PT1255558E - Anticorpos anti-april e células hibridoma - Google Patents

Description

ΕΡ 1 255 558 /PT DESCRIÇÃO "Anticorpos anti-APRIL e células de hibridoma"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se em geral a anticorpos que modulam a actividade do factor de necrose tumoral (TNF) e moléculas relacionadas com o receptor de TNF (TNFR) e, mais especificamente, o membro das famílias de TNF e TNFR designado por APRIL. A invenção também se refere a métodos para o diagnóstico e/ou tratamento in vitro, in situ e/ou in vivo de células de mamífero ou condições patológicas associadas com TALL-1, APRIL, TACI ou BCMA, utilizando uma ou mais moléculas agonistas ou antagonistas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Várias moléculas, tais como o factor de necrose tumoral-cx ("TNF-a"), factor de necrose tumoral-β ("TNF-β" ou "linfotoxina-α"), linfotoxina-β ("LT-β"), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, ligando Apo-1 (também designado por ligando Fas ou CD95), ligando Apo-2 (também designado por TRAIL), ligando Apo-3 (também designado por TWEAK), osteoprotegerina (OPG), APRIL, ligando RANK (também designado por TRANCE), e TALL-1 (também designado por BlyS, BAFF ou THANK) foram identificadas como membros da família de citóquinas do factor de necrose tumoral ("TNF") [veja-se, e.g., Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271 : 12687-12690 (1996);

Wiley et al. , Immunity, 3_:673-682 (1995); Browning et al.,

Cell, 7_2‘847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 publicado em 16 de Janeiro, 1997; WO 97/25428 publicado em 17 de Julho de 1997; Marsters et al., Curr. Biol. , _8:525-528 (1998); Simonet et al., Cell, 89 :309- 319 (1997); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401- 32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); W098/28426 publicado em 2 de Julho, 1998; W098/4675 publicado em 22 de Outubro de 1998; WO/98/18921 publicado em 7 de Maio de 1998; Moore et ai., Science, 285:260-263 (1999);

Shu et al., J. Leukocyte Biol., 6_5:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189 : 1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., 2

ΕΡ 1 255 558 /PT J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)]. De entre estas moléculas, foi referido que o TNF-a, TNF-β, ligando CD30, ligando 4-1BB, ligando Apo-1, ligando Apo-2 (Apo2L/TRAIL) e ligando Apo-3 (TWEAK) estão envolvidos na morte celular apoptótica. Foi referido que ambos, o TNF-α e o TNF-β, induzem a morte celular apoptótica em células tumorais susceptíveis [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sei., _83_: 1881 (1986);

Dealtry et al., Eur. J. Immunol., _17_:689 (1987)]. Várias moléculas na família do TNF têm também um papel (papéis) importante(s) na função ou desenvolvimento do sistema imunitário [Gruss et al. , Blood, 8_5:3378 (1995)]. Zheng et al. referiram que o TNF-α está envolvido na apoptose após estimulação de células T positivas para CD8 [Zheng et al.,

Nature, 377:348-351 (1995)]. Outros investigadores referiram que o ligando CD30 pode estar envolvido na eliminação de células T auto-reactivas no timo [Amakawa et ai., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, resumo N°. 10, (1995)]. O ligando CD40 activa muitas funções das células B, incluindo a proliferação, secreção de imunoglobulinas e sobrevivência [Renshaw et ai., J. Exp. Med., 180:1889 (1994)]. Foi referido que outra citóquina da família do TNF recentemente identificada, TALL-1 (BlyS), sob determinadas condições, induz a proliferação de células B e a secreção de imunoglobulinas. [Moore et ai., supra; Schneider et ai., supra; Mackay et ai., J. Exp. Med., 190:1697 (1999)].

Mutações nos genes do receptor ou ligando Fas/Apo-1 de ratinho (designados por lpr e gld, respectivamente) foram associadas com alguns distúrbios auto-imunes, indicando que o ligando Apo-1 pode desempenhar um papel na regulação da eliminação clonal de linfócitos auto-reactivos na periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6^:279-289 (1994); Nagata et ai., Science, 267:1449-1456 (1995)]. Também foi referido que o ligando Apo-1 induz apoptose após estimulação em linfócitos T positivos para CD4 e em linfócitos B, e poderá estar envolvido na eliminação de linfócitos activados quando a sua função deixa de ser necessária [Krammer et ai., supra; Nagata et al., supra]. Foi referido que anticorpos monoclonais de ratinho agonistas que se ligam especificamente ao receptor de Apo-1 exibem actividade de morte celular que é comparável 3

ΕΡ 1 255 558 /PT com, ou semelhante à de TNF-oí [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169 : 1747-1756 (1989)] .

Pensa-se que a indução de várias respostas celulares mediada por estas citóquinas da família do TNF é iniciada pela sua ligação a receptores celulares específicos. Anteriormente, foram identificados dois receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) e 75 kDa (TNFR2) [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 87:3127-3131 (1990); EP 417563, publicado em 20 de Março de 1991; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, ÉÇL:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 8_8: 2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 1_1:3020-3026 (1991)]. Verificou-se que estes TNFR partilham a estrutura típica dos receptores de superfície celular, incluindo as regiões extracelular, transmembranar e intracelular. As porções extracelulares de ambos os receptores também foram encontradas naturalmente como proteínas de ligação a TNF solúveis [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9_:3269 (1990) ; e Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 8_7:8331 (1990); Hale et al., J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, p. 113 (P42 4) ] . A porção extracelular de TNFR do tipo 1 e tipo 2 (TNFR1 e TNFR2) contém um padrão de sequência de aminoácidos repetitivo de quatro domínios ricos em cisteína (CRD) designados de 1 a 4, começando no terminal NH2. [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra; Banner et al., Cell, _73.:431-435 (1993)]. Existe um padrão repetitivo de CRD semelhante em várias outras proteínas de superfície celular, incluindo o receptor do factor de crescimento nervoso (NGFR) p75 [Johnson et al., Cell, 47:545 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593 (1987)], o antigénio CD40 de células B [Stamenkovic et al., EMBO J., 8_:1403 (1989)], o antigénio 0X40 de células T [Mallet et al., EMBO J., 9_:1063 (1990) e o antigénio Fas [Yonehara et al., supra e Itoh et al., Cell, 6_6:233-243 (1991)]. As CRD também são encontradas em proteínas T2 do tipo TNFR solúveis (sTNFR) dos poxvírus Shope e mixoma [Upton et al., Virology, 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991) ; Upton et al., Virology, 184:370 (1991)]. Um 4

ΕΡ 1 255 558 /PT alinhamento óptimo destas sequências indica que as posições dos resíduos de cisteína são bem conservadas. Estes receptores são por vezes referidos colectivamente como membros da superfamília de receptores de TNF/NGF.

Os ligandos da família do TNF identificados até agora, com a excepção da linfotoxina-α, são proteínas transmembranares do tipo II, cujo terminal C é extracelular. Pelo contrário, a maioria dos receptores na família de receptores de TNF (TNFR) identificados até agora são proteínas transmembranares do tipo I. Em ambas as família de ligandos e receptores de TNF, no entanto, verificou-se que a homologia identificada entre membros da família ocorre essencialmente no domínio extracelular ("ECD"). Várias das citóquinas da família de TNF, incluindo TNF-α, ligando Apo-1 e ligando CD40, são clivadas proteoliticamente na superfície celular; a proteína resultante em cada caso forma tipicamente uma molécula homotrimérica que funciona como uma citóquina solúvel. As proteínas da família do receptor de TNF são também normalmente clivadas proteoliticamente para libertar ECD do receptor solúveis que podem funcionar como inibidores das citóquinas cognatas.

Mais recentemente, foram identificados outros membros da família do TNFR. Em von Bulow et al., Science, 278:138-141 (1997), os investigadores descrevem um receptor de membrana plasmática designado por activador transmembranar e que interage com CAML ou "TACI". Está descrito que o receptor TACI contém um motivo rico em cisteína, característico da família do TNFR e é apresentado quer em células B, quer em células T activadas. Num teste in vitro, a reticulação de TACI na superfície de células Jurkat transfectadas, com anticorpos específicos para TACI levou à activação de NF-KB. [veja-se também, WO 98/39361 publicado em 18 de Setembro de 1998] .

Laabi et al., EMBO J., 3^:3897-3904 (1992) descreveram a identificação de um novo gene designado por "BCM" cuja expressão se verificou coincidir com a maturação terminal de células B. O quadro de leitura aberta do ADNc normal de BCM previa um polipéptido com 184 aminoácidos de comprimento, com um único domínio transmembranar. Estes investigadores mais tarde designaram este gene por "BCMA." [Laabi et al., Nucleic 5

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Acids Res., 2_2:1147-1154 (1994)]. Foi referido que a expressão de ARNm de BCMA estava ausente em linhas de células B malignas humanas que representam a fase de linfócitos pro-B e, assim, pensa-se que está ligada à fase de diferenciação dos linfócitos [Gras et ai., Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995)]. Em Madry et ai., Int. Immunology, 1_0 : 1693-1702 (1998), foi descrita a clonagem de ADNc de BCMA de murídeo. É referido que o ADNc de BCMA de murídeo codifica para um polipéptido com 185 aminoácidos de comprimento, com 62% de identidade com o polipéptido BCMA humano. O alinhamento das sequências de proteína de murídeo e humana revelou um motivo conservado de seis cisteínas na região N-terminal, sugerindo que a proteína BCMA pertence à superfamília do TNFR [Madry et ai., supra].

Em Marsters et ai., Curr. Biol., 6_: 7 5 0 (1996), os investigadores descrevem um polipéptido humano de sequência nativa de tamanho completo, designado por Apo-3, que exibe semelhanças com a família de TNFR nas suas repetições ricas em cisteínas, extracelulares, e se assemelha ao TNFR1 e CD95 na medida em que contém uma sequência de domínio de morte citoplasmática [veja-se também Marsters et ai., Curr. Biol., 6_: 166 9 (1996)] . O Apo-3 também foi referido por outros investigadores como DR3, wsl-1, TRAMP, e LARD [Chinnaiyan et ai., Science, 274:990 (1996); Kitson et ai., Nature, 384:372 (1996); Bodmer et ai., Immunity, _6 : 79 (1997); Screaton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 9_4:4615-4619 (1997)).

