｆｉ、Ａでは２１、Ｂでは３７６ ）を発現する細胞；黒画角、ＣＤ１６　：　７　：ζ（４８−６５）（ｍｆ　ｉ 、Ａ、３１　；Ｂ、８２）；白画角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）’Ｇｌｕ ６０ＧＩｎ　（ｍｆ　ｉ、Ａ。

３３；Ｂ、９２）；十文字、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ａｓｐ６３Ａｓｎ 　（ｍｆ　ｉ、Ａ、３０；Ｂ、７４）：黒三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５ ）Ｔｙ　ｒ６２Ｐ　ｈ　ｅ　（ｍ　ｆ　ｌ　％　Ａ　、２４　；　Ｂ　、８８　 ）　；白丸、ＣＤｌ６：７：ζ（４８−６５）ＧＩｕ６１ＧＩｎ　（ｍｆ　ｉ。

Ａ、２０；Ｂ、６２）；および白三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ｔｙ　 ｒ６２Ｓｅ　ｒ　（ｍｆ　ｉ、Ｂ、６４）。第１０Ｄ図および第１０Ｅ図は細胞 溶解活性を示し、第１０Ｆ図はアミノ末端チロシン付近の点突然変異を有するキ メラによるカルシウムイオン起動を示す（Ｙ５１）。カルシウム起動および細胞 溶解分析について同じ記号を用い、右側に示している。黒丸、ＣＤ１６：ζ（ｍ ｆｉ、Ｄ、２１．２；Ｅ、６７２）を発現する細胞；黒画角、ＣＤ１６　：　７ 　；ζ（４８−６５）（ｍｆ　ｉ、Ｄ、３１．３；Ｅ、１７９）を発現する細胞 ；黒三角、ＣＤｌ６：７：ζ（４８−６５）Ａｓｎ４８Ｓｅｒ　（ｍｆ　ｔ。

Ｄ、２２．４．Ｅ、２０９）；白画角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）Ｌｅｕ ５０Ｓｅ　ｒ　（ｍｆ　ｉＳＤ。

２５．０；Ｅ、１４２）；および自三角、ＣＤ１６：７：ζ（４８−５５）Ｔｙ 　ｒ５１Ｐｈｅ　（ｍｆ　ｉ、Ｄ。

３２．３；Ｅ、２９４）。

第１１図　この内部反復の配列およびそれらの細胞溶解を支持する能力の比較。

第１１Ａ図はζ細胞内ドメインを３分の１に分割し、それらにＣＤ１６：７キメ ラのトランスメンブランドメインを付けることによって形成されるキメラを模式 的に表わしたものである。細胞内ドメインの配列を下の方に示すが、共有する残 基を箱に囲っており、関連残基に星印を付けている。第１１Ｂ図は、′３個のζ サブドメインの細胞溶解力を示している。黒丸、ＣＤ１６：ζ（ｍｆ　ｉ、４７ ６）を発現する細胞；黒画角、ＣＤ１６：７：ζ（３３−６５）（ｍｆ　ｉ、６ ８）；白画角、ＣＤ１６：７：ζ（７１−１０４）（ｍｆ　ｉ。

１１４）；および黒三角、ＣＤ１６：７：ζ（１０４−０４−１３８）（，１０ ４）。

第１２図は、ＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩキメラを模式的に表わしたものである。

第１′３図　ＣＤ４　：　ＦＣＲ７１１およびＣＤ１６：ＦＣＲ７１１キメラの 架橋の後のカルシウム起動。

第１３Ａ図は、ＣＤ１６細胞外ドメインと抗体を架橋した後時間の関数として示 されたカルシウム感受性の螢光口１ｎｄｏ−１を有する細胞によって放射される 紫色／青色螢光の比率を示す。第１３Ｂ図は、抗体と架橋した後のＣＤ４：Ｆｃ ＲγＩＩキメラを有する細胞の紫色／青色螢光の比率の増加の同様な分析を示す 。

第１４図　ＣＤ４　：　ＦｃＲ７１１およびＣＤ１６：ＦｃＲγＩＩキメラの細 胞溶解分析。第１４Ａ図は、ＣＤ１６　：　ＦｃＲ７１Ｉキメラ（エフェクター 細胞）を発現する多数の細胞障害性Ｔリンパ球に細胞を暴露するときに、抗−Ｃ Ｄ１６ハイブリドーマ（標的）細胞から放出される５１Ｃｒの比率を示す。第１ ４Ｂ図は、ＨＩＶエンヘローブ糖タンパク質を発現する標的細胞に対してＣＤ４ ：ＲｃＲγＩＩキメラによって媒介される細胞障害性の同様な分析を示す。

第１５図　細胞溶解に重要なＦｃＲγＩＩＡ尾における残基の同定。第１５Ａ図 は、欠失構成物を模式的に表わしたものである。第１５Ｂ図および第１５Ｃ図は 、ＣＤ１６　：　ＦｃＲγＩＩＡのカルボキシル末端欠失変異体によるカルシウ ム起動および細胞溶解を示す。第１５Ｄ図および第１５Ｅ図は、ＣＤ１６：Ｆｃ Ｒ７１１Ａの細胞内尾のアミノ末端が漸進的に少なくなる３文節系キメラによる カルシウム起動および細胞溶解を示す。

第１６図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）は、ＣＤ３デルタレセブタータンパク質 のアミノ酸配列を示し、箱に入っている配列は好ましい細胞溶解性シグナル形質 導入部分を表わす。

第１７図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）は、Ｔ３ガンマ−レセプタータンパク質 のアミノ酸配列を示し、箱に入っている配列は好ましい細胞溶解性シグナル形質 導入部分を表わす。

第１８図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）は、ｍｂｌレセプタータンパク質のアミ ノ酸配列を示し、箱に入っている配列は好ましい細胞溶解性シグナル形質導入部 分を表わす。

第１９図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）は、Ｂ２９レセプタータンパク質のアミ ノ酸配列を示し、箱に入っている配列は好ましい細胞溶解性シグナル形質導入部 分をヒトＩｇＧ１：レセプターキメラの構築ヒトＩｇＧ１重鎖配列をＣＨ３ドメ インにおける配列を、抗体ｍＲＮＡのトランスメンプラン形の３′末端由来のｃ 　ＤＮＡフラグメントに結合することによって作成した。３′末端フラグメント は基質としての扁桃ｃＤＮＡライブラリー、およびそれぞれ所望なりＮＡフラグ メントの５′および３′末端に対応する配列：ＣＧＣＧＧＧ　ＧＴＧ　ＡＣＣＧ ＴＧ　ＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧ　ＧＧＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア）お よび ＣＧＣＧＧＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＴＣＣＡＧＡ　ＧＣＣＣＧＴ　ＣＣＡ 　ＧＣＴ　ＣＣＣＣＧＴ　ＣＯＴ　ＧＧＧ　ＣＯＴ　ＣＡ　（Ｓ　Ｅ　Ｑ　Ｉ　 Ｄ　Ｎ　Ｏ：　８　）を有するオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反 応によって得られた。５′オリゴは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインにおけるあ る部位に相補性であり、３′オリゴはメンプランに股がるドメインをコードする 配列の５′の部位に相補性である。ＰＣＲ生成物をＢｓ　ｔＸＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化し、可変および定常領域を有する半合成ＩｇＧ１抗体遺伝子のＢｓ　ｔ ＸＩとＢａｍＨ１部位の間に連結させた。ＢｓｔＸＩ−ＢａｍＨＩフラグメント をインサートした後、構成物の増幅部分を制限フラグメント相互交換によってＣ ａ　３のＳｍａ　１部位まで置換しｓ　Ｓ　ｍ　ａ　ｉ部位と３′オリゴの間の 部分のみがＰＣＲ反応に由来するようにした。

ヒトＩ　ｇＧｌ　：ζキメラレセプターを作成するため、ＢａｍＨＩ部位の重鎮 遺伝子末端を下記のζキメラのＢａ　ｍ　Ｈ１部位に連結して、抗体配列が細胞 外部分を形成するようにした。キメラをコードするプラスミドでトランスフェク ション下ＣＯ８細胞をフローサイトメトリーによって分析したところ、軽鎖ｃＤ ＮＡをコードする発現プラスミドを同時トランスフェクションするときには抗体 決定基は高度に発現し、軽鎖の発現プラスミドがないときには、抗体決定基の発 現は中程度であった。

ηまたはγに融合したヒトＩｇＧ１を含む同様なキメラ（下記を参照）またはＴ 細胞レセプターまたはＦｃレセプタータンパク質の任意のシグナル形質導入部分 は一般的には分子生物学の標準的手法を用いて構築することができる。

重鎮も軽鎖も単一プロモーターから発現させることができる単一の転写単位を作 成するために、ビシストニックｍ　ＲＮ　Ａをコードするプラスミドを、重鎖お よび軽鎖７８ｋＤのグルコース制御したタンパク質コードするｍＲＮＡの５′未 翻訳部分から作成した。ｇｒｐ７８配列は、それぞれ５′および３′末端におけ る配列ＣＧＣＧＧＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＧＡ　ＣＧＣＣＧＧ　ＣＣＡ　ＡＧＡ 　ＣＡＧ　ＣＡＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋９）および ＣＧＣＧＴＴ　ＧＡＣＧＡＧ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＧＴＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＡ Ｇ　ＣＡＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０） を有するプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡのＰＣＨによって得た。これらの オリゴ体とのポリメラーゼ連鎖反応は、］０９６ジメチルスルホキシドの存在下 にて行った。ＰＣＲによってｉ４られたフラグメントをＮｏｔｌおよびＨｉ　ｎ 　ｃ　１１て消化し、ヒトＩｇＧ１コード配列の下流のＮｏｔｌおよびＨｐａ１ 部位の間にインサートした。ヒトＩｇＧカッパー軽鎖ｃＤＮＡをコードする配列 を、次にｇｒｐ７８リーダーの下流にＨｉｎｃＩＩ部位およびベクターのもう一 つの部位を用いてインサートした。これらの操作から得られる発現プラスミドは 、半合成重鎮遺伝子と、ｇｒｐ７８リーダー配列と、カッパー軽鎖ｃＤＮＡ配列 と、５Ｖ４０ＤＮＡフラグメント由来のポリアデニル化シグナルから成っていた 。発現プラスミドによりＣＯ８細胞をトランスフェクションしたところ、プラス ミドコード重鎮決定基単独のトランスフェクションと比較して、著しく改良され た重鎮決定基の発現が得られた。

重鎖／レセプターキメラおよび軽鎖とから成るビシストロニック遺伝子を作成す るため、上流の重鎮配列を本明細書に記載の任意のキメラ重鎖／レセプター遺伝 子で置き換えることができる。

ヒトζ　（Ｗｅｉｓｓｉａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ。

８５：　９７０９−９７１３　（１９８８ｂ）　）および７　（Ｋｕｅｓｔｅｒ ら、Ｊ６Ｂｊｏ１．　Ｃｈｅｓ、、　２６５：　６４４ｇ−８４５２（１９９０ ））　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡをＨＰＢ−ＡＬＬ腫瘍細胞ライン（Ａｒｕｆｒｏら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８４：　８５７３−８５７７　（１９８７ｂ ）　）およびヒトナチュラルキラー細胞から調製したライブラリーからポリメラ ーゼ連鎖反応によって単離し、一方、ηｃ　ＤＮＡ（Ｊｏｎ　ら、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７：　３３１９−３３２３　 （１９９０））をネズミ胸腺細胞ライブラリーから単離した。ζ、ηおよびγｃ 　ＤＮＡを、膜に股がるドメインの直ぐ上流にＢａｍｔ１１部位を有するＣＤ４ の設計された形態の細胞外ドメインに連結しく　Ａｒｕｆｆｏら、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＬＩＳＡ、　８４：　８５７３−８５７７（１９８７ｂ ）；　Ｚｅｔｔｌｅｓｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　９．３ ４７−３５３　（１９９０）　）　、これを膜に股がるドメインの敗残基土流の 同様な位置のζおよびｙ７ｃＤＮＡに自然に含まれるＢａｍＨ１部位（ＳＥＱＩ Ｄ　ＮＯ８：１，３．４および６）に連結した。γと融合タンパク質を形成させ るため、ＢａｍＨ１部位を、同じ近似部位の配列に組み込んだ（第１図；５ＥＱ ＩＤ　ＮＯ：２および５）。遺伝子融合を、選択可能なマーカーとしてＥ、ｃｏ ｌｉ　ｇｐｔ遺伝子を有するワクシニアウィルス発現プラスミド中に導入しくＭ 。

