PT100511A

PT100511A - Uso de neurotrofina-4, processo de diagnostico baseado na expressao da mesma e producao de neurotrofina-4, e conjunto de diagnostico

Info

Publication number: PT100511A
Application number: PT100511A
Authority: PT
Inventors: Nancy Ip; George D Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharma; Finn Hallbook; Carlos Fernando Ibanez Moliner; Hakan Bengt Persson
Priority date: 1991-05-21
Filing date: 1992-05-21
Publication date: 1993-09-30
Also published as: JPH08510987A; NZ242813A; CA2109598A1; AU2302192A; WO1992020365A1; IE921636A1; EP0587806A1; EP0587806A4; AU674659B2

Description

-2- 73 993 6526-079-118 , MEMÓRIA DESCRITIVA^ PROCESSOS TERAPÊUTICOS E DE DIAGNÓSTICO BASEADOS NA EXPRESSÃO DE NEUROTROFINA-4

1. INTRODUÇÃO O presente invento refere-se à neurotrofina-4 (NT-4), um novo membro caracterizado, da família de genes BDNF/NGF/NT-3 e a processos de diagnóstico e terapêuticos que utilizam a neurotrofina-4 no tratamento de desordens neurológicas.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO A família do factor de crescimento do nervo inclui o factor de crescimento do nervo β (NGF), o factor neurotrofico derivado de cérebro (BDNF), e a neurotrofina-3 (NT-3), também conhecido como factor neurotrofico derivado do hipocampo (HDNF). Esta família de proteínas desempenha um papel importante no sistema nervoso de vertebrados adultos ou em desenvolvimento, apoiando a sobrevivência neuronal.

Com base na sequência de aminoácidos da proteína NGF de ratinho (Angeletti, et al. . 1973 Biochemistrv. 12: 100-115) foram isoladas as sequências de ÂDN que codificam o NGF humano e de ratinho (Scott et al.. 1983, Nature 302: 538-540; Ullrich et al.. 1983 Nature 303: 821-825). A comparação entre NGF humano e de ratinho mostrou que a proteína é conservada entre os mamíferos e apoiando isto, isolaram-se actividades semelhantes à do NGF a partir de várias espécies (Harper e Thoenen, 1991 Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 21: 205-229).

Subsequentemente, sequências de ADN de NGF de boi (Meier et al.. 1986, EMBO J. 5.: 1489-1493); de pinto (Meier et al. . EMBO J. 5.: 1489-1493; Ebendal et al.. 1986 EMBO J. 5.: 1483-1487; Wion et al.. 1986 FEBS Letters 203: 82-86); cobra (Selby et al, 1987, Neurosci. Res. 18: 293-298); rato (Whittemore et al.. 1988, J. Neurosci. Res. 20: 403-410); e porquinho-da-índia (Schwarz et al.. 1989, Neurochem. 52: 1203-1209) foram também determinadas. O factor neurotrófico derivado de cérebro (BDNF) foi inicialmente isolado de cérebro de porco (Barde et al.. 1982, /: 73 993 / 6526-079-118 -3- EMBO J. 1,: 549-553) e subsequentemente clonado a partir deste tecido como um ADNc (Leibrock et al.. 1989, Nature 341: 149-152). O gene de NT-3 foi isolado de ratinho (Hohn et al.. 1990, Nature 344: 339-341), de rato (Maisonpierre et al, 1990, Science 247: 1446-1451; Ernfors et al.. 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 5454-5458), e humano (Rosenthal et al.. 1990, Neuron 4.: 767-773), utilizando oligonucleótidos degenerados baseados na similaridade de sequência entre os outros dois factores. Os três factores apresentam aproximadamente 55% de similaridade de aminoácidos um com o outro, e a maior parte das diferenças de sequência estão presentes" em cincõ regiões que contêm motivos de aminoácidos característicos de cada proteína. Foi recentemente mostrado que a actividade neurotrófica in vitro de duas destas proteínas podia ser adquirida por combinações específicas destas regiões variáveis. 0 NGF apoia o desenvolvimento e manutenção do simpático periférico e de neurónios sensoriais derivados da cristã neural (revisto em Thoenen e Barde, 1980, Phvsiol. Rev.. 60: 1284-1325; Levi-Montalcini, 1987, Science 237: 1154-1162). Não foi encontrada qualquer actividade de BDNF em neurónios simpáticos periféricos, mas este factor apoia in vivo a sobrevivência tanto de neurónios sensoriais derivados do placódio como da cristã neural (Hofer e Barde, 1988, Nature. 331: 261-262). Os neurónios sensíveis a NT-3 in vivo permanacem sem ter sido identificados. No entanto, em gânglios explantados de pinto ou culturas neuronais dissociadas, in vitro. os três factores apoiam ambos os grupos de populações neuronais sobrepostas ou únicas, sugerindo que o NT-3 exerce também in vivo ambas as actividades neurotróficas específica ou sobreposta (Hohn et al♦. 1990, Nature. 344: 339-341; Maisonpierre et al.. 1990, Science. 247: 1446-1451; Ernfors et al. f 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 5454-5458; Rosenthal et al.f 1990, Neuron 4: 767-773). Todos os três factores são expressos em grupos específicos de neurónios no cérebro, com os níveis de ARNm mais elevados para os três factores no hipocampo (Ayer-LeLievre et al.. 1988, Science. 240: 1339-1341; Ernfors et al. . 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 5454-5458; Ernfors et al.f 1990, Neuron 5.: -4- 73 993 Ο 6526-079-118 511-526; Watmore et al.. 1991, Neurol. 109: 141-152; Hofer et al. . 1990, EMBO J. . 9.: 2459-2464; Phillips et al. . 1990, Science. 250: 290-294). No cérebro, o NGF revelou apoiar neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal (revisão em Whittemore e Seiger, 1987, Brain Res.. 434: 439-464; Thoenen et al.. 1987, Rev. Phvsiol. Biochem. Pharmacol., 105: 145-178; Ebendal, 1989, Proa. Growth Factor Res. 1.: 143-159) e BDNF revelou estimular a sobrevivência desses neurónios in vitro (Alderson et al.. 1990, Neuron 5: 297-306).

Os efeitos das três proteínas" são mediados pela sua interacção com receptores específicos presentes em células sensitivas. Foram isolados clones moleculares para os receptores de NGF (NGF-R) de rato, humano e de galinhas, e a análise da sequência de nucleótidos destes clones revelou que o NGF-R contém um domínio ligado à membrana plasmática, uma região citoplasmática e um domínio extracelular de extremidade amino, rico em cisteína (Johnson et al.. 1986, Cell. 47: 545-554; Radeke et al.. 1987, Nature. 325: 593-597; Large et al.. 1989, Neuron 2: 1123-1134). 0 NGF-R apresenta uma similaridade de sequência baixa mas significativa em relação ao receptor para um factor da necrose tumoral (Schall et al. . 1990, Cell. 61: 361-370) bem como em relação aos antigénios CD40 de superfície de linfócitos (Stamenkovic et al.f 1989, EMBO J. . .8: 1403-1410) Θ 0X40 (Mallett et al.. 1990, EMBO J.. 9: 1063-1068). 0 NGF-R pode ocorrer em dois estados aparentes, conhecidos como estados de baixa e elevada afinidade (Sutter, et al.. 1979, J. Biol. Chem.. 254: 5972-5982; Landreth e Shooter, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. JJ_x 4751-4755; Schechter e Bothwell, 1991, Cell 24: 867-874). 0 gene para o NGF-R parece codificar uma proteína que forma parte de ambos os estados de afinidade do receptor, baixa e elevada (Hampstead et al.. 1989, Science. 243: 373-375), embora apenas o receptor de elevada afinidade tenha sido proposto para mediar a actividade biológica de NGF. Ambos, BDNF (Rodriguez-Tebar et al. . 1990, Neuron, 4.: 487-492) e NT-3 (Ernfors et al.. 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87: 5454-5458) podem interagir com o NGF-R de baixa afinidade, sugerindo que o NGF-R de baixa afinidade possa estar, de um modo -5- 73 993 6526-079-118 ainda desconhecido, envolvido na mediação dos efeitos biológicos de todos os três factores.

No sistema nervoso em desenvolvimento, o NGF e o seu receptor revelaram ser sintetizados na área alvo e nos neurónios de resposta, respectivamente, no momento em que o axónio em crescimento atinge o seu alvo (Davies et al.. 1987, Nature. 326: 353-358). Em concordância com isto, o nível de ARNm de NGF no embrião de pinto em desenvolvimento atinge um máximo no dia embriónico 8 (E8) (Ebendal e Persson, 1988, Develoornent. 102: 101-106), que coincide com o tempo dê inervaçãosensorialv Contudo, no pinto, o ARNm de NGF-R é expresso no seu máximo em etapas embrionárias precoces, anteriores à inervação neuronal (Ernfors et al. . 1988, Neuron. 1., 983-996), e no embrião de pinto E8 foram detectados elevados níveis de ARNm de NGF-R no mesênquima, nos somitos e em células do tubo neural (Hallbook et al.f 1990, Develoornent. 108; 693-704; Heuer et al.. 1990, Dev. Biol. . 137: 287-304; Heuer 1990, Neuron. 5.: 283-296). Esta observação, juntamente com o facto de que ARNm de NGF é expresso no embrião de pinto E3 em níveis relativamente elevados (Ebendal e Persson, 1988, Development. 102: 101-106), indica que o NGF pode desempenhar um papel no desenvolvimento precoce que é distinto da sua função como factor neurotrófico. Em concordância com esta possibilidade, o NGF revelou recentemente que controla a proliferação e diferenciação de células precursoras de estriamento de embrião de rato E14, em cultura (Cattaneo e McKay, 1990, Nature. 347: 762-765). No embrião de pinto o ARNm de BDNF e de NT-3 são expressos no seu máximo em E4,5, e o BDNF revelou controlar a diferenciação de células da cristã neural de aves in vitro (Kalcheim e Gendreau, 1988, Dev. Brain Res.. 41: 79-86).

Além disso, foi também apresentada evidência para uma função não neuronal do NGF. Os ainda não explicados níveis elevados de NGF encontrados na glândula submandibular de ratinho macho pode indicar outras funções para o NGF (Levi-Montalcini, 1987, Science. 237: 1154-1162). No rato adulto o NGF revelou induzir a síntese de ADN e estimular a secreção de IgM em -6- 73 993 6526-079-118 células B (Otten et al.. 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86: 10059-10063). Adicionalmente, o NGF está presente em quantidade suficiente na próstata de porquinho-da-índia, de tal modo que Rubin e Bradshaw (1981, J. Meur. Res. 6.: 451-464) foram bem sucedidos no isolamento e na caracterização de NGF substancialmente puro, a partir deste tecido exócrino. O elevado nível de NGF na próstata de porco apoia a hipótese de que este factor neurotrófico funciona numa capacidade não neuronal ainda não compreendida (Bradshaw, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47: 191-216; Harper, et al.. 1979, Nature 279: 160-162; Harper e Thoenen, 1980, J. Neurochem. 34: 893-9'Õ3)T ~ ...........

Para além disso, o ARNm de NGF é expresso em espermatócitos e espermatídeos precoces em testículos de rato adulto (Ayer-LeLievre et al♦. 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85: 2628-2632), e a proteína NGF está presente em células germinais de todas as etapas desde espermatócitos até espermatozóides (Olson et al. . 1987 , Cell Tissue Res.. 248: 275-286; Ayer-LeLievre et al.. 1988a, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2628-2632). ARNm de NGF-R foi também detectado em testículos de rato adulto, onde é expresso nas células de Sertoli sob controlo negativo da testosterona, e tem sido sugerido que nos testículos o NGF controla a meiose e a espermiação (Persson et al.. 1990, Science. 247: 704-707).

3. SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a neurotrofina-4 (NT-4), um novo membro recentemente caracterizado da família de genes BDNF/NGF/NT-3. 0 presente invento proporciona moléculas de ácido nucleico que codificam NT-4. Estas moléculas podem compreender uma sequência substancialmente como as apresentadas para NT-4 na Figura 1 [SEQ ID NO: 1 (NT-4, víbora), SEQ ID NO: 2 (NT-4, Xenopus)], Figura 4 (SEQ ID NO: 43), Figura 8 (SEQ ID NO: 49), Figura 14 (SEQ ID NO: 61), Figura 15 (SEQ ID NO: 63), Figura 17 (SEQ ID NO: 69), Figura 18 (SEQ ID NO: 75), Figura 20 (SEQ ID NO: 93) e Figura 21 (SEQ ID NO: 116) ou podem compreender uma -7- / 73 993 >. r .N._ 6526-079-118 sequência que seja pelo menos cerca de setenta por cento homóloga com essa sequência. O presente invento também proporciona uma proteína ou moléculas peptídicas que compreendem uma sequência substancialmente como as apresentadas para NT-4 na Figura 2 [SEQ ID NO: 22 (NT-4, víbora), SEQ ID NO: 23 (NT-4, Xenopus)], Figura 4 (SEQ ID NO: 44), Figura 8 (SEQ ID NO: 50), Figura 14 (SEQ ID NO: 62), Figura 15 (SEQ ID NO: 64), Figura 17 (SEQ ID NO: 70), Figura 18 (SEQ ID NO: 76), Figura 20 (SEQ ID NO: 94), ou Figura 2Ϊ (SEQ ID NO: 117) ou podem compreender uma sequência qué“seja pelo menos setenta por cento homóloga com essa sequência. O presente invento proporciona, para além disso, a expressão de moléculas de NT-4 biologicamente activas em sistemas de procariotas e de eucariotas. O presente invento proporciona, para além disso, a produção de NT-4 em quantidades suficientes para aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Do mesmo modo, anticorpos anti-NT-4 podem ser utilizados em aplicações terapêuticas e de diagnóstico. Para a maior parte dos fins é preferível usar genes de NT-4 ou produtos de genes das mesmas espécies para fins terapêuticos e de diagnóstico, embora a utilidade de espécies cruzadas de NT-4 possa ser útil em concretizações específicas deste invento. 0 presente invento proporciona, para além disso, aplicações terapêuticas e de diagnóstico baseadas na expressão de NT-4 pela revelação de níveis detectáveis de expressão de NT-4 em músculo esquelético humano, próstata, timo e testículos.

4. DESCRICÃO DAS FIGURAS FIGURA l. Alinhamentos de sequências de ADN dos fragmentos isolados que codificam NGF, BDNF, NT-3 e o novo factor neurotrófico NT-4 de espécies diferentes. (A) Representação esquemática da molécula de preproNGF de ratinho. A caixa com tracejado indica a sequência de sinal 73 993 6526-079-118

-8- (SS), barras pretas indicam sítios de clivagem proteolítica e a caixa sombreada representa o NGF maduro. Regiões usadas para os iniciadores degenerados são indicadas por setas. O iniciador a montante da região de codificação, foi da lisina 50 até à treonina 56 e o iniciador a jusante inclui do triptofano 99 até ao ácido aspártico 105. A região amplificada compreende sequências de ADN do par de bases (bp) 168 até ao 294 nas moléculas de NGF maduro e em todos os membros da família do NGF até agora descritos, esta região está localizada num exão. (B) Alinhamento de sequênciasdê núcleotidos para NGF, BDNF, NT-3 e NT-4 isolados a partir de espécies diferentes. Os fragmentos correspondem aos aminoácidos 57 a 98 no NGF maduro de ratinho. Bases idênticas estão marcadas por pontos. A numeração refere-se a nucleótidos nas sequências de NGF maduro de ratinho (Scott et al.. 1983, Nature 300: 538-540). SEQ ID NO: 1 (NT-4, víbora), SEQ ID NO: 2 (NT-4, Xenopus). SEQ ID NO: 3 (NGF, humano), SEQ ID NO: 4 (NGF, rato), SEQ ID NO: 5 (NGF, galinha), SEQ ID NO: 6 (NGF, víbora), SEQ ID NO: 7 (NGF,

Xenopus), SEQ ID NO: 8 (NGF, salmão), SEQ ID NO: 9 (BDNF, humano), SEQ ID NO: 10 (BDNF, rato), SEQ ID NO: 11 (BDNF, galinha), SEQ ID NO: 12 (BDNF, víbora), SEQ ID NO: 13 (BDNF,

Xenopus). SEQ ID NO: 14 (BDNF, salmão), SEQ ID NO: 15 (BDNF, raia), SEQ ID NO: 16 (NT-3, humano), SEQ ID NO: 17 (NT-3, rato), SEQ ID NO: 18 (NT-3, galinha), SEQ ID NO: 19 (NT-3, Xenopus). SEQ ID NO: 20 (NT-3, salmão), SEQ ID NO: 21 (NT-3, raia).

FIGURA 2. Alinhamento de sequências de aminoácidos deduzidas para NGF, BDNF, NT-3 e NT-4 de espécies diferentes. A numeração dos aminoácidos (código de letra única) é tirada a partir de NGF maturo de ratinho (Scott et al.. 1983, Nature 300: 538- 540). Os aminoácidos idênticos estão indicados com pontos. As posições que apresentam substituções de aminoácidos conservativos em todas as espécies variantes do mesmo factor estão sublinhadas. A linha a tracejado indica que a sequência correspondente não foi isolada. As barras apresentam regiões variáveis nas diferentes moléculas (R59 a S67 e D93 a A98). SEQ ID NO: 22 (NT-4, víbora), SEQ ID NO: 23 (NT-4, Xenopus). SEQ ID NO: 24 (NGF, humano), SEQ 73 993 /- 6526-079-118 ·· ·~) -9- “ ' ID NO: 25 (NGF, rato), SEQ ID NO: 26 (NGF, galinha), SEQ ID NO: 27 (NGF, víbora), SEQ ID NO: 28 (NGF, Xenopus). SEQ ID NO: 29 (NGF, salmão), SEQ ID NO: 30 (BDNF, humano), SEQ ID NO: 31 (BDNF, rato), SEQ ID NO: 32 (BDNF, galinha), SEQ ID NO: 33 (BDNF, víbora), SEQ ID NO: 34 (BDNF, Xenopus). SEQ ID NO: 35 (BDNF, salmão), SEQ ID NO: 36 (BDNF, raia), SEQ ID NO: 37 (NT-3, humano), SEQ ID NO: 38 (NT-3, rato), SEQ ID NO: 39 (NT-3, galinha), SEQ ID NO: 40 (NT-3, Xenopus). SEQ ID NO: 41 (NT-3, salmão), SEQ ID NO: 42 (NT-3, raia). FIGURA 3. Filogenia deduzida de membros da"família 'de''NGF"; Árvores filogenéticas apresentando evolução de NGF (A), BDNF (B), e NT-3 (C) foram construídas utilizando análises de sequências de nucleótidos. NT-3 de humano foi utilizado como ponto de referência em (A) e (B), NGF humano e BDNF humano foram utilizados em (C). A barra da escala em (A) representa um comprimento de ramo correspondente a uma marca de diferença relativa de 20. A mesma escala foi utilizada em (B) e em (C). (D) apresenta um filograma da relação evolutiva entre os diferentes membros da família de NGF. Os dados foram compilados a partir de sequências de aminoácidos deduzidas. A barra da escala representa um comprimento de ramo de 20. Todas as árvores apresentadas são desprovidas de raiz, de modo a que os ramos sejam medidos em relação um ao outro sem referência exterior. Abreviações: chi, galinha; hum, humano; sal, salmão; vip, víbora; xen Xenopus. FIGURA 4. Sequência de NT-4 de Xenopus e Comparação com NGF, BDNF e NT-3. (A) Um local de início de tradução potencial foi colocado numa caixa. Um local de clivagem de sinal putativo está indicado por uma seta marcada com SC. Aminoácidos dentro da sequência de sinal que são idênticos entre NT-4 de Xenopus e BDNF de porco e de rato estão indicados com estrelas. Uma sequência de consenso para N-glicosilação está sublinhada e a seta indica o início presumível da proteína matura NT-4. (SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44) -10- / .· · /; 73 993 6526-079-118 -j (B) Comparação de sequência de aminoácidos (código de letra única) de NT-4 de Xenouus (SEQ ID NO: 45) com NGP de ratinho (Scott et al.. 1983, Nature 300: 538-540) (SEQ ID NO: 46), BDNF de ratinho (Hofer et al. . 1990, EMBO J. 9.: 2459-2464) (SEQ ID NO: 47) e NT-3 de ratinho (Hohn et al. . 1990, Nature 344: 339-341) (SEQ ID NO: 48). Substituições de aminoácidos idênticos comparados com a sequência de aminoácidos de NT-4 são apresentadas por pontos. As sequências que diferem entre NGP, BDNF e NT-3 também diferem na sequência da proteína NT- 4. FIGURA 5. Expressão transiente da proteína NT-4 deXenopus em células COS e a sua interacção com NGF-R em células PC12. (A) SDS-PAGE de meios condicionados de culturas de células COS marcadas in. vivo (3 x 104 cpm aplicados em cada faixa) transfectadas com o gene de NGF de rato, um plasmídeo de controlo sem inserção, ou o gene de NT-4 de Xenopus. É apresentada uma auto-radiografia do gel seco após uma exposição durante a noite a película de raios X. (B) Diluições seriadas de meio de células COS transfectadas, contendo quantidades iguais de proteínas NT-4 (círculos abertos), ou NGF (círculos fechados) foram testadas quanto à sua capacidade para substituir 125I-NGF no seu receptor em células PC12. Foram realizados testes de ligação a 37 °C utilizando 125i_NGf 1.5x10^M e 1 x 104 células por ml. Meio de células simuladamente transfectadas não conseguiu substituir a ligação de 125l-NGF das células PC12. Cada ponto representa a média ± SD de determinações em triplicado. FIGURA 6. Estimulação de excrescência de neurites em gânglios embrionários de galinha. (A, B, e C) Excrescência de neurites induzida em gânglios da raiz dorsal com proteína NT-4 recombinante (A), NGF recombinante (B) e proteína BDNF (C). (D) A resposta de gânglios da raiz dorsal a meio condicionado de células simuladamente transfectadas. (E e F) Estimulação de excrescência de neurites de gânglios 73 993 6526-079-118

-li do simpático em resposta a NT-4 (E) ou NGF (F). (G, H, e I) Gânglios nodosos estimulados com proteínas NT-4 recombinante (G), NT-3 (H), e BDNF (X). Todas as figuras são fotografias de microscópio de campo claro de gânglios após 1,5 dias em cultura. FIGURA 7. Detecção de ARNm de NT-4 em diferentes tecidos de Xenopus. (A) ARN Poli(A)+ (10 jtig por poço) dos tecidos indicados de fêmea adulta de Xenopusfoi sujeito a electroforesenum*gel de agarose contendo formaldeído, transferido para um filtro de nitrocelulose e hibridado com um fragmento Hindi de 500 bp do exão 3' do gene de NT-4 de Xenopus. Para comparação, o filtro foi também hibridado com um fragmento de PCR de 180 bp do gene de NGF de Xenopus (centro marcado da faixa, NGF). o filtro hibridado com a sonda de NT-4 foi exposto durante 2 dias; o filtro hibridado com a sonda de NGF foi exposto durante 2 semanas. Uma exposição prolongada de 2 semanas do filtro hibridado com a sonda de NT-4 não revelou ARNm de NT- 4 em nenhum outro tecido senão o de ovário que inclui oócitos de diferentes etapas. A faixa marcada com CNS inclui cérebro e espinal medula. (B) ARN Poli (A)+ (10 /xg) de ovário de Xenopus foi analisado quanto à expressão dos quatro membros da família de NGF. Cada filtro foi hibridado com as sondas indicadas, obtidas por marcação de fragmentos de PCR dos seus respectivos genes de Xenopus. A localização dos fragmentos de PCR marcados no exão 3' dos seus genes é apresentada na Figura IA. Os filtros foram lavados com elevada severidade e expostos a películas de raios X durante 5 dias. FIGURA 8. Sequência de nucleótidos de NT-4 de Xenopus com locais de clivagem de endonucleases de restrição (SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50). FIGURA 9. Expressão de ARNm de NT-4 em ovário de Xenopus laevis. 73 993 c 6526-079-118 -12-

Ovário de Xenonus laevis adulto foi seccionado num crióstato (secções de 14 μτα. de espessura) e as secções foram depois hibridadas com os oligonucleótidos de mero 48 indicados, marcados com 35S-dATP utilizando desoxinucleotidil—transferase terminal. (A) Hibridação utilizando um oligonucleótido específico de ARNm de NT-4 de Xenopus com a sequência 5'CCCACAAGCTTGTTGGCATCTATGGTCAGAGCCCTCACATAAGACTGTTTTGC3'. (SEQ ID NO: 95) (B) Hibridação utilizando um oligonucleótido de controlo de comprimento e conteúdo em G+C semelhantes. Após hibridação as secções foram lavadas em 1 x SSC a 55 °C seguido de exposição a películas de raios X durante 10 dias. São apresentadas na figura fotografias das películas de raios X reveladas. Note-se a marcação intensa sobre muitas células pequenas com a sonda de NT-4 e a ausência de marcação com a sonda de controlo. As setas apontam oócitos grandes (etapa VI) que não são marcados com nenhuma das duas sondas. Barra da escala, 2 mm. FIGURA 10. Iluminação de campo claro de auto-radiografias de emulsão apresentando oócitos que expressam ARNm de NT-4 no ovário de Xenopus. Secções hibridadas com as sondas de ARNm de NT-4 de Xenopus. específicas (A,B) ou de controlo (C), como descrito na FIG. 9 foram cobertas com emulsão Kodak NTB2, expostas durante 5 semanas, reveladas e contrastadas à luz com violeta de cresilo. Esta figura apresenta micro-fotografias de campo claro das secções reveladas. Note-se no quadro A a marcação intensa de ARNm de NT-4 sobre oócitos de pequena dimensão (Etapas I e II) e a ausência de marcação sobre oócitos de grande dimensão (Etapas V e VI). 0 quadro B apresenta uma maior ampliação da área que se encontra dentro do rectângulo no quadro A. Note-se a intensa marcação do citoplasma dos oócitos de etapa II apresentados na fotografia. (C) Nenhuma marcação pode ser observada usando a sonda de controlo. Abreviaturas: n, núcleo; fc, células do folículo; 73 993 6526-079-118

-13- ,y. t: e ' ( pl, camada pigmentada. Barra da escala' em A, 50 μι; em B e en C, 15 pm. FIGURA 11. Níveis de ARNm de NT-4 em oócitos em diferentes etapas da oógenese. Foram utilizadas autorradiografias de emulsão (apresentadas na figura 10) de secções hibridadas com a sonda específica de ARNm de NT-4 de Xenopus para contar o número de grãos numa unidade de área. A unidade de área escolhida foi cerca de um centésimo de um oócito de etapa I. Foram analisadas quinze unidades de área em 10 oócitos diferentes nas etapas indicadas. Barras de erro apresentam õ S.D. ........... FIGURA 12. Análise de expressão de ARNm de NT-4 por transferência de Northern durante a oógenese em Xenopus laevis. Ovários de dois Xenopus laevis adultos foram dissecados e tratados com colagenase para remover células de folículo e libertar os oócitos. Os oócitos foram então agrupados nos grupos indicados seguindo as etapas descritas por Dumont, 1972, J. Morphol. 136: 153-180. 0 ovário total e as células de folículo libertadas foram também incluídos na análise. O ARN celular total foi então preparado e 40 jug/poço de ARN foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1% contendo formaldeído. Este foi transferido para um filtro de nitrocelulose e hibridado com um fragmento HincII de 600 bp do exão 3' do gene de NT-4 de Xenopus. 0 filtro foi lavado com elevada severidade e exposto durante cinco dias a uma película de raios X. Note-se o decréscimo acentuado no nível de ARNm de NT-4 em oócitos nas etapas V e VI. FIGURA 13. (A) A sequência de aminoácidos parcial de xNT-4 (SEQ ID NO: 51) indicando as posições onde os oligonucleótidos degenerados foram sintetizados e utilizados para iniciar a amplificação de ADN genómico humano e de rato através da reacção em cadeia com polimerase. As setas indicam oligonucleótidos representando oligonucleótidos degenerados com sentido ou anti-sentido. Um conjunto de oligonucleótidos degenerados para o iniciador 2Z representa os aminoácidos 184-189 de rBDNF (SEQ ID NO: 52). A sequência de aminoácidos parcial de NT-4 de Xenopus iíf iíf

73 993 J 6526-079-118 -14- - até ao aminoácido 223, como representada é do aminoácido 167 descrito na Figura 4, supra. (B) Oligonucleótidos degenerados utilizados para clonagem de NT-4 humano e de rato. 0 oligonucleótido 3Z na Figura 13 é compreendido por uma mistura de 3Z e 3Z' por forma a permitir a degenerescência do codão da serina. 2Y (SEQ ID NO: 53)/ 2Z (SEQ ID NO: 54)/ 3Y (SEQ ID NO: 55), 3Z (SEQ ID NO: 56), 3'Z (SEQ ID NO: 57) e 4Z (SEQ ID NO: 58). (C) Caudas de clonagem para oligonucleótidos degenerados 3' (SEQ ID NO: 59) e 5' (SEQ ID NO: '60). .............. .........................................-...... - FIGURA 14. Sequência de ADN do fragmento isolado que codifica uma porção do NT-4 de rato (SEQ ID NO: 61). A estrutura de leitura aberta prevista para o péptido codificado pelo fragmento de ácido nucleico rNT-4 está representada pelo código de letra única (SEQ ID NO: 62). A sequência entre parênteses constitui parte do iniciador de pcr. FIGURA 15. Sequência de ADN do fragmento isolado que codifica uma porção de NT-4 humano (SEQ ID NO: 63). A estrutura de leitura aberta prevista para o péptido codificado pelo fragmento de ácido nucleico hNT-4 está representada pelo código de letra única (SEQ ID NO: 64). A sequência entre parênteses constitui parte do iniciador de PCR. FIGURA 16. Alinhamento de sequência de aminoácidos deduzidas a partir de neurotrofinas representativas. Os aminoácidos estão indicados usando o código de letra única. Aminoácidos idênticos estão indicados por pontos. As linhas a tracejado indicam uma inserção de 7 aminoácidos dentro da região conservada de ambos rNT-4 (SEQ ID NO: 62) e hNT-4 (SEQ ID NO: 64). XNT-4 (SEQ ID NO: 65)/ rNGF (SEQ ID NO: 66), rBDNF (SEQ ID NO: 67), rNT-3 (SEQ ID NO: 68). x=Xenopus. r=rato, h=humano. A sequência entre parênteses constitui parte do iniciador de PCR. FIGURA 17. (A) Sequência de ADN de um fragmento isolado que codifica uma porção de NT-4 humano (SEQ ID NO: 69). 0 péptido 73 993