Pan et ai. descreveram outro membro da família de receptores de TNF designado por "DR4" [Pan et ai., Science, 276:111-113 (1997); veja-se também W098/32856 publicado em 30 de Julho de 1998] . Foi referido que o DR4 contém um domínio de morte citoplasmática capaz de activar o aparelho suicida da célula. Pan et ai. descrevem que se pensa que o DR4 é um receptor para o ligando conhecido como Apo2L/TRAIL.

Em Sheridan et ai., Science, 277:818-821 (1997) e Pan et ai., Science, 277:815-818 (1997), é descrita outra molécula que se pensa ser um receptor para Apo2L/TRAIL [veja-se também, W098/5179 publicado em 19 de Novembro de 1998; W098/4162 publicado em 24 de Setembro de 1998] . Essa molécula é designada por DR5 (também foi designada alternativamente por Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER 6 ΕΡ 1 255 558 /PT [Screaton et al., Curr. Biol., T_:693-696 (1997); Walczak et al. , EMBO J. , 1_6: 5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 1_7:141-143 (1997); W098/3598 publicado em 20 de Agosto de 1998; EP 870827 publicado em 14 de Outubro de 1998; W098/46643 publicado em 22 de Outubro de 1998; WO99/0265 publicado em 21 de Janeiro de 1999; WO99/0916 publicado em 25 de Fevereiro de 1999; W099/11791 publicado em 11 de Março de 1999]. Tal como para o DR4, está descrito que o DR5 contém um domínio de morte citoplasmático e é capaz de sinalizar a apoptose. A estrutura de cristal do complexo formado entre Apo-2L/TRAIL e DR5 está descrita em Hymowitz et al., Molecular Cell, £:563-571 (1999).

Foi identificado recentemente ainda outro receptor que contém o domínio de morte, DR6, [Pan et al., FEBS Letters, 431:351-356 (1998)]. Além de conter quatro domínios ricos em cisteína extracelulares, putativos, e um domínio de morte citoplasmático, pensa-se que o DR6 contém uma sequência de fecho de correr de leucinas putativa que se sobrepõe a um motivo rico em prolina na região citoplasmática. O motivo rico em prolina assemelha-se a sequências que se ligam a domínios src-homologia-3, que são encontrados em muitas moléculas de transdução de sinal intracelulares.

Outro grupo de receptores recentemente identificados é designado por "receptores de engodo" (decoy receptors) que se pensa que funcionam como inibidores, em vez de transdutores de sinalização. Este grupo inclui DCR1 (também designado por TRID, LIT ou TRAIL-R3) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277;818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186 : 1165-1170 (1997); e Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)] e DCR2 (também designado por TRUNDD ou TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol., 7_: 1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7_:813-820 (1997)], ambos moléculas de superfície celular, bem como OPG [Simonet et al., supra; Emery et al., infra] e DCR3 [Pitti et al., Nature, 396:699-703 (1998)], que são ambos proteínas solúveis, segregadas. 7

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Outros membros da família do TNFR identificados de novo incluem CARI, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, e TNFL1 [Brojatsch et al.r Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery et al.r Cell, 87:427-436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem., 272 :14029-14032 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:6216-6221 (1997); Emery et al. , J. Biol. Chem., 273:19363-19367 (1998); W099/0400 publicado em 28 de Janeiro de 1999; WO99/0773 publicado em 18 de Fevereiro de 1999; W099/3398 publicado em 8 de Julho de 1999] .

Tal como revisto recentemente por Tewari et al. , o TNFR1, TNFR2 e CD40 modulam a expressão de citóquinas pró-inflamatórias e co-estimulantes, receptores de citóquinas e moléculas de adesão celular, através da activação do factor de transcrição, NF-κβ [Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop., 6_:39-44 (1996)]. O NF-κβ é o protótipo de uma família de factores de transcrição diméricos, cujas subunidades contêm regiões Rei conservadas [Verma et al., Genes Develop., 9:2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 1_4:649-681 (1996)]. Na sua forma latente, o NF-κβ está complexado com membros da família do inibidor ΙΚβ; por inactivação do ΙΚβ em resposta a determinados estímulos, o NF-κβ libertado transloca-se para o núcleo, onde se liga a sequências de ADN específicas e activa a transcrição de genes. Como descrito acima, os membros de TNFR identificados até agora, ou incluem, ou não possuem uma região de domínio de morte intracelular. Algumas moléculas de TNFR que não possuem o domínio de morte, tais como TNFR2, CD4 0, HVEM, e GITR, são capazes de modular a actividade de NF-κβ [veja-se, e.g., Lotz et al., J. Leukocyte Biol., 60:1-7 (1996)].

Para uma revisão sobre a família de citóquinas do TNF e seus receptores, veja-se Ashkenazi e Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Gruss e Dower, supra, e Nagata, Cell, 8j3:355-365 (1997).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os requerentes verificaram surpreendentemente que o ligando da família do TNF designado por TALL-1 se liga ao receptor TACI e ao receptor BCMA. Os requerentes também verificaram, surpreendentemente, que o ligando da família do 8

ΕΡ 1 255 558 /PT TNF designado por APRIL se liga a ambos os receptores TACI e BCMA. Embora alguns ligandos TALL-1 e APRIL e alguns receptores TACI e BCMA tenham sido descritos anteriormente, não foi considerado na especialidade gue o TALL-1 e o APRIL se ligam e activam os receptores TACI e BCMA. A presente invenção proporciona assim novos antagonistas de anticorpo destes ligandos APRIL relacionados com TNF, de acordo com as reivindicações. Os antagonistas aqui descritos têm utilidade, entre outras coisas, no diagnóstico ou tratamento in vitro, in situ ou in vivo de células de mamífero ou condições patológicas associadas com a presença (ou ausência) de TALL-1, APRIL, TACI OU BCMA.

As suas utilizações incluem o tratamento de condições patológicas ou doenças em mamíferos associadas com, ou resultantes de uma expressão e/ou actividade aumentadas ou potenciadas de TALL-1 ou APRIL. Para tratamento, podem-se administrar antagonistas de TALL-1 ou antagonistas de APRIL ao mamífero que sofre desta condição patológica ou doença. Os antagonistas de TALL-1 e antagonistas de APRIL aqui descritos incluem imunoadesinas do receptor TACI ou imunoadesinas do receptor BCMA, bem como anticorpos contra o receptor TACI ou receptor BCMA, que preferencialmente bloqueiam ou reduzem a ligação ou activação do receptor respectivo pelo ligando TALL-1 ou ligando APRIL. Por exemplo, podem-se utilizar imunoadesinas do receptor TACI para tratar artrite reumatóide ou esclerose múltipla. Os antagonistas de TALL-1 e antagonistas de APRIL aqui descritos incluem também anticorpos anti-TALL-1 ou anticorpos anti-APRIL que são capazes de bloquear ou reduzir a ligação dos ligandos respectivos aos receptores TACI ou BCMA. Ainda outras moléculas antagonistas incluem formas modificadas de forma covalente, ou proteínas de fusão, compreendendo TACI ou BCMA. A título de exemplo, estes antagonistas podem incluir TACI ou BCMA tratado com PEG e TACI ou BCMA fundido com sequências heterólogas, tais como marcadores epitópicos ou fechos de correr de leucinas. Opcionalmente, a(s) molécula(s) antagonista(s) utilizada(s) serão capazes de bloquear ou neutralizar a actividade de ambos, TALL-1 e APRIL, e.g. um antagonista duplo que bloqueia, ou neutraliza a actividade de ambos, TALL-1 e APRIL. Pode-se utilizar um único tipo de molécula antagonista, ou uma combinação de dois ou mais tipos de antagonistas. 9

ΕΡ 1 255 558 /PT A invenção é de acordo com as reivindicações e proporciona moléculas antagonistas particulares compreendendo anticorpos anti-APRIL. Estes anticorpos incluem anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Numa concretização, os anticorpos anti-APRIL compreendem os anticorpos monoclonais anti-APRIL descritos nos Exemplos a seguir. Também são proporcionados aqui hibridomas que segregam vários anticorpos monoclonais anti-APRIL.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1A-1B mostram uma sequência de polinucleótidos que codifica para um TACI humano de sequência nativa (SEQ ID N0:1): (a sequência complementar inversa é apresentada em SEQ ID NO: 11) e a sua sequência de aminoácidos putativa (SEQ ID NO:2). A Figura 2 mostra uma sequência de polinucleótidos que codifica para um BCMA humano de sequência nativa (SEQ ID N0:3): (a sequência complementar inversa é apresentada em SEQ ID NO: 12) e a sua sequência de aminoácidos putativa (SEQ ID NO:4). A Figura 3 mostra uma sequência de polinucleótidos que codifica para um TALL-1 humano de sequência nativa (SEQ ID NO:5): (a sequência complementar inversa é apresentada em SEQ ID NO: 13) e a sua sequência de aminoácidos putativa (SEQ ID NO:6).

As Figuras 4A-4B mostram uma sequência de polinucleótidos que codifica para um APRIL humano de sequência nativa (SEQ ID NO:7): (a sequência complementar inversa é apresentada em SEQ ID NO: 14) e a sua sequência de aminoácidos putativa (SEQ ID NO:8).

As Figuras 5A-5B mostram exemplos de métodos para calcular a % de identidade de sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos designada por "Proteína de Comparação", com a sequência de aminoácidos designada por "PRO". Para os fins aqui descritos, a sequência "PRO" pode ser 10

ΕΡ 1 255 558 /PT a sequência de TACI, BCMA, TALL-1, ou APRIL referidas aqui nas Figuras 1, 2, 3, ou 4, respectivamente. A Figura 6 mostra um alinhamento de duas sequências de aminoácidos para o receptor TACI, designadas por "hTACI (265)" (SEQ ID NO: 9), que se pensa ser uma variante de splicing, e "hTACI", também referida nas Figuras 1A-1B (SEQ ID NO:2).