Ａｍ１ｏｔおよびＢ、Ｓ、、未発表）、ミコフェノール酸中ての成長のための同 族組換えおよび選択によりワクシニア組換株のゲノムにインサートした（　Ｆａ ｌｋｎｅｒら、Ｊ。

Ｖｌｒｏｌ、、　８２：　１８４９−１８５４　（１９８８）　；　ｌ３ｏｙｌ ｅ　ら、Ｇｅｎｅ、　６５：１２３−１２８　（１９８８））。フローサイトメ トリー分析を行ったところ、ワクシニア組換体は細胞表面でＣＤ４　：ζおよび ＣＤ４　：γ融合タンパク質を多量に産生ずる指示を行っていたが、ＣＤ４：η の発現は実質的に弱いことを示していた（第１図）。後者の知見は、ηｃＤＮＡ 発現プラスミドのネズミハイブリドーマ細胞うイン中へのトランスフェクション はこれに匹敵するζ発現プラスミドのトランスフェクションよりも実質的に発現 が少ないという最新の報告と一致する（　Ｃ１ａｙｔｏｎら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、。

１７２：　１２４３−１２５３　（１９９０）　）　、　’７クシニア組換え体 に感染した細胞の免疫沈澱を行ったところ、融合タンパク質は天然に存在するＣ Ｄ４抗原とは異なり共有結合にょる二量体を形成することが判った。モノマー性 ＣＤ４　：ζおよびＣＤ４：γ融合タンパク質の分子質量および元のＣＤ４は、 それぞれ６３．５５および５３ｋＤであることが判った。融合タンパク質の大き な方の質量は細胞内部分の大きな方の長さとほぼ一致し、これは元のＣＤ４の長 さを７５（ＣＤ４：ζ）または５（ＣＤ４：γ）残基だけ超過する。

トランスフェクシント上でのヒトＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６ＴＭ）のマクロファ ージ／ナチュラルキラー細胞形態の細胞表面発現はネズミ（Ｋｕｒｏｓａｋｉら 、Ｎａｔｕｒｅ。

３４２：　８０５−８０７　（１９８９）　）またはヒト（Ｈｌｂｂｓら、５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２４６：　１６０８−１６１１　（１９８９））　７での同時ト ランスフェクション並びにヒトζ（Ｌａｎｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４２： ８０３−８０５　（１９８９）　）により促進される。

これらの報告内容と一致していることであるが、キメラの発現は、組換えワクシ ニアウィルスで同時トランスフェクションまたは同時感染することにより標的細 胞へ伝達するとき、ＣＤ　１６　Ｔ−表面発現を行うこともできる（第２図）。

ζによる（ＣＤ１６１Ｍ）表面発現の促進は検討を行った細胞ラインにおけるγ による促進（第２図）よりも一層顕著であったが、元のＣＤ４　（データーは図 示せず）はＣＤＩ６ＴＭ表面発現を促進しなかった。

存在する抗原又はＦｃレセプターと関連しないキメラを作成するため、膜内Ａｓ ｐまたは膜内Ｃｙｓ残基または両者を欠いている突然変異ζ融合タンパク質を作 成した。フローサイトメトリーを行ったところ、異なる突然変異キメラによる細 胞表面発現の強度は、突然変異をしていない前駆体（データーは図示せず）とは 余り変わらず、免疫沈澱実験では、キメラによる総発現量は同じであった（第３ 図）。予測されたように、トランスメンブランシスティン残基を欠く突然変異キ メラ体は、ジスルーフイド結合二量体を形成しないことが判った（第３図）。

Ａｓｐを欠＜２ＦＩ類の突然変異キメラ体はＣＤ　１６　ＴＭ（７）表面発現を 支持することかできなかったが、Ｃｙｓを欠くがＡｓｐをａするモノマー性キメ ラ体はＣＤ１６ＴＭを同時発現させることかできたが、親ユニ体より効率は低か った（第３図）。

実施例Ｖ 突然変異レセプターはカルシウム応答を開始する能力を保持する。

融合タンパク質の架橋によりＴ細胞抗原レセプターで起こることが知られている ものと同様な方法で遊離の細胞内カルシウムを蓄積するかどうかを決定するため 、ヒトＴ細胞白血病ラインの細胞であるジュルヵソトＥ６（ＡＴＣＣ寄託番号Ｔ ｌＢ１５２、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メ リーランド州）をワクシニア組換え体で感染させ、細胞外ドメインと抗体との架 橋の後、相対的細胞質カルシウム濃度を１１足した。フローサイトメトリー測定 を、カルシウム感受性染料１ｎｄｏ−１を添加した細胞で行った（　Ｇｒｙｎｋ ｔｅｖｌｃｚ　ら、Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　ＣｈｅＬ、　２６０：　３３４０−３４ ５０　（１９８５）ＨＲａｂｊｎｏｖｉｔｃｈら、Ｊ、ｌ１ｉｕｎｏ１．、　１ ３７：　９５２−９６１　（１９８６））　、第４図に、ＣＤ４：ζおよびこの Ａｓｐ−およびＣｙｓ−突然変異体に感染した細胞でのカルシウムフラックス実 験の結果を示す。キメラ体の架橋により、細胞内カルシウムは再現可能に増加し た。ＣＤ４　＋ηおよびＣＤ４：γも同様に感染細胞中の細胞内カルシウムを蓄 積した（データーは図示せず）。ジュルカソト細胞は、細胞表面上でＣＤ４を低 い水準で発現したが、ＣＤ１６：この存在または非存在下での元のＣＤ４の架橋 （Ｃ，ｌ？、およびＢ、Ｓ、、未発表）（第４図および図示していないデ−ター ）では細胞内カルシウム濃度に変化はなかった。

キメラレセプターが細胞溶解エフェクタープログラムを誘導するかどうかをＤｊ 定するため、ＨＩＶエンベロープｇ　ｐ　１２０　／　ｇ　ｐ　４１複合体のＣ Ｄ４認識に基づいたモデル標的：エフェクター系を作成した。ヘラ細胞をｇｐ１ ２０／ｇｌ）４１を発現する組換えワクシニアウィルスに感染させ（Ｃｈａｋｒ ａｂａｒｔｉ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２０：　５３５−５３７（１９Ｈ）ＨＥ ａｒｌ　ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６４：　２４４ｇ−２４５１（１９９０） ）、５１Ｃｒで標識した。標識細胞を、ＣＤ４　：ζ、ＣＤ４　：ηまたはＣＤ ４：γキメラを発現するワクシニア組換え体またはＣＤ４：ζＣｙｓｌｌＧ１ｙ ：Ａｓｐ１５Ｇｌｙ二重突然変異キメラに感染されたヒトの同種特異＋ 的な（ＣＤ８　、ＣＤ４　）細胞障害性Ｔリンパ球ラインからの細胞と共にイン キュベーションした。第５図は、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞がＣＤ４ キメラを発現する細胞障害性１９２８球（ＣＴＬ）によって特異的に溶解するこ とを示している。未感染ヘラ細胞は、ＣＤ４：ζキメラを有するＣＴＬによって 標的とはされず、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞は未感染ＣＴＬによって 認識されなかった。各種のキメラの効力を比較するため、エフェクター／標的比 をＣＤ４キメラを発現するＣＴＬの画分に就いて補正し、且つフローサイトメト リーで測定したように、ｇｐ１２０／４１を発現するヘラ細胞の画分について補 正した。第５Ｃ図は、第４Ａ図および第４Ｂ図に示した細胞溶解実験に用いたＣ ＴＬによるＣＤ４発現のサイトメトリー分析を示す。表面ＣＤ４：この平均密度 はＣＤ４　：ηの平均密度を大きく上回ったがどちらの形態を発現する細胞の細 胞溶解効率も同じであった。ｇｐ１２０を発現する標的の画分を補正すると、Ｃ Ｄ４：ζおよびＣＤ４：ηタンパク質によって媒介される細胞溶解の効率は特異 的Ｔ細胞レセプター標的：エフェクタ一対について報告された最良の効率に匹敵 する（ＣＤ４　：ζを発現するＴ細胞による５０％放出に対する平均エフェクタ ー／標的比は１．９±０．９９、ロー１０であった）。ＣＤ４ニア融合体の活性 は、トランスメンブランＡｓｐおよびＣｙｓ残基を欠（ＣＤ４：ζ融合体の活性 と同様に低かった。しかしながら、いずれの場合にも、有意な細胞溶解が観察さ れた（第５図）。　ワクシニア感染がＣＴＬによる人工的認識を促進することが あるという可能性を制御するため、同様な細胞溶解実験をＣＤ１６のホスファチ ジルイノシトールと結合した形態（ＣＤ１６．、）を発現するワクシニア組換え 体で感染し、５１０ｒで標識した標的細胞、及びＣＤ１６Ｐ、またはＣＤ１６＋ ζを発現するコントロール組換え体に感染したＣＴＬで行った。第６Ａ図は、非 −ＣＤ４キメラを発現するＴ細胞は元のヘラ細胞またはｇｐ１２０／４１を発現 するヘラ細胞を認識しないことを示しており、同様に、ＣＤ４キメラを発現する Ｔ細胞は他のワクシニアでコードされた表面タンパク質を発現するヘラ細胞を認 識しないことを示している。また、非キメラＣＤ４を発現するＣＴＬはｇｐ１２ ０／４１を発現するヘラ細胞を有意に溶解しない（第６Ａ図）。

ＣＤ４は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原によって発現される非多形配列と相互作用する ものと考えられる（　Ｇａｙら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２８：　６２８−６２９　 （１９８７）；　５Ｉｅｃｋ＋＋＋ａｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ。

３２８：　３５１−３５３　（＋９８７）　）。ＣＤ４とクラスＩＩ抗原との間 の特異的相互作用は精製したタンパク質では報告されていないか、ある条件下で はＣＤ４を発現する細胞とクラス１１分子を発現する細胞とが付着することを示 すことかできる（Ｄｏｙｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３０：　２５６−２５９　 （１９８７）；Ｃ１ａｙｔｏｎら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍａｄ、、１７２：　１２４３ −１２５３　（１９９０）；Ｌａｌｌ１ａｒｒｅら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４５： 　７４３−７４１３　（１９８９））　、次に、クラスＩＩをＨする細胞に対し て殺生を検出することができるかとうかを検討した。第６Ｂ図は、クラスＩＩの 抗原を多量に発現するラジＢ細胞ラインに対してＣＤ４　：ζによって指示され る特異的細胞溶解はないことを示している。温和な（約５％）細胞溶解が観察さ れるが、ラジ細胞のクラスＩＩ陰性突然変異体、ＲＪ２．２．５（Ａｃｃｏｌｌ ａ、　Ｒ，Ｓ、　、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５７：　１０５３−１０５ ８（１９８３）　）は、未感染のＴ細胞とインキュベーションしたラジ細胞と同 じ感受性を示す。

実施例ＶＩＩＩ Ｔ細胞抗原／　Ｆ　ｃレセプターラニーター鎖による細胞溶解の誘導のための配 列要件 ＣＤ４とことのキメラは細胞障害性１９２８球（ＣＴＬ）を有して、ＨＩＶｇｐ １２０を発現する標的細胞を殺すことができるが、ＣＤ４に対する代替物を検索 してヒトＴ細胞ラインに導入されるラニーターキメラの特製を明確に比較した。

