PT106916A

PT106916A - Sonda de ácido péptido nucleico, estojo e método para detectar e/ou quantificar escherichia coli o157:h7 e respectivas aplicações

Info

Publication number: PT106916A
Application number: PT106916A
Authority: PT
Inventors: Nuno Filipe Ribeiro Pinto De Oliveira Azevedo; Carina Manuela Fernandes Almeida; José Mário De Sousa; Rui Jorge Alves Rocha; Laura Isabel Macieira Cerqueira; Maria Jo O Lopes Da Costa Vieira
Original assignee: Univ Do Minho; Univ Do Porto; Biomode Biomolecular Determination S A
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2014-10-30
Also published as: WO2014178741A2; PT106916B; US20160273025A1; WO2014178741A3

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AO DESENVOLVIMENTO DE UMA SONDA DE ÁCIDO PÉPTIDO NUCLEICO (PNA) PARA A DETECÇÃO DE ESCHERICHIA COLI SEROTIPO O157: H7 EM DIFERENTES TIPOS DE AMOSTRAS. PNA É UMA MOLÉCULA SINTÉTICA ANÁLOGA À MOLÉCULA DE DNA QUE, DEVIDO ÀS SUAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS, PERMITE UMA ANÁLISE MAIS RÁPIDA E MAIS SENSÍVEL DO QUE AS SONDAS DE ADN. ESTAS SONDAS SÃO COMBINADAS COM HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE (FISH), UMA TÉCNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR, QUE PERMITE A VISUALIZAÇÃO DIRETA DO MICRORGANISMO NA AMOSTRA. A COMBINAÇÃO DESTAS DUAS TECNOLOGIAS PERMITIU O DESENVOLVIMENTO DE UM PROCEDIMENTO DE FISH MAIS RÁPIDO, MAIS SIMPLES E MAIS EFICIENTE. ESTE TESTE PODE SER APLICADO A UMA GRANDE VARIEDADE DE AMOSTRAS, TAIS COMO ALIMENTOS, SANGUE, BIOPSIAS, FEZES, ÁGUA E OUTRAS AMOSTRAS CLÍNICAS, AMBIENTAIS OU DA INDÚSTRIA AGRÍCOLA E ALIMENTAR.A PRESENTE INVENÇÃO TAMBÉM INCLUI O DESENVOLVIMENTO DO KIT DE DETEÇÃO E RESPECTIVO PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE E. COLI O157: H7 UTILIZANDO OS TIPOS DE AMOSTRAS ACIMA MENCIONADAS.

Description

importantes devido à sua elevada virulência e sua associação com complicações potencialmente fatais (Sheibani, 2007). Dentro do grupo de EHEC, a E. coli serotipo 0157: H7 (serótipo baseia-se no 0 [Ohne] antigénio - determinado pelo lipopolissacárido da parede celular - e o H [Haunch] antigénio devido à proteína flagelar) é a mais comummente isolada (Gyles, 2007). A dose infecciosa de E. coli 0157: H7 está descrita como sendo muito baixa - cerca de 1-100 CFU / mL - mais baixa do gue a maioria dos agentes patogénicos entéricos (Robinson e McKillip, 2010). A virulência deste microrganismo deve-se maioritariamente a três fatores. O primeiro, e o mais importante, é a produção de toxinas do tipo Shiga (Stxs), chamadas Stxl e Stx2. Estas toxinas estão atualmente entre as citotoxinas mais potentes capazes de afetarem células eucarióticas (Robinson e McKillip, 2010) . Embora o tipo de Stx produzida influencie diretamente a gravidade da doença, a produção de Stxs por si só é insuficiente para a E. coli 0157 :H7 se tornar patogénica. O apoio do locus enterocyte effacement (uma ilha de patogenicidade que codifica uma bateria de fatores de virulência especializados) e a presença do plasmídeo pOl57 (codifica um sistema de secreção de tipo II, uma enterohemolisina, um inibidor de linfócitos e potenciais adesinas, entre outros) são também necessários ( Robinson e McKillip, 2010).

Os sintomas da infeção por EHEC são muito diversos, podendo a infeção originar desde casos assintomáticos até casos letais. Os sintomas da doença geralmente desaparecem uma semana depois. Em casos graves os pacientes podem desenvolver o síndrome hemolítico-urêmico (HUS), Púrpura Trombocitopenica Trombótica (TTP), ou até mesmo morrer (Robinson e McKillip, 2010). 0 HUS atinge as células endoteliais renais e pode levar à insuficiência renal aguda (Robinson e McKillip, 2010) . 0 HUS tem taxa de mortalidade significativamente mais elevada e, no caso de sobrevivência, os pacientes geralmente ficam com sequelas renais permanentes. Para além dos sintomas típicos de HUS, a TTP 2 está associada a sintomas neurológicos como dores de cabeça, convulsões, letargia e encefalopatia (Robinson e McKillip, 2010) . Para os surtos de E. coli 0157 :H7 detetados nos EUA, 25% das pessoas afetadas foram hospitalizados, 5-10% desenvolveram SHU ou TTP e 1% morreram (Pennington, 2010) .

Em relação aos reservatórios ambientais, geralmente o gado bovino serve de reservatório primário e natural de E. coli 0157:H7 e estima-se que 10 - 80% de todos os animais são colonizados por esta bactéria (Yoon e Hovde, 2008) . Outros animais, como cabras, ovelhas e porcos podem também ser portadores. Resultados de um estudo que inclui 90 surtos confirmados microbiologicamente (ocorridos entre 1982 e 2006), mostram que as fontes de transmissão para os seres humanos foram alimentos em 42,2% dos casos; produtos lácteos em 12,2%; contato com animais em 7,8%; água em 6,7%, ambiente em 2,2% e desconhecidas em 28,9% dos surtos (Pennington, 2010).