As Figuras 7A-7D mostram os resultados de um teste in situ, de coloração para actividade de AP. As células COS 7 foram transfectadas com TACI (Fig. 7A-7C) ou vector plasmidico (Fig. 7D) e incubadas com AP-TALL-1 (Fig. 7A, 7D); AP-TNF-alfa (Fig. 7B); ou AP-EDA (Fig. 7C).

As Figuras 8A-8H mostram os resultados, por análise de transferência de Western de vários testes de co-imunoprecipitação de TALL-1 ou APRIL com imunoadesinas de TACI ou BCMA, como descrito em pormenor no Exemplo 2. Nas Figuras 8A-BH, o TALL-1 é designado por "Blys/TALL-1".

As Figuras 9A-9B mostram os resultados de outros testes de ligação para demonstrar que o TALL-1 e APRIL são ligandos para TACI e BCMA. Na Figura 9A, as células COS 7 foram transfectadas com TALL-1 (9a-9c); APRIL (9d-9f); ou TNF-alfa (9g-9i) e incubadas com BCMA-Fc (9a, 9d, e 9g) ; TACI-Fc (9b, 9e, e 9h) ; ou TNFRl-Fc (9c, 9f, e 9i) . As células foram então lavadas, fixadas e a ligação da proteína Fc foi detectada por anticorpo de cabra anti-humano biotinilado, seguido de Cy3-estreptavidina. Na Figura 9B, as células COS 7 foram co-transf ectadas com TACI (1, 2, e 3); BCMA (4, 5, e 6); ou vector (7, 8, e 9) e incubadas com meio condicionado contendo AP-TALL-1 (1, 4, e 7), AP-APRIL (2, 5, e 8) ou AP-TNF-alfa (3, 6, e 9). As células foram então lavadas, fixadas e coradas quanto a actividade de AP in situ. Nas Figuras 9A-9B, o TALL-1 é designado por "BlyS/TALL-1". A Figura 10 mostra um diagrama de barras que ilustra os resultados de um ELISA de IgM, que testa os efeitos das citóquinas, ligandos e receptores indicados na produção de IgM em PBL alvo. 11

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As Figuras 11A-11D mostram os resultados de testes que demonstram que a interacção entre TALL-1 ou APRIL e TACI ou BCMA resulta na activação de NF-KB. Na Figura 11A, a estimulação da activação de NF-KB mediada por TACI/BCMA por TALL-1 ou APRIL. Nas Figuras 11B e 11C, a estimulação da activação de NF-KB mediada por TACI/BCMA por co-transfecção de TALL-1 ou APRIL de tamanho completo. Na Figura 11D, o tratamento de células IM-9 não transfectadas com Flag-TALL-1 também resultou na activação de NF-KB, tal como medido num teste de desvio de mobilidade electroforética. A Figura 12 mostra um diagrama de barras que ilustra os resultados de um teste ELISA, que testa os efeitos de bloquear as interacções TALL-l/TACI e TALL-1/BCMA na produção de IgM especifica de NP, de IgGl de baixa afinidade e de IgGl de afinidade elevada.

As Figuras 13-1 (painéis A, B e C) e 13-2 (painéis A, B, e C) mostram a análise imuno-histoquímica de secções de baço de ratinhos imunizados tratados com TACI-Fc ou BCMA-Fc e descritos em maior pormenor no Exemplo 5. A Figura 14A mostra os resultados de um ELISA que testa a ligação de vários anticorpos anti-APRIL a Flag-APRIL. A Figura 14B mostra uma tabela que indica os vários resultados de testes de anticorpos monoclonais 3C6.4.2; 5E8.7.4; 5E11.1.2; e 5G8.2.2, incluindo análise do isotipo.

As Figuras 15A-15D mostram diagramas de barras que ilustram os resultados de ELISA de ligação competitiva de anticorpos anti-APRIL 3C6.4.2 ("3C6") (Fig. 15A); 5E8.7.4 ("5E8") (Fig. 15B); 5E11.1.2 ("5E11") (Fig. 15C); e 5G8.2.2 ("5G8") (Fig. 15D), descritos em maior pormenor no Exemplo 9. no

As Figuras 16A e 16B mostram os resultados de testes que demonstram a inibição de artrite induzida por colagénio, por tratamento com TACI-Fc num modelo de murideo in vivo. As observações da pontuação artrítica são descritas Exemplo 10. 12

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As Figuras 17A-17F mostram perfis histoquímicos e radiológicos de articulações de ratinhos CIA tratados com TACI-Fc ou controlos.

As Figuras 18A-18E mostram os resultados de testes que demonstram que o TACI-Fc inibiu respostas imunitárias anti-colagénio no modelo de murideo de CIA. As Fig. 18A e 18B mostram os níveis no soro de anticorpos do isotipo IgGl e IgG2a anti-BCII; A Fig. 18C ilustra os efeitos de TACI-Fc nas respostas de células T proliferativas; a Fig. 18D ilustra os efeitos de TACI-Fc na produção de IL-2 por células T; a Fig. 18E ilustra os efeitos de TACI-Fc na produção de interferão-gama por células T.

As Figuras 19A-19B mostram os efeitos inibidores de TACI-Fc na proliferação de células T não previamente estimuladas, induzida por anti-CD3 ((Fig. 19A) e na produção de IL-2 por células T não previamente estimuladas induzida por anti-CD3, tal como medido por testes in vitro. A Figura 20 mostra os resultados de um teste que demonstra a inibição de encefalomielite alérgica experimental (EAE) por tratamento com TACI-Fc, num modelo de murideo in vivo. As observações da pontuação de EAE clínica são descritas no Exemplo 11. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

Os termos "TACI" ou "polipéptido TACI" ou "receptor TACI" quando aqui utilizados, incluem os "polipéptidos TACI de sequência nativa" e "variantes de TACI" (que são definidas mais à frente). "TACI" é uma designação dada aos polipéptidos que são codificados pelas moléculas de ácido nucleico compreendendo as sequências de polinucleótidos apresentadas na Figura 1 e suas variantes ou fragmentos, moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência apresentada na Figura 1 e suas variantes, bem como fragmentos dos anteriores. Os polipéptidos TACI podem ser isolados de uma variedade de fontes, tal como de tipos de tecido humano ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos. 13

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Um polipéptido TACI de "sequência nativa" compreende um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido TACI correspondente derivado da natureza. Estes polipéptidos TACI de sequência nativa podem ser isolados da natureza, ou podem ser produzidos por meios recombinantes e/ou sintéticos. 0 termo "polipéptido TACI de sequência nativa" inclui especificamente formas truncadas ou segregadas que ocorrem naturalmente (e.g., uma sequência de dominio extracelular), formas variantes que ocorrem naturalmente (e.g. formas de splicing alternativo) e variantes alélicas do polipéptido que ocorrem naturalmente. Os polipéptidos TACI incluem, mas não se lhes limitam, polipéptidos descritos em von Bulow et al., supra e W098/39361 publicado em 11 de Setembro de 1998, a variante de splicing (designada por "hTACI(265)n acima e apresentada na Fig. 6 (SEQ ID NO:9), e o polipéptido TACI compreendendo a sequência contígua de resíduos de aminoácido 1-293 das Fig. 1A-1B (SEQ ID N0:2).

Um "domínio extracelular" ou "ECD" de TACI refere-se a uma forma do polipéptido TACI que é essencialmente isenta dos domínios transmembranar e citoplasmático. Normalmente, o ECD de um polipéptido TACI terá menos de cerca de 1% destes domínios transmembranares e/ou citoplasmáticos e preferencialmente terá menos de cerca de 0,5% destes domínios. Deve entender-se que quaisquer domínios transmembranares identificados para os polipéptidos TACI são identificados de acordo com critérios utilizados por rotina na especialidade, para identificar o tipo de domínio hidrófobo. As fronteiras exactas de um domínio transmembranar podem variar, mas muito provavelmente por não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer das extremidades do domínio, como inicialmente identificado. As formas de ECD de TACI incluem as descritas em von Bulow et al., supra e W098/39361. "Variante de TACI" significa um polipéptido TACI com pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um TACI ou ECD de TACI de sequência nativa de tamanho completo. De preferência, esta variante de TACI actua como antagonista de TALL-1 ou antagonista de APRIL, como definido a seguir. Estes polipéptidos variantes de TACI incluem, por exemplo, 14 ΕΡ 1 255 558 /PT polipéptidos TACI em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados ou eliminados no terminal N e/ou C, bem como num ou mais domínios internos da sequência de aminoácidos de tamanho completo. Também são contemplados fragmentos do ECD de TACI. Normalmente, um polipéptido variante de TACI terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipéptido TACI codificado por uma molécula de ácido nucleico apresentada na Figura 1, ou um seu fragmento especificado. Os polipéptidos variantes de TACI não incluem a sequência de polipéptido TACI nativa. Normalmente, os polipéptidos variantes de TACI têm pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, muitas vezes pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos 30 aminoácidos de comprimento, mais 15

ΕΡ 1 255 558 /PT frequentemente pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 200 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 250 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 300 aminoácidos de comprimento, ou mais.

Os termos "BCMA" ou "polipéptido BCMA" ou "receptor BCMA" quando aqui utilizados incluem "polipéptidos BCMA de sequência nativa" e "variantes de BCMA" (que são descritas mais à frente). "BCMA" é uma designação dada aos polipéptidos que são codificados pelas moléculas de ácido nucleico compreendendo as sequências de polinucleótidos apresentadas na Figura 2 e suas variantes, moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência apresentada na Figura 2 e suas variantes, bem como fragmentos dos anteriores. Os polipéptidos BCMA podem ser isolados de uma variedade de fontes, tal como de tipos de tecido humano ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes e/ou sintéticos.

