PT1029059E - Hidróxi-fenil piruvato dioxigenase mutada, sequência de adn e obtenção de plantas contendo este gene tolerante aos herbicidas - Google Patents

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Descrição "Hidróxi-fenil piruvato dioxigenase mutada, sequência de ADN e obtenção de plantas contendo este gene tolerantes aos herbicidas" A presente invenção diz respeito a uma sequência de. ácidos nucleicos que codifica para uma hidróxi-fenil piruvato dioxigenase (HPPD) mutada, um gene quimérico contendo esta sequência como sequência de codificação e sua utilização para obtenção de plantas resistentes a determinados herbicidas.

As hidróxi-fenil piruvato dioxigenases são enzimas que catalisam a reacção de transformação do para-hidróxi-fenil-piruvato (HPP) em homogentisato. Esta reacção dá-se na presença de ferro (Fe2+) na presença de oxigénio (Crouch N. P. & al., Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, 1997). Pode-se pôr a hipótese que as HPPD contêm um centro activo apto a catalisar esta reacção no qual se ligam o ferro, o substracto e a molécula de oxigénio, um tal centro activo nunca tinha sido descrito até ao momento.

Conhecem-se além disso determinadas moléculas inibidoras desta enzima que se fixam à enzima de uma forma competitiva para inibir a transformação de HPP em homogentisato. Algumas destas moléculas encontraram uma utilização como herbicidas na medida em que a inibição da reacção nas plantas conduz a um branqueamento das folhas das plantas tratadas e à morte das ditas plantas (Pallett K. E. et al. 1997 Pestic. Sei. 50 83-84). Os tais herbicidas que apresentam como alvo a HPPD descrita no estado da técnica são em particular os isoxazois (EP 418175, EP470856, EP487352, EI-527036, EP560482, EP682659, US5424276) em particular o isoxaflutole, o herbicida selectivo do milho, os dicetonitrilos (EP496630, EP496631), 2 em particular a 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-SO2CH3-4-CF3 fenil)-propano-1,3-diona e a 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-S02CH3-4-2,3C12 fenil)-propano-1,3-diona, as tricetonas (EP625505, EP625508, US5,506,195) em particular a sulcotriona ou ainda os pirazolinatos.

Para tornar as plantas tolerantes aos herbicidas dispõe-se de três estratégias principais, (1) a destoxificação do herbicida por uma enzima que vem transformar o herbicida, ou o seu metabolito activo em produtos de degradação não tóxicos como por exemplo os enzimas de tolerância ao bromoxinil e ao basta (EP 242 236, EP 337 899); (2) a mutação da enzima alvo numa enzima funcional mais sensível ao herbicida, ou no seu metabolito activo, como por exemplo os enzimas tolerantes ao glifosato (EP 293 356, Padgette S. R. & al. J. Biol. Chem., 266, 33, 1991); ou (3) a sobre-expressão do enzima sensível de maneira a produzir na planta quantidades suficientes de enzima alvo em relação às constantes cinéticas deste enzima em relação ao herbicida de maneira a se ter enzima suficientemente funcional, apesar da presença do seu inibidor.

Esta terceira estratégia que foi descrita para obter com sucesso plantas, tolerantes aos inibidores de HPPD (WO 96/38567) foi estendida pela primeira vez a uma estratégia de sobre-expressão simples da enzima alvo sensível (não mutada) sendo utilizada com sucesso para conferir às plantas uma tolerância a um nível agronómico a um herbicida.

Apesar do sucesso obtido com estas estratégias de simples sobre-expressão da enzima alvo, permanece necessário melhorar o sistema de tolerância aos inibidores de HPPD para obter uma tolerância, quaisquer que sejam as condições de cultura das plantas tolerantes, ou as doses comerciais de aplicação de herbicidas nos campos. 3 A presente invenção diz respeito por isso em primeiro lugar a uma HPPD mutada que sendo funcional,- isto é conservando as suas propriedades de catálise da transformação de HPP em homogentisato é menos sensível aos inibidores de HPPD que o HPPD nativo antes da mutação.

No que diz respeito ao carácter competitivo da inibição emite-se a hipótese de que os inibidores de HPPD vêm ligar-se à enzima no centro activo desta última, ou na proximidade deste de maneira a bloquear o acesso da HPDD a este centro activo e impedir a sua transformação na presença de ferro e de oxigénio. Efectuando uma mutação que limita o acesso do inibidor ao centro activo da enzima preservando o acesso da HPP a este último podem-se obter enzimas mutadas funcionais, menos sensíveis aos inibidores de HPPD.

Constatou-se agora que efectuando uma mutação da enzima na sua parte C-terminal era possível obter HPPD funcionais menos sensíveis aos inibidores de HPPD de maneira a que a sua expressão nas plantas permita uma tolerância melhorada aos inibidores de HPPD. A presente invenção diz respeito a uma HPPD mutada funcional, menos sensível aos inibidores de HPPD compreendendo pelo menos uma mutação na sua parte C-terminal.

Por "mutação" entende-se de acordo com a invenção a substituição de um aminoácido da sequência primária por um outro aminoácido. Será utilizada a' seguir a expressão "aminoácido mutado" para designar o aminoácido substituído por um outro, designando o local da mutação na sequência primária da proteína.

Foram descritos vários HPPD no estado da técnica e a sua sequência primária, em particular os HPPPD de bactérias como Pseudomonas (Ruetschi & al. Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), de plantas como a Arabidopsis 4 (WO 96/38567, Genebank AF047834), ou de cenoura (W096/38567, Genebank 87257), de Coccicoídes (Genebank COITRP), ou de mamíferos como o rato ou o porco. 0 alinhamento destas sequências conhecidas, através dos métodos habituais do estado da técnica, como por exemplo o método descrito por Thompson, J. D. & al. (CLUSTAL W: Improving the sensitivity of Progressive multiple séquence alignment through séquence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids research, 22:4673-4680, 1994) e o acesso a estes programas informáticos de alinhamento de sequências acessíveis por exemplo via internet, o perito no estado da técnica pode definir as homologias da sequência em relação a uma sequência de referência, e encontrar os aminoácidos chaves, ou definir ainda as regiões comuns em particular definindo uma região de C-terminal e uma região de N-terminal a partir desta sequência de referência.

Para a presente invenção a sequência de referência é a sequência de Pseudomonas, todas as definições e indicações de posições de aminoácidos específicos são feitas em relação à sequência primária de HPPD da Pseudomonas. A figura 1 em anexo representa um alinhamento de várias sequências de HPPD descrita no estado da técnica, alinhadas em relação à sequência de HPPD de Pseudomonas como referência compreendendo a sequência de HPPD da Streptomyces avermitilís (Genebank SAV11864), de Daucus carotta (Genebank DCU 87257), de Arabidopsis thaliana (Genebank AF047834), de Zea mais, de Hordeum vulgare· (Genebank HVAJ693), de Mycosphaerella graminlcola (Genebank AF038152), de Coccicoides immitis (Genebank .COITRP) e de Mus musculus (Genebank MU54HD). A numeração dos aminoácidos aminados da sequência da Pseudomonas é dada por esta figura, o passando-se o mesmo com os aminoácidos comuns a estas sequências designadas com um asterisco. Na base de um 5 tal alinhamento é fácil 'de identificar a partir da definição do aminoácido de Pseudomonas pela sua posição e pela sua natureza, correspondendo a posição do aminoácido a outra sequência de HPPD (o alinhamento de sequências de diferentes origens, plantas, mamíferos, bactérias, mostrando que este método de alinhamento bem conhecido do perito no estado da técnica pode ser generalizado a qualquer outra sequência). Um alinhamento de diferentes sequências de ΗΡ-DD é igualmente descrito no pedido de patente de invenção WO 97/49816. A parte de C-terminal das HPPD, sede do centro activo da enzima distingue—se por um péptido de ligação da sua parte N-terminal, assegurando a estabilidade da enzima e a sua oligomerização (a HPPD da Pseudomonas é um tetrâmero, as das plantas são dímeros) como mostra a representação esquemática da estrutura ternária do monómero, da HPPD da Pseudomonas representada pela Figura 2. Esta estrutura foi obtida através dos métodos habituais de estudo por difracção de raios-X de cristais.. 0 péptido de ligação vai permitir definir a extremidade N-terminal da parte C-terminal da enzima, situando-se o dito péptido entre os aminoácidos 145 e 147 para a Pseudomonas (cf. figura 1). A parte de C-terminal pode então ser definida como sendo constituída pela sequência definida de um lado pelo péptido de ligação, e pelo outro lado por uma extremidade C-termínal da enzima, a mutação efectuada na parte C-terminal da HPPD é então efectuada na zona definida deste modo. No alinhamento de sequências representado na figura 1 em anexo, nota-se para todas as sequências dois aminoácidos na posição 161 e 162 para a sequência de Pseudomonasr (D=Aspl61 e H=Hisl62). Por referência à HPPD de Pseudomonas pode-se então definir que o péptido de ' ligação representando a extremidade N-terminal da parte C-terminal 6 da HPPD situa-se aproximadamente entre dos aminoácidos 5 e 15 a montante do aminoácido Asp 161.

De acordo com um modo preferencial de realização da invenção a mutação é efectuada nos aminoácidos que são substituídos por aminoácidos com um impedimento estereoquímico superior ou ainda um dos aminoácidos ionizados, ou ionizáveis. De preferência a mutação é efectuada sobre os aminoácidos com impedimento estereoquímico fraco. Por aminoácido de impedimento estereoquímico fraco entende-se de preferência de acordo com a invenção a glicina ou os aminoácidos de impedimento estereoquímico fraco como a alanina, a cisteína, a serina...

Todo o aminoácido de impedimento estereoquímico superior ao do aminoácido substituído pode ser utilizado para a mutação de acordo com a invenção. De forma preferencial os aminoácidos serão substituídos do local da mutação pelos aminoácidos seguintes: leucina, isoleucina, ou triptofano.

Por aminoácido ionizado ou ionizável entende-se de acordo com a invenção todo o aminoácido que apresenta para além dos . grupos que participam na ligação péptídica, um grupo amino, ácido carboxílico (COQH), ou ainda amónio, ou -C00-. Trata-se de preferência dos aminoácidos seguintes: glutamina e ácido glutâmico ou asparagina, ou ácido aspártico.

De acordo com uma concretização preferencial da invenção, a mutação será efectuada num aminoácido da parte C-terminal comum as várias sequências de HPPD, estes últimos podem ser identificados através do método de alinhamento de sequências.

De acordo com uma concretização particular da invenção, a HPPD mutada compreende na sua parte C-terminal, a sequência péptídica seguinte: -Gly-Phe-Xaa-Yaa-Xab-Asn-Phe-Yab-Yac-Leu-Phe- 7 em que Xaa e Xab representam independentemente um do outro a glicina (Gly), ' ou um aminoácido de impedimento estereoquimico superior à glicina entendendo-se que se um Xaa ou Xab representa Gly, então o outro é diferente de Gly,

Yaa representa um aminoácido qualquer, de preferência Ala, Lys ou Glu*,

Yab representa um aminoácido qualquer de preferência Lys, Ser, Arg ou Asn*, e

Yac representa qualquer aminoácido, de preferência Ala, Glu ou Gin*,

De maneira vantajosa pelo menos um dos Xaa, ou Xab representa Leu, Glu, Trp ou Ile.