Antes dos produtos alimentares serem libertados para o consumidor, estes devem passar por um controlo de qualidade que permite avaliar a existência de contaminações. A importância do controle de qualidade, leva à necessidade de implementar métodos de deteção rápidos, sensíveis e fiáveis, bem como versáteis, de forma a adaptar-se facilmente às necessidades das diferentes linhas de produção e de processamento de alimentos. Estes métodos podem reduzir substancialmente o tempo, o trabalho e custo global do processo de deteção. O teste para a fermentação de sorbitol tem sido sugerido como método mais simples de deteção de E. coli 0157: H7, pois esta bactéria não possui a enzima β-glucorunidase. A maioria dos métodos de cultura existentes foram desenvolvidos com base nesta característica. No entanto outras propriedades desta bactéria, tais como a incapacidade de fermentar rhamanose e tolerância ao telurito, têm sido também exploradas (Raji et al., 2003). Estas técnicas de cultura continuam a ser um aspeto integral de controlo de qualidade durante o processamento de alimentos por 3 serem relativamente baratos, tecnicamente simples e apresentarem elevada especificidade e sensibilidade. No entanto, estes métodos são também muito demorados, laboriosos e incapazes de detetar estirpes de E. coli 0157: H7, que fermentam o sorbitol e são suscetíveis ao telurito (Raji et al, 2003.). Falham também na deteção de patógenos em números mais baixos (<200 amostra CFU / g) . Adicionalmente, os métodos de cultura, tais como a norma ISO 16654, incluem geralmente um ensaio de aglutinação (detecção de antígeno 0157 ou H7) pouco específico, uma vez que os antigénios 0157 e H7 estão presentes em outras espécies de Escherichia coli. Estes anticorpos também podem reagir de forma cruzada com outros serotipos de E. coli, outras Escherichias e de outros membros da família Enterobacteriaceae (Raji et al., 2003) . FISH é um método molecular amplamente aplicado para a identificação de microrganismos. Este método baseia-se na ligação específica de oligonucleótidos pequenos (sondas) em regiões específicas do RNA ribossomal (rRNA), devido à sua distribuição celular elevada abundância, universal e utilização como um marcador filogenético. A sonda está ligada a um fluorocromo e, após uma etapa de hibridização, a fluorescência pode ser detetada devido ao número elevado de cópias de rRNA dentro da célula. Mais recentemente, as sondas de ácido péptido nucleico (PNA) têm sido aplicadas na deteção microbiana (Cerqueira et al., 2008). Estas moléculas que mimetizam o DNA são capazes de hibridar especificamente com ácidos nucleicos complementares obedecendo às regras de Watson-Crick. A ligação destas moléculas à sequencia alvo é mais forte uma vez que o PNA tem uma unidade repetida neutra de N-(2-aminoethil) glicina em vez da carga negativa do grupo açúcar-fosfato. O uso adequado dessa molécula na tecnologia de FISH tornou o procedimento mais robusto, mais rápido e mais eficiente, e permitiu o desenvolvimento de vários métodos de PNA FISH para a deteção de organismo patogênico (Cerqueira et al., 2008). 4

Neste documento apresenta-se o desenvolvimento de um novo método de PNA FISH para a deteção específica de E. coli 0157 em alimentos e amostras clínicas. Este é o primeiro método de PNA FISH desenvolvido para detetar um sorotipo específico.

Sumário da Invenção 0 presente invento refere-se a uma sonda de ácido péptido nucleico (PNA) e método associado, para detetar o serótipo 0157 da espécie E. coli (isto é identificar ou quantificar). A sonda descrita na presente invenção reconhece o 23S rRNA do microrganismo em questão ou as sequências genómicas correspondentes ao rRNA mencionado. As sondas de PNA têm características físico-químicas inerentes à sua estrutura que, quando aplicadas a um método baseado na tecnologia FISH, permitem uma análise mais rápida, robusta e específica do que usando uma sonda de DNA.

Uma das vantagens deste método é o facto de a sonda funcionar de forma robusta numa grande variedade de amostras biológicas, o que geralmente não acontece para os outros métodos moleculares de deteção.

Outro aspeto relevante é o tempo necessário à deteção. 0 método desenvolvido consegue igualar os melhores tempos descritos para os restantes métodos moleculares, mesmo quando o tipo de amostra exige um passo de enriquecimento anterior à análise. A rapidez, aliada à fiabilidade do método, poderá determinar o tratamento atempado e adequado da contaminação e/ou infeção quer numa perspetiva clínica quer de segurança alimentar.

Outro dos aspetos da presente invenção relaciona-se com o desenvolvimento de um estojo, baseado na aplicação desta sonda à técnica de hibridação fluorescente in situ (FISH), que permite a deteção da E. coli 0157 num variado conjunto de amostras biológicas, de uma forma simples e rápida. 5 A sonda de PNA, que permite detetar a presença de E. coli 0157, poderá numa realização preferencial, detetar a sequência alvo no rRNA, no rDNA ou nas sequências complementares do rRNA de E. coli 0157.

Um das realizações da presente invenção é a descrição de uma sonda de PNA de deteção e/ou quantificação de E. coli 0157 caracterizada por ter pelo menos 86% de semelhança com à sequência SEG ID No. 1 -5' - CAA CAC ACA GTG TC -3, de preferência 87%, 88 O, O / 89%, 90%, 91%, 92% , 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de semelhança com à sequência SEG ID No. 1 -5'- CAA CAC ACA GTG TC -3.

Numa realização ainda mais preferencial, as sequências anteriormente descritas encontra-se ligada a pelo menos um tipo de fração detetável. Sendo que, o tipo de fração detetável a utilizar poderá ser selecionado a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de deteção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente, entre outros.

Numa realização ainda mais preferencial o grupo fluoróforo poderá ser pelo menos um dos seguintes: fluoróforos de Alexa series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',7'-diclorofluoresceina, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio), entre outros. É ainda objeto da presente invenção um estojo de deteção da presença ou ausência e/ou quantificação E. coli 0157 em amostras biológicas.

Sendo que numa realização mais preferencial o estojo poderá ainda apresentar pelo menos uma das seguintes soluções: uma solução de fixação, uma solução de hibridação e uma solução de lavagem.

Ora numa realização ainda mais preferencial a solução de fixação poderá compreender paraformaldeido e etanol, nomeadamente 2-8% 6 (peso/vol) de paraformaldeído e 25-90% (vol/vol) de etanol e/ou a solução de hibridação poderá compreender formamida. É também objeto da presente invenção a descrição de um método de deteção de E. coli 0157 ou de deteção da E. coli 0157 em amostras biológicas, que utiliza a sonda de PNA anteriormente mencionada e que compreende os seguintes passos: • contacto da sonda de PNA com amostras biológicas; • hibridação da sonda de PNA com a sequência alvo dos microrganismos presentes nas amostras biológicas; • detecção da hibridação como indicativo da referida deteção e quantificação nas amostras biológicas, a hibridação poderá ser feita de preferência por fluorescência.

Ora, as referidas amostras biológicas podem ser proveniente de sangue, ar, alimentos, água, biopsias ou fezes, entre outras. É ainda objeto da presente invenção a utilização das sondas de PNA anteriormente descritas, a utilização dos estojos anteriormente descritos e da metodologia para serem aplicadas numa metodologia de deteção de E. coli 0157, ou de deteção de E. coli 0157 a em amostras biológicas.