Um polipéptido BCMA de "sequência nativa" compreende um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido BCMA correspondente derivado da natureza. Estes polipéptidos BCMA de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes e/ou sintéticos. 0 termo "polipéptido BCMA de sequência nativa" inclui especificamente formas truncadas ou segregadas que ocorrem naturalmente (e.g. uma sequência do domínio extracelular), formas variantes que ocorrem naturalmente (e.g., formas de splicing alternativo) e variantes alélicas do polipéptido que ocorrem naturalmente. Os polipéptidos BCMA incluem os polipéptidos descritos em Laabi et al., EMBO J., 11:3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994); Gras et al., Int. Immunology, 7:1093-1106 16 ΕΡ 1 255 558 /PT (1995); Madry et al., Int. Iminunology, JU): 1693-1702 (1998); e o polipéptido BCMA que compreende a sequência contígua dos resíduos de aminoácido 1-184 da Fig. 2 (SEQ ID NO:4).

Um "domínio extracelular" ou "ECD" de BCMA refere-se a uma forma do polipéptido BCMA que é essencialmente isenta dos domínios transmembranar e citoplasmático. Normalmente, o ECD de um polipéptido BCMA terá menos de cerca de 1% destes domínios transmembranares e/ou citoplasmáticos e, de preferência, terá menos de cerca de 0,5% destes domínios. Deve entender-se que quaisquer domínios transmembranares identificados para os polipéptidos BCMA são identificados de acordo com os critérios utilizados por rotina na especialidade, para identificar o tipo de domínio hidrófobo. As fronteiras exactas de um domínio transmembranar podem variar, mas muito provavelmente por não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer das extremidades do domínio, como inicialmente identificado. As formas de ECD de TACI incluem as descritas em Laabi et al., EMBO J., 11:3897-3904 (1992); Laabi et al., Nucleic Acids Res. , 2_2:1147-1154 (1994); Gras et al., Int. Immunoloqy, 7^:1093-1106 (1995); Madry et al., Int. Immunology, 1_0; 1693-1702 (1998). "Variante de BCMA" significa um polipéptido BCMA com pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um BCMA ou ECD de BCMA de sequência nativa. De preferência, uma variante de BCMA deste tipo actua como antagonista de TALL-1 ou antagonista de APRIL, como definido a seguir. Estes polipéptidos variantes de BCMA incluem, por exemplo, polipéptidos BCMA em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados ou eliminados no terminal N e/ou C, bem como num ou mais domínios internos ou na sequência de aminoácidos de tamanho completo. Os fragmentos do ECD de BCMA também são contemplados. Normalmente, um polipéptido variante de BCMA terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente 17 ΕΡ 1 255 558 /PT pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipéptido BCMA codificado por uma molécula de ácido nucleico apresentada na Figura 2 ou um seu fragmento especificado. Os polipéptidos variantes de BCMA não incluem a sequência de polipéptido BCMA nativa. Normalmente, os polipéptidos variantes de BCMA têm pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, muitas vezes pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 200 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 18 ΕΡ 1 255 558 /PT 250 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 300 aminoácidos de comprimento, ou mais.

Os termos "TALL-1" ou "polipéptido TALL-1", quando aqui utilizados, incluem os "polipéptidos TALL-1 de sequência nativa" e "variantes de TALL-1". "TALL-1" é uma designação dada aos polipéptidos que são codificados pelas moléculas de ácido nucleico compreendendo as sequências de polinucleótidos apresentadas na Figura 3 e suas variantes, moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência apresentada na Figura 3 e suas variantes, bem como fragmentos dos anteriores que têm a actividade biológica do TALL-1 de sequência nativa. As variantes de TALL-1 terão de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipéptido TALL-1 de sequência nativa apresentado na Figura 3. Um polipéptido TALL-1 de "sequência nativa" compreende um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido TALL-1 correspondente derivado da natureza. Estes polipéptidos TALL-1 de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes e/ou sintéticos. O termo "polipéptido TALL-1 de sequência nativa" inclui especificamente formas truncadas ou segregadas que ocorrem naturalmente (e.g., uma sequência de domínio extracelular), formas variantes que ocorrem naturalmente (e.g. formas de splicing alternativo) e variantes alélicas do polipéptido que ocorrem naturalmente. O termo "TALL-1" inclui os polipéptidos descritos em Shu et al., GenBank N°. de acesso AF136293; W098/18921 publicado em 7 de Maio de 1998; EP 869180 publicado em 7 de Outubro de 1998; W098/27114 publicado em 25 de Junho de 1998; W099/1296 publicado em 18 de Março de 1999; WO99/33980 publicado em 8 de Julho de 1999; Moore et al., supra; Schneider et al., supra; e Mukhopadhyay et al., supra.

Os termos "APRIL" ou "polipéptido APRIL" quando aqui utilizados, incluem os "polipéptidos APRIL de sequência nativa" e "variantes de APRIL". "APRIL" é uma designação dada aos polipéptidos que são codificados pelas moléculas de ácido nucleico compreendendo as sequências de polinucleótidos apresentadas na Figura 4 e suas variantes, moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência apresentada na Figura 4 e 19 ΕΡ 1 255 558 /PT suas variantes, bem como fragmentos dos anteriores que têm a actividade biológica do APRIL de sequência nativa. As variantes de APRIL terão de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipéptido APRIL de sequência nativa apresentado na Figura 4. Um polipéptido APRIL de “sequência nativa" compreende um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido APRIL correspondente derivado da natureza. Estes polipéptidos APRIL de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes e/ou sintéticos. O termo "polipéptido APRIL de sequência nativa" inclui especificamente formas truncadas ou segregadas que ocorrem naturalmente (e.g., uma sequência de domínio extracelular), formas variantes que ocorrem naturalmente (e.g. formas de splicing alternativo) e variantes alélicas do polipéptido que ocorrem naturalmente. O termo "APRIL" inclui os polipéptidos descritos em Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); GenBank N°. de acesso AF046888; WO 99/00518 publicado em 7 de Janeiro de 1999; WO 99/12965 publicado em 18 de Março de 1999; WO 99/33980 publicado em 8 de Julho de 1999; WO 97/33902 publicado em 18 de Setembro de 1997; WO 99/11791 publicado em 11 de Março de 1999; EP 911.633 publicado em 28 de Março de 1999; e WO99/50416 publicado em 7 de Outubro de 1999. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências polipeptídicas de ligandos ou receptores aqui identificadas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácido numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido nestas sequências de ligandos ou receptores aqui identificadas, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para obter a percentagem máxima de identidade de sequência e não considerando nenhuma substituição conservativa como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de vários modos, que estão no âmbito dos conhecimentos na especialidade, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis ao público, tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar os parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir um 20 ΕΡ 1 255 558 /PT alinhamento máximo ao longo da totalidade do comprimento das sequências que estão a ser comparadas. Para os fins aqui descritos, no entanto, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são obtidos como descrito a seguir, utilizando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2, em que o código de fontes completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela seguinte. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 é da autoria da Genentech Inc. e o código de fontes apresentado na Tabela a seguir foi apresentado com a documentação para o utilizador no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registado com o N° . de registo da U.S. Copyright TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível ao público através da Genentech, Inc. South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código de fontes proporcionado na Tabela a seguir. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, de preferência UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.

TABELA - CODIGO DE FONTES 7* * C-C iftcreassít Ffom 12 io 15

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ΕΡ 1 255 558 /PT /* */ #ÍRd«de < sidio.fi> íinctudc <ctype.h> Idefine MAXJMP 16 /· max jumps in a diag V Adefine MAXGAP 24 f* don't continue to penalize gaps larger dum this */ jfdefiee JMPS 1024 l* max jmps in at) path *) ídcfine MX 4 1* save if thert’s at least MX-1 bases since last jmp ’ ^define DMAT 3 /* value of matching bases V Adefinc DM1S 0 /* penal ty for mismaíched bases */ ífdefme DINSO 8 !* penalty for a gap "/ Mefme DINSl 1 /* penalty per base *( tfdefme PINSO 8 /' penalty for a gap "7 ^define P1NS1 4 !* penalty per residue */ struct jmp { sbort n|MAXJMPj; /* size ofjmp (neg for dely) *7 unsigned sbort xÍMAXJMPJ; /* base no. ofjmp in seq x */ }; t* lííiúts seq to 2Ί6 ~J */ struct diag { int score; t* score at to jmp */ iong offset; t* offset of prev block */ short íjmp; /* current jmp índex *! struct jtnp jp; 1* listofjmps *t struct path { int spe; /* number of teadíng spaces */ sbort nfJMPS];/* síste ofjmp {gap) *í int ioc ofjmp (to ciem before gap) *1 }; char *ofik; char *namex{2]; char *prog; char *seqx(2]; int dmax; int dmaxD; ínt dna: int eodgaps; int gapx, gapy; int tenO. leni; int ngapx, ngapy; int smax; int *xbni; íong offset; struct diag *dx; struct path PP&B; /* output file name *i /* seq names: getseqsO */ /* pnog natne for err msgs V /* seqs: getseqsí) *! I* best diag: nw() *1 /* final diag V !* set if dna: mam0 V /* set tf penaiiamg «ui gaps */ /* total gaps in seqs */ /* seq tens "7 /* total siie of gaps */ /* max score: isw() */ /* bitmap for matchíng *t /* current offset in jmp fiie */ /* holds diagonais */ /* holtis path for seqs */ char *caliocO, *malloe0, *index()T *strepy(); char *getseq(), *g_calloc(); 22

ΕΡ 1 255 558 /PT /* Ncedleman-Wunseh alignmem progratn * * usage: progs fitei fi!e2 * where filei and file2 are two dna or two protein sequenees. * The seqeences can te in upper- or !ower-case an trtay comain atnbiguity * Any fines teginning wíth V, ' > Or * <' are tgnored * Ma* fite lettgih is 65535 (timiied by unsigned stion x ui the jmp Street)