6526-079-118 previsto codificado pelo fragmento de ácido nucleico hNT-4 de 192 bp é representado pelo código de letra única (SEQ ID NO: 70). A sequência entre parênteses constitui parte do iniciador de PCR. (B) Sequência de oligonucleótidos do iniciador da extremidade 5', denominado hNT-4-5#/ [contendo uma sequência (SEQ ID NO: 71) que codifica ETRCKA (SEQ ID NO: 72)], utilizada na amplificação primária de ADN genómico humano juntamente com o iniciador da extremidade 3', denominado 4Z (SEQ ID NO: 58) [contendo uma sequência de nucleótidos que codifica WIRIDT]r(C) Sequência de oligonucleótidos do iniciador da extremidade 5' utilizado para amplificar o produto de reacção do PCR primário. O iniciador, denominado hNT-4-5"' [contendo uma sequência (SEQ ID NO: 73) que codifica DNAEEG (SEQ ID NO: 74)] foi utilizado com o iniciador 3', 4Z (SEQ ID NO: 58), para obter um fragmento de 162 bp ( mais os bp da cauda de clonagem). 0 fragmento de PCR de 162 bp foi depois utilizado numa reacção de separação de PCR utilizando o nosso fragmento de PCR anteriormente utilizado a montante (denominado 2YZ3Z) para gerar o fragmento único de 192 bp mais a cauda de clonagem apresentado em (A). Informação adicional da sequência de ácido nucleico prolongada em 3' foi obtida seguindo a subclonagem e a sequenciação deste fragmento. FIGURA 18. Sequência de ADN da porção do clone fágico de genoma humano isolado 7-2 que codifica NT-4 humano (SEQ ID NO: 75). A proteína hNT-4 prevista codificada pelo clone genómico 7-2 é representada pelos símbolos de letra única para aminoácidos (SEQ ID NO: 76). A região em caixa representa o local de clivagem previsto da préproteína hNT-4. As setas indicam resíduos conservados na pré-sequência. A região sublinhada (N-R-S) representa uma sequência de consenso para n-glicosilação. A região em círculo representa a metionina de iniciação. O local de aceitação de união está localizado nos pares de bases 461-462 (AG) da SEQ ID NO: 75, representando a extremidade 3' do intrão. FIGURA 19. Alinhamento de sequências de aminoácidos deduzidas a partir de neurotrofinas representativas (SEQ ID NOS. 77-92). Os aminoácidos estão indicados utilizando o código de letra única. Aminoácidos idênticos aos codificados pelo clone fágico de genoma humano 7-2 (SEQ ID NO: 77) estão indicados com um asterisco. As linhas a tracejado representam interrupções em aminoácidos homólogos quando comparados com a proteína codificada pela SEQ ID NO: 77. FIGURA 20. Sequência de ADN do fragmento isolado que codifica uma porção do clone fágico de genoma humano, 2-1 (SEQ ID NO: 93). A estrutura de leitura aberta previstapáraòpéptido codificado pelo fragmento de ácido nucleico isolado está representada pelo código de letra única (SEQ ID NO: 94). FIGURA 21. Sequência de ADN do fragmento isolado que codifica uma porção do clone fágico de genoma humano, 4-2 (SEQ ID NO: 116). A estrutura de leitura aberta prevista para o péptido codificado pelo fragmento de ácido nucleico isolado está representada pelo código de letra única (SEQ ID NO: 117). FIGURA 22. Análise da expressão de ARNm de NT-4 humano por transferência de Northern. ARNm específico de tecido de humano foi adquirido à Clontech. Foram fraccionados por electroforese ARN (10 μg) num gel de 1% de agarose-formaldeído seguida de transferência por capilaridade para uma membrana de nylon (MagnaGraph, Micron Separations, Inc.) com 10X SSC (pH 7). Os ARN foram reticulados na membrana sob a acção de UV por exposição a luz ultravioleta (Strataiinker, Stratagene, Inc) e hibridados a 65 °C com uma sonda marcada radioactivamente (um fragmento Xhol-Notl de 680 bp contendo a região de codificação completa de HG7-2 NT-4 (ver Exemplo na Secção 9, infra) na presença de NaP04 0,5 M (pH 7), 1% de albumina de soro bovino (Fracção V, Sigma), 7% de SDS, EDTA 1 mM (Mahmoudi e Lin, 1989, Biotechniaues T_i 331-333), e 100 jug/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado, tratado com ultra-sons (sonicated). o filtro foi lavado a 65 °C com 2X SSC, 0,1% de SDS e submetido a auto-radiografia durante a noite com um écran de intensificação (Cronex, DuPont) e película de raios X (XAR-5, Kodak) a -70 °C. 73 993 6526-079-118 -17- -ν; : A coloração do gel com brometo de etídio demonstrou que tinham sido testados níveis equivalentes de ARN total para as diferentes amostras (como em Maisonpierre et al.. 1990, Science 247: 1446-1451).

Faixa 1: ARNm poli(A)+ de fígado fetal; Faixa 2: ARNm poli(A)+ de cérebro fetal? Faixa 3: ARNm poli(A)+ de próstata; Faixa 4: ARNm poli(A)+ de músculo; Faixa 5: ARNm poli(A)+ de intestino? Faixa 6: ARNm poli(A)+ de rim; Faixa 7: ARNm poli(A)+ de fígado; Faixa 8: ARNm poli (A)+ de baço; Faixa 9: ARNm poli(A)+ de timo; “Faixa 10: ARNm poli(A)+ de ovário? Fáixa 1Γ:'ARNm pol±(A)+ de testículo; Faixa 12: ARNm poli(A)+ de placenta; Faixa 13: ARNm poli(A)+ de cérebro; Faixa 14: ARN total de cérebro. FIGURA 23. Sobrenadantes de linhas de células COS transfectadas; Q1 (pCMX-HG7-2Q), N7 (pCMX-hNT-3/hNT-4) e XI (pCMX- XNT4/hNT4) foram testados em volumes de 10 μΐ, 50 μΐ e 250 μΐ quanto a actividade promotora de neurites em explantes DRG. Foi utilizado como controlo um sobrenadante de uma linha de células cos simuladamente transfectada. FIGURA 24. Os sobrenadantes de linhas de células COS, Q1 (pCMX-HG7- 2Q) e M (pCMX-HG7-2M) foram testados quanto à sua actividade promotora de sobrevivência em células associadas a DRG. Os volumes testados variaram de 5 μΐ até 250 μΐ num volume total de 2 ml. FIGURA 25. Culturas enriquecidas em neurónios motores isoladas a partir de embriões de rato E14 foram tratadas com duas diluições de sobrenadantes de células COS da linha celular M (pCMX-HG7-2M). A actividade biológica foi medida pela actividade da colina-acetiltransferase (CAT), como descrito em Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24: 407-409. Foram apresentados como controlos tanto uma linha de células COS simuladamente transfectada (MOC COS), como um neurónio motor sem tratamento (C-NT). 73 993 / 6526-079-118 -18- 5. DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO ^ O presente invento proporciona genes e proteínas de NT-4. Baseia-se, pelo menos em parte, na clonagem, caracterização e expressão do gene de NT-4.

Em particular, o presente invento proporciona moléculas de ácido nucleico recombinante que codificam NT-4. Estas moléculas compreendem uma sequência substancialmente como a apresentada na Figura 1 (SEQ ID NO: 1) para víbora, Figura 1 (SEQ ID NO: 2), Figura 4 (SEQ ID NO: 43) ou Figura 8 (SEQ ID NO: 49) para NT-4 de Xenopus. Figura 14 (SEQ ID NO: 61)'pâra:NT-4 de“ rato,' Figura 15 (SEQ ID NO: 63), Figura 17 (SEQ ID NO: 69) ou Figura 18 (SEQ ID NO: 75) para NT-4 humano, Figura 20 (SEQ ID NO: 93) e Figura 21 (SEQ ID NO: 116) para uma sequência de tipo NT-4 humano, ou uma sequência que seja pelo menos cerca de setenta por cento homóloga com qualquer dessas sequências, na qual a homologia se refere a identidade de sequência (por exemplo, uma sequência que possua 70 por cento de homologia com uma segunda sequência partilha 70 por cento dos mesmos resíduos nucleotídicos com a segunda sequência).

Num aspecto particular, o presente invento, detalhado na Secção 8 do Exemplo e na Figura 15 (SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64) aqui apresentadas, é determinada a sequência de nucleótidos e de aminoácidos para uma porção de uma molécula de neurotrofina humana. Noutro aspecto do presente invento, detalhado na Secção 9 do Exemplo e na Figura 17 (SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70) e na Figura 18 (SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76) aqui apresentadas, é determinada a sequência de nucleótidos e de aminoácidos para a totalidade da molécula de neurotrofina humana. Em outro aspecto do presente invento detalhado na secção 9 do Exemplo e na Figura 20 (SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94) e na Figura 21 (SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:117) aqui apresentadas, são detalhadas as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para uma porção de clones dum fago genómico humano, 2-1 e 4-2, respectivamente, que são semelhantes mas não idênticos às sequências de nucleótidos e de aminoácidos descritas na Figura 18 (SEQ ID NO: 75). Embora esta molécula de neurotrofina humana seja aqui referida como -19- 73 993 6526-079-118 neurotrofina-4 humana, deve ser compreendido que esta molécula pode ser o homólogo humano da neurotrofina-4 de Xenoous aqui descrita ou, alternativamente, uma molécula de neurotrofina distinta porém homóloga. De modo semelhante, a molécula aqui referida como NT-4 de rato pode ser o homólogo de rato de NT-4 ou, alternativamente, uma molécula de neurotrofina distinta porém homóloga. Os processos e composições do presente invento não dependem de qualquer nomenclatura individual. 0 presente invento também proporciona proteína NT-4 ou moéculas peptídicas substancialmente purificadas ." Est as moléculas podem compreender uma sequência substancialmente como aqui apresentada na Figura 2, (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2), Figura 4 (SEQ ID NO: 44) Figura 8 (SEQ ID NO: 50), Figura 14 (SEQ ID NO: 62), Figura 15 (SEQ ID NO: 64) Figura 17 (SEQ ID NO: 70), Figura 18 (SEQ ID NO: 76), Figura 20 (SEQ ID NO: 94) e Figura 21 (SEQ ID NO: 117) para NT-4, ou uma sequência que seja pelo menos setenta por cento homóloga com qualquer destas sequências. Em concretizações adicionais específicas não limitantes do invento, uma proteína ou péptido substancialmente purificado compreende a sequência KCNPSGSTTR (SEQ ID NO: 96). Noutra concretização do invento, um péptido ou proteína substancialmente purificado compreende a sequência RGCRGVD (SEQ ID NO: 97). Ainda noutra concretização do invento, um péptido ou proteína substancialmente purificado compreende a sequência KQWIS (SEQ ID NO: 98). Ainda numa outra concretização do invento, um péptido ou proteína substancialmente purificado compreende a sequência KQSYVR (SEQ ID NO: 99). Ainda noutra concretização do invento, um péptido ou proteína substancialmente purificado compreende a sequência GPGXGGG (SEQ ID NO: 100), onde X representa um do grupo de 20 aminoácidos. Numa concretização afim do invento, um péptido ou proteína substancialmente purificado compreende a sequência GPGVGGG (SEQ ID NO: 101) ou GPGAGGG (SEQ ID NO: 102). Ainda noutra concretização do invento, um péptido ou proteína substancialmente purificado compreende a sequência ESAGE (SEQ ID NO: 103). Ainda noutra concretização do invento, um péptido ou proteína substancialmente purificado compreende a sequência -20- 73 993 6526-079-118 DNAEE (SEQ ID NO: 104).

As proteínas e péptidos do invento podem ser produzidas por síntese química utilizando técnicas padrão ou podem ser produzidas usando as moléculas de ácido nucleico do invento que codificam NT-4, utilizando sistemas de expressão eucarióticos ou procarióticos, conhecidos para um perito na arte, como os descritos no pedido de PCT, PCT/US90/04916, depositado em 29 de Agosto de 1990, publicado como WO 91/03569, que é aqui incorporado como referência na íntegra, ou como exemplificado infra (ver Secção 6.2.4., infra, e Figura~5) para expressão transiente em células COS. O presente invento também proporciona o uso de NT-4 na promoção do crescimento e/ou da sobrevivência de células do sistema nervoso, em particular, mas não limitado a, células do gânglio da raiz dorsal ou de derivados de placódio neural (ver Secção 6.2.4., infra. e Figura 6, por exemplo). 0 presente invento também proporciona porções de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos de NT-4, substancialmente como se segue para NT-4 nas Figuras 1, 2, 4, 8, 14, 15, 17, 18, 20, ou 21 (SEQ ID NO listados supra) que não são idênticas a porções de BDNF, NGF, ou NT-3 substancialmente do mesmo tamanho. O presente invento proporciona, para além disso, uma célula eucariótica ou procariótica que contém ácido nucleico recombinante que codifica NT-4 e que expressa proteína NT-4 recombinante. Numa concretização específica a célula é uma célula eucariótica, como uma célula COS. De acordo com isto, o presente invento também proporciona uma proteína ou péptido de NT-4 recombinante que é produzido por inserção na célula de ácido nucleico recombinante que codifica NT-4 (por ex., por transfecção, transdução, electroporação, micro-injecção, etc.) sob condições que permitam a expressão de NT-4 e posterior isolamento de NT-4 da célula.

Adicionalmente, o presente invento proporciona moléculas 73 993 \ 6526-079-118 -21- ' ..... produzidas por PCR utilizando, por exemplo, os seguintes oligonucleótidos como iniciadores: 5'CAGTATTTTTACGAAACC (SEQ ID NO: 105) e 3'gtcttgtttggctttaca (SEQ ID N0; 106) para nt-4 humano e 5'CAGTATTTTTACGAGACG (SEQ ID NO: 107) e 3'CGATTGTTTGGCTTTACA (SEQ ID NO: 108) para NT-4 de rato, ô utilizando como molde qualquer ADN genómico ou ADNc adequado. Numa concretização específica do invento, estes iniciadores podem ser utilizados em conjugação com ADNc humano como molde para produzir fragmentos do gene de NT-4 humano que sejam adequados para clonagem. ...................................................... — A produção e uso de derivados, análogos, e péptidos afins com NT-4 são também considerados, e dentro do âmbito do presente invento. Tais derivados, análogos, ou péptidos que possuem a desejada actividade neurotrófica, imunogenicidade ou antigenicidade podem ser utilizados para, por exemplo, terapêutica, ou em imunoensaios, para imunização, etc. Derivados, análogos ou péptidos afins com NT-4 podem ser testados quanto à actividade desejada por processos conhecidos na arte.

Os derivados afins com NT-4, análogos e péptidos do invento podem ser produzidos por vários processos conecidos na arte. As manipulações que resultam na sua produção podem ocorrer ao nível do gene ou da proteína. Por exemplo, o gene de NT-4 clonado pode ser modificado por qualquer uma das numerosas estratégias conhecidas na arte (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). A sequência de NT-4 pode ser clivada em locais apropriados com endonuclease(s) de restrição, seguida de posterior modificação enzimática, se desejada, isolada e ligada in vitro. Na produção do gene que codifica um derivado, análogo ou péptido afim com NT-4, deve ser tomado cuidado para assegurar que o gene modificado permanece na mesma estrutura de leitura aberta que a NT-4, não interrompido por sinais de paragem de tradução, na região do gene onde a actividade específica de NT-4 desejada está codificada. -22- 73 993 6526-079-118

Adicionalmente, o gene de NT-4 pode ser mutadb in vitro ou in vivo, para criar e/ou destruir sequências de tradução, iniciação, e/ou terminação, ou para criar variações em regiões de codificação e/ou formar novos locais de endonuclease de restrição ou destruir outos pré-existentes, para facilitar a posterior modificação in vitro. Qualquer técnica para mutagénese conhecida na arte pode ser utilizada incluindo, más não estando limitado a, mutagénese localmente dirigida in vitro (Hutchison, C., et al.. 1978, Jj_ Biol. Chem. 253: 6551), uso de ligantes TABr (Pharmacia), etc.

Como discutido infra f a prepro ou região madura de codificação de NT-4, pode ser utilizada para construir genes quiméricos baseados na neurotrofina. Por exemplo, genes de neurotrofina incluindo, mas não limitados a NGF, BDNF e NT-3 podem proporcionar a região prepro para a construção de genes quiméricos de neurotrofina e prepo/região de codificação madura de NT-4.

Manipulações da sequência NT-4 podem também ser realizadas ao nível da proteína. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas incluindo, mas não estando limitadas a clivagem química específica por brometo de cianogénio, tripsina, quimiotripsina, papaína, protease V8, NaBH4, acetilação, formilação, oxidação, redução, síntese metabólica na presença de tunicamicina, etc.

Adicionalmente, podem ser sintetizados quimicamente análogos e péptidos afins com NT-4. Por exemplo, um péptido correspondente a uma porção de NT-4 que medeia a actividade neurotrofica desejada pode ser sintetizado utilizando um sintetizador de péptidos. 0 presente invento proporciona, para além disso, um processo de tratamento de desordens de fertilidade relacionadas com disfunção ovário/oócito. Como apresentado nos exemplos infra, em particular na Secção 7, a NT-4 está envolvida na maturação dos oócitos. A discussão da Secção 7.3 demonstra que a NT-4 é produzida por oócitos, é concentrada preferencialmente nos oócitos imaturos em relação aos maduros, e parece desempenhar um papel na oógenese. A função putativa da proteína NT-4 no ovário parece estar acoplada a acontecimentos que ocorrem no oócito pré-vitelogénico e vitelogénico precoce/semi-precoce.

Tem sido estabelecido que outros membros da família de genes BDNF/NGF/NT-3, em particular o NGF, estão envolvidos na maturação meiótica (Nebrada et al. . 1991, Science, 252 ϊ 558-563). Uma vez que a NT-4 tejfiexibido propriedades semelhantes a NGF (ver Secção 6, infra) pode ser usado como um factor envolvido na regulação do desenvolvimento do oócito. Estas propriedades do NT-4 podem ser exploradas para proporcionar um processo para tratamento de desordens de infertilidade e/ou outras disfunções dos ovários associadas com a oogénese.

Assim, de acordo com o invento, é proporcionado um processo de tratamento de desordens de infertilidade e/ou outras disfunções dos ovários compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de NT-4 ou de um péptido afim com NT-4 num portador farmaceuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que induz a maturação apropriada de um oócito e/ou ovulação. Por exemplo, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser uma suficiente para manter níveis de NT-4 em circulação no soro a uma concentração de entre cerca de 1 a 100 x 10“-*·° M. 0 estabelecimento de doses eficazes adicionais está dentro da previsão de um perito na arte.

Doses eficazes de NT-4 ou de um péptido afim com NT-4 formuladas em portadores farmacológicos apropriados podem ser administradas por qualquer via apropriada incluindo, mas não limitada a, injecção (por ex., intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, etc.), por absorção através de camadas epiteliais ou mucocutâneas (por ex., mucosa oral, mucosa rectal ou intestinal, etc.); etc. -24- - . ' 73 993 6526-079-118

Adicionalmente, a NT-4 ou um péptido de NT-4 pode ser utilizado em qualquer portador farmacológico adequado, ligado a um portador ou molécula alvo (por ex. , anticorpo, hormona, factor de crescimento, etc.) e/ou incorporado em liposomas, microcápsulas, e preparação para libertação controlada anterior à administração in vivo.

Cada sequência de ADN de NT-4 de mamífero respectiva, pode ser utilizada como uma sonda marcada com 32P para isolar um clone genómico e de ADNc respectivo através dos processos salientados na parte de Materiais e Métodos da Séccão "8 7 infra: Os fragmentos do gene NT-4 humano e NT-4 de rato podem ser utilizados directamente (como sondas marcadas com 32P) ou indirectamente (para deduzir uma estratégia de PCR como descrito infra) para isolar clones de ADNc ou genómicos de NT-4 de outros mamíferos, com base na natureza única da inserção do aminoácido 7 na região de codificação de rNT-4 e hNT-4, ou outros aspectos únicos da região de codificação de NT-4 humano ou de rato.

Qualquer gene de NT-4 de mamífero isolado através da informação revelada pela sequência de NT-4 humano e de rato pode ser utilizada nas várias manipulações discutidas para NT-4 de Xenopus. embora não seja limitada a estas. Por exemplo, as proteínas e péptidos de NT-4 de mamífero, subsequentes à caracterização do gene de comprimento total como discutido no Exemplo da Secção 9, podem ser produzidos utilizando as moléculas de NT-4 do respectivo mamífero num sistema de expressão procariótico ou eucariótico conhecido por um perito na arte, como os descritos no pedido de PCT, PCT/US90/04916, depositado em 29 de Agosto de 1990, publicado como WO91/03569, ou como exemplificado infra (ver Secção 6.2.4., supra, e Figura 5) para expressão transiente em células COS. Funções adicionais para NT-4 de mamífero, como descrito infra para NT-4 de Xenopus. incluem, mas não estão limitadas a: promoção de crescimento e/ou sobrevivência de células do sistema nervoso, em particular, mas não limitado a, células do gânglio da raiz dorsal ou derivados do placódio neural (ver Secção 6.2.4., e Figura 6, por exemplo), tratamento de desordens de fertilidade relacionadas com η ’ - 73 993 c 6526-079-118 .¾ ,.:.. . ό' ( ·\ -25- disfunção ovário/oócito (ver Secção 7)f tratamento de desordens de infertilidade e/ou outras disfunções do ovário associadas com a oogénese (ver Secção 6), tratamento de doenças do neurónio motor (ver Secção 10), tratamento de uma hiperplasia epitelial como a hipertrofia prostática benigna (ver Secção 10), tratamento da impotência enquanto relacionada com a função glandular da próstata (ver Secção 10) e, assim, as quantidades terapeuticamente eficazes de NT-4 de mamífero para o tratamento das ditas desordens como formulado em portadores farmacológicos adequados para proporcionar uma composição farmacêutica, podem ser administradas por qualquer via apropriada incluindo “"mas" não limitada a injecção (por ex., intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, etc.), por absorção através da camada epitelial ou mucocutânea (por ex., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal,etc.); etc.

Adicionalmente, a NT-4 ou péptido de NT-4 de rato, humano ou de outro mamífero pode ser utilizado em qualquer portador farmacológico adequado, ligado a um portador ou molécula alvo (por ex., anticorpo, hormona, factor de crescimento, etc.) e/ou incorporado em liposomas, microcápsulas, e preparações de libertação controlada anterior à administração in vivo.

Adicionalmente, o presente invento, que se refere a ácidos nucleicos que codificam NT-4 e a proteínas, fragmentos peptídicos ou derivados a partir deles produzidos, bem como a anticorpos dirigidos contra proteína NT-4, péptidos ou derivados, pode ser utilizado para diagnosticar ou monitorizar a progressão de doenças e desordens do sistema nervoso que estão associadas com alterações no padrão de expressão de NT-4. Essas alterações podem ser um decréscimo ou aumento relativamente ao de pacientes normais, preferivelmente, ou de outras amostras retiradas do paciente, ou de amostras do mesmo paciente retiradas anteriormente.

Em várias concretizações do invento genes de NT-4 e sequências e subsequências de ácido nucleico afins, incluindo sequências complementares, podem ser utilizadas em testes de

73 993 6526-079-118 // -26- hibridação para diagnóstico. As sequências de ácido nucleico de NT-4 ou suas subsequências, compreendendo cerca de 15 nucleótidos, podem ser usadas como sondas de hibridação. Testes de hibridação podem ser utilizados para detectar, prognosticar, diagnosticar ou monitorizar condições, desordens ou estados de doença associados com alterações nos níveis de NT-4. Por exemplo, os dados apresentados no Exemplo da Secção 10 revelam expressão de NT-4 humano específica no tecido em músculo esquelético bem como na glândula da próstata, timo e testículos. O nível de expressão de NT-4 humano no tecido muscular pode ser indicativo da presença ou ausência de degradação" neuronal. Assim, ARNm poli(A)+ ou ARN total de uma amostra de tecido de um paciente pode ser testada quanto à presença de ARNm de NT-4 humano no tecido do músculo esquelético. Adicionalmente, os dados apresentados na Secção 10 do Exemplo revelam expressão específica de NT-4 de tecido na glândula da próstata humana. Sequências de ADN que codificam NT-4 ou uma porção deste, bem como proteína ou um péptido de NT-4, podem ser úteis como agente terapêutico para tratar doenças da próstata.

Num processo semelhante, os testes de diagnóstico podem ser imunoensaios. Assim, podem ser utilizados anticorpos em imunoensaios para quantificar o nível de NT-4 numa amostra de um paciente de modo a detectar, prognosticar, diagnosticar, ou monitorizar condições, desordens ou estados de doença associados com alterações nos níveis de NT-4.

Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a sistemas de ensaio competitivo e não competitivo, utilizando técnicas tais como radioimunoensaio, ELISA (imunoensaio usando anticorpo ou antigénio ligado a enzimas), imunoensaios pela técnica de "sanduíche", reacções de precipitina, reacções de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação do complemento, ensaios imuno-radiométricos, imunoensaios com marcadores fluorescentes, imunoensaios de proteína A, e ensaios de imunoelectroforese, para referir apenas alguns. -27- -27- / 73 993 6526-079-118

Fragmentos de anticorpo anti-NT-4 ou derivados contendo o domínio de ligação podem também ser utilizados nestes ensaios.

Fragmentos de anticorpo que contêm o idiotipo da molécula podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem mas não estão limitados a, fragmento F(ab/)2 que pode ser produzido por digestão com pepsina da molécula de anticorpo; fragmentos Fab' que podem ser obtidos por redução das pontes de dissulfureto deste e fragmentos Fab que podem ser obtidos pelo tratamento da molécula do anticorpo com papaína e um agente redutor. ~ *..................~..... · São também proporcionados conjuntos de diagnóstico. Por exemplo, um tal conjunto pode incluir uma sonda específica para NT-4 em recipiente adequado. Numa concretização, a sonda é um anticorpo específico para NT-4. Noutra concretização, a sonda é um ácido nucleico (sonda molecular) capaz de hibridar com uma sequência de ácido nucleico de NT-4. A sonda pode ser detectavelmente marcada; alternativamente o conjunto pode ainda incluir um par de ligação específica marcado, para a sonda.

Os imunoensaios e ensaios de hibridação acima descritos podem também ser utilizados para quantificar níveis de NT-4 como indicadores de eficácia terapêutica, por comparação dos níveis em amostras de pacientes antes e depois do tratamento de uma desordem, particularmente, de uma doença de neurónios motores.

De uma maneira análoga, a expressão de ARNm de NT-4 humana em tecido muscular, conduz a processos de tratamento potenciais de desordens em neurónios motores que incluem a administração a um paciente com necessidade desse tratamento, de uma quantidade eficaz de um factor de NT-4 para apoiar a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores. A expressão de ARNm de NT-4 em músculo humano sugere vias adicionais para o diagnóstico e tratamento de desordens neuronais. 0 transporte axonal retrógrado pode ser característico de NT-4. 0 transporte retrógrado específico de NT-4 pode ser usado -28- 73 993 6526-079-118 para indicar se os neurónios estão a responder a NT-4 em estados normais ou de doença. Assim, o presente invento proporciona um processo de diagnóstico de desordens do sistema nervoso periférico relacionadas com NT-4 compreendendo a injecção de um péptido ou proteína NT-4 detectavelmente marcados num nervo periférico, e determinando se o péptido ou a proteína NT-4 marcado está ou não a ser transportado de um modo retrógrado, em que a falha de transporte retrógrado se correlaciona positivamente com a ausência de resposta a NT-4 e indica a presença de uma desordem do sistema nervoso periférico que está relacionada com NT-4. Processos análogos podem ser utilizados para diagnosticar uma desordem do sistema nervoso central. A avaliação do transporte retrógrado pode ser efectuada por qualquer processo conhecido na arte, incluindo mas não se limitando a MRI, CAT, ou varrimento de cintilação. Tais processos podem ser utilizados para identificar a localização de uma lesão do sistema nervoso, pois o transporte retrógrado deve diminuir substancialmente ao atingir a lesão. 0 invento proporciona ainda conjuntos para avaliação de transporte retrógrado compreendendo uma proteína NT-4, um derivado ou fragmento detectavelmente marcados, num recipiente. Tal marcação pode ser com um isótopo radioactivo, ou outra marcação conhecida na arte. 0 presente invento pode ser utilizado para tratar doenças e desordens do sistema nervoso que podem estar associadas com alterações no padrão da expressão de NT-4 ou podem benificiar da exposição a NT-4 ou anticorpos anti-NT-4 (ou fragmentos deste deste contendo o domínio de ligação). Mostrámos que o NT-4 humano é expresso no músculo esquelético (Ver Exemplo da Secção 10, infra,). Com base nesta verificação, o invento proporciona o tratamento de doenças em neurónios motores. Um vasto conjunto de desordens neurológicas pode afectar os neurónios motores. Os neurónios motores superiores, por exemplo, são predominantemente afectados por acidentes cérebrovasculares, neoplasmas, infecções e traumas. Os neurónios motores inferiores, ou células da córnea anterior, são secundariamente 73 993 6526-079-118

JÇ r&fA

29- afectadas por estes processos, mas adicionalmente são objecto de várias desordens em que a perda da célula da córnea anterior é o efeito primário, incluindo esclerose lateral amiotrópica, atrofia infantil e juvenil da espinal medula, poliomielite e sindroma pós-polio, neuropatias hereditárias motoras e sensoriais, e neuropatias motoras tóxicas (por exemplo, vincristina). As desordens dos neurónios motores que podem ser tratadas de acordo com o presente invento incluem mas não estão limitadas às precedentes. Processos de formulação e administração da proteina NT-4, derivados, fragmentos ou seus anticorpos que podem também ser utilizados, incluem mas não estão limitados aos descritos supra ou aos conhecidos na arte.