これらのラインはＣＤ４を発現し、異なるキメラのカルシウム起動および細胞障 害力の種類または程度の関係を特異的に定義することを困難にしうる。これを回 避するために、キメラをＣＤ１６の細胞外ドメインがラニーターのトランスメン ブランおよび細胞内配列に結合していることＣＤ１６との間に作成した（第７Ａ 図）。遺伝子融合体を、選択可能なマーカーとしてＥ、ｃｏｌｉ　ｇｐｔ遺伝子 を有するワクシニアウィルス発現プラスミドに導入し、同族組換えおよび選択に よってワクンニアＷＲ株のゲノムにインサートしてミコフェノール酸中て成長さ せた（ＦａｌｋｎｅｒおよびＭｏ５ｓ。

）、　Ｖｊｒｏｌ、、　６２：　１８４９　（１９８８）　；　Ｂｏｙｌｅおよ びＣｏｕｐａｒ。

Ｇｅｎｅ、６５：　１２３　（１９８８））　。

Ｔ細胞ラインにワクシニア組換え体を感染させ、細胞外ドメインを抗体と架橋し た後、相対的細胞質遊離カルシウムイオン濃度を計１定した。分光学的螢光法（ 高固体数）およびフローサイトメトリー（単一細胞）にょるＭｌ定を染料１ｎｄ ｏ−１を添加した細胞で行った（　Ｇｒｙｎ−ｋｌｅｗｉｃｚら、Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２１３０：　３４４０　（１９８５））　、第７Ｂ図は、 ＣＤ１６：ラニーター融合タンパク質を発現するワクンニア組換え体で感染させ たジェルカットヒトＴ細胞白血病の細胞から収集したデーターの分析を示してい る。このギメラ体を架橋すると細胞内カルシウムが再現可能に増加するが、非キ メラＣＤ１６を発現する細胞を同様に処理］またとこるほとんどまたは全く効果 がなかった。キメラを抗原レセプターを欠く突然変異体細胞ラインで発現したと ころ、ＲＥ　Ｘ　３３　Ａ　（Ｂｒｅｌｔｍｅｙｅｒら、Ｊ、　ｌｍ５ｕｎｏ１ ．、＋３８：　７２６　（１９８７）：　５ａｎｃｈｏら　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２６４＋　２０７６０　（１９８９）　）またはジュルカット突 然変異体Ｊ　ＲＴ　−Ｌ　Ｔ　３．　５　（Ｗｅｉｓｓら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ 、１．。

１．３５：　１２３　（１９８４）　）　、またはＣＤ１６抗体の架橋に対する 強力な応答が見られた。同様なデーターはＲＥＸ２ＯＡ　（ＢｒｅｉｔＩｌｅｙ ｅｒら、上記引用文献、１９８７；　Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、」、旧０１．　Ｃｈ ｅｇ＋、、　２［ｉ５：　１４０３Ｂ　（１９９０）　）突然変異体細胞ライト および本実験室で確立されたジュルカット細胞ラインのＣＤ　３　／　Ｔ　ｉ陰 性突然変異体について収集した（データーは図示せず）。ＣＤ１６：ζを発現す る組換え体で感染すると、抗−ＣＤ３抗体に対する応答は保存されないことから 、融合タンパク質は細胞内ＣＤ３複合体鎖を取り戻すことによって作用しないこ とを示している（データーは図示せず）。

キメラか細胞によって媒介される免疫を再設定する能力を評価するため、ＣＴＬ をＣＤ１６キメラを発現するワクシニア組換え体に感染させ、膜結合した抗ＣＤ １６抗体を発現するハイブリドーマ細胞を特異的に溶解するのに用いた（下記参 照）。このアッセイは、Ｆｃレセプターを有する細胞のエフェクター機構を分析 するために最初に開発されたハイブリドーマ細胞障害性アッセイの延長である（ ＧｒａｚｉａｎｏおよびＦａｎｇｅｒＳＪ、　ｌｍ５ｕｎｏ１．、１３８：　９ ４５．１９８７；　ＧｒａｚｉａｎｏおよびＦａｎｇｅｒ、　Ｊ、　１ｍＩＩｕ ｎｏ１．。

＋３９：　３５−３６．１９８７Ｈ５ｈｅｎ　ら、Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏ、、 　２８：　９５９゜１９８９；　Ｆａｎｇｅｒ　ら、ｌ１ｉｕｎｏ１．　Ｔｏｄ ａｙ、　１０：　９２．１９８９）。

第８Ｂ図は、細胞障害性Ｔリンパ球におけるＣＤ１６：ζを発現することにより 、修飾したＣＴＬが３６８（抗−ＣＤ　１６　；　Ｆｌｅｊｔ　ら、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ。

７９・３２７５．１９８２）ハイブリドーマ細胞を殺すことができるか、ＣＤ１ ６のホスファチジルイノシトール結合形を発現するＣＴＬは不活性であることを 示している。ＣＤ１６、ζを有するＣＴＬも、無関係な抗体を発現するハイブリ ドーマ細胞を殺さない（データーは図示せず）。

細胞溶解に必要な最少限のζ配列を同定するため、ζ細胞内ドメインを順次カル ボキシル末端から除いた一連の欠失突然変異体を作成した（第８Ａ図）。ラニー ターの細胞内ドメインのほとんどは、細胞溶解力で容易に取り除くことができ、 完全な長さのキメラＣＤ　］、　６　：ζは本質的に残基６５まで欠失したキメ ラ、ＣＤ１６ζＡｓ　ｐ６６　と効力がほとんど同じであった（第８Ｂ図）。ζ 残基５９まで欠失すると（キメラＣＤ１６＋ζＧｌｕ６０　）細胞障害性が実質 的に減少し、残基５０まて更に欠失すると活性が若干低下した。しかしながら、 細胞内ドメインが３残基トランスメンブランアンカーまで減少し−Ｃも活性は完 全にはなくならなかった（第８Ｂ図）。

ζはジスルフィド結合二量体であるので、細胞溶解活性の保持は、内因性ζかキ メラζ欠失を有するヘテロニ量体を形成することによって活性が再構築されるも のと説明される。この考え方を試験するため、ζ残基１１および１５をそれぞれ ＡｓｐとＣｙｓからＧｌｙへ変え（ＣｙｓｌｌＧｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ）、免 疫沈澱を上〜記のようにし、て行った。約２Ｘ　１０６個のＣＶＩ細胞を血清下 ４．　Ｄ　Ｍ　Ｅ培地て１時間組換えワクシニアに感染させ、感染個数（ｍｏｉ ）を少なくとも１０とした。感染後６〜８時間後に、細胞をＰ　Ｂ　Ｓ　／　１ 　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａでプレートから脱着させ、Ｃ１ａｒｋおよびＥｉｎｆ ｅｌｄの方法によってラクトペルオキシダーゼおよびＨ２Ｏ２を用いて２×１０ 　個の細胞当たり０．２ｍＣ１の１２５１テ表面標識した（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ 　Ｔｙｐｉｎｇ　１１．　ｐｐ、　１５５−１６７゜ｓｐｒ＋ｎｇｅｒ−ｖｅｒ ＋ａｇ　％ニューヨーク、１９８６年）。標識した細胞を遠心分離によって収集 し、１％ＮＰ−４０，０，１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５ＭＴｒ 　ｉ　ｓ％ｐＨ８，０，５ｍＭ　ＭｇＣ１５ｍＭ２ゝ ＫＣＩ、０，２Ｍヨードアセタミドおよび１ｍＭＰＭＳ　Ｆで溶解した。核を遠 心分離によって除去し、ＣＤ１６タンパク質を抗体３　Ｇ　８　（Ｐｌｃｉｔら 、上記引用文献、　１９８２；　Ｍｅｄａｒｅｘ　）および抗−マウスＩｇＧア ガロース（Ｃａｐｐｅｌ　、ダーハム、ノース・カロライナ州）と免疫沈澱した 。試料を８％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル中で非還元性条件下で、または１ ０％ゲル中で還元条件下で電気泳動を行った。これらの免疫沈澱により、ＣＤ１ ６：　ζＣｙｓｌｌＧｌｙ／Ａｓｐ１５Ｇ１ｙキメラはジスルフィド結合した二 量体構造中では会合しないことが確認された。

突然変異体レセプターの細胞溶解活性も試験した。残基６５まて欠失した突然変 異体キメラ（ＣＤ１６：ζＣｙｓｌｌＧｌｙ／Ａｓｐ１５ＧＩｙ／Ａｓｐ６６　 ）の細胞溶解分析での活性は、アッセイの条件によっては匹敵する突然変異して いないキメラであって、因子が通常はＣＤ１６：この２以内であるかまたは活性 が区別できないもの（ＣＤ１６：ζＡｓｐ６６　）の２〜８分の１であった（第 ９Ｂ図）。突然変異キメラの活性の減少は、同様な構造のＣＤ４キメラて見られ た減少に匹敵しく前記参照）、二量体に比較してζモノマーの効率が低いことに よるものと思われる。対照的に、残基５９まて欠失したＡｓｐ−５Ｃｙｓ−突然 変異キメラは、細胞溶解活性を持たず（第９Ｂ図）、トランスメンブランｃｙＳ および／またはＡｓｐ残基によって媒介される他の鎖との会合が残基６５よりも 多いアミノ末端の欠失における細胞溶解活性が弱く持続することに関与するとい う仮説を支持している。

フローサイトメトリーの検討を行ったところ、トランスメンブランＡｓｐおよび Ｃｙｓを欠く欠失突然変異体はＴＣＲ−突然変異体ジュルカット細胞ラインにお ける抗体の架橋に応答して、遊離の細胞内カルシウムイオンの増加を促進するこ とができることを示していた（第９Ｄ図）。同様な結果は親のジュルカットライ ンで発現したキメラについても得られた（図示せず）。ＣＤ１６：ζＣｙｓ１１ Ｇ１ｙ／Ａｓｐ１５Ｇｌｙ／Ｇｌｙ６０＊の場合には、これらのデーターは、カ ルシウム応答を媒介する能力は細胞溶解を支持する能力とは突然変異的には分離 することができることを示している。

ζトランスメンブラン残基の可能な寄与を明確に除去するために、このトランス メンブランおよび最初の１７の細胞質性残基を、膜スパンニングおよびＣＤ５ま たはＣＤ７抗原のそれぞれ最初の１４または最初の１７個の細胞質性残基をコー ドする配列で置換した（第９Ａ図）。

生成する３文節系融合タンパク質、ＣＤ１６：５：ζ（４８−６５）およびＣＤ １６：７：ζ（４８−６５）は、より単純なＣＤ１６・ζキメラと同様にジスル フィド結合二量体を形成しなかったが、これはζトランスメンブランドメインに システィン残基を欠いていたためである。いずれの３文節系キメラもジュルカッ トおよびＴＣＲ陰性細胞ラインでカルシウムを起動しく第９Ｄ図）、ＣＴＬにお ける細胞溶解応答を示すことができた（第９Ｃ図、データーは図示せず）。しか しながら、キメラＣＤ１６：７：ζ（４８−５９）における残基５９までのζ部 分の欠如により、ＴＣＲ陽性または陰性のジュルカット細胞におけるカルシウム 応答性を指示する３文節系融合体の能力または成熟ＣＴＬにおける細胞溶解を指 示する能力がなくなる（第９Ｃ図および第９Ｄ図、データーは図示せず）。