Tomando como referência a sequência de HPPD da Pseudomonas os aminoácidos mutados são escolhidos entre os aminoácidos seguintes: Pro215, Gly298, Gly332, Phe333,

Gly334, Gly336 e Asn337, mais preferencialmente os aminoácidos Pro2l5 e Gly336.

Entre os exemplos de mutações preferidas citam-se as mutações seguintes Pro215Leu, Gly33.6Glu, Gly336Trp, ou Gly336Ile.

Entende-se que as mutações descritas acima podem ser combinadas duas a duas, como por exemplo uma mutação dupla dos aminoácidos Gly334 e Gly336. A presente invenção diz respeito igualmente a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma HPPD mutada descrita acima. De acordo com a presente invenção entende-se por "sequência de ácido nucleico" uma sequência nucleótidica que pode ser do tipo de ADN ou ARN, de preferência do tipo ADN, em particular de cadeia dupla, seja de origem natural, ou sintética, em particular uma sequência de ADN para a qual os codões que codificam para HPPD mutada de acordo com a invenção terão sido optimizados em função do organismo hospedeiro no qual 8 ela será expressa, estes métodos de optimização são bem conhecidos do perito no estado da técnica. A sequência que codifica para uma HPPD de origem não mutada pode ser de qualquer origem. Em particular, ela pode ser de origem bacteriana. Como exemplos interessantes podem-se citar bactérias do tipo Pseudortionas sp., por exemplo Pseudomonas fluorescens, ou ainda as cianobactérias do tipo Synechocystis. A sequência pode ser também de origem vegetal, em particular resultante de plantas dicotiledóneas, tais como o tabaco, Arabidopsis, de ombellifères tais como Daucus caxottà, ' ou ainda monicotiledóneas tal como Zea mais, ou o trigo, ou então a cevada. As sequências codificadoras e o meio de as isolar e clonar sâo descritas nas referências citadas anteríormente, sendo ó seu conteúdo aqui incorporado por referência. A mutação poderá ser efectuada na sequência de ácido nucleico que codifica para HPPD de origem não mutada por qualquer método adequado para substituir na dita sequência o codão que codifica para o aminoácido mutado pelo codâo correspondente ao aminoácido que vem de substituir, estando os ditos çodões descritos largamente na literatura e bem conhecidos do perito no estado da técnica. Vários processos da biologia molecular permitem realizar esta mutação.

Um primeiro processo consiste em submeter as culturas de células a uma pressão de selecção longa com um inibidor de HPPD na presença, ou não de um agente mutagénico, mutando então o gene de HPPD espontaneamente sob o efeito desta pressão de selecção e eventualmente do agente mutagénico, evoluindo o gene de tal maneira que codifica para uma enzima mutada permitindo a expressão da actividade de HPPD nas condições em que a enzima não modificada é inibida parcialmente, ou na sua totalidade. As células podem ser células vegetais ou bactérias e no segundo caso, 9 elas podem exprimir uma HPPD nativa (de origem bacteriana), ou uma HPPD de uma outra origem (bacteriana, fungos, algas, plantas), introduzida na bactéria utilizada para a mutagénese sob uma forma adequada permitindo a expressão desta HPPD, tendo o gene que codifica para HPPD nativo da dita bactéria, no caso de existir sido suprimido. Tais meios de transformação de bactérias são bem conhecidos do perito no estado da técnica, e abundantemente descritos na literatura, assim como meios de mutação (em particular: Sambroock & al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

No caso da célula ser uma célula vegetal que exprime uma HPPD nativa, a HPPD mutada pode ser isolada e clonada, ou ainda as plantas podem ser regeneradas a partir de culturas celulares de acordo com os métodos usuais. As plantas obtidas deste modo exprimem então uma HPPD mutada funcional menos sensível aos inibidores de HPPD que a HPPD nativa. Os métodos de regeneração encontram-se abundantemente descritos na literatura (compreendendo as referências citadas anteriormente) e bem conhecidas do perito no estado da técnica. A selecção das células que apresentam uma HPDD mutada menos sensível aos inibidores de HPPD é efectuada por meio de um instrumento de rastreio adequado. No que diz respeito ao objecto da presente invenção e da solução pesquisada uma HPPD menos sensível aos inibidores de HPPD, um instrumento de rastreio de realização simples consiste em determinar as doses de inibidor de HPPD que inibem a 100% os HPPD de origem não mutados, letais para as células que exprimem esta HPPD não mutada, de submeter as células após mutação a esta dose determinada, de isolar as células mutadas que resistiram a esta dose letal, depois isolar e clonar o gene que codifica para a HPPD mutada. 10

Esta operação de mutagénese por cultura celular foi efectuada num grande número de células de Pseudomonas que exprimem a sua HPPD nativa (ver em particular os exemplos específicos descritos a seguir). Em todos os casos, os mutantes isolados através do método de selecção definido acima foram mutantes que apresentam uma mutação na parte C-terminal da HPPD.

Um outro processo de preparação de uma sequência de ácido nucleico mutada de acordo com a invenção e da proteína correspondente consiste em efectuar uma mutagénese dirigida sobre um ou vários aminoácidos seleccionados previamente, por exemplo identificando os aminoácidos comuns a várias sequências na parte C-terminal, ou ainda procurando reproduzir numa HPPD de origem determinada uma mutação obtida por mutagénese aleatória (cultura de células) numa HPDD de uma outra origem. Os processos de obter estas mutações dirigidas .são bem conhecidos do perito no estado da técnica e largamente descritos na literatura (em particular: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, Edited by M. J. McPherson, IRL, Press) , ou para aquelas em que se pode utilizar os kits comerciais (por exemplo o U.S.E. Mutagenesis Kit de la Societé PHARMACIA). Em todos os casos, é útil de utilizar após esta mutagénese dirigida o mesmo método de selecção das HPPD mutadas menos sensíveis que a HPPD não mutada correspondente utilizada para a mutagénese aleatória descrita acima. A presente invenção diz então respeito igualmente a um processo de preparação de uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma HPPD mutada de acordo com a invenção; estando o dito processo definido acima. A invenção tem ainda como objectivo a utilização de uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma HPPD mutada de acordo com a invenção num processo para a transformação de plantas, como gene marcador, ou como 11 sequência de codificação permitindo conferir à planta uma tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD. Evidentemente esta sequência pode igualmente ser utilizada em associação com outro(s) gene(s) marcadore(s) e/ ou sequência(s) codificante(s) para uma ou várias propriedades agronómicas. A presente invenção diz igualmente respeito a um gene quimérico (ou cassete de expressão) compreendendo uma sequência de codificação, tal como elementos de regulação na posição 5' e 3' heterólogos que podem funcionar num organismo hospedeiro, em particular as células vegetais ou as plantas, a sequência de codificação compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma HPPD mutada, tal como definida anteriormente.

Por organismo hospedeiro entende-se qualquer organismo mono ou pluricelular, inferior, ou superior, no qual o gene quimérico de acordo com a invenção pode ser introduzido para a produção de HPPD mutada. Tratam-se em particular de bactérias, por exemplo E. coli, de leveduras, em particular dos géneros Saccharomyces ou Kluyveromyces, Pichia, de fungos, em particular Aspergillus, de um baculovirus, ou de preferência células vegetais e plantas.

Por "célula vegetal" entende-se de acordo com a invenção toda a célula originária de uma planta e que pode constituir tecidos indiferenciados, tais como os dos caules, de tecidos diferenciados tais como os dos embriões, partes de plantas, plantas, ou sementes.

Entende-se por "planta" de acordo com a invenção todo o organismo multicelular diferenciado capaz de fotosintese, em particular de monocotiledóneas ou dicotiledóneas, mais particularmente plantas de cultura destinadas, ou não à alimentação animal, ou humana, como o milho, trigo, colza, soja, arroz, cana de açúcar, a beterraba, o tabaco, o algodão etc. 12

Os elementos de regulação necessários à expressão da sequência de ácido nucleico que codifica para uma HPPD são bem conhecidos do perito no estado da técnica em função do organismo hospedeiro. Compreendem em particular sequências promotoras, activadores de transcrição, sequência de terminação incluindo os codões de iniciação e de paragem. Os meios e métodos para identificar e seleccionar os elementos de regulação são bem conhecidos pelo perito no estado da técnica e largamente descritos na literatura. A invenção diz respeito mais particularmente à transformação de plantas. Comò sequência de regulação promotora nas plantas pode-se utilizar qualquer sequência promotora de um gene que se exprime naturalmente nas plantas em particular um promotor que se exprime em particular nas folhas das plantas, como por exemplo os promotores ditos constitutivos de origem bacteriana, virai, ou vegetal, tal como por exemplo um promotor de histona, tal como descrito no pedido de patente de invenção EPQ507698, ou um promotor de actina de arroz de um gene de virus da planta, tal como por exemplo, o do mosaico da Λ couve flor (CAMV 19S ou 35S), ou ainda os promotores ditos dependentes da luz como o de um gene da pequena sub-unidade da ribulose-biscarboxilase/oxigenase (RuBisCO), ou pode ser utilizado qualquer promotor adequado conhecido.

De acordo com a invenção pode-se igualmente utilizar em associação com a sequência reguladora promotora, outras sequências de regulação que estão situadas entre o promotor e a sequência de codificação, tais como os activadores de transcrição ("amplificadores"), como por exemplo o activador de translação do vírus do mosaico do tabaco (TMV) descrito no pedido de patente WO 87/07644, ou virus etch do tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed.

Como sequência de regulação de terminação ou de poliadenilação pode-se utilizar qualquer sequência 13 correspondente de origem bacteriana, como por exemplo o terminador de Agrobacterium tumefaciens, ou ainda de origem vegetal, como por exemplo um terminador de histona, tal como o descrito no pedido de patente de invenção EPO633317.