0 invento pode também ser utilizado para tratar hipertrofia prostática benigna (BPH), uma condição comum mas ainda mal conhecida que ocorre principalmente em machos com mais de 50 anos de idade. A proliferação da próstata durante a BPH pode ser induzida por um factor de crescimento como a NT-4 através de um fenómeno de ansa autócrina. A síntese e excreção de NT-4 será seguida pelo transporte de NT-4 de volta à célula prostática por via de um receptor específico na membrana da célula prostática. Têm sido definidas ansas autócrinas para várias moléculas de factores de crescimento e linhas de células tumorais. Em alguns casos, estas ansas autócrinas foram definidas experimentalmente pelo uso de abordagens anti-sentido para a ruptura da ansa autócrina. Assim, uma aplicação terapêutica do presente invento inclui o uso de um ácido nucleico anti-sentido para NT-4 humana ou uma sua porção para inibir a tradução do ARNm de NT-4 na próstata, (para procedimentos que podem ser utilizados ver o pedido copendente da U.S. Na. Série 07/728 784 depositado em 3 de Julho de 1991 e aqui incorporado na sua totalidade como referência). Por exemplo, um paciente que sofra de uma doença localizada na próstata, caracterizada pelo aumento da transcrição de um gene de NT-4 no tecido da próstata em relação aos níveis de transcrição do gene de NT-4 na próstata de pacientes normais, pode ser administrada uma quantidade eficaz de um oligonucleótido para tratar uma doença da próstata, preferencialmente a hipertrofia prostática benigna. O 73 993 6526-079-118 ΐί*Γ -30- oligonucleótido deve ter pelo menos 6 nucleótidos de comprimento e ser complementar a pelo menos uma. porção do transcrito de ARN do gene de NT-4, e assim, ser capaz de hibridar com o transcrito de ARN. Adicionalmente, anticorpos anti-NT-4 podem ser utilizados para inibir a ligação de NT-4 ao seu receptor específico na membrana da célula da próstata. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido nucleico anti-sentido ou de um anticorpo anti-NT-4 pode ser distribuída de qualquer forma supra descrita. 0 invento pode também ser utilizado para tratar outras disfunções relacionadas com a próstata, especificamente a impotência. Tal doença pode ser o resultado directo ou indirecto de níveis inadequados de NT-4 na próstata. Assim, tanto a detecção da disfunção como o tratamento do paciente para a impotência por via da aplicação de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína NT-4, ou um fragmento funcional ou derivado de NT-4 pode ser distribuída por qualquer um dos processos supra descritos. 0 presente invento revela a detecção da expressão de NT-4 em tecido do timo humano. Assim, o invento pode também ser utilizado para tratar desordens imunológicas que afectam a transmissão neuromuscular, incluindo mas não estando limitado a miastenia grave, uma desordem auto-imunológica adquirida associada com o receptor da acetilcolina(AChR) nas pregas pós-sinápticas na junção neuromuscular. A doença manifesta-se como fraqueza e fadiga muscular devido ao bloqueio do AChR pós-sináptico ou membranas musculares por ligação de anticorpos específicos ao AChR. (Ver por exemplo, Drachman, 1983, Trends. Neurosci. 6:446-451). 0 tratamento de tais desordens neurológicas imunologicamente mediadas pode incluir aplicações terapêuticas da proteína NT-4 ou um fragmento funcional ou derivado de NT-4, distribuído por qualquer dos processos supra descritos. O presente invento proporciona um processo de tratamento de desordens de neurónios motores compreendendo a administração. r / -31- 73 993

J 6526-079-118 a um paciente com necessidade de tal tratamento, de uma quantidade eficaz de uma proteína NT-4, derivado ou fragmento peptídico capaz de apoiar a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores como demonstrado num sistema de cultura in vitro.

Em concretizações in vitro. quantidades eficazes de factor neurotrófico podem ser desejavelmente determinadas numa base de caso por caso, já que neurónios motores de diferentes fontes tissulares ou de espécies diferentes podem exibir diferentes sensibilidades para o factor neurotrófico. Para qualquer cultura em particular, pode ser desejável a construção de uma curva de resposta a dose que correlaciona a concentração do factor neurotrófico e a resposta do neurónio motor. Para avaliar a sobrevivência, crescimento, e/ou diferenciação do neurónio motor, podem-se comparar neurónios motores expostos a uma proteína NT-4, derivado ou fragmento peptídico de NT-4 com neurónios motores não expostos a uma proteína NT-4, derivado ou fragmentos peptídicos de NT-4, utilizando por exemplo, corantes vitais para avaliar a sobrevivência, microscopia de contraste de fase e/ou coloração de neurofilamentos para medir a germinação de neurites, ou técnicas que medem a bioactividade de compostos associados a neurónios motores, tais como a colina actiltransferase (CAT), ou quaisquer outros processos conhecidos na arte. A actividade do CAT pode ser medida, por exemplo, por colheita e lise de neurónios motores tratados e não tratados numa solução Tris-HCl (pH 8,6) 20 mM contendo cerca de 1% de Triton X-100, removendo uma alíquota de alguns microlitros, e medindo a actividade de CAT utilizando, como substrato, 0,2 ml de [1- C] acetil-CoA, NaCl 300 mM, brometo de colina 8 mM, EDTA 20 mM, e neostigmina 0,1 mM em tampão NaH2P04 (pH 7,4) 50 mM, utilizando o procedimento de micro-Fonnum como descrito em Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24.:407-409, aqui incorporado na sua totalidade como referência.

Numa concretização específica não limitante do invento, podem ser preparados neurónios motores, e cultivados in vitro. como se segue. Pelo menos uma porção da espinal medula, obtida -32- 73 993 6526-079-118 preferencialmente de um organismo embriónico como o rato, pode ser assepticamente obtida e separada do bolbo, gânglios sensoriais e meninges aderentes. Os segmentos ventrais da medula podem então ser isolados, uma vez que os neurónios motores estão localizados nas córneas ventrais (anteriores) da espinal medula. Os segmentos ventrais da medula podem ser dissecados em pedaços pequenos e incubados em cerca de 0,1% de tripsina e 0,01% de desoxiribonuclease tipo 1 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) isento de cálcio e magnésio, a 37 °C durante 20 minutos. A solução de tripsina pode então ser removida, e as células podem ser lavadas e colocadas' em meio fresco, tal como meio essencial mínimo de Eagle (MEM) a 45%, mistura nutriente F12 de Ham a 45%, soro fetal bovino inactivado pelo calor a 5%, soro de cavalo inactivado pelo calor a 5%, glutamina (2mM), penicilina G (0,5 U/ml), e estreptomicina (0,5 /xg/ml). O tecido pode ser mecanicamente dissociado por trituração suave através de uma pipeta de Pasteur, e os sobrenandantes combinados e filtrados através de um filtro de nylon (por exemplo, Nitex, Tekto; 40 /xm). A suspensão celular filtrada pode então ser fraccionada utilizando uma modificação do método apresentado por Schnaar e Shnaffner (1981, J. Neurosci. 1:204-217). Todos os passos são desejavelmente efectuados a 4 °C. Pode ser dissolvida metrizamida em meio F12:MEM (1:1) e pode ser estabelecido um gradiente descontínuo que consiste numa almofada de metrizamida a 18% (por exemplo, 0,5 ml), 3 ml de metrizamida a 17%, 3 ml de metrizamida a 12%, e 3 ml de metrizamida a 8%. A suspensão celular filtrada (por exemplo, 2,5 ml) pode ser disposta em camadas sobre o gradiente descontínuo e o tubo pode ser centrifugado a 2500 g durante 15 minutos utilizando um rotor oscilante (por exemplo, Sorvall HB4). A centrifugação pode resultar em três camadas de células: fracção I (na interface 0-8%), fracção II (na interface 8-12%) e fracção III (na interface 12-17%). A fracção I, enriquecida em neurónios motores, pode ser removida num volume pequeno (por exemplo, cerca de 1 ml) e lavado duas vezes com um meio definido isento de soro, tal como 50% de F12 e 50% de meio MEM suplementado com glutamina (2mM), insulina (5 /xg/ml), transferrina (100 μg/ml), progesterona (20 nM), putrescina (100/xM), e selenite de sódio / - -33- 73 993

J 6526-079-118 (30 nM, ver Bottenstein e Sato, 1979/ Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 514-517). A contagem das células viáveis pode então ser obtida por contagem em hemocitómetro na presença de azul de tripano. A suspensão de células enriquecidas em neurónios motores pode então ser plaqueada a uma densidade de cerca de 100 000 células/cm^ ©m poços de cultura de tecidos (preferencialmente de 6 mm) préviamente revestidos com poli-L-ornitina (por exemplo, 10 /ig/ml) e laminina (por exemplo, 10 /xg/ml). Uma proteína NT-4, factor derivado ou peptídico, podem ser adicionados. Por exemplo, em concretizações específicas, a NT-4 pode ser adicionada para obter uma concentração final de cerca de ο,οΐ e 100 ng/ml, e preferencialmente cerca de 50 ng/ml. As culturas de neurónios motores podem ser mantidas em meio definido isento de soro a 37°C numa atmosfera de 95% de ar/ 5% de C02 e cerca de 100 % de humidade relativa.

Numa concretização adicional do invento, a sequência de ácido nucleico recombinante afim com NT-4, tal como a contida no bacteriófago HG7-2, HG4-2, e/ou HG2-1, pode ser utilizado para construir genes quiméricos de prepro/NT-4 maduro. Por exemplo, quando se deseja exprimir uma proteína NT-4 madura, um derivado ou fragmento peptídico in vivo ou in vitro. pode-se fundir a região prepro de um gene neurotrófico distinto com a região codificadora madura da sequência afim com NT-4. Os genes neurotróficos que podem proporcionar a região prepro incluem mas não estão limitados a NGF, BDNF, e NT-3. Tal construção quimérica pode promover o aumento da estabilidade do transcrito do ARNm quimérico em relação a um transcrito de ARNm de NT-4 do tipo selvagem, pode aumentar a eficiência da tradução ou pode produzir um molde mais adequado para o processamento proteolítico numa proteína ou fragmento peptídico de neurotrofina madura, biologicamente activa, aumentando assim a expressão. Qualquer perito na arte possui o conhecimento necessário para construir tais sequências quiméricas de ácido nucleico, dadas as sequências de ADN publicadas de outros genes de neurotrofina como NGF (Scott et al. . 1983, Nature 302:538-540, Ullrich et al.. 1983, Nature 302:821-825), BDNF -34 73 993 6526-079-118 u (Leibrock et al., 1989, Nature 341:149-152} e NT-3 (Honh et al.. 1990, Nature 344:339-341; Maisonpierre et al., 1990, Science 247:1446-1451; Ernfors et al.. 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA £7:5454-5458; Rosenthal et al. . 1990, Neuron 4.: 767-773), bem como as indicações de estratégias para produzir uma junção de fusão (por exemplo, ver Darling et al.. 1983, Cold Spring Harbor Symposium Quantitative Biology 48:427-434; Edwards et al.. 1988, J.Biol. Chem. 263: 6810-6815; Suter et al. . 1991, EMBO J. 10.:2395-2400). Numa outra concretização, construções quiméricas que fundem a região prepro de um ácido nucleico recombinante afim com NT-4, como as contidas no bacteriófago Ηθ7^-2, HG 4^2~e HG2-1, com as regiões maduras de outras neurotrofinas, podem também ser usadas para promover a expressão eficaz dessas outras neurotrofinas, como discutido supra. O presente invento proporciona também processos de detecção ou medida da actividade de NT-4. Como descrito no Exemplo 12, verificámos que o trkB é um receptor funcional para NT-4. Com base nestas verificações, o invento proporciona processos para a detecção ou medida da actividade de NT-4 compreendendo a exposição de uma célula que expressa trkB a um agente de teste, e detectando ou medindo a ligação do agente de teste a trkB, em que a ligação específica a trkB se correlaciona positivamente com a actividade de NT-4 no agente teste. Numa concretização específica, a célula que expressa trkB é uma célula transfectada, tal como o fibroblasto 3T3, que expressa trkB recombinante, de tal forma que a sobrevivência da célula é dependente da exposição à neurotrofina-4 ou ao BDNF. Assim, a detecção da ligação do agente de teste pode ser efectuada por observação da sobrevivência destas células transfectadas.

6. EXEMPLO: ESTUDOS EVOLUTIVOS DA FAMÍLIA DO FACTOR DE CRESCIMENTO DO NERVO REVELAM UM NOVO MEMBRO ABUNDANTEMENTE EXPRESSO NO OVÁRIO DE XENOPUS 73 993 6526-079-118

-35-

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS 6. 1. 1. PREPARAC&O DE ADN O ADN genómico foi isolado por procedimentos padrão (Davis et al.. 1986, Basic Methods In Molecular Biology", Elsevier, New York) de leucócitos humanos e de fígado de rato Sprague-Dawley, de rã fXenopus laevis) e de raia (Raia clavata). O ADN genómico foi também obtido de salmão (Salmão) e de cobra elefante (Vipera lebetina). O ADN foi precipitado com etanol, recolhido utilizando um gancho de vidro, lavado com 80% de etanol, sêco e "dissolvido em água até uma concentração final de l mg/ml. O ADN de salmão (Sigma, St. louis, MO) foi dissolvido em água, extraído duas vezes com fenol e uma vez com clorofórmio, e precipitado com etanol. 6. 1. 2. REACÇÕES EM CADEIA COM POLIMERASE, CLONAGEM MOLECULAR E SEOUENCIACÃO DE ADN Seis misturas separadas de oligonucleótidos mero 28 representando todos os codões possíveis correspondentes à sequência de aminoácidos KQYFYET (SEQ ID NO:110) (oligonucleótido-5') e WRFIRID (SEQ ID NO:111) (oligonucleó-tido-3') (Fig. IA) foram sintetizadas num sintetizador de ADN da Applied Biosystems A381. O oligonucleótido-5' continha um local EcoRI sintético e o oligonucleótido-37 continha um local HindiII sintético (Knoth et al.. 1988, Nucl. Acids Res. 16:1093; Numberg et al. , 1989, J. Virology 63^ 3240-3249). Cada mistura de oligonucleótidos foi então utilizada para iniciar a amplificação de 0,8 yq de ADN genómico utilizando a reacção em cadeia com polimerase (PCR) (Taq DNA polimerase, Promega) (Saiki et al.. 1985, Science 230:1350-1354). Os produtos de PCR foram digeridos com HindiII e EcoRI. analisados num gel de agarose a 2% e clonados no plasmídeo Bluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA). 0 tamanho da região amplificada mais os iniciadores é de 179 pares de bases (bp) para o NGF e de 182 bp para o BDNF e NT-3. Como resultado de locais EcoRI internos em alguns casos, foram também isolados fragmentos mais pequenos de 144 bp e 95 bp. Os fragmentos de ADN clonados foram sequenciados utilizando o processo de terminação de cadeia por nucleótidos didesoxi -36- 73 993 6526-079-118 (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467) com a T7 DNA polimerase (Pharmacia,Uppsala). Foram sequenciados entre dois e vinte clones independentes para cada gene e espécie, e na totalidade foram sequenciados mais de 200 clones independentes.

Foram pesquisados aproximadamente 2 ooo ooo de clones provenientes de uma biblioteca genómica de Xenopus preparada por inserção de ADN genómico digerido com Mbol no local BamHI do fago EMBL-3 utilizando procedimentos convencionais com um fragmento de PCR de 18 2 bp de NT-4'.....de^ xenopus · larcado com [a-32P]dCTP por tradução por corte para uma actividade específica de aproximadamente 5 x 108 cpm//ug. A hibridação foi efectuada em 4 x SSC (1 x SSC é NaCl 150 mM, citrato de sódio 15 mM (pH 7,0)), 40% de formamida, 1 x Solução de Denhardt, 10% de sulfato dextrano a 42 "C. Os filtros foram lavados a 55 °c em 0,1 x SSC, 0,1% SDS e expostos a filmes Kodak XAR-5 a -70 "C. Oito clones de fagos foram isolados, e um fragmento Psti de 1,5 kb de hibridação de um destes clones foi subclonado no plasmídeo pBS-KS (Stratagene). A sequência nucleotídica do fragmento subclonado foi determinada pelo processo de terminação de cadeia por nucleótidos didesoxi (Sanger et al. . 1977, _Proc. Natl. Acad. SCÍ. USA 74: 5463-5467).

6. 1. 3. ANÁLISE COMPUTADORIZADA DOS DADOS DA SEQUÊNCIA

As comparações e alinhamentos das sequências de ADN e de aminoácidos apresentadas na Tabela I foram realizadas num computador VAX utilizando o software UWGCG (Devereux et al.. 1984, Nucl. Acid. Res. 72:387-395). Os resultados da comparação das sequências de aminoácidos utilizando os programas UWGCG estão apresentados como percentagem de semelhança de aminoácidos ou de identidade nucleotídica entre as sequências, tendo em conta as alterações de aminoácidos conservativos (Gribskov e Burgess, 1986, Nucl. Acid Res. 14.:6745-6763; Schwartz e Dayhoff, 1979, "An Atlas of Protein Sequence and Structure", ed. Natl. Biomed. Res. Found., Washington D. C., pp. 353-358). Foi usada a "Phylogenetic Analysis Using Parsimony (versão 3.0f PAUP) para a construção dos filogramas (Felsenstein, 1988, Annu. Rev. Gene -37- 73 993 6526-079-118 22.:521-555; Swofford e Olsen, 1990, em "Molecular Systematics", Hills and Moritz, Eds. Sunderland, M.A., Sinaver Assoe., Inc. pp 441-501). Investigações para as árvores mais prováveis foram realizadas utilizando tanto os algoritmos exaustivos como os heurísticos (permuta de ramos). 6. 1. 4. PRODUÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE,

ENSAIO DE LIGAÇÃO A CÉLULAS PCI2, E ENSAIOS DE ACTIVIDADES NEUROTRÓFICAS

Para a expressão transiente de proteínas recombinantes em células COS, foram clonados fragmentos apropriados de- ADN no vector pXM (Yang et al ♦ . 1986, Cell 47.:3-10). Para NT-4, o fragmento PstI de 1,5 kb sequenciado de xenopus foi clonado em pXM, e para NGF foi usado um fragmento BstEII-PstI de 771 bp do exão 37 do gene de NGF de rato (Halbook et al.. 1988,

Development 108:693-704). Para expressar a proteína BDNF, foi também sub-clonado em pXM um fragmento amplificado por PCR, contendo a sequência de codificação da prepro BDNF do gene de BDNF de ratinho (Hofer et al.. 1990. EMBO J. .9:2459-2464). para NT-3, um clone de ADNc de rato de 1020 bp foi inserido em pXM ÍErnfors et al.. 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5454-5458). Células COS (Gluzman, 1981, Cell 3.:175-182) crescidas até cerca de 70% de confluência foram transfectadas com 25 /zg de ADN plasmídico por placa de 100 mm utilizando o protocolo DEAE-dextrano-cloroquina (Luthman e Magnusson, 1983, Nucl. Acids Res. 17.:1295-1305). As células transfectadas foram então crescidas em meio completo (DMEM com 10% de FCS), e meio condicionado foi recolhido 3 dias após a transfecção. Placas (35 mm) transfectadas em paralelo foram crescidas até à terceira noite após a transfecção na presença de 200 /xci/ml de [35S]cisteína (Amersham, UK). Alíquotas (10-20 μΐ cada) de meios condicionados marcados in vivo foram analisadas por SDS-PAGE em geis de poliacrilamida a 13%. Os geis foram tratados com EnHance (New England Nuclear, Boston, MA), secos, e expostos a filmes Kodak XAR-5 com écrans de intensificação durante 24-48 horas a 80 eC. As auto-radiografias foram varridas num densitómetro Shimadzu, e as quantidades relativas das diferentes proteínas /' -38- 73 993 6526-079-118 recombinantes foram estimadas pelo cálculo da área correspondente a cada proteína em relação à área obtida com NGF de rato. A quantidade absoluta de proteína NGF de rato foi obtida por imunotransferência quantitativa dos meios condicionados utilizando padrões de NGF purificado de ratinho, e foi usada para determinar a concentração de proteína em amostras contendo outras proteínas recombinantes.

Para o teste de ligação das proteínas recombinantes às células PC12 (Greene e Tischler, 1976, _Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73.:2424-2428), NGF de ratinho foi marcado'· com" 125I pelo processo da T-cloramina para uma actividade média de 7 x 107 cpm/^g. A ligação em estado estacionário foi medida por ensaios de competição efectuados a 37 °C ou a 0 °C utilizando 1 x 104 células por ml, 125I-NGF a 1,5 x 10“9 M; e diluições seriadas de meios condicionados contendo quantidades equivalentes de NGF ou NT-4. Todos os componentes foram adicionados ao mesmo tempo, e as células foram recolhidas por centrifugação após se ter obtido o equilíbrio (1-3 horas de incubação). Experiências de controlo utilizando meio de células COS simuladamente transfectadas, mostraram que outras proteínas presentes no meio condicionado não tinham qualquer efeito sobre a ligação de 125j-ngf ás células PC12. A ligação não específica foi medida numa incubação paralela em que foi adicionado pelo menos um excesso de NGF não marcado de 1000 vezes. Todos os resultados foram corrigidos tendo em conta esta ligação não específica que foi sempre 10% inferior à ligação total.

As actividades biológicas das diferentes proteínas foram medidas pela capacidade dos meios condicionados das células COS transfectadas, contendo quantidades iguais de proteína recombinante, para estimular a excrescência de neurites a partir de explantes do simpático, gânglios da raiz dorsal e nodoso^ de embriões de galinha E9 (Ebendal, 1984, "Organizing Principies of Neural Development, S. Sharms, ed., New York: Plenum Publishing Corp., pp. 93-107; Ebendal, 1989, "Use of Collagen Gels to Bioassay Nerve Growth Factor Activity In Nerve Growth Factors", R. A. Rush, ed. (Chichester: John Wiley & Sons, pp. 81-93). 73 993 /-' 6526-079-118 c r~ -39- ^ ^

Foram ensaiadas diluições seriadas de meio condicionado e foram contadas as excrescências fibrosas.

6. 1. 5. PREPARAÇÕES DE ARN E ANALISE POR TRANSFERÊNCIA

Os tecidos indicados de fêmea adulta de Xenopus foram dissecados e congelados em azoto líquido. O cérebro e a espinal medula foram combinados. Vários lóbulos do ovário foram dissecados, incluindo oócitos de diferentes etapas. As amostras de tecido congelado foram homogeneizadas em isotiocianato de guanidina 4 M, /3-mercaptoetanol 0,1 M, citrato de sódio (pH 7,0) 0,025 M e homogeneizados três vezes durante 15 s com um Polytron. Cada homogeneizado foi aplicado em camada sobre uma almofada de 4 ml de CsCl em 0,025 M de citrato de sódio (pH 5,5) e centrifugados a 15 °C num rotor Beckman SW41 a 35 000 rpm durante 76 horas (Chirgwin et al.. 1979, Biochemistry 78^5294-5299). 0 ARN poli(A)+ foi purificado por cromatografia de celulose-oligo(dT) (Aviv e Leder, 1972, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408-1412) e o ARN recuperado foi quantificado espectrofotométricamente antes da utilização em análise de transferência ARN. 0 ARN poli(A)+ (10 μg) de cada amostra foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1% contendo 0,7% de formaldeído. Foi utilizada a transiluminação-UV do gel corado para confirmar que todas as amostras continham quantidades semelhantes de ARN intacto. 0 gel foi então transferido para um filtro de nitrocelulose. 0 filtro foi hibridado com as sondas de ADN indicadas. As sondas foram marcadas com [a-33P]dCTP por tradução por corte com uma actividade específica de cerca de 5 x 105 cpm//ig, e a hibridação foi efectuada como descrito acima. Os filtros foram lavados em condições de elevada severidade (0,1 x SSC, 1% de SDS, 54 °C) e expostos a filmes Kodak XAR-5.

6. 2. RESULTADOS

Os fragmentos de ADN que codificam NGF, BDNF e NT-3 de humano, rato, cobra, rã, e peixe foram isolados utilizando a técnica de PCR com iniciadores degenerados de regiões conservadas nestas três proteínas, localizadas entre a lisina 50 e a treonina 56 para o iniciador a montante e entre o triptofano -40- / 73 993 6526-079-118 C·' 99 até o ácido aspártico 105 para o iniciador a jusante (Fig. IA) . A região amplificada contem três dos seis resíduos de cisteínas e cobre aproximadamente um terço das moléculas maduras. Uma comparação da região amplificada nas moléculas já caracterizadas de NGF de diferentes espécies mostra que esta contém duas regiões variáveis, da arginina 59 à serina 67 e do ácido aspártico 93 à alanina 98. Uma região hidrofílica que se crê estar exposta na superfície da molécula (Bradshaw, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47.:191-216), bem como as regiões altamente conservadas da glicina 68 ao triptofano 76 e da treonina 85 à treonina 91 estão também incluídas nã região amplificada. As moléculas de BDNF e NT-3 possuem um aminoácido extra entre as posições 94 e 95 da proteína NGF de ratinho, a qual está também incluída na região amplificada.

As sequências da molécula madura completa de proteína NGF, BDNF e NT-3 de ratinho, foram comparadas de modo a calcular qual a representatividade da região amplificada na molécula completa. As moléculas maduras completas mostram 65/57% de similaridade (similaridade de sequência de aminoácidos/identidade de sequência nucleotídica) entre NGF e BDNF, 70/61% de similaridade entre NGF e NT-3 e 68/58% de similaridade entre BDNF e NT-3. Quando se compara a região isolada neste estudo, a similaridade entre NGF e BDNF é de 62/53%, entre NGF e NT-3 é de 67/58% e entre BDNF e NT-3 é de 69/60%. Isto sugere fortemente que a região isolada neste estudo é representativa da moléclula completa e que pode ser utilizada para monitorizar as relações evolutivas entre os diferentes factores. A comparação das sequências par a par foi efectuada (Tabela I), tendo em consideração as substituições de aminoácidos conservativos, utilizando a matriz de comparação de Schwartz e Dayhoff (1979, "In Atlas of Protein Sequence and Structure, M.O. Dayhoff, ed., Washington, D.C., Natl. Biomed. Res. Found., pp. 353-358). Além disso, a comparação das sequências de aminoácidos dadas abaixo e apresentadas na Tabela I indicam a percentagem de similaridade, não identidade. As árvores filogenéticas foram construídas utilizando análise parcimónica (Felsenstein, 1988, Ann. Rev. Genet. .22.: 521-565; Swofford e Olsen, 1990, "In Molecular 73 993 6526-079-118

-41-

Systematics, D. M. Hills e C. Moritz, eds., Sunderland, MA:Sinauer Assoe., Inc., pp.411-501). Como abaixo apresentado, todos os fragmentos de ADN isolados com sequências de aminoácidos previstas relacionadas com as de NGF, BDNF, e NT-3 continham resíduos de cisteína conservados nas posições correctas. Isto foi usado como critério inicial para considerar uma sequência como membro da família de genes do factor de crescimento do nervo.

6. 2. 1. NGF, BDNF E HDNF/NT-3 SÃO ALTAMENTE CONSERVADAS DURANTE A" EVOLUÇÃO ---------------------------—*......................

6. 2. 1. 1. FACTOR DE CRESCIMENTO DO NERVO A sequência nucleotídica (Fig. 1B [humano (SEQ ID N0:3), rato (SEQ ID NO:4), galinha (SEQ ID N0:5), víbora (SEQ ID NO:6), Xenopus (SEQ ID NO: 7), salmão (SEQ ID NO: 8) ] e a sequência de aminoácidos prevista dos fragmentos isolados que codificam NGF estão altamente conservados do peixe ao humano (Fig. 2.[humano (SEQ ID NO:24), rato (SEQ ID NO:25), galinha (SEQ ID NO:26), víbora (SEQ ID NO:27), Xenopus (SEQ ID NO:28), salmão (SEQ ID NO:29)]. A maior parte das alterações de aminoácidos não conservativos foram encontradas nas regiões variáveis da arginina 59 à serina 67 e do ácido aspártico 93 à alanina 98 (Fig. 2). A similaridade entre as sequências de NGF de Xenopus e humano é 93/79% (Tabela I). NGF de Xenopus e de galinha são idênticas excepto para uma alteração conservativa da lisina 62 à arginina 62 (Fig. 2). As sequências de NGF de víbora e de salmão contêm, respectivamente, 11 e 19 aminoácidos diferentes (de 42), comparadas com NGF humano, enquanto todas as outras espécies apresentaram apenas quatro diferenças. Nenhuma das sequências de aminoácidos de NGF isoladas continha o resíduo aminoácido extra presente em BDNF e NT-3 entre o ácido glutâmico 94 e a lisina 95 das sequências de NGF humano.

As relações inter-espécies das diferentes sequências de NGF foram analisadas pela construção de uma árvore filogenética (Fig. 3A). A sequência de NGF de salmão parece ter divergido mais do que as sequências de NGF isoladas de outras espécies. -42- 73 993 6526-079-118

Nenhuma sequência de NGF pode ser isolada de raia utilizando a técnica de PCR descrita, sugerindo que as sequências de NGF de raia podem estar acima da tolerância de erros de emparelhamento dos iniciadores utilizados no nosso protocolo de PCR. Alternativamente, a ausência de NGF em peixes cartilaginosos pode implicar que o NGF aparecesse depois da separação do ramo levando à evolução de peixes ósseos (há cerca de 450 milhões de anos), mas antes dos anfíbios e vertebrados superiores terem evoluído a partir deste ramo (há cerca de 400 milhões de anos).

TABELA I

NGF

Hum Rato Gal Víb Xen Sal Humano - 95 93 86 93 69 Rato 87 - 88 87 88 69 Galinha 80 73 - 90 100 74 Víbora 73 72 75 - 90 67 Xenonus 79 73 83 76 - 74 Salmão 60 61 60 51 53 - Raia X X X X X X 73 993 6526-079-118 ΝΤ-3 -43- Hum Rato Gal Xen Sal Raia - 100 100 100 81 88 91 - 100 100 81 88 81 83 - 95 81 86 X X X X X X 73 79 86 - 86 90 67 64 71 71 - 74 76 73 71 72 71

Hum Rato Gal Víb. Xen Sal Raia - 100 95 86 95 100 93 91 - 95 86 95 100 93 88 84 - 91 91 95 93 83 78 85 - 88 86 84 73 82 85 82 - 95 88 82 80 83 75 78 - 99 77 76 78 74 74 78 — -44-

-44- J 73 993 6526-079-118

Identidades nucleotídicas e similaridades de aminoácidos foram calculadas com um computador VAX (pacote de software de UWGCG; Devereux et al. .1984. Nucl. Acids Res. 12.:389-395) de acordo com a matriz de comparação de Schwartz e Dayhoff (1979f Washington, D.C. Natl. Biomed. Res. Found. pp.353-358), tendo em consideração as alterações de aminoácidos conservativos. As figuras abaixo das diagonais apresentam a percentagem de identidade nucleotídica. As figuras acima das diagonais apresentam a percentagem de similaridade de aminoácidos. X indica que as sequências não foram isoladas daquelas espécies (NGF de raia e NT-3 de vibora). Hum,humano; Gal, "galinha? Víb, víbora; Sal, salmão; Xen, Xenoous.