Descrição geral da invenção A presente invenção engloba a sonda de PNA, reagentes, métodos e estojo destinados à deteção ou quantificação de estirpes de E. coli 0157. A sonda aqui descrita permite a deteção especifica de E. coli 0157 através da ligação ao rRNA, sequências genómicas correspondentes ao rRNA (r) , ou ainda sequências complementares às mesmas. 7 A maior especificidade das sondas de PNA (relativamente às sondas de DNA) permite uma melhor discriminação de sequências de nucleótidos relacionadas. Isto tem particular importância para esta sonda uma vez que existem alguns microrganismos filogeneticamente relacionados com E. coli 0157 que apresentam apenas um nucleótido de diferença (nucleótido na posição 8 da sonda descrita nesta invenção) na região alvo selecciona. São exemplos desta situação outras estirpes de Escherichia coli não-0157:H7. A sonda de PNA descrita nesta invenção tem 14 nucleótidos com a seguinte sequência nucleotidica: SEQ ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3'.

No entanto, a sonda a usar na deteção por ser até 86% idêntica à sequência acima mencionada.

Esta sonda é aplicada à análise por hibridação in situ fluorescente (FISH), que, no caso de amostras positivas para E. coli 0157, resulta na emissão de um sinal fluorescente detectável quer através de microscopia de fluorescência quer através de citometria de fluxo. 0 desenvolvimento da nova sonda de PNA-FISH foi realizado de forma empírica com recurso a softwares específicos. A seleção da sequência da sonda foi feita inicialmente através do alinhamento de sequências de rDNA do microrganismo alvo, com sequências de microrganismos muito relacionados. Isto permitiu identificar as regiões potencialmente úteis que depois serão avaliadas com base em outros parâmetros como: especificidade, temperatura de hibridação, percentagem de guanina/citosina, energia livre de ligação e estrutura secundária.

Após o desenho e síntese da sonda, as 3 etapas do procedimento de FISH, fixação/permeabilização, hibridação e lavagem, têm que ser desenvolvidos e otimizados para a sonda selecionada. Este processo geralmente envolve os seguintes parâmetros: 8 temperatura, concentração de formamida e etanol, e tempo de hibridação e lavagem. De referir que, devido a complexidade do processo e ao grande número de variáveis existentes, nem sempre é possível desenvolver um método para cada sequência e como tal, muitas vezes várias alternativas e sequências são testadas.

Uma hibridação bem sucedida permite depois aferir da presença/ausência e mesmo concentração de um microrganismo, por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou PCR em tempo real. 0 sinal fluorescente detetado é geralmente o resultado da ligação específica das pequenas sondas às dezenas ou centenas de cópias de rRNA existentes no citoplasma da bactéria. Essa fração detetável da sonda, que reporta a existência de um complexo estável formado pela sonda e o alvo, é selecionada a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de deteção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente. 0 método descrito na presente invenção compreende o contacto de uma amostra com pelo menos uma sonda de PNA com sequência semelhante à anteriormente descrita. Consequentemente, a análise é baseada num único ensaio com um parecer definitivo contrariamente aos métodos convencionais de deteção de E. coli 0157 que se baseiam em características fenotípicas e requerem vários dias a fornecer o resultado. É ainda objeto da presente invenção um estojo adequado à execução do ensaio para detetar, isto é encontrar, identificar ou quantificar, E. coli 0157 presente em amostras biológicas. 0 estojo da invenção inclui a sonda de PNA e outros reagentes ou compostos selecionados para a realização dos ensaios de hibridação in situ.

Numa realização ainda mais preferencial, o de um estojo adequado à execução do ensaio para detetar, identificar ou quantificar E. 9 coli 0157 contém ainda uma solução de fixação, hibridação e lavagem.

Preferivelmente, o método pretende ser um meio de diagnóstico coadjuvante para a decisão terapêutica e controlo de qualidade. A implementação deste método na identificação de E. coli 0157 permitirá deste modo, adequar o tratamento clínico à bactéria em causa e identificar prematuramente focos de contaminação.

As sondas de PNA podem ser aplicadas diretamente na amostra preparada em lâmina, já que a aplicação destas sondas não envolve o uso de reagentes ou enzimas para a permeabilização das membranas celulares antes da hibridação. No entanto, necessita de alguns dos compostos mais utilizados nas hibridações. Assim, as sondas são normalmente incluídas em estojos que permitam um mais fácil manuseamento por parte dos utilizadores. Se a abordagem pretendida envolver a análise do PNA-FISH por citometria de fluxo, a sonda poderá ser aplicada na amostra em suspensão, utilizando os mesmos compostos para a hibridação.

Descrição detalhada da invenção I - Definições a) Como usado neste documento, termo "nucleótido" inclui moléculas naturais e não naturais normalmente conhecidas por quem utiliza tecnologia relacionada com ácidos nucleicos, para desse modo gerar polímeros que se ligam especificamente a ácidos nucleicos. b) Quando usado o termo "sequência de nucleótidos", é o mesmo que referir um segmento de um polímero que contém subunidades, neste caso os nucleótidos. 10 significa uma sequência de c) 0 termo "sequência alvo" nucleótidos de E. coli 0157 que se pretende que seja detetada no ensaio, onde a porção de nucleótidos da sonda é desenhada para hibridar. d) 0 termo "sonda de PNA" significa um polímero de subunidades de PNA que apresenta uma sequência de nucleótidos e é específica para hibridar com uma sequência alvo do microrganismo de interesse. As moléculas de PNA são mímicas das de DNA, na qual a estrutura carregada negativamente de açúcar-fosfato é substituída por uma aquiral e eletricamente neutra formada por unidades repetidas de N -(2-aminoetil) glicina. e) Quando é usado o termo "fração detetável", este refere-se a moléculas que podem ser ligadas à sonda, para, assim, tornar a sonda detetável por um instrumento ou método. f) 0 termo "amostra" refere-se a qualquer amostra biológica que pode conter o microrganismo ou sequência alvo para a deteção. As amostras poderão ser clínicas (por exemplo: sangue, urina, fezes, etc...) , alimentares (carne, ovos, formulas infantis, leite, etc...) ou ambientais (por exemplo: água). II - Breve Descrição das figuras A figura 1 apresenta o alinhamento parcial das sequências de rDNA 23S para seleção da sonda. A sequência complementar anti-paralela da sonda EcoPNA1169 é apresentada por cima do alinhamento e sequências completamente complementares à sonda encontram-se salientadas. 11 III - Descrição

Concepção da sonda de PNA:

