PT101064A - Proteinas e peptidos prepro quimericos, moleculas de acido nucleico que os codificam, e processo de producao de uma neurotrofina - Google Patents
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Description
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MEMÓRIA DESCRITIVA 1.INTRODUÇÃO O presente invento refere-se à construção e expressão em células hospedeiras eucariotas de novas proteínas prepro ou de novos péptidos prepro, quiméricos, que expressam factores neurotróficos bioactivos. O invento baseia-se, em parte substancial, na verificação de que as proteínas prepro ou os péptidos prepro, quiméricos, compreendendo a região prepro de um primeiro factor neurotrófico fundido com a proteína madura ou uma sua porção, de um segundo factor neurotrófico diferente, ãoffem processamento pós-tradução eficaz resultando num nível de expressão aumentado da proteína bioactiva do segundo factor neurotrófico.
2.ANTECEDENTES DO INVENTO 2.1.FACTORES NEUROTRÓFICOS 1990, Science 0 desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso depende de proteínas conhecidas como factores neurotróficos. Um factor neurotrófico é uma citoquina, uma proteína que actua como um mensageiro e que comunica com outras células na coordenação e regulação corrente das funções biológicas. Os factores neurotróficos promovem a sobrevivência e/ou diferenciação de componentes do sistema nervoso. A morte generalizada das células neuronais acompanha o desenvolvimento normal dos sistemas nervoso central e periférico e, aparentemente, desempenha um papel crucial na regulação do número de neurónios que se projectam para um dado campo alvo. (Berg, D. K. 1982, Neuronal Developement 297--331). Estudos de ablação e transplante de tecidos alvo periféricos durante o desenvolvimento mostraram que a morte de células neuronais resulta da competição entre o neurónios por quantidades limitantes de factores de sobrevivência ("factores neurotróficos") produzidos nos seus campos de projecção. Factores neurotróficos importantes identificados até agora incluem o factor de crescimento do nervo (NGF; Levi-Montalcini e Angeletti, 1968, Phys. Rev. 48.:534); neurotrofina-3 (NT-3; Hohn et al. . 1990, Nature 344:339 ? Maisonpierre et al.. 74 586 6526-056-118 -2-
247:1446), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; Barde et al. , 1982, EMBO J. 1.:549), neurotrofina-4 (NT-4; Hallbook et al.. 1991, Neuron 6.:845-858) e factor neurotróf ico ciliar (CNTF; Lin et al». 1979, Science 246:1023).
As neurotrofinas são geralmente sintetizadas in vivo como proteínas precursoras "prepro". A região "prepro" refere-se ao terminal NH2 do precursor que é removido proteoliticamente durante a biossíntese da forma madura, biologicamente activa, da proteína. A região "pre" refere-se à sequência de sinal removida normalmente por processamento proteolítico durante a translòcáção através da membrana celular para originar a proteína "pro"; a região "pro" é então removida por processamento proteolítico para originar a forma madura (ver e.g. Darnell et al.. 1990, Molecular Cell Biology 2a Edição, Scientific American Books, pag. 650-657).
2.1.1. FACTOR DE CRESCIMENTO DO NERVO 0 factor de crescimento do nervo (NGF) é, de longe, a melhor caracterizada destas moléculas neurotróficas e verificou--se, in vitro e in vivo. ser essencial para a sobrevivência dos neurónios sensoriais simpáticos e derivados da cristã neuronal, durante o desenvolvimento precoce da galinha e da ratazana (Levi--Montalcini e Angeletti, 1963, Develop. Biol. 2! 653-659; Levi--Montalcini et al. . 1968, Physiol. Rev. 48.:524-569. Até há pouco tempo quase todos os estudos sobre o NGF tinham-se focado no seu papel no sistema nervoso periférico, mas, agora, parece que o NGF também influencia o desenvolvimento e manutenção de populações específicas de neurónios no sistema nervoso central (Thoenen et al. . 1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109:145-178; Whittemore e Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439-464). A abundância de proteína NGF na glândula submaxilar do ratinho permitiu a determinação da sequência de aminoácidos primária por química de proteínas relativamente convencional (Angeletti e Bradshaw, 1971, Proc. Natl. Acad. Sei. 68:2417--2420). O gene do NGF já foi clonado a partir de muitas espécies, incluindo o ratinho (Scott et al.. 1983, Nature, 302:538-540 , £. <u
74 586 6526-056-118 -3-homem (Uilrich et al. . 1983, Nature, 303;821-825)f vaca e galinha (Meier et al. . 1986, EMBO J. 5.:1489-1493) e ratazana (Whittemore, et al.f 1988, J. Neurosci. Res., 20.: 402-410) usando técnicas convencionais de biologia molecular baseadas na disponibilidade da sequência da proteína do NGF de ratinho para conceber sondas oligonucleotídicas adequadas. 0 gene de NGF de ratinho abarca aproximadamente 45 kb, contendo vários exões 5' pequenos, resultando a junção ("splicing") alternada em quatro espécies distintas de ARNm (Serby, et al. . 1987, Mol. Cell. Biol. 7.:3057-3064). Dóis transcritos principais resultam em péptidos prepro de NGF "comprido·1 e "curto" (Edwards, et al.. 1986, Nature, 319:784-787: Serby, et al. . 1987, Mol. Cell. Biol., 7.:3057-3064). O precursor "curto" contém uma sequência de sinal convencional (região pré) no terminal NH2 que flanqueia a região pro. 0 precursor comprido contém uma "região pro" adicional no seu terminal NH2 (ver e.q. . Suter et al.. 1991, EMBO J. 10.:2395-2400, Figura 1). Até à data não foi elucidada qualquer distinção funcional entre o precursor prepro de NGF "comprido" e "curto". Contudo, o transcrito de ARNm mais curto é mais abundante na maior parte dos tecidos (Edwards et al.. 1986 J. Biol. Chem. 263:6810-6815). A forma biologicamente activa do NGF de ratinho é um complexo 7S, compreendendo um dímero de uma forma madura completamente processada de /3-NGF em conjunto com dois membros da família da calicreína das serina-proteases, a subunidade a e a subunidade )fdo NGF (Varon et al. . Biochemistry 7.: 1296-1303)? Mason et al.f 1983 , Nature, 303:300-307) . A tradução, processamento e secreção do precursor de NGF para formar uma forma-biologicamente activa do NGF está bem documentada. Darling, et al. (1983, Cold Spring Harbor Symp. Quan. Biol. 48:427-433) . com base na força da sequência relatada de ADNc que codifica o NGF de ratinho (scott, et al.. 1983, Nature 302:538-540) . utilizaram um sistema de tradução in vitro isento de células para identificarem intermediários chave na biossíntese do complexo 7S do NGF. A sequência de sinal do precursor prepro do NGF é removida através de processamento proteolítico para originar uma 74 586 6526-056-118 4
espécie pro-NGF de aproximadamente 31 kD. A região pro do intermediário pro-NGF contém um par de resíduos arginina que se sabe serem sítios de processamento endoproteolítico. O processamento proteolítico em qualquer um destes resíduos resulta num espécie intermediária principal (21 kD) e secundária (18/5 kD) adicionais. A forma madura do NGF pode ser derivada proteoliticamente a partir de qualquer uma das espécies intermediárias acima mencionadas. Num ponto qualquer da biossíntese da forma madura do NGF, liberta-se proteoliticamente um dipéptido do terminal COOH (arg-gly).
Mostrou-se in vivo que a subunidade^”"cliva proteoliticamente o precursor pro-NGF na forma madura do NGF (Edwards, et al. . 1988, J. Biol. Chem. 263:6810-6815). Tentativas para mimetizarem 0 processo in vitro não tiveram sucesso, resultando em processamento infiel do precursor pro-NGF, presumivelmente devido ao dobramento aberrante do produto de tradução in vitro. Silen e Agard (1989, Nature 341:462-464) demonstraram que a região pro pode facilitar a dobragem adequada do precursor da protease a--lítica. Consequentemente, a região pro do precursor de NGF pode, também, ser necessária para a dobragem adequada antes do processamento endoproteolítico no forma madura e associação no complexo 7S de NGF biologicamente activa. Evidência para esta hipótese está documentada em Suter et al. (1991, EMBO J. 10.:2395--2400), que atribuíram funções a dois dos domínios parcialmente conservados dentro da região pro do NGF. Mostrou-se que o domínio 1 era essencial para a expressão do NGF em células COS. Adicionalmente, verificou-se que o Domínio II, localizado na região pro do NGF próxima da região de codificação madura, estava envolvido no processamento proteolítico.
Mostrou-se recentemente que o processamento proteolítico do pro-NGF, in vivo. é controlado pelo produto do gene fur humano, uma endoprotease associada à membrana que partilha homologia estrutural com o gene KEX2, que codifica uma endoprotease de levedura (Bresnahan, et al.. 1990, J. Cell Biol. 111:2851-2859).
Consequentemente, a iniciação da biossíntese da forma activa
74 586 6526-056-118 -5-do NGF de ratinho envolve a transcrição do gene de NGF e a possível junção alternativa do produto de transcrição para gerar ARNm capazes de tradução do precursor prepro comprido ou curto de NGF. O precursor prepro do NGF comprido ou curto é subsequentemente submetido a uma série de acontecimentos de processamento endoproteolítico, possivelmente induzido por dobragem adequada do precursor através das características estruturais da região pro, resultando na forma madura do NGF.