6. 2. 1. 2. FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DE CÉREBRO

As sequências de ADN similares à do BDNF humano foram encontradas em todas as espécies investigadas (Fig. 1B [SEQ ID NOS:1-21, supra listadas). A similaridade nas sequências de aminoácidos e de nucleótidos, entre a raia, a espécie mais primitiva investigada, e o humano são de 93/77% (Tabela I). Apenas duas alterações não conservativas foram verificadas fora das regiões variáveis, enquanto dez alterações similares foram encontradas em duas regiões variáveis (Fig. 2). Em Xenopus. (SEQ ID NO:34) a leucina 90 é substituída por uma fenilalanina como resultado de uma mutação num único par de bases, C para T na primeira posição do codão, e em salmão (SEQ ID NO:35), o triptofano 77 é substituído por uma tirosina como resultado de uma mutação dupla, mudando o codão de TGG para TAT (Fig. 1B [SEQ ID N0:14]). Todas as sequências isoladas continham um resíduo de aminoácido extra na posição 96, comparadas com o NGF (Fig.2 [SEQ ID NO:24-29]). As sequências de BDNF de diferentes espécies apareceram como um grupo homogéneo de sequências quando analisadas pelo processo parcimónico (Figura 3B). 6. 2. 1. 3. NEUROTOFINA-3

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas para NT-3 de humanos (SEQ ID NO.-16 e 37), rato (SEQ ID NO: 17 e 38), galinha (SEQ ID NO:18 e 39), Xenopus (SEQ ID NO:19 e 40), salmão (SEQ ID NO:20 e 41), e de raia são altamente similares -45- 73 993 6526-079-118 (Figs. 1B, Figura 2). A maior parte das alterações são mutações silenciosas que resultam de alterações na terceira posição dos codões, usualmente transições que preservam a estrutura da pirimidina ou purina do par de bases. Apenas alterações de aminoácidos não conservativos foram encontradas nas duas regiões variáveis e não se verificaram substituições de aminoácidos fora das duas regiões variáveis. A sequência de salmão não possui o Asp-94 que está presente em todas as outras moléculas de NT-3 (Fig. 2) e possui uma distância maior do ponto de ramificação na árvore filogenética do que as sequências de NT-3 das outras espécies (Figura 3C). " ......* *--------------- ----------- ------ 6. 2. 1. 4. UM NOVO MEMBRO DA FAMÍLIA DE GENES DO FACTOR DE CRESCIMENTO DO NERVO Fragmentos adicionais de ADN foram isolados de víbora (SEQ ID NO:1) e Xenopus (SEQ ID NO:2), e as sequências previstas de aminoácidos (SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23, respectivamente) revelaram que estes fragmentos continham todos os três resíduos de cisteína nas mesmas posições como no NGF, BDNF e NT-3 (Fig. 1B, Fig. 2). Uma comparação com as sequências de NGF, BDNF e NT-3 de Xenopus indicou que esta nova sequência está relacionada, mas não é idêntica, às sequências de outros membros da família do NGF. 0 gene que inclui esta sequência foi portanto denominado neurotrofina-4 (NT-4). A comparação das sequências de nucleótidos e de aminoácidos mostram que a NT-4 de Xenopus e de víbora têm uma similaridade de 91/73%. Esta similaridade está na mesma gama da encontrada entre NGF e BDNF de Xenopus e de víbora (Tabela I). Tal como para os outros membros da família do NGF, alterações de aminoácidos não conservativos foram apenas observadas nas duas regiões variáveis (Fig. 2). 6. 2. 1. 5. COMPARAÇÃO E FILOGENIA DOS MEMBROS DA FAMÍLIA DE GENES DO FACTOR DE CRESCIMENTO DO NERVO Uma comparação das árvores filogenéticas para o NGF, BDNF e NT-3 mostraram ramos mais longos na árvore de NGF, indicando uma maior taxa de alterações evolutivas (Figuras 3A-3C). A relação de cada membro da família de NGF com os outros membros foi estudada pela construção de um filograma comparando as -46- 73 993 6526-079-118 sequências de aminoácidos deduzidas para os quatro membros da família. O filograma mostrou que o NGF está mais proximamente relacionado com NT-3 do que com BDNF e NT-4 (Figura 3D). NT-3 está tão relacionado com NGF como com BDNF. NT-4 está mais claramente relacionado com BDNF do que com os outros membros. 6. 2. 2. CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DA PROTEÍNA NT-4

De modo a permitir uma caracterização mais detalhada do gene de NT-4 e do seu produto genético, pesquisámos uma biblioteca genómica de Xenopus com o fragmento de PCR de NT-4 e isolámos um clone fágico contendo uma inserção de 16 kb. A partir desta inserção foi subclonado e sequenciado um fragmento PstI de 1,5 kb, Figura 4A (SEQ ID NO:43). A sequência nucleotídica continha uma estrutura de leitura aberta que codifica uma proteína de 236 aminoácidos (SEQ ID NOí44) que apresentou vários aspectos estruturais característicos dos outros membros da família do NGF. A extremidade amino da proteína NT-4 prevista contém uma sequência de sinal putativa de 18 aminoácidos em que uma região de 4 aminoácidos é idêntica às regiões correspondentes de BDNF no porco e no rato (Leibrock et al.. 1989, Nature 341:149-152; Maisonpierre et al. . 1990, Science 247:1446-1451). Segue-se um local de clivagem do sinal potencial, que é também idêntico ao que foi proposto para o BDNF (Figura 4A). Um local de clivagem potencial para uma proteína NT-4 madura de 123 aminoácidos é encontrado a seguir ao aminoácido 113 na proteína prepro-NT-4. Um único local de N-glicosilação previsto (Asn-Lys-Thr) está localizado 8 aminoácidos antes do local de clivagem putativo.

Uma comparação da proteína NT-4 madura com as proteínas BDNF, NT-3 e NGF maduras de ratinho revelaram 60%, 58% e 51% de identidade de aminoácidos, respectivamente. Todos os 6 resíduos de cisteína envolvidos na formação de pontes dissulfeto [Figura 4B (SEQ ID NO:45-48)] estão incluídos na proteína NT-4 madura. As regiões que são idênticas entre NGF, BDNF e NT-3 são também similares na proteína NT-4. A maioria das diferenças de sequências entre a proteína NT-4 e as outras três proteínas foram encontradas nas mesmas regiões variáveis previamente 73 993 6526-079-118 ,.· , 1 '77 -47- identifiçadas nos outros membros da família.

6. 2. 3. LIGAÇÃO AO NGF-R E ACTIVIDADE NEUROTRÓFICA DE NT-4 O fragmento PstI de 1,5 kb de Xenoous foi clonado no vector de expressão pXM (Yang et al.. 1986, Cell 47:3-10) e transientemente expresso em células COS. SDS-PAGE de meios condicionados de células transfectadas marcada com [35S]-cisteína apresentou uma proteína NT-4 com um Mr de 14K (Figura 5A). A proteína NGF produzida e marcada em placas paralelas migrou de alguma forma mais rapidamente do que a proteína NT-4. Esta diferença na mobilidade é devida provavelmente às variações na carga das duas proteínas. Diferenças de mobilidade semelhantes foram também observadas para proteínas NGF com tamanhos idênticos, de espécies diferentes.

Meios condicionados de células COS transfectadas contendo quantidades iguais de NGF de rato e proteína NT-4 de Xenopus foram testadas quanto à sua capacidade para competir para a ligação de NGF marcado com 125I ao seu receptor nas células PC12. Os testes de ligação foram efectuados a 37 eC e sob condições em que 80% do 125I-NGF associado às células é ligado ao NGF-R de baixa afinidade (Sutter et al.. 1979, J. Biol. Chem 254.:3972). Foram necessárias concentrações semelhantes de NGF e NT-4 (6xlO-10M) para deslocar 50% do 125i-ngf das células PC12, indicando que as duas proteínas se ligam ao NGF-R de baixa afinidade com uma afinidade semelhante (Figura 5B). A elevadas concentrações, a proteína NT-4 foi menos eficaz no deslocamento de 125I-NGF, sugerindo que neste caso o 125I-NGF remanescente associado às células foi ligado a receptores de elevada afinidade ou interiorizado. 0 facto de esta diferença poder não ser observada num ensaio paralelo efectuado a 0°C em que não ocorre mobilização ou interiorização da membrana sugere que a proteína NT-4 não é capaz de competir com NGF para a interiorização, um processo conhecido por ser exclusivamente mediado através dos receptores de elevada afinidade (Olender e Stach, 1980, J. Biol. Chem. 255:9338-9343: Bernd e Greene, 1984, J. Biol. Chem. 259:15509-15516; Hosang e Shooter, 1987, EMBO J.

73 993 6526-079-118 £:1197-1202). A proteína NT-4 transientemente expressa em células COS foi testada quanto à sua capacidade de promover o crescimento de neurites a partir de explantes de gânglios de embrião de pinto. Foi verificada uma clara estimulação da excrescência de neurites em explantes de gânglios da raiz dorsal de galinha (Figura 6A). A comparação das curvas de resposta a dose utilizando quantidades iguais de proteínas NT-4 e NGF revelaram que a actividade obtida com NT-4 era inferior àquela que se observava com NGF (Figuras 5A e 5B) r~Ss "proteínâs BDNF~e“NT-4 recombinantes estimulavam a excrescência de neurites em gânglios da raiz dorsal numa extensão semelhante (Figuras 6A e 6C). A proteína NT-4 provocou uma fraca, mas consistente, excrescência de neurites a partir de gânglios nodosos (Figura 6G), embora não se tivesse conseguido detectar em gânglios simpáticos (Figura 6E). Isto contrasta com o NGF, o qual estimula marcadamente a excrescência de neurites a partir de gânglios simpáticos. (Figura 6F), e com a NT-3, a qual apresentou uma clara actividade nos gânglios nodosos (Figura 6H). Tal como para NT-4, a actividade de promoção da excrescência de neurites do BDNF nos gânglios nodosos (Figura 61) foi inferior à actividade observada com o NT-3.

6. 2. 4. EXPRESSÃO DO ARNm DE NT-4 EM DIFERENTES TECIDOS DE XENOPUS

Foi preparado ARN poliadenilado a partir de 11 tecidos diferentes de Xenopus e utilizado para análise por transferência de Northern. A hibridação com a sonda de NT-4 de Xenopus revelou elevados níveis de dois transcritos de NT-4 de 2,3 kb e 6,0 kb no ovário (Figura 7A). Em contraste, o nível de ARNm de NT-4 estava abaixo do limite de detecção em todos os outros tecidos analisados. A hibridação com a sonda de NGF de Xenopus mostrou um ARNm de NGF de 1,3 kb no coração (Figura 7A) e no cérebro. No entanto, a quantidade de ARNm de NGF nestes tecidos era na ordem de 100 vezes inferior ao nível de ARNm de NT-4 no ovário. Foi também detectado ARNm de NGF no ovário, embora a quantidade de ARNm de NGF fosse aproximadamente 100 vezes inferior ao nível de 73 993 6526-079-118 . , .....^ : ν- ; -49- ARNm de NT-4 neste tecido (Figura 7B). Os níveis de ARNm NT-3 e de BDNF no ovário estavam ambos abaixo do limite de detecção (Figura 7B).

6. 3. DISCUSSÃO

Usámos a reacção em cadeia com polimerase (PCR) em combinação com iniciadores de oligonucleótidos degenerados para isolar os genes para diferentes membros da família do NGF a partir de espécies diferentes. Uma comparação das sequências nucleotídicas e de aminoácidos das proteínas completas maduras NGF, BDNF e NT-3 revelou similaridades que são as mesmas que se obtiveram por comparação da região dos genes analisados neste estudo. Assim, esta região parece ser representativa do resto do gene e pode desta forma ser utilisada para estudar a conservação evolutiva da proteína completa madura.

Os genes de NGF, BDNF e NT-3 de diferentes espécies incluem regiões que mostram identidade completa entre peixes e mamíferos, bem como regiões de baixa similaridade. Uma comparação de sequências de NGF de diferentes espécies com as sequências correspondentes de BDNF ou NT-3 mostrou que o gene de NGF é menos conservado em vertebrados do que os de BDNF e HDNF/NT-3. Os dois últimos genes parecem ser igualmente conservados em todas as espécies estudadas, excepto em salmão, em que o NT-3 é menos conservado do que o BDNF. Neste contexto, é interessante especular acerca do facto de que o relógio molecular parece acelerar-se em alguns ramos, notavelmente o de NGF, e não em outros. Geralmente acredita-se que existe uma força selectiva que preserva a estrutura terciária correcta da proteína (Dickerson, 1971, J. Mol. Evol. 1.:26-45; Kimura e Ohta, 1974, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71:2848-2852). A diferença na conservação evolutiva dos três factores sugere que tem havido uma maior pressão selectiva sobre os genes de BDNF e NT-3 do que sobre o gene do NGF. Foram propostas alterações ambientais para levar a alterações na pressão selectiva alterando o óptimo de desempenho de um produto genético específico (Kimura, 1983, em "Evolution of Genes and Proteins", pp.208-233). Neste contexto, é possível que as alterações evolutivas mais extensas observadas /

73 993 6526-079-118

Cp. -50- no NGF quando comparado com BDNF e NT-3, reflictam o facto de que a função do NGF se tenha modificado mais durante a evolução. Estudos de estrutura-função do NGF mostraram que esta molécula pode tolerar alterações estruturais consideráveis sem perda ou modificação do seu perfil de actividade, sugerindo que o grau mais baixo da conservação evolutiva do NGF possa ser devida a uma estrutura mais estável desta proteína, que é assim menos fácilmente perturbada por substituições. Outra explicação possível é a de que as regiões do genoma onde os genes para os diferentes factores estão localizados possuírem diferentes taxas de mutação geral. Foram apresentadas taxas diferentes' de'mutação para regiões do genoma não codificadores (Wolfe et al.. 1989, Nature 337.:283-285) mas isto é menos claro se puder levar a um número aumentado de alterações em regiões codificadoras. 0 NGF e a NT-3 de salmão são notavelmente mais diferentes quando comparados com estas moléculas em outras espécies. Àlguns aminoácidos, incluindo a treonina 82 e histidina-treonina--fenilalanina na posição 85 a 87 em NGF, bem como a ausência do aminoácido entre as posições 94 e 95 (comparado com as duas outras proteínas), são características consistentes da proteína NGF. 0 facto da sequência isolada de salmão conter todos estes motivos específicos de NGF argumenta que esta não é um membro adicional da família, mas que representa o NGF de salmão. Em contraste com todas as outras sequências de NT-3 estudadas, o NT-3 de salmão não possui o aminoácido na posição 95. Uma vez que o aminoácido extra está presente na NT-3 de raia, é provável que o ancestral comum da raia e salmão tivesse uma sequência de NT-3 ancestral que incluísse o aminoácido extra na posição 95. Desta forma, as alterações na molécula de NT-3 de salmão devem ter ocorrido depois desta separação do gene do ancestral comum. A maior parte das alterações nos aminoácidos da sequência de salmão estão nas mesmas regiões que variam, com um menor grau, também nas outras espécies, sugerindo fortemente que as sequências isoladas de NGF e NT-3 de salmão não são pseudogenes. A maior divergência de NGF e NT-3 de salmão, comparadas com outras espécies, reflecte provavelmente o elevado grau de expansão evolutiva dos peixes ósseos. -51- 73 993 .. - /. 6526-079-118

Os resultados neste estudo indicam que a família do NGF existia provavelmente há 500 milhões de anos nos peixes primitivos, que eram os ancestrais dos actuais vertebrados superiores. A família de genes pode ter sido formada por duplicação genética, que se crê ser o mecanismo mais comum através do qual novos genes evoluem (Li, W., 1983, em "Evolution of Genes and Proteins", pp.14-37). Duplicações de genes funcionais podem ter sido facilitadas, uma vez que toda a informação necessária para a síntese de uma proteína biologicamente activa está contida num exão 3' (Hallbook et al.. 1988, Mol. Cell. Biol. 8.:452-456; Leibròck et al. . 1989; Nature 341:149-152; Hohn et al.. 1990, Nature 344:339-441). A formação da família envolveu várias duplicações de genes (Figura 3D).

Uma vez que a NT-4 está mais proximamente relacionada com BDNF do que com NT-3 ou NGF, parece que a NT-4 e o BDNF foram formados a partir de um gene ancestral comum. No entanto, uma vez que não foi distinguida a partir dos resultados apresentados nenhuma molécula do tipo progenitor para todos os quatro factores, a relação evolutiva do ancestral putativo BDNF/NT-4 com os ancestrais de NGF e NT-3 não pode ser definitivamente estabelecida. A topologia dos filogramas utilizando dados de espécies diferentes está geralmente de acordo com a relação evolutiva consensual entre espécies diferentes. No entanto, para ambos de NGF e BDNF, as sequências de galinha mostram um ramo mais precoce no filograma do que o esperado. A comparação de NT-4, NGF e BDNF de víbora e Xenopus revelou que as sequências de NT-4 nestas espécies têm 11 substituições de aminoácidos, comparados com 9 e 8 substituições em NGF e BDNF, repectivamente. Isto sugere que nestas espécies, a NT-4 divergiu com uma taxa que é comparável a, ou mais rápida que, a taxa de divergência de NGF ou BDNF.

As substituições de aminoácidos altamente conservados na molécula de NGF não eliminam a actividade biológica, mas em muitos casos afectam a quantidade de proteína produzida, indicando que existem outros constragimentos para além da actividade biológica, tais como a estabilidade da proteína, que -52- 73 993 6526-079-118 pode ser importante para a conservação da proteína NGF. Adicionalmente, o facto de todos os membros da família do NGF poderem interagir com o NGF-R de baixa afinidade sugere que a conservação completa de certas regiões nestes factores pode ser devida a constrangimentos nestes genes para reter proteínas que possam interagir com o NGF-R. Os mecanismos básicos e estratégias para a ontogenia precoce do embrião são semelhantes em todos os vertebrados e envolvem presumivelmente genes que são conservados em todos os vertebrados. A conservação evolutiva dos factores neurotróficos é dessa forma consistente com a noção de que são importantes no desenvolvimento' embrionário.....precoce- em muitas espécies diferentes. 0 hipocampo contém os níveis mais elevados de ARNm de NGF, BDNF, e NT-3 no cérebro (Ernfors et al. . 1990, J. Dev. Neurosci. £:57-66). É uma estrutura altamente especializada derivada do arquipálio que inicialmente apareceu nos cérebros de anfíbios e de répteis. 0 hipocampo de mamíferos é importante para a memória, aprendizagem e funções cognitivas conhecidas por estarem associadas com elevada plasticidade neuronal (Crutcher e Collins, 1982, Science 277:67-68). Estas exigências podem ter produzido uma pressão selectiva durante a filogenia para mecanismos de promoção de plasticidade, possivelmente mediados por factores neurotróficos. No entanto, os resultados neste estudo mostram claramente que o evento da duplicação dos genes para os factores neurotróficos precedeu largamente a formação do hipocampo. Esta evidência indica que os factores neurotróficos não evoluíram como consequência da formação do hipocampo e apoia a noção de que a plasticidade neuronal nesta região do cérebro é, pelo menos em parte, devida a estas moléculas. A organização do sistema nervoso dos vertebrados primitivos, isto é, peixes cartilaginosos, apresenta algumas semelhanças básicas com o sistema nervoso de vertebrados superiores. Os nervos cranianos e o sistema nervoso somático sensorial e autónomo em peixes cartilaginosos são em geral semelhantes aos dos vertebrados superiores (Young, J.Z., 1981, The Life of Vertebrates, New York, Oxford University Press). É 73 993 6526-079-118 rjr

-53-desta forma provável que os princípios das interacções neurotróficas sejam os mesmos tanto nos vertebrados primitivos como nos superiores. A conservação evolutiva dos factores neurotróficos semelhantes a NGF também nos vertebrados primitivos sugere que estes factores evoluíram inicialmente em invertebrados e foram depois adaptados para funcionar no desenvolvimento do sistema nervoso dos vertebrados. O nosso estudo da conservação evolutiva da familia do NGF levou ao isolamento de um novo membro desta família, denominado neurotrofina-4 ou NT-4, fragmentos de TCR do gene-de"NT-4 foram isolados de Xenopus e víbora, e um clone genómico foi subsequentemente isolado a partir de Xenopus. A análise da sequência nucleotídica deste clone revelou uma estrutura de leitura aberta para uma proteína de 236 aminoácidos, a qual mostrou várias características estruturais que se assemelham às dos outros três membros da família do NGF. Isto inclui a presença de uma sequência de sinal putativa de extremidade amino e um potencial local de N-glicosilação próximo de um local de clivagem proteolítica que prevê uma proteína NT-4 madura de 123 aminoácidos. 0 tamanho da proteína NT-4 madura é 4 aminoácidos mais longa do que a de BDNF e NT-3, e 5 aminoácidos mais longa do que a proteína madura NGF. Na proteína NT-4 madura, todos os 6 resíduos de cisteína envolvidos na formação das pontes dissulfeto são conservados. A proteína NT-4 difere dos outros membros da família nas mesmas regiões que variam entre as sequências dos outros três membros da família. Como para NGF, BDNF, e NT-3, a proteína completa prepro-NT-4 é codificada num único exão. Assim, tanto a organização do gene como as características estruturais da proteína prevista indicam que o gene de NT-4 é um membro adicional da família do NGF. 0 facto do gene de NT-4 ter sido isolado tanto de répteis como de anfíbios sugere que este está presente em várias espécies diferentes.

Tanto BDNF como NT-3 apresentaram interacção com NGF-R de baixa afinidade (Rodriguez-Tebar et al.. 1990, Neuron 4.:487-492,-Ernfors et al.f 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5454-5458). -54- 73 993 6526-079-118 A proteína NT-4 de Xenopus deslocou 125I-NGF do seu receptor de baixa afinidade em células PCI2, indicando que o quarto membro desta família pode também interagir com o NGF-R de baixa afinidade. A comparação das curvas de deslocamento obtidas a 37 “C e a 0 °C sugere que a proteína NT-4 não pode competir para a ligação ao NGF-R de elevada afinidade. A proteína codificada pelo gene do NGF-R de baixa afinidade parece fazer parte tanto dos receptores de baixa como de elevada afinidade (Hempstead et al.. 1989, Science 243:373-375). O mecanismo pelo qual dois receptores cinéticamente diferentes são formados a partir do mesmo gene de receptor não é conhecido, embora tenha sido proposto que os dois estados podem ser produzidos pela formação de um complexo entre o domínio citoplasmático do receptor e uma proteína intracelular (Radeke et al. . 1987, Nature 325:593-597: Meakin e Shooter, 1991, Neuron 6.:153-163). Alternativamente, uma cadeia de receptor de elevada afinidade pode ser codificada por um gene separado e, em semelhança ao receptor da interleuquina-2 (Hatakeyama et al.. 1989, Science 744:551-556) e ao receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas (Matsui et al.. 1989, Science 243:800-804). as duas cadeias de receptor podem formar um dímero que constitui o receptor de elevada afinidade. 0 facto de todos os quatro membros da família do NGF poderem interagir com o NGF-R de baixa afinidade sugere que o estado de baixa afinidade do NGF-R pode estar, de uma forma ainda não conhecida, envolvida na mediação dos efeitos biológicos de todos estes factores. Neste contexto, é interessante notar que foi mostrado que o gene de NGF-R de baixa afinidade era expresso em muitos tecidos tanto de origem neuronal como não neuronal, não conhecidos por responderem a NGF. Isto inclui o mesênquima, células do tubo neural e somitos no embrião de pinto precoce (Halbrook et al.. 1990, Development 108:693-704? Heuer et al., 1990a, Dev. Biol. 137:287-304; Heuer et al.. 1990b, Neuron 5.:283-296), assim como desenvolver e regenerar neurónios motores da espinal medula (Ernfors et al. . 1989, Neuron 2.: 1605-1613; Ernfors et al. . 1991, J. Dev. Neurosci. 9.:57-66). será portanto de interesse investigar se a proteína NT-4 é de importância funcional em qualquer desses tecidos ou populações neuronais. 73 993 - -: 6526-079-118 /........ -.- -55- C ^α A actividade neurotrófica da proteína NT-4 foi ensaiada em explantes de gânglios embrionários de pinto, e como para os outros três membros da família do NGF, a proteína NT-4 mostrou uma clara estimulação da excrescência de neurites a partir de gânglios da raiz dorsal. No entanto, quando comparado com NGF, a proteína NT-4 mostrou uma actividade inferior nos gânglios da raiz dorsal. Tanto BDNF como como NT-3 induzem prontamente a excrescência de neurites em explantes de gânglios nodosos, embora a resposta com NT-3 fosse consistentemente mais forte do que com BDNF. 0 NGF estimula fortemente a excrescência de neurites em gânglios simpáticos, é a NT=3 possui 'também actividade nestes gânglios, ainda que seja muito menor do que a de NGF (Maisonpierre et al. . 1990, Science 247:1446-1451;

Ernfors et al.. 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5454-5458). A NT-4 mostrou uma actividade mais fraca em gânglios nodosos comparada com a NT-3 e nenhuma actividade em gânglios simpáticos. 0 espectro da actividade biológica da NT-4 em explantes de gânglios periféricos assemelha-se à de BDNF, o que está de acordo com o facto de que a NT-4 é estruturalmente semelhante ao BDNF. A análise por transferência de Northern de 11 tecidos diferentes de Xenopus apresentou níveis elevados de NT-4 no ovário, enquanto que o nível de ARNm de NT-4 estava abaixo do limite de detecção em todos os outros tecidos examinados. Dois ARNm de NT-4 de 2,3 kb e 6,0 kb foram encontrados nos oócitos. A presença de dois transcritos do mesmo gene foi préviamente observada para o BDNF, em cujo caso dois ARNm de 1,4 kb e 4,0 kb estão presentes no cérebro de rato (Leibrock et al.. 1989, Nature 341:149-152; Maisonpierre et al. . 1990, Science 247:1446-1451; Ernfors et al.. 1990a, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87.:5454-5458). A hibridação com uma sonda de NGF de Xenopus revelou ARNm de NGF no coração de Xenopus, provavelmente como resultado da expressão de ARNm de NGF em tecidos alvo para inervação neuronal. o nível de ARNm de NGF no coração era, no entanto, mais do que 100 vezes inferior ao nível de ARNm de NT-4 no ovário. Uma vez que o elevado nível de ARNm de NT-4 no ovário não se correlaciona com a inervação neuronal, parece improvável -56- 73 993 6526-079-118 que a proteína NT-4 tenha apenas uma função neurotrófica neste caso. Em vez disso, a expressão abundante de ARNm de NT-4 no ovário de Xenopus implica uma função não neurotrófica adicional e importante para a proteína NT-4. Foi também detectado ARNm de NGF no ovário de Xenoous embora com níveis cerca de 100 vezes inferiores aos do ARNm de NT-4; Não foram detectados ARNm de BDNF e NT-3 neste tecido.

Foram descritos ARNm para dois factores de crescimento como ARNm maternais em oócitos de Xenopus. Um destes ARNm codifica uma proteína com forte similaridade' cóm o factór de crescimento de fibroblastos básico (Kimelman e Kirschner, 1987, Cell 51.; 869-877); o outro ARNm codifica uma proteína homóloga do factor de crescimento transformante α (Weeks e Melton, 1987, Cell 51.:861-867). Foi sugerido que estes factores funcionassem como morfogénios para a formação do mesoderma e subsequente indução deste tecido no tubo neural. No rato, estudos de hibridação in situ revelaram ARNm de NT-3 no epitélio de folículos secundários e terciários, e foi sugerido um papel para o NT-3 na oogénese (Ernfors et al. . 1990, Neuron 5.:511-526).

7. EXEMPLO: IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS QUE EXPRESSAM ARNm DE NT-4 NO OVÁRIO DE XENOPUS LAEVIS POR HIBRIDAÇÃO IN SITU

7. 1. MATERIAIS E MÉTODOS 7.1.1.ISOLAMENTO. MANIPULAÇÃO E CULTURA DE OÓCITOS. EMBRIÕES E CÉLULAS DE XENOPUS Rãs machos e fêmeas X. leavis foram mantidos no laboratório a 19 °C. Depois de anestesiados por imersão dos animais em 0,25% de metanossulfonato de tricaína (Sandoz, Suiça), os lóbulos do ovário foram removidos cirurgicamente, lavados com Hepes salino de Barth modificado (MBSH) (Gurdon e Wickens, 1983, Methods Enzymol. 101:370-86) e dissociados por incubação durante a noite a 20 °C em MBSH isento de cálcio e -57- 73 993 6526-079-118 contendo 2 mg/ml de colagenase. A separação do extracto dos oócitos pré-vitelogénicos e vitelogénicos foi obtida por sedimentação diferencial, e os oócitos foram depois separados manualmente sob um microscópio de dissecação nas várias classes de desenvolvimento descritas por Dumont (1972, supra).

Embriões de clivagem sincronómica foram obtidos por fertilização in vitro como essencialmente descrito por Newport e Kirchner (1982). Células de rim de Xenopus Ag f oram cultivadas· em - meio· de Leibowitz L15 diluído com água destilada 60:40 (v/v) e suplementado com Hepes pH 7,35 10 mM, hipoxantina 10 μΜ (Sigma), glutamina 4 mM e 10% de soro fetal bovino (Gibco) a 20 °C. As culturas foram equilibradas com ar e mantidas no escuro.

7.1.2. HIBRIDACÃO IN SITU

Ovários frescos congelados de rãs Xenopus laevis adultas foram seccionados (14 μ) num crióstato (Leitz, Alemanha) e as secções foram descongeladas em lâminas pré-tratadas com poli-L-lisina (50 Mg/ml), sendo posteriormente fixadas em formalina a 10% durante 30 min. e lavadas duas vezes em PBS. A desidratação foi efectuada numa série graduada de etanol incluindo 5 min. de incubação em clorofórmio e posterior secagem das lâminas ao ar. Dois oligonucleótidos de mero 53, um específico para ARNm de NT-4 de Xenopus (5'CCCACAAGCTTGTTGGCATCTATGGTCAGAGCCCTCACATAAGACTGTTTTGC3' [SEQ ID NO:109]) e o outro, como um controlo,específico para ARNm de BDNF de galinha (correspondendo aos aminoácidos 61 a 77 da proteína BDNF madura de galinha (Hallbook et al. . 1991 Neuron 6.:845-58 [contido na SEQ ID N0S:11 e 32]), foram marcados na extremidade 3# com a35S-dATP usando desoxiribonucleotidil transferase terminal (IBI, New Haven) com uma actividade específica de aproximadamente lxlO9 cpm/μ. A hibridação foi efectuada a 42 °C durante 16 horas em formamida a 50%, 4x SSC, lx solução de Denhardt, 1% de sarcosil, NaP04 (pH 7,0) 0,02M, 10% de sulfato dextrano, 0,5 mg/ml de ARNt de levedura, DTT 0,06M 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado e lxlO7

73 993 6526-079-118 -58- s s ,· cpm/ml de sonda oligonucleotídica marcada cóm 35S. As secções foram subsequentemente enxaguadas, lavadas 4 vezes (15 min. cada) a 55 °c em l x SSC, enxaguadas com água, desidratadas numa série graduada de etanol e secas ao ar. As secções foram expostas à película de raios-X, seguidas por revestimento com a emulsão fotográfica NTB-3 da Kodak (diluída 1:1 em água), expostas durante 5-6 semanas a -20 °C, e desenvolvidas, fixadas e contrastadas com violeta de cresilo.