Para identificar oligonucleótidos potencialmente úteis para usar como sonda, foram escolhidas 16S and 23S rDNA sequências disponíveis no sítio do National Centre for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Esta seleção contemplou 6 sequências de E. coli 0157 :H7, 6 E. coli não-0157:H7 e estirpes de espécies relacinadas pertencentes à família Enterobacteriaceae (Figura 1). As sequências de interesse foram alinhadas usando o programa ClustalW disponível no European Bioinformatics Institute (EBI, www.ebi.ac.uk/clustalw/). Foi identificada uma região conservada no rRNA 23S de todas as estirpes de E. coli 0157 :H7 (Figura 1) . Os critérios para seleção da sequência final da sonda incluíram: a percentagem de Guanina/Citusina; o tipo de estruturas secundárias e a temperatura de hibridação. Após a avaliação destes parâmetros, foi escolhida a seguinte sequencia: 5'-CAA CAC ACA GTG TC-3'. Esta sequencia híbrida nas posições 1169 a 1183 da estirpe TW14359 E. coli 0157:H7 (número de acesso: CP 001368). A sonda foi chamada de EcoPNAll69 devido à posição inicial da sequência. Posteriormente, a sequência selecionada foi sintetizada e os aligonucleótidos acoplados, no terminal amina, ao fluorocromo Alexa Fluor 594.

Avaliação teórica do desempenho da sonda de PNA:

Após a concepção da sonda, o seu desempenho foi avaliado através da determinação dos valores teóricos da sensibilidade e da especificidade. Estes parâmetros foram avaliados com recursos ao programa acima mencionado, ProbeCheck disponíveis na base de dados SILVA de rRNA. Para esta estimativa teórica apenas sequências de boa qualidade com pelo menos 1900 pb foram consideradas, assim como estirpes de E. coli com serótipo atribuído. A sonda foi alinhado com um total de 180.344 12 sequências presentes na base de dados para a subunidade grande do RNA (23S/28S, LSU). Também foi testado contra a base de dados para a subunidade pequena (16S/18S, SSU) para avaliar a existência de uma possível hibridação com as sequências de 16S rRNA. A especificidade foi calculada como nECs/TnECs x 100, onde nECs representa o número de estirpes não-E. coli 0157:H7 que não reagiu com a sonda e TnECs o número total de estirpes não-E. coli 0157:H7 examinadas. A sensibilidade foi calculada como ECs/TECs x 100, onde o ECs é o número de estirpes de E. coli 0157:H7 detectados pela sonda e TECs é o número total de estirpes de E. coli 0157:H7 existentes na base de dados.

Através do programa probeCheck, foi possível verificar que a sonda EcoPNAll69 detectas todas as 80 sequências de E. coli 0157:H7, mas também 11 outras sequências, num total de 91 sequências detetadas (ultimo acesso, Julho de 2012) . Assim, os valores teóricos de especificidade de sensibilidade foram de 88 e 100%, respetivamente. As 11 estirpes não E. coli 0157:H7 detetadas pela sonda EcoPNAll69, incluíram 3 E. coli não-0157, 7 Salmonella spp. e 1 estirpe de Cronobacter. A sonda de PNA desta invenção contém preferencialmente 14 nucleótidos e poderá ser pelo menos 86% idêntica à sequência SEQ ID No. 1-5'- CAA CAC ACA GTG TC -3', de preferência 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de semelhança com à sequência SEQ ID No. 1 -5'- CAA CAC ACA GTG TC -3.

Alternativamente, esta invenção contempla também variações nas sequências nucleotídicas das sondas. Tais variações podem incluir deleções, inserções entre outras. Como por exemplo uma das seguintes sequências: • SEQ ID No . 2 - 5'- AAC AAC ACA CAG TG -3'; • SEQ ID No . 3 - 5'- AAC ACA CAG TGT CG -3'; • SEQ ID NO . 4 - 5'- AAC AAC ACA CAG TGT C -3'; • SEQ ID No. 5 - 5'- CAA CAC ATA GTG TC -3'. 13

Fração detetável da sonda de PNA: Não limitado aos seguintes exemplos, a fração detetável da sonda de PNA pode incluir diferentes tipos de moléculas, como conjugados de dextrano, cromóforos, fluoróforos, radioisótopos, enzimas, hapteno, composto quimioluminescente entre outros.

Como exemplo, entre a classe dos fluoróforos são preferíveis para utilização (mas não limitados a): fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',7'-diclorofluoresceína, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio). Método: A presente invenção apresenta um método para a determinação da presença de E. coli 0157 usando uma sequência de nucleótidos com pelo menos 86% de homologia com a região de 14 nucleótidos aqui descrita - SEQ ID No. 1. 0 método pode contemplar o contacto de uma amostra com a sonda de PNA descrita neste documento com a sequência alvo da bactéria sob condições de hibridação adequadas ou condições de hibridação in situ adequadas (como apresentado no EXEMPLO 1). 0 método pode ser dividido em: preparação das amostras (que contempla o passo enriquecimento, quando necessário) , fixação, hibridação, lavagem e visualização dos resultados (ver EXEMPLO 1) . 0 método pode ser realizado em células aderidas ou em suspensão.

Optimização do protocolo: 0 procedimento de PNA FISH envolve 4 etapas: fixação e permeabilização da amostra; hibridação da sonda; lavagem da sonda não-ligada e observação ao microscópio de fluorescência. 14

Os seguintes passos é uma optimização possível das condições de optimização, sem ter a intenção de ser limitativo:

Existem vários fatores que influenciam a hibridação da sonda de PNA e a sequência alvo. Estes incluem a percentagem de formamida (ou outro reagente químico desnaturante), a concentração salina e consequentemente a força iónica, a percentagem de etanol, a temperatura de hibridação e lavagem, a concentração de detergente, o pH entre outros.

Para identificar as condições óptimas de hibridação, pode ser necessário fixar os diferentes fatores e variar cada fator isoladamente até se encontrar um grau de discriminação desejado.

Quanto mais próxima se encontra uma sequência alvo de outra não-alvo na amostra, maior terá que ser o grau de rigor na definição dos diferentes fatores que influenciam a hibridação. Nesta invenção sequências não-alvo (isto é, sequências não- E. coli 0157:H7), podem ter apenas um nucleótido de diferença em relação às sequências alvo, sendo necessário um elevado nível de descriminação de forma a evitar hibridações não específicas.

Para melhor compreender o comportamento da sonda EcoPNAll69 e assim determinar as melhores condições de hibridação, as temperaturas de hibridação e lavagem foram variadas entre 53 e 61 °C; a concentração de etanol foi variada entre 50 e 80% e diferentes tempos de hibridação foram também testados (30, 45, 60 e 90 minutos).