De acordo com uma concretização particular da invenção utiliza-se em 5' a sequência de ácido nucleico que codifica para uma HPPD mutada, uma sequência de ácido nucleico que codifica para um péptido de trânsito, estando esta sequência disposta entre a região promotora e a sequência codificadora por HPPD de maneira a permitir a expressão de uma proteína de fusão péptido de trânsito/ HPPD mutada, estando esta última definida anteriormente. 0 péptido de trânsito permite dirigir a HPPD mutada nos plastos, mais particularmente nos cloroplastos, a proteína de fusão é clivada entre o péptido de trânsito e a HPPD mutada na passagem através da membrana dos plastos. O péptido de trânsito pode ser simples como um péptido de trânsito de EPSPS (descrito na patente de invenção.US 5,188,642), ou um péptido de trânsito da pequena sub-unidade de ribulose-biscarboxilase/oxigenasè (ssu RuBisCO) de uma planta, compreendendo eventualmente alguns aminoácidos da parte N-terminal da ssu . RuBisCO de uma planta, compreendendo eventualmente alguns aminoácidos da parte N-terminal da ssu RuBisCO madura (EP189707), ou ainda um péptido de trânsito múltiplo compreendendo um primeiro péptido de trânsito de planta fusionada a uma parte da sequência N-terminal de uma proteína madura de localização plastidial fusionada a um segundo péptidó de trânsito da planta, tal como descrito na patente de invenção EP 508909, e mais particularmente o péptido de trânsito optimizado compreendendo um péptido de trânsito da ssu RuBisCO de turnesol fusionado com 22 aminoácidos de extremidade N-terminal da ssu RbisCO de milho fusionado com o péptido de trânsito da ssu de RuBisCO 14 de milho com a sua sequência codificadora, tal como descrito na patente EP508909. A presente invenção diz igualmente respeito à proteina de fusão péptido de trânsito/HPPD mutada, estando os dois elementos desta proteina de fusão definidos mais acima. A presente invenção diz respeito igualmente a um vector de clonagem e/ ou de expressão para a transformação de um organismo hospedeiro contendo pelo menos um gene quimérico, tal como definido acima. Este vector compreende para além do gene quimérico acima, pelo menos uma origem de replicação. Este vector pode ser constituído por um plasmideo, um cosmideo, um bacteriófago, ou um virus, transformados pela introdução de um gene quimérico de acordo com a invenção. Tais vecto.res de transformação em função do organismo hospedeiro a transformar são bem conhecidos pelo perito no estado da técnica e largamente descritos na literatura. Para a transformação de células vegetais, ou de plantas trata-se em particular de um virus que pode ser utilizado para a transformação de plantas desenvolvidas e contendo além disso os . seus ' próprios elementos de replicação. e de expressão. De forma preferencial, o vector de transformação das células vegetais, ou das plantas de acordo com a invenção é um plasmideo. A invenção tem ainda como objecto um processo de transformação dos organismos hospedeiros, em particular das células vegetais por integração de pelo menos uma sequência de ácido nucleico, ou de um gene quimérico, tal como definido acima, transformação que pode ser obtida por qualquer meio conhecido adequado, amplamente descrito na literatura especializada e particularmente as referências citadas no presente documento, mais particularmente pelo vector de acordo com a invenção. 15

Uma série de métodos consiste em bombardear as células, os protoplastos, ou os tecidos com as partículas às quais se encontram ligadas as sequências de ADN. Uma outra série de métodos consiste em utilizar como meio de transferência na planta um gene quimérico inserido num plasmideo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou Ri de Agrobacterium rhizogenes. Podem ser utilizados outros métodos, tais como a injecção- riticro ou electroporação, ou ainda a precipitação directa por meio de PEG. 0 perito no estado da técnica fará a escolha do método adequado em função da natureza do organismo hospedeiro, em particular da célula vegetal, ou da planta. A presente invenção tem ainda como objecto os organismos hospedeiros, em particular as células vegetais ou plantas transformadas e contendo um gene quimérico compreendendo uma sequência codificadora para uma HPPD mutada definida acima.

A presente invenção tem ainda como objectivo as plantas contendo células transformadas, em particular as plantas regeneradas a partir de células transformadas. A regeneração é obtida através de qualquer processo adequado que dependa da natureza das espécie, como por exemplo descrito nas referências abaixo. Para os processos de transformação das células: vegetais e de regeneração de plantas cita-se em particular as patentes e os pedidos de patentes de invenção seguintes: US 4,459,355, US 4,536,475, US' 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4, 495, 050, US 5, 036, 006, US 5,100,792, US 5,371,014, US . 5,478,744, US5,179,022, US5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5, 445, 765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP539 563, EP 674 775, WO 91/02071 e WO 95/06128. 16 A presente invenção diz respeito igualmente às plantas transformadas resultantes de cultura e/ ou de cruzamento das plantas regeneradas acima, assim como as sementes das plantas transformadas contendo células transformadas.

As plantas transformadas podem ser obtidas de acordo com a invenção podendo ser do tipo monocotiledóneas, tais como por exemplo os cereais, a cana de açúcar, o arroz e o milho, ou as dicotiledóneas como por exemplo o tabaco, a soja, a colza, o algodão, a beterraba, o trevo, etc. É igualmente um objecto da invenção um processo de eliminação de ervas selectivo de plantas, em particular de culturas com o auxilio de um inibidor de HPPD em particular um herbicida definido anteriormente, caracterizado por se aplicar este herbicida nas plantas transformadas de acordo com a invenção tanto em pré-sementeira, na pré-emergência como na pós-emergência da cultura. A presente invenção diz respeito igualmente a um processo de controlo de ervas daninhas à superfície de um campo compreendendo sementes ou plantas transformadas com o gene quimérico de acordo com a invenção, cujo processo consiste em aplicar na dita superfície do campo .uma dose tóxica para as ditas ervas daninhas de um herbicida inibidor de HPPD, sem contudo afectar de maneira substancial as sementes, ou as plantas transformadas com o dito gene quimérico de acordo com a invenção. A presente invenção diz respeito igualmente a um processo de cultura de plantas transformadas de acordo com a invenção com um gene quimérico de acordo com a invenção, cujo processo consiste em semear as sementes das ditas plantas transformadas numa superfície de um campo adequada para a cultura das ditas plantas, a aplicar à superfície do dito campo uma dose tóxica para as ervas daninhas de um herbicida que tem como alvo a HPPD definida acima, no caso das ervas daninhas se encontrarem presentes sem afectar de 17 maneira substancial as ditas semente ou as ditas plantas transformadas, e depois a recolher as plantas cultivadas, assim que elas chegam à maturidade desejada e eventualmente a separar as sementes das plantas recolhidas.

Nos dois processos acima, a aplicação do herbicida que tem como alvo a HPPD pode ser feita de acordo com a invenção, tanto na pré-sementeira como na pré-emergência, ou na pós- emergência da cultura.

Por herbicida no sentido da presente invenção entende-se um principio activo herbicida individualmente, ou associado a um aditivo que modifica a sua eficácia como por exemplo um agente que aumenta a actividade (sinergistica) ou limitante da actividade (em inglês safener). Os herbicidas inibidores da HPPD foram anteriormente definidos em particular. Evidentemente para a sua aplicação prática, os herbicidas acima encontram-se associados de uma maneira ela própria conhecida aos adjuvantes de formulações utilizados habitualmente em agroquímica.

Quando a planta transformada de acordo com a invenção compreende um outro gene tolerante a um outro herbicida (como por exemplo um gene que codifica para uma EPSPS mutada, ou que não confere à planta uma tolerância ao glyphosate), ou quando a planta transformada é naturalmente insensível a um outro herbicida, o processo de acordo com a invenção pode compreender a aplicação simultânea ou desfasada no tempo de um inibidor de HPPD em associação com o dito herbicida, por exemplo o glyphosate. É ainda objecto da invenção a utilização de um gene quimérico que codifica para uma HPPD mutada como gene marcador ao longo do ciclo "transformação-regeneração" de uma espécie vegetal e de selecção no herbicida acima.

Todos os métodos ou operações descritas abaixo nestes exemplos são dados a título de exemplos e correspondem a uma escolha efectuada entre os diferentes métodos 18 disponíveis para chegar ao mesmo resultado. Esta escolha não possui nenhuma incidência sobre a qualidade do resultado e como consequência, todo o método adaptado pode ser utilizado pelo perito no estado da técnica para chegar ao mesmo resultado. A maior parte dos métodos de engenharia dos fragmentos de ADN são descritos em "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 e 2, Ausubel F. M. et al., publicados por Greene Publishing Associates et Wiley-Interscience (1989) ou em Molecular cloning, T.. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, 1982.

Exemplo 1: Teste de rastreio colorimétrico de mutanfces que apresentam uma tolerância à 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-SQ2-CH3-4-CF3 fenil) propano-1,3-diona pRP C: o vector pRP A (descrito no pedido de patente de invenção WO 96/38567) contendo um fragmento de ADN genómico e a região codificante da HPPD de Pseudomonas fluorescens A32 foi digerido por Ncol, purificado e depois ligada no vector de expressão pKK233-2 (Clontech) ele próprio digerido por Ncol, local de clonagem único deste vector. A orientação do gene no vector pRP C obtido deste modo permitindo a expressão sob o controlo do promotor trc foi verificada.

Um meio de cultura do tipo caldo YT a 1% de agarose (ultra pur Gibco BRL) e a 5 mM de L-Tyrosina (Sigma) contendo o agente de selecção do vector pRP C acima é alimentado a uma placa de 96 poços a uma razão de 100 μΐ por poço. 10 μΐ de uma cultura de E. coli em fase de crescimento, exponencial contendo o vector pRP C' é alimentado a cada poço. Após 16 horas a 37°C os poços que não contêm o meio de cultura, ou os que foram inoculados com uma cultura de E. coli contendo o vector PKK233-2 são translúcidos, enquanto que os poços inoculados com uma 19 cultura de E.. coli contendo o vector pRP C são de cor castanha.

Foi efectuada uma gama com meio de cultura idêntico contendo as concentrações variáveis (0 mM a . 14 mM) de 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-metilsulfonil-4“ trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona (EP 0 496 631) solubilizado em água e levado a pH 7,5. Esta molécula é um dicetonitrilo, reconhecido como sendo um inibidor eficaz de actividade HPPD (Pallett, K. E. et al. 1997. Pestic. Sei. 50, 83-84). Observa-se uma ausência total de coloração na cultura bacteriana contendo o vector pRC a 7 mM do composto acima.

Os mutantes de HPPD obtidos por mutagénese dirigida, assim como obtidos por mutagénese aleatória foram selecciònados por escurecimento do meio contendo 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona a uma concentração de 7 mM como será mostrado a seguir.

Foram obtidos resultados idênticos substituindo a 2-ciano-3-ciclopropil-l-^-metilsulfonil-é- trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona pela 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-(metiltio)fenil)-propan-1,3-diona e pela 2-(2-cloro-3-etóxi-4-(etilsulfonil) benzoil)-5-metil-l,3-ciclohexanodiona, (WO 93/03009) utilizadas respectivamente a 3,5 mM e 7 mM,

Estes resultados confirmam que um teste . baseado na actividade de HPPD, qualquer que seja a origem desta actividade permite identificar as actividades da HPPD que apresentam uma tolerância aos inibidores de actividade de HPPD da familia dos isoxazoles, tal como das tricetonas.

Exemplo 2: Mutagénese aleatória do gene de HPPD da Pseudomonas fluorescens A32 com o auxilio da hidróxilamina 20 O ADN plasmidico de uma cultura de E. coli contendo o vector pRP C descrito abaixo foi extraído utilizando o protocolo padrão. Este ADN foi colocado na presença da hidróxilamina, agente químico mutagénico provocando a substituição da citosina por timidina durante uma hora a 80°C utilizando um protocolo padrão. A estirpe DH10B de E. coli K12 foi transformada com o ADN plasmidico potencialmente mutado obtido deste modo. A utilização do teste de rastreio colorimétrico descrito no exemplo 1 permitiu identificar após rastreio vários milhares de clones potencialmente mutados capazes de escurecer o meio, isto é de transformar o HPPD em homogentisato mesmo na presença de 7 mM de 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona.