7. 1. 3. ANÁLISE DAS TRANSFERÊNCIAS DE ARN

As amostras indicadas foram homogeneizadas em isotiocianato de guanidina 4M, /8-mercaptoetanol 0,1 M, citrato de sódio 0,025 M (pH 7,0) e homogeneizadas 3 vezes durante 15 segundos com um Polytrone. Cada homogeneizado foi aplicado em camadas sobre uma almofada de 4 ml de CsCl 5,7 M em citrato de sódio 0,025 M (pH 5,5) e centrifugado a 15“C num rotor Beckman SW41 a 35 000 rpm durante 16 horas (Chirgwin et al.. 1979, Biochemistry 78.:5294-5299). ARN poliadenilado (Poli(A)+ARN) foi purificado por cromatografia de oligo(dT)-celulose (Aviv e Leder, 1972, PNAS .69.: 1408-1412) e a recuperação de ARN (40 μg) foi quantificada espectofotométricamente antes de usar na análise de transferência de ARN. 0 ARN celular total (40 jtfg) ou, quando indicado, o poli(A)+ARN (5 μg) de cada amostra foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1% contendo 0,7% de formaldeído. A transiluminação-UV do gel corado foi utilizada para confirmar que todas as amostras continham quantidades semelhantes de ARN intacto. 0 gel foi então transferido para um filtro de nitrocelulose. 0 filtro foi então hibridado com um fragmento HincII de 350 bp do exão 3' do gene de NT-4 de Xenopus (Hallbook et al. . 1991, Neuron 6.:845-858). O fragmento foi marcado com a-32P-dCTP por tradução por corte com uma actividade específica de cerca de 5xl01 2 cpm//ig e a hibridação efectuou-se como descrito (Ernfors et al.. 1988, Neuron .1:983-96). Os filtros foram lavados com elevada severidade (0,lxSSC, 0,1% de SDS, 54 °C) e expostos a películas AR-5 da Kodak a -70 °C. 1

2. RESULTADOS 2

Secções de tecido oriundo de ovário de Xenopus laevis /'y -59- 73 993 6526-079-118 adulta foram hibridadas com uma sonda oligonucleotídica marcada com 35S-dATP específica para ARNm de NT-4 de Xenopus. Como controlo para a especificidade da hibridação, secções adjacentes foram hibridadas com uma sonda oligonucleotídica do mesmo comprimento e conteúdo em GC complementar ao ARNm do factor neurotrófico derivado de cérebro (BDNF) de galinha. A sonda específica para o ARNm de NT-4 revelou uma intensa marcação entre muitas células pesquisadas através do ovário com um tamanho (50-400 /m de diâmetro) correspondente aos oócitos em etapas precoces da oogénese (Fig. 9A). Nenhum ARNm de NT-4 pôde ser detectado entre oócitos maduros, oócitos nar etapa VI pós-vitelogénica (setas na Fig. 9A). A sonda de controlo específica de ARNm de BDNF de galinha não marcou quaisquer células no ovário de Xenopus. A análise de auto-radiografias de emulsão das secções hibridadas revelou uma marcação intensa entre o citoplasma de oócitos com um diâmetro de 50-200 /im (Fig. 10A e 10B) correspondente aos oócitos na etapa I de acordo com Dumont, 1972, supra. A sonda específica para o ARNm de NT-4 também marcou oócitos com diâmetro superior correspondentes às etapas II a IV, embora a intensidade da marcação entre estas células fosse inferior à verificada entre os oócitos na etapa I. De acordo com a análise de baixa amplificação de iluminações de campo escuro (Fig. 9), as auto-radiografias de emulsão não apresentaram qualquer marcação entre os oócitos maduros nas etapas V e VI. Nenhuma marcação foi verificada entre quaisquer células depois da hibridação com a sonda controlo para BDNF (Fig. 10C). Para permitir uma determinação mais detatalhada do nível de ARNm de NT-4 durante a oogénese, foi contado o número de grãos por uma unidade de área arbitráriamente escolhida. A unidade de área escolhida correspondeu aproximadamente a um centésimo da área da secção transversal de um oócito na etapa I. 0 resultado desta análise mostrou que a intensidade da marcação entre oócitos na etapa I era de 1,7 e 4,3 vezes superior à dos oócitos nas etapas II/III e IV, respectivamente (Fig. 11). 0 número de grãos por unidade de área entre os oócitos nas etapas V e VI não foi significativamente superior ao nível do ruído de

73 993 6526-079-118 fundo da marcação.

7. 2. 1 ANÁLISE POR TRANSFERÊNCIA DE NORTHERN DA EXPRESSÃO DE ARNm DE NT-4 DURANTE A OOGÉNESE E DESENVOLVIMENTO PRECOCE DE XENOPUS

Uma quantidade fixa de ARN celular total (40 μg) preparado a partir de etapas diferentes de oócitos bem como de uma fracção enriquecida de células de folículo foi analisada por transferências de Northern utilizando uma sonda específica para NT-4 de Xenopus (Hallbook et al.. 1991, supra). De acordo com os resultados da hibridação in situ. os níveis mais eleVadôS de transcritos de NT-4 com tamanhos de 2/3 kb e 6,0 kb estavam presentes nos oócitos mais pequenos (etapas I e II) (Fig. 12). O nível de ARNm de NT-4 declinou abruptamente nos oócitos das etapas mais maduras V e VI. Foi observado um fraco sinal de hibridação na preparação das células de folículo que foi provavelmente devido a contaminação com um pequeno número de oócitos nas etapas I e II. O mesmo resultado foi obtido quando iima quantidade fixa de ARN poliadenilado (5 /Ag) foi analisado a partir das diferentes amostras apresentadas na Fig. 12.

Os resultados da análise da expressão de ARNm de NT-4 no ovário mostrou que o ARNm de NT-4 está restrito aos oócitos imaturos. Para testar a possibilidade da expressão de ARNm de NT-4 ser induzida após a fertilização, o nível de ARNm de NT-4 foi determinado em embriões de Xenopus em desenvolvimento por transferência de Northern de ARN poliadenilado. Foi encontrado um nível baixo de ARNm de NT-4 em células somáticas de rim A6 de Xenopus em cultura que foram também incluídas na análise. No entanto, não pôde ser detectado ARNm de NT-4 em embriões precoces desde o início das divisões por clivagem até à etapa de nêurula.

7. 3. DISCUSSÃO A expressão abundante de ARNm de NT-4 no ovário de Xenopus (Hallbook et al. . 1991 supra) indica que este membro da família de NGF desempenha um papel na oogénese e/ou na embriogénese precoce. A localização das células que expressam ARNm de NT-4 no -61- 73 993 6526-079-118 ovário proporciona discernir sobre a função putativa da proteína NT-4 no ovário. Em anfíbios, assim como em todos os outros vertebrados, a fertilização do ovo desencadeia um período de rápida clivagem celular. Este acontecimento é controlado por uma classe de ARNm maternais solúveis expressos durante a oogénese e armazenados no ovo infertilizado para subsequente desenvolvimento (Davidson, 1986, Gene Activity in Early Development (New York, Academic Press)). Esta classe de ARNm maternais inclui dois factores de crescimento, o factor de crescimento do fibroblasto básico (Kimelman e Kirchner, 1987, Cell 51.:869-77) e o factor-/? de crescimento transformante (Weeks e Melton, 1987, Cell, 5JL:861-67), assim como vários protooncogenes tal como o c-myc (Godeau et al.. 1986, EMBO J. 5.Í3571-77); (Vriz et al. . 1989, EMBO J. £:4091-97), c-fos (Mohun et al.. 1989, Development, 107:835-46). ras (Andeol et al. . 1990, Dev. Biol. 139:24-34). ets-2 (Chen et al.. 1990, Science, 250:1416-1418) e c-mos (Sagata et al. . 1988, Nature 335:519-25). Oócitos de Xenopus na etapa VI madura são apanhados na profase da meiose I e tanto c-mos (Sagata et al. . 1988) como ets-2 (Chen et al.. 1990), mostraram funcionar durante a re-iniciação da divisão meiótica. A verificação de níveis elevados de ARNm de NT-4 em oócitos na etapa I e II mas de um nível diminuído abaixo do limite de detecção tanto das transferências de Northern como da hibridação in situ em oócitos nas etapas V e VI, sugere fortemente que o ARNm de NT-4 não pertence à classe dos ARNm maternais. Este resultado é também argumento contra o papel da proteína NT-4 na re-iniciação da divisão meiótica ou na embriogénese precoce. De acordo com isto, a adição de proteína NT-4 recombinante a oócitos imaturos na etapa VI não resultou na indução da clivagem das vesículas germinais in vitro e não foi detectado ARNm de NT-4 em embriões precoces de Xenopus. Em vez disso, a função putativa da proteína NT-4 no ovário parece estar acoplada a acontecimentos que ocorrem em oócitos pré-vitelogénicos e vitelogénicos semi-precoces. Tanto NGF (Ayer-LeLievre et al. . 1988 PNAS 85.:2628-2632), como o receptor de NGF de baixa afinidade de 75 kD (Persson et al. . 1990, Science, 247:704-707) e o componente trkA de elevada afinidade do receptor de NGF (J.P. Merlo e H. Persson, não publicado) são 73 993 6526-079-118

-62- expressos nos testes em que o NGF mostrou recentemente estimular a síntese de ADN no início da meiose (Parvinen et al.. 1991, enviado para publicação). Assim, parece que as neurotrofinas não funcionam apenas como factores neurotroficos mas desempenham também um papel importante nos tecidos reprodutivos.

8. EXEMPLO: ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FRAGMENTOS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICAM NT-4 DE MAMÍFEROS 8.1. MATERIAIS E MÉTODOS -------------- --------------

8.1.1. PREPARAÇÃO DE ADN ADN genómico foi isolado como descrito em 6.1. 1, supra. 8.1.2.REACÇÕES EM CADEIA COM POLIMERASE, CLONAGEM MOLECULAR E SEOUENCIACÃO DE ADN Misturas de oligonucleótidos de mero 34 (incluindo a cauda) representando todos os codões possíveis correspondentes às sequências de aminoácidos QYFFET (contida na SEQ ID NO:51) e QYFYET (SEQ ID NO:52) (oligonucleótido 5') e WISECK, CKAKQS E WIRIDT ( cada uma contida na SEQ ID NO:51) (oligonucleótido 3') (Fig. 13) foram sintetizadas, com ligantes, como descrito em 6.1.2. supra. Em conjunto, 2Y (derivado de xNT-4 [SEQ ID N0:50]) e 2Z (derivado de BDNF/NT-3 [SEQ ID NO:51]) representam todas as sequências conhecidas para neurotrofinas de todas as espécies nesta região. Uma primeira amplificação tanto de ADN genómico de rato como de humano foi efectuada com a Taq polimerase (Cetus) com ciclos de 1 minuto a 95°C, 2 minutos a 43"C e 2 minutos a 72eC. Uma alíquota das reacções de PCR primárias foi então reamplifiçada utilizando os mesmos iniciadores da primeira amplificação, ou novos oligonucleótidos iniciadores degenerados e complementares que vão resultar num desvio esperado de tamanho. Os produtos de PCR do procedimento de reamplificação foram purificados como se segue: as bandas com o tamanho esperado foram purificadas em gel, reamplifiçadas, e purificadas em coluna utilizando as colunas "primerase" da Stratagene. Estas foram então digeridas completamente com EcoRI e Sall. -63- 73 993 6526-079-118 analisadas e repurifiçadas utilizando colunas Primerase (Stratagene) e ligadas em Bluescript KS(-) digerido com EcoRI-Xhol. Os transformantes foram seleccionados para um pBS-KS contendo uma inserção de tamanho aproximado ao previsto. Os fragmentos clonados foram sujeitos a uma análise da sequência de ADN como descrito em 6.1.2, supra. 8.1.3 ISOLAMENTO CLONES GENÓMICOS DE COMPRIMENTO TOTAL E DE CLONES DE ADNc QUE CODIFICAM rNT-4 E hNT-4

Uma biblioteca de ADNc de ovário humano' em Λ GT-10 foi obtida da Clontech. Uma biblioteca de ADNc de hipocampo humano em A :ZAPII foi obtida da Stratagene. Uma biblioteca de ADN genómico humano em EMBL3/SP6/T7 foi obtida de Clontech. Uma biblioteca de ADNc de cérebro de rato em A -ZAP foi obtida da Stratagene. O isolamento de clones de NT-4 pode ser efectuado como se segue:

Uma inserção clonada codificando o fragmento rNT-4 (Fig. 14 [SEQ ID NO:61]) ou o fragmento hNT-4 (Fig.15 [SEQ ID NO:63]) são marcadas por PCR para uma actividade específica de aproximadamente 5xl08 cpm/ng. A hibridação foi efectuada numa solução de hibridação consistindo em 0,5 mg/ml de ADN de esperma de salmão a 60 °C. Os filtros foram lavados a 60 °C em 2xSSC, 0,1% SDS e expostos a uma película XAR-5 da Kodak a -70 °C. Alternativamente, oligonucleótidos cuja sequência corresponde exactamente à da neurotrofina de mamífero desejada, podem ser utilizados para produzir sondas (por exemplo, marcação pela quinase) e podem ser utilizados para seleccionar as mesmas bibliotecas pelos processos convencionais. Os fagos positivos foram purificados em placa e infectaram a multiplicidade baixa, uma estirpe apropriada de E. coli em caldo liquido como descrito por Maniatis et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Os fagos GT-10 e EMBL3/SP6/T7 foram preparados como se segue: as culturas foram incubadas durante a noite a 37 "C com agitação constante. A suspensão nocturna é tornada 1 M em NaCl e 8% em -64- 73 993 6526-079-118 PEG, bem misturada e incubada durante a noite a 4 °C para precipitar o bacteriófago. 0 bacteriófago foi precipitado via centrifugação, e ressuspendido em tampão TM (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; MgCl2 10 mM), aplicado em camadas sobre um gradiente descontínuo de CsCl e centrifugado à velocidade, e durante o tempo apropriados para se ligar o bacteriófago. 0 bacteriófago é removido, transferido para um tubo Eppendorf fresco e lisado pela adição de 1 volume de formamida. O ADN de EMBL3 é precipitado pela adição de 2 volumes de etanol a 100%. O ADN de EMBL-3 é recuperado por microcentrifugação, lavado com etanol a 70% e ressuspendido em tampão TE "TTris-HCl 10'mM; pH'7,5r Na2_EDTA 1 mM) . O ADN é extractado várias vezes com fenol:clorofórmioralcóol isomílico (24:24:1), precipitado com etanol, ressuspendido em tampão TE, digerido com vários enzimas de restrição e submetido a electroforese através dum gel de agarose a 1%. Após a electroforese, o ADN digerido é transferido para nitrocelulose e hibridado com sondas de rNT-4 ou hNT-4 marcado com 32P, em condições supra descritas. A banda hibridada é subclonada no vector plasmídico pBS-KS e submetida a análise da sequência do ADN pelo processo de terminação de cadeia por didesoxi (Sanger et al.. 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467).

As preparações de plasmídeo X-ZAP foram efectuadas como se segue: são combinados 200 X de células XLl-Blue com ODgQQ=l,0, 200 λ de caldo de fagos de título elevado, e 1 \ do fago auxiliar R408 (1x10 minutos pfu/ml). Para controlo negativo não se adicionou caldo de fagos. Incuba-se a 37 °c durante 15 minutos. Adiciona-se 5 ml de meio 2xYT, agita-se durante 3 horas a 37 °C. Ao fim de 3 horas, o controlo negativo deve estar turvo e as amostras límpidas. As amostras são aquecidas a 65 °C durante 30 minutos, e centrifugadas a 4 000 g durante 5 minutos. 0 sobrenadante contém um caldo de fagemídeos. Para resgatar os fagemídeos, adiciona-se 0,5 λ do caldo a 200 λ de células XLl-Blue (0D60q=1). Incuba-se durante 15 minutos a 37 °C. Plaqueia-se 1-100 λ (preferencialmente 10 λ ) em placas de LB com ampicilina. Incuba-se a 37 °C durante a noite e picam-se as colónias grandes. Depois de purificar o ADN plasmídico, -65- ' ..... ·~ 73 993 6526-079-118 sequencia-se como acima.

As bibliotecas de ADNc de fagos são seleccionadas de acordo com processos padrão (Maniatis et al.. supra) como supra descrito.

As placas positivas são purificadas, re-isoladas e submetidas a análise da sequência de ADN como supra descrito.

8.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Uma região da sequência codificante de NT-4 'dê "Xenopus foi usado como modelo para a síntese de iniciadores de oligonucleótidos degenerados. A figura 13 denota que o iniciador de oligonucleótido-5' 2Y [SEQ ID NO:53] (QYFFET) e os iniciadores de oligonucleótidos-3,' 3Y [SEQ ID NO:55] (WISECK), 32 [SEQ ID NO:56] (CKAKQS) e 4Z [SEQ ID N0:58] (WIRIDT) eram derivados da sequência de aminoácidos de xNT-4. O iniciador de oligonucleótido-5' 2Z [SEQ ID NO:54] (QYFYET) é derivado da região homóloga de rBDNF. Todas as possíveis combinações destes oligonucleótidos degenerados foram utilizadas para amplificar ADN tanto de bibliotecas de ADN genómico de rato como de humano. Uma vez que os iniciadores representados por 3Y [SEQ ID NO:55] e 32 [SEQ ID NO:56] de xNT-4 não são conservadas na família de genes NGF/BDNF/NT-3, e portanto não fosse provável que amplificassem NGF, BDNF ou NT-3, estes dois iniciadores foram utilizados na reamplificação ou no PCR secundário.

Os fragmentos de ADN com os tamanhos aproximados esperados foram obtidos por amplificação por PCR e reamplificação tanto de bibliotecas genómicas de rato como de humano, quando foram usadas as seguintes combinações de iniciadores: (1) 2Y/3Z (PCR primário): 2Y, 2Z/3Y (PCR secundário) (2) 2Y/3Z (PCR primário): 2Y, 2Z/32 (PCR secundário) (3) 2Y/4Z (PCR primário): 2Y, 2Z/32 (PCR secundário) (4) 2Z/4Z (PCR primário): 2Y, 2Z/3Z (PCR secundário)

Os produtos secundários de PCR com o tamanho aproximado -66- 73 993 6526-079-118 esperado foram submetidos a electroforese através de um gel de agarose a 2%, eluídos por técnicas padrão, digeridos com EcoRI e Sall e ligados ao ADN de pBS-KS digerido com EcoRI-Xhol. Os transformantes positivos foram seleccionados, e os fragmentos inseridos foram sujeitos a sequenciação de ADN pelo processo de terminação de cadeia didesoxi (Sanger et al.. supra).

Foi deduzida uma estrutura de leitura aberta para uma porção de NT-4 de rato (Fig. 14 [SEQ ID NO:62]) e a sequência de aminoácidos que codifica NT-4 humano (Fig. 15 [SEQ ID NO:64]). A Figura 16 ilustra a região homóloga dòs fragmentos rNT-4-(SEQ ID NO:62) e hNT-4 (SEQ ID NO:64) com membros representativos da família de genes NGF/BDNF/NT-3.

Uma estrutura de leitura aberta codificando uma porção de NT-4 humano maior do que a apresentada na Figura 15 está mostrada na Figura 17A (SEQ ID NO:69 e SEQ ID N0:70). A figura 17A apresenta informação adicional da sequência 3' para a região de codificação do NT-4 humano 3'. O fragmento de ácido nucleico de 192 bp foi isolado como supra descrito na Descrição das Figuras. 0 tamanho actual dos produtos de PCR recuperados do procedimento de reamplificação era maior do que o previsto devido a 7 aminoácidos adicionais no fragmento de ADN de NT-4 de rato (GPGVGGG) [SEQ ID NO:101] e de NT-4 humano (GPGAGGG) [SEQ ID NO:102].

As inserções de 7 aminoácidos de rNT-4 e hNT-4 estão descritas como 'GPGXGGG' [SEQ ID NO: 100], em que X=V para rNT-4 e X=A para hNT-4. A valina e a alanina possuem um grupo R não polar. Não é presentemente conhecido se a posição 4 é conservada para conter um grupo não polar em outras proteínas NT-4 de mamífero, ou se a inserção de 7 bp será por si só característica de outros genes de NT-4 de mamífero. É interessante notar que o NGF de peixe possui uma inserção de 22 aminoácidos na mesma região como revelado no presente invento. 73 993 ..... 6526-079-118 -¾ -67- 9. EXEMPLO: ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE UM CLONE GENÓMICO DE NT-4 HUMANO Pesquisámos uma biblioteca genómica de placenta humana em EMBL3/SP6/T7 (Clontech, K802 como hospedeiro). Um total de 1#25 x 106 pfu foram plaqueados em placas NZY grandes. Foram feitos duplicados de filtros de nitrocelulose da Schleicher and Schuell, e foram hibridadas com uma sonda de 120 bp ( a partir do clone 17B de hNT-4f que foi obtido a partir de ADN genómico de humano utilizando os iniciadores 2Z4Z seguidos de 2Z3Z), marcados por PCR utilizando iniciadores de oligonucleótidos 2Z/3Z. Os filtros foram hibridadós a 60 ec cõm a sonda marcada radioactivamente (106 cpm/ml) nas seguintes condições de hibridação: NaP04 0,5 M, BSA 1%, SDS 7%, EDTA 1 mM, e 100 Mg/ml de ADN de esperma de salmão. Os filtros foram então lavados a 60 °C com2xSSC e 071% SDS, e submetidos a auto-radiografia. Após quatro dias de exposição, os sinais positivos foram identificados nos filtros em duplicado. Um total de 7 poços foram repicados, postos em 1 ml de tampão SM, agitadas durante 2 horas, e re-plaqueadas da forma que se segue: 1) 100 μΐ de uma diluição 10“3 (1 μΐ em 1 ml), misturados com 100 μΐ de células e plaqueados, quase sempre obtendo uma placa confluente; 2) 200 μΐ de uma diluição 10“5, que resulta em placas ("plaque") isoladas. Foram feitos levantamentos duplicados e pesquisaram-se como acima descrito com a sonda de 120 kb de hNT-4. Após 2 dias de exposição, muitos positivos foram identificados na placa confluente para os poços HG2, 4 e 7. Foi identificado um positivo bem isolado tanto nas placas HG4-2 como nas HG7-2. Foi repicada uma única placa para HG4-2 e HG7-2, colocada em 500 μΐ de tampão SM, e agitada durante 2 horas, após as quais foi misturado 100 μΐ de eluente com 100 μΐ de células e foi plaqueado. A placa foi então inundada com 3 ml de tampão SM, e o sobrenadante foi recolhido como o primeiro caldo de elevado título. As três placas foram então plaqueadas utilizando 100 μΐ deste primeiro caldo misturado com 100 μΐ de células. As placas foram então inundadas com 3 ml de tampão SM e agitadas num aparelho rotativo durante 3 horas à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido, centrifugado para remoção dos resíduos celulares, seguiu-se a adição de clorofórmio e 73 993 6526-079-118 /

-68- utilizou-se o resultante como segundo caldo de elevado título. Dois μΐ de caldo de elevado título de HG4-2 e HG7-2 foram aplicados num filtro de nitrocelulose da Schleicher and Schuell, e verificou-se que hibridava com a sonda de rNT-4 de 180 bp [isolado a partir do plasmídeo contendo uma inserção obtida por PCR de ADN genómico de rato utilizando iniciadores concebidos com base na sequência do nosso clone de NT-4 de rato que codifica os aminoácidos GELSVCD (SEQ ID NO:112) (iniciador degenerado) e KAESAG (SEQ ID NO:113) (iniciador exacto)]. Foram preparados lisados de placas e lisados líquidos para HG4-2# HG7-2 e HG2-1. Foi preparado ADN fágicò,uma álíquòta de cada um foi submetida a electroforese em gel de agarose e submetida à análise de Southern. Verificou-se que HG4-2, HG7-2 e HG2-1 hibridavam com a sonda de rNT-4 de 180 bp (hibridação NaP04 como acima, 65 eC), e com uma sonda de oligonucleótido de mero 45 (GGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAG) [SEQ ID NO:114] correspondente aos aminoácidos GGGCRGVDKRHWVSE [SEQ ID NO:115] codificados pelo fragmento de PCR humano do clone 17B (6xSSC, hibridação a 45 °C). O tamanho da inserção para estes três clones genómicos é aproximadamente de 9-23 kb. Ambos contêm o exão que codifica o(s) gene(s) que está proximamente relacionado com as sondas utilizadas para a selecção, hNT-4 (120 bp) e rNT-4 (180 bp). O ADN de fago para os clones genómicos foi digerido com vários enzimas de restrição e submetido a análise de Southern. O fragmento apropriado que hibrida com a sonda rNT-4 (180 bp) pode ser subclonada no vector Bluescript. o tamanho dos fragmentos de ADN a ser subclonados é o seguinte: clone 2-1 (fragmento Xhol de 1,0 kb), clone 4-2 (fragmento Xhol de 4,0 kb) e clone 7-2 (fragmento BamHI de 5,0 kb). A sequência de codificação completa pode ser obtida e esta informação pode ser usada para identificar os limites do exão para permitir a subclonagem deste gene num vector de expressão apropriado.

Para este fim, a análise da sequência nucleotídica foi efectuada no clone fágico do genoma humano 7-2, que foi obtido por pesquisa de uma biblioteca genómica humana com um fragmento de PCR derivado de ADN genómico humano utilizando oligonucleótidos degenerados para a sequência de ADN de NT-4 de

Xenopus (ver discussão, supra). A análise da sequência revelou que o clone fágico humano 7-2 contém uma sequência idêntica à sequência do fragmento de PCR utilizado como sonda para pesquisa da biblioteca genómica. Esta sequência está contida naquilo que parece ser um exão que codifica um novo factor neurotrófico (Figura 18, SEQ ID NO:75 e SEQ ID NO:76). 0 alinhamento da proteína codificada por este exão (figura 19, SEQ ID NO:77) com as neurotrofinas conhecidas revelou que partilha características encontradas em todas as neurotrofinas conhecidas (Figura 19, SEQ ID Nos: 78-92). Contém umaregião prepro em que são conservados muitos dos aminoácidos idênticos conservados entre as regiões prepro de neurotrofinas previamente definidas. Além disso, esta região prepro é precedida por um local de aceitação de união localizado na mesma região como em outros genes de neurotrofina. A região prepro contém também um local de glicosilação de consenso na posição apropriada, e termina num local de clivagem que era muito semelhante aos locais de clivagem encontrados nas outras neurotrofinas (Figura 18). A região prepro de 7-2 é, no entanto, invulgar, devido ao seu curto comprimento quando comparada com a região prepro de neurotrofinas conhecidas. 0 decréscimo no comprimento ocorre na porção N-terminal da região prepro, que é a menos conservada das porções de prepros entre os membros da família. A região madura retém todas as 6 cisteínas encontradas em todas as neurotrofinas préviamente identificadas. Muitos dos resíduos partilhados entre os diferentes membros da família das neurotrofinas são também conservados. Excluindo a extensa similaridade de sequência partilhada por um fragmento de PCR derivado de ADN genómico de rato, que pode corresponder à proteína de rato equivalente à codificada pelo clone humano 7-2, alinhamentos por computador revelaram que a neurotrof ina codificada pelo clone fágico 7-2 era muito similar à NT-4 de Xenopus. Isto verificava-se tanto para as regiões prepro como para as regiões maduras. A proteína codificada pelo clone 7-2 é invulgar, quando comparada com as neurotrofinas conhecidas, devido à presença de uma inserção situada entre a segunda e a terceira cisteína na região madura. -70- 73 993 6526-079-118 A análise da sequência foi também efectuada em dois clones humanos adicionais isolados no mesmo procedimento de pesquisa que deu o clone 7-2 (ver discussão, supra). A sequência destes clones era similar, mas não idêntica, à obtida a partir do clone 7-2, aumentando a possibilidade de que estes codifiquem novas neurotrofinas mais proximamente relacionadas com 7-2 do que com as outras neurotrofinas. A sequência parcial de um destes clones, o clone 2-1, é apresentado na Figura 20 (SEQ ID NO:93 e SEQ ID NO:94). A sequência descrita começa na posição correspondente ao aminoácido 50 nos alinhamentos apresentados na Figura 19. A sequência parcial do éíutro clone, o clone-4-2,-é apresentada na Figura 21 (SEQ ID NO:116 e SEQ ID NO:117).

10. EXEMPLO:EXPRESSÃO ESPECÍFICA EM TECIDOS DE NT-4 HUMANA

Um fragmento Xhol-Notl de 680 bp, contendo a região de codificação completa de clone NT-4 genómico humano, HG7-2, foi marcado radioactivamente e utilizado em análise de Northern de vários PoliA+ARN específicos de tecidos humanos. Os ARNm específicos de tecidos humanos foram fraccionados por electroforese através de um gel de 1% de agarose-formaldeído seguida por transferência por capilaridade para uma membrana de nylon com íoxssc. os ARN foram reticulados nas membranas por exposição à luz ultravioleta e hibridados a 65 °C com a sonda de NT-4 Xhol-Notl de 680 bp marcada radioactivamente na presença de NaP04 0,5 M (pH 7), 1% de albumina de soro de bovino (Fraction V, Sigma), 7% de SDS, EDTA 1 mM e 100 ng/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e tratado com ultra-sons. 0 filtro foi lavado a 65 °C com 2XSSC, 0,1% de SDS e submetido a auto-radiografia durante a noite com uma câmara de intensificação e uma película de raios-X a -70 °c. A coloração do gel com brometo de etídeo demonstrou que estavam a ser pesquisados níveis equivalentes de ARN total para as diferentes amostras. A sonda de NT-4 humana hibridou fortemente com o ARNm de músculo esquelético, próstata, timo, testículos e placenta (Figura 22). A sonda de NT-4 hibridou com um transcrito de ARNm maior no músculo esquelético do que na próstata. Estes dados 73 993 6526-079-118 f -71- .,, sugerem que pode estar presente uma família multigene pequena de NT-4 humana, possuindo diferentes níveis de expressão bem como dimensões dos transcritos. A elevada expressão de NT-4 humana no tecido muscular esquelético sugere que o presente invento pode ser utilizado para tratar desordens do sistema nervoso, especificamente o vasto conjunto de desordens neurológicas que afectam os neurónios motores (ver discussão, supra). Adicionalmente, a expressão elevada de NT-4 humana no tecido da próstata sugere que o presente invento pode ser utilizado pará tratar doenças da próstata, preferencialmente BPH e impotência (ver discussão, supra). Finalmente, a expressão de NT-4 humana em tecido do timo sugere que o presente invento pode ser utilizado para tratar desordens imunológicas relacionadas, do nervo e do tecido muscular, incluindo mas não se limitando a miastenia grave (ver discussão, suora).