2.1.2. FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DO CÉREBRO
Usando cérebro de porco como material de partida, Barde et al. (1982, EMBO J. 1.:549-553), relataram um factor, agora denominado factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), que parecia promover a sobrevivência dos neurónios do gânglio da raiz dorsal de embriões E10/E11 de pinto. Verificou-se que a actividade neurotrófica residia numa proteína altamente básica (ponto isoeléctrico, pi 10,1) que migrava durante a electroforese em gel com dodecilsulfato de sódio (SDS) como uma banda única de 12,3 kD. Referiu-se que a natureza altamente básica e o tamanho molecular do BDNF eram muito semelhantes aos do monómero de NGF. A clonagem do gene do BDNF foi primeiro realizada como se descreve na no Pedido de Patente U.S., co-pendente, Número de Série 07/400 591, apresentado em 30 de Agosto de 1989, que é aqui incorporada para referência na sua totalidade (ver também a Publicação Internacional PCT Na WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991). Clonaram-se ADNc e/ou genes de BDNF genómico, completos a partir de uma variedade de espécies, incluindo o Homem, porco, ratazana e ratinho e foram determinadas as sequências destes genes. A expressão de BDNF recombinante foi conseguida em células COS. A primeira demonstração de especificidade neuronal do BDNF diferente da do NGF consistiu na demonstração in vitro de que o BDNF purificado suporta a sobrevivência de 40-50% dos neurónios sensoriais dissociados do gânglio nodoso derivado do placodo neural do embrião de pinto em E6, E9 ou E12 (Lindsay et al.. 1985 74 586
/·' .^.y-çr fv 6526-056-118 -6- J. Cell Sei. Supp. 3.:115-129). O NGF não tinha qualquer efeito aparente sobre estes neurónios por si próprio ou em conjunto com o BDNF. Mostrou-se, mais tarde, em estudos de culturas de explantes que o BDNF parecia suportar a sobrevivência e o crescimento para o exterior de neurites ("neurite outgrowth") a partir de outros gânglios sensoriais derivados de placodo neural, incluindo os gânglios petrosal, geniculado e venterolateral trigeminal (Davies et al.. 1986, J. Neurosci. 6: 1897-1904), nenhum dos quais se tinha considerado sensível ao NGF. Para além dos seus efeitos em neurónios de gânglios periféricos cultivados, verificou-se que o BDNF estimulava a sobrevivência e a diferenciação neuronal de células cultivadas da cristã neuronal de codorniz (Kalcheim e Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41: 79-86).
Dois estudos recentes com BDNF (Kalcheim et al. . 1987, EMBO J. 6.: 2871-2873; Hofer e Barde, 1988, Nature 331:261-262 Ϊ indicaram, contudo um papel fisiológico do BDNF no desenvolvimento do SNP em aves. Para além do seu efeito nos neurónios sensorais periféricos com origem na cristã neuronal e no placodo neuronal, verificou-se que o BDNF suporta a sobrevivência dos neurónios do SNC em desenvolvimento; Johnson et al. (1986, J. Neurosci. 6.:3031-3938) apresentaram dados indicando que o BDNF suporta a sobrevivência de células do gânglio retinal cultivadas a partir de embriões de ratazana E17.
Para além dos seus efeitos na sobrevivência dos neurónios em desenvolvimento em cultura, o BDNF mostrou ter efeitos em neurónios cultivados do sistema nervoso periférico e central de adultos. A análise da estrutura primária prevista do BDNF maduro revelou uma semelhança surpreendente com o NGF; com apenas três hiatos introduzidos nas sequências do NGF para optimizar o emparelhamento, são comuns aos vários NGF 51 identidades (da cobra ao Homem) e ao BDNF. É importante verificar que estas identidades incluem seis resíduos cisteína.
74 586 6526-056-118 -7- 2.1.3. NEUROTROFINA-3
Encontrou-se outro membro da família da neurotrofina, designado neurotrofina-3, e o gene da NT-3 foi clonado a partir do ratinho, ratazana e humano (ver Pedido de Patente U.S. N® de Série 07/490 004, apresentado em 7 de Março, 1990, incorporado aqui para referência na sua totalidade? ver também Publicação Internacional de PCT Na WO 91/03569, publicada em 21 de Março, 1991). Verificou-se que a estrutura global da proteína NT-3 madura de ratinho, consistindo em 119 aminoácidos com um pi calculado de cerca de 9,5, se assemelhava à estabelecida para o NGF e para o BDNF; uma sequência de sinal putativa de 18 aminoácidos (mostrando 5 e 9 identidades de aminoácidos com o BDNF e o NGF, respectivamente) parece ser seguida por uma sequência pro de 121 aminoácidos (como comparado com uma sequência pro de 103 aminoácidos no ratinho e uma sequência pro de 112 aminoácidos no BDNF de ratinho). Uma comparação entre o NGF, BDNF e NT-3 maduros de ratinho revelou 54 identidades de aminoácidos. Todos os 6 resíduos de cisteína, que se sabe no NGF e BDNF estarem envolvidos na formação de pontes dissulfureto (Leibrock et al.. 1989, Nature 341:149-152: Angeletti, 1973, Biochem. 1^:100-115), estão entre os resíduos conservados. De modo semelhante a NT-3 madura de ratazana parece partilhar uma homologia de aminoácidos de 57% com o NGF de ratazana e 58% de homologia de aminoácidos como o BDNF de ratazana; 57 dos 120 resíduos de aminoácido (48%) parecem ser partilhados por todas as três proteínas. De novo, se verificou que os seis resíduos de cisteína do NGF e BDNF de ratazana eram absolutamente conservados na NT-3 de ratazana e as regiões de maior homologia entre as três proteínas parecem agrupar-se em torno destes resíduos de cisteína.
Para além da homologia entre a NT-3, NGF e BDNF dentro de uma espécie, foi observado um elevado grau de conservação na sequência de ácidos nucleicos entre a NT-3 de ratazana e humana dentro da região que codifica o polipéptido maduro (119 aminoácidos). As sequências de aminoácidos deduzidas da NT-3 madura de ratazana e humana (bem como da NT-3 de ratinho) parecem 74 586 6526-056-118 -8-
ser absolutamente idênticas, o que relembra o elevado grau de conservação do BDNF, que mostra identidade completa com a sequência de aminoácidos do polipéptido maduro entre a ratazana, ratinho, humano e porco. Por contraste, as sequências de aminoácidos do NGF maduro de humano e de roedor (ratinho ou ratazana) diferem em aproximadamente 10%.
Estudos da activdade neurotrófica da NT-3 indicaram que a NT-3 é capaz de promover a sobrevivência e o crescimento para o exterior de neurites de neurónios do gânglio da raiz dorsal, dissociados, em cultura. Além disso observou-se que a NT-3 promovia o crescimento para o exterior de neurites a partir de explantes do gânglio nodoso e do gânglio simpático, ao passo que o BDNF promovia o crescimento para o exterior a partir do gânglio nodoso mas não do gânglio simpático e o NGF promovia o crescimento para o exterior a partir de explantes do gânglio simpático mas não a partir de explantes do gânglio nodoso. Consequentemente, parece que a NT-3 tem uma especificidade de acção mais lata do que o BDNF ou NGF. 2.1.4. NEUROTROFINA-4 A neurotrofina-4 é um novo membro da família do NGF que foi recentemente clonada e isolada (hallbook et al.. 1991, Neuron 6.:845-858). Obtiveram-se fragmentos de PCR correspondendo ao gene de NT-4 de Xenopus e víbora e isolou-se subsequentemente um clone genómico de Xenopus. A análise da sequência nucleotídica deste clone revelou uma estrutura de leitura aberta para uma proteína de 236 aminoácidos, com várias características estruturais semelhantes às do NGF, BDNF e NT-3. Estas características incluem uma sequência de sinal putativa, amino terminal, e um sítio potencial de N-glicosação próximo de um sítio de clivagem proteolítica. Tal como é verdade para o NGF, BDNF e NT-3, toda a proteína prepro-NT-4 de Xenopus é codificada por um único exão.
2.2. PRODUÇÃO DE NEUROTROFINAS
Foram utilizados vários vectores de expressão e hospedeiros
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74 586 6526-056-118 -9-em tentativas para produzir neurotrofinas recombinantes.
Todos os que usaram sistemas de expressão de células animais (células de rim de mamífero), Leibrock et al. [Nature 341;149 (1989)] relataram a expressão de BDNF activo de porco, e Rosenthal et al. [Neuron 4.:767 (1990)], Maisonpierre et al. [Science 247:1446 (1990)] e Hohn et al. [Nature 344:339 (1990)] relataram separadamente a expressão de NT-3 biologicamente activa de várias espécies. Além disso, Chan et al. [Publicação EP Na 370171, publicada em Maio de 1990] relatou a expressão de BDNF humano, maduro, biologicamente activo, a partir de células de insecto através de um sistema de expressão de baculovírus.
Em relação à produção microbiana de neurotrofina, Iwai et al. [Chem. Pharm. Buli. 34.:4727 (1986)] relataram a expressão de "genes" sintéticos para o NH2 humano e a sua fusão em E. Coli. 0 produto foi apenas caracterizado pela massa molecular, após tratamento com um agente redutor e não existia qualquer informação em relação à presença de actividade biológica.
Dicou et al.. fJ. Neuroscience Res. 22.:13 (1989)] relataram a expressão separada de fusões de NGF de ratinho e hNGF em E. Coli. Dicou et al. (1989, J. Neurosci. Res. 22.:13-19) fundiram a sequência de ADN completa de factor de crescimento do nervo prepro de ratinho ao terminal carboxilo do gene da beta-galactosidase de Escherichia coli e também fundiram um fragmento de ADN genómico correspondendo aos codões 11 a 106 do gene do factor de crescimento de nervo humano ao quinto codão do terminal amino da beta-galactosidades. Ambos os vectores bacterianos estavam associados com a expressão de grandes quantidades de proteínas quiméricas. Embora após a lise das células bacterianas, a maior parte do factor de crescimento do nervo prepro quimérico de ratinho parecesse ser insolúvel, a maioria do factor de crescimento do nervo beta, quimérico humano parecia existir no sobrenadante. A actividade neurotrófica não foi referida.