Após a optimização de todos os parâmetros referidos anteriormente, a sondas descrita neste documento apresentou os melhores resultados nas seguintes condições:

Foram preparados esfregaços de cada cultura bacteriana (cerca de 20 yL) em lâminas adequadas à visualização em microscópio de fluorescência. Os esfregaços foram imersos em 4% (peso/vol) paraformaldeído (Sigma) durante 10 minutos, seguido por 50% (vol /vol) etanol, também durante 10 minutos. Depois de secas ao ar, 15 as amostras foram então cobertas com 20 μΐ de solução de hibridação contendo: 10% (peso/vol)de sulfato dextran (Sigma); 10 mM de NaCl (Sigma); 30% (vol/vol) de formamida (Sigma); 0,1% (peso/vol) pirofosfato de sódio (Sigma); 0,2% (peso/vol) polivinilpirrolidona (Sigma); 0,2% (peso/vol) Ficol (Sigma), 5 mM de EDTA dissódico (Sigma); 0,1% (vol/vol) Triton X-100 (Sigma); 50 mM Tris-HCl (pH 7,5; Sigma) e 200nM de sonda PNA. As amostras foram cobertas com lamelas, colocados em pequenas caixas húmida protegidas da luz e incubadas por 45 minutos a 59°C. Posteriormente, as lamelas foram retiradas e as lâminas foram submersas numa solução de lavagem previamente aquecida (59°C) durante 30 minutos, contendo 5 mM Tris Base (Sigma), 15 mM de NaCl (Sigma) e 1% (vol/vol) de Triton X (pH 10; Sigma) . Posteriormente, as lâminas foram removidas da solução de lavagem e secas a 59°C na mesma incubadora durante aproximadamente 5 minutos. Antes da visualização ao microscópio, foi colocada uma gota de óleo de imersão não-fluorescente (Merck) e lamela. As lâminas foram armazenadas no escuro por um período máximo de 24 horas antes da microscopia.

Avaliação da especificidade e sensibilidade experimentais da sonda:

Para testar a especificidade e sensibilidade experimentais da sonda de PNA, o protocolo acima descrito foi aplicado a 53 estirpes. Foram incluídas 20 estirpes E. coli 0157:H7 e 25 estirpes não-E. coli 0157:H7. Adicionalmente, foram incluídas 8 estirpes pertencentes ao mesmo género e família {Escherichia, Salmonella, Enterobacter, Shigella and Klebsiella) . Os resultados mostram que a hibridação ocorre apenas com estirpes de E. coli 0157:H7 e, portanto, os valores de especificidade e sensibilidade obtidos foram ambos de 100%. 16 especificidade de

Tabela 1

Resultados do teste de sensibilidade da sonda EcoPNAl169. Strain Serotype Isolation origin Verotoxin production PNA FISH outcome , ' d · , '· r + !!!!!!!!!!!ÍÍÍSÍÍ^:Í!ÍÍIlÍÍl^^lÍÍgS:Í:Í: E.coli 0157:H7 Human stool stxl, stx2 + CECT 4782 from outbreak of hemorrhagic colitis ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::-::½ E.coli 0157:H7 - Gene stx2 + CECT 5947 has been replaced Et <â COlí lllÉÉllljí mmmm iBBBBBBBBBBBi mmmmrnmmmmm + Illllillllll E.coli 0157:H7 Faecal swab stx2 + CCC-1-12* Illllillllll 11111111 lllllil stx2 + lilliliilllll E.coli 0157:H7 Faecal swab stx2 + CCC-7-12* lllllllllllllll lliiiiiil llllllllll BB1IÍII1BBB11 + liiliiliilll E.coli 0157:H7 Milk filter stx2 + CCC-11-12* 11Í1II!!!!!!!II + llliiliiliii E. coli 0157:H7 Milk filter stx2 + CCC-13-12* llllllll llllllll stx2 + íímímíí E. coli 0157:H7 Bovine milk stx2 + CCC-15-12* filter lllllillllillll rnmmmmmmmm 1BBÍÉBÍBBB1I + iiiiiiilie E.coli 0157:H7 Bovine milk stx2 + CCC-18-12* filter E,COlí llllllll lllllil Milk £ilt$r + liiliiliilll E.coli 0157:H7 Milk filter NT + CCC-24-12* Illlllillllllllll llllllll 1111117 m + pjj&pilSp ft¥:^:iW::::::::w::w::::::::AV:«:::::::::::::::::: E.coli 0157:H7 Milk filter NT + 17 CCC-26-12* llllllli '63 (B8) iH- Wêêêêêêêêêè llllllllll E.coli 0141:K85(B):H4 Swine ND - CECT 504 oedema, !lil!!l!l!l!llllliiilliiilj|i lliwlll mÊmmmmm llillllilliliil wmmmÊmmmm llllllllllllll llIllSlllllll E.coli 0103:K- : H- - ND - CECT 533 E,COli 0111;K58(B4);H- Ilzàntiie BfÉMIllBBP 111111¾ E.coli 055:K5 9(B5) :H- - ND - CECT 730 mmmmmmmÊmmmmmmm iiiiiiiiiii; CECT 736 ) :H" E.coli 0125a,125b:K70(B Gastroenter ND - CECT 740 15) :Hl 9 itis !lil!!l!l!l!lllllilliíli:iljlj llllllli -;h23 llllliiiiiillillil llllllllll E.coli 0111:K58 (B4) :H- Infantile ND - CECT 832 gastroenter itis wmmmmimWM llllllli tllllillllllt; E.coli 097:K- H- - ND - CECT 4555 iiiiiiiiii llllllli Illlilllllllill! MÊÊÊÊmÊÊÊÊÊm E.coli "TvR............ Faecal swab stxl, stx2 - CCC-3-12* ^ÊÊ^áÊiíÊi^ÈMMMMÊ 1111111111 I1I11I11I1I; llllIÉIÉilllll E.coli 02 6 Faecal swab NT - CCC-8-12* !lll!!!!Í!!l!l!llllllll llllllllll llliliillllilll III» llllllllll CCC-9-12* E.coli 02 6 Caprine stxl - CCC-19-12* milk filter mm&Êrnmmm llilllll; llllllll§liilillB IBlBÉMllllllB ccc-ao-ií* íTu^Xk E.coli 026 Bovine milk stxl - CCC-21-12* filter E,coli llllllllll iiiiiiiiiiiê lillillilliil 1III1M11I111 Escherichi 06 Clinicai ND - acoli CECT Isolate 434 WÊÊíÊÊÈÊÊiÈÈÈÊÈÊÊÈà llllllli WÈÈÊÊÈÊÊÊÊÊÊÊÊÊÈÈÈM mmrnmmmmm llllllllll Blllliielllll Illlilllllllill! Escherichi ND Bovine ND - a coli N5* faeces llllllilllllll ilÉlÉlÉl mmmmmmÊm ΙΙΙΙ1ΙΙΙ1ΙΙ; llllllllllllll 29425 Kl2) Escherichi NR Human - - 18 isolate a hermanii ATCC 33650 mBph&rxvki"--ií i|| , ·,r 1 ..' !Í!lpg...^aa43...l »a........... ..............jilllillF"11 ™ d.....|| Shigella boydii ATCC 9207 NR — ND m OrOvair..................................................................................................................................................................................... TypMmurí-y. WÈÊÊÊÈÈÈÈÈÈÈIÈÊÈÈÊÊÊÊÊÊÊÊÈÈÈÈÊÊÈÊÈÊÊÊÈÈÈÈÊÊÊÊÊÊÊÈÈÈÈiÊÊÊÈÈÈÈÈÈÈÈÊÊÊÈ 12416 Salmonella enterica enterica s orovar NR ............................. ~ ................i................. Typhi SGSC 3036 ||sXffl08«Ha $nt£íti4í$ ifeç 2476 — WÊÊÊÊêÊÊÊÊÊÊê En terobact NR Child's - - er throat sakasaki CECT 858 ϋΡieb&iellãt m