Após sequenciação dos’ diferentes mutantes revelou-se que a utilização deste instrumento de mutagénese/rastreio permitiu isolar 4 mutantes distintos correspondentes a 3 locais de mutação distintos: -primeiro local: a prolina 215 foi substituída por uma leucina, mutante designado PfL215 - segundo loca.l: a glicina 334 foi substituída por uma serina, mutante designado por PfS334 a glicina 334 foi substituída por um ácido aspártico, mutante chamado PfD334 - Terceiro local: a glicina 336 foi substituída por um ácido serina mutante chamado PfS336

Estes três locais mutados permitem obter uma tolerância melhorada em relação à HPPD não mutada encontram-se localizados na parte C-terminal da proteína. 21

Os clones derivados do clone pRP C que contêm a região codificante do gene de HPPD da Pseudomonas fluorescens A32 contendo uma ou várias mutações são denominadas pRP C seguido do nome da ou das mutações efectuadas como por exemplo pRP C PfL215 ou pRPC PIS336 (ou ainda simplesmente pela única designação do ácido aminado mutado, como por exemplo PfL215 ou PfS336, salvo indicação em contrário, quanto à origem da HPPD mutada). A ou as modificações por mutagénese aleatória podem ser efectuadas em qualquer proteina possuindo uma actividade do tipo HPPD isto é transformando o 4-hidróxi fenilpiruvato em homogentisato, em que a região de codificação é ou.poderia ser clonada. Os HPPD descritos neste texto são entre outros os de P. fluorescens, Arabidopsis thalíana, Daucus carotta, Zea mais e Syne.chocystis, mas é claramente evidente para o perito no estado da técnica- que todas estas aplicações são aplicáveis aos outros HPPD.

Exemplo 3: Mutagénese dirigida do gene de HPPD de Pseudomonas fluorescens A32 por analogia de sequência.

Para o alinhamento das sequências proteicas de HPPD de Pseudomonas fluorescens A32, Arabidopsis thalíana, de rato, de porco e de Coccicoides..., é possível escolher entre os aminoécidos que se encontram conservados nas diferentes sequências um determinado número dentro deles para lhes efectuar uma mutação e obter HPPD tolerantes: poder-se-ia adicionar ao alinhamento, apresentado na figura 1, sequências de outras HPPD descritas na literatura. 0 alinhamento destas sequências diferentes põe claramente em evidência que uma das regiões melhores conservadas se situa entre a glicina na posição 332 e a fenilalanina 342. Não só esta região é muito conservada, mas além disso ela engloba as duas glicinas na posição 334 22 e 336 identificadas por mutagénese aleatória (a negrito no alinhamento das sequências e marcadas com um asterisco).

Foi efectuada uma mutagénese sobre o vector pRP C utilizando o kit U.S.E. de mutagénese da Pharmacia. Os oligonucleótidos foram utilizados para as mutagéneses da fenilalanina 333, da glicina 334, da glicina 336 e da asparagina 337·, mas também para aquelas dos mutantes duplos das glicinas 334 e 336 como indicado nos esquemas seguintes (identificadores de sequências em anexo, SEQ ID N° 1 a 12):

Mutagénese de PHE333, substituída unicamente por Trp

Oligo 1: GAAGTTGCCC TCGCCCCACC CATCGTCGCC CTT

Mutagénese de. PHE333, substituída unicamente.por LEU & ILE

Oligo 2: GAAGTTGCCC TCGCCRAKCC CATCGTCGCC CTT

Mutagénese de GLY334, substituída unicamente por TRP

Oligo 3: CTTGAAGTTG CCCTCCCAAA ACCCATCGTC GCC

Mutagénese de GLY334, substituído unicamente por ASP

Oligo 4: CTTGAAGTTG CCCTCGTCAA ACCCATCGTC GCC

Mutagénese de GLY334, substituída unicamente por SER

Oligo 5: CTTGAAGTTG CCCTCGCTAA ACCCATCGTC GCC

Mutagénese de GLY334, substituída unicamente por LEU & ILE

Oligo 6: CTTGAAGTTG CCCTCRAKAA ACCCATCGTC GCC

Mutagénese de GLY336, substituída unicamente por ASP,

Oligo 7: CAGCGCCTTG AAGTTGTCCT CGCCAAACCC ATC Mutagénese de GLY336, substituída unicamente por GLU Oligo 8: CAGCGCCTTG AAGTTYTCCT CGCCAAACCC ATC Mutagénese de GLY336, substituída unicamente por TRP Oligo 9: CAGCGCCTTG AAGTTCCACT CGCCAACCC ATC Mutagénese de GLY336, substituída unicamente por ile Oligo 10: CAGCGCCTTG AAGTTDACTC GCCAAACCCA TC-Mutagénese de GLY334 & GLY336, substituída por todos os outros aminoácidos è portanto com a possibilidade de obter um mutante duplo

Oligo 11: CGCTTGAAGT TNNNCTCNNN AAACCCATCG TC 23

Mutagénese de ASN337, substituída unicamente por LEU & ILE Oligo 12: GAACAGCGCC TTGAARAKGC CCTCGCCAAA CCC

Após triagem com a 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfeníl)-propan-1,3-diona entre várias centenas de mutantes potenciais foram identificados 15 novos mutantes em que 12 são mutantes'. simples e 3 são mutantes duplos (ver tabela de recapitulação) que apresentam uma tolerância ao inibidor 2-ciano-3- ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil) -propan-1,3-diona no nosso teste de detecção colorimétrico. É preciso acrescentar que determinados mutantes identificados no decurso destas mutagéneses dirigidas são idênticos aos mutantes identificados no exemplo 2 {como por exemplo PfS334 e PfD334;) .

Foi possível combinar mutações não apenas nas regiões próximas, como é o caso para obter os mutantes duplos na posição 334 e 336, mas também nas regiões afastadas como no. caso da obtenção de mutantes duplos na posição 215 e 336 como indicado a seguir. pRP C PÍL215 Delta: 0 ADN plasmídico do clone pRP C PfL21 foi dirigido Pstl, purificado, depois novamente ligado. 0 primeiro local Pstl situa-se ao nivel da Leucina 289 e o último local situa-se no local de clonagem múltipla de PKK233.2, o clone obtido pRPC PfL215 delta, contém a parte da sequência de codificação de HPPD PfL215 incluindo a mutação Pro215Leu, mas não a parte terminal, nem a parte genómica. PRP C PÍL215 W336, PRP C PÍL215 E336, PRP C PfL215 1336:

Os ADN . plasmídicos dos clones pRP CPÍW336, pRP CpfE336, pRP CPfl336 foram digeridas por Mlul e HindIII, Mlul situam-se na parte codificante de HPPD de Pseudomonas fluorescens ao nivel do ácido aspártico 254, HindIII situa-se no local de clonagem múltipla do PKK223.3. Os fragmentos 24 contendo as partes C-terminais dos HPPD mutados, tal como a parte genómica foram purificados, depois ligados no plasmídeo pRP C PfL215 Delta, digerido por Mlul e HindIII. Os três clones obtidos deste modo são equivalentes ao clone pRP C PfL215, mas contêm respectivamente também a mutação W336, E336 e 1336.

Os mutantes obtidos são identificados como se segue:

Mutantes simples:

Fenilalanina 333 substituída por triptofano chamado PfW333 Fenilalanina 333 substituída por leucina Glicina 334 substituída por chamado PÍL333 triptofano Glicina 334 substituída por chamado PÍW334 prolina Glicina 334 substituída por chamado ΡΪΡ334 leucina Glicina 334 substituída por chamado PfL334 isoleucina Glicina 336 substituída por chamado Pf1334 ácido aspártico chamado PfD336 Glicina 336 substituída por glutamina Glicina 336 substituída por chamado PfQ336 ácido glutárico chamado PfE336 Glicina 336 substituída por triptofano Glicina 336 substituída por chamado PÍW336 isoleucina chamado Pf1336 Asparagina337 substituída por leucina chamado PfL337

Mutantes duplos obtidos por mutagénese dirigida:

Glicina 334 substituída por alanina e

Glicina 336 substituída por alanina chamado PÍA334-A336 25

Glicina 334 substituída por alanina e

Glicina 336 substituída por arginina chamado PfA334-R336

Glicina 334 substituída por serina e

Glicina 336 substituída por arginina chamado PfS334-R336

Mutantes duplos obtidos por clonagem:

Prolina 215 substituída por leucina e

Glicina 336 substituída por triptofano chamado PÍL215-W336

Prolina 215 substituída por. leucina e

Glicina 336 substituída por ísoleucina chamado PÍL215- 1336

Este resultado mostra que é possível por mutagénese dos aminoácidos conservados entre as sequências proteicas de diferentes HPPD localizados na parte C-terminal, de obter as HPPD que. apresentam uma tolerância aos inibidores de actividade de HPPD. Assim, toda a região conservada entre as diferentes sequências de aminoácidos de HPPD é um bom alvo para obter mutantes que são interessantes de analisar para determinar a sua tolerância. É evidente que faz parte da invenção toda a mutação ou mutação múltipla que permite obter uma HPPD tolerante, mesmo se esta proteína não se encontra exemplificada neste texto. É também bem demonstrado que o domínio C terminal é bem o alvo privilegiado da mutagénese de uma HPPD tendo em vista uma boa tolerância da enzima aos seus diferentes inibidores. Com efeito, no domínio N-terminal definido como indo do aminoácido n° 1 ao péptido de ligação definido 26 anteriormente para as Pseudomonas fluorescens A32, ou ao seus correspondentes nos HPPD de outras espécies torna-se muito difícil de definir uma região conservada. A ou as modificações por mutagénese dirigida a partir de informações deduzidas de um alinhamento de sequência podem ser feitos em qualquer proteína possuindo uma actividade do tipo HPPD, isto é de transformação de 4-hidróxifenilpiruvato em homogentisato, em que a região de codificação é ou poderá ser clonada. Os HPPD descritos neste texto são entre outros os de P. fluorescens, Arabidopsis thaliana, Daucus carota, Zea mais e

Synechocystis, mas é claramente evidente que todas estas modificações são aplicáveis às outras HPPD.

Exemplo 4: Mutagénese dirigida do gene de HPPD de

Pseudomonas fluorescens A32.

Os resultados obtidos pòr mutagénese aleatória como descrito no exemplo 2, assim como os obtidos após o alinhamento das diferentes sequências mostram claramente que o péptido que vai de F#333 a F#338 (numeração do HPPD de P. fluorescens) é uma região particularmente interessante em termos de mutagénese para obter uma tolerância.