Finalmente, Hu et al. [Gene 70:57 (1988); e Abstract 343.16 da 20th Ann. Meeting of the Soc. for Neuroscience (1990] relataram a expressão de NGF de ratinho em E. Coli. 74 586 6526-056-118 -10-
3. SUMÁRIO DO INVENTO
0 presente invento refere-se a novas proteínas prepro ou péptidos prepro quiméricos compreendendo factores neurotróficos bioactivos e ao uso destes precursores e das suas sequências de ácido nucleico para produzir proteínas ou péptidos que têm uma ou mais actividades biológicas de uma neurotrofina. As moléculas prepro quiméricas proporcionadas pelo presente invento contêm uma região prepro heteróloga fundida com uma sequência de neurotrofina madura ou uma sua porção ou derivado biologicamente activo. As sequências de neurotrofina madura que podem ser usadas de acordo com o presente invento são as da família NGF/BDNF de moléculas homólogas incluindo mas não se limitando a NGF, BDNF, NT-3 e NT-4. De modo semelhante, as regiões prepro podem ser derivadas daquelas moléculas de neurotrofina da família NGF/BDNF incluindo mas não se limitando a NGF, BDNF, NT-3 e NT-4. 0 invento tem por base em parte substancial, a verificação de que as proteínas prepro ou péptidos prepro quiméricos, compreendendo a região prepro do factor de crescimento do nervo, fundida com a porção madura do factor neurotrófico derivado de cérebro (NGF/BDNF prepro são processadas mais eficazmente por uma célula hospedeira eucariota do que o factor neurotrófico derivado de cérebro prepro homólogo (BDNF prepro). Baseia-se ainda na verificação de que células hospedeiras eucariotas, transfectadas e amplificadas estavelmente, que expressam NGF/BDNF prepro quimérico segregam apenas a forma madura do BDNF para os meios. De acordo com o presente invento, podem ser utilizadas as regiões "comprida" ou "curta" do NGF na construção de genes neurotróficos quiméricos. 0 invento também se baseia na verificação de que proteínas prepro ou péptidos prepro, quiméricos, compreendendo a região prepro de NT-3 fundida com a região madura de codificação de factor neurotrófico derivado de cérebro (NT-3/BDNF prepro) são mais eficientemente processadas do que o factor neurotrófico derivado de cérebro prepro, homólogo, (BDNF prepro). Baseia-se ainda na verificação de que células hospedeiras eucariotas, estavelmente transfectadas e amplificadas, que expressam —11— 74 586 6526-056-118 ^ ito (j> NT-3/BDNF quimérico segregam apenas a forma madura do BDNF para os meios. O presente invento proporciona ácidos nucleicos codificando proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos, e processos para a expressão destas proteínas e péptidos neurotróficos, quiméricos, através da utilização desses ácidos nucleicos.
4. DESCRICÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Electroforese em gel de poliacrilamida de BDNF, NGF recombinantes e de formas precursoras quiméricas. Os sobrenadantes de células CHO-DG44, marcadas metabolicamente, transfectadas estavelmente com várias construções foram resolvidos por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS e visualizadas por auto-radiografia. Faixa 1: células CHO-DG44 de tipo selvagem, de controlo. Foram usadas as seguintes construções: vector de expressão pCDM8 contendo o gene do NGF humano (faixa 2); construção de BDNF prepro curta (faixa 3); construção quimérica de NGF/BDNF prepro comprida (faixa 4). Faixa 5: marcadores de massa molecular.
Figura 2. Bioactividade do BDNF recombinante. Ensaiaram-se sobrenadantes em bruto de linhas celulares CHO transfectadas com gânglios da raiz dorsal de pinto embrionário (E8) e foi registado o crescimento para o exterior de neurites. Diamantes a cheio: linha celular DGC-N/B-2.5-#23 (contendo a construção quimérica comprida de NGF/BDNF prepro). Quadrados a ponteado: linha celular DGZ1000-B-3-2.5 (contendo a construção curta de BDNF prepro).
Figura 3. Sequência de ADNc de BDNF humano (SEQ ID Nal) e sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID Ne2) e comparação de sequências de ADN de porco (SEQ ID N23 e SEQ ID Na4), ratazana (SEQ ID Na5 e SEQ ID Na6) e galinha (SEQ ID Nfi7 e SEQ ID Na8). A figura mostrada é da Publicação internacional de PCT Na WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991. 74 586 6526-056-118 -12-
Figura 4. Sequência de nucleótidos (SEQ ID Na9) e deduzida de aminoácidos (SEQ ID N210) do NGF humano. Os números -187 a -1 indicam a região prepro comprida. A informação para a sequência é da Publicação EP 121 338, publicada em 10 de Outubro de 1984, de Gray e Ullrich.
Figura 5. Sequências alinhadas de ADN de genes de NT-3 de ratazana (SEQ ID Nall) e de humano (SEQ ID N213). O sítio de início de tradução previsto está indicado por "PREPRO—" e o início previsto da NT-3 madura está indicado por "MADURO—". As proteínas NT-3 madura de ratazana (SEQ ID Na12) e humana (SEQ' ID N214) têm sequências de aminoácidos idênticas, ao passo que as regiões prepro diferem em 11 posições, que estão sublinhadas. A figura mostrada é da Publicação Internacional de PCT Ns WO 91/03569, publicada em 21 de Março de 1991.
Figura 6. Fragmento 3 de ADN (SEQ ID N215 e 16) utilizado na construção de NT-3/BDNF quimérica correspondendo a 35 aminoácidos da região prepro de NT-3 (SEQ ID Na17).
Figura 7. Análise por transferência de Western de meios condicionados de clones de células CHO expressando o BDNF prepro original (faixa 2-11) ou o NT-3/BDNF prepro quimérico (faixa 12--19). A faixa 1 foi carregada com 450 ng de BDNF humano maduro, purificado. A faixa 20 foi carregada com marcadores de massa molecular baixa pré-corados de BRL. A faixa 8 e a faixa 16 representam clones não produtores de cada transfecção.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento refere-se a novas proteínas prepro ou péptidos prepro, quiméricos compreendendo factores neurotróficos bioactivos e ao uso destes precursores e das suas sequências de ácido nucleico para a produção de proteínas ou péptidos que têm uma ou mais actividades biológicas de uma neurotrofina. As moléculas prepro quiméricas proporcionadas pelo presente invento contêm uma região prepro heteróloga fundida com uma sequência madura de neurotrofina ou sua porção ou derivado biologicamente
74 586 6526-056-118 activos. As sequências de neurotrofina madura que podem ser usadas de acordo com o presente invento são as da família NGF/BDNF de moléculas homólogas incluindo mas não se limitando a NGF, BDNF, NT-3 e NT-4. De modo semelhante, as regiões prepro podem ser derivadas das moléculas de neurotrofina da família NGF/BDNF incluindo, mas não se limitando a NGF, BDNF NT-3 e NT-4. O invento baseia-se, em parte substancial na verificação de que proteínas prepro ou péptidos prepro, quiméricos, compreendendo a região prepro do factor de crescimento de nervo e a porção madura do factor neurotrófico derivado de cérebro (NGF/BDNF prepro) ou a região prepro da NT-3 e a porção madura do factor neurotrófico derivado do cérebro (NT-3/BDNF prepro) são processados mais eficientemente por uma célula hospedeira eucariota do que o factor neurotrófico derivado de cérebro prepro, homólogo, (BDNF prepro). Baseia-se ainda na verificação de que células hospedeiras eucariotas, amplificadas e transfectadas estavelmente, expressando o NGF/BDNF prepro ou o NT-3/BDNF prepro segregam apenas a forma madura do BDNF para os meios. O processamento pós-tradução do BDNF prepro homólogo é altamente ineficiente. Em contaste, um membro da mesma família de genes da neurotrofina, NGF, é processado eficientemente. Apenas a forma bioactiva madura do NGF é segregada para os meios das células hospedeiras a seguir a transfecção transiente. 0 problema do processamento do BDNF persistiu na geração de linhas celulares hospedeiras estáveis para a produção do BDNF maduro bioactivo. 0 presente invento proporciona uma nova solução para este problema de processamento por expressão de construções quiméricas, que numa concretização específica contém a região comprida do NGF prepro fundida no quadro ("in frame") com o BDNF maduro e noutra concretização específica contém a região prepro da NT-3 fundida na quadro com o BDNF maduro. 0 presente invento proporciona ácidos nucleicos codificando proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos e a processos para a expressão destas proteínas e péptidos neurotróficos, quiméricos, pela utilização desses ácidos nucleicos.
74 586 6526-056-118 -14- A expressão de ácidos nucleicos codificando as proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos, de acordo com o presente invento proporciona vantagens significativas em relação ao uso de ácidos nucleicos codificando proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, homólogos. A produção de proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos, proporciona níveis aumentados de expressão do factor neurotrófico bioactivo. Este nível aumentado de expressão deve, adicionalmente, proporcionar melhores esquemas de purificação do factor neurotrófico bioactivo, na medida em que as formas não processadas contaminantes dos factores neurotróficos expressos não estão presentes no sobrenadantes em bruto.
5.1. OS PRODUTOS DE EXPRESSÃO DO PRESENTE INVENTO
As proteínas bioactivas que podem ser obtidas de acordo com o presente invento são factores neurotróficos maduros que são membros da família de genes da neurotrofina, ou suas porções ou derivados biologicamente activos. O termo "biologicamente activo", tal como aqui usado refere-se à capacidade de expressar uma ou mais actividades biológicas da neurotrofina madura de comprimento total. Estas neurotrofinas incluem, mas não estão limitadas a BDNF, NT-3, NGF e NT-4 maduros e a outros membros que sejam identificados por processos utilizados para a determinação de membros da família de genes da neurotrofina (e.g. usando sondas moleculares, geradas por PCR, correspondentes a regiões de homologia dentro da família? ver Publicação PCT WO 91/03569).