11. CONSTRUÇÃO DE NT-4 HUMANA EM VECTORES DE EXPRESSÃO EUCARIÓTICOS E MEDIÇÃO DA ACTIVIDADE BIOLÓGICA DA NT-4 HUMANA

11.1 MATERIAIS E MÉTODOS

11. 1. 1. CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO EUCARIÓTICOS QUE CODIFICAM A NT-4 HUMANA

Foram construídos em pCMX (Na de Acesso NRRL B-18790) dois vectores de expressão eucarióticos contendo a região que codifica o precursor prepro do clone genómico humano HG7-2. A primeira construção utilizou o local normal de início de tradução de pCMX (pCMX-HG7-2Q), enquanto o outro utilizou o local de início de tradução consenso de Kozak (pCMX-HG7-2M). Um fragmento genómico de 5 kb de HG7-2, contendo a região de codificação completa clonada no local Bam Hl de Bluescript, foi amplificado por PCR utilizando os seguintes oligonucleótidos: hNT4-5'XhoM:CGGTACCCTCGAGCCACCATGCTCCCTCTCCCCTCA [SEQ ID NO:118] 73 993 / 6526-079-118 ç; -72- cr "·;Γ..... hNT4-3'Not:CGGTACAAGCGGCCGCTTCTTGGGCATGGGTCTCAG [SEQ ID NO:119] HNT4-5'XhoQ:CGGTACCCTCGAGCCACCCAGGTGCTCCGAGAGATG [SEQ ID NO:120]

As combinações de iniciadores de oligonucleótidos de hNT4-5/XhoM e hNT4-3'Not foram utilizados para construir pCMX-HG7-2Q, enquanto os oligo hNT4-5/XhoQ e hNT4-3/Not foram utilizados para construir o pCMX-HG7-2Q. 0 fragmento de PCR foi digerido com Xhol/Notl e subclonado em pCMX digerido com Xhol/Notl. ......................~ .............. ..........................................- -11. 1. 2. CONSTRUÇÃO DE GENES QUIMÉRICOS FUNDINDO UMA

REGIÃO PREPRO DE NEUROTROFINA COM A REGIÃO DE CODIFICAÇÃO MADURA DO NT-4 HUMANO

Foram construídos dois vectores de expressão eucarióticos que codificam a porção madura de NT-4 humana. Em primeiro lugar, a região prepro de NT-4 humana foi substituída pela região prepro de NT-4 de Xenopus (pCMX-xNT4/hNT4). Em segundo lugar, a região prepro de NT-4 humana foi substituída pela região prepro de NT-3 humana (pCMX-hNT3/hNT4). Os seguintes oligonucleótidos foram utilizados na construção do pCMX-xNT4/hNT4 e do pCMX-hNT3/hNT4: (1) 5‘CDM8: GAGACCGGAAGCTTCTAGAGATC [SEQ ID NO:121] (2) Fusão hNT3/HNT4 (oligonucleótido "US"): TGCAGTTTCGCTCACCCCCCGTTTCCGCCGTGATGT [SEQ ID NO:122] (3) Fusão hNT3/HNT4 (oligonucleótido "DS") ACATCACGGCGGAAACGGGGGGTGAGCGAAACTGCA [SEQ ID NO:123] (4) Fusão xNT4/hNT3 (oligonucleótido "DS"): ACTTCCCGGCTAAAACGGGGGGTGAGCGAAACTGCA [SEQ ID NO:124] (5) Fusão xNT4/hNT4 (oligonucleótido "US"): TGCAGTTTCGCTCACCCCCCGTTTTAGCCGGGAAGT [SEQ ID NO:109] 0 vector plasmídico contendo hNT-3 (pC8-hNT3) foi amplificado por PCR com os oligonucleótidos de fusão 5'CDM8 e hNT3/hNT4 como iniciadores. O plasmídeo contendo hNT-4 (pCMX-HG7-2Q) foi amplificado por PCR com o oligonucleótido de -73- 73 993 6526-079-118 fusão de hNT3/hNT4 "DSH e com o oligonucleótido hNT4-3 'Notl. O fragmento de PCR obtido foi excisado do gel, e reamplifiçado por PCR com os oligonucleótidos 5'CDM8 e hNT4-3,Notl. O produto foi então digerido com HindIII ePstl e subclonado em pCMX-HG7-2Q digerido com HindIII/PstI. Desta maneira, o plasmídeo de expressão pCMX-hNT3/hNT4 continha a região prepro de hNT3 fundida com a região que codifica NT-4 madura. Do mesmo modo, o plasmídeo de expressão de NT-4 humana (pCMX-HG7-2Q) foi amplificado por PCR com os oligonucleótidos "US" de fusão xNT4/hNT4 e 5'CDM8 como iniciadores, enquanto o pCMX-HG7-2Q foi amplificado com os oligonucleótidos "DS" de“ fusão xNT4/hNT4 e hNT4-3/Notl. O fragmento de PCR foi excisado gel, reamplifiçado com os oligonucleótidos 5'CDM8 e o hNT4-3'Not. O produto foi então digerido com HindIII e Pstl e subclonado em pCMX-HG7-2Q digerido com HindIII/PstI Assim, o plasmídeo de expressão eucariótico resultante, pCMX-xNT4/hNT4 contém a região prepro de NT-4 de Xenopus fundida com a região de codificação de NT-4 humana madura.

11. 1. 3. EXPRESSÃO DE NT-4 HUMANA RECOMBINANTE

EM CÉLULAS COS

Foram desenvolvidas células COS M5 até uma densidade de l,5xl05 células/poço numa placa de 6 poços Costar em meios DMEM suplementados com 10% de FBS, glutamina e piruvato de Na (todos da Irvine Scientific excepto o FBS).

No dia seguinte as células foram aspiradas e alimentadas com 2 ml/poço de meios RPMI contendo 400 jug/ml de DEAE-Dextran (Pharmacia), cloroquina 400 μΜ (Sigma), glutamina 4 mM (Irvine), 1 x ITS (insulina, transferrina, selénio, Sigma). A cada poço foi adicionado 2 μg do ADN apropriado e misturou-se por rotação. Foram utilizadas três construções em separado: pCMX-xNT4, contendo o precursor prepro de NT-4 de Xenopus: e duas construções de NT-4 humana, pCMX-HG7-2M e pCMX-HG7-2Q. Após a adição do ADN as placas foram recolocadas a 37 °C numa incubadora com 5% de C02 durante 3 horas e 15 minutos. A mistura meio/ADN foi então aspirada e foram adicionados 2 ml/poço de -74- 73 993 6526-079-118 DMSO a 10% em PBS isento de Ca2+, Mg2+ durante 2 minutos. 0 DMSO/PBS foi aspirado, os poços foram lavados mais uma vez com 10% de FBS/DMEM e realimentados com 10% de FBS/DMEM. Na manhã seguinte, as placas a ser bioensaiadas foram lavadas uma vez com Meio Definido (DM) e realimentadas com 2 ml/poço de DM. Três dias após a transfecção, os sobrenadantes foram removidos das células e os resíduos celulares foram precipitados por microcentrifugação. Os sobrenadantes foram transferidos para tubos novos e ensaiados quanto à bioactividade.

11.1.4. PREPARAÇÃO DE CULTORAS ENRIQUECIDAS EM NEURÓNIOS MOTORES

Foram utilizados em todas as experiências embriões (E14) de ratos Sprague-Dawley (HSD OU Zivic-Miller). Foram sacrificadas ratas grávidas por asfixia por dióxido de carbono, e os embriões foram rapidamente removidos e colocados num meio gelado para dissecação posterior. As espinais medulas foram removidas assépticamente dos embriões de rato com 14 dias de gestação. A região caudal da espinal medula foi separada da região do bolbo (ao nível do primeiro gânglio da raiz dorsal), liberta dos gânglios sensoriais e das meninges aderentes. A medula foi então subdividida em segmentos ventrais e médiodorsais para culturas separadas. Os tecidos da espinal medula ventral foram segmentados em pequenos pedaços e incubados em 0,1% de tripsina (GIBCO) e 0,01% de desoxiribonuclease tipo I (Sigma) em PBS a 37 °C durante 20 minutos. A solução de tripsina foi então removida, lavada e substituída com meio consistindo em 45% de meio essencial mínimo de Eagle (MEM), 45% de mistura nutriente F12 de Ham(F12), 5% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (GIBCO), 5% de soro de cavalo inactivado pelo calor (GIBCO), glutamina (2 mM), penicilina G (0,5 U/ml), e estreptomicina (0,5 /ig/ml). 0 tecido foi então mecanicamente dissociado por trituração suave através de uma pipeta de Pasteur, e os sobrenadantes foram combinados e filtrados através de uma fibra de nylon (Nitex, Tekto; 40 μια). A suspensão de células filtrada foi então sujeita a uma modificação do procedimento de fraccionamento descrito por Schnaar e Schnaffner (1981, J. -75- 73 993 6526-079-118

Neurosci. 1.:204-217). Todos os passos foram efectuados a 4 aC. A metrizamida foi dissolvida em meio F12:MEM (1:1), e foi estabelecido um gradiente descontínuo que consistiu na preparação de camadas de metrizamida a 18% (0,5 ml), 3 ml de metrizamida a 17%, 3 ml de metrizamida a 12%, e 3 ml de metrizamida a 8%. A suspensão filtrada de células da espinal medula ventral (2,5 ml) obtida como acima descrito, foi acamada sobre o gradiente descontínuo, o tubo foi centrifugado a 2500 x g durante 15 minutos utilizando um rotor oscilante (Sorvall HB4). A centrifugação resultou em três camadas de células: fracção I (na interface 0-8%), fracção ΊΙ (na interface 8-12%), e fracção III (na interface 12-17%). As células de cada interface foram removidas num volume pequeno (cerca de 1 ml), lavadas duas vezes com meio definido isento de soro consistindo em 50% de F12 e 50% de MEM, suplementado com glutamina (2 mM), insulina (5 jug/ml), transferrina (100 jag/ml), progesterona (20 nM), putrescina (100 μΜ), e selenite de sódio (30 nM) (Bottenstein e Sato, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. 76:514-517). A contagem das células viáveis foi obtida por contagem em hemocitómetro na presença de azul de tripano. As células ventrais da espinal medula fraccionada (enriquecidas com neurónios motores) foram então plaqueadas com uma densidade de 100 000 células/cm2 em poços de 6 mm préviamente revestidos com poli-L-ornitina (Sigma: 10 μg/ml) e laminina (GIBCO: 10 μg/ml). 0 tratamento com sobrenadantes de células COS contendo NT-4 de células COS foi efectuado no dia do plaqueamento. As culturas foram mantidas em meio definido isento de soro a 37 °C numa atmosfera de 95% de ar/5% de C02 com quase 100% de humidade relativa. No dia 2 (quarenta e oito horas), as células foram colhidas para medição da colina-acetiltransferase (CAT) como descrito em Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24:407-409.

11.2 RESULTADOS

11.2.1. EXPRESSÃO EUCARIOTA DE NT-4 HUMANA RECOMBINANTE BIOLOGICAMENTE ACTIVA 0 ADN plasmídico de cada uma das construções baseadas no -76- 73 993 6526-079-118 pCMX (pCMX-HG7-2M, pCMX-hNT3/hNT4 e pCMX-xNT4/hNT4) foi preparado e individualmente transfectado para células COS. Os sobrenadantes de COS de cada linha de células transfectadas foram utilizados de modo a avaliar a actividade biológica de cada forma recombinante respectiva de NT-4. Os volumes de sobrenadantes de COS testados foram 10, 50 e 250 μΐ num volume total de 2 ml. Q1 (PCMX-HG7-2Q) , N7 (pCMX-hNT3/hNT4 de fusão), e XI (pCMX-xNT4/hNT4) possuíam actividade de promoção de neurites em explantes DRG (Figura 23). Adicionalmente, tanto Q (pCMX-HG7-2Q) como M (pCMX-HG7-2M) foram examinados quanto à sua actividade de promoção de sobrevivência em células dissociadas de DRG. Os volumes testados foram de 5-250 μΐ num volume total de 2 ml. Quando adicionados às culturas de neurónios dissociados de DRG, os sobrenandantes de COS contendo hNT-4 promoveram 30% de sobrevivência neuronal comparados com 10% de sobrevivência com sobrenadantes de células COS simuladamente transfectadas. (Figura 24). O efeito biológico da proteína humana recombinante de sobrenadantes de células COS transfectadas com pCMX-HG7-2M foi testado em culturas enriquecidas em neurónios motores preparadas como suora descrito no Exemplo da Secção 11.1.4. 0 tratamento das culturas enriquecidas em neurónios motores com pCMX-HG7-2M derivado de NT-4 humana diluído de 1:5, resultou num aumento de 2,9 vezes na actividade da colina-acetiltransferase (CAT) após 48 horas, quando comparado com controlos não tratados (C-NT) e simuladamente transfectados (MOC COS) (Figura 25). 0 aumento na actividade de CAT caiu 1,7 vezes quando foi testada uma diluição de 1:50, sugerindo que era uma resposta dependente da dose (Figura 25).

11.3 DISCUSSÃO 0 presente invento proporciona a utilização de um sistema de expressão eucariótico in vitro para a expressão de NT-4 humana recombinante. 0 presente invento descreve várias estratégias para a expressão de ima forma biologicamente activa de NT-4 humana recombinante nas células cos. Num exemplo, a sequência de ADN que codifica o precursor prepro de NT-4 foi -77- 73 993 6526-079-118 amplificada utilizando duas estratégias de amplificação por PCR, para produzir plasmídeos de expressão com base no pCMX contendo o local de inicio de tradução pCMX(pCMXHG7-2M), ou um local de tradução consenso de Kozak (pCMX-HG7-2Q). Noutro exemplo, foram construídos para expressão nas células COS, dois genes quiméricos de neurotrofina fundindo a região prepro de NT-4 de Xenopus (pCMX-xNT4/hNT4) ou da região prepro de NT-3 humana (pCMX-hNT3/hNT4), com a região de codificação da NT-4 madura (ver Secção 5, supraf para uma discussão da utilização de construções quiméricas para a expressão de NT-4 in vitro). A expressão de uma forma biologicamente activa de NT-4 humana num sistema eucariótico de expressão in vitro, aumenta substancialmente a facilidade com que a produção de NT-4 humana recombinante, péptidos ou seus derivados, podem ser escalonados tanto para aplicações terapêuticas como de diagnóstico, discutidas supra. Do ponto de vista do presente invento, qualquer perito na arte pode fácilmente construir um plasmídeo contendo uma sequência de ADN idêntica, como descrito, ou uma sequência similar codificando uma proteína ou derivado desta, semelhante a uma NT-4 homóloga, porém distinta. O perito na arte pode também usar ou escolher entre vários vectores plasmídicos de ADN conhecidos na arte, para construir um plasmídeo de expressão para utilização num sistema de expressão eucariótico. Demostrámos que a NT-4 humana recombinante, produzida como precursor prepro completo ou por via de ima construção quimérica baseada na neurotrofina, é biológicamente activa, como demonstrado pelo efeito de estimulação de sobrenadantes de COS de NT-4 recombinante na excrescência de neurites em explantes DRG e bioactividade de culturas de neurónios motores. 12. EXEMPLO: trkB Ê UM RECEPTOR PARA A NEUROTROFINA-4 Sobrenadantes de células COS foram também examinados num ensaio de sobrevivência utilizando fibroblastos 3T3. Neste sistema de ensaio, os fibroblastos 3T3, que não expressam proteínas receptoras de neurotrofina, são transfectados com vectores de expressão de mamíferos que codificam trkA ou trkB. A sobrevivência de fibroblastos 3T3, é dependente da adição de um -78- 73 993 6526-079-118 ,, ·'· ,------- factor neurotrófico e respectiva ligação a um receptor específico. Células C0S-M5 foram cultivadas e transfectadas com PCMX-HG7-2Q, pCMX-HG7-2M ou pCMX-HG7-2Q como descrito no Exemplo da Secção 11.1.3.

Um clone de ADNc de trkA completo de rato foi obtido do Dr. Eric Shooter da Universidade de Stanford. o ADNc de trkA de rato foi sub-clonado no vector de expressão de mamífero, pCMX para originar pCMX-trkA.

Um clone de ADNc de trkB de rato foi obtido por pesquisa de uma biblioteca de ADNc de cérebro de rato, no vector lambda Zap2 (Stratagene) com oligonucleótidos específicos para trkB de rato, correspondentes à maior parte das regiões de codificação 5' e 3' de trkB. O ADNc de trkB de rato foi subclonado em pCMX para produzir pCMX-trkB.

Fibroblastos 3T3 foram cultivados e transfectados como descrito em Glass et al.. 1991, Cell 66:405-413.

Neste sistema de ensaio de sobrevivência, fibroblastos 3T3, que não expressam proteínas receptoras de neurotrofinas, foram transfectados com trkA, um proto-oncogene que codifica um receptor de tirosina quinase para NGP, ou com trkB, uma tirosina quinase que serve como uma proteína de ligação funcional para BDNF e NT-3. As células transfectadas estão dependentes da adição da neurotrofina correspondente para a sobrevivência, e assim podem ser utilizadas para o ensaio de actividade biológica das neurotrofinas. A adição de sobrenadantes de células COS contendo NT-4 neste bioensaio indicou que as células viáveis permanecem após 48 horas apenas em culturas de 3T3 trkB (Tabela 2). Assim, estes resultados demonstram que a proteína NT-4 possui actividade biológica neste sistema, e sugere que o trkB, mas não o trkA, serve como uma proteína de ligação funcional para o NT-4.

-79- J 73 993 6526-079-118 ,------- C'"” TABELA 2

Ensaio de Sobrenadantes de COS em Linhas celulares 3T3 crue Exoressam TrkA e TrkB. Diluições Simulados HG7- HG7- hNT3/ 2Q 2M hN·] 1:5 - - - - 1:10 - - - - 3T3 1:20 - - - - 1:50 - *» * - 1:5 - - - - 1:10 - - - - 3T3-trkA 1:20 - - - - 1:50 - - — — 1:5 — + + + 1:10 - + + + 3T3-trkB 1:20 - + + + 1:50 — + + + 13. DEPÓSITOS DE MICRORGANISMOS Os seguintes bacteriófagos recombinantes contendo uma sequência do genoma humano afim com neurotrofina-4, foram depositados em 22 de Agosto, 1991 (HG4-2 e HG7-2) e em 11 de Setembro, 1991 (HG2-1) com a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, e marcadas com o número de acesso indicado. Adicionalmente, a construção do gene quimérico, pCMX-hNT3/hNT4, foi depositada em 30 de Outubro, 1991 com a American Type Culture Collection e marcada com o número de acesso indicado.

Bacteriófaqo Número de acesso ATCC HG4-2 75069 HG7-2 75070 HG2-1 75098 pCMX-hNT3/hNT4 75133 73 993 6526-079-118 ^ -80- -: O presente invento não está limitado em âmbito pelos microorganismos depositados ou pelas concretizações específicas aqui descritas. De facto, várias modificações do invento em adição às aqui descritas, tornar-se-ão aparentes aos peritos na arte a partir da descrição anterior e figuras acompanhantes. Pretende-se que tais modificações caiam no âmbito das reivindicações em apêndice. Várias publicações foram aqui citadas as quais são aqui incorporadas como referência na sua totalidade.

73 993 6526-079-118 -81- igff'£ (1) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 1: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 1: 60 120 130

CAAATGTAAT CCCGCTGGTG GAACTGTGGG TGGCTGCCGG GGTGTTGATC GACGCCATTG GATCTCTGAG TGCAAGGCTA AACAGTCTTA CGTGAGGGCT CTGACTATGG ATTCTGACAA GATTGTTGGC (1) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 2: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 2: 60 120

CAAGTGCAAT CCATCAGGCA GCACCACTAG AGGATGCCGA GGTGTAGACA AAAAGCAATG GATATCTGAG TGCAAAGCAA AACAGTCTTA TGTGAGGGCT CTGACCATAG ATGCCAACAA GCTTGTGG'GT (1) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 3: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 127 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla 130 -82- 73 993 --···*» 6526-079-118 (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 3: CAAGTGCCGG GACCCAAATC CCGTTGACAG CGGGTGCCGG GGCATTGACT CAAAGCACTG 60 GAACTCATAT TGTACCACGA CTCACACCTT TGTCAAGGCG CTGACCATGG ATGGCAAGCA 120 GGCTGCC 127 (1) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 4: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 127 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 4: CAAGTGCCGG GCCCCAAATC CTGTAGAGAG TGGATGCCGG GGCATTGACT CCAAGCACTG 60 GAACTCATAC TGCACCACGA CTCACACCTT TGTCAAGGCG TTGACAACAG ACGACAAACA 120 GGCTGCC ,,n (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 5: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 127 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) 60 -83- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 5: 120 127

CAAGTGCAGG GACCCTAGGC CGGTGTCCAG CGGGTGCCGA GGGATCGATG CGAAGCATTG GAACTCTTAC TGCACCACGA CACACACCTT CGTCAAAGCA CTGACCATGG AGGGCAAGCA AGCAGCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 6: (i) características da Sequência (A) Comprimento: 127 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 6: CAAGTGCAAA AATCCAAGTC CAGTATCAGG TGGGTGCAGG GGCATTGATG CCAAGCATTG 60 GAATTCGTAT TGCACCACAA CAGACACATT TGTCAGGGCA TTAACCATGG AAGGCAATCA 120 GGCATCT 127 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 7: (i) Características da Sequência: (A) Comprimento: 127 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 7: CAAATGCAGG GACCCAAAGC TAGTTTCAAG CGGATGCCGT GGGATTGATG CAAAGCATTG 60 GAACTCTTAT TGTACCACCA CGCACACCTT TGTCAAAGCA TTAACAATGG AAGGGAAGCA 120

AGCAGCA 127 73 993

6526-079-118 -84- ' (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 8: (i) Características da Sequência: (A) Comprimento: 127 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 8: 60 120 127

CACGTGCCGT GGCGCCCGGG CGGGCAGCTC TGGCTGCCTG GGCATCGACG GGCGACACTG GAACTCCTAC TGCACCAACT CGCACACCTT CGTGCGGGCG CTGACTTCCT TTAAGGACCT GGTGGCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 9: (i) Características da sequência: (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 9: 60 120

CAAGTGCAAT CCCATGGGTT ACACAAAAGA AGGCTGCAGG GGCATAGACA AAAGGCATTG GAACTCCCAG TGCCGAACTA CCCAGTCGTA CGTGCGGGCC CTTACCATGG ATAGCAAAAA GAGAATTGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 10: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla 130

73 993 6526-079-118 -85- (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 10; CAAGTGTAAT CCCATGGGTT ACACGAAGGA AGGCTGCAGG GGCATAGACA AAAGGCACTG 60 GAACTCGCAA TGCCGAACTA CCCAATCGTA TGTTCGGGCC CTTACTATGG ATAGCAAAAA 120 GAGAATTGGC 130 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 11: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia; não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 11: 60 120 130

CAAATGCAAC CCCAAGGGGT ACACAAAGGA AGGCTGCAGG GGCATAGACA AGAGGCACTG GAACTCACAG TGCCGAACTA CCCAGTCTTA CGTGAGAGCT CTCACCATGG ATAACAAAAA GAGAGTTGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 12: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) -86- -86- "Sjflí 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N°: 12: CAAGTGCAGC ACGAAGGGTT ATGCAAAAGA AGGCTGTAGA GGCATAGACA AGAGGTACTG 60 GAATTCCCAG TGCCGAACTA CTCAGTCTTA CGTCCGCGCT CTCACCATGG ATAACAAAAA 120 GAGGATTGGA 130 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N» 13: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 13: CAAATGCAAC CCTATGGGTT ACATGAAAGA AGGCTGCAGA GGCATAGACA AAAGGTACTG 60 GAACTCTCAG TGCCGAACTA CTCAGTCTTA CGTGCGGGCT TTCACCATGG ATAGCAGAAA 120 AAAAGTTGGT 130 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 14: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) ‘(xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 14: CAAATGTAAC CCTATGGGGT ACACAAAGGA GGGCTGCCGT GGAATAGACA AGAGGCATTA 60 TAACTCCCAA TGCAGGACAA CCCAGTCCTA CGTGCGAGCG CTCACCATGG ATAGCAAAAA 120 130

GAAGATTGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N= 15: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 15:

CAAATGTAAC CCCAAGGGTT TCACCAACGA AGGCTGCAGA GGGATAGACA AGAAACATTG GAATTCGCAG TGTAGAACCA GCCAATCCTA TGTGCGAGCT CTAACCATGG ATAGTAGGAA GAAGATTGGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N= 16: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 16:

GCGATGTAAG GAAGCCAGGC CGGTCAAAAA CGGTTGCAGG GGTATTGATG ATAAACACTG GAACTCTCAG TGCAAAACAT CCCAAACCTA CGTCCGAGCA CTGACTTCAG AGAACAATAA ACTCGTGGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 17: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla -88- 73 993 6526-079-118 (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Nfi: 17: 60 120 130

GAGGTGTAAA GAAGCCAGGC CAGTCAAAAA CGGTTGCAGG GGGATTGATG ACAAACACTG GAACTCTCAG TGCAAAACGT CGCAAACCTA CGTCCGAGCA CTGACTTCAG AAAACAACAA ACTCGTAGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 18: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 18: 60 120 130

AAGGTGTAAA GAAGCCAAAC CTGTTAAAAA TGGCTGCCGA GGCATTGACG ACAAGCACTG GAACTCCCAG TGCAAGACAT CCCAAACTTA CGTTAGAGCA TTGACTTCAG AAAACAATAA ACTTGTAGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ν' 19: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 66 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico)

73 993 6526-079-118 -89- (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 19: AAGGIGIAAA GAGGCAAGAC CTGTCAAAAA TGGCTGTCGA GGCATAGACG ACAAACACTG 60 GAATTC 66 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 20: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 128 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: não conhecida (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N°: 20: CAAGTGTCGG ACTGCCAAAC CTTTTAAGAG CGGCTGTCGC GGCATCGAXG ACAAACACXG 60 GAACTCGCAG XGTAAGACCX CICAGACGXA CGXCAGAGXC ICXGACGCAG GACCGIACCI 120 CXGXGGGC 12a (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 21: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 130 pares de bases (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 21: CCGCXGCAAG GAGXCGAAGC CGGGCAAGAA CGGGXGCCGG GGCAXCGACG ACAAACACXG 60 GAACXCGCAG TGCAAGACCA GCCAGACCXA XGXCCGAGCG CIGAGCAAGG AGAACAAXAA 120 130

AXAXGXGGGC -90- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 22: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 22:

Lys Cye Aen Pro Ala Gly Gly Thr Vai Gly Gly Cye Arg Gly Vai Asp 1 5 io 15

Arg Arg Híb Trp Ile Ser Glu Cya Lys Ala Lys Gin Ser Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Met Asp Ser Asp Lys Ile Vai Gly 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N8 23: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N8: 23:

Lye Cye Aen Pro Ser Gly Ser Thr Thr Arg Gly Cye Arg Gly Vai Aep 15 10 15

Lys Lys Gin Trp Ile Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin Ser Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Ile Asp Ala Asn Lys Leu Vai Gly 35 40 -91- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N8 24: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NH: 24:

Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Vai Asp Ser Gly Cye Arg Gly Ile Asp 15 10 15

Ser Lye His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Vai Lys 20 25 30

Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N8 25: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 25:

Lys Cys Arg Ala Pro Asn Pro Vai Glu Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp 1 5 10 15

Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Vai Lys 20 25 30

Ala Leu Thr Thr Asp Asp Lys Gin Ala Ala 35 40 73 993 6526-079-118 -92- ;. (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ne 26: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 26:

Lye Cys Arg Asp Pro Arg Pro Vai Ser Ser Gly Cye Arg Cly Ile Aep 5 10 15

Ala Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr Hie Thr Phe Vai Lys 20 25 30

Ala Leu Thr Met Glu Gly Lys Gin Ala Ala 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 27: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia; simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da sequência: SEQ ID NB: 27:

Lys Cys Lys Asn Pro Ser Pro Vai Ser Gly Gly Cys Arg Gly Ile Asp 1 5 10 15

Ala Lye His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr Asp Thr Phe Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Met Glu Gly Asn Gin Ala Ser 35 40 -93- -93-

73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 28: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NE: 28:

Lys Cye Arg Asp Pro Lys Pro Vai Ser Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp 5 10 15

Ala Lye Hie Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Vai Lyu 20 25 30

Ala Leu Thr Met Glu Gly Lye Gin Ala Ala 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ν' 29: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 29:

Thr Cys Arg Gly Ala Arg Ala Gly Ser Ser Gly Cys Leu Gly Ile Asp 15 10 15

Gly Arg His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Asn Ser Híb Thr Phe Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Ser Phe Lys Asp Leu Vai Ala 35 40 - -94- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 30: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 30:

Lye Cye Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp 1 5 10 15

Lye Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Ara 20 25 30

Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 31: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 31:

Lye Cys Aen Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cye Arg Gly Ile Asp 1 5 10 15

Lye Arg His Trp Asn Ser Cln Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Met Asp Ser Lye Lys Arg Ile Gly 35 40- -95- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 32: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 32:

Lys Cys Asn Pro Lys Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp 1 5 10 15

Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Met Asp Asn Lys Lys Arg Vai Gly 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 33: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NE: 33:

Lys Cys Ser Thr Lys Gly Tyr Ala Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp 1 5 10 15

Lys Arg Tyr Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Met Asp Asn Lys Lys Arg Ile Gly 35 40 73 993 6526-079-118 -96- Γ " i' (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 34: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 34:

Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Met Lys Glu Gly Cya Arg Gly Ile Aep 15 10 15

Lys Arg Tyr Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Phe Thr Met Asp Ser Arg Lys Lys Vai Gly 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N= 35: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 35:

Lya Cya Aan Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cya Arg Gly Ile Aap 15 10 15

Lye Arg Hie Tyr Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Met Aap Ser Lye Lys Lys Ile Gly 35 40 -97- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NE 36: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 36:

Lys Cys Asn Pro Lys Gly Phe Thr Asn Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp 15 lo 15

Lys Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Ser Gin Ser Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Met Asp Ser Arg Lys Lys Ile Gly 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NE 37: (i) Características da sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 37:

Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp 15 10 15

Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly 35 40 -98- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Nfl 38: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NE: 38:

Arg Cys Lye Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp 15 10 15

Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 39: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 39:

Arg Cys Lys Glu Ala Lys Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp 15 10 15

Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly 35 40 “99” ^ //_ 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NE 40: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 21 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 40:

Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp 15 10 15

Asp Lys Híb Trp Asn 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Nfi 41: (i) características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NE: 41:

Lys Cys Arg Thr Ala Lys Pro Phe Lys Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp 15 10 15

Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Thr Gin Asp Arg Thr Ser Vai Gly 35 40 73 993 6526-079-118 -100- -(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 42: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 43 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 42:

Arg Cys Lys Glu Ser Lys Pro Gly Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp 15 10 15

Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg 20 25 30

Ala Leu Ser Lys Glu Asn Asn Lys Tyr Vai Gly 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 43: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 1302 pares de bases (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura

(A) Nome/Código: CDS (B) Localização: ligação (529..534, 538..1248) (xi) Descrição da Sequência: SEQ. ID NE: 43 (Segue Sequência) -101-

-101- J 73 993 6526-079-118 CAATCATACT TATGAACAGC AGGGGGAGCC CTCGCCTTAC TTCCCAGCCA TGCAGAACTC 60 AAGCAGCTTT GTTTATGCCG ATCCCTAAGC AGCCCAGACC ACACTGAGCA TGTGCACAGT 120 CTTAGTCTTG CAAAGATGTT TAACAAAGTT ACAAGATGGT GACCCCCXGT AGCCAACTTT 180 GAAAGCATAA ATCATTTGTT TGATTAGGCT TGTGGTGCAG TAAGTTCATG TTTATATTTA 240 GCATACAAAA TACAGCATTT CTAGCCTTAT TCTATTTTAG ACTTTACCCT TTAATGCCCA 300 GTTCTGCCCA TTGCCTTATA GATGTTAAAG TCCCAATATC ACATTGGCAT CCTCGGCTGT 360 TTACAACAAA CATTAAAACT TGTACTTATA TTTAACATTC TGTTGTTCTT CCAATATTCC 420 ATCACACTTA GACCCTAAAA GAATTATATG TATATAATTT GCATAAATTA TATAATGGCA 4B0 GCCGTATTCT AATTCTGTTT TTTTTTTTTT TTTTTGCAGT GGTCTGAG GTG GAT 534

Vai Asp 1 TAA GTA Vai ATG Met ATC Ile 5 CTC Leu CGC Arg GCC ATC TGC GCT GCC CCC Ala Zle Cys 20 Ala Ala Pro GGC CCC GAT AAA ACA TCA Gly Pro 35 Asp Lys Thr Ser AAC TTC AGT CAT GTC CTG Asn 50 Phe Ser His Vai Leu 55 ACC TAT TCC AGC ATG GCT Thr Tyr Ser Ser Met 70 Ala GTG ACT CTT TCA AGT GAG Vai Thr Leu Ser 85 Ser Glu TCA GAG GAG ACA GTG GTA Ser Glu Glu 100 Thr Vai Vai CTA AAA CGG GCA TCA GGA Leu Lys 115 Arg Ala Ser Gly GAG CTC TCT GTG TGT GAC Glu 130 Leu Ser. Vai Cys Asp 135 ACA GCC GTG GAT GAT CGG Thr Ala Vai Asp Asp 150 Arg CAG ACT CTA ACA GGA CCA Gin Thr Leu Thr 165 Gly Pro AAT CCA TCA GGC AGC ACC Asn Pro Ser Gly 180 Ser Thr CAA TGG ATA TCT GAG TGC Gin Trp 195 Ile Ser Glu Cys CTT TAT GCC ATG GTG ATC Leu Tyr Ala 10. Met Vai Ile TTC CAG AGC CGG ACC ACA Phe Gin 25 Ser Arg Thr Thr GAA GCC TCA GAC CGG CAA Glu 40 Ala Ser Asp Arg Gin 45 CAA AAT GGG TTC TTT CCA Gin Asn Gly Phe Phe 60 Pro GGT AAG GAC TGG AAC CTA Gly Lys Asp Trp 75 Asn Leu GAG CCT TCT GGA CCT CCA Glu Pro Ser 90 Gly Pro Pro CAT CCA GAA CCA GCC AAC His Pro 105 Glu Pro Ala Asn TCT GAT TCG GTC AGC TTG ser 120 Asp Ser Vai Ser Leu 125 AGT GTC AAC GTC TGG GTT Ser Vai Asn Vai Trp Vai 140 GGT AAA ATA GTG ACT GTC Gly Lys Ile Vai 155 Thr Vai CTG AAG CAA TAC TTC TTT Leu Lys Gin 170 Tyr Phe Phe ACT AGA GGA TGC CGA GGT Thr Arg 185 Gly Cys Arg Gly AAA GCA AAA CAG TCT TAT Lys 200 Ala Lys Gin Ser Tyr 205 TCA TAC TGT TGT 582

Ser Tyr Cye Cye 15 GAT TTG GAT TAT 630

Asp Leu Asp Tyr 30 TCA GTT CCC AAC 678

Ser Vai Pro Asn GAT TTG TCA TCC 726

Asp Leu Ser Ser 65 TAC TCA CCT AGA 774

Tyr Ser Pro Arg 80 CTA CTT TTC TTG 822

Leu Leu Phe Leu 95 AAG ACT TCC CGG 870

Lys Thr Ser Arg 110 TCC CGT CGG GGA 918

Ser Arg Arg Gly ACC GAT AAA CGT 966

Thr Asp Lys Arg 145 ATG TCT GAG ATT 1014

Met Ser Glu Ile 160 GAG ACC AAG TGC 1062

Glu Thr Lye Cye 175 GTA GAC AAA AAG 1110

Vai Asp Lys Lys 190 GTG AGG GCT CTG 1158

Vai Arg Ala Leu 73 993 6526-079-118 ACC ATA GAT GCC AAC AAG CTT GTG GGT TGG CGT TGG ATC CGT ATT GAC 1206 Thr Ile Asp Ala Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp 210 215 220 225 ACA GCG TGT GTC TGT ACC TTG TTG AGT CGG ACA GGA AGG ACG 1248 Thr Ala Cys Vai Cye Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Thr 230 235 TAAAAGACGA GGGTTAGCAA AATAGAGAGA AGAGGTTGAT CCGTTGACCT GCAG 1302 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 44: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 239 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 44:

Vai Asp Vai Met Ile Leu Arg Leu Tyr Ala Met Vai Ile Ser Tyr Cys 1 5 10 15 Cys Ala Ile Cys Ala Ala Pro Phe Gin Ser Arg Thr Thr Asp Leu Asp 20 25 30 Tyr Gly Pro Asp Lys Thr Ser Glu Ala Ser Asp Arg Gin Ser Vai Pro 35 40 45 Asn Asn Phe Ser His Vai Leu Gin Asn Gly Phe Phe Pro Asp Leu Ser 50 55 60 Ser Thr Tyr Ser Ser Met Ala Gly Lys Asp Trp Asn Leu Tyr Ser Pro 65 70 75 80 Arg Vai Thr Leu Ser Ser Glu Glu Pro Ser Gly Pro Pro Leu Leu Phe 85 90 95 Leu Ser Glu Glu Thr Vai Vai His Pro Glu Pro Ala Asn Lys Thr Ser 100 105 110 Arg Leu Lys Arg Ala Ser Gly Ser Asp Ser Vai Ser Leu Ser Arg Arg 115 120 125 Gly Glu Leu Ser Vai Cys Asp Ser Vai Asn Vai Trp Vai Thr Asp Lys 130 135 140 Arg Thr Ala Vai Asp Asp Arg Gly Lys Ile vai Thr Vai Met Ser Glu 145 150 155 160 Ile Gin Thr Leu Thr Gly Pro Leu Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys 165 170 175 Cye Asn Pro Ser Gly Ser Thr Thr Arg Gly cys Arg Gly Vai Asp Lys 180 185 190 73 993

6526-079-118 -103-

Lys Gin Trp Ile Ser Glu Cye Lys Ala Lye Gin Ser Tyr Vai Arg Ala 195 200 205

Leu Thr lie Asp Ala Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile 210 215 220

Asp Thr Ala Cys Vai Cye Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Thr 225 230 235 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 45: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 123 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N8: 45:

Ala Ser Gly Ser Asp Ser Val Ser Leu Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ser 1 5 10 15 Vai Cye Asp Ser Val Asn Val Trp Val Thr Asp Lys Arg Thr Ala Val 20 25 30 Asp Asp Arg Gly Lys Ile Val Thr Val Met Ser Glu Ile Gin Thr Leu 35 40 45 Thr Gly Pro Leu Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Asn Pro Ser 50 55 60 Gly Ser Thr Thr Arg Gly Cys Arg Gly Val Asp Lys Lys Gin Trp Ile 65 70 75 80 Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ile Asp 85 90 95 Ala Asn Lys Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys 100 105 110 Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Thr 115 120 -104- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ne 46: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 118 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 46:

Ser Ser Thr His Pro Vai Phe His Met Gly Glu Phe Ser Vai Cye Asp 15 10 15

Ser Vai Ser Vai Trp Vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lve 20 25 30

Gly Lye Glu Vai Thr Vai Leu Ala Glu Vai Aen Ile Aen Aen Ser Vai 35 40 45

Phe Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lye Cys Arg Ala Ser Aen Pro Vai 50 55 60

Glu Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser LyB His Trp Asn Ser Tyr Cye 65 70 75 8o

Thr Thr Thr Híb Thr Phe Vai Lys Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lye Gin 85 90 95

Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cye Vai Cye Vai Leu 100 105 no

Ser Arg Lya Ala Thr Arg 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 47: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 119 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido -105- -105- / 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 47:

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Trp Vai Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser 20 25 30 Gly Gly Thr Vai Thr Vai Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin 35 40 45 Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 50 55 60 Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys 65 70 75 60 Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NE 48: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 119 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 48:

Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Vai Cys Asp Ser 1 5 10 15

Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp lie Arg Gly 20 25 30

Hie Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile Ly9 Thr Gly Asn Ser Pro Vai 35 40 45

Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys 50 55 60 -106- -106- 73 993 6526-079-118

Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys Hia Trp A9n Ser Gin Cys Lya 65 70 75 80

Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Aen Lys Leu 85 90 95

Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Ala Leu 100 105 110

Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 49: (i) Características âa Sequência (A) Comprimento: 1313 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura:

(A) Nome/Código: CDS (B) Localização: 552..1259 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N“: 49: CTGCAGGGAA ACAATCATAC TTATGAACAG CAGGGGGAGC CCTCGCCTTA CTTCCCAGCC 60 ATGCAGAACT CAAGCAGCTT TGTTTATGCC GATCCCTAAG CAGCCCAGAC CACACTGAGC 120 ATGTGCACAG TCTTAGTCTT GCAAAGATGT TTAACAAAGT TACAAGATGG TGACCCCCTG 180 TAGCCAACTT TGAAAGCATA AATCATTTGT TTGATTAGGC TTGTGGTGCA GTAAGTTCAT 240 GTTTATATTT AGCATACAAA ATACAGCATT TCTAGCCTTA TTCTATTTTA GACTTTACCC 300 TTTAATGCCC AGTTCTGCCC ATTGCCTTAT AGATGTTAAA GTCCCAATAT CACATTGGCA 360 TCCTCGGCTG TTTACAACAA ACATTAAAAC TTGTACTTAT ATTTAACATT CTGTTGTTCT 420 TCCAATATTC CATCACACTT AGACCCTAAA AGAATTATAT GTATATAATT TGCATAAATT 480 ATATAATGGC AGCCGTATTC TAATTCTGTT ΪΤΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTTTGCAG TGGTCTGAGG 540 TGGATTAAGT A ATG ATC CTC CGC CTT TAT GCC ATG GTG ATC TCA TAC TGT 590

Met Ile Leu Arg Leu Tyr Ala Met Vai Ile Ser Tyr Cys 15 10 TGT GCC ATC TGC GCT GCC CCC TTC CAG AGC CGG ACC ACA GAT TTG GAT Cys Ala Ile Cys Ala Ala Pro Phe Gin Ser Arg Thr Thr Asp Leu Asp 15 20 25 636

73 993 6526-079-118 / /*' -107- TAT GGC ccc GAT AAA ACA TCA GAA GCC TCA GAC CGG CAA TCA GTT CCC 686 Tyr Gly Pro Aep 30 Lys Thr 35 Ser Glu Ala Ser Asp Arg 40 Gin Ser Vai Pro 45 AAC AAC TTC AGT CAT GTC CTG CAA AAT GGG TTC TTT CCA GAT TTG TCA 734 Asn Asn Phe Ser His 50 Vai Leu Gin Asn Gly Phe 55 Phe Pro Asp Leu 60 Ser TCC ACC TAT TCC AGC ATG GCT GGT AAG GAC TGG AAC CTA TAC TCA CCT 782 Ser Thr Tyr Ser 65 Ser Met Alã Gly Lys 70 Asp Trp Asn Leu Tyr 75 Ser Pro AGA GTG ACT CTT TCA AGT GAG GAG CCT TCT GGA CCT CCA CTA CTT TTC 830 Arg Vai Thr 80 Leu Ser Ser Glu Glu 85 Pro Ser Gly Pro Pro 90 Leu Leu Phe TTG TCA GAG GAG ACA GTG GTA CAT CCA GAA CCA GCC AAC AAG ACT TCC 878 Leu Ser 95 Glu Glu Thr Vai Vai 100 His Pro Glu Pro Ala 105 Asn Lys Thr Ser CGG CTA AAA CGG GCA TCA GGA TCT GAT TCG GTC AGC TTG TCC CGT CGG 926 Arg 110 Leu Lys Arg Ala Ser 115 Gly Ser Asp Ser Vai 120 Ser Leu ser Arg Arg 125 GGA GAG CTC TCT GTG TGT GAC AGT GTC AAC GTC TGG GTT ACC GAT AAA 974 Gly Glu Leu Ser Vai 130 Cys Asp Ser Vai Asn Vai 135 Trp Vai Thr Asp 140 Lys CGT ACA GCC GTG GAT GAT CGG GGT AAA ATA GTG ACT GTC ATG TCT GAG 1022 Arg Thr Ala Vai 145 Asp Asp Arg Gly Lys 150 Ile Vai Thr Vai Met 155 Ser Glu ATT CAG ACT CTA ACA GGA CCA CTG AAG CAA TAC TTC TTT GAG ACC AAG 1070 Ile Gin Thr 160 Leu Thr Gly Pro Leu 165 Lys Gin Tyr Phe Phe 170 Glu Thr Lye TGC AAT CCA TCA GGC AGC ACC ACT AGA GGA TGC CGA GGT GTA GAC AAA 1118 Cys Asn 175 Pro Ser Gly Ser Thr 180 Thr Arg Gly Cys Arg 185 Gly Vai Asp Lys AAG CAA TGG ATA TCT GAG TGC AAA GCA AAA CAG TCT TAT GTG AGG GCT 1166 Lys 190 Gin Trp Ile Ser Glu 195 Cys Lys Ala Lys Gin 200 Ser Tyr Vai Arg Ala 205 CTG ACC ATA GAT GCC AAC AAG CTT GTG GGT TGG CGT TGG ATC CGT ATT 1214 Leu Thr Ile Asp Ala 210 Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg 215 Trp Ile Arg 220 Ile GAC AC* Asp Thr GCG Ala TGT Cys 225 GTC Vai TGT Cys ACC Thr TTG Leu TTG Leu 230 AGT CGG ACA Ser Arg Thr GGA Gly AGG Arg 235 ACG Thr 1259 TAAAAGACGA GGGTTAGCAA AATAGAGAGA AGAGGTTGAT CCGTTGACCT GCAG 1313 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 50: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 236 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear

73 993 6526-079-118 -108- (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 50:

Met Ile Leu Arg Leu Tyr Ala Met Vai Ile Ser Tyr Cys Cys Ala lie 15 10 15

Cys Ala Ala Pro Phe Gin Ser Arg Thr Thr Asp Leu Asp Tyr Gly Pro 20 25 30

Asp Lys Thr Ser Glu Ala Ser Asp Arg Gin Ser Vai Pro Asn Asn Phe 35 40 45

Ser His Vai Leu Gin Asn Gly Phe Phe Pro Asp Leu Ser Ser Thr Tyr 50 55 60

Ser Ser Met Ala Gly Lys Asp Trp Asn Leu Tyr Ser Pro Arg Vai Thr 65 30 75 80

Leu Ser Ser Glu Glu Pro Ser Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Ser Glu 85 90 95

Glu Thr Vai Vai His Pro Glu Pro Ala Asn Lys Thr Ser Arg Leu Lys 100 105 110

Arg Ala Ser Gly Ser Asp Ser Vai Ser Leu Ser Arg Arg Gly Glu Leu 115 120 125

Ser Vai Cys Asp Ser Vai Asn Vai Trp Vai Thr Asp Lys Arg Thr Ala 130 135 140

Vai Asp Asp Arg Gly Lys Ile Vai Thr Vai Met Ser Glu Ile Gin Thr 145 150 155 160

Leu Thr Gly Pro Leu Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Asn Pro 165 170 175

Ser Gly Ser Thr Thr Arg Gly Cys Arg Gly Vai Asp Lys Lys Gin Trp 180 185 190

Ile Ser Glu Cys Lye Ala Lys Gin Ser Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ile 195 200 205

Asp Ala Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ala 210 215 220

Cys Vai Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Thr 225 230 235 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Nfi 51: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 57 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido. (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida

73 993 6526-079-118 -109- (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 51:

Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lye Cys Asn Pro Ser Gly Ser Thr Thr Arg 15 10 IS

Gly Cys Arg Gly Vai Asp Lye Lye Gin Trp Ile Ser Glu Cye Lye Ala 20 25 30

Lye Gin Ser Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ile Aep Ala Aen Lye Leu Vai 35 40 45

Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr 50 55 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 52: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 6 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 52:

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 53: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 17 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) -110- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 53: CARTAYTTYT TYGARAC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 54: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 17 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NE: 54: CARTAYTTYT AYGARAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 55: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 17 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura: (A) Nome/Código; base modificada (B) Localização: 9

(C) Outra informação: /marcação = N /nota= "N =1" (ix) Estrutura: (A) Nome/Código; base modificada -111- 73 993 6526-079-118 (B) Localização: 12

(C) Outra informação: /marcação = N /nota= nN =1" (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 55:

TTRCAYTCNS WNATCCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 56: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 17 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura: (A) Nome/Código; base modificada (B) Localização: 9

(C) Outra informação: /marcação = N /nota= "N = I" (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 56: GAYTGYTTNG CYTTRCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 57: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 17 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) 73 993 6526-079-118 C-»'· -112- (ix) Estrutura: (A) Nome/Código; base modificada (B) Localização: 9

(C) Outra informação: /marcação = N /nota= "N =i" (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 57:

CTYTGYTTNG CYTTRCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 58: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 17 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura: (A) Nome/Código; base modificada (B) Localização: 6 (C) Outra informação: /marcação = n /nota= "N =1" (ix) Estrutura: (A) Nome/Código; base modificada (B) Localização: 9

(C) Outra informação: /marcação = N /nota= "N =1" (ix) Estrutura: (A) Nome/Código; base modificada (B) Localização: 12

(C) Outra informação: /marcação = N /nota= "N = I" -113- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 58 GTRTCNATNC KNATCCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N8 59: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 17 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N8: 59 CCAAGCTTCT AGAATTC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 60: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 17 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 60 GACTCGAGTC GACATCG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N8 61: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 126 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla -114- 73 993 6526-079-118 (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura:

(A) Nome/Código: CDS (B) Localização: 1..126 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 61: CAG TAT TTT TAC GAG ACG CGC TGC AAG GCC GAA AGC GCT GGG GAA GGT 48 Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg CyB Lys Ala Glu Ser Ala Gly Glu Gly 1 5 10 15 GGC CCA GGT GTG GGC GGA GGG GGC TGT CGC GGC GTG GAT CGG AGG CAC 96 Gly Pro Gly Vai Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly Vai Asp Arg Arg Hi8 20 25 30 TGG CTC TCA GAA TGT AAA GCC AAA CAA TCG 126 Trp Leu Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin Ser 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N1 62: (i) características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 62:

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Ala Glu Ser Ala Gly Glu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Gly Vai Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly Vai Asp Arg Arg His 20 25 30 Trp Leu Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin Ser 35 40 1 INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N1 63; (i) Características da Sequência -115- 73 993 6526-079-118 (A) Comprimento: 126 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura:

(A) Nome/Código; CDS (B) Localização: 1..126 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 63: CAG TAT TTT TAC GAA ACC CGC TGC AAG GCT GAT AAC GCT GAG GAA GGT Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly 1 5 10 15 GGC CCG GGG GCA GGT GGA GGG GGC TGC CGG GGA GTG GAC AGG AGG CAC Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly Vai Asp Arg Arg His 20 25 30 TGG GTA TCT GAG TGT AAA GCC AAA CAA TCG Trp Vai Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin Ser 35 40 48 96 126 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 64: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 42 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Nfi: 64:

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cya Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly 1 5 10 15

Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly Vai Asp Arg Arg Hie 20 25 30

Trp Vai Ser Glu CyB Lys Ala Lys Gin Ser 35 40 -116- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 65: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 35 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N°: 65:

Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Aan Pro Ser Gly Ser Thr Thr Arg 1 5 io 15

Gly Cye Arg Gly Vai Asp Lye Lys Gin Trp Ile Ser Glu Cye Lye Ala 20 25 30

Lys Gin Ser 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 66: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 35 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NE: 66:

Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala Pro Asn Pro Vai Glu Ser 15 10 15

Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr 20 25 30

Thr His Thr 35 -117- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ne 67: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 35 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SÉQ ID Ns: 67:

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys αβπ Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu 15 10 15

Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cye Arg Thr 20 25 30

Thr Gin Ser 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 68: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 35 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 68:

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn 15 10 15

Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr 20 25 30

Ser Gin Thr • 35 -118- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 69: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 192 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura:

(A) Nome/Código; CDS (B) Localização: 1..192 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 69: CAA TAT TTT TTC GAG ACC CGC TGC AAG GCT GAT AAC GCT GAG GAA GGT 48 Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly 1 5 10 15 GGT CCG GGG GCA GGT GGA GGG GGC TGC CGG GGA GTG GAC AGG AGG CAC 96 Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly Vai Asp Arg Arg His 20 25 30 TGG CTA TCT GAG TGC AAG GCC AAG CAG TCC TAT GTG CGG GCA TTG ACC 144 Trp Vai Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin Ser Tyr Vai Arg Ala Leu Thr 35 40 45 GCT GAT GCC CAG GGC CGT GTG GGC TGG CGA TGG ATC CGC ATC GAT ACG 192 Ala Asp F;n Ala Gin Gly Arg Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 70: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 64 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 70:

Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cye Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly 1 5 10 15

Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cya Arg Gly Vai Aap Arg Arg Hi· 20 25 30 -119- 73 993 6526-079-118

Trp Vai Ser Glu Cye Lys Ala Lys Gin Ser Tyr Vai Arg Ala Leu Thr 35 40 45

Ala Asp Ala Gin Gly Arg Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg He Αερ Thr 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 71: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 35 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura:

(A) Nome/Código: CDS (B) Localização: 18..35 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 71:

GACTCGAGTC GACATCG GAA ACC CGC TGC AAG GCT

Glu Thr Arg Cys Lys Ala 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NE 72: (i) Características da sequência (A) Comprimento: 6 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N“: 72:

Glu Thr Arg Cys Lys Ala 1 5 -120- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 73: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 35 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura:

(A) Nome/Código: CDS (B) Localização: 18..35 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N5: 73:

GACTCGAGTC GACATCG GAT AAC GCT GAG GAA GGT

Asp Asn Ala Glu Glu Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 74: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 6 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 74:

Asp Asn Ala Glu Glu Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 75: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 1404 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico -121- 73 993 6526-079-118 (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura:

(A) Nome/Código: CDS (B) Localização: 460..1104 (xi) Descrição da Sequência : SEQ ID NB: 75: CTTGTCACCC AGGTGGCACC CGAGTGGTGC ACTCTCTGCT CACTGCAACC TCGGCCTCCT 60 GGGTTCGAGT GATTCTCCTA CCTCAGCCTA CTGAGTAGCT GGGATTACAG GCGTGCAGCA 120 CTATGCCCGG TTAATTTTGG TATTTTTGGT AGAGATGAGG TTTCACAATG TTGACCAGCT 180 gctctggaac TCCTGACCTC AAGTCATCCA CCTGCCTCAG CCTCCCAGAG TGCTGGGATT 240 AGAGGTGTGG GGCACAGTGC CTGGCCTGTA GTAGTTGAAT ATTTATTATT AATCTACAAG 300 TTGCGCATTA CGCAAGCCCT AGATATAGGG TCCCCCAAAC TTCTAGAACA AGGGCTTCCC 360 CACAATCCTG GCAGGCAAGC CTCCCCTGGG GTTCCCAACT TCTTTCCCCA CTGAAGTTTT 420 TACCCCCTTC TCTAATCCCA GCCTCCCTCT TTCTGTCTC i CAG GTG CTC CGA GAG 474

Gin Vai Leu Arg Glu ATG CTC CCT CTC CCC TCA TGC TCC CTC CCC ATC 1 CTC CTC CTT TTC 5 CTC 522 Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu 10 15 20 CTC CCC AGT GTG CCA ATT GAG TCC CAA CCC CCA CCC TCA ACA TTG CCC 570 Leu Pro Ser Vai Pro lie Glu Ser Gin Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro 25 30 35 CCT TTT CTG GCC CCT GAG TGG GAC CTT CTC TCC CCC CGA GTA GTC CTG 618 Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Vai Vai Leu 40 45 50 TCT AGG GGT GCC CCT GCT GGG CCC CCT CTG CTC TTC CTG CTG GAG GCT 666 Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala 55 60 65 GGG GCC TTT CGG GAG TCA GCA GGT GCC CCG GCC AAC CGC AGC CGG CGT 714 Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg 70 75 80 85 GGG GTG AGC GAA. ACT GCA CCA GCG AGT CGT CGG GGT GAG CTG GCT GTG 762 Gly Vai Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Vai 90 95 100 TGC GAT GCA GTC AGT GGC TGG GTG ACA GAC CGC CGG ACC GCT GTG GAC 810 Cys Aep Ala Vai Ser Gly Trp Vai Thr Asp Arg Arg Thr Ala Vai Asp 105 110 115 858 -122- 858 -122- Gin Vai Leu Arg Glu Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile 1 5 10 15 Leu Leu Leu Phe Leu Leu Pro Ser Vai Pro lie Glu Ser Gin Pro Pro 20 25 30 Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser 35 40 45 Pro Arg Vai Vai Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu 50 55 60 73 993 6526-079-118 TTG CGT GGG CGC GAG GTG GAG GTG TTG GGC GAG GTG CCT GCA GCT GGC Leu Arg Gly Arg Glu Vai Glu Vai Leu Gly Glu Vai Pro Ala Ala Gly 120 125 130 GGC AGT ccc CTC CGC CAG TAC TTC TTT GAA ACC CGC TGC AAG GCT GAT Gly Ser Pro Leu Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cye Lys Ala Asp 135 140 145 AAC GCT GAG GAA GGT GGT CCG GGG GCA GGT GGA GGG GGC TGC CGG GGA Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly 150 155 160 165 GTG GAC AGG AGG CAC TGG GTA TCT GAG TGC AAG GCC AAG CAG TCC TAT Vai Asp Arg Arg Hie Trp Vai Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin Ser Tyr 170 175 180 GTG CGG GCA TTG ACC GCT GAT GCC CAG GGC CGT GTG GGC TGG CGA TGG Vai Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gin Gly Arg Vai Gly Trp Arg Trp 185 190 195 ATT CGA ATT GAC ACT GCC TGC GTC TGC ACA CTC CTC AGC CGG ACT GGC Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Vai Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly 200 205 210 CGG GCC TGAGACCCAT GCCCAGGAAA ATAACAGAGC TGGATGCTGA GAGACCTCAG Arg Ala 215

GGATGGCCCA GCTGATCTAA GGACCCCAGT TTGGGAACTC ATCAAATAAT CACAAAATCA CAATTCTCTG ATTTGGAGCT CAATCTCTGC AGGATGGGTG AAACCACATG GGGTTTTGGA GGTTGAATAG GAGTTCTCCT GGAGCAACTT GAGGGTAATA ATGATGATGA TATAATAATA ATAGCCACTA TTTACTGAGT GTTTACTGTT TCTTATCCCT AATACATAAC TCCTCAGATC AACTCTCATG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 76: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 215 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 76: 906 954 1002 1050 1098 1154 1214 1274 1334 1394 1404 -123- 73 993 6526-079-118 <g£'· -· · ft // —^-•--'íríTjfgr» '•vgt 'ãj·í;'’

Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Pro Ala 65 70 75 80 Asn Arg Ser Arg Arg Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg 85 90 95 Gly Glu Leu Ala Vai Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg 100 105 110 Arg Thr Ala Vai Asp Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu 115 120 125 Vai Pro Ala Ala Gly Gly Ser Pro Leu Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr 130 135 140 Arg Cye Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Cya Arg Gly Val Asp Arg Arg His' Trp Val Ser Glu Cys Lys 165 170 175 Ala Lye Gin Ser Tyr val Arg Ala Leu Thr Ala Asp A1& Gin Gly Arg 180 185 190 Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg lie Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu 195 200 205 Leu Ser Arg Thr Gly Arg Ala 210 215 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 77: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 214 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N8: 77:

Val Leu Arg Glu Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Leu Pro Ser Val Pro Ile Glu Ser Gin Pro Pro Pro 20 25 30 Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro 35 40 45 Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala Gly Pro Pro Leu Leu Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Pro Ala Asn 65 70 75 80 Arg Ser Arg Arg Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly 85 90 95 Glu Leu Ala Val Cye Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Aap Arg Arg 100 105 110 73 993 6526-079-118 -124-