* A sequence wiih 1/3 or more of íts eíements ACGTU is assunted to te DNA * Output is in the file "align.out' * * The program tnay create a tmp fite tn Amp to bofd mfo aboitt ttaceback. * Original versíon devefoped under BSD 4,3 ots a vax 8650 */ ffinclude "nw.ir #mclude "day.h" slatic dbval[26j = { 1.14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3.15.0,0,0,5,6.8.8,7.9,0,10,0 }; static _phval[26) = { 1, 2|(l < <{Ό·-Ά·)Η<! < <('N'"*A’)), 4, 8, 16. 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF. 1 < < 10, 1 < <11. 1 < <12. 1 < < 13, 1 < < 14. 1 < < 15, K<t6. t C < 17, 1< < 18, l<<19, 5<<2G, 1<<2S, 1<<22, I < <23. I < <24. I < <25|(1 < <(Έ'-Ά’))|(Ι< <<-Q,-,A‘)) }; main msiníac, av) tat ac; ehar *av[ ]; { preg *= av[0J;

If {ac !- 3) í <prtntf(stderr,'usage: %s filei ftleíVn*, prog); fprmtf{st<lerr,"where fíiel and fiteZ are two dna or two protein sequsuees.ln*); fprimfistden·, "The sequences can be in upper- or iower-caseW); fprsmf($iderr,*At!y fines tegmniag with or * < ‘ are ignoredln"}; fprktrfistderr,'Output ts in tte file Valign.oirtDn’); exit(i); > namexfO] “ avflj; namexf.U = Bvf2.j; seqx[0j = getseq(jw«t'*f0], &teitO), seqxfí) = getseq(natnex{13, &ienl);

Kbtn = (dna)? dbval : jpbv&l; entlgaps ~ 0; /* I to penalize endgaps */ afile = "aiign.out"; /“output file */ ttwQ; /* fiii ia tíie matrix, get the possihle jmps */ teadjmpsO; /* get lhe actual jmps */ priítrO /* prim statj, atígnmem */ } cleanup(O); /* tmlink any unp files */ 23

ΕΡ 1 255 558 /PT

/* do the alignment, retunt best scorc; maioO * cfua: values in Fitclt and Smith, PNA5, SO, 1382-1386, 1983 * pro: PAM 250 values * When scores are equal, we prefer mismatches io »ny gap, prefer * a bcw gap to çxiendíng ata ongoing gap, and prefer a iap in seqx ‘ to a gap ín seq y.

V nw() nw í char *px, *py; f* seqs and ptrs */ int •rttlely, *ddy; /* keep track cf ddy *1 int ndelx, delx; /* keep track of delx *1 int *mtp; 1* for swappíng towO, rowl *1 int mis·; /* score for each type */ útl insO, insl; 1* insertkm penaltks */ register id; /* diagonal índex V register ii; /* jmp índex */ register •colO, *cotl; /* score for ctirr, last row */ register xx, yy; /* index into seqs *i àx = (struct diag *)g_caltoeCto g« diags*, lenO+Ienl+1, sl*eof(struct diag»; tsdely = (int *)g_cal)oc("to get ndeiy", leni Ή, si/.eofí iuO); dely = {int *)g_calfoc{"to get dely\ len! +1, skeof(int))', cotO = {inl *)g_caHoc<’io gel coiO", len S + 1, sixeoffint)); coll = {int *)g”caltoc(”to get coll", ieal + 1, si/eof(ini)); insO =» (dna)? DJNSO t PINSO; insl = (dna)? DINSl : PINS1; smax ~ -10000; tf (etidgaps) { for (cotOJO] - deíyfO] *» -insO, yy = 1; yy < = ienl; yy++) { cotOfyyj = dely{>73 = colQjyy-!] - insl; ndelyíyy) = yy; > cotOJO} = O; /* Waterman Bell Math Bíot 84 */ > etse for {yy ~ 1: yy < » leni; yy + +) delyjyyj = -insO; /* ftll in ntatch mairix *! for{px = seqx|0], m ~ 1; XX <~ JenO; ρχ++, xx + +){

/* icitialize First entry in cól V tf feedgaps) { tf (xx = = 1) eollfO] = ctelx = -(insO-HnsI); eise eollfO] — clcix = colOfO] - insl; ndelx = xx; } else { cot J fOJ « O; ttelx = -insO; íttleix - 0; } 24

ΕΡ 1 255 558 /PT nw forfpy — seqx[l], yy = 1; yy < « leni; py++, yy++) { mis = coÍOby-1]; if (dna) mis + = (xbm(*px-'A’J&xbm[*py-'A>])? DMAT ; DM1S; else mis + = _day[*px-’A'][*py-‘A'J; /* update penalry for del in n seq; * favor new det over ongong del * ignore MLAXGAP if weighting endgaps *1 if (endgaps | ( ndeíyfyy] < MAXGAP) { if (colO(yy) · insO > - detyfyyl) { deiyfyy] = CôtOfyyj - {uisO-Mnsi): ndelyjyy] — 1; } else { dely[yy} -= insl; ndelyíyy]-i--e. > } else { if <coJO[yy] * (insO+insl) > = <iely[yy|) { delyfyy) = eolOJyy] - (isisO+insl): ndeiylyyj = 1; } else ndeíyfyy]-»- +; } i* updaie penaliy for del in y seq; * lavor new del o ver ongong del *i if (endgaps f { ndelx < MAXGAP) { if (col!(yy-I] - insO > ~ delx) { del* colI[yy-t| - (insO+insi); ndelx = 5; }<&«{ delx - = insl; ndelx + + ; } ) else { if (coll[yy*l] * (ínsO+insl) > = delx) { delx = coll[yy-ll - (insO+insí); ndel* =» I: } eke ndelx + + ; > /* ptefc the maximum score; were favoring * mis over arcy dei and delx over dely */

25 ΕΡ 1 255 558 /PT ...nw td « χχ - yy + " !' »f <m«s > = dei* && m« > - deíylyy]) coti{yy] = m»s: dse if (detx > - dslyíyy]) { eoíljyy) = deU; ij * d£ftd).ijmjí: if{dx[íd].jp.o|OJ &&. (!dfu |} (ndelx > » MAXÍMF && xx > dx{kl}.jp.x{ij3+MX) j 1 mis > dxfjdj .score+DíNSO)) { dxtiiQ.>j«ç»+ +; if(++ij > — MAXJMP) { writejinps(id): *j — dxjidj.ijnip — 0; dx[id|.oft«t * offset; offset + “ steeoflsiruct jtnp) + s«eof{offset}; ) > dx[td}.jp.uí'jl - «W*; dxfidj jp.xlij} * xx. dxiidl.scote -ádx. cerftfyy] = deiyfcyyj; ij «> dxfidj. ijmp; 1 (Bdelytol > «= MAXJMP &&xx > dxíWJ jp xriji+MX) j | tnis > dxfjdJ.scote + OÍNSO}) t dx[idj.ijinp+ +; ifí4-+-ij > » MAXJMP) { writcjnipsfíd); ij ** dx[idMjmp “ 0; dx[id].offset ss offset; offset + — sÍ3teof<struct jcapí +· sixeof(offcec); } } dx{id) jp nfô5 = -odely[y>'3; dx{WJ.jp.Klu} * «5 dxfidj.score ·= delyfyyl;} íf {** = - lenO &4t yy < leul) { /* last ool *í íf (MMjgSps) coli|yy) iasO+insl -yy): if to>ll{yy5 > stnax) { smax = cotllyyj; dm*x — èd;}} > if (endgaps && xx < tenO) colS[yy-lj -- wsQ+insJ*{iet0-»O; if <colJ[yy-l) > sroax) { smax - coUfyy-IJ: draax ~ id; trap = ctrtO; colO »» coll; coH «= tmp;} (votd) free((char *)ndely); (void) free((dhar *)dely); (void) ffee({ch*r *)col0): fvoid) freeí(char *)coll) > 26

ΕΡ 1 255 558 /PT /* * * primO “ only routine visibíe outside tlus moduie * * sutic:

* getmaiO - trace back best path, count maicltts: priniO

* Pr_a*'SnO " Pr™ fllignmfint of described tu array p[ ]: priíttQ

* dumpblockQ ~ dump a block of fines witit niunbers, stars; pr_a)ignQ

* nums() - pvit out a number Une: dttnspbloekO

* pudineO -- put out a lírtt (natne, [num], scq, liiunt]): dumpbtockO

* surs{) * .puí a line of stârs; dumpbloekO * stripnameO - strip any país and prefix from a sequame */ #indudÊ Ow.h’

Wefinc SPC 3 #defint P LI NE 256 l* maxtmum outpui límt *! Aáefme P SPC 3 !* spaee between name or num and $eq */ extern _day[£6]í26]. int olen; /* ser output lute lengtb *! FILE ‘fx; t* output file */

primO { print

utt Ix, i>\ firstgap, lastgap; f* overlsp V if (ífx = fopen(oftl6, ’w')> = = 0) { fprintfístderr,' %s: can't write prog, ofiie); elea»up{t); } fprintfifx, ” < íirst sequeoce: Ss (lengíh = %d)Vn\ namex[0]. lenO); fprintfífx, ’ <second sequence: %s (lepgih = %d)\n\ namexll). tent>; oien = 60;

Sx — íeuO; iy ·=· leni; firstgap = lastgap = 0; íf (dmax < ienl -1) { /* Icading gap m x *7 pp[0].spc = firstgap = leni - droax - i; ly -= pp[0].spc; } eLse ιΓftJmax > leni -1> { /* leaditig gap it» y rf pp[l}.spc = firstgap = dmax -{leni -1); ix -= pp[i).Spc; }

if (dmaxO < lettO · 1) { )* trailins gap ir» x V lastgap = lenO - dmaxO -1; ix - — lastgap; > cise if (dmaxO > lenO - I) { f* tnúling gap m y */ lastgap = dmaxO - (lenO - i); ly ·» lastgap: ) gctmatflx, ly, firsigap, lastgap); pr_aiignO; } 27