Estão disponíveis as sequências de ADN que codificam várias proteínas de neurotrofina que podem ser expressas usando o presente invento. Ver Ullrich et al. (Nature 303;821 (1983); Publicação E.P. 121 338, publicada em 10 de Outubro de 1984) em relação às sequências de codificação de hNGF e, e.g.. Meier et al. (EMBO J. 5.:1489 (1986)) e Schwarz et al. (J. Neurochem. 52.:1203 (1989)) em relação aos ADNc de NGF para várias outras espécies? estirpe de plasmideo ATCC phBDNF-C-1 (Na de Acesso 4068) em relação a um clone de ADNc de hBDNF e, e.g. Leibrock et al.. infra, em relação a ADNc de BDNF de porco; e estirpe de 74 586 6526-056-118 -15-
plasmideo ATCC pC8-hN3 (Pl) (Na de Acesso 40765) em relação a um clone de ADNc de NT-3 humana e Maisonpierre et al. (Science 247:1446 (1990)) e Hohn et al. (Nature 344:339 (1990)) em relação a sequências de codificação de várias outras espécies. Foi relatada a clonagem de genes de NT-3 humana (Rosenthal et al.. Neuron 4.:767 (1990)) bem como de ratazana (Maisonpierre et al.. infra). Além disso, as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para o BDNF são descritas na Publicação de PCT WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991 e Pedido de Patente U.S., co-pendente, Na de Série 570 657, apresentada em 20 de Agosto de 1990; as sequências de nucleótidos e de aminoácidos para à NT-3 são descritas na publicação de PCT WO/03569 publicada em 21 de Março de 1991 e Pedido de Patente co-pendente N2 de Série 570 189, apresentado em 20 de Agosto de 1990). Para além disso as sequências de nuleótidos e de aminoácidos para o BDNF (SEQ ID Nal-8), para o NGF (SEQ ID Na9-10) e para a NT-3 (SEQ ID Nall-14) são apresentadas nas Figuras 3, 4 e 5, respectivamente, do presente invento.
Para além disso, pode ser identificado um gene de neurotro-fina de qualquer organismo usando as regiões de homologia partilhada por quaisquer dois membros da família de moléculas BNF/NGF/NT-3/NT-4, usando os processos apresentados acima. Por exemplo, e não como limitação, uma nova neurotrofina pode ser identificada e clonada por síntese de oligonucleótidos degenerados de BDNF/NGF/NT-3/NT-4 correspondendo a segmentos de sequências de proteínas altamente conservadas entre quaisquer duas neuro-trofinas. Estes oligonucleótidos podem ser usados como inciadores em reacções em cadeia de polimerase (PCR) com o molde de ADNc preparado a partir de células que se suspeite que expressem a neurotrofina desejada. Os produtos de PCR podem, então, ser usados como sondas para permitirem a clonagem de ADNc completo e/ou de genes genómicos, cujas sequências podem ser determinadas por métodos comuns. Podem ser identificadas novas neurotrofinas por selecção daquelas que contêm, para além das sequências homólogas a outras neurotrofinas conhecidas, sequências não homólogas a outras neurotrofinas conhecidas íe.q.. pelo menos seis nucleótidos contíguos nos quais pelo menos dois nucleótidos dife-
74 586 6526-056-118 -16-rem). De modo semelhante os oligonucleótidos correspondentes a sequências de uma neurotrofina em uma espécie podem ser usados em PCR para gerarem sondas para permitirem a clonagem do gene da neurotrofina de outras espécies. 0 NGF e o BDNF são proteínas básicas de aproximadamente 120 aminoácidos que partilham cerca de 50% de identidade da sequência de aminoácidos, incluindo a conservação absoluta de seis resíduos cisteína que se mostrou, no NGF activo, formarem três pontes dissulfureto (Bradshaw, A., 1978, Ann. Rev. Biochem. 47;191-216; Leibrock et al.. 1989, Nature 341:149-52). A comparação ‘das sequências do NGF a partir de espécies evolutivamente divergentes revelou que os aminoácidos que flanqueiam estes resíduos cisteína compreendem as regiões mais conservadas da molécula (Meier et al. . 1986 EMBO J. 5,: 1489-93; Selby et al. . 1987, J. Neurosci. Res. 18:293-8). Surpreendentemente, estas são também as regiões mais semelhantes entre o BDNF e o NGF (Leibrock et al.f 1989, Nature 341:149-52.
Num aspecto preferido do presente invento, produz-se uma neurotrofina humana, madura, por expressão de uma molécula prepro quimérica de acordo com o presente invento. Numa concretização específica, a molécula prepro quimérica é codificada por um ácido nucleico contendo a região prepro comprida do NGF fundida no quadro ("in frame") com a sequência de codificação do BDNF maduro. Numa outra concretização, a molécula prepro quimérica é codificada por um ácido nucleico contendo a região prepro da NT-3 fundida no quadro com a região de codificação do BDNF maduro. Ainda noutra concretização, a região prepro comprida do NGF está fundida no quadro com a região de codificação da NT-3.
Tal como foi discutido supra f não foi documentado qualquer significado biológico distinto entre a região prepro '"comprida" e "curta" do precursor do NGF. Ainda noutro aspecto específico do invento, pode ser utilizada a região prepro "comprida" ou "curta" na construção de genes neurotróficos quiméricos. Um perito na arte pode utilizar uma região prepro "curta" do NGF ou uma região prepro "comprida" do NGF na construção de fusões quiméricas do
74 586 6526-056-118 -17-presente invento compreendendo uma região prepro do NGF.
As moléculas de neurotrofina maduras que podem ser expressas como precursores prepro quiméricos de acordo com o presente invento também incluem sequências e fragmentos ou derivados, substancialmente equivalentes que são biologicamente activos.
Por exemplo, as sequências de ácido nucleico da neurotrofina podem ser alteradas por substituições, adições ou delecções que podem proporcionar moléculas funcionais. Devido à degeneração das sequências de nucleótidos de codificação, podem ser usadas na prática do presente invento outras sequências de ADN que codificam substancialmente a mesma sequência de aminoácidos da neurotrofina. Estas incluem, mas não estão limitadas a sequências de nulceótidos compreendendo todas as porções dos genes da neurotrofina que são alterados pela substituição de diferentes codões que codificam um resíduo de aminoácido funcionalmente equivalente dentro da sequência, produzindo assim um mudança silenciosa. Do mesmo modo, as proteínas de neurotrofina ou seus fragmentos ou derivados, do invento incluem, mas não estão limitados àqueles que contêm, como parte da sua sequência de aminoácidos primária, sequências alteradas nas quais se substituem resíduos dentro da sequência por resíduos de aminoácido funcionalmente equivalentes, resultando numa mudança silenciosa. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido, dentro da sequência, pode ser substituído por outro aminoácido de polaridade semelhante que actua como um equivalente funcional, resultando numa alteração silenciosa. Substitutos para um aminoácido dentro da sequência podem ser seleccionados de entre outros membros da classe a que o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Estão também incluídas no âmbito do invento proteínas ou fti). S/· " di
74 586 6526-056-118 -18-fragmentos de neurotrofina ou seus derivados que são obtidos através de modificação durante ou após a tradução, e.q.. por glicosação, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular, acetilação, fosforilação, redução clivagem, etc.
Adicionalmente, uma dada sequência de neurotrofina pode sofrer mutação in vitro ou in vivo. para criar e/ou destruir sequências de tradução, iniciação e/ou terminação ou para criar variações nas regiões de codificação e/ou formar novos sítios de endonuclease de restrição ou destruir outros já existentes, p'àra facilitar ainda mais a modificação in vitro. Pode ser usada qualquer técnica de mutagénese conhecida na arte, incluindo mas não se limitando a mutagénese dirigida ao sítio in vitro (Hutchinson, et al.. 1978, J. Biol. Chem. 253:6551). uso de ligadores TAB ® (Pharmacia), etc. O presente invento também se refere à expressão dos ácidos nucleicos que codificam moléculas de neurotrofina prepro, quiméricas e à recuperação do produto neurotrofina madura.
5.2. CONSTRUÇÃO DAS PROTEÍNAS PREPRO OU PÉPTIDOS PREPRO. NEUROTRÓFICOS. QUIMÉRICOS
Os ácidos nucleicos que codificam proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos quiméricos podem ser construídos usando tecnologia comum de ADN recombinante, por exemplo, por digestão por enzima de restrição e ligação das sequências de ácido nucleico que codificam as regiões prepro e maduras desejadas. Alternativamente, as sequências de ácido nucleico podem ser construídas usando síntese química, como tecnologia de fosforamideto em fase sólida. Em concretizações preferidas do invento, pode ser usada reacção em cadeia de polimerase (PCR; Saiki et al.. 1985, Science 230:1350-1354) para conseguir a união ("splicing") de sequências de ácido nucleico por extensão de sobreposição (Horton et al. . 1989, Gene 77.:61-68) e, assim, produzir ácidos nucleicos codificando as proteínas prepro ou péptidos prepro neurotróficos, quiméricos do invento (ver.e.q..
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Secção 6, infra).
Num aspecto preferido, os ácidos nulceicos do invento são produzidos pela utilização de duas reacções de PCR em separado, cada uma com um molde diferente. Como ilustração, se é desejada uma quimera X-Y, realiza-se primeiro a PCR com um molde, por exemplo X, usando uma sonda completamente homóloga com X e uma sonda com uma região homóloga com X e uma região homóloga com Y. 0 produto de reacção PCR é, depois, isolado e usado como uma sonda numa segunda reacção de PCR, com Y como um molde e uma segunda sonda completamente homóloga com Y.
Pode ser ainda desejável incorporar nos iniciadores sítios de endonuclease de restrição úteis.