Thr Ala Vai Asp Leu Arg Gly Arg Glu Vai Glu Vai Leu Gly Glu Vai 115 120 125 Pro Ala Ala Gly Gly Ser Pro Leu Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Arg 130 135 140 Cye Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Cys Arg Gly Vai Asp Arg Arg Kis Trp Vai Ser Glu Cys LyB Ala 165 170 175 Lys Gin Ser Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gin Gly Arg Vai 180 185 190 Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Vai Cys Thr Leu Leu 195 200 205 Ser Thr Arg Gly Arg Ala 210 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 78: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 176 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 78:

Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Met Ala Gly LyB Asp Trp Asn Leu Tyr Ser 1 5 10 15 Pro Arg Vai Thr Leu Ser Ser Glu Glu Pro Ser Gly Pro Pro Leu Leu 20 25 30 Phe Leu Ser Glu Glu Thr Vai Vai His Pro Glu Pro Ala Asn Lys Thr 35 40 45 Ser Arg Leu Lys Arg Ala Ser Gly Ser Asp Ser Vai Ser Leu Ser Arg 50 55 60 Arg Gly Glu Leu Ser Vai Cys Asp Ser Vai Asn Vai Trp Vai Thr Asp 65 70 75 80 Lys Arg Thr Ala Vai Asp Asp Arg Gly Lys Ile Vai Thr Vai Met Ser 85 90 95 Glu Ile Gin Thr Leu Thr Gly Pro Leu Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr 100 105 110 Lya Cys Asn Pro Ser Gly Ser Thr Thr Arg Gly Cys Arg Gly Vai Asp 115 120 125 Lys Lys Gin Trp Ile Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin Ser Tyr Vai Arg 130 135 140 -125- 73 993 6526-079-118

Ala Leu Thr Ile Asp Ala Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg 145 150 155 160

Ile Asp Thr Ala Cye Vai Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Thr 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 79: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 177 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ν': 79:

Glu Phe Gin Pro Met Ile Ala Thr Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gin Gin 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Asn Ser Pro Arg Vai Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu 20 25 30 Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Val Gly Asn Pro Val 35 40 45 Vai Ala Asn Arg Thr Ser Pro Arg Arg Lys Tyr Ala Glu His Lys Ser 50 55 60 His Arg Gly Glu Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr 65 70 75 80 Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Val Thr Val Leu 65 90 95 Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu 100 105 110 Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile 115 120 125 Asp Asp Lys Bis Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val 130 135 140 Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile 145 150 155 160 Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg 165 170 175

Thr

73 993 6526-079-118 -126- (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 80; (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 175 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 80:

Gin Pro Vai Ile Ala Met Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gin Gin Arg Arg 1 5 10 15 Tyr Asn Ser Pro Arg Vai Leu Leu Ser Asp Thr Thr Pro Leu Glu Pro 20 25 30 Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Vai Gly Ser Pro Val Val Ala 35 40 45 Asn Arg Thr Ser Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Glu His Lye Ser His Arg 50 55 60 Gly Glu Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys 65 70 75 80 Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Val Leu Gly Glu 85 90 95 Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg 100 105 110 Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Gly Arg Gly Ile Asp Asp 115 120 125 Lys Kis Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala 130 135 140 Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile 145 150 155 160 Asp Thr Ser Cys Vai Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr 165 170 175 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Nfi 81: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 178 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples -127- -127-

73 993 6526-079-118 (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 81:

Glu Phe Gin Pro Met Ile Ala Thr Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gin Gin 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Asn Ser Pro Arg Val Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu 20 25 30 Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Val Gly Asn Pro Val 35 40 45 vai Thr Asn Arg Thr Ser Pro Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Glu His Lys 50 55 60 Ser Hie Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Val 65 70 75 80 Thr Asp Lye Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Val Thr Val 85 90 95 Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gin Tyr Phe Tyr 100 105 110 Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly Gly Arg Gly 115 120 125 lie Asp Asp Lys Hifi Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr 130 135 140 Vai Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp Arg Trp 145 150 155 160 Ile Arg Xle Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly 165 170 175

Arg Thr (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 82: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 160 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 82: 73 993

6526-079-118 -128-

Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Vai Met Leu Ser Ser Gin Val Pro Leu Glu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Aep Ala 20 25 30 Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg 35 40 45 Gly Glu Leu Ser Vai Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala 50 55 60 Aap Lye Lys Thr Ala Vai Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu 65 70 75 80 Glu Lys Vai Pro Vai Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu 85 90 95 Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Gly Arg Gly Ile 100 105 110 Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val 115 120 125 Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile 130 135 140 Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 145 150 155 160 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 83: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 160 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência : SEQ ID N s: ; 83: Asp Leu 1 Tyr Thr Ser 5 Arg Val Met Leu Ser 10 Ser Gin Val Pro Leu Glu 15 Pro Pro Leu Leu 20 Phe Leu Leu Glu Glu 25 Tyr Lys Asn Tyr Leu 30 Asp Ala Ala Asn Met 35 Ser Met Arg Val Arg 40 Arg His Ser Asp Pro 45 Ala Arg Arg Gly Glu 50 Leu Ser Val Cys Asp 55 Ser Ile Ser Glu Trp 60 Val Thr Ala Ala Asp Lye 65 Lys Thr Ala Val 70 Aep Met Ser Gly Gly 75 Thr Val Thr Val Leu 80

Clu Lye Vai Pro Vai Ser Lys Gly Gin Leu Lye Gin Phe Phe Tyr Clu -129- 73 993 6526-079-118 85 90 95

Thr Lye Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Gly Arg Asp Ile 100 105 110 Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai 115 120 125 Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile 130 135 140 Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 145 150 155 160 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 84: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 160 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 84:

Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Vai Met Leu Ser Ser Gin Vai Pro Leu Glu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala 20 25 30 Ala Αβη Met Ser Met Arg Vai Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg 35 40 45 Gly Glu Leu Ser Vai Cye Asp Ser Ile Ser Glu Trp Vai Thr Ala Ala 50 55 60 Asp Lys Lys Thr Ala Vai Asp Met Ser Gly Gly Thr Vai Thr Vai Leu 65 70 75 80 Glu Lys Vai Pro Vai Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu 85 90 95 Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Gly Arg Asp Ile 100 105 110 Asp Lye Arg His Trp Asn Ser Gin Cye Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai 115 120 125 Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile 130 135 140 Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 145 150 155 160 -130- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 85: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 160 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N‘ !: 85: Asp Met Tyr Thr ser Arg Vai Met Leu Ser Ser Gin Vai Pro Leu Glu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala 20 25 30 Ala Asn Met Ser Met Arg Vai Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg 35 40 45 Gly Glu Leu Ser Vai Cys Asp Ser lie Ser Glu Trp Vai Thr Ala Ala 50 55 60 Asp Lys Lys Thr Ala Vai Asp Met Ser Gly Gly Thr Vai Thr Vai Leu 65 70 75 80 Glu Lys Vai Pro Vai Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu 65 90 95 Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Gly Arg Asp Ile 100 105 110 Αερ Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Vai 115 120 125 Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile 130 135 140 Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 145 150 155 160 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 86: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 180 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido. (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida 73 993 6526-079-118 -131- (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ XD NB: 86:

Ala 1 Ala Arg Vai Thr 5 Gly Gin Thr Arg Asn 10 Ile Thr Vai Asp Pro Arg 15 Leu Phe Lye Lye 20 Arg Arg Leu His Ser 25 Pro Arg Vai Leu Phe 30 Ser Thr Gin Pro Pro 35 Pro Thr Ser Ser Asp Thr 40 Leu Asp Leu Asp 45 Phe Gin Ala His Gly 50 Thr Ile Pro Phe Asn Arg Thr 55 His Arg Ser 60 Lys Arg Ser Ser Ser 65 His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu 70 Phe Ser 75 Vai Cys Asp Ser Vai 80 Ser Vai Trp Vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala 85 90 Thr Asp Ile Lys Gly Lys 95 Glu Vai Met Vai 100 Leu Gly Glu Vai Asn 105 Ile Asn Asn Ser Vai 110 Phe Lys Gin Tyr Phe 115 Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn 120 Pro 125 Vai Asp Ser Gly Gly 130 Arg Asp Ile Asp Ser Lys His 135 Trp Asn Ser 140 Tyr Cys Thr Thr Thr 145 His Thr Phe Vai Lys Ala Leu Thr 150 Thr Asp 155 Glu Lys Gin Ala Ala 160 Trp Arg Phe Ile Arg 165 Ile Asp Thr Ser Cys Vai 170 Cys Vai Leu Ser Arg 175 Lys Ala Thr Arg 180 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Nfi 87: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 180 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido -132- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Nfi: 87:

Ala Ala Arg Vai Thr Gly Gin Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Lye 1 5 10 15 Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr 20 25 30 Gin Pro Pro Pro Thr Ser Ser Asp Thr Leu Asp Leu Asp Phe Gin Ala 35 40 45 His Gly Thr Ile Ser Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Thr His Pro Vai Phe Híb Met Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val 65 70 75 80 Ser Vai Trp Vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lye Gly Lye 85 90 95 Glu Vai Thr Vai Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser val Phe Lya 100 105 110 Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala Pro Asn Pro Val Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Arg Asp Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cye Thr Thr 130 135 140 Thr Híb Thr Phe Vai Lys Ala Leu Thr Thr Asp Asp Lys Gin Ala Ala 145 150 155 160 Trp Arg Phe Ile Arg ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Val Leu Ser Arg 165 170 175

Lys Ala Ala Arg 180 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N5 88: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 179 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NQ: 88: -133- 73 993 6526-079-118

Ala Ala Arg Val Ala Gly Gin Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg 1 5 10 15 Phe Lye Lye Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gin 20 25 30 Pro Pro Arg Glu Ala Asp Thr Thr Gin Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly 35 40 45 Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser 50 55 60 Hie Pro Xle Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser 65 70 75 80 Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lye Glu 85 90 95 Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gin 100 105 110 Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly 115 120 125 Gly Arg Asp Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr 130 135 140 His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala Trp 145 150 155 160 Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys 165 170 175

Ala Val Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 89: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 163 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 89:

Phe Phe Lye Lys Lye Arg Phe Arg Ser Ser Arg Val Leu Phe Ser Thr 1 5 10 15

Gin Pro Pro Pro Glu Ser Arg Lys Gly Gin Ser Thr Gly Phe Leu Ser 20 25 30 -134- 73 993 6526-079-118

Ser Ala Vai Ser Leu Asn Arg Thr Ala Arg Thr Lys Arg Thr Ala His 35 40 45 Pro Vai Leu His Arg Gly Glu Phe Ser Vai Cye Asp Ser Val Ser Met 50 55 60 Trp Vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val 65 70 75 B0 Thr Vai Leu Gly GlU Vai Asn Ile Asn Asn Asn Val Phe Lys Gin Tyr 85 90 95 Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Arg Pro Vai Ser Ser Gly Gly 100 105 110 Arg Asp Ile Asp Ala Lys HiS Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr Híb 115 120 125 Thr Phe Vai Lys Ala Leu Thr Met Glu Gly Lys Gin Ala Ala Trp Arg 130 135 140 Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cya Vai Cys Vai Leu Ser Arg Lys Ser 145 150 155 160 Gly Arg Pro (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Nfi 90: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 124 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 90:

His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Glu Ser His Pro Val Phe His Arg Gly 1 5 10 15 Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr 20 25 30 Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val 35 40 45 Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys 50 55 60 Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Gly Arg Asp Ile Asp Ala Lys 65 70 75 80 His Trp Asn Ser Tyr Cye Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lye Ala Leu 85 90 95 Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr 100 105 110 Ser Cys Val Cys val Leu Ser Arg Lys Thr Gly Gin 115 120 -135- -135-

73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 91: (i) Características da sequência (A) Comprimento: 164 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 91:

Val Aep Pro Lys Leu Phe Gin Lys Arg Gin Phe Gin Ser Pro Arg Val 1 5 10 15 Leu Phe Ser Thr Gin Pro Pro Leu Leu Ser Arg Asp Glu Glu Ser Val 20 25 30 Glu Phe Leu Asp Asn Glu Asp Ser Leu Asn Arg Asn Ile Arg Ala Lys 35 40 45 Arg Glu Asp His Pro Val His Asn Leu Gly Glu His Ser Val Cys Asp 50 55 60 Ser Val Ser Ala Trp Val Gly Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly 65 70 75 80 Asn Thr Val Thr Val Met Glu Asn Val Asn Leu Asp Asn Lye Val Tyr 85 90 95 Lye Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asn Pro Asn Pro Glu Pro 100 105 110 Ser Gly Gly Arg Asp Ile Asp Ser Ser His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr 115 120 125 Glu Thr Asp Gly Phe Ile Lys Ala Leu Thr Met Glu Gly Asn Gin Ala 130 135 140 Ser Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Val Ile Thr 145 150 155 160 Lye Lye Lye Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 92: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 196 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido. (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida -136- 73 993 6526-079-118 (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 92:

Pro Ala Gly Ser Ser Pro Asp Pro Ser Ser Pro Vai Vai Asp Pro Lys 1 5 10 15 Leu Phe Ser Lys Arg His Tyr Pro Ser Pro Arg Vai Vai Phe Ser Glu 20 25 30 Vai Ile Pro Ser His Asp Vai Leu Asp Gly Glu Gly Tyr Asp Phe Glu 35 40 45 Arg Vai Arg Gly Leu Arg Vai Arg Arg Lys Ala Vai Ser His Thr Met 50 55 60 Hie Arg Gly Glu Tyr Ser Vai Cye Asp Ser Ile Asn Thr Trp Vai Asn 65 70 75 80 Thr Lys Arg Ala Thr Asp Met Ser Gly Asn Glu Vai Thr Vai Leu Ser 85 90 95 Híb Vai Thr Vai Asn Asn Lys Vai Lys Lys Gin Leu Phe Tyr Glu Thr 100 105 110 Thr Cye Arg Ser Pro Thr His Arg Ser Ser Gly Ile Vai Ile Gly Gly 115 120 125 Arg Ser Gly Gly Arg Gly Gly Ser Gin Gly Ser Lys Thr Gly Asn Ser 130 135 140 Gly Gly Arg Asp Ile Asp Ser Arg Tyr Trp Asn Ser His Cys Thr Asn 145 150 155 160 Thr Asp Ile Tyr Vai Ser Ala Leu Thr Vai Phe Lys Glu Gin Thr Ala 165 170 175 Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asn Ala Ser Cys Vai Cys Vai Ser Arg Thr 180 185 190

Aen Ser Trp Ser 195 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 93: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 225 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura:

(A) Nome/Código: CDS (B) Localização: 1..225 -137- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 93: CGA GTG GTC CTG TCT AGG GGT GCC GCT GCC GGG CCC CCT CTG GTC TTC 48 Arg Vai Vai Leu Ser Arg Gly Ala Ala Ala Gly Pro Pro Leu Vai Phe 1 5 10 15 CTG CTG GAG ACT GGA GCC TTT CGG GAG TCA GCA GGC GCC CGG GCC AAC 96 Leu Leu Glu Thr Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Arg Ala Asn 20 25 30 CGC AGC CAG CGA GGG GTG AGC GAT ACT TCA CCG GCG AGT CAT CAG GGT 144 Arg Ser Gin Arg Gly Vai Ser Asp Thr Ser Pro Ala Ser His Gin Gly 35 40 45 GAG CTG GCC CTG TGC GAT GCA GTC AGT GTC TGG GTG ACA GAC CCC TGG 192 Glu Leu Ala Leu CyB Asp Ala Vai Ser Vai Trp Vai Thr Asp Pro Trp 50 55 60 ACT GCT GTG GAC TTG GGT GTG CTC GAG GTC GAG 225 Thr Ala Vai Aap Leu Gly Vai Leu Glu Vai Glu 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 94: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 75 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 94:

Arg Vai Vai Leu Ser Arg Gly Ala Ala Ala Gly Pro Pro Leu Vai Phe 15 10 15

Leu Leu Glu Thr Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly Ala Arg Ala Asn 20 25 30 Arg Ser Gin 35 Arg Gly Vai Ser Asp 40 Thr Ser Pro Ala Ser 45 His Gin Gly Glu Leu 50 Ala Leu Cys Asp Ala 55 Vai Ser Vai Trp Vai 60 Thr Asp Pro Trp Thr 65 Ala Vai Asp Leu Gly Vai 70 Leu Glu Vai Glu 75 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB95: (i) Características da Sequência -138- -138-

73 993 6526-079-118 (A) Comprimento: 53 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADNc (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 95: CCCACAAGCT TGTTGGCATC TATGGTCAGA GCCCTCACAT AAGACTGTTT TGC 53 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 96: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 10 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ne: 96:

Lys Cys Asn Pro Ser Gly Ser Thr Thr Arg 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 97: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 7 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido -139- -139-

73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 97:

Arg Gly Cys Arg Gly Vai Asp 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 98: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 5 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 98:

Lys Gin Trp Ile Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NE 99: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 6 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 99:

Lys Gin Ser Tyr Vai Arg 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 100: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 7 aminoácidos -140- 73 993 6526-079-118 (Β) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 100:

Gly Pro Gly Xaa Gly Gly Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 101: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 7 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 101:

Gly Pro Gly Vai Gly Gly Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 102: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 7 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido -141- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 102

Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N° 103: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 5 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 103

Glu Ser Ala Gly Glu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 104: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 5 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 104

Asp Asn Ala Glu Glu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ns 105: (i) Características da Sequência -142- 73 993 6526-079-118 (A) Comprimento: 18 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 105: CAGTATTTTT ACGAAACC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 106: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 18 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADNc (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 106:

ACATTTCGGT TTGTTCTG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 107: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 18 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) -143- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 107: CAGTATTTTT ACGAGACG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 108: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 18 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADNc (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 108: ACATTTCGGT TTGTTAGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 109: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 36 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 109: TGCAGTTTCG CTCACCCCCC GTTTTAGCCG GGAAGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Ne 110: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 7 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples -144- 73 993 6526-079-118 (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID NB: 110:

Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N= 111: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 7 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 111:

Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 112: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 7 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 112:

Gly Glu Leu Ser Vai Cys Asp 1 5 -145- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 113: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 6 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 113:

Lys Ala Glu Ser Ala Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 114: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 45 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 114: GGAGGGGGCT GCCGGGGAGT GGACAGGAGG CACTGGGTAT CTGAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 115: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 15 aminoácidos. (B) Tipo: aminoácido (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: Péptido -146- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 115:

Gly Gly Gly Cys Arg Gly Vai Asp Arg Arg His Trp Vai Ser Glu 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NB 116: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 582 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: dupla (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (ix) Estrutura

(A) Nome/Código: CDS (B) Localização: 1..396 (xi) Descrição < da Sequência: SEQ ID Na :116: GTA GTT TGT CCA ATT ATG TCA CAC CAC AGA AGT AAG GTT CCT TCA CAA 48 Vai Vai Cye Pro Ile Met Ser His His Arg Ser Lys Vai Pro Ser Gin 1 5 10 15 AGA TCC TCT AGA GTC GCG CCC GCG ACC TGC AGG CGC AGA ACT GGT AGG 96 Arg Ser Ser Arg Vai Ala Pro Ala Thr Cys Arg Arg Arg Thr Gly Arg 20 25 30 TAT GGA AGA TCC CTC GAG GTG GAG GTG TTG GGC GAG GTG CCT CCA GCT 144 Tyr Gly Arg Ser Leu Glu Vai Glu Vai Leu Gly Glu Vai Pro Pro Ala 35 40 45 GTC GGC AGT TCC CTC CGC CAG CAC TTC TTT GTT GCC CGC TTC GAG GCC 192 Vai Gly Ser Ser Leu Arg Gin His Phe Phe Vai Ala Arg Phe Glu Ala 50 55 60 GAT AAA TCT GAG GAA GGT GGC CCG GGG GTA GGT GGA GGG GCT GCC GCC 240 Asp Lys Ser Glu Glu Gly Gly Pro Gly Vai Gly Gly Gly Ala Ala Ala 65 70 75 80 GGG GTG TGG ACC GGG GGG CAC TGG GTG tct GAG TGC AAG GCC AAG CAG 288 Gly Vai Trp Thr Gly Gly His Trp Vai Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin 85 90 95 -147- --- - ·— -147- --- - ·— Ά ' ' 436 73 993 6526-079-118 TCC TAT GTG CGG GCA TTG ACC GCT GAT GCC CAG GGC CGT GTG GAC TGG 336

Ser Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gin Gly Arg Vai Asp Trp 100 105 110 CGA TGG ATT CAA ACT GGC ACA GCC TGT GTC TGC ACA CTC CTC AGC CGG 384

Arg Trp Ile Gin Thr Gly Thr Ala Cys Vai Cys Thr Leu Leu Ser Arg 115 120 125 ACT GGC TGG GCC TGAGACTTAT ACCCAGGAAC TGGTCAGGCA GAAAAAGAAC Thr Gly Trp Ala 130 AGAGCTGGAT GCTGAGAGAC CTCAGGGTTG GCCCAGCTGC TCTACGGACG GACCCCAGTT 496 GGGGAACTCA TGAAATCATC ACAAAATCAC AACTCTCTGA ATTTGAGCTC AATCTCTGCA 556 GGATGGGTGC CACCACATGT GGTTTT 582 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Nfi 117: (i) Características da Sequência (A) Compriprimento: 132 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (D) Topologia: linear (ii) Tipo de Molécula: Proteína (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 117:

Vai Vai Cys Pro Ile Met Ser His His Arg Ser Lys Val Pro Ser Gin 1 5 10 15 Arg Ser Ser Arg Vai Ala Pro Ala Thr Cys Arg Arg Arg Thr Gly Arg 20 25 30 Tyr Gly Arg Ser Leu Glu Vai Glu Vai Leu Gly Glu Val Pro Pro Ala 35 40 45 Vai Gly Ser Ser Leu Arg Gin His Phe Phe Val Ala Arg Phe Glu Ala 50 55 60 Asp Lys Ser Glu Glu Gly Gly Pro Gly Vai Gly Gly Gly Ala Ala Ala 65 70 75 80 Gly Vai Trp Thr Gly Gly His Trp Vai Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gin 85 90 95 Ser Tyr vai Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gin Gly Arg Val Asp Trp 100 105 110 Arg Trp Ile Gin Thr Gly Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg 115 120 125

Thr Gly Trp Ala 130 -148- 73 993 6526-079-118 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 118: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 36 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico)

(xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 118 CGGTACCCTC GAGCCACCAT GCTCCCTCTC CCCTCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID 'N2 119: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 36 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ns: 119 CGGTACAAGC GGCCGCTTCT TGGGCATGGG TCTCAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 120: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 36 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) -149- 73 993 6526-079-118 (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 120 CGGTACCCTC GAGCCACCCA GGTGCTCCGA GAGATG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 121: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 23 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 121 GAGACCGGAA GCTTCTAGAG ATC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 122: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 36 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Na: 122 TGCAGTTTCG CTCACCCCCC GTTTCCGCCG TGATGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID N2 123: (i) Caracteristicas da Sequência (A) Comprimento: 36 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples -150- 73 993 6526-079-118 (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico) (xi) Descrição da Sequência: SEQ ID Ν': 123: ACATCACGGC GGAAACGGGG GGTGAGCGAA ACTGCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID Na 124: (i) Características da Sequência (A) Comprimento: 36 pares de base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Tipo de cadeia: simples (D) Topologia: não conhecida (ii) Tipo de Molécula: ADN (genómico)

(xi) Descrição da Sequência: SEQ ID N2: 124: ACTTCCCGGC TAAAACGGGG GGTGAGCGAA ACTGCA

Claims

73 993 / ) 6526-079-118 -151- · '' -j- REIVINDICACÕES 1 - Uso de NT-4 ou de um péptido afim com NT-4 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma desordem de infertilidade envolvendo oócitos.
2 - Uso de acordo com a reivindicação l, caracterizado por a proteína ou péptido serem derivados de NT-4 humano.
3 - Uso de uma proteína NT-4, péptido de NT-4 ou derivado capazes de suportar a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma desordem dos neurónios motores relacionada com NT-4.
4 - Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a desordem ser seleccionada do grupo consistindo em esclerose amiotrófica lateral, atrofia muscular espinal progressiva, atrofia muscular infantil, poliomielite, síndrome pós-polio, doença de Charlot-Marie Tooth, trauma dos nervos ou lesão dos nervos.
5 - Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína NT-4 ser codificada por uma sequência de ácido nucleico recombinante, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
6 - Processo para promover a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores, caracterizado por se exporem os neurónios motores a uma concentração terapeuticamente eficaz de uma proteína NT-4, péptido de NT-4 ou derivado que são capazes de promover a sobrevivência, crescimento e/ou diferenciação de neurónios motores.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a proteína NT-4 ser codificada por uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo a sequência de ADN, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o 73 993 6526-079-118 ^ S -152- ~ número de acesso 75070.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracteriza-do por a proteína NT-4, péptido de NT-4 ou derivado serem codificados por uma molécula de ácido nucleico recombinante que tem uma homologia de pelo menos cerca de 70% com a correspondente sequência de ADN, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
9 - Processo para diagnosticar uma desordem de nêurónios motores num paciente caracterizado por compreender os passos de: (a) determinar uma concentração de NT-4 numa amostra retirada de um paciente, por meio de um ensaio imunométrico utilizando um anticorpo anti-NT-4; (b) calcular a diferença entre a concentração de NT-4 da amostra retirada do paciente e a concentração média de NT-4 de amostras análogas de indivíduos normais; e (c) diagnosticar uma desordem de nêurónios motores quando a diferença entre a concentração de NT-4 da amostra retirada do paciente e a concentração de NT-4 de uma amostra análoga de pelo menos um indivíduo normal se correlaciona positivamente com a desordem de nêurónios motores.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o anticorpo anti-NT-4 ser capaz de se ligar a uma proteína NT-4 codificada por uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo a sequência de ADN afim com NT-4, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o anticorpo anti-NT-4 ser capaz de se ligar a uma proteína NT-4 codificada por uma molécula de ácido nucleico recombinante que tem uma homologia de pelo menos 70% com a correspondente sequência de ADN, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de -153- 73 993 6526-079-118 acesso 75070.
12 - Uso de um oligonucleótido que: (a) consiste em pelo menos seis nucleótidos; (b) compreende uma sequência complementar a pelo menos uma porção de um transcrito de ARN do gene NT-4? e (c) é hibridável com o transcrito de ARN, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença localizada na próstata caracterizada por transcrição aumentada de um gene NT-4 em tecido da próstata, relativamente aos níveis dé transcrição em tecido da próstata dé pacientes normais.
13 - Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a doença localizada na próstata ser hipertrofia prostática benigna.
14 - Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o oligonucleótido compreender uma sequência que é 100% complementar à porção correspondente do transcrito de ARN codificado pela sequência de ADN, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
15 - Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o oligonucleótido compreender uma sequência que é pelo menos 70% complementar à porção correspondente do transcrito de ARN codificado pela sequência de ADN, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
16 - Uso de uma proteína NT-4 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma desordem de impotência envolvendo a próstata humana.
17 - Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a proteína NT-4 ser codificada por uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo a sequência de ADN afim com NT-4, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como -154 -154

73 993 6526-079-118 depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
18 - Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a proteína NT-4 ser codificada por uma molécula de ácido nucleico recombinante que tem uma homologia de pelo menos cerca de 70% com a correspondente sequência de ADN, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
19 - Conjunto de diagnóstico para detectar o transporte retrógrado num neurónio motor, caracterizado por compreéiider num recipiente adequado uma proteína NT-4, derivado ou fragmento peptídico marcados detectavelmente.
20 - Conjunto de diagnóstico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a proteína NT-4, derivado ou fragmento peptídico marcados detectavelmente serem codificados por uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo a sequência de ADN afim com NT-4, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070,
21 - Conjunto de diagnóstico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a proteína NT-4, derivado ou fragmento peptídico marcados detectavelmente serem codificados por um fragmento de ácido nucleico que tem uma homologia de pelo menos cerca de 70% com a correspondente sequência de ADN, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
22 - Proteína prepro quimérica, caracterizada por compreender; (a) uma sequência de aminoácidos de uma região prepro de uma neurotrofina diferente de NT-4; (b) uma sequência de aminoácidos de uma região prepro de uma forma madura de uma proteína afim com NT-4.
23 - Proteína prepro quimérica de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por a sequência de aminoácidos da forma -155- 73 993 6526-079-118 madura de uma proteína afim co com NT-4 ser codificada por uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo pelo menos uma porção da sequência de ADN que codifica NT-4, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
24 - Proteína prepro quimérica de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por a neurotrofina diferente de NT-4 ser factor de crescimento de nervo, factor neurotrófico derivado de cérebro ou neurotrofina-3.
25 - Proteína prepro quimérica de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por a região prepro da neurotrofina diferente de NT-4 ser derivada de xenopus NT-4.
26 - Proteína prepro quimérica de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por a região prepro da neurotrofina diferente de NT-4 ser derivada de NT-3 humana.
27 - Molécula de ácido nucleico, caracterizada por compreender uma sequência de nucleótidos que codifica a proteína prepro quimérica da reivindicação 22.
28 - Vector de ADN, caracterizado por ser pCMX-hNT3/hNT4 depositado no ATCC com o número de acesso 75133.
29 - Vector de ADN, caracterizado por ser pCMX-xNT4/hNT4.
30 - Proteína NT-4 recombinante substancialmente pura, caracterizada por ser codificada pelo vector de ADN da reivindicação 28.
31 - Proteína NT-4 recombinante substancialmente pura, caracterizada por ser codificada pelo vector de ADN da reivindicação 29.
32 - Uso de uma proteína NT-4 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma desordem imunológica, relacionada -156- -156-

73 993 6526-079-118 com NT-4, que afecta a transmissão neuromuscular.
33 - Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a desordem ser miastenia grave.
34 - Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a proteína NT-4 ser codificada por uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo a sequência de ADN afim com NT-4, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
35 - Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a proteína NT-4 ser codificada por uma molécula de ácido nucleico recombinante que tem uma homologia de pelo menos cerca de 70% com a correspondente sequência de ADN, tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070.
36 - Processo de produção de NT-4, caracterizado por compreender o crescimento de uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 26, sob condições tais que a proteína prepro quimérica seja expressa e processada pela célula de modo a produzir a forma madura de NT-4.
37 - Processo para detectar ou medir a actividade de NT-4, caracterizado por compreender (a) a exposição de uma célula que expressa trkB a um agente de teste; e (b) detectar ou medir a ligação específica do agente de teste a trkB, correlacionando-se a ligação específica a trkB positivamente com a actividade de NT-4 no agente de teste. 21. MAi 1992 Lisboa, Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC., FINN HALLBOOK, CARLOS FERNANDO IBANEZ MOLINER e HAKAN BENGT PERSSON =0 AGENTE 0FICIAL=