Paralelamente a esta informação constatou-se através de uma análise da estrutura tridimensional' da enzima de Pseudomonas fluorescens estirpe A32 por exemplo (figura 1) que a parte C-terminal da proteína do seu monómero contém o centro catalítico da enzima. São portanto os aminoácidos deste domínio C-terminal que é preciso mutar prioritariamente, quando se espera modificar a interacção da proteína inibidora e obter deste modo uma enzima mais tolerante. 27

Procurou-se então por análise da estrutura tridimensional da proteína HPPD de P. fluorescens, as mutações pontuais que poderiam acarretar uma alteração conformacional do hexapéptido Phe333 a Phe338 sem mutar directamente este péptido. A ideia directriz é que a mutação de um aminoácido suficientemente afastado do centro activo, um aminoácido não conservado pode influenciar o posicionamento no espaço deste péptido de Phe333 a Phe338 e induzir deste modo uma ' tolerância aos inibidores de HPPD por efeito de "ricochete".

Procurou-se então na estrutura os aminoácidos próximos deste hexapéptido; um número pequeno de aminoácidos respondem a este critério, como o ácido aspártico 287 e a glicina 298 (a título informativo o átomo de carbono alfa da glicina. 334 do hexapéptido está a 9,61 angstroms do átomo do ferro situado no centro catalítico e o carbono alfa da glicina 298 está a 5,75 angstroms do da glicina 334). Esta glicina 298 pareceu ser o melhor candidato ente os dois aminoácidos, uma vez que toda a mutagénese vai conduzir a um aminoácido com uma cadeia lateral de maior dimensão e substituiu-se esta glicina por um ácido glutâmico (em que a cadeia lateral está além disso carregada negativamente) tendo em vista uma modificação suficientemente sensível para que o efeito seja visível.

Além disso, quando se efectua a mutação da glicina 298 por um ácido glutâmico a cadeia lateral deste ácido glutâmico que é muito impedida "esbarra" com a estrutura secundária em folha beta na qual se encontra o motivo conservado LLQIF. A fenilalanina 312 deste motivo encontra-se ela própria muito próxima do ferro.

Testou-se a mutação Gly298 em Glu298.

Esta mutação de Gly298 em Glu298 foi criada por mutagénese dirigida (U.S.E. Mutagenesis Kit, Pharmacia) do vector pRP 28 C utilizando o oligonucleótido n° 13 (identificador da sequência em anexo-SEQ ID N°13): GLY298 substituído porácido qlutâmico

Oligo 13: GCCTTCCACGGAAGATTCGTCCAGCAGGATACC

Este mutante chamado PfE298 provoca o escurecimento do meio de rastreio contendo 7 mM de RPA202248 (vér tabela de recapitulação).

Isto confirma que com o .conhecimento da estrutura tridimensional da HPPD pode-se determinar um determinado número, de mutações eficazes em termos de tolerância aos inibidores de HPPD, quer seja de origem bacteriana, vegetal, ou outra. Com efeito, é realmente possível modelar a estrutura não importa de qual HPPD de que se possui a sequência proteica, uma vez que se conhece a estrutura precisa no caso : da HPPD dê P. fluorescens. Esta modelação será sobretudo interessante no caso da modelação do domínio C-terminal, o melhor conservado ' em termos de sequência primária ' e sobretudo o mais prometedor em termos ' de tolerância aos· inibidores de. HPPD. . A ou as modificações por mutagénese dirigida a partir de informações deduzidas da estrutura tridimensional de uma HPPD modelada, ou determinada por análise dos cristais obtidos na presença, ou na ausência de um inibidor, podem ser feitas a todas as proteínas que possuem uma actividade do tipo de HPPD, isto é de transformação do 4-hidróxifenilpiruvato em . homogentisato, em que a' região codificadora é ou pode ser clonada. As HPPD descritas no presente documento são entre outras as de P. fluorescens, Ãrabidopsis thallanaf Daucus carotar Zea mais e

Synechocystis, mas é claramente evidente para o perito no estado da técnica que todas estas modificações são aplicáveis às outras HPPD. 29

RvCTnpio 5; Expressão de HPPD mutantes de Pseudomonas fluorescens no tabaco A) Construção dos genes quiméricos PRP-VB3: 0 ADN do vector binário pBI121 (Clontech) foi digerido HindIII e Xbal, as extremidades foram completadas com os dNTP com o auxilio da pfu polimerase (Stratagène) , o vector foi purificado. 0 ADN do clone pRP-S descrito no exemplo 2 do pedido no pedido PCT 96/38567 e compreendendo o encadeamento "promotor de histona dupla-TEV-OTP-gene de. HPPD-terminador Nos" foi digerido por HindIII e Saci, as extremidades foram completadas com dNTP com o auxilio da pfu polimerase (Stratagène), a inserção foi purificada e depois ligada no . vector purificado descrito anteriormente. A orientação foi verificada por digestão Sall. 0 clone pRP-VB3 possui . então a estrutura seguinte de gene quimérico:

RB/ promotor Nos/NPTII/ terminador Nos/ promotor de histona dupla/tev/otp/HPPD truncado/ terminador Nos/LB RBLB = Fronteira direita e' esquerda respectivamente do T-ADN de Agrobacterium tumefaciens

Promotor .Nos = promotor da. nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens NPTII = sequência codificante da neomicina fosfotransferase do tipo II (que.confere resistência à canamicina)

Terminador NOS = sequência de terminação da nopalina sintase da Agrobacterium tumefaciens Promotor de histona dupla = descrito na EP 507 689 Tev= amplificador TEV (Carrington. & Freed) 30

Otp= péptido de trânsito optimizado (EP 508909) pRP-VB3-b: o ADN do cione pRP-VB3 foi digerido por BamHI purificado, depois ligado no vector pZERO-1 (invitrogen) que não contém os locais de restrição BstEII e Sall, digerido por BamHI e purificado. Uma parte do OTP, o gene da HPPD e o terminador Nos são deste modo transferidos para o pZERO-1. pRP-VB3-c: o ADN do cione pRP-VB3-b foi digerido por Sall purificado, depois ligado na presença do adaptador apresentado abaixo (oligonucleótidos 14 e 15-SEQ ID N° 14 e 15 em anexo) de forma a substituir o local de restrição Sall pelo local BstEII, 5' TCGAGAGAGAGGTGACCGAGAGA 3' 3' CTCTCTCCACTGGCTCTCTCTAGCT 5' pRP-VB3-d: o ADN do cione pRP-VB3-c foi digerido por BamHI,. a inserção foi purificada, depois clonado no vector PUC19 (Biolabs) digerido por BamHI. Uma parte do OTP, o gene dè HPPD e o terminador Nos são assim transferidos para o PUC19. pRP-VB3-e: o vector PUC 19 não possui os locais de restrição Pmll e StuI,· o ADN do cione pRP-VB3-d foi digerido por Pmll e Stul, purificado, depois ligado a ele mesmo permitindo- assim suprimir o local Not no gene de HPPD e dè truncar a parte codificante de HPPD de cerca de 500 pares de bases a fim de tornar mais fácil a triagem das colónias transformadas que integraram os HPPD mutantes pRP-VB3-f: o vector pRP-VB3-e foi digerido por Notl, as extremidades foram completadas com os dNTP com o auxílio da pfu polimerase (Stratagèné), o vector foi purificado, digerido por BamHI, purificado e depois clonado no vector PUC 19 digerido por Kpnl, as extremidades completadas com os dNTP com o auxilio da pfu polimerase 31 (Stratagène), purificado, digerido por BamHI, purificado. pRP-VB83-g: o ADN do clone pRP-VB3 foi digerido por BstEII, as extremidades foram completadas com os dNTP com o auxilio da pfu polimerase (Stratagène), o vector foi purificado, depois ligado a ele mesmo permitindo assim a desaparição do local único BstEII deste vector. pRP-VB3-d: o ADN do. clone pRP-VB3-f foi digerido por BamHI e Saci, purificado, depois ligado no vector pRP-VB3-g digerido, por BamHI e Saci e purificado. 0 clone pRP-RD224 possui então a' estrutura seguinte:

RB/ promotor Nos/NPTII/ terminador Nos/ promotor de histona dupla/tev/otp/HPPD truncado/ terminador Nos/LB

Mutantes pRP-RD224: os ADN dos vectorês transportando as '.HPPD mutadas, assim como a HPPD não mutada contida no vector. PKK233-2 foram digeridos por Kpnl e .BstEII, purificados e depois ligados no vector pRP-RD224, digerido por Kpnl e BstEII e- purificados. Os transformantes estando integrados no gene de HPPD mutado foram seleccionados através' da dimensão da inserção por digestão com Kpnl e BstEII. Os clones obtidos são designados como pRP-RD224 ao qual se adiciona o tipo de mutação efectuada.na HPPD, criou-se assim por exemplo a pRP RD224 Pf (para a enzima não mutada) pRP RD224 PfD336 (para a enzima com um ácido .aspártico em 336), pRP RD224 PfQ336 (para a enzima com uma glutamina em 336), pRP RD224 PfL333 (para a enzima com uma leucina em 333), pRP RD224 PfA33~A336 (para a enzima com uma alanina em 334 e em 336, mutante duplo). B) Transformação do Tabaco "Pequeno Havana" 32

Os genes quiméricos descritos anteriormente foram transferidos para o tabaco "Pequeno Havana" de acordo com os processos de transformação e de regeneração já descritos no pedido de patente de invenção europeia EP n° 0 508 909. 1) Transformação: O vector é introduzido na estirpe não oncogénica de Agrobacterium tumefaciens EHA101. 2) Regeneração A· regeneração do tabaco "Pequeno Havana" a ' partir de explantes foliares foi realizada num meio de base Murashige e Skoog (MS) compreendendo 30 g/1 de sacarose, tal como 350 mg/1 , de cefotaxima e de doses variáveis de 2-ciano- l-[4-(metilsulfonil) -2-trifluorometilfenil·]- ' 3— (1— metilciclopropil)- propan-1,3-diona (EP 0 496 630), 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm que é um análogo de 2-ciano-3-ciclopropil“l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil·) -propan-1, 3-diona,. ou directamente de doses de 2 ou 4 ou 8 ppm de 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona. Os explantes foliares são retirados de plantas em estufa e transformados de acordo com a técnica dos discos foliares (Science 1985, vol·. 227, p. 1229-1231) em três etapas sucessivas: - a primeira compreende a indução de rebentos num meio MS aditivado com 30g/l de sacarose contendo 0,05 mg/1 de ácido naftilacético (ANA) e 2 mg/1 de benzilaminopurina (BAP) durante 15 dias e de doses variáveis de herbicidas, a 2-ciano- l-[4-(metilsulfonil) -2-trifluorometilfenil]- 3-(1-metilciclopropil)- propan- 1,3-diona (EP 0 496 630), ou a 2-ciano-3-ciclopropil-l- 33 (2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona). - Os rebentos verdes formados ao longo desta etapa são de seguida desenvolvidos em cultura num meio MS aditivado de 30 g/1 de sacarose e de doses variáveis de herbicidas, mas não contendo hormona, durante 10 dias. Depois retira-se os rebentos desenvolvidos e cultiva-se em meio de enraizamento MS com meio teor em sais, vitaminas e açúcares e doses variáveis de isoxaflutole e não contendo hormona. No final de cerca de 15 dias, os rebentos enraizados são transferidos para a terra. C) Medida da tolerância ao herbicida das plân tuias in-vitro.