ATCC 112II NT - non-toxigeninc E. coli; EPEC - enteropathogenic E. coli (epidemiologically implicated as pathogens, but virulence mechanism is not related to the excretion of enterotoxins); ND -Not determined; NR - non-relevant Information for the present study; * - Isolates; SGSC - Salmonella Genetic Stock Centre; ATCC - American Type Culture Collection; NCTC - National Collection of Type Cultures; CECT - Spanish Type Culture Collection.

Enriquecimento:

As amostras a analisar podem ser provenientes de alimentos, biopsias, sangue, água, fezes entre outros.

As amostras contendo E. coli 0157:H7 apresentam geralmente baixos níveis de contaminação. Por este motivo é recomendado um 19 passo de enriquecimento da amostra que facilita o processo de detecção. Este passo de enriquecimento pode ser feito em vários tipos de meio de cultura, desde meios ricos complexos (tais como a água tamponada peptonada e o trypticase soy broth) até meios selectivos tais como: GN (Gram Negative) broth, R & F® Enrichment Broth (R&F-EB) ou E. coli (EC) broth (Vimont et ai., 2006).

Trypticase Soy Broth (TSB) é o meio de enriquecimento mais frequentemente utilizado. Antibióticos tais como a novobiocina (o mais comum), cefixima, cefsulodina ou a vancomicina, e outros compostos selectivos (ex. sais biliares - inibir as estirpes não-Enterobacteriaceae); são frequentemente adicionados a este meio para promover um enriquecimento selectivo. Estes meios são, em seguida, incubados durante um período que varia geralmente entre 16 e 24 horas (overnight growth) a 35 até 42 ° C. No entanto, os dados relativos à eficácia dos protocolos de enriquecimento são muito poucos e diferem de estudo para estudo. A temperatura de incubação, não parece estar relacionada com o tipo de serotipo procurado (Vimont et al, 2006.), mas alguns autores demonstraram que as estirpes de 0157:H7 apresentam geralmente uma temperatura óptima média de cerca de 40 ° C. Na verdade, a ISO recomendada para a deteção de 0157 em amostras alimentares (ISO 16654:2001 - Microbiology de alimentos para consumo humano e animal - Método horizontal para a detecção de Escherichia coli 0157) inclui um pré-enriquecimento no meio mTSB a 41,5 ° C.

Para avaliar a influência do meio de enriquecimento e da temperatura de incubação no limite de deteção do método de PNA FISH, foram usamos dois meios diferentes a 37 e 41,5 ° C. Foi selecionados o meio seletivo mTSB com novobiocina (MTSB + N) , que é atualmente recomendado pela International Organization for Standardization (ISO 16654:2001) e o BPW (buffered peptonated water), um meio não seletivo amplamente utilizados nos 20 protocolos de enriquecimento de vários agentes patogénicos, que também tem sido aplicada na deteção de E. coli 0157:H7. 0 método de PNA FISH descrito neste documento foi testado em dois tipos diferentes de amostras de alimentos: carne moida, leite não pasteurizado (duas matrizes comumente associado a infeções por E. coli 0157:H7) artificialmente contaminados com concentrações de que variam de 0,01 a 100 CFU / g ou 25 ml de amostra de alimento. Duas estirpes de E. coli 0157:H7 foram utilizados (CCC-5-12 e CECT 4267) para inoculação e as amostras foram analisadas simultaneamente pela ISO 16654:2001. Como se observa no quadro 2, o mTSB permitiu obter o melhor limite de deteção, enquanto o uso de temperaturas mais elevadas (41,5 ° C) não pareceu melhorar a taxa de deteção da E. coli 0157. 0 bom desempenho do mTSB pode estar relacionado com a natureza seletiva deste meio, que inclui novobiocina e sais biliares que inibem parcialmente o crescimento da microflora existente nos alimentos. No entanto, após a determinação da taxa de crescimento de ambas as estirpes de E. coli em BPW e mTSB, foi possível observar que a composição do meio (e não os fatores seletivos) é o factor determinante para o crescimento desta bactéria. Foram observadas taxas de crescimento de ~ 0,5 h-1 (a 41,5 °C) e de 0,4 h-1 para as estirpes cultivadas em mTSB, enquanto que as cultivadas em BPW apresentaram valores de 0,07 h-1 para ambas as temperaturas. Para melhor quantificar o desempenho de cada um dos métodos de enriquecimento, os valores de sensibilidade e de especificidade para ambos os meios, mTSB e BPW a 37 ° C, foram determinadas com base nos resultados presentes na Tabela 3. Os valores de especificidade obtidos foram ambos de 100% (intervalo de confiança [IC] de 95%, 69, 87 - 100), enquanto os valores sensíveis foram de 94,44% (IC 95%, 70,63 - 99,71) para mTSB e 55, 55% (IC 95%, 31,35 - 77,59) para BPW. Embora o melhor desempenho se tenha verificado para mTSB + N, deverá ser possível padronizar a etapa de enriquecimento de forma a permitir a deteção simultânea de diferentes patogénicos alimentares. 21

Outra característica importante a ter em conta ao otimizar protocolos de FISH é que alguns componentes alimentares podem apresentar um forte sinal de autofluorescência, e assim interferir com a deteção da bactéria. Para eliminar/reduzir este fenómeno, podem ser adicionado uma etapa adicional antes do processo de hibridação. Foram testadas duas abordagens diferentes: um paço de centrifugação (para remover partículas de alimentos) e o uso de um detergente (Triton X-100, 1%) para emulsionar os compostos lipídicos. Ambos os paços diminuíram o sinal de autofluorescência, mas o detergente apresentou uma redução mais significativa e também pareceu melhorar o sinal de fluorescência. Isto pode acontecer porque o detergente poderá também ajudar na permeabilização celular.