１８残基のモチーフの中の個々の残基の寄与を検討するため、部位指定突然変異 誘発により多数の突然変異体を作成し、それらのキメラレセプターの低発現（第 １０Ａ図および第１０Ｄ図）または高発現（第１０Ｂ図および第１０Ｅ図）の条 件下でレセプター指定殺生を媒介する能力を評価した。第１０図は、残基５９か ら６３まで及んでいる多数の比較的控え目な置換（すなわち、酸性残基をその同 族アミドにより置換またはチロシンをフェニルアラニンで置換）により、細胞溶 解効力が幾分減少し、一般的に変異体はカルシウムを起動する能力を保持してい ることを示している。しかしながら、集合的には、これらの残基は、これらの欠 失により細胞溶解活性が欠如するかぎりは、重要なサブモチーフを有する。Ｔｙ ｒ６２をＰｈｅまたはＳｅｒに変換すると、いずれも細胞障害性およびカルシウ ム応答かなくなった。１８残基のセグメントのアミノ末端では、Ｔｙｒ５１をＰ ｈｅで置換するとカルシウム起動も細胞溶解活性も完全になくなるが、５０位の ＬｅｕをＳｅｒで置換すると、カルシウム応答はなくなるが細胞溶解性は部分的 に損なわれるたけである。特定の仮説に束縛されることなく、短期フローサイト メトリー分析でＬｅｕ５０Ｓｅｒ突然変異体がカルシウムを起動することができ ないことは、細胞溶解分析の長期に亙る遊離の細胞内カルシウムイオンの実質的 な増加を媒介する能力を十分に反映しないからと推定される。しかしながら、カ ルシウム不感受性の細胞溶解活性はある種の細胞溶解性Ｔ細胞ラインについて報 告されており、同様な現象が本明細書に記載の結果の基となっているという可能 性は除外されてはいない。Ａｓｎ４８をＳｅｒで置換すると、幾つかの実験では 細胞障害性か部分的に損なわれたが、他の実験ではほとんど効果はなかった。

余剰の配列要素の潜在的な役割を検討するため、この細胞内ドメインを３個のセ グメント、スパニング残基３３〜６５．７１〜１０４および１０４〜１３８に分 割した。これらのセグメントのそれぞれを、ＣＤ７の細胞内ドメインの塩基性膜 アンカー配列の末端に導入されるＭ　Ｉ　ｕ　１部位によってＣＤ１６：ＣＤ１ ７キメラに結合した（下記を参照、第１１Ａ図）。３個の要素の細胞溶解効力を 比較したところ、これらの効力は等しかった。

配列番比較したところ（第１１Ａ図）、第二のモチーフはチロシン間に１１個の 残基を有し、第一および第三のモチーフは１０個の残基を持っていた。

Ｔ細胞活性化の方法は正確に説明されてはいないが、抗原レセプター、またはζ 細胞内配列を有するレセプターキメラの集合により、カルシウム起動、サイトカ インおよび顆粒の放出、および活性化の細胞表面マーカーの出現が誘導されるこ とは明らかである。この活性部位である、固有の酵素活性を有するには小さすぎ ると思われる短い直線状ペプチドも、１個または精々数個のタンパク質と相互作 用を行って、細胞活性化を媒介する。細胞溶解を媒介する能力は、突然変異的に カルシウム蓄積を媒介する能力と分離することができるので、遊離カルシウムの 起動はそれだけでは細胞の活性化には十分ではないことも明らかである。

本明細書に示されるように、この細胞内ドメインからの１８残基をトランスメン ブランおよび２個の関係のないタンパク質の細胞内ドメインに付加すると、生成 するキメラ体が融合タンパク質の細胞外部分に結合する標的細胞に対して細胞溶 解活性を再設定することができる。

１８残基のモチーフを有するキメラの活性は、完全な長さのζに基づいたキメラ の約８分の１であるが、減少した活性は、通常は野生型のζがジスルフィド結合 二量体を形成することができるトランスメンブラン相互作用を喪失していること によるものと思われる。すなわち、モチーフと同じカルボキシル末端を有し且つ トランスメンブランＣｙｓおよびＡｓｐ残基を欠くζ欠失構成物の活性は、典型 的には１８個の残基モチーフだけを有するキメラより若干低い。

本発明者らが注目した細胞溶解能を有する要素は２個のチロシンを何するがセリ ンまたはスレオニンはなく、活性に対するホスホリル化の可能な寄与が制限され る。

どの千ロジンでも突然変異すると、活性が破壊され、予備実験でも１８残基のモ チーフを有するキメラ表面抗原の架橋の後に実質的なチロシンのホスホリル化が 示されていないが、このホスホリル化の低水準での寄与の可能性は除外できない 。２個の千ロジン残基で注目された効果の外に、このモチーフのアミノおよびカ ルボキシル末端における多数のアミノ酸による置換によって、低レセプター密度 の条件下では活性が低下する。

ζ活性モチーフと同様な配列は、数種類の他のトランスメンブランタンパク質の 細胞質ドメイン、例えばＣＤ３δおよび７分子、表面１ｇＭに関連したタンパク 質ｍｂ１およびＢ２９、および高親和性ＩｇＥレセプター、ＦｃεＲ１のβおよ びγ鎖に見出だすことができる（ＲｅｔｈＳＮａｔｕｒｅ、　３３８：　３８３ ．１９８９）　ｏ　これらの配列の機能は確定されていないが、効率的に発現さ れる場合には、それぞれは自律的Ｔ細胞活性化を行うことができ、このような活 性によってζ陰性突然変異細胞ラインに見られる残基のＴＣＲ応答性を説明する ことができる（　Ｓｕｓｓｍａｎ　ら、Ｃｅ１１．５２：　８５．１９８８）。

ζ自身はほぼ等間隔になった３個の配列を有し、細胞内ドメインのラフな３区分 は、それぞれが細胞溶解応答を開始することができることを示している。この接 合イソ形である７７　（Ｊｌｎら、上記引用文献、　１９９０；　Ｃ１ａｙｔｏ ｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ！ｌ；Ａ、　８８二５ ２０２．１９９１）は、第三のモチーフのカルボキシルハーフを欠いている。第 一のモチーフのカルボキシルハーフが除去されると活性が失われるので、ηの生 物学的有効性の大半は最初の２つのモチーフに寄与するものと思われる。異なる 測定によれば、ηは抗原によって媒介されるサイトカイン放出（Ｂａｕｅｒら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８８：　３ｇ４２ ゜１９９１）または再設定した細胞溶解の促進ではこと同等な活性を有するが、 ηはレセプター刺激に応じてはホスホリル化されない（Ｂａｕｅｒら、上記引用 文献、１９９１）。したがって、ホスホリル化には総ての３種類のモチーフが存 在することが必要であり、または第三のモチーフは未同定のチロメンキナーゼに 対する好ましい基質である。

異なるヒトＦＣレセプターサブタイプの作用を評価するために、ヒトＣＤ４、Ｃ Ｄ５またはＣＤ１６抗原の細胞外ドメインをＦｃＲＩ　１７ＡＳＢｌ、Ｂ２およ びＣサブタイプのトランスメンブランおよび細胞内ドメインに連結したキメラ分 子を作成した（　ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔの命名法、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、 　ｌ■ｕｎｏ１．、９：　４５７．１９９１）　、具体的には、前記したＦｃＲ Ｉ　ＩＡ、ＢｌおよびＢ２イソ形のトランスメンブランおよび細胞質ドメインに 対応するｃ　ＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、予め存在 するクローンＰＣ２３または（標準的な手法によって構築された）ヒト扁桃ｃＤ ＮＡライブラリーから増幅した。

ＣＣＣＧＧＡ　ＴＣＣＣＡＧ　ＣＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＴＣＴＴ（ＳＥＱ　 Ｉ　ＤＮ　Ｏ：　１８　；　Ｒｃ　ＲＩ　Ｉ　Ａ前進）ＣＧＣＧＧＧ　ＧＣＧ　 ＧＣＣＧＣＴ　ＴＴＡ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＣＡＴＧＧＴＣ ＧＴＴ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９；ＦｃＲＩＩＡ復帰） ＧＣＧ　ＧＯＯＧＧＡ　ＴＣＣＣＡＣＴＧＴ　ＣＣＡ　ＡＧＣＴＣＣＣＡＧ　Ｃ ＴＣＴＴＣＡＣＣＧ　（Ｓ　Ｅ　Ｑ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ｏ：　２０　；　Ｆ　ｃ　Ｒ Ｉ　Ｉ　Ｂ　１　オよびＦｃＲＩＩＢ２前進）および ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　Ｇｅｅ　ＧＣＣＴＡＡ　ＡＴＡ　ＣＧＧ　ＴＴＣＴＧ Ｇ　ＴＣ（Ｓ　Ｅ　ＱＩＤ　ＮＯ：２１；ＦｃＲＩＩＢｌおよびＦｃＲＩＩＢ２ 復帰）。

これらのプライマーはそれぞれ酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔｌの開裂部位を含み 、５′末端から６残基だけインデントした。Ｎｏｔ１部位の後ろには、直ぐアン チセンス停止コドンＣＴＡまたはＴＴＡが続いていた。総てのプライマーは、所 望なフラグメントの５′および３′末端に相補的な１８個以上の残基を含んでい た。ＩＩＡイソ形とは１アミノ酸残基だけ異なるＦｃＲＩＩγＣ細胞質ドメイン に対応するｃＤＮＡフラグメント（残基２６８におけるＰの代わりにＬ）を、下 記の配列のプライマーを用いてＰＣＲを重複させることによる部位指定突然変異 誘発によって生成した。

ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＧＡＣＡＡＣＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＡＣ Ａ　Ａ　（Ｓ　Ｅ　ＱＩＤ　ＮＯ：２２）および ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＧＴＣＴＴＴ　Ｃ ＴＧ　Ａ　（Ｓ　Ｅ　ＱＩＤ　ＮＯ：２３）。

ＰＣＲフラグメントを、それぞれＣＤ１６またはＣＤ４細胞外ドメインを含むワ クシニアウィルス発現ヘクターにインサートした後、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｇｐｔの同 時組み込みの選択を用いてチミジンキナーゼ座で組換えにより野生型のワクシニ アウィルスにインサートして、所望な組換体の同定を容易にした。総てのイソ形 （第１２図に示されている）が同一であることは、ジデオキシ配列決定によって 確認した。

キメラレセプタータンパク質の産生を、更に免疫沈澱法によって確認した。約１ ０７個のＪＲＴ３．Ｔ３．５細胞を血清不含Ｉ　ＭＤＭ培地で組換えワクシニア で１時間感染させ、感染多重度を少なくとも１０とした。感染から１２時間後、 細胞を集めて、ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ法を用いて１ ０７個の細胞当たり０．５ｍＣｒの　Ｉで表面標識した（Ｃ１ａｒｋおよびＥｌ ｎｆｅｌｄ　、上記引用文献）。標識した細胞を遠心分離によっＣ収集し、１％ ＮＰ−４０，０，１ｍＭ　ＭｇＣｌ　５ｍＭ　ＫＣｌ、０．２Ｍヨードアセタミ ドお２ゝ よび１ｍＭ　ＰＭＳＦで溶解した。核を遠心分離によって除去し、ＣＤ１６融合 タンパク質を抗体４Ｇ８および抗−マウスＩｇＧアガロースで免疫沈澱した。試 料を還元条件下で電気泳動した。総ての免疫沈澱したキメラレセプター分子は、 予想した分子質量のものであった。

キメラレセプターが細胞質不含カルシウムイオンの増加を媒介する能力を試験す るため、組換えウィルスを用いて（本明細書に記載の）ＴＣＲ−突然変異体ジュ ルカット細胞ラインをを感染させ、（本明細書に記載の）モノクローン性抗体３ ０８またはＬｅｕ−３Ａによるレセプター細胞外ドメインの架橋の後に、細胞質 不含カルシウムを（本明細書に記載の）細胞中で測定した。これらの実験から、 ＦｃＲ７１１ＡおよびＣの細胞内ドメインは細胞外ドメインの架橋の後細胞質不 含カルシウムイオンの増加を媒介することができるが、ＦｃＲγＩＩＢＩおよび Ｂ２の細胞内ドメインは同様な条件下では不活性であることが判った（第１３Ａ 図および第１３Ｂ図）。

ＦＣＲ７Ｉ　ＩＡのＣＤ４、ＣＤ５およびＣＤ１６ハイブリツドは、カルシウム 応答を促進する能力を本質的に等しく有した（第１３図、データーは図示せず） 。単球およびリンパ球ラインからの他の細胞ラインは、細胞外ドメインの架橋に よって開始されるシグナルに応答することができた（データーは図示せず）。

細胞溶解に異なるＦｃＲγＩＩ細胞内ドメインを包含させることを検討するため 、ヒト細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を、ＣＤ１６：ＦｃＲ７１１Ａ、Ｂｌ、 Ｂ２およびＣキメラを発現するワクシニア組換え体に感染させた。次に、感染し た細胞を、ＣＤ１６に対する細胞表面抗体を発現した５１Ｃｒを標識したハイブ リドーマ細胞（すなわち、３Ｇ８　１０−２細胞）と同時培養した。