As . experiências são realizadas por acção de um agente de selecção com os mutantes indicados na tabela seguinte e mostram que se não se obtêm rebentos/ plântulas para as doses mais . elevadas de herbicida, nos ensaios de transformação/ regeneração com uma HPPD não mutada, pelo contrário os mutantes permitem graças a uma melhor tolerância da enzima de obter plântulas mesmo a doses elevadas de 2-ciano- l-[4-(metilsulfonil) -2- trifluorometilfenil]- 3-(1-metilciclopropil)- propan-1,3-diona (EP 0 496 630), ou de 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2- metílsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona (ver tabela de recapitulação). Estas plântulas obtidas com concentrações elevadas do agente de selecção com uma HPPD mutada e que não se pode obter com HPPD selvagens são completamente normais. . .

No decurso da selecção in vitro com 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorornetilfenil)-propan-1,3-diona a lppm, 2ppm, 4ppm e 8 ppm parece que um determinado número de mutantes não permite a regeneração 34 fácil das plantas- de tabaco transformadas, qualquer que seja a dose de herbicida utilizada, É de salientar de qualquer maneira que podem ser obtidos transformantes com um número maior de ensaios de transformação, e/ ou determinando as concentrações do agente de selecção.

Pelo contrário com os outros mutantes é fácil de obter plântulas verdes e portanto completamente normais. Os mutantes que dão mais plântulas são os .mutantes PfL215, PfD3-36 e PfQ336 (para os mutantes estudados de acordo com este processo).

No decurso da transformação com PfD336

Foi obtido com 25% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 1 ppm, Foi obtido com 25% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 2 ppm, Foi obtido. com 35% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 4 ppm, Foi obtido com 15% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a.8 ppm. No decurso da transformação com PfL215, Foi obtido com 8 % dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 1 ppm, Foi obtido com 60% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 2 ppm, Foi obtido com 8% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 4 ppm, Foi obtido com 24% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 8 ppm. No decurso da transformação com PfQ336, Foi obtido com 35% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 1 ppm, Foi obtido com 25% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 2 ppm, 35

Foi obtido com 40% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 4 ppm, Foi obtido com 0% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a.8 ppm. No decurso da transformação com HPPD não mutado, Foi obtido com 15% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 1 ppm, Foi obtido com 70% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 2 ppm, Foi obtido com 15% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção realizada a 4 ppm, Foi obtido com 0% dos acontecimentos de transformação tolerando a selecção. realizada a 8 ppm..

Estes resultados vêm então confirmar que as HPPD mutadas são estatisticamente mais eficazes que a HPPD selvagem; com os dois mutantes PfD336 e PfL215 é possível obter transformantes com a dose mais elevada de 2-ciano-3-c'iclopropil-1- (2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil) -propan-1,3-diona, quando isto não é possível com a HPPD não mutada.

Além disso com o mutante P.fQ336 são obtidos numerosos acontecimentos de transformação a 4 ppm de 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona, 40% de plântulas, enquanto que com HPPD selvagem uma fraca percentagem de plantas são obtidas a 4 ppm deste herbicida. 36

Tabela recapitulativa dos mutantes de HPPD de P. fluorescens

Tipo de HPPD Actividade no teste de triagem* com uma dose de agente de selecção de % de plântulas verdes obtidas na dose de X ppm de herbicida 0 mM 7 mM Selvagem 10 0 15% a 4 ppm Mutado PfL215 10 7 2 4 % a 8 ppm FfE2 98 8 3 Sem plântulas verdes PfL333 5 4 - PÍW333 — — Sem plântulas verdes Pf5334 7 7 Sem plântulas verdes PfD334 1 1 - PfW334 6 6 - PfP334 5 5 Sem plântulas verdes PfL334 5 4 Sem plântulas verdes Pf1334 5 4 Sem plântulas verdes PfS336 - - - PfD336 2 1 15% a 8 ppm PÍQ336 8 8 40% a 8 ppm PfE336 10 8 - PÍW336 10 9 - Pfl336 10 8 . - PfL337 8 8 Sem plântulas verdes PÍA334-A336 8 8 - PÍA334-R336 8 7 Sem plântulas verdes PfS334-R336 5 5 Sem plântulas verdes *: teste de triagem descrito no exemplo 1.· dados não disponíveis 0 número 10 corresponde a uma actividade forte do mesmo nível que a HPPD não mutada e sem inibidor, o número 0 corresponde a uma actividade nula seja devido a uma inibição completa pela 2-ciano“3-ciclopropil-l-(2- 37 metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona, seja devido a uma mutação que provoca a inactividade da enzima, os números até 9 correspondem a actividades intermédias mais fortes quando o número aumenta no teste de avaliação descrito no exemplo 1.

Os resultados confirmam que a introdução de uma HPPD que apresenta uma tolerância aos inibidores de actividade de HPPD nas plantas confere a estas uma tolerância a estes mesmos inibidores, tolerância que é melhor do que a obtida com uma HPPD não mutada. D) Tolerância in vivo.

Todas as plantas após o enraizamento foram aclimatizadas e conduzidas a sementes.

As sementes de várias cápsulas são misturadas e depois semeadas sobre uma mistura de terra e de areia na razão de cerca de 100 sementes por barqueta de sementeira. O genótipo selvagem de "Pequeno Havana" é incluído como controlo. Os tratamentos são efectuados na razão de 600 g/ha de isoxaflutole formulado. As anotações do aspecto das semente são realizadas 12 horas após o tratamento, a nota 5 é para o melhor aspecto, a nota 1 é para o pior. As médias das observações de vários acontecimentos de transformação (10-20 acontecimentos de transformação por HPPD avaliada) são representativas da tolerância em pré-emergência de HPPD selvagem e das HPPD mutadas.

Estas medições foram efectuadas para vários mutantes de HPPD de Pseudomonas fluorescens nas posições 336 e 215 permitem estabelecer os valores médios de tolerância. no quadro a seguir.

Ensaio 1 2 Pf não mutado 2,06 2,2 38

PfW33 6 - 2,8 PfD336 3, 35 - PÍQ336 2, 94 - PÍL215 3 -

Estes resultados mostram que as HPPD mutadas de acordo com a invenção apresentara nas plantas transformadas uma tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD superior à tolerância obtida com a HPPD nativa correspondente.

Exemplo 6: Mutagénase dirigida do gene de HPPD de Synechocystis.

Escolhe-se um local' de mutação eficaz na HPPD da Pseudomonas , fluorescens em termos de tolerância aos inibidores de HPPD e transpõe-se para uma outra HPPD.

Esta transposição é-feita numa HPPD o mais divergente possível da HPPD da Pseudomonas fluorescens e das outras HPPD . conhecidas. Para fazer isto trabalha-se com o gene codificante para a HPPD de Synechocystis conhecida graças à sequenciação sistemática do genoma desta cianobactéria que nunca foi clonado como tal. Por isso, isolou-se primeiro o gene uma vez que se o fez exprimir em E. coli. 1) obtenção do gene O ADN genómico da cianobactéria Synechocystis PCC6803 foi extraído e purificado utilizando os protocolos padrão. 200 pg deste ADN genómico foram amplificados por reacção de polimerização em cadeia (PCR) utilizando 1,25U de pow polimerase (Bõhringer) no seu tampão num volume reaccional de 50 μΐ com 200 μΜ de dNTP (desóxiribonucleótido-trifósfato) . As sequências de oligonucleótidos sintéticos 15 e 17 (SEQ ID N° 16 e 17 em anexo) utilizadas como 39 iniciadores foram deduzidas da sequência publicada em Genebank de HPPD de Synechocystis.

Oligo 16 ATTATGGAAT TCGACTATCTT Oligo 17 CAGTATTCAT AATGTTAATT ATG 0 programa de amplificação, 5 minutos a 94°C, depois 50 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 49°C, 1 minuto a 72°C, depois 5 minutos a 72°C, foi realizado num aparelho Perkin-Elmer 9600. 2) Clonagem do gene e expressão. 0 fragmento amplificado obtido por PCR foi purificado, digerido por EcoRI, repurifiçado, depois clonado no vector ptrc-99A (Pharmacia) previamente digerido poe EcoRI e Smal. A bactéria JM105 foi transformada pelo plasmídeo recombinante. A sequenciação. permitiu verificar a conformidade do fragmento clonado com a sequência de HPPD de Synechocystis publicado. A actividade da dioxigenase de HPPD de Synechocystis obtido deste modo foi observada por escurecimento do meio utilizando o teste colorimétrico descrito anteriormente (cf. Exemplo 1) com· adição de IPTP (isopropil-p-D-tio-galactopiranozide) na concentração de .1 mM a fim de induzir a expressão da proteína. Nas mesmas condições num meio contendo 7mM de'2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil) -propan-l,'3-diona não há escurecimento do meio, o que confirma a inibição da actividade de HPPD de Synechocystis. pela 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2- metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona. 3) Mutagénese dirigida.

Por alinhamento das sequências proteicas da Pseudomonas fluorescens A32 e de HPPD de Synechocystis 40 PCC6803 estimou-se que as glicinas na posição 334 e 336 de HPPD de Pseudomonas (glicinas indicadas por asteriscos na figura do exemplo 3 e que são muito fortemente conservadas) encontram-se na posição 318 e 320 da HPPD de Synechocystis (a negrito sobre o alinhamento das sequências proteicas na figura 3).

Foram obtidos vários mutantes da posição 334 na Pseudomonas fluorescens, foram realizadas duas experiências de mutagénese dirigida (U.S.E., Pharmacia) utilizando os oligonucleótidos MUGLYA e MUGLYB destinados a substituir a glicina 318 .(de Synechocystis correspondendo à glicina 334 de P. fluorescens) seja em Asparagina,· ou em serina, seja em prolina, ou alanina (SEQ ID N° 18 e 19).

GLY318 substituição possível por SER&ASN Oligo 18 CGGGCAAAAG GATTTARCCA AGGAAACTTT CAAG GLY318, substituição possível por PRO &. ALA Oligo 19 CGGGCAAAAG GATTTSCNCA AGGAAACTTT CAAG

Nas duas experiências os' clones obtidos após mutagénese provocaram o escurecimento do meio de rastreio a 7 mM de. 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona (teste descrito no exemplo 1). Foi sequenciado um mutante de cada experiência. A glicina 318 foi substituída por asparagina designada SyN318 semelhante a PfD334 (no exemplo 3) A glicina318 foi substituída por alanina, designada SyA318 semelhante a PfA334 (no exemplo 3).

Estes resultados confirmam que as mutações que conduzem a uma tolerância colocada em evidência por uma HPPD deu as suas transposições a uma outra HPPD de uma outra espécie, de um outro reino.