ΕΡ 1 255 558 /PT /* * trate bacfc lhe best pathf count matctej *i staiic getmat geimai(ix. \y. ftrstgap, lastgap) int U. ty; f* "cort' {minas entigaps) */ int ftrstgap, lastgap: /* ieading trailing overíap *t int ctar áoubie rcgister register char nm, iO, iJ, sii@, sitl; ο«αί32ϊ; pct; nO, »i; *pO, *pí; /* get total ntatehes, score •f Ϊ0 — i 1 = skÕ = siz! κ 0; pO a: SMptlD] + ppí!5<spc; pi Setjxjl] + PPlO].spc, nO = ppi/ispc + 1; ní = pp(0].spe + 1; nm — 0; whíie ( *pO && *p) ) { if (sizO) { pi + +; nl + +; siri)—: } dse íf (siil) { pO+ +; nO+ +; sí2i~; ) dst { íf (nbroí.^pO^A^&xbmt^i^A’]) nm+ + ; if (r.0++ ρρ[03.χ[ίϋ}> staO ~ ppíO].nfiO++lt ίΓ{ηΙ + 4· “<“ pp£l|.st[ít J) sizl - ppflj ofil ++]; pCM- + ; pí + + ; Ϊ } l* pít homoiogy * if ptoaluiag endgaps, base is ttte shorier s«j * eise, fcnotk off overhangs atid take shorter core ·/ if (eodpps)

Ix = (l«nO < leni}? íerít; leal; etse li = (tx < )y)7 Ix : ly; pct - lOO-*C<ie«ble}t«n/(tit)ubíe)ts; íí>rintf(fx, "Vn"): fprmtf/fi, ' < %ύ maícbSs io aa overtap of %d: %.27 percem shníiarityta", nm, (ran «*·*· 1)? ; *es\ Ix, pct); 28

ΕΡ 1 255 558 /PT fpriwfíftt, " <gaps in firsi sequente; %d\ gapx); . ..getlrtat if (gapjí) i (void) Sprint f{outx, " (%d %s%s}', flgapx. (dna)? "base";"reiídue", {ngspx == 5)? "'.'s"): íprimf(f*,"%s"< ouix); fprinitXfjt, ", gaps ir» second saquence: Kd*, gapy); tf (gap>) { ívoid) sprííirffoutx, “ (%d %s%sy, agapy, {dna}? "basc";”residufi’', (ngapy —— U? “"rVj; fpnmftfx/fts*, outx); } íf (dna) fpmtfffx, *\n<s«we; %<l (mut-h — %â, mismafcii ~ %â, gappenalty %ú + %ri perbasejln", stnax, DMAT, DMÍS, DÍNSO, DíNSt}; eise fpnnf(fj, \n<score: &d (Dayboff PAM 250 matrix, gap penaity - %d + %<J per res«jue3\ii\ smax. PINSO, PINS1); ff(endgaps) fprirtfTti, ”<emigsps ponaltietl. lefi endgap. %ú %$%i, right codgap; %i %s%$\n', firstgap, (dna)? "base' : “residue", {fifstgap “ “ 1)? ” r 'i", lastgap, (dna)? "base” : ’ residue", {tastgap ~~ !)? ; V); eise fpnntíTfx. " <eadgaps nòt penal izftfJVn*); } statie nm; /* matches m core — for chcddng */ statie Ima*; /* lengths of stnppcd file carnes *1 statie UÍ21; f* jmp irtóex for a ρβΰι *f statie wPl: /* auraber ai start of currern line */ statie ni|2J; /* current elem munber - far gapping *f statie si?.[23; statie char *psra: t* ptr to curtem elernem *i statie cftar i* ptr to next output char Slot */ statie dtar outmfP LÍNE); /* output line *7 statie dtar stôifP LíNEj; /* sa by starsO *f l* * print aiignnteiu of deseribed iji síract patli ppf J */ jtatic pralign

p,-_âtigDO {

int nn; !* citar eoura V int more; regtstix i; for {í = 0, Intax ~ 0; i < 2; i+ +) { nn ~ imprameínamesfi)}; íf (na > Imas}

Inux = m, ncj t} = i; nífi] “ 1',

Srifil = ij[i] = 0; psfil = seqxfií; po[i] = owft]; } 29

ΕΡ 1 255 558 /PT -..pr_align for («η = nm = £L more =* i more;) { for {t “ more = 0; í < 2; i+ +> { f* * do we trave more of ih.s setpience? */ contáuie; more + +; íf (pj>|i].spc) { /* Jeadiag space *i *í>o[iJ + + “ ' ppíij.spc-: }

*ls« ir (s«[t}> { /* in a gap V “po[iJ+ + “ } else { /* we're jmníog a seq etemenr *pofi) « *ps[i]; ir (istowerfpsfí])) *ps[ij “ ioupper(*psfi]); p°í>]++; ps.fi H' + . /* * are we ar next gap for ftts seq? */ *** ppítl.xfijfi]}) { Λ * we need to merge ali gaps * ai this Joeation si2fi] - pp[il.ft{ij[il++J; whUe ~ - pp[ij r[ijli)l> sia{i| += j^íj.o[ijIi]++J; > nifí]+ + ; > } if {++«11 oten 11 ímore && na) { dumpbloekQ; for{i = 0; i <2; i+ +} pojij - omji}; nnnO; > > } /* * ílump a biook- of tines, iactuding numbers, stars; pr_aJign()

V static dumpblock

durapbtocfcQ í register i; for {i = 0; i < 2; i+ + ) •pofij— “ J\0‘; 30

ΕΡ 1 255 558 /PT ...dumpbiock (voÍd) putc.Cin', fx); for (5 — 0; * < 2; >->+) { if (*out[iJ <£& (*out[i] ‘ ’ i 1 *(pofii) !“*}){ ifíi === 0)

Fiums(t); if(i = = 0<&& *out[ij) starsO; fmUínefí); if fí =» >= 0 && *out[l]) fprint iífx, ssar); tf (i - =* i) nums(i); } } 1 r ” pm ous s number ííqb: chimpMockO */ Siatk tíums(íx) nums { int ix; dhar regitter register cfetar !* iralex in outf J ftoldíag secj tine */ nlínefP_LIN£J; *, j; *ρπ, *px, *py; for fpn = tiiitíe, i « 0; i < Itpsuc+PjSPC; i+ +, pn+ +} *pn — * for <i - ncjíxj, py — out[ix); *py; py + +·, pn4 +) { jf(«py = = ’ ’ i j *py == *pn =* ' else {

Sf (*% 10 = = o 11 (i =« í && ocftxj I» { j = (i < 0)? -i: i; for (px = pn; j; j /= 10, px-> *px = jSlO + ’0‘; tf (í < 0) *px = } cise *ptt — ' i++; } } *pa = ‘\0·; ncfix) ~ >; for (po ~ uliee; *pn; pn+ +> (void) pote(“pn, fx); (vtiitl) puic(’ta*, £x); } i* •puí out a Hae (aame. (num), sctj, intuo]): dumpblockO */

Stíltic puflinetix) { putlíne int ix; 31

ΕΡ 1 255 558 /PT ...putline int »; register ehar *px; for (px = uamexjix), i = 0; *px && *px ?= V; px++, i+ +) (voítl)puK{*fi.<, fj); for (, i < imax+PJSPC; i+ + ) (voftf) putc{' ', fx); l* ibese count ffom ! : * nifj curreni et-emeni (ta® l) * nc[ ] is numbcr ar sran of currcnt line "7 for(jw = oaifixj: *px; pi + +) (voitl) puic(*px&Ox7F, fx); (votd) piKcCVn', fx); } /* * put a !ine of stars (seqs aiways in outfO}, wt{!]): thimpiífockC »/ slatic s tarso stars { int i; registar ohar *p0, *p5, cx. *ρχί »f (**om[0} | s (*curC01 = - ' ' && *(po[03) = « ' ‘) | j ?*οωΜ I! C*«uíl] == *&& *<po{l]) = = ’ ')) return; px = star; for (i = ímax+P__SPC: i: í-) *px+-t· — ' for {pG ** oat[0], pl ” oui[lJ; *p0 &&, *pl; p0+ +, pt + +) { if (ísalphaCpO1) isalpha(*pl)) { íf (Χ&υιί*ρΟ-·Α·]&χδ(ϊΐ[*ρΙ-Ά']) { cx nm+ + ; } eise Sf (ídfiâ && ^dayt^pCKA^f^pKAl > 0} cx - V; cásc cx = ‘ *] } felíft CX = * '; *px+-4 « cx; } *px+ + — 'W; *px = 'W; }

32 ΕΡ 1 255 558 /PT /* * strip path or prefix tora pn, remnt lea: prjtísgnÇ) */ statíc strípoame/pn) char *pn; /* file narae (raay be psth) V { regfeter citar *px, *py; py » 0 ; for (px » pn: *px; px+-r) if<*px == V) stripname if (py) py β ρχ + i; returr»ÇstrÍen(pn)); (void) Sírcpy(pn, py); }

33 ΕΡ 1 255 558 /PT /* * cíeamipO - cleanup any rmp fite * geiseqQ - read iu seq, set cm. leis, maxlen * g cillocO " caíloeO error eheckin * readjmpsO - get ihe good jtnps, frora tmp file tf rteeessary * wntsjtnpsO - write a filiei array of jmps to a tmp file: nw() */ tfirudnde “nw.h* ^tnelude <sys/filc.h> char *jname = 'Vtmp/hGtngXXXXXX"; f* tmp file for jiups */ FILE *§; int deanupO; /* cleanup tmp file *í iong IseekO; /* * remdve any tmp fite if we blow *s eleanupti) int t;{ if(0> (voíd) unlirtScljndme); exit(t);> cleanup t* * read, reront ptr to seq, set dna, leu, maxlen * slcip línes staning witfi ' <. or ' > ’ * seq ir upper or lower case */ char *

getsetjffile, ien) char int *:eti:í char registo-char int FILE /* file tiame */ !* seq len */ line[H)?.4j. *p$eq; *px, *py; natge, tlen; *íjp; getseq «Γ(((ρ = fopeaifile/r’)} 0}{ fprinrf(sttlcn-,"%s: can’t read %s\n', prog, file); exit(I);} tlen ~ natge = 0; whSc <fgets(Uiw, 1024, ήρ)} { íf (*line = - || *line ~~ ’< ’ | j *ltn£ =~ *>') continue; for (px “ liite; *px !=> ‘\n'; px+ +) íf (isupper(*px) j | islower(*px)} if ((pseq ·> matioc((uasígnc<JKtlea+6)>) = = 0} { fprincf;atleiT,-%s: matloci) failed to get %d bytes fot %s\n”, prog, tlen-r6, fite); exiiíl);> pseqfO] = pseqfl.1 ^.pseqpj ^ pseq[3) «* 'VO'; 34