Para além disto, os factores neurotróficos quiméricos podem ser produzidos por PCR num só passo utilizando três iniciadores oligonucleotídicos. Por exemplo, pode ligar-se um ácido nucleico codificando pelo menos uma porção da região prepro desejada (X) a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína ou péptido neurotrófico, maduro, (Y) criando três iniciadores oligonucleotídicos, um dos quais corresponde a uma porção da sequência X (o "iniciador X"), um outro corresponde a uma porção da sequência Y ( o "iniciador Y") e um terceiro que contém uma porção das sequências X e Y ("o iniciador XY"). Estes três oligonucleótidos podem ser combinados numa PCR em um passo, sendo desejável que os iniciadores X e Y estejam presentes em quantidades maiores do que o iniciador XY, por exemplo numa razão de X:Y:XY de cerca de 100:1:100. [o molde utilizado na PCR pode ser uma mistura de ácidos nucleicos codificando a região prepro desejada e a proteína ou péptido neurotrófico maduro]. A posição dos sítio de união é determinada pelo nucleótido em ponte (e.g. o iniciador XY).
Podem ser usadas as condições de amplificação comummente usadas na arte, por exemplo, 1 minuto a cerca de 94°C, 2 minutos a cerca de 43°C e 3 minutos a cerca de 72°C durante 35 ciclos, usando soluções e métodos padrão de PCR. O fragmento de PCR
74 586 6526-056-118 -20- resultante pode, depois, ser purificado em ^ electroforese em gel, digerido com a endonuclease de restrição adequada e ligado num vector de clonagem adequado.
Processos adicionais de construção das quimeras do presente invento serão prontamente aparentes aos peritos na arte.
Os produtos de reacção de ADN podem ser clonados usando qualquer processo conhecido na arte. Pode ser usado qualquer número de sistemas vector-hospedeiro conhecidos na arte. Vectores possíveis incluem, mas não estão limitados a cosmídeos plasmideos ou vírus modificados, mas os sistemas de vectores devem ser compatíveis com a célula hospedeira usada. Estes vectores incluem mas não estão limitados a bacteriófagos como derivados lambda ou plasmideos como pBR322, pUC ou derivados plasmídicos de Bluescript@ (Stratagene). Podem ser introduzidas moléculas recombinantes nas células hospedeiras através de transformação, transfecção, infecção, electroporação, etc.
5.3.EXPRESSÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANDO PROTEÍNAS PREPRO OU PÉPTIDOS PREPRO. NEUROTRÓFICOS. QUIMÉRICOS A sequência nucleotídica codificando uma proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico, pode ser ligada num vector de expressão adequado, i.e.. um vector que contém os elementos necessários para a transcrição da sequência de ADN qimérica, clonada. Os sinais de transcrição e tradução necessários podem, também, ser proporcionados por um dos genes da neurotrofina e/ou as suas regiões flanqueadoras correspondendo a proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico. Pode ser utilizada uma variedade de sistemas hospedeiro eucariota--vector para a expressão da sequência de ADN quimérica, clonada e o resultante transcrito de ARNm. Estes incluem, mas não estão limitados a sistemas de células de mamífero infectadas com vírus fe.q.. vírus vacinia, adenovírus, etc.),'transfectados com outros vectores, contendo ácidos nucleicos do invento integrados cromossomicamente, etc., mas o sistema hospedeiro usado deve ter a maquinaria celular adequada para processar a quimera prepro na
74 586 6526-056-118 -21-neurotrofina madura. Os elementos de expressão dos vectores variam nas suas potências e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro-vector utilizado, pode ser usado qualquer um de um número de elementos adequados de transcrição e tradução.
Pode ser usado qualquer dos processos previamente descritos para a inserção de fragmentos de ADN num vector para construir vectores de expressão contendo uma sequência codificando uma proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico, consistindo nos sinais de controlo de transcrição/tradução adequados a montante das sequências de ADN quiméricas. Estes processos podem incluir técnicas de ADN recombinante e sintéticas in vitro e recombinações in vivo (recombinação genética). A expressão de sequências de ácido nucleico codificando proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácido nucleico de modo que a proteína prepro ou péptido prepro, neurotrófico, quimérico, seja expresso num hospedeiro transformado com a molécula de ADN recombinante. Por exemplo, a expressão pode ser controlada por qualquer elemento promotor/intensificador conhecido na arte como sendo activo em células de mamífero. Os promotores que podem ser usados para controlar a expressão do factor neurotrófico quimérico incluem, mas não estão limitados ao promotor do citomegalovírus (CMV), à região promotora precoce de SV40 (Bernoist e chambom, 1981, Nature 290:304-310). ao promotor contido na repetição terminal longa de 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto.et al. . 1980, Cell 22.:787-797), ao promotor da timidina-cinase do herpes (Wagner et al.. 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78.:144-1445), às sequências reguladoras do gene da metalotionina (Brinster et al. . 1982, Nature 296:39-42; e às seguintes regiões animais de controlo da transcrição, que exibem especificidade tissular e foram utilizadas em animais transgénicos: região de controlo do gene da elastase I que é activa nas células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38.:639-646; Ornitz et al.. 1986, Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 5(3:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 2:425-515)? região de controlo do gene da insulina que é activa nas células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122). região de 74 586 6526-056-118 -22-
controlo do gene da imunoglobulina que é activa nas células linfoides (Grosschedl et al.. 1984, Cell 38.: 647-658; Adames et al.. 1985, Nature 318:533-538: Alexander et al.. 1987, Mol. Cell. Biol. 7.:1436-1444) região de controlo do vírus do tumor mamário do ratinho que é activo em células testiculares, da mama, linfoides e em mastócitos (Leder et al.. 1986, Cell 45:485-495),região de controlo do gene da albumina que é activa no fígado (Pinkert et al.. 1987, Genes and Devei. 1.:268-276), região de controlo do gene da alfa-fetoproteína que é activa no fígado (Krumlauf et al.. 1985, Mol. Cell. Biol. 5.:1639-1648: Hammer et al.. 1987, Science 235:53-581: região de controlo do gene da alfa 1-antitripsina que é activa no fígado (Kelsey et al.. 1987, Genes and Devei. 1.:161-171) região de controlo do gene da beta-globina que é activa em células mielóides (Mogram et al.. 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al.. 1986, Cell 46:89-94; região de controlo do gene da proteína básica mielina que é activa em oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al. f 1987, Cell 48:703-712); região de controlo do gene da cadeia leve 2 da miosina que é activa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286) e região de controlo do gene da hormona gonadotrópica de libertação que é activa no hipotálamo (Mason et al. . 1986, Science 234:1372-1378).
Um exemplo específico de um vector de expressão que pode ser usado é o CDM8 (Seed, 1987, Nature 329:840-842: Seed e Aruffo, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84.:3365-3369; Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84.:8573-8577); outro exemplo pode ser o pCMX (ver pedido co-pendente Na de Série 678 408, apresentado em 28 de Março de 1991).
Os vectores de expressão contendo inserções do gene de proteína prepro ou péptido prepro, neurotróficos, quiméricos, podem ser identificados por três abordagens gerais: (a) hibridação ADN-ADN, (b) presença ou ausência de funções de gene marcador e (c) expressão de sequências inseridas. Na primeira abordagem, a presença de um gene estranho inserido num vector de expressão pode ser detectada por hibridação ADN-ADN usando sondas compreendendo sequências que são homólogas a pelo menos uma
74 586 6526-056-118 -23-porção de um gene de proteína prepro ou de péptido prepro, neurotróficos, quiméricos, inserido. Na segunda abordagem, o sistema vector recombinante/hospedeiro pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou ausência de certas funções de gene "marcadores" (e.q.. actividade de timidina-cinase, transformação de fenótipo, etc.) causadas pela inserção de genes estranhos no vector. Por exemplo, se a sequência de codificação da proteína prepro ou do péptido prepro, neurotróficos, quiméricos, é inserida dentro da sequência de gene marcador do vector, os recombinantes contendo a inserção quimérica podem ser identificados pela ausência da função de gene marcador.' Na terceira abordagem, os vectores de expressão recombinantes podem ser identificados ensaiando o produto de gene estranho expresso pelo recombinante. Estes ensaios podem ser baseados, por exemplo, nas propriedades físicas ou funcionais do produto de gene do factor neurotrófico em sistemas de bioensaio tal como descritos infra. na Secção 5.4.
Uma vez identificada e isolada uma molécula de ADN recombinante particular, podem ser usados vários métodos conhecidos na arte para as propagar. Uma vez estabelecidos sistemas de hospedeiros e condições de crescimento adequados, os vectores de expressão recombinantes podem ser propagados e preparados em quantidade. A expressão a partir de certos promotores pode ser elevada na presença de certos indutores; assim, pode ser controlada a expressão de proteína prepro ou de péptido prepro, neurotróficos, quiméricos, manipulados geneticamente. Além disso, células hospedeiras diferentes têm mecanismos específicos e característicos para a tradução e para o processamento e modificação de pós-tradução (e.q.. glicosação, clivagem) das proteínas. Devem ser escolhidas linhas celulares ou sistemas hospedeiros apropriados de modo a se assegurar o processamento necessário e.q.. a remoção por clivagem da região prepro) e para qualquer modificação desejada. São, assim, preferidas as células hospedeiras de mamífero, como as de macaco, humano ou bovino.
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Em concretizações específicas do invento, o ADN que codifica neurotrofinas quiméricas pode ser expresso num sistema de células CHO de acordo com processos apresentados infra. Uma vez identificado um recombinante que expressa a neurotrofina quimérica, o produto de qene maduro deve ser analisado. Isto pode ser conseguido por ensaios baseados nas propriedades físicas ou funcionais do produto. Ver Secção 5.4. infra.
Uma vez identificado a proteína ou péptido do factor neurotrófico maduro, ele pode ser isolado e purificado por processos comuns, incluindo a cromatografia fe.q.. cromatogrâfia de permuta iónica, afinidade e de separação por tamanhos), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica comum para a purificação de proteínas.