Em relação ao tempo de deteção do ensaio, a implementação do método de FISH PNA pode poupar pelo menos 2 dias na deteção de E. coli 0157: H7 relativamente ao protocolo tradicional.

Em conclusão, observou-se que o método de PNA FISH aqui descrito apresenta um limite de deteção de 1 CFU por 25 g de alimento, depois de uma etapa de enriquecimento overnight em mTSB. A comparação com o método de cultura tradicional evidenciou um valor de especificidade de 100% e sensibilidade de 94%. Finalmente observou-se também que o uso de compostos seletivos e temperatura mais elevada representa apenas uma melhoria limitada no limite de deteção do método.

Tabela 2 - Resultados de PNA FISH obtidos na deteção de E. coli 0157:H7 em diferentes matrizes alimentares inoculadas com concentrações bacterianas entre 0,01 e 100 CFU por 25g ou ml de alimento. Os resultados apresentados incluem 3 ensaios independentes. 22

Concentra tion Ground beef Unpasteurized milk CFU/25g 37*C 4 IIP 11! !p7!i; 4Í,S°C or ml) mTSB+N ΞΡ. mTBS+N BPW mTBS+N mTBS+N im Hijijijij illlllijiij: lllllllill ^ÈÈÈm {Ji)i! lllfc/ 6 31! ·.· '6) ‘ dllr 10 + + + + + (6/6) + (6/6)a (4/6) a (6/6)£ (2/6)£ a (6/6)* êmmmmmmmmmi ........ llliillliil T (VO)' (0/í5)· <ϊ'-'ίΟ ' 6) ' * '6) 0.1 - - - - - - (6/6)b ( 6 / 6) h (6 ()' (6/6)b (6/6)b (6/6)b ...................... (6/6)'· (6/0)*' (6/6)1 (6/6)h (h/6)1 a - Samples that tested positive by PNA FISH/Total positive samples determined by culture method; b - samples that tested negative by PNA FISH/Total negative samples determined by culture.

Tabela 3 - Comparação entre os resultados de cultura (ISO 16654:2001, considerada o gold Standard) e os resultados de PNA FISH relativamente à deteção de E. coli 0157 :H7 em 30 amostras de carne picada após uma pré-enriquecimento em mTSB e BPW a 37 °C. ISO 16654 :2001 result Present Abse nt Total 0 mTSB Test positive 17 0 17 É o υ -P Test negative 1 \2 13 d o Total 18 12 30 m cn H BPW Test positive 10 0 10 |jd| < ;z; Test negative 0 12 20 0-1 Total 18 12 30

Visualização dos resultados: em qualquer microscópio de sensivel ao fluoróforo em no microscópio, que não são

Esta etapa pode ser realizada epifluorescência com um filtro questão. Outros filtros presentes 23 capazes de detetar o sinal fluorescente da sonda foram utilizados a fim de confirmar a inexistência de autofluorescência.

Estojo: A presente invenção contempla ainda um estojo que permite a realização do ensaio que determina a presença de E. coli 0157:H7. 0 estojo nesta invenção compreende uma sonda PNA semelhante pelo menos 86% à sequência SEQ ID No 1 e outros reagentes ou composições que são selecionados para a realização do ensaio.

As sondas de PNA, as suas caracteristicas, os métodos e estojo desta invenção são apropriados à análise de ácidos nucleicos presentes, ou não, internamente no organismo de interesse. Assim, esta invenção pode ser usada para ambas, análise do organismo ou análise dos ácidos nucleicos extraídos ou derivados do organismo de interesse, fazendo com que a fonte da sequência alvo não seja uma limitação nesta invenção.

Os seguintes exemplos ilustram diferentes situações e diversos passos de aplicação da invenção, são realizações preferências da presente invenção, sem ter a intenção de ser limitativo em qualquer um dos deles: EXEMPLO 1: Detecção de E. coli serotipo 0157:H7 em diferentes tipos de amostras (clinicas, alimentares ou ambientais)

Sequência: SEQ ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3 (acoplada ao Alexa

Fluor 594) 24

Preparação das amostras:

As amostras clínicas, alimentares ou ambientais, foram submetidas a um passo de enriquecimento antes da aplicação da sonda de PNA. Isto deve-se ao facto de a E. coli 0157:H7 apresentar geralmente baixos níveis de contaminação. Este passo de enriquecimento pode ser feito no meio recomendado pelo método convencional de análise para cada amostra. No caso de alimentos, rações animais e fezes, foi utilizada o mTSB. As amostras foram depois incubadas por um período de 18 a 22h a 37°C, a 120 rpm. Após o enriquecimento, 15 μΐ da cultura foram misturados com 15 de Triton X-100 (1%) diretamente numa lâmina adequada para fluorescência. A lâmina foi colocada cerca de 5 minutos na estufa a 59°C ou deixada ao ar para secar.

Fixação:

Com o objectivo de prevenir a perda de 23S rRNA durante o processo de hibridação, a amostra foi imersa numa solução de 4% (peso/vol) de paraformaldeído e de 50% (vol/vol) etanol durante dez minutos cada.

Hibridação:

Após a fixação, as amostras foram então cobertas com uma gota de solução de hibridização contendo: 10% (peso/vol)de sulfato dextran (Sigma); lOmM de NaCl (Sigma); 30% (vol/vol)de formamida (Sigma); 0,1% (peso/vol) pirofosfato de sódio (Sigma); 0,2% (peso/vol) polivinilpirrolidona (Sigma); 0,2% (peso/vol) Ficol (Sigma), 5 mM de EDTA dissódico (Sigma); 0,1% (vol/vol) Triton X-100 (Sigma); 50 mM Tris-HCl (pH 7,5; Sigma) e 200nM de sonda PNA. As amostras foram cobertas com lamelas (para garantir o espalhamento uniforme da sonda), colocados em pequenas caixas húmida (para impedir a evaporação da solução de hibridação) protegidas da luz e incubadas por 45 minutos a 59°C. 25

Lavagem:

Após o tempo de hibridação as lamelas foram removidas e as lâminas imersas numa solução de lavagem pré-aquecida a 59°C contendo 5mM de Tris Base, 15mM de NaCl e 1% (vol/vol) de Triton X (pH 10) . As amostras foram então colocadas na estufa à temperatura de hibridação durante 30 minutos. Posteriormente, as lâminas foram removidas da solução de lavagem e secas a 57°C, na mesma incubadora, durante aproximadamente 5 minutos. Antes da visualização ao microscópio, foi colocada uma gota de óleo de imersão não-fluorescente (Merck) e lamela. As lâminas foram armazenadas no escuro por um período máximo de 24 horas antes da microscopia.