この分析法では、キメラのＣＤ１６細胞外ドメインがリンパ球エフェクタープロ グラムを活性化することができる細胞内セグメントに連結している場合には、Ｃ Ｄ１６キメラを有するＣＴＬはハイブリドーマ標的細胞を殺しく遊Ｍ５１Ｃ「を 放出することができた）。この細胞溶解分析法を下記に詳細に説明する。第１４ Ａ図は、ＣＤ１６　：　ＦｃＲ７１１ＡおよびＣを有するが、ＦＣＲ７１１ＢＩ またはＢ２を持たないＣＴＬは、細胞表面抗−ＣＤ１６抗体を発現する標的細胞 を溶解することができることを示している。

特異的細胞溶解が、場合によってはＣＤ１６部分との相互作用に起因するといっ た可能性を除外するため、細胞溶解実験を行い、ＦｃＲＩＩ細胞内ドメインをＣ Ｄ４細胞外ドメインに結合した。この場合には、標的細胞は、ＨＩＶエンベロー プｇｐ１２０／４１タンパク質を発現するヘラ細胞（具体的には、ワクシニアベ クターｖＰＥ１６（ナショナル・インステイテユート・オブ・アレルギー・アン ド・インフェクションズ・ディシーズ・ＡＩＤＳ・デポジトリ−、ベセスダ、メ リーランド州、から入手可能）で感染したヘラ細胞）であった。ＣＤ１６系と同 様に、ＨＩＶエンベロープを発現する標的細胞は、ＣＤ４：ＦｃＲγＩＩＡキメ ラを発現するが、ＦｃＲγ１１ＢＩまたはＢ２を発現しないＴ細胞によって溶解 されやすい（第１４Ｂ図）。

ＦｃＲ７１１ＡおよびＣの細胞内ドメインは、延長したＦｃＲγ／ＴＣＲζ科の 部分を含む任意の他のタンパク質と評価し得るほどの配列の相同性を共有してい ない。

細胞溶解の誘導に関与する配列要素を定義するため、分子内ドメインコード配列 の５′および３′欠失（下記に記載され、第１５Ａ図に示される）を作成し、（ 本明細書に記載の方法で）カルシウム起動および細胞溶解分析における効力を評 価した。細胞内ドメインのアミノ末端部分を除去した実験では、ＦｃＲγＩＩの トランスメンブランドメインを無関係なＣＤ７抗原のトランスメンブランドメイ ンで置換して、膜に股がるドメインによって媒介される相互作用の寄与の可能性 を排除した。

第１５Ｂ図および第１５Ｃ図は、チロシン２９８を含む１４個のカルボキシル末 端残基を除去することにより、細胞溶解能が完全に喪失し、カルシウム起動能が 実質的に減少することを示している。チロシン２８２の直前まで更に欠失を行っ たところ、同一の表現形を得た（第１５Ｂ図および第１５Ｃ図）。細胞内ドメイ ンのＮ−末端から残基２６８までの欠失では、カルシウムプロフィールまたは細 胞溶解能のいずれについても実質的な効果はないが、残基２７５まで欠失を行う と、遊離のカルシウム放出は著しく損なわれるが細胞溶解に就いてはほとんど影 響がなかった（第１５Ｄ図および第１５Ｅ図）。残基２８２まで更に欠失を行う と、ＦｃＲγＩ’　１尾が得られ、これはカルシウムを起動しまたは細胞溶解を 誘導する能力を欠いていた（第１５Ｄ図および第１５Ｅ図）。

「これらの大まかな測定によって定義される「活性要素」は比較的大きく　（３ ６アミノ酸）、１６残基数だけ離れた２個のチロシンを含んでいる。

実施例Ｘ 本発明による他の細胞内およびトランスメンブランシグナル形質導入ドメインは 、Ｔ細胞レセプタータンパク質、ＣＤ３デルタおよびＴ３ガンマ−１およびＢ細 胞レセプタータンパク質、ｍｂｌおよびＢ２９から誘導することができる。これ らのタンパク質のアミノ酸配列を、第１６図（ＣＤ３デルタ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２４）、第１７図（Ｔ３ガンマ−、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）、第１８図 （ｍｂｌ；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）および第１９図（Ｂ２９；ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：２７＞に示す。

細胞溶解シグナルの形質誘導に十分な（したがって、好ましくは本発明のキメラ レセプターに包含される）配列の部分を括弧で示す。これらのタンパク質ドメイ ンを含むキメラレセプターを構築し、一般的には前記のように本発明の治療法に 用いる。

実施例ＸＩ 実験的方法：ワクシニア感染および放射免疫沈澱法的５Ｘ１０６個のＣＶ１細胞 を血清不含ＤＭＥ培地で、組換えワクシニアで１時間感染させ、感染多重度（ｍ ｏｉ）を少なくとも１０とした（ＣＶＩ細胞について測定したタイター）。感染 の後、細胞を新鮮な培地に移し、メチオニンおよびシスティン不含ＤＭＥＭ（Ｇ ｉｂｃｏ　；グランド・アイランド、ニューヨーク州）中で２００μＣ１／ｍ１ ３５Ｓ−メチオニン＋システィン（Ｔｒａｎ３５Ｓ−ラベル、ＩＣＮ；ニアスト ・メサ、カリフォルニア州）で代謝的に６時間標識した。標識した細胞を、１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳで脱着させ、遠心分離によって収集し、１％ＮＰ−４ ０、Ｏ，ｌ５ＤＳ。

０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５Ｍ　Ｔｒｉｓ％ｐＨ８，０，０，５ｍＭ　ＥＤ ＴＡおよび１ｍＭ　ＰＭＳＦで溶解した。核を遠心分離によって除去し、ＣＤ４ タンパク質を０ＫＴ４抗体および抗−マウスＩｇＧアガロースで免疫沈澱した（ ＣａｐｐｅＬダーハム、ノース・カロライナ州）。試料を、非還元（Ｎ　Ｒ）条 件下および還元（Ｒ）条件下で８％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル中で電気泳 動を行った。　Ｓで標識した試料を含むゲルをＥ　ｎ　３Ｈａ　ｎ　ｃ　ｅ　（ Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン、マサチューセッツ州）に 浸漬した後、オートラジオグラフィを行った。ＣＤ１６のトランスメンブラン形 、ＣＤ１６．Ｈの促進された発現を、単にＣＤ１６．Ｍで感染されたＣＶＩ細胞 における発現を、ＣＤ１６ＴＭおよびζまたはガンマ−キメラをコードするウィ ルスで同時感染した細胞での発現と比較することによって測定した。感染し、６ 時間以上インキュベーションした後、細胞をＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡでプレー トから脱着させ、ＣＤ１６ＴＭまたはキメラの発現を間接免疫螢光およびフロー サイトメトリーによって測定した。

カルシウムフラックス分析 ジュルカットサブラインＥ　６　（Ｗｅｉｓｓら、Ｊ、　１ｍ１ｕｎｏ１、、　 ＋３３：１２３−１．２８　（＋９８４）　）細胞を、血清不ａＩＭＤＭ中で絹 換えワクシニアウィルスにｍａｉｌＯで１時間感染させ、ＩＭＤＭ、１０％ＦＢ Ｓ中で３〜９時間インキュベーションした。細胞を遠心分離によって収集し、１ ｍＭ　Ｉｎｄｏ−１アセトメトキシエステル（Ｇｒｙｎｋｉｅｖｉｃｚ　ら、Ｊ 、　ＢＩｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６０：　３３４０−３４５０（１９８５））　 （分子プローブ）を含む完全培地に３×１０６個の細胞数／ｍｌで再懸濁し、３ ７℃で４５分間インキユヘーンヨンした。Ｉｎｄｏ−１を添加した細胞をペレッ ト化し、血清不含ＩＭＤＭ中に１×１０６／ｍｌで再懸濁し、室温で暗所に保存 した。細胞をフローサイトメトリーにより紫色および青色螢光放射を同時に測定 することによってＪＭのカルシウムイオンを分析した＜Ｒａｂｉｎｏｖｊｔｃｈ ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３７：　９５２−９６１　（１９８Ｂ））　。

カルシウムフラックスを開始するため、フイコエリトリン（Ｐ　Ｅ）抱、３Ｌｅ ｕ−３Ａ　（抗−ＣＤ　４　）　（ＢｅｃｔｏｎＤｉＣｋｉｎｓｏｎ　、リンカ ーン・パーク、ニューシャーシー州）を１８ｇ　／　ｍ　ｌで細胞懸濁液に加え た後、時間０に未抱合のヤギ抗−マウスＩｇ０１０μｇ　／　ｍ　ｌを加えるか 、または未抱０３ＧＢ　（、抗−ＣＤ１６）モノクローン性抗体を１μｇ　／　 ｍ　ｌ細胞懸濁液に加えた後、時間０にＰＥｌを加えた。紫色／青色放射比のヒ ストグラムは、ＰＥ陽性（感染）細胞の個体群から収集し、これは典型的には全 細胞数の４０〜８０％であった。未感染細胞でのＴ細胞抗原レセプターは、架橋 なしに抗体０ＫＴ３によって誘導された。ＣＤ１６キメラレセブターを含む実験 には、（抗体なしで）低めの細胞内カルシウムに対するベースラインの変動を示 す試料は分析から除外した。次に、ヒストグラムデーターをライト・ハンド・マ ン（クーパーシティ、フロリダ州）ソフトウェアを用いて二元データーをＡＳＣ ＩＩに転換した後、フォートランプログラムのコレクションを用いる分析によっ て解析した。第二の抗体試薬を添加する前に紫色／青色放射比を用いて、初期の 比率を規格化して、１に設定し、残りの閾値の比を、残りの個体数の１０％が閾 値を越えるように設定した。

細胞溶解分析 ヒトＴ細胞ラインＷＨ３、ＣＤ８＋ＣＤ４　ＨＬＡＢ４４制限細胞溶解性ライン をＩＭＤＭ、ＩＬ−２１００Ｕ／ｍｌ含む１０％ヒト血清に保持し、放射線照射 した（３０００ラツト）ＨＬＡに釣り合わない末梢血リンパ球およびフィトヘマ グリチニン１μｇ　／　ｍ　１で非特異的に、または放射線を照射したＢ４４を 含む単核細胞で周期的に刺激した。非特異的刺激から１日後に、ＰＨＡに新鮮な 培地を添加して０．５μｇ／ｍｌまで希釈し、３日後に培地を取り替えた。刺激 を加えてから少なくとも１０日間、細胞を生育させた後、細胞障害性分析に用い た。細胞を血清不含培地中で組換えワクシニアに１時間感染させ、少なくとも１ ０の感染多重度とした後、完全培地中で３時間インキュベーションした。細胞を 遠心分離によって収集し、１×１０７個の細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。完全 培地１００μｌ／ウエルを含むＵ字形マイクロタイタープレートのそれぞれのウ ェルに１００μｌを加えた。細胞を、２倍の連続段階で希釈した。それぞれ試料 についての２つのウェルにはリンパ球が含まれておらず、クロムの放出が自然に 起こり、全クロム吸収を測定することができた。ヘラサプラインＳ３からの標的 細胞を、６．０または１０．０ｃｍのプレート中で、ｍｏｉが約１０で１時間血 清不含培地中で感染させた後、完全培地で３時間インキュベーションした。

次に、これらをＰＢＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡで皿から脱着させ、計数した。標的細 胞１０６個のアリコート（ヘラ、ラジ、またはＣＤ４キメラレセプター実験用の ＲＪ２゜２．５細胞および３０８　１０−２細胞；　５ｈｅｎら、Ｍｏｌ。