5.4. ENSAIOS DO FACTOR NEUROTRÓFICO
As proteínas e péptidos de neurotrofina produzidos de acordo com o invento são capazes de exibirem uma ou mais actividades biológicas, incluindo, mas não lhes estando limitadas, actividade neurotrófica, ligação por anticorpos a neurotrofinas, ligação a receptores relacionados, etc. O termo "actividade neurotrófica", tal como aqui usado, deve ser considerado como referindo um efeito biológico sobre células do sistema nervoso, incluindo, mas lhes estando limitado, neurónios, astrócitos, células da glia, oligodendrócitos, célula da microglia e de Schwann. O efeito biológico é uma alteração na estrutura e/ou fisiologia de uma célula nervosa que não ocorre na ausência de exposição directa ou indirecta ao factor neurotrófico quimérico. Exemplos de efeitos biológicos são o prolongamento da sobrevivência, o crescimento de neurites, a manutenção do desenvolvimento de funções diferenciadas (como a expressão de uma enzima, e.q.. colina--acetiltransferase ou tirosina-hidroxilase) ou, de modo contrário, a morte ou senescência celular ou desdiferenciação. A presença de actividade neurotrófica pode ser determinada usando qualquer ensaio conhecido para essa actividade bem como sistemas que podem ser desenvolvidos no futuro. Sistemas de 74 586 6526-056-118 -25-
sistemas de bioensaio de cultura de tecidos usando explantes de tecidos, células preparadas a partir de tecidos ou linhas celulares imortalizadas, por exemplo derivadas do cérebro, espinal-medula ou sistema nervoso periférico, bem como sistemas de teste in vivo. nos quais o factor neurotrófico pode ser administrado a um animal; os efeitos neurotróficos podem ser detectados neste animal por realização de testes químicos, histológicos ou comportamentais usando o referido animal. Adicionalmente, um factor neurotrófico pode ser incorporado como um transgene num animal transgénico não humano e os seus eféitos biológicos podem ser medidos no referido animal.
Por exemplo, mas não como limitação, a actividade neurotrófica pode ser medida usando qualquer dos sistemas de bioensaio bem conhecidos, seguintes: (i) sistema de ensaio de gânglios da raiz dorsal, tal como descrito em Barde et al.. 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77:1199-1203, que é aqui incorporado para referência, na sua totalidade; (ii) sistema de ensaio de gânglios nodosos, como descrito por Lindsay et al.. 1985, Dev. Biol. 112:319-328. que é aqui incorporado para referência na sua totalidade; (iii) ensaio de gânglios simpáticos como descito por Barde et al.. 1982, EMBO J. 1.:549-553, que é aqui incorporada para referência na sua totalidade; (iv) neurónios da espinal-medula. Resumidamente, pode ser removida a espinal-medula, assépticamente, de um animal de teste, cortada em posição caudal em relação ao bolbo raquidiano e libertada de gânglios sensoriais e de meninges. A medula pode, então, ser subdividida em segmentos ventral e mediodorsal para culturas separadas, e os tecidos cortados em pequenos pedaços e dissociados por trituração através de uma pipeta de Pasteur numa mistura de 50 por cento de DMEM (Gibco) e 50 por cento de mistura nutriente de Ham F12 74 586 6526-056-118 -26-
(Gibco) suplementada com glucose 33 mMf glutamina 2 mM, NaHC03 15 mM, HEPES 10 mM, 25 μg/ml de insulina, 100 jLig/ml de transferrina, putrescina 60 μΜ, progesterona 20 nM, selenito de Na 30 nM, 0,5 μg/ml de penicilina G, 0,5 μg/ml de estreptomicina e 2,5 μg/ml de albumina de soro bovino. A trituração pode, depois, ser repetida duas vezes e os sobrenadantes podem ser reunidos e filtrados através de um filtro Tetko de 40 μιη. As células ventrais dissociadas podem, então, ser plaqueadas numa placa de cultura revestida com poli-D-lisina (10 μg/ml) a uma densidade de 0,5 milhões de células por placa de 35 mm. As células mediodorsais dissociadas podem ser plaqueadas a uma densidade de 1,5 milhões de células por placa de 35 mm revestida com poli-D-lisina (10μg/ml), poli-L-ornitina (10 μg/ml) ou poli-L-ornitina mais laminina (5 μg/ml). (v) ensaios de neurónios colinérgicos do prosencéfalo basais (ver Publicação PCT WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991); (vi) ensaio de neurónios dopaminérgicos mesencefálicos ventrais (ver Publicação PCT WO 91/03568, publicada em 21 de Março de 1991; e (vii) ensaios de células PC12.
6. EXEMPLO: CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DA QUIMERA NGF-PREPRO/BDNF MADURO
6.1. CONSTRUÇÃO DE MOLÉCULAS DE ÁCTDO NUCLEICO QUIMÉRICAS USANDO REACCÃO EM CADEIA DE POLIMERASE
Foi utilizada uma clonagem por reacção em cadeia de polimerase (PCR; Saiki et al.. 1985, Science 230:1350-1354) para a construção de uma quimera prepro NGF/BDNF maduro consistindo na forma prepro comprida de NGF de ratinho fundida com a sequência de BDNF humano maduro. 74 586 6526-056-118 -27-
PCR. O iniciador 5' (5'-CTC-GTC-GAC-AGC-CGG-CAC-TCT-GAC-CCT-GCG-CGC-CGA-3') [SEQ ID Na17] codificava os 7 primeiros aminoácidos do BDNF incluindo dois sítios de restrição únicos, Nael e BssH2, que foram gerados por modificação da utilização dos codões. 0 inicador 3' de PCR era um oligo 3· pCDM8 correspondendo a uma região a jusante da sequência poliligadora na extremidade 3' da sequência de BDNF em pC8hB (5'-CAA-AGA-TCC-TCT-AGA-GTC-G(C)-3') [SEQ ID Na18 ]. 0 poliligador contém um sítio de restrição Notl. Estes dois iniciadores foram usados em PCR com ADN de pC8hB (hBDNF em pCDM8) como molde. Usaram-se 5 microgramas de pCShBcom 500 ng de cada um dos iniciadores durante 5 ciclos de PCR. 0 produto de PCR foi digerido com Nael e Notl simultaneamente e isolou-se um produto de digestão de 365 pb por electroforese em gel. A preparação do vector foi realizada por digestão do pC81mN (NGF de ratinho, comprido, em pCDM8) com Eco47 e Notl e isolamento do fragmento de vector de 4,6 kb por electroforese em gel. O fragmento de 365 pb foi ligado nos sítios Eco47/Notl do pC8lmN. Esta ligação resultou numa fusão directa no quadro da região prepro do NGF de ratinho com a região de codificação do BDNF maduro. As construções foram testadas diagnosticamente por digestão com BssH2, avaliando a perda do sítio Eco47 durante a subclonagem e, por fim, por sequênciação de ADN.
6.2.EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS QUIMÉRICAS
Usaram-se células CHO-DG44 para se gerarem linhas estáveis para a produção de BDNF bioactivo. As células CHO-DG44 (obtidas junto do Dr. L. Chasin da Universidade de Columbia) não têm ambas as cópias do gene da di-hidrofolato-redutase (Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220). As linhas de células CHO-DG44, estavelmente transfectadas, expressando BDNF, foram anteriormente descritas (Publicação Internacional de PCT Na WO 91/03568, publicada em 21.de Março de 1991). Estas linhas foram geradas por transfecção com ADN de pC8hB que codifica o gene do BDNF humano incluindo a região prepro clonada no vector de expressão pCDM8. As células CHO-DG44 (lxlO6 células/placa de 100 mm) foram transfectadas pelo proceso da coprecipitação com -28- 74 586 6526-056-118 fosfato de cálcio com 20 μg da quimera NGF/BDNF (pC81mN/B) em conjunto com 0,2 /tg do plasmideo p410 que codifica um gene enfraquecido da di-hidrofolato-redutase (dhfr). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram passadas em meios de selecção (F12 de Ham sem hipoxantina e timidina contendo 10% de soro de bovino fetal dialisado e 1% de cada um de penicilina e estreptomicina; meios -HT). Os clones resistentes a -HT foram tratados como conjuntos para amplificação com metotrexato (MTX). Os clones obtidos com MTX 0,05μΜ foram também tratados como conjuntos para amplificação adicional com MTX 2,5 μΜ. Isolou-se um clone único, seleccionado primeiro em MTX 0,05 μΜ e, depôis, em MTX 2,5 μΜ (consequentemente duas séries de amplificação) (DGC-N/B-2.5#23), que provou ser o maior produtor de BDNF tal como avaliado por bioactividade e marcação metabólica. Avaliou-se a bioactivdade classificando o crescimento para o exterior de neurites de gânglios da raiz dorsal (DRG) de pinto embrionário (E8) (Maisonpierre et al. . 1990, Science 247.:1446-1451).
7. EXEMPLO: COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE PROCESSAMENTO ENTRE BDNF PREPRO. HOMOLOGO. E A QUIMERA NGF PREPRO/BDNF
Realizaram-se experiências para a comparação directa do processamento e expressão do BDNF prepro com a quimera NGF prepro/BDNF em células CHO.