Estes resultados confirmam também que as modificações da sequência proteica na parte C-terminal de uma HPPD, qualquer que seja a origem (bateriana, ou outra) podem acarretar uma tolerância melhorada aos inibidores de HPPD. 41

Exemplo 7: Estudo biocpiimico de uma HPPD mutada, mutantes de Synechocystis

Os mutantes SyN318 e SYA318 obtidos no exemplo anterior foram estudados em comparação com a HPPD não mutada de Synechocystis em relação às características bioquímicas de Km e 150 em relação a um inibidor de HPPD que é a 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona. Esta análise foi feita utilizando o protocolo seguinte: a) Medida de actividade A actividade de HPPD é medida . determinando por cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC) a quantidade de produto formada, isto é homogentisato, após incubação da enzima com o seu substracto, HPPD. A injecção de diferentes doses de homogentisato que varia de 12 a 48 nmoles na coluna permite determinar o tempo de retenção do homogentisato e de correlacionar a área do pico com a quantidade de produto injectado.

As medidas de actividade são realizadas num volume final de 200 μΐ contendo: ascorbato a 12,6 mM, ferro (FeH8N208S2, 6H20) a 178 μΜ (previamente preparado no tampão Tris acetato 0,1 M pH 6), 50 pg de extracto bruto contendo HPPD, HPPD a 352 μΜ, e tampão tris acetato 0,1 M pH 7,5. A enzima é incubada durante 1 min a 30 °C com ferro num primeiro período e depois 5 min a 30°C com ascorbato antes do arranque da reacção por adição do substracto o HPP. A incubação é continuada durante 1 min 30 a 30°C, depois a reacção é terminada por adição de 70 μΐ de ácido perclórico a 20%. As proteínas são de seguida eliminadas por centrifugação durante 5 min a 15300 rpm a 20°C. O sobrenadante é recuperado. A quantidade de homogentisato 42 formada é então analisada por injecção de 75 μΐ de ensaios numa coluna Pico Tag C18 ligada ao sistema HPLC. A eluição é realizada com um débito de 1 ml/min. A eluição isocrática realizada é a seguinte: 1-0% de tampão B (seja 100% de tampão A: água, acetonitrilo 3% (v/v), ácido trifluoroacético 0,1% (v/v)) durante 6 minutos; 2 -100% de tampão B (acetonitrilo 100%) até ao minuto 11; 3- 0% de tampão B até ao minuto 19. À saída da coluna o homogentisato é detectado por medida da absorvância a 288 nm. A quantidade de produto formada é definida através da área do pico sobre o cromatograma.

b) Determinação do KM A Km de HPPD para HPP é determinada medindo a velocidade inicial da reacção cora diferentes concentrações de HPP. As reacções são efectuadas nas condições descritas acima com as concentrações de HPP que vão de 5,5 μΜ a 1400 μΜ. c) Determinação de IC50 A IC50 é determinada medindo a velocidade inicial da reacção nas condições descritas acima, após incubação da enzima durante 10 min a 30°C com ferro, ascorbato, substracto a 1056 mícromolar e com concentrações· de inibídor variáveis. A concentrações de 2-ciano-3- ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona utilizada variam de 10”10 a 10-4 M.

Os valores de Km estimados da enzima para o seu substracto isto é o 4-hidróxifenilpiruvato e os valores de 150 estimados a actividades comparáveis são apresentados na tabela seguinte: HPPD nativa SYN318 SyA318 Km 60 μΜ 470 μΜ 320 μΜ 150 8 0 nM 80 μΜ 40 μΜ 43

Estes resultados confirmam que as mutações efectuadas na parte C-terminal da proteína, se influenciam diminuindo a afinidade da enzima para o substracto (Km), influem ainda mais fortemente diminuindo a afinidade da enzima para o inibidor (150) . Com efeito, a proporção. 150 de uma HPPD mutante em 150 de HPPD não mutante (que é a imagem da perda de afinidade para o inibidor) é de 1000 e 500 para SyN 318 e SyA318. respectivamente em que a proporção Km de uma HPPD mutante sobre Km, de HPPD não mutada (que é a imagem da perda de afinidade para o substracto) é de 8 e 5 para SyN 318 e SyA 318 respectivamente. Isto é bem o exemplo que estes dois mutantes possuem uma afinidade um pouco menor para o substracto da enzima, mas sobretudo uma afinidade nitidamente mais fraca para os inibidores da enzima e portanto para\ a 2-ciano-3-ciclopropil-l- (2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona.

Estes resultados confirmam que o teste de triagem colorimétrica descrito no exemplo 1 permite detectar HPPD mutadas que apresentam uma tolerância para os inibidores de actividade de HPPD. Eles validam o instrumento que utilizam para fazer a triagem e identificar os mutantes de HPPD tolerantes aos inibidores de HPPD. Este instrumento de rastreio é rápido e de simples utilização e é por isso que o utilizam, mas é claro que qualquer outro instrumento pode ser utilizado para fazer uma análise semelhante; será possível- de utilizar -um instrumento de triagem que mede a actividade e a sua inibição baseadas no desaparecimento, de HPP (dosagem radioactiva, dosagem espectrofotométrica, ou outra), ou baseado no consumo de oxigénio, ou baseado no aparecimento do homogentisato (com acoplamento de uma outra actividade enzimática) -um instrumento de triagem vivo, como por exemplo o crescimento de bactérias em HPP como única fonte de carbono 44 na presença de inibidores de HPPD permitindo seleccionar os únicos clones com uma HPPD tolerante. -Pode igualmente ser examinada a utilização de um rastreió in vivo nas plantas utilizando vectores de transformação de plantas, sistemas de transformação, sistemas de regeneração e de selecção com um inibidor de HPPD como aqueles descritos no exemplo 5 e 8.

Exemplo 8: Avaliação de HPPD de Synech.ocyst.is não mutada e mutada, SyN318 e SyA318 imitada no tabaco. A) Construção dos genes quiméricos: 0 vector utilizado para fazer â construção permite a expressão de HPPD de Synechocystis (selvagem, ou mutantes) nas plantas de tabaco do tipo PBD6 chama-se pRD224 (descrito no exemplo .5). Este vector foi inicialmente concebido para clonar todos os mutantes de HPPD de Pseudomonas por simples substituição do gene de HPPD truncado deste vector ao nível dos locais Κρη I e BstE II. Pode .igualmente servir de clonagem do gené de HPPD de Synechocystis tendo em vista a criação de uma· planta transgénica. B) Estratégia de clonagem A sequência codificadora para HPPD de Synechocystis é clonada no vector pRD224 por substituição da sequência codificadora para HPPD de Pseudomonas fluorescens truncada. No entanto ela não pode ser clonada directamente entre os locais Κρη I e BstE . II, uma vez que as sequências N terminais dos genes de HPPD de Synechocystis e de Pseudomonas são muito diferentes. Mas a clonagem entre . o local Bam Hl do OTP e o local BstE II é possível. Para'isso 45 é necessário' recriar do lado 5', a montante da sequência de HPPD, o local Bam Hl seguido da parte codificante para a OTP situada a jusante de Bam Hl..

0 gene de HPPD de Synechocystis contido no vector pTRC 99A é amplificado por reacção de polimerização em cadeia (PCR) com o auxílio dos iniciadores A e B. 0 oligonucleótido A permite adicionar o local Bam Hl a montante do gene de HPPD, assim como uma parte da sequênGia de OTP entre o local Bam Hl e o início' do gene.· 0 oligonucleótido B permite adicionar o local BstE II a jusante do gene. Os iniciadores A e B são indicados nas SEQ ID N° .20 e 21: Oligonucleótido GACTATCTTC3' A: 5'nnnnnnnnnn GGATCCGGTG CATGGAATTC Oligonucleótido TTAATTATG3' B: 5' NNNNNNNN.NN GGTCACCAGT ATTCATAATG A reacção de amplificação é realizada a uma temperatura de hibridação de 52°C. Os produtos PCR são de seguida separados em gel de agarose. A banda do ADN correspondente ao gene de .HPPD é cortada e depois purificada.

Este fragmento é de seguida clonado no vector binário. Este é previamente digerido por Bam Hl e BstE II, depois sepiarádo do fragmento correspondente a HPPD truncado sobre o. gel de agarose. Este vector é então purificado da mesma maneira, que o gene de HPPD.

. A ligação ente o vector binário e a inserção é realizada à noite a 16°C pela T4 ADN ligase. A mistura de ligação é utilizada para transformar as células de E. coli. DH10B electrocompetentes. Os clones positivos são seleccionados no meio LB contendo canamicina a 50 pg/ml. A 46 presença da inserção de interesse no vector binário é controlada num gel de agarose após minipreparação e digestão do ADN plasmidico por Bam Hl e Sac I durante 1 hora a 37°C. 0 vector recombinante é então utilizado para transformar células de Agrobecterium tumefaciens EHA105 electrocompetentes. A selecção faz-se em meio LB contendo canamicina a 50 -pg/ml. Este vector recombinante é então portador de um TDNA contendo o gene de resistência à canamicina, e uma sequência de codificação para o conjunto OTP-HPPD Synechocystis sob o controlo do ' promotor de histona dupla e um terminador Nos, C) Transformação/regeneração do tabaco variedade PBD6 A transformação é realizada como é apresentado no exemplo 5, salvo que a selecção é feita primeiro com 200 mg/ml de canamicina.

Pelo contrário os rebentos novos obtidos com canamicina são excisados e transferidos individualmente para um meio desprovido, de hormonas para favorecer o seu enraizamento e contendo 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona para seleccionar as plântulas transgénicas tolerantes a este herbicida.

Trata-se do meio MS (SIGMA M-5519 4,4 g/1) contendo 350 mg/1 de cefotaxina, 1% sacarose (p/v) e 0; ou 8 ppm de 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona. A sobre-produção de HPPD nas células transformadas permite o desenvolvimento de plântulas de clorofila tolerantes a 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorornetilfenil)-propan-1,3-diona, enquanto que as plantas . com origem nas células não transformadas sensíveis ao herbicida aparecem completamente brancas. 47

Após duas semanas, as raizes estão suficientemente desenvolvidas para que as plantas possam ser transferidas para a terra e cultivadas em estufa. D)Resultados A partir de 60 discos foliares em média cerca de 40 rebentos são règenerados por cada construção. Após 2 dias de cultura em meio na presença de 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona determinadas plântulas começam a tornar--s.e brancas. Após 8 horas de enraizamento este branqueamento é suficientemente significativo para ser interpretável. A 8 ppm a 2-ciano-3-ciclopr.opil-1- (2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil) -propan-1,3-diona constata-se que apenas 40% das plantas que contêm a enzima selvagem sobrevivem, contra 72% das plantas que contêm a enzima SyA318 e 88% para aquela que. contém a enzima SYN318. As plantas contendo as enzimas mutadas apresentam por isso uma melhor tolerância que aquelas que çontêm a enzima.selvagem.

Após mais de um mês a 8 ppm de 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propan-1,3-diona o número de plantas verdes para a transformação com a HPPD selvagem é de 0%, para a SyN3l8 esta percentagem é de 17% e para o mutante SyA318 é de 19%.