Resultados:

Os resultados são obtidos através de observação ao microscópio de fluorescência com filtro adequado à detecção do fluorocrómo Alexa Fluor 594 ligado à sonda de PNA. EXEMPLO 2: Deteção de Salmonella e E. coli 0157:H7 em fezes.

Este exemplo pretende ilustrar a possibilidade de utilizar a sonda de E. coli 0157 :H7 em conjunto com a sonda de Salmonella spp. previamente desenvolvida no trabalho de Almeida et al., 2010. Estas duas bactérias são causas comuns de gastroenterites e, como tal, a sua rápida deteção de fezes é de extrema importância. O uso de uma abordagem "multiplex" (utilização simultânea de várias sondas) pode simplificar o procedimento e acelerara a dtecção. Estas duas sondas têm temperaturas de hibridação muito próximas e podem portanto ser usadas facilmente num ensaio "multiplex". 26

Sequências: SEQ ID No. 1 - 5'- CAA CAC ACA GTG TC -3 (acoplada ao Alexa

Fluor 594)

Sequencia do artigo de Almeida et al., 2010: 5'- AGG AGC TTC GCT TGC -3' (acoplada ao Alexa Fluor 488)

Preparação das amostras: 25g de fezes foram misturadas com 225 ml de mTSB. Podem ser usadas diferentes quantidades de amostra, mas mantendo a razão de 1/10 (peso/vol). Seguidamente, as amostras foram incubadas overnight (18 a 22h) a 37°C e 120 rpm. Após o enriquecimento, 15 μΐ de amostra foram colocadas numa lâmina adequada e misturas com 15 μΐ de 1% Triton X-100 para minimizar a intrefrência de partículas autofluorescentes. Finalmente a amostra foi secar ao ar ou na estufa a 59°C durante cerca de 5 minutos.

Hibridação: A hibridação foi realizada como descrito anteriormente no Exemplo 1 com uma pequena diferença. A solução de hibridação continha duas sondas: sonda de PNA para detectar Salmonella e sonda de PNA para detectar E. coli 0157:H7, cada uma na concentração de 200nM.

Lavagem: A lavagem foi realizada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.

Resultados:

Os resultados foram obtidos através da observação ao microscópio de fluorescência com filtro adequados à detecção do fluorocromos Alexa Fluor 594 e 488 ligados às sondas de PNA.

Lisboa, 30 de Abril de 2013. 27

Referências :

Gyles CL: Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview. J Anim Sei 2007, 85(13 Suppl):E45-62.

Pennington H: Escherichia coli 0157. Lancet 2010, 376(9750):1428-1435.

Robinson AL, McKillip J: Biology of Escherichia coli 0157:H7 in human health and food safety with emphasis on sublethal injury and detection. In: Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. Edited by Mendez-Vilas A: Formatex; 2010: 1096-1105.

Raji MA, Jiwa SF, Minga MU, Gwakisa PS: Escherichia coli 0157: H7 reservoir, transmission, diagnosis and the African situation: a review. East Afr Med J 2003, 80(5):271-276.

Cerqueira L, Azevedo NF, Almeida C, Jardim T, Keevil CW, Vieira MJ: DNA mimies for the rapid Identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridization (FISH) . Int J Mol Sei 2008, 9(10):1944-1960.

Almeida C, Azevedo NF, Fernandes RM, Keevil CW, Vieira MJ: Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples. Appl Environ Microbiol 2010, 76 (13) :4476-4485.

Vimont A, Vernozy-Rozand C, Delignette-Muller ML: Isolation of E. coli 0157:H7 and non-0157 STEC in different matrices: review of the most commonly used enrichment protocols. Lett Appl Microbiol 2006, 42(2):102-108. 28

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Sonda de PNA para a deteção e/ou quantificação de E. coli serotipo 0157:H7 caracterizada por compreender pelo menos uma sequência com 86% de semelhança com a sequência SEQ ID No. 1.
2. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos uma sequência SEQ ID No. 1 e contemplando variações nas sequências nucleóticas das sondas como por exemplo nas sequintes sequências SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5.
3. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por detetar a sequência alvo no rRNA, no rDNA ou nas sequências complementares do rRNA de E. coli 0157:H7.
4. Sonda de PNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter ainda uma sequência com 14 nucleótidos e ter 86% de semelhança com a sequência SEQ ID No 5.
5. Sonda de PNA, de acordo com as reivindicações 1-4, caracterizada por se encontrar ligada a pelo menos um tipo de fração detetável.
6. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o tipo de fração detetável da sonda ser selecionado a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de deteção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente. 1
7. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o grupo flurofo ser pelo menos um dos seguintes: fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',7'-diclorofluoresceína, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio).
8. Estojo para a deteção de E. coli 0157 :H7 caracterizado por compreender pelo menos uma das sondas descritas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.
9. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender ainda pelo menos uma das seguintes soluções: uma solução de fixação, uma solução de hibridação e uma solução de lavagem.
10. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a solução de fixação compreender paraformaldeido e etanol, nomeadamente 2-8% (peso/vol) de paraformaldeido e 25-90% (vol/vol) de etanol.
11. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a solução de hibridação compreender formamida.
12. Método de deteção de E. coli 0157:H7 caracterizado por utilizar as sondas de PNA descritas na reivindicação 1 a 7 e por compreender os seguintes passos: a. contacto da sonda de PNA com nas referidas amostras; 2 b. hibridação da sonda de PNA com a sequência alvo dos microrganismos presentes nas referidas amostras; c. deteção da hibridação como indicativo da referida deteção e quantificação nas referidas amostras.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida amostra biológica ser proveniente de alimentos, sangue, ar, água, biopsias ou biopsias.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a hibridação ser por fluorescência.
15. Utilização das sondas de PNA como descritas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada por ser aplicada numa metodologia de deteção de E. coli 0157:H7 em amostras biológicas.
16. Utilização do estojo descrito em qualquer uma das reivindicações de 8 a 11, caracterizado por ser aplicado na deteção de E. coli 0157:H7 em amostras biológicas. Lisboa, 21 de Agosto de 2013. 3