7.1 MARCAÇÃO METABÓLICA
As linhas de células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com pC8hD ou pC81mN/B e amplificadas com metotrexato 2,5 μΜ foram comparadas por marcação metabólica (Figura 1). Para esta experiência de marcação, as células CHO-DG44 que expressam BDNF da construção de BDNF prepro curta (linha celular=DGZ1000-B-3-2.5) ou da construção quimérica NGF prepro comprida de ratinho/BDNF (linha celular=DGC-N/B-2.5-#23) foram semeadas a densidades iguais (2xl05 células/alvéolo em placa de 6 alvéolos) 24 horas antes da marcação. As células foram, então, marcadas com 35S-cisteína e 35S-metionina durante 4 horas sob condições de isenção de soro. Resolveram-se aliquotas de 30 μΐ dos
74 586 6526-056-118 -29- sobrenadantes de células marcadas por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (gel a 15%) e as proteínas marcadas foram transferidas para membranas de nylon e visualizadas por auto-radiografia. Tal como se observa na Figura 1, as células CHO-DG44 transfectadas estavelmente com o gene do NGF humano no vector de expressão pCDM8 expressaram a forma madura do NGF que migrava a uma massa molecular de aproximadamente 12 300 (Figura 1, faixa 2). Na faixa 1 mostram-se células CHO-DG44 de tipo selvagem, como controlo. Detectaram-se proBDNF não processado (31 kD), a porção pro do precursor proBDNF processado (16 kD) e a forma madura (14 kD) a proteína BDNF prepro curta, na linha celular transfectâda estavelmente DGZ1000-B-3-2.5 (obtida após selecção semelhante em MTX e amplificação tal como usada para a linha celular DGC-N/B-2.5-#23) (Figura l, faixa 3). Apenas se detectou a forma madura processada proteoliticamente de BDNF (14 kD) em DGC-N/B-2.5-#23, estavelmente transfectada com a construção quimérica proNGF/BDNF comprida (Figura 1, faixa 4). Não foi detectado proNGF/BDNF nos meios condicionados desta linha celular. Calculamos, a partir da intensidade da marcação do BDNF maduro, que a linha celular DGC-N/B-2.5-#23 produza cerca de cinco (5) vezes mais proteína BDNF madura por célula em relação à linha celular DGZ1000-3-2.5 feita com a construção proBDNF curta.
7.2 BIOACTIVIDADE
Comparou-se a bioactividade do BDNF produzido nas duas linhas de células CHO, descritas anteriormente. Os sobrenadantes em bruto foram ensaiados com gânglios da raiz dorsal de pinto embrionário (E8) e registou-se o crescimento para o exterior de neurites. Consistentemente com as experiências de marcação metabólica, a linha celular DGC-N/B-2.5-#23 parecia produzir aproximadamente cinco (5) vezes mais BDNF maduro em relação à linha celular DGZ1000-B-3-2.5. Por exemplo, o crescimento para o exterior de neurites máximo foi conseguido com 10 μΐ de sobrenadante derivado de células DGC-N/B-2.5-#23 ao passo que eram necessários 50 μΐ de sobrenadante de DGZ1000-B-3-2.5 para conseguir a bioactividade máxima de DRG (Figura 2). 74 586 6526-056-118
•sP"' -30- 7.3
COMPARAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NGF USANDO REGIÕES PREPRO DE NGF COMPRIDA E CURTA
As células COS foram transfectadas com NGF prepro contendo a região comprida (,,lmNGFH) ou curta ("smNGF") do NGF prepro com a região de codificação do NGF maduro. Os sobrenadantes da cultura foram recolhidos 48 horas após a transfecção e ensaiados em explantes de DRG, em conjunto com o NGF purificado e um sobrenadante de células COS falsamente transfectadas. Os resultados usando três concentrações diferentes de cada construção, como se mostra na Tabela 1, revelam bioactividade significativa do NGF expresso com qualquer uma das formas comprida e curta da região prepro. TABELA 1
Efeito dos Vários Sobrenadantes de Células COS em Explantes de DRG AMOSTRA DILUIÇÃO DRG (-) CONTROLO NGF io ng/ml 0, 0, 0, 0, 0,5 5+,5+,5+,5+,5+ FALSA 10 jLíl 0, 1, 1, 1, 1 50 JL6l 0,5, 1, 1, 1, 1,5 100 μΐ 0,5, 0,5, 1, 1, 1 250 μΐ 2, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5 smNGF 10 μΐ 2, 3, 3, 3, 3,5 50 μΐ 5, 5, 5, 5, 5 100 μΐ 5+, 5+, 5+, 5+, 5+ 250 μΐ 5+, 5+, 5+, 5+, 5+ lmNGF 10 μΐ 2, 2, 2, 2, 2 50 μΐ 4, 4, 4, 4, 4 100 μΐ 5, 5, 5, 5, 5 250 μΐ 5, 5, 5, 5, 5 74 586
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7.4.CONCLUSÕES
Conclui-se destes estudos que a porção pro comprida do NGF é melhor adequada para o processamento do BDNF em células CHO do que a porção pro curta do BDNF. As vantagens da construção de gene quimérica proNGF/BDNF maduro, consiste em permitir maiores níveis de expressão de BDNF numa base por célula em células de mamífero. Adicionalmente, deve permitir melhores esquemas de purificação para o BDNF por não aparecerem formas contaminantes de BDNF não processado nos sobrenadantes em bruto.
Para além disso, a utilização da região prepro comprida ou curta do NGF resulta na expressão de NGF biologicamente activo. Isto indica que a região prepro comprida ou curta do NGF pode ser utilizada na construção de genes neurotróficos quiméricos.
8. EXEMPLO: CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DA QUIMERA NT-3 PREPRO/BDNF
8.1. CONSTRUÇÃO DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUIMÉRICAS
Obteve-se um fragmento de ADN de Hindlll-Xhol contendo toda a região de codificação do BDNF prepro e maduro humano a partir de digestão do plasmideo pC8hB com as enzimas de restrição correspondentes. O plasmideo pC8hB foi derivado por clonagem das sequências de codificação do BDNF humano, incluindo toda a região prepro, no vector de expressão pCDM8 (discutido supra). este fragmento foi ligado em pDSRa2 (ver Pedido de Patente Europeia Publicado 90305433.6, Publicação EPO Νδ 0398753A2, incorporada aqui para referência na sua totalidade. O plasmideo pDSRa2 tinha sido previamente digerido para tornar disponíveis os sítios de clonagem δ'-ΗΐηάΙΙΙ e 3/-Sall, para ligação do fragmento contendo BDNF humano. O plasmideo resultante foi designado pDSRa2(BDNF).
Para a geração de um plasmideo quimérico com uma sequência NT-3 prepro e uma sequência BDNF madura, prepararam-se três fragmentos de ADN como se segue, e em seguida ligaram-se numa orientação específica. Um fragmento de ADN 5/-HindIII/3/-NarI de 74 586 6526-056-118 -32-
aproximadamente 400 pb contendo toda a sequência de BDNF prepro humano sofreu delecção por digestão com enzima de restrição a partir do plasmideo de expressão pDSRa2(BDNF) descrito anteriormente. Um fragmento de ADN recuperado desta digestão continha todo o vector de expressão pDSRa2 e a sequência de BDNF humano maduro, limitada pelos sítios 5'-HindIII e 3#-NarI (fragmento de ADN marcado Nal). Um fragmento de ADN δ'-ΗίηάΙΙΙ/^'-SacII de aproximadamente 300 pares de bases, contendo a região prepro da NT-3 humana, foi obtido através de digestão do plasmideo pC8hN3 com as enzimas de restrição correspondentes. Sequências de codificação, correspondendo a 35 resíduos de aminoácido da região prepro da NT-3, sofreram delecção a jusante do sítio SacII como uma consequência da digestão. 0 plasmideo pC8hN3 foi derivado por clonagem das sequências de codificação de NT-3 humana, incluindo toda a região prepro, no vector de expressão pCDM8. 0 fragmento de 300 pares de bases 5/-HindIII/3/-SacII foi marcado fragmento de ADN Na2. Finalmente, preparou-se o fragmento de ADN Na3, que era um ligador oligonucleotídico sintetizado para regenerar os 35 resíduo de aminoácido em falta, anteriormente referidos (Figura 6 e SEQ ID N2:15-17). O ligador também continha os meios sítios dos sítios de restrição 5'-SacII e 3'-Narl para promover a ligação aos fragmentos de ADN N8s 1 e 2 descritos supra. Esta ligação resultou no vector de expressão pDSRa2(NT-3/BDNF), em que a região prepro da NT-3 (fragmento Ns2) está ligada ao BDNF maduro (fragmento Nal) pelo ligador oligonucleotídico (fragmento Na3; Figura 6 e SEQ IDNa:15).
8.2. EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DA QUIMERA NT-3/BDNF EM CÉLULAS CHO
Usaram-se células CHO-D(-) (número de acesso ao ATCC CCL 61) para gerarem linhas estáveis para produção de BDNF bioactivo. As células CHO-D(-) não têm o gene codificando a di-hidrofolato--redutase e são mantidas no meio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM), suplementado com aminoácidos não essenciais de MEM, 1% de cada uma de penicilina e estreptomicina, 10% de soro de bovino fetal, hipoxantina e timidina. As células CHO-D(-) (0,8xl06/placa 74 586 6526-056-118 -33-
fosfato de cálcio, usando 2,5 μg da construção quimérica NT-3/BDNF [pDSRa2(NT-3/BDNF)] linearizado previamente por digestão com enzima de restrição Pvul. Este vector (pDSRa2) codifica um minigene da di-hidrofolato-redutase de ratinho (dhfr) que, quando expresso, permite às células CHO-(-) transfectadas ultrapassarem a deficiência no gene dhfr e tornarem-se capazes de crescerem na ausência dos nucleótidos hipoxantina e timidina. As células CHO-D(-) progenitoras ou as células transfectadas sem sucesso pelo vector pDSRa2 não sobreviverão nos meios de selecção, que tem a composição do meio de manutenção descrito anteriormente, com a excepção de o soro de bovino fetal ser substituído por soro de bovino fetal dialisado e a hipoxantina e a timidina serem omitidas. As células foram tripsinizadas e semeadas 48 horas após a transfecção a lxlO5 células /placa de 100 mm em meios de selecção. As colónias individuais foram recolhidas duas semanas mais tarde usando cilindros de clonagem. Cada clone foi expandido em placas de 100 mm. Quando as culturas atingiram a confluência, os meios originais contendo soro foram aspirados e substituídos com 3 ml de meios isentos de soro. Os meios condicionados (CM) foram recolhidos e carregou-e 50 μΐ de cada um num gel de pliacrilamida-SDS a 15% e submeteram-se a electroforese em gel. A transferência de Western do gel foi realizada com antissoro de coelho específico para o BDNF maduro. Como se mostra na figura 7, todos os clones expressando o BDNF original a partir de pDSRa2(BDNF) segregaram formas múltiplas de BDNF não processado, para além da forma madura, processada de BDNF. A razão de formas não processadas para forma processada era de cerca de 2:1. Em contraste, todos os clones expressando NT-3/BDNF quimérico a partir de pDSRa2(BDNF) segregaram apenas a forma totalmente processada, madura do BDNF sem precursores parcialmente processados detectáveis.