ΕΡ 1 255 558 /PT ...gfctseq py = pseq + 4; *leti = tlen; rewindfíp); whiie (fg£U(line, 1024, fp>) { if (*líne >= = ' ! | *line » = ‘ <’ | j *line ® » ‘ >*} continue; f»r{px tine; *px ?= ’\e‘; px + +) { tf (isupper(*px)) *py + =£ *ρχ; elsc íf (jstower(*px)) *py+ + “ touppcr(*px); íf (index("ATGCU*,*(py'S))) natgc + +; } *py+ + « 30'; •py = \C; (vnid) íblose(fp)-t dna natge > (ílen/3); returolps^íj +4); } gcalloc thar · g_caJloe{msg, nx, sz)

char *rosg; I* projraro, calling routine V

úii nx. si; /* asunber and sitx of cfctuents V i thar *px, *ca)loc0;

If ((px = calioc((nnsign«J)iw, (unsigned)sz)) = = 0> { tf (*tnsg) { sz); tprin<f(stderr, *%s: g_ca)loc0 failed %s (n=%d, 5z=%d)tn", prog, msg, nx, } } rettirn(px); } /* * get final jmps from dx[} or ttnp flie, set ppí ], resei dmajs: maínO ·/ readjmps

readjwpsO { int fd “ -1; int siz, ÍO.tl; register i. j. xx: (voidj fctose(fj): íf{(fd = open(jiwm*. C5RDONLY, 0» < 0} { fprirwf(std£n·, "%s: ean't openO %sln\ prog, jnaine); deanupCl): } í for (i * iO =* íí — 0, droaxO = dtnax, xx lenO; ; i+ + ) { whilí (1) { far (j = dxtdmaxj.ijrap; j > = 0 &.A. djí[dinaxJ,jp.x[íJ > = xx; j—)

35 ΕΡ 1 255 558 /PT if (j < Ο && dx[dmaxJ,offses && fj) { (voíd) lseeb<fd, <Sx[dmax].oRset, O); <-voiet> readfrd, fchar *)&iix[(!max}.jp, síxeof($*rudi jropM; <void) read(Fd, (char *)á«U[ílraaxl.effsei, sizcofítíxfdma.Tj.ofEel)); dxídmaxj.ymp - MAXJMP-l;} else breaJt;} if α > = jmpsh fprintf{íKtefr. '%> too many gaps «n alígnmení\n\ prog); ckaniipOh} lf(j >= 0>{ siz = dxiilmax] !p.n[j); xx = dxldrnixl.jp. x[j); díiiíA + ~ sit; If (six < 0) [ /* gap in seccmd seq */ pp{IJ.nfi1j = -slí; xx + = sií; /* id = xx - yy + lent - I V ppfl|,xpi] — xx - dmax + leni - I: gapv -í' 4, ngapy - = ste; f* ignore MAXGAP wlicri deing endglps *1 ϋζ f-sir < MAXGAP | i enágaps)·? -sá : MAXGAP; if + +; -.readjmps > efac íf <siz > 0) { 1* gap «n firsi seq *1 pplOl.nftO] - ítz; ppíO].x[iO> = xx; gapx + + ; ngapx + = $k; l* ignore MAXGAP wben doitig aidgsps */ siz - {siz < MAXGAP 11 ersdgspsJV siz : MAXGAP; Í0+ + .}} ebe > b«ak; /* reverse the oriler oFjíõps *! for (j = 0. iO—; j < ffi; j+ +. íQ—) { i = ppíoi.oiij; ppfOj.nfj] => pr/OJ.o(iQj: pp[0|.n{i!)j = i; * = pp[0).x(jj: pptOj.xUI - pp|0j.*[i0}; pp[0].*[it>S = *;} for (j = 0, il~; j < il; j+ +. il—) { i = ppni nljl: ρρΠ!·πϋ) «= ppÍil.nfíi}: ppIUnííll = i: > = ppn!-*tíS; ppf>í.x{0 ^ ppUl.xtii); ρρΡ)-*1·υ °= i;} if (fd >=0} (votó) close(fd); if <fj) { (voíd) unlinkíjname}; ή ·» 0 ; oflsét *· 0;} } 36

ΕΡ 1 255 558 /PT (* * wrae a fiifed jtnp stwa offeet of the prev o*» (*f sey); aw() */ writtimpscíx} wrítcjrops inl ix; { char *mfcí«np0; if {wktenip(j«arn#) < 0) f fprintf(stóen, "fés: caa't mkíampO %s\n", prog, jname); cleatmpC 0; } if {(§ - fopffl^jnantÉ, 'w*}> ~= 0) { <^rioif(s«derr, "%s. can't wr«e %s\n\ prcg, joatnc): e%ií( t>; } > (voíti) fvvrite((c3w stz*0f(sira«t jaip), i, fj); (voíd) fvvritc«cbar *}á«ix|ixí.oíTís«t, 5Í«of(tíjt{!*] .oífse»), í,

Para os fins aqui descritos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de, ou entre, uma determinada sequência de aminoácidos A em relação a, com, e, ou contra, uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode ser dito, de forma alternativa, como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos em relação a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue:

100 vezes a fracção X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácido classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento do programa de A e B e em que Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Deve ter-se em conta que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A em relação a B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B em relação a A. Como exemplos de cálculos de % de identidade de sequência de aminoácidos, as Figuras 5A-5B mostram como calcular a % de identidade de sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos designada por "Proteína de Comparação" em relação à sequência de aminoácidos designada por "PRO". 37

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Salvo especificamente referido em contrário, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos aqui utilizados são obtidos como acima descrito utilizando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2. No entanto, a % de identidade de sequência de aminoácidos também pode ser determinada utilizando o programa de comparação de sequências NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 2_5: 3389-3402 (1997)). O programa para comparação de sequências NCBI-BLAST2 pode ser retirado do site da NCBI na Internet. O NCBI-BLAST-2 utiliza vários parâmetros de pesquisa, sendo todos esses parâmetros de pesquisa ajustados para valores predeterminados, incluindo, por exemplo, "unmask" = "yes", "strand" = "all", "expected occurrences" = 10, "minimum low complexity length" = 15/5, "multi-pass e-value" = 0,01, "constant for multi-pass" = 25, "dropoff for final gapped alignment" = 25 e "scoring matrix" = BLOSUM62.

Em situações em que o NCBI-BLAST2 é utilizado para comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de, ou entre, uma determinada sequência de aminoácidos A em relação a, com, e, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode ser dito, de forma alternativa, como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos em relação a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue:

100 vezes a fracção X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácido classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências NCBI-BLAST2 nesse alinhamento de A e B do programa e em que Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Deve ter-se em conta que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A em relação a B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B em relação a A.

O termo "marcado com epítopo" quando aqui utilizado, refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo um polipéptido fundido com um "polipéptido marcador". O 38 ΕΡ 1 255 558 /PT polipéptido marcador tem resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual se pode produzir um anticorpo. 0 polipéptido marcador é também, de preferência, bastante único na medida em que o anticorpo não tenha reacção cruzada substancial com outros epítopos. Os polipéptidos marcadores adequados têm geralmente, pelo menos seis resíduos de aminoácido e têm normalmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácido (de preferência entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácido).

Tal como aqui utilizado, o termo "imunoadesina" designa moléculas do tipo anticorpo que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efectoras dos domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é outra que não o local de reconhecimento e de ligação ao antigénio de um anticorpo (i.e., é "heterólogo") e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A parte de adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo pelo menos o local de ligação de um receptor ou um ligando. A sequência do domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. O termo "antagonista" é utilizado no sentido mais lato e inclui qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou totalmente uma ou mais actividades biológicas de um polipéptido TALL-1, polipéptido APRIL, ou ambos, TALL-1 e APRIL, in vitro, in situ e in vivo. Exemplos destas actividades biológicas de polipéptidos TALL-1 e APRIL incluem ligação de TALL-1 ou APRIL a TACI ou BCMA, activação de NF-KB e activação da proliferação e de secreção de Ig por células B, condições relacionadas com imunidade, tais como artrite reumatóide, bem como outras descritas na literatura. Um antagonista pode funcionar de um modo directo ou indirecto. Por exemplo, o antagonista pode funcionar de modo a bloquear, inibir ou neutralizar, parcial ou totalmente, uma ou mais actividades biológicas do polipéptido TALL-1, polipéptido APRIL ou ambos, TALL-1 e APRIL, in vitro, in situ, ou in vivo, 39

ΕΡ 1 255 558 /PT como resultado da sua ligação directa a TALL-1, APRIL, TACI ou BCMA. 0 antagonista pode também funcionar indirectamente, bloqueando, inibindo ou neutralizando, parcial ou totalmente uma ou mais actividades biológicas do polipéptido TALL-1, polipéptido APRIL ou ambos, TALL-1 e APRIL, in vitro, in situ ou in vivo, como resultado de, e.g., bloquear ou inibir outra molécula efectora. A molécula antagonista pode compreender uma actividade antagonista "dupla" em que a molécula é capaz de bloquear, inibir ou neutralizar, parcial ou totalmente, uma actividade biológica de ambos, TALL-1 e APRIL. 0 termo "agonista" é utilizado no sentido mais lato e inclui qualquer molécula que potência, estimula ou activa, parcial ou totalmente uma ou mais actividades biológicas do polipéptido TACI, polipéptido BCMA ou ambos, TACI e BCMA, in vitro, in situ ou in vivo. Exemplos destas actividades biológicas de TACI e BCMA incluem activação de NF-KB, indução da produção e secreção de imunoglobulinas e proliferação celular, bem como outras referidas na literatura. Um agonista pode funcionar de um modo directo ou indirecto. Por exemplo, o agonista pode funcionar de modo a potenciar, estimular ou activar parcial ou totalmente uma ou mais actividades biológicas do polipéptido TACI, polipéptido BCMA ou ambos, TACI e BCMA, in vitro, in situ ou in vivo, como resultado da sua ligação directa a TACI ou BCMA o que provoca a activação do receptor ou transdução de sinal. 0 agonista pode também funcionar indirectamente para potenciar, estimular ou activar parcial ou totalmente uma ou mais actividades biológicas do polipéptido TACI, polipéptido BCMA, ou ambos, TACI e BCMA, in vitro, in situ ou in vivo, como resultado, e.g., da estimulação de outra molécula efectora, o que por sua vez provoca a activação do receptor TACI ou BCMA ou a transdução de sinal. É contemplado que um agonista possa actuar como uma molécula potenciadora que funciona indirectamente para potenciar ou aumentar a activação ou actividade de TACI ou BCMA. Por exemplo, o agonista pode aumentar a actividade de TALL-1 ou APRIL endógeno num mamífero. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pré-complexando o TACI ou BCMA, ou estabilizando complexos do ligando respectivo com o receptor TACI ou BCMA (tal como estabilizando o complexo nativo formado entre TALL-1 e TACI ou APRIL e TACI). 40