１ｍ５ｕｎｏ１．、２６：　９５９　（１９８９）　、ＣＤ　１６キメラレセブ ター実験用）を遠心分離し、無菌の５１ｃｒ−クロム酸ナトリウム（１ｍＣｉ／ ｍ　ｌ、Ｄｕｐｏｎｔ、ウイルミングトン、プラウエア州）５０μｍに３７℃で 断続的に混合しながら１時間再懸濁させた後、ＰＢＳで３回線状した。培地に１ ０５個の細胞数／ｍｌで再懸濁した標識した細胞１００μｌを、それぞれのウェ ルに加えた。ラジおよびＲＪ２．２．５標的細胞を、ヘラ細胞と同様に標識した 。

マイクロタイタープレートを７５０Ｘｇで１分間回転させ、３７℃で４時間イン キュベーションした。インキュベーション期間が終了したならば、それぞれのウ ェルの細胞を緩やかにピペッティングすることによって再懸濁させ、試料を採取 して取り込まれた総カウント数を測定し、マイクロタイタープレートを７５０Ｘ ｇで１分間回転させた。上澄液１００μｌアリコートを採取し、ガンマ−線シン チレーションカウンターで計数した。殺生率を、フローサイトメトリーによって 測定した感染した標的細胞の画分（通常は５０〜９０％）について補正した。

感染したエフェクター細胞に対して、エフェクター：標的比を、感染した細胞の 割合（通常はＣＤ４キメラレセプター実験に対して２０〜５０％であり、ＣＤ１ ６キメラレセブター実験に対して〉７０％）に対して補正した。

ζ配列のイン・ビトロでの突然変異誘発ζ配列のアミノ酸残基１１および／また は１５で点突然変異を作り出すために、ζトランスメンブランドメインの上流の ＢａｍＨ１部位から伸びており且つ元のζ残基１１をＣｙｓからＧｌｙへ（０１ １Ｇ）または残基１５をＡｓｐからＧｌｙへ（Ｄ１５Ｇ）へ転換し、または両方 （Ｃ１１Ｇ／Ｄ　１５Ｇ）を行う合成オリゴヌクレオチドブライマーを作成し、 ＰＣＲ反応で用いて、突然変異したフラグメントを生成させ、これを野生型ＣＤ ４　：ζ構成物に再インサートした。

ζ欠失を作るために、ζｃＤＮＡ配列を、残基５０．５９または６５の後に停止 コドン（ＵＡＧ）を作るように設計された合成オリゴヌクレオチドブライマーを 用いて、ＰＣＨによって増幅した。プライマーは、通常はＣＧＣＧＧＧ　ＣＧＧ 　ＣＣＧ　ＣＴＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１１）の形態の配列で、最後の３ 残基は停止アンチコドンに対応する５′末端から５または６残基数インデントし た酵素Ｎｏｔｌに対する開裂部位を含んでいた。Ｎｏｔｌおよび停止アンチコド ンな１８個以上の残基が続いた。生成するキメラは、それぞれＣＤ１６：ζＹ５ １　、ＣＤ１６：ζＥ６０１＊ およびＣＤ１６：ＣＤ６６　と呼ばれた。トランスメンブランドメインの上流の ＢａｍＨ１部位およびＮｏｔ１部位を用いて、野生型ＣＤ１６：ζ構成物に再導 入されるフラグメントを生成させた。モノマー性ζキメラを、前記のＡｓｐ−お よびＣｙｓ　ＣＤ４：ζ構成物をＢａｍＨｌおよび５ａＣＩで消化することによ ってζトランスメンプランおよび膜近位細胞内配列を解放し、このフラグメント をそれぞれＣＤ１６：ζＥ６０　およびＣＤ］６　ＣＤ６６　にインサートする ことによって作っｔこ。

ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５）およびＣＤ１６：７ζ構成物ＣＤ１６：ＣＤ６ ６”を作成するため、トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインの１７ 個の引き続く残基に対応するζｃＤＮＡ配列を、ＣＤ５およびＣＤ７ｃＤＮＡか ら得られた対応するトランスメンブランおよび細胞質ドメインに置き換えた。Ｃ Ｄ５およびＣＤ７フラグメントは、ＢａｍＨＩ制限開裂部位を有し且つそれぞれ ＣＤ５およびＣＤ７のトランスメンブランドメインの直ぐ上流の領域に対応する 前進オリゴヌクレオチドおよびこれに続くそれぞれＣＤ５およびＣＤ７配列と重 複する復帰オリゴヌクレオチドおよび５ａｃｌ制限開裂部位を含むζ配列を用い るＰＣＲ反応によって生成した。

ＣＤ５　：ζ：　ＣＧＣＧＧＧ　ＣＴＣＧＴＴ　ＡＴＡ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴ Ｔ　ＣＴＧＧＣＧ　ＣＴＧ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： 　１２）ＣＤ７　：ζ：　ＣＧＣＧＧＧ　ＧＡＧ　ＣＴＣＧＴＴ　ＡＴＡ　ＧＡ Ｇ　ＣＴＧ　ＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＡＴＣＣＣＧ　（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１３）。

ＣＤ５およびＣＤ７　ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＳａｃ　Ｉで消化し、Ｂ ａｍＨＩおよび５ａｃＩで消化したＣＤ１６：ζＥ６０”に連結し、ＢａｍＨＩ から５ａｃｌまでのζ配列をＣＤ７フラグメントで置き換えた。

構成物ＣＤ１６：ＣＤ５及びＣＤ１６：ＣＤ７を作成するため、ＣＤ５およびＣ Ｄ７フラグメントを、ＮｏｔＩ制限開裂部位を含みそれぞれＣＤ５およびＣＤ７ の残基Ｇ１０４１６およびＡ１ａ１９３の後の停止コドン（ＵＡＡ）をコードす るオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって得た。ＣＤ５およびＣＤ７　ＰＣ ＲフラグメントをＢａｍＨＩおよびＮｏｔｌで消化し、ＣＤ１６：ζＡｓ　ｐ６ ６　構成物に挿入した。

ζ細胞溶解性シグナル形質導入モチーフ内のＮ−末端残基のイン・ビトロでの突 然変異誘発 ζモチーフ内のＳａｃ　１部位から伸張し、元の残基４８をＡｓｎからＳｅｒへ （Ｎ４８Ｓ）、残基５０をＬｅｕからＳ　ｅ　ｒ　ヘ（Ｌ　５０　Ｓ　）　、残 基５１をＴｙｒからＰｈｅへ（Ｙ５１Ｆ）転換する合成オリゴヌクレオチドブラ イマーを合成し、ＰＣＲ反応で使用し、野生型ＣＤ１６：７：ζ（４８−６５） 構成物に再導入するフラグメントを生成させた。

ζ細胞溶解性シグナル形質導入モチーフ内のＣ−末端残基のイン・ビトロでの突 然変異誘発 Ｎｏｔ１部位３′から停止コドンまで伸張し、元の残基６０をＧｌｕからＧｌｎ へ（Ｅ６０Ｑ）、残基６１をＧｌｕからＧｌｎ　（Ｅ６１Ｑ）　、残基６２をＴ ｙｒからＰｈｅまたはＳｅｒへ（Ｙ６２ＦまたはＹ６２Ｓ）、残基６３をＡｓｐ からＡｓｎへ（Ｄ　６３　Ｎ）転換する合成オリゴヌクレオチドブライマーを合 成し、ＰＣＲて用いて、ＢａｍＨ１部位からＮｏｔＩ部位までの野生型のＣＤ１ ６：ＣＤ６６　構成物にサブクローンした。

トランスメンブランと細胞内ドメインとの間の接合部にＭ　ｌ　ｕ　ＩおよびＮ ｏｔ１部位を有するＣＤ７トランスメンブランフラグメントを、下記の配列を有 するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって得た：ＣＧＣＧＧＣＧＣＧ　Ｇ ＣＣＡＣＧ　ＣＧＴ　ＣＣＴ　ＣＧＣＣＡＧ　ＣＡＣＡＣＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：　１４）。

生成するＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、ＣＤ１６：７ ：ζ（４８−６５）構成物に再インサートした。残基３３〜６５．７１〜１０４ および１０４〜１３７をコードするζフラグメントを、前進プライマーの５′末 端にＭ　ｌ　ｕ　１部位および停止コドンと、続いて復帰プライマーの５′末端 にＮｏｔ１部位を含むプライマーの対を用いてＰＣＲ反応によって得た。それぞ れの場合に、制限部位をプライマーの５′末端から６残基数インデントして、制 限酵素による開裂が確実に起こるようにした。

ζ３３　：　ＣＧＣＧＧＧ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＴＴＣＡＧＣＣＧＴ　ＣＣＴ　Ｃ ＧＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１５）ζ７１　：　ＣＧＣ ＧＧＧ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＧＡＣＣＯＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＧＧ＾＾＾ Ｇ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１Ｂ）およびζ　１　０４　：　ＣＧＣＧＧＧ　 ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＡＴＴ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣＧＡＧ　ＣＧＣ（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１７）　。

ＦｃＲγＩＩＡ欠失突然変異体の構築 カルボキシル末端ＦｃＲＩＩＡ欠失突然変異体は、完全な長さの構成物について と同様に、２８２及び２９８の位置のチロシンをコードする配列を停止コドン（ ＴＡＡ）に転換して、ＰＣＲによって構築した。Ｎ−末端欠失は、生成するフラ グメントをＭ　ｌ　ｕ　ＩおよびＮｏｔｌ制限部位の間の、ＣＤ７トランスメン ブランドメインに融合したＣＤ１６細胞内ドメインをコードする予め構築されて いる発現プラスミドに挿入することができるオリゴヌクレオチドであって、ＣＤ ７トランスメンブランドメインがこのトランスメンブランと細胞内ドメインとの 間の接合部におけるＭ　１　ｕ　１部位に末端があるものを用いて、ＰＣＲによ って細胞内ドメインを順次少なくコードするフラグメントを増幅することによっ て得た。

他の態様 前記の実施例は、ζ、ηまたはγキメラの集合がＴ細胞で細胞溶解性エフェクタ ー細胞応答を開始するのに十分であることを示している。Ｔリンパ球、ナチュラ ルキラー細胞、好塩基性顆粒細胞、マクロファージおよび肥満細胞を含むζ、η およびγが既知の範囲で発現することは、保存された配列モチーフか造血臓器の 細胞に共通な感覚装置と相互作用することができ、免疫系における宿主防御の重 要な成分をレセプターが集合することによって媒介することができることを示し ている。

細胞溶解性応答の効力と、ＭＨＣクラスＩＩレセプターを有する標的細胞に対す る応答がないことは、ζ、ηまたはγに基づくキメラが養子免疫療法によりＡＩ ＤＳに対する遺伝子による介在の基礎を形成することを示している。内因性ζお よびγが広く分布しており、γに関連したＦｃレセプターが異なる細胞種におけ る細胞障害性を媒介することが明らかなことから（Ｆａｎｇｅｒら、１ｓｓｕｎ ｏ１．　Ｔｏｄａｙ、　１０：　９２−９９　（１９８９））　、様々な細胞を この目的に考慮することができる。例えば、好中性顆粒球は、循環において寿命 が極めて短く　（約４時間）、細胞溶解性が高いものであり、キメラの発現のた めの好ましい標的細胞である。好中球がＨＩＶに感染しても、ウィルスを放出し ないと思われ、これらの細胞（最も有力なものは白血球）が多量に存在すること から宿主の防御が容易になる。もう一つの注目に値する宿主細胞の可能性は、レ トロウィルスの処理に現在のところ容易に入手し得る個体の成熟Ｔ細胞である（ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ａ、　、Ｓｃｊ＾ｔｒ、、　２６２：　６２−６９ 　（１９９０）　）。組換えＩ　Ｌ−２の助けにより、Ｔ細胞の個体群は培養で 比較的容易に増加させることかでき、しかも増加した個体群は、再浸出するとき には、典型的には寿命が短いのである（　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ、Ｅｎｇｌ 、Ｊ、Ｍｅｄ、＋　３２３：　５７０−５７８　（１９９０））　。