Um litro de meios condicionados isentos de soro de um dos clones NT-3/BDNF quiméricos foi submetido a purificação por passagem através de uma coluna de S-Sepharose seguida por uma coluna de exclusão de tamanhos Sephacryl S-200. A análise por
74 586 6526-056-118 -34- SDS-PAGE e a determinação da sequência de aminoácidos mí que tinha sido obtida uma proteína homogénea com uma massa molecular de 14 kD (tal como previsto para o BDNF maduro humano), com uma sequência N-terminal única de acordo com a sequência N-terminal do BDNF humano maduro. Para além disso, demonstrou-se por ensaio de gânglios da raiz dorsal de pinto (descrito para a quimera NT-3/BDNF, supra) que o BDNF purificado possuía actividade biológica completa.
8.3. EXPRESSÃO EM CÉLULAS COS E BIOACTIVIDÃDE DA QUIMERA NT—3/BDNF
Usaram-se células COS-7 (número de acesso ao ATCC CRL 1651) como sistema de expressão transiente para testar a produção de BDNF bioactivo. As células COS-7 são rotineiramente mantidas em D-MEM com 10% de soro de bovino fetal e 1% dos antibióticos penicilina e estreptomicina. As células COS-7 (5xl06 células/ml) foram transfectadas por electroporação a 1600 volt durante 0,4 ms com, individualmente, 20 μg de cada um de pDSRa2, pDSRa2(BDNF) e pDSRa2(NT-3/BDNF). As células COS-7 transfectadas foram plaqueadas a 2xl06 células/placa de 60 mm. Recolheu-se meio condicionado acumulado entre 24 e 72 horas após transfecção. Avaliou-se a bioactividade graduando o crescimento para o exterior de neurites de gânglios da raiz dorsal de pinto (E8) (tal como para a quimera NGF/BDNF). Tal como se mostra na tabela 2, o isolados clonais Cl 1 e Cl 20 do pDSRa2(NT-3/BDNF) quimérico eram aproximadamente 5 vezes mais activos do que o BDNF maduro expresso a partir de pDSRa2(BDNF), contendo este último a região prepro inalterada do BDNF. (SEGUE TABELA 2)
74 586 6526-056-118 -35- TABELA 2
Ensaio de Explantes de DRG de Pinto de Meios Condicionados a Partir de Células COS Transfectadas com ADN Plasmídico 1- 1 FONTE DE ADN -Γ 1 Volume de 1--, | Graduação do cresci- 1 1 Meio testado | mento para o exterior | 1 I μ,Ι | de neurites 1 J_ 1 |pDSRa2 1 1 10 o O ** o o o 1 I 50 10, 0, 0, 0,5, 0,5 | I 1 |pDSRa2(BDNF) 1 1 10 1 1 |0, 0,5, 0,5, 0,5, 0,5 | 1 I 50 |1, 1/ 1/ 1/5, 1/5 | I I |pDSRa2(NT-3/BDNF), 1 CI 2 | 10 1 1 |1, 1, 1/5, 1,5, 1,5 | 1 I 50 |2,5, 2,5, 2,5, 2, 2 | |pDSRa2(NT-3/BDNF), 1 CI 20 | 10 1 1 |1/ 1/ 2, 2, 2 | 1 1 _L 50 |2,5, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5 J 1 1
8.4. CONCLUSÕES
Estes estudos demonstram que a substituição da região prepro do BDNF com a região prepro de NT-3 facilita o processamento proteolítico da região prepro e aumenta significativamente o rendimento líquido do BDNF maduro. Além disso, o sítio de clivagem reconstituído entre as sequências de ADN de NT-3 prepro e BDNF maduro foi reconhecido com precisão pela célula hospedeira sem qualquer alteração no terminal NH2 do BDNF processado, maduro. Tal como com a construção de gene quimérico de NGF/BDNF, a construção de gene quimérico de NT-3/BDNF resulta em níveis mais elevados de BDNF processado na base de uma célula em células de mamíferos e isto deve também permitir melhores esquemas de purificação por eliminação e minimização de formas contaminantes não processadas.
74 586 6526-056-118 -36- 0 presente invento não deve ser limitado em âmbito pelas concretizações específicas aqui descritas. De facto, várias modificações do invento, para além das descritas aqui tornar-se--ão evidentes para os peritos na arte a partir da descrição anterior e das figuras que a acompanham. Estas modificações destinam-se a cair dentro do âmbito das reivindicações em anexo. São aqui citadas várias publicações e pedidos de patente, sendo as suas descrições incorporadas para referência nas suas totalidades.
Lisboa, 13. íiQ'!. 1992
Por RE6ENER0N PHARMACEUTICALS, INC. e AMGEN, INC. =0 AGENTE 0FICIAL=
Claims (50)
- 74 586 6526-056-118 -1- REIVINDICACÔES 1 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos, caracterizados por compreenderem (a) uma região prepro de uma primeira neurotrofina e (b) uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente à forma madura de uma segunda neurotrofina, em que a primeira e segunda neurotrofinas são diferentes.
- 2 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos, caracterizados por compreenderem (a) uma região prepro de uma primeira neurotrofina e (b) uma sequência de aminoácido biologicamente activa, substancialmente equivalente a uma porção da forma madura de uma segunda neurotrofina, em que a primeira e segunda neurotrofinas são diferentes.
- 3 - Proteína prepro quimérica de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por a primeira e segunda neurotrofinas serem seleccionadas de entre o grupo consistindo em factor de crescimento do nervo, factor neurotrofico derivado do cérebro e neurotrofina-3,
- 4 - Proteína prepro quimérica de acordo com a reivindicação 2 caracterizada por a primeira e segunda neurotrofinas serem seleccionadas de entre o grupo consistindo em factor de crescimento de nervo, factor neurotrofico derivado do cérebro e neurotrofina-3.
- 5 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por a região prepro ser a região prepro comprida do factor de crescimento de nervo.
- 6 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 2, caracterizados por a região prepro ser a região prepro comprida do factor de crescimento de nervo.
- 7 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por a região prepro ser a 74 5866526-056-118 -2 região prepro curta do factor de crescimento de nervo
- 8 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 2, caracterizados por a região prepro ser a região prepro curta do factor de crescimento de nervo.
- 9 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por a primeira neurotrofina ser neurotrofina-3.
- 10 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 2, caracterizados por a primeira neurotrofina ser neurotrofina-3.
- 11 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação l, caracterizados por a primeira neurotrofina ser factor neurotrofico derivado do cérebro.
- 12 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 2, caracterizados por a primeira neurotrofina ser factor neurotrofico derivado do cérebro.
- 13 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizados por a segunda neurotrofina ser factor neurotrofico derivado do cérebro.
- 14 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizados por a segunda neurotrofina ser factor neurotrofico derivado do cérebro.
- 15 - Proteína prepro ou péptido prepro quiméricos de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizados por a segunda neurotrofina ser factor neurotrofico derivado do cérebro.
- 16 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 1.74 586 6526-056-118 -3-
- 17 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 2.
- 18 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 3.
- 19 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 4.
- 20 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 5.
- 21 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 6.
- 22 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 7.
- 23 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 8.
- 24 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 9.
- 25 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 10.
- 26 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína 74 586 6526-056-118 -4-prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 11.
- 27 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência núcleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 12.
- 28 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 13.
- 29 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 14.
- 30 - Molécula de ácido nucleico caracterizada por compreender uma sequência nucleotídica que codifica a proteína prepro ou o péptido prepro quiméricos da reivindicação 15.
- 31 - Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada por ser um vector.
- 32 - Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada por ser um vector.
- 33 - Célula recombinante caracterizada por conter o vector da reivindicação 31.
- 34 - Célula recombinante caracterizada por conter o vector da reivindicação 32.
- 35 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a forma madura da segunda neurotrofina.
- 36 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado74 586 6526-056-118 -5- por compreender cultivar uma célula recombinante molécula de ácido nucleico da reivindicação 2, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a porção da forma madura da segunda neurotrofina.
- 37 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 3, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a forma madura dá segunda neurotrofina.
- 38 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 4, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a porção da forma madura da segunda neurotrofina.
- 39 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 5, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a forma madura da segunda neurotrofina.
- 40 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 6, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a porção da forma madura da segunda neurotrofina.
- 41 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 7, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e 74 586 c^··; SW v .....,> 6526-056-118 -6-processados pela célula de modo a produzir a forma madura da segunda neurotrofina.
- 42 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 8, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a porção da forma madura da segunda neurotrofina.
- 43 - Processo de produção de uma neurotrofina caractérizadó por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 9, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a forma madura da segunda neurotrofina.
- 44 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 10, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a porção da forma madura da segunda neurotrofina.
- 45 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 11, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a forma madura da segunda neurotrofina.
- 46 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 12, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a porção da forma madura da segunda neurotrofina. -7- 74 586 6526-056-118
- 47 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 13, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a forma madura da segunda neurotrofina.
- 48 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 14, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a forma madura da segunda neurotrofina.
- 49 - Processo de produção de uma neurotrofina caracterizado por compreender cultivar uma célula recombinante contendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 15, sob condições tais que a proteína ou péptido prepro quiméricos sejam expressos e processados pela célula de modo a produzir a forma madura da segunda neurotrofina.
- 50 - Processo de acordo com a reivindicação 35 ou 36 caracterizado por a forma madura produzida da segunda neurotrofina ou a sua porção serem capazes de exibir actividade neurotrófica. Lisboa, 13. »·*- í992 Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. e AMGEN, INC. =0 AGENTE 0FICIAL=
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