ΕΡ 1 255 558 /PT Ο termo “antagonista de TALL-1" ou "antagonista de APRIL" referem-se a qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza, parcial ou totalmente, uma actividade biológica de TALL-1 ou APRIL, respectivamente, ou de ambos, TALL-1 e APRIL, e inclui, mas não se lhes limitando, formas solúveis do receptor TACI ou receptor BCMA, tais como uma sequência de domínio extracelular de TACI ou BCMA, imunoadesinas do receptor TACI, imunoadesinas do receptor BCMA, proteínas de fusão do receptor TACI, proteínas de fusão do receptor BCMA, formas do receptor TACI modificadas de modo covalente, formas do receptor BCMA modificadas de modo covalente, variantes de TACI, variantes de BCMA, anticorpos do receptor TACI, anticorpos do receptor BCMA, anticorpos de TALL-1, e anticorpos de APRIL. Para determinar se a molécula antagonista de TALL-1 bloqueia, inibe ou neutraliza, parcial ou totalmente, uma actividade biológica de TALL-1 ou APRIL, podem-se realizar testes para determinar o(s) efeito (s) da molécula antagonista, por exemplo, na ligação de TALL-1 ou APRIL a TACI ou a BCMA, ou a activação de NF-KB pelo respectivo ligando. Estes testes podem ser realizados em formatos de teste in vitro ou in vivo conhecidos, por exemplo, em células que expressam BCMA e/ou TACI. De preferência, o antagonista de TALL-1 utilizado nos métodos aqui descritos será capaz de bloquear ou neutralizar pelo menos um tipo de actividade de TALL-1, o que pode opcionalmente ser determinado em testes como aqui descrito. Para determinar se uma molécula antagonista de APRIL bloqueia, inibe ou neutraliza, parcial ou totalmente, uma actividade biológica de TALL-1 ou APRIL, podem realizar-se testes para determinar o(s) efeito(s) da molécula antagonista, por exemplo, na ligação de TALL-1 ou APRIL a TACI ou a BCMA, ou a activação de NF-KB pelo ligando. Estes testes podem ser realizados em formatos in vitro ou in vivo conhecidos, por exemplo, utilizando células transfectadas com TACI ou BCMA (ou ambos TACI e BCMA) (de preferência transfectadas a níveis relativamente baixos). De preferência, o antagonista de APRIL utilizado nos métodos aqui descritos será capaz de bloquear ou neutralizar pelo menos um tipo de actividade de APRIL, o que pode ser opcionalmente determinado num teste de ligação ou num teste de produção de IgM. Opcionalmente, um antagonista de TALL-1 ou antagonista de APRIL será capaz de reduzir ou inibir a ligação quer de TALL-1, quer de APRIL (ou ambos TALL-1 e APRIL) a TACI ou a 41

ΕΡ 1 255 558 /PT BCMA, em pelo menos 50%, de preferência em pelo menos 90%, mais preferencialmente em pelo menos 99%, e muito preferencialmente em 100%, em comparação com uma molécula de controlo negativo, num teste de ligação. O antagonista de TALL-1 ou antagonista de APRIL pode compreender anticorpos que irão inibir competitivamente a ligação de outro ligando ou anticorpo a TACI ou BCMA. Os métodos para determinar a especificidade e afinidade dos anticorpos por ligação competitiva são conhecidos na especialidade [veja-se, e.g., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1998); Colligan et al., Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoe., Nova Iorque (1992; 1993); Muller,

Meth. Enzym., 9_2:589-601 (1983). O termo "agonista de TACI" ou "agonista de BCMA" referem-se a qualquer molécula que potência, estimula ou activa, parcial ou totalmente, uma actividade biológica de TACI ou BCMA, respectivamente, ou de ambos, TACI e BCMA, e inclui, mas não se lhes limitando, anticorpos anti-receptor TACI e anticorpos anti-receptor BCMA. Para determinar se uma molécula agonista de TACI potência, estimula ou activa parcial ou totalmente uma actividade biológica de TACI ou BCMA, podem-se realizar testes para determinar o(s) efeito(s) da molécula agonista, por exemplo, em PBL ou células transfectadas com TACI ou BCMA. Estes testes podem ser realizados em formatos de testes in vitro ou in vivo conhecidos. De preferência, o agonista de TACI utilizado nos métodos aqui descritos será capaz de potenciar ou activar pelo menos um tipo de actividade de TACI, que pode ser opcionalmente determinada em testes tais como os aqui descritos. Para determinar se uma molécula agonista de BCMA potência, estimula ou activa, parcial ou totalmente, uma actividade biológica de TACI ou BCMA, podem-se realizar testes para determinar o(s) efeito(s) da molécula agonista, por exemplo, na actividade de APRIL ou TACI. Estes testes podem ser realizados em formatos in vitro ou in vivo, por exemplo, utilizando PBL ou células transfectadas com TACI ou BCMA. De preferência, o agonista de TACI ou agonista de BCMA será capaz de estimular ou activar TACI ou BCMA, respectivamente, na mesma extensão que é conseguida pelo ligando nativo para os receptores TACI ou BCMA. 42

ΕΡ 1 255 558 /PT Ο termo “anticorpo" é utilizado no sentido mais lato e abrange especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais simples contra TALL-1, APRIL, TACI, ou BCMA, composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos de cadeia única e fragmentos de anticorpo. 0 termo “anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e. os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos, excepto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente, que poderão estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpo convencionais (policlonais), que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que são sintetizados pela cultura de hibridomas, não contaminados por outras imunoglobulinas. 0 adjectivo “monoclonal" indica que o anticorpo é obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea e não deve ser entendido como sendo necessária a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a ser utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (veja-se, e.g., Patente US N°. 4816567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos, utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a, ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular, ou que pertencem a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico a, ou homólogo às sequências 43

ΕΡ 1 255 558 /PT correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que estes exibam a actividade biológica desejada (Patente US N°. 4816567;

Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). São conhecidos na especialidade métodos para produzir anticorpos quiméricos.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g. murideo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) que contêm a sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpos receptores) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como um ratinho, rato ou coelho, com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos da sequência estrutural (FR - framework) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor, nem nas sequências CDR ou sequências estruturais importadas. Estas modificações são feitas para refinar e maximizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo, de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também irá compreender, de forma óptima, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja-se Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct♦ Biol., 2:593-596 (1992). O anticorpo humanizado inclui um anticorpo PRIMAI IZED™ em que a região de ligação ao antigénio do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por imunização 44

ΕΡ 1 255 558 /PT de macacos Macaca com o antigénio de interesse. São conhecidos na especialidade métodos para produzir anticorpos humanizados.

Os anticorpos humanos também podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na especialidade, incluindo bibliotecas de apresentação em fagos. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. , 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol.

Biol., 222:581 (1991) . As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para uma preparação de anticorpos monoclonais humanos. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1) : 86-95 (1991). “Isolado" quando utilizado para descrever as várias proteínas aqui descritas, significa uma proteína que foi identificada e separada e/ou recuperada de um componente do seu meio ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu meio ambiente natural são materiais que iriam tipicamente interferir com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticas da proteína e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em concretizações preferidas, a proteína será purificada (1) até um grau suficiente para se obterem pelo menos 15 resíduos N-terminais ou internos, da sequência de aminoácidos utilizando um sequenciador de copo giratório, ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE, sob condições não redutoras ou redutoras, utilizando coloração com azul de Coomassie ou, de preferência, com prata. Proteínas isoladas incluem proteínas in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do meio ambiente natural da proteína não estará presente. Normalmente, no entanto, a proteína isolada será preparada por pelo menos um passo de purificação. "Tratamento" ou "terapia" refere-se, quer a tratamento terapêutico, quer a medidas profilácticas ou preventivas. "Mamífero" para fins de tratamento ou terapia refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de quinta e animais de zoológico, desporto ou animais de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De preferência, o mamífero é um humano. 45

ΕΡ 1 255 558 /PT “Condição patológica relacionada com TALL-1" e "condição patológica relacionada com APRIL" referem-se a patologias ou condições associadas com níveis de expressão ou de actividade anormais de TALL-1 ou APRIL, respectivamente, em excesso ou inferiores aos níveis de expressão ou actividade em mamíferos saudáveis normais, em que estes níveis em excesso ou diminuídos ocorrem num tipo de tecido ou célula sistémico, localizado ou particular, ou num local do corpo. As condições patológicas relacionadas com TALL-1 e as condições patológicas relacionadas com APRIL incluem doenças imuno-relacionadas agudas e crónicas e cancro.

Os termos "cancro", "canceroso" e "maligno" referem-se a, ou descrevem, a condição fisiológica em mamíferos que se caracteriza tipicamente por um crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem, mas não se lhes limitam, carcinomas, incluindo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particulares destes cancros incluem cancro de células escamosas, cancro de pulmão de células pequenas, cancro de pulmão de células não pequenas, cancro gastrointestinal, linfoma de Hodgkin não-Hodgkin, cancro pancreático, glioblastoma