適当な条件下では、ＣＤ４キメラを発現する細胞によりＨＩＶが認識されると、 細胞分裂を誘発する刺激も供給され、修飾された細胞群はウィルスの負荷に対し てダイナミックに応答することができる。本明細書出は細胞溶解性Ｔリンパ球に おける融合タンパク質の挙動に注目してきたが、ヘルパーリンパ球でキメラ体が 発現すれば、サイトカインのＨＩＶによって起動される供給源が提供され、この サイトカインはＡＩＤＳでのヘルパー細胞サブセットの崩壊を防止することがで きる。ウィルスの浸透以外の段階での感染の防止処理の幾つかの方法の最近の報 告（Ｆｒ１ｅｄｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３５：　４５２−４５４　（１９ ８ｇ）　；Ｇｒｅｅｎ　ら、Ｃｅ１１．５８：　２１５−２２３　（１９８９） ＨＨａｌｌｓ　ら、Ｃｅ１ｌ。

５８：　２０５−２１４　（１９８９）；　Ｔｒｏｎｏ　ら、Ｃｅ１１．５９： 　１１３−１２０（１９８９）；　Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　 ３４５：　６２５−８２８　（１９９０））は、ＣＤ４キメラを有する細胞を設 計により、作用の細胞内部位を有する適当な因子の発現によりウィルスの産生を 妨げるようにすることができることを示唆している。

自律的キメラにより１９２３球にシグナルを伝達することができれば、イン・ビ ボでレトロウィルスによって操作されたリンパ球を制御することもできるように なる。

例えば、補体結合ドメインを除去するように操作された特異的１ｇＭ抗体によっ て媒介される架橋刺激により、これらのリンパ球の数をその場で増加させること ができ、同様な特異的１ｇＧ抗体（例えば、キメラ鎖に操作を行ったアミノ酸変 異体を認識するもの）で、操作された個体を選択的に欠失することができる。更 に、抗−ＣＤ４キメラ抗体はＣＤ４　：ζキメラ体を発現するジュルカット細胞 でカルシウムを起動するのに追加の架橋を必要としない（データーは示していな い）。反復した体外での増幅に頼ることなしに細胞個体数を制御することができ れば、遺伝子操作を行ったＴ細胞について提案される現在の用途の範囲および効 力を実質的に拡大することができる。

ζ、ηまたはγ細胞内配列から成る他のキメラ体を作るためには、レセプターの 細胞外ドメインをコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａまたはゲノム配列に、選択するトラ ンスメンブランドメインの直ぐ前の位置に導入される制限部位を付与することが できる。次に、制限部位に末端がある細胞外ドメインフラグメントを、ζ、ηま たはγ配列に結合することができる。典型的な細胞外ドメインは、補体、炭水化 物、ウィルスタンパク質、細菌、原生動物または後生動物寄生虫、またはそれら によって誘導されるタンパク質を認識するレセプターから誘導することができる 。

同様に、病原体または腫瘍細胞によって発現されるリガンドまたはレセプターを ζ、ηまたはγ配列に結合し、これらのリガンドを認識するレセプターを有する 細胞に対する免疫応答を指示することができる。

本発明をその具体的な態様に関して記載してきたが、更に変更を行うことができ 、且つ本出願は本発明の変異体、使用または適合を包含し、本発明が関係する技 術分野にあり且つ請求の範囲に記載されている上記の本質的な特徴に応用するこ とができる本発明の開示からの離反を包含することを理解されるであろう。

配列リスト （１）　一般的情報 （１）出願人：ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション （ｉｆ）　発明の名称：レセプターキメラによる細胞性免疫の再設定 （Ｉｎ　配列の数：２７ （Ｉｖ）　連絡先 （Ａ）住所：　フィッシュ・アンド・リチャードソン（Ｂ）番地：　２２５、フ ランクリン・ストリート（Ｃ）市　：　ボストン （Ｄ）州　：　マサチューセッツ （Ｅ）国　：　アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　０２１１０−２８０４（Ｖ）　コンピューターで判読可能な 形態：（Ａ）媒体の種類＝　３゜５”ディスク、１．４４　Ｍｂ＜Ｂ’）’：ｊ ＞ビューター：　ＩＢＭ　ＰＳ／２モデル５ｏｚマタハ５ＳＸ （Ｃ）オペレーティング・システム：　ＩＢＭ　Ｐ、Ｃ，ＤＯＳ（３，３０版） （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（５，０版）（ｖＤ　現在の出願デー ター （＾）出願番号： （Ｂ）出願臼。

（Ｃ）分類： （Ｖ目１）弁理士／代理人情報： （Ａ）名称：クラーク、ボール・ティー（Ｂ）登録番号：　３０，１６２ （Ｃ）参照／証明書番号：　００７８６／１１９００２（１ｘ）　電話連絡情報 ： （Ａ）　ｉ話：　（８１７）　５４２−５０７０（Ｂ）　ファクシミリ＋　（８ １７）　５４２−８９０６（Ｃ）　テレックス：　２００１５４ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１に対する情報（１）　配列の特徴 （Ａ）長さ：　１７２Ｂ塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖＝　２本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （ｉｆ）　分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列の説明：　ＳＥｏ　１０ 　ＮＯ：　１社１驕α！　０Ａｌｆｆ冗Ｃ−τＡα℃にコ１０ゴαｔπχ寞心μ α窃に　５０ｃｃｘａｘ＾ｅｃＴＧ　入Ｇ入ＧｅＡＡ入入τ　ｘｃｈａｃｈｏａ ｈａ　’ｘａｃ＾ＧｈＧｋＣｔ　（ｉｃＴＯｃｃＡＡｃｅ　１３００Ｑｌｕ６ｅ ｎ　ＧＧＡＣＣＡＡＧＧＡ入＾ｃｒｘｃｃｃｃｃπにｍ可コＡ　ｔＸ〜μでｒひ １０　３００（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４：につ０ての情報（１）　配列 の特徴： （Ａ）長さ：５７５アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）分子の種類：タンメ豪り質 （ＸＩ）　配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４：Ｑｌｍ　Ｃ’ｙｍ　ＬＪ ｕ　Ｌｓｕ　Ｓｓｒ　Ａｓｐ　Ｓｓｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｍ　Ｖａｎ　Ｌａｕ　Ｌ暑 ｕ　Ｏｌｕ　ｍａｒ　Ａｇｅ　１１■ ３７０　３フ５　３１１０ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・５についての情報（１）　配列の特徴 （Ａ）長さ：４６２アミノ酸 （Ｂ）種類、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・線状 り１１）分子の種類、タンパク質 （Ｎ）　配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　５：Ｌｙｅ　（ｌｌｙ　Ａｓｐ 　Ｔｈｒ　Ｖａｎ　Ｏｌｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　＾ｌａ　Ｓ＠ｒ 　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　Ｌｙｅ　！＋Tｒ Ｌｙ＠入５ｒｓＬｓｕＬｙ＠！ｌ５Ｏ１ｕ＾５ｐ５ａｒＪｖｐ？ｈｒＴｙｒｆｌ ａＣｙｓ６１ｕＶａｌＧｌｕムｓｐ　Ｇ１１ｌ　ＬＹｇ　Ｇｌｕ　ａｌｕ　Ｖａ ｌ　Ｃ１ａ　Ｌ＠ｕ　Ｌｓｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｓ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　＾１ ｍ　Ａｇ■ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　Ｂについての情報（［１）種類・アミノ酸 ｕｌｍ　Ｙ翻　ｔＪｍ　ＰｒＯｌｌａ　ＪＬＩＩＩ　丁ｈｒ　Ｏｌｎ　Ｏｌｖ　 Ａ１１ｌｌ　ＬＦ＠　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｌ・ｕ　Ｏｌｙ　Ｌ凾■ Ｉｍｔ　（Ｉｌｙ　（Ｓｌｙ　ＬｙＩＩｌｌｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ａ ｈａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｏｌｕ　Ｏｌｙしｈａ　ｑｒ　Ａｇ{１ ４６Ｓ　４〕０　４フｓ　４−０ （ｘｌ）　配列の説明：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１６：αに一×１αにσ■講 ＣＣσ■ＩＧ＾ににＯ叱に＾に１（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１７について の情報（１）　配列の特徴： （＾）長さ二３３塩基 （Ｂ）　ＦＪ類：核酸 （Ｃ）鎖　ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （目）分子の種Ｗ４＝核酸 （ｘｌ）配列の説明：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１７：αに小にＡＣばばＡツウ にＡτＧＮＩＧ＜にＧ＾ｏ　Ｃｃｅ（２）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：　ｔｇについ ての情報（１）　配列の特徴： （＾）長さ＝２６塩基 （Ｂ）種類・核酸 （Ｃ）鎖　ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー・線状 （ＩＩ）分子の種類：核酸 （ｘｌ）配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋　１８：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ＋　１９についての情報（１）　配列の特徴 （＾）長さ　４２塩基 （Ｂ）　ＦＪ類二核酸 （Ｃ）鎖　一本鎖 （Ｄ）トポロジー・線状 （１１）分子の種類、核酸 （ｘｉ）　配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１９：ＣＧｅ０６ＧＯＣＧｄ 　ｅｅｃｃ？Ｉ’ＴＡｃＴ　？ＡＴ’ｒＡｅ？Ｏ？Ｔ　ａｘｅｘＴＧＧ丁ｃａ　 Ｔτ（２）　ＳＥｏ　１０　Ｎｏ＋　２０についての情報（＋）　配列の特徴： （＾）長さ＝３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （目）分子の種類：核酸 （ｘｌ）配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２０：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：　２１についての情報（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）長さ＝３２塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （１１）　分子の種類：核酸 （ｘｌ）配列の説明：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２１：粥オ小にＯα４Ｃαに℃ −ｕ五Ｉ＾Ｃ復ｔテαに４π（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２２についての情 報（１）　配列の特徴： （＾）長さ＝３１塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　二一本膜 （Ｄ）トポロジー：線状 （ＩＩ）分子の種類：核酸 （ｘｌ）配列の説明：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２２：ｍｈｏ　ｋｃＡＡｃｃＴ Ｇｋｋ　０ＡＡｊｌＣＣｊＬＪＬＣＩＬ　ｋ（２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　２ ３についての情報（１）　配列の特徴： （Ａ）長さ二３１塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー・線状 （１１）分子の種類：核酸 （ｘｌ）配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２３：（２）　ＳＥＱ　ｆＤ　 ＮＯ：　２４についての情報（１）　配列の特徴。