Paralelamente, se a regeneração é feita com a 2-ciano-l-[4-(metilsulfonil) -2-trifluorometilfenil]- 3—(1— metilciclopropil)- propan-1,3-diona (EP 0 496 630), nas doses de 5 a 10 ppm (um inibidor menos forte do que as HPPD), . os três genes permitem obter plantas morfologicamente completamente conformes. Isto confirma, se fosse necessário que a sobre-expressão de uma HPPD mutada, ou não mutada permite obter uma tolerância no laboratório. 48

Estes resultados parecem estar de acordo com os resultados obtidos in vitro para cinéticas enzimáticas e parece bem possível de estabelecer uma correlação entre as medidas bioquímicas in vitro e os resultados in vivo.

Este último exemplo confirma a coerência pelo menos parcial entre o rastreio in vitro (exemplo 1) análise bioquímica (exemplo 6} e tolerância de uma planta.

Listagem das Sequências (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (1) REQUERENTE:

(A) NOME: RHONE-POULENC AGROCHIMIE (B) RUA: 14-20 Rue Pierre BAIZET (C )CIDADE: lyon (E) PAÍS: França (F) CÓDIGO POSTAL: 69009

(íi) TÍTULO DA INVENÇÃO: HIDRÓXI-FENIL PIRUVATO DIOXIGENASE MUTADA, SEQUÊNCIA DE ADN E OBTENÇÃO DE PLANTAS CONTENDO ESTE GENE TOLERANTES AOS HERBICIDAS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 21

(iv) FORMA A SER LIDA PELO COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Floppy dislc

(B) COMPUTADOR: IBM PC COMPATÍVEL

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Versão #1.-30 (OEB) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO; nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:l: GAAGTTGCCC TCGCCCCACC -CATCGTCGCC CTT 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 2: (í)CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO·: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C .)TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii).TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:2: GAAGTTGCCC TCGCCRAKCC CATCGTCGCC CTT 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:' (A) COMPRIMENTO:. 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:3: CTTGAAGTTG CCCTCCCAAA ACCCATCGTC GCC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 4: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:4: CTTGAAGTTG CCCTCGTCAA. ACCCATCGTC GCC 33 (2) INFORMAÇÃO. PARA A SEQUÊNCIA ID N° 5: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases {B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:5: CTTGAAGTTG CCCTCGCTAA ACCCATCGTC GCC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 6: (i)CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:6: CTTGAAGTTG CCCTCRAKAA ACCCATCGTC GCC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 7.: (i}CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°;7: CAGCGCCTTG AAGTTGTCCT CGCCAAACCC ATC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 8: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:8: CAGCGCCTTG AAGTTYTCCT CGCCAAACCC ATC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 9: (i)CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótído (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:9: CAGCGCCTTG AAGTTCCACT CGCCAAACCC ATC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 10: (i.) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear'

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:10 CAGCGCCTTG AAGTTDACTC GCCAAACCCA TC 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 11: (!)CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D). TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:ll CGCTTGAAGT TNNNCTCNNN AAACCCATCGTC 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° .12: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:12 GAACAGCGCC TTGAARAKGC CCTCGCCAAA CCC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 13: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:13 GCCTTCCACG GAAGATTCGT CCAGCAGGAT ACC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 14: (i)CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C }TIPQ DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN {xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:14 TCGAGAGAGA GGTGACCGAG AGA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 15: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:15 TCGATCTCTC GGTCACCTCT CTC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 16: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN. (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:16 ATTATGGAAT TCGACTATCTT 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 17: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TI.PO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:17: CAGTATTCAT AATGTTAATT ATG ,23 (2) . INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 18: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO.DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:18: CGGGCAAAAG GATTTARCCA AGGAAACTTT. CAAG 34 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:19 CGGGCAAAAG GATTTSCNCA AGGAAACTTI CAAG 34 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 20.: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases. (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

{ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:20:

rf2JlNrf2JNtJNNN GGATCCGGTG CATGGAATTC GACTATCTTC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID N° 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C )TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° :21:, NNNNNNNNNN GGTCACCAGT ATTCATAATG TTAATTATG 39

Lisboa, 8 de Julho de 2008

Claims (31)

1 Reivindicações 1. Hidróxi-fenil piruvato dioxigenase (HPPD) mutada conservando a suas propriedades de catálise do para-hidróxi-fenil-piruvato (HPP) em homogentisato, menos sensível aos inibidores de HPPD que o RHPPD de origem não mutada, caracterizada por compreender pelo menos uma mutação na sua parte C-terminal, em que a dita parte C-terminal é constituída pela sequência proteica que está contida entre o péptido de ligação de um lado e a extremidade C-terminal da enzima pelo outro lado.

2. HPPD mutada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o péptido de ligação representando a extremidade N-terminal da parte C-terminal de HPPD se encontrar localizado entre os aminoácidos 5 e 15 a montante do aminoácido Aspl61, relativo à LHPPD da Pseudomonas.

3. HPPD mutada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1' .ou 2, caracterizada por a mutação ser efectuada nos aminoácidos que são substituídos por aminoácidos de impedimento estereoquímico superior.

4. HPPD mutada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o aminoácido com fraco impedimento estereoquímico ser a glicina (Gly).

5. HPPO mutada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por o aminoácido do local de mutação ser substituído por um dos aminoácidos seguintes: glutamina (Gin), ácido glutâmcio (Glu), leucina (Leu), isoleucina (ILE) ou triptofano (Trp). 2

6. HPPO mutada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por a mutação ser efectuada sobre um aminoácido da parte C-terminal comum a várias sequências de HPPD.

7. HPPD mutada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por compreender na s^ua parte C-terminal, a sequência peptídica seguinte: *j -Gly-Phe-Xaa-Yaa-Xab-Asn-Phe-Yab-Yac-Leu-Phe-+ J em que Xaa e Xab representam independentemente um do outro a glicina (Gly) ou um:, aminoácido. com um.....impedimento estereoquimico superior ao da glicina, entendendo-se que se um Xaa, ou Xab representa Gly, então o outro é diferente de Gly, Yaa representa Ala, Lys. ou Glu., Yab representa Lys, Ser,. Arg, ou Asn,. e Yac representa Ala, Ser, Glu ou Gin.

8. HPPD mutada de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por pelo menos Xaa, ou Xab representarem Leu, Glu, Trp, ou Ile.'

9. HPPD mutada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por Xab representar Glu, Trp, ou Ile, de preferência Trp.

10. HPPD mutada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por que pelo menos relativamente à sequência de HPPD de Pseudomonas, os aminoácidos mutados· serem escolhidos entre os aminoácidos seguintes: Pro215, Gly298, Gly332, Phe333, Gly334, Gly336 e Asn 337, preferencialmen-te os aminoácidos Pro215 e Gly336. 3

11. HPPD mutada de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender uma mutação escolhida entre as mutações seguintes: Pro215Leu, Gly336Glu, Gly338Trp ou Gly3361Ile.

12. Sequência de ácido nucleico que codifica para uma HPPD mutada conservando as suas propriedades de catálise de HPP em homogentisato de acordo com uma das reivindicações 1 a 11.

13. Gene quimérico compreendendo uma sequência de codificação, assim como elementos de regulação na posição 5' e 3' heterólogos que podem funcionar num organismo hospedeiro, em particular as células vegetais, ou as plantas, caracterizado por a sequência de codificação compreender pelo menos- umâ sequência de ácido nucleico que codifica' para . uma HPPD mutada. que conserva as suas propriedades: de catálise da HPP em homogentisato,' tal como definido anteriormente. . .

14. -Gene quimérico de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o organismo hospedeiro ser escolhido entre as bactérias por exemplo, E. coli, as leveduras, em particular das espécies Saccharomyces ou Kluyveromycesf Pichia, os fungos, em particular o Aspergillus, os baculovírus, ou as células vegetais e as plantas.

15. Gene quimérico - de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o organismo hospedeiro ser uma célula vegetal ou uma planta.

16. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender em 5' da sequência de ácidos nucleicos codificante para uma HPPD.mutada, uma sequência' 4 de ácidos nucleícos que codifica para um péptido de trânsito da planta, estando esta sequência disposta entre a região promotora e a sequência codificadora para a HPPD mutada de maneira a permitir a expressão de uma proteína de fusão peptidíca de transição/ HPPD mutada.

17. Proteína de fusão do péptido de trânsito/HPPD mutada, estando a HPPD mutada definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

18. Vector de clonagem e/ ou de expressão, para a transformação de um organismo hospedeiro caracterizado por conter pelo menos um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações' 13 a 16. .

19. Processo de transformação de um organismo hospedeiro, caracterizado por se integrar de maneira estável no dito organismo· hospedeiro pelo menos uma.· sequência de ácidos nucleícos de acordo com a reivindicação 12, ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o organismo hospedeiro ser uma célula vegetal.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se regenerar uma planta a partir da célula vegetal transformada.

22. Organismo hospedeiro transformado em particular célula vegetal, ou planta, caracterizado por conter uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12, ou um 5 gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16.

23. Célula vegetal caracterizada por conter uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12, ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16.

24. Planta transformada caracterizada por conter células transformadas de acordo com a reivindicação 23.

25. Planta de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por ser regenerada a partir de células transformadas de acordo com a reivindicação 23.

26. Planta transformada caracterizada por ter origem em culturas e/ ou no cruzamento de plantas regeneradas, de acordo com. a reivindicação 25.

27. Plantas transformadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizadas por serem escolhidas entre as monoçotiledóneas, em particular os cereais, a .cana de açúcar, o arroz e o milho, ou entre as dicotiledóneas, em particular o tabaco, a soja,· a colza, o algodão, a beterraba e o trevo.

28.. Semente transformada, caracterizada- por conter células transformadas de acordo com a reivindicação 23 e por provir de uma planta transformada de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 2.7·.

29. Processo de controlo de ervas daninhas na superfície de um campo compreendendo sementes de acordo com a reivindicação 28, ou plantas transformadas de acordo com 6 qualquer uma das reivindicações 24 a 27, em que o processo consiste em aplicar na dita superfície do campo uma dose tóxica para as ditas ervas daninhas de um herbicida inibidor de HPPD sem contudo afectar de maneira substancial as sementes, ou ' as plantas transformadas com o dito gene quimérico de acordo com a invenção.

30. Processo de cultura de plantas transformadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, em que o processo consiste em plantar as sementes das ditas plantas transformadas de acordo com a reivindicação 28 numa superfície de um campo adequado à cultura das ditas plantas, a aplicar sobre a dita superfície do dito campo, uma dose tóxica para as ervas daninhas de um herbicida que apresenta como alvo a HPPD no caso de presença de ervas daninhas sem afectar de maneira substancial as ditas sementes, ou as ditas plantas transformadas, e depois em colher as plantas cultivadas, quando elas chegam á maturidade desejada e eventualmente em separar as sementes das plantas colhidas.

31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 ou 30, caracterizado por o inibidor de HPPD ser escolhido entre os isoxazoles, em particular o isoxaflutole, os dicetonitrilos, em particular a 2-ciano-3-ciclopropil-1- (2-SO2CH3-4-CF3 fenil) -propano-1,3-diona e a 2-ciano-3-ciclopropil-l-(2-S02CH3-4-2,3C12 fenil)-propano-1,3-diona, as tricetonas, em particular a sulcotriona, ou os pirazolinatos. Lisboa, 8 de Julho de 2008