（＾）長さ：　１７１アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （１１）分子の種類二アミノ酸 （ｘｌ）配列の説明：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２４：ｋｌａｔ　Ｏｌｕ　ｍｉ ｓ　Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　デｈ＠　Ｌａｕ　ｊ＠ｒ　Ｏｌｙ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌａ ｕ　Ｊｕａ　Ｔｈｒ　Ｌｎｕ　Ｌａ■ ＸＪｎ　１ｉｌＬａ　Ｏｌｙ　Ｔｈｒ　ＸＡｕ　＾１ｍ　Ｏｌａ　露ｏｒ　Ｘｌ ｇａ　Ｌｙｅ　Ｏｌｙ　＾−鵡　厘ｉｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　kｙ− スＱ　２５　３０ ＬＹＳ　ｌｒｇ　Ｔｒｐ　０１ｎ為ａｍ　ＯＬｕ　Ｌｙｓ　１ｌｈａ　Ｏｌｙ　 Ｖａｌ＾ｓｐ　ｌｂｔ　Ｐｍ　ｋｓｐ＾ｍｐ　？ｙｒｉｔｓ　１フＯｌフＳ 蛍光強度 ＦＩＧ、　１ｃ ・＃　−−ＣＤ４ ・　し　ＣＤ４：（ａ： ・　＠４１　ＣＤ４ニア・ ＦＩＧ、　２ 蛍光強度 ＦＩＧ、　３ａ −４４ＣＤ４：（ ◆　ＣＤ４：Ｃ１１Ｇ／Ｄ１５Ｇぐ ・　ＣＤ４：ぐ −Ｉ　ＣＤ４：Ｃ１Ｉ　Ｇぐ ・　）　ＣＤ４：Ｄ１５Ｇぐ　匡 ＠　ＣＤ４：Ｃ１１Ｇ１０１５Ｇ（ ＦＩＧ、　３ｂ 蛍光強度 ＦＩＧ、　４ａ Ｏ，０１００，０２００，０３００，０４００，０時間　（秒） ＦＩＧ、　４ｂ ＦＩＧ、　４ｃ Ｏ，０１００，０２００，０３００，Ｏａ、０時間　（秒） ＦＩＧ、　４ｄ Ｏ，０１００，０２００，０３００，０４００，０ＦＩＧ、　５ａ ＦＩＧ、　５ｂ Ｅ／Ｔ比 ＦＩＧ、　５ｃ 蛍光強度 ＦＩＧ、　６ａ ＦＩＧ、　６ｂ １：”ｌ（３，７ｂ−ＦＳＰＰＱＡＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧ　ＣＤ１６°Ｃ時間　 （秒） ＦＩＧ、　８ａ Ｆ３４”　Ｙ５１゜ ＦＩＧ、　８ｂ Ｅ／Ｔ比 、８１　．１　１　１０　１００ 時間　（秒） ＦＩＧ、　１０ａ ・０１　．１　１　１０　１００ Ｅ／Ｔ比 ＦＩＧ、　１０ｂ 、０１　．１　１　１０　１００ Ｅ／Ｔ比 ＦＩＧ、１１ｂ ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、　１３ａ 時間　（秒） ＦＩＧ、　１３ｂ 時間　（秒） ＦＩＧ、　１４ａ ＦＩＧ、　１４ｂ ＦＩＧ、　１５ｂ ＦＩＧ、　１５ｄ ＦＩＧ、　１５ｅ ＦＩＧ、１６　（Ｓｅｑ、　ＩＤ　Ｎｏ：　２４）Ｉ　ＭＥＨ９ＴＦＬＳＧＬ　 ＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳ　ＰＦＫＩＭＥＥＬＥ　ＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳ　ＩＴＳｆ ＶＥＧＴＶＧＴ５１　ＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬ　ＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩ　ＹＲＣＮ ＧＴＤＩＹＫ　ＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹ　ＲＭＣＱＳＣＶＩ：ＬＤｌｏｌ　ＰＡＴ ＶＡＧＩＩＶＴ　ＤＶＩＡＴＬＬＬＡＬ　ＧＶＦＣＦＡＧＨＥＴ　ＬＳＧＭＤＴ Ｑ　ＡＬＬＲＮＤＱｖＹＱ１５１　ＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹ　５ＨＬＧＧＮ％４Ａ ＲＮ　Ｋ會ＦＩＧ、　１７　（Ｓｅｑより　Ｎｏ：　２５）１　ＭＥＱＧＫＧＬ ＡＶＬ　ＩＬＡＩＩＬＬＱＧＴ　ＬＡＱＳＩＫＧＮＨＬ　Ｖ）ＣＶＹＤＹＱＥＤ Ｇ　５ＶＬＩ、ＴＣＤＡＥＡ５１　ＫＮＩＴＩｌｌＦＫＤＧＫ　ＭＩＧＦＬＴＥ ＤＫＫ　ＫＷＬＧＳＮＡＫＤ　ＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳ　ＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹｌ ｏｌ　ＹＲＭｃＱｎｃｘｐ−ＬＮＡＡｒｘｓａｒｔ、ｒ　ｘＥｚｖｓｚＦｖＬＡ ＶＧＶＹＦＴＡＧＱＤ　巨弼垣厚薫ｘ１５１　ＱＴＬＬＦＮＤＱＬＹ　ＱＰＬＫ ＤＲＥＤＤＱ　ＹＳ）ＩＬＱＧＮＱＬＲ沿けＦＩＧ、１８　ｔｓ＠ｑ　ｘｏ　Ｎ ｏ：　２６）Ｉ　ＭＰＧＧＬＥＡＬＲＡ　ＬＰＬＬＬＦＬＳＹＡ　ＣＬＧＰＧＣ ＱＡＬＲＶＥＧＧＰＰＳＬＴＶ　ＮＬＧＥＥＡＲＬＴＣ５１ＥＮＮＧＲＮＰＮＩ Ｔ　ＷＷＦＳＬＱＳＮＩＴ　ＷＰＰＶＰＬＧＰＧＱ　ＧＴＴＧＱＬＦＦＰＥ　Ｖ ＮＫＮＴＧＡＣＴＧ５１　ＲＦＡＡＫＫＲ９ＳＭ　ＶＫＦ）ＩＣＹＴＮＨ５ＧＡ ＬＴＷＦＲＸＲＧ　５ＱＱＰＱＥＬＶＳＥ　ＥＧＲＩＶＱＴＱＮＧｌｏｌ　５Ｖ ＹＴＬＴＩＱ？ＪＩ　ＱＹＥＤＮＧＩＹＦＣＫＱＫＣＤＳＡＮＨＮ　ＶＴＤＳＣ Ｇ置Ｌ　ＶＬＧＦＳＴＬＤＱＬ１５１　ＫＲＲ？ＪＴＩＪＤＧＩ　ＩＬＩＱＴＬ ＬＩＩＬ　ＦＩＩＶＰＩＦＬＬＬ　Ｄ　ＤＧＫＡＧＭＥ　ＥＤＨＴＹＥＧＬＮ工 ２０１　ＤＱＴＡＴＹＥＤＩＶ　ＴＬＲＴＧＥＶＫＷＳ　ＶＧＥＨＰＧ　Ｅ査国 際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／６２　 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４Ｂ／／　Ｃ０７Ｋ　１３１００　８３１８ −４Ｈ（７２）発明者　コーラナス、ウォルデマーアメリカ合衆国マサチューセ ッツ州、ウォータータウン、テンプルトン、パークウェイ、８１ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞応答を、感染因子、該因子で感染した細胞、腫瘍着しくは癌性細胞、ま たは哺乳類の自己免疫によって生成した細胞に向ける方法であって、該方法は上 記の哺乳類に治療細胞の有効量を投与することからなり、この細胞が上記の因子 または上記の細胞を特異的に認識して破壊することができることを特徴とする方 法。 ２．前記の細胞応答がＭＨＣから独立している、請求の範囲第１項に記載の方法 。 ３．前記の治療細胞が、膜に結合したタンパク質性のキメラレセプターを発現し 、該レセプターが（ａ）前記の因子または前記の細胞を特異的に認識し、結合す ることができる細胞外部分と、（ｂ）前記の治療細胞にシグナルを送り、レセプ ターに結合した因子またはレセプターに結合した細胞を破壊することができる細 胞内またはトランスメンプラン部分とから成る、請求の範囲第１項に記載の方法 。 ４．前記の細胞内部分または前記のトランスメンプラン部分が、Ｔ細胞レセプタ ータンパク質、Ｆｃレセプタータンパク質またはＢ細胞レセプタータンパク質の シグナル形質導入部分、またはその機能性誘導体である、請求の範囲第３項に記 載の方法。 ５．前記のレセプター部分が、ζ、η、γ、ＣＤ３デルタ、Ｔ３ガンマー、ｍｂ １またはＢ２９である、請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．前記のキメラレセプターが、 （ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸４２１〜５３２、（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：６のアミノ酸４２３〜４５５、４３８〜４５５、４６１〜４９４または ４９４〜５２８、（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸４００〜４２０、（ ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のアミノ酸４２１〜５７５、（ｅ）ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：４のアミノ酸４２３〜４５５、４３８〜４５５、４６１〜４９４または４ ９４〜５２８、（ｆ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のアミノ酸４００〜４２０、（ｇ ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５のアミノ酸４２１〜４６２、（ｈ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：５のアミノ酸４０２〜４１９、（１）第１５Ａ図のアミノ酸Ｔｙｒ２８２〜 Ｔｙｒ２９８、（ｊ）第１６図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）のアミノ酸１３２ 〜１７１、 （ｋ）第１７図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）のアミノ酸１４０〜１８２、 （ｌ）第１８図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）のアミノ酸１６２〜２２０、 （ｍ）第１９図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）のアミノ酸１８３〜２２８ から成る、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．前記の治療細胞が、 （ａ）Ｔリンパ球、 （ｂ）細胞障害性Ｔリンパ球、 （ｃ）ナチュラルキラー細胞、 （ｄ）好中性球、 （ｅ）顆粒細胞、 （ｆ）マクロファージ、 （ｇ）肥満細胞、 （ｈ）ヘラ細胞、および （ｉ）胎児幹細胞（ＥＳ） から成る群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．前記の感染因子が免疫不全症ウイルスである、請求の範囲第１項に記載の方 法。 ９．前記の細胞外部分が、ＣＤ４のＨＩＶエンベロープ結合部またはその機能性 ＨＩＶエンベロープ結合部誘導体である、請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．前記の細胞障害性Ｔリンパ球がＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球である、請 求の範囲第９項に記載の方法。 １１．タンパク質性膜に結合したキメラレセプターを発現する細胞であって、前 記のレセプターが、（ａ）感染因子、感染因子に感染した細胞、腫瘍、腫瘍若し く１は癌性細胞、または自己免疫によって生じた細胞を特異的に認識し、結合す ることができる細胞外部分と、（ｂ）前記の細胞にシグナルを送り、レセプター に結合した因子またはレセプターに結合した細胞を破壊することができるＴ細胞 レセプター、ＦｃレセプターまたはＢ細胞レセプターに由来する細胞内部分また はトランスメンプラン部分とから成る、細胞。 １２．前記の結合がＭＨＣから独立している、請求の範囲第１１項に記載の細胞 。 １３．前記のレセプタータンパク質がζ、η、γ、ＣＤ３デルタ、Ｔ３ガンマー 、ｍｂ１またはＢ２９である、請求の範囲第１１項に記載の細胞。 １４．前記のキメラレセプターが、 （ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸４２１〜５３２、（ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：６のアミノ酸４２３〜４５５、４３８〜４５５、４６１〜４９４または ４９４〜５２８、（ｃ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６のアミノ酸４００〜４２０、（ ｄ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のアミノ酸４２１〜５７５、（ｅ）ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：４のアミノ政４２３〜４５５、４３８〜４５５、４６１〜４９４または４ ９４〜５２８、（ｆ）ＳＥＱ　ｌＤ　ＮＯ：４のアミノ酸４００〜４２０、（ｇ ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５のアミノ酸４２１〜４６２、（ｈ）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：５のアミノ酸４０２〜４１９、（ｉ）第１５Ａ図のアミノ酸Ｔｙｒ２８２〜 Ｔｙｒ２９８、（ｊ）第１６図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）のアミノ酸１３２ 〜１７１、 （ｋ）第１７図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）のアミノ酸１４０〜１８２、 （ｌ）第１８図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）のアミノ酸１６２〜２２０、 （ｍ）第１９図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）のアミノ酸１８３〜２２８ のアミノ酸から成る、請求の範囲第１３項に記載の細胞。 １５．前記の治療細胞が、 （ａ）Ｔリンパ球、 （ｂ）細胞障害性Ｔリンパ球、 （ｃ）ナチュラルキラー細胞、 （ｄ）好中性球、 （ｅ）顆粒細胞、 （ｆ）マクロファージ、 （９）肥満細胞、 （ｈ）ヘラ細胞、および （ｉ）胎児幹細胞（ＥＳ） から成る群から選択される、請求の範囲第１１項に記載の細胞。 １６．前記の細胞外部分が、ＣＤ４のＨＩＶエンベロープ結合部またはその機能 性ＨＩＶエンベロープ結合部誘導体である、請求の範囲第１１項に記載の細胞。 １７．前記の細胞障害性Ｔリンパ球が、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球である、 請求の範囲第１６項に記載の細胞。 １８．前記の細胞外部分が、免疫グロブリン分子またはその抗原結合性フラグメ ントである、請求の範囲第１１項に記載の細胞。 １９．請求の範囲第１１項に記載のキメラレセプターをコードするＤＮＡ。 ２０．請求の範囲第１９項に記載のキメラレセプターＤＮＡを含んで成るベクタ ー。 ２１．哺乳類に請求の範囲第１６項に記載の宿主細胞を投与することを特徴とす る、免疫不全ウイルス感染症の治療法。 ２２．請求の範囲第１１項に記載のキメラレセプターを特異的に認識して、結合 する、実質的に純粋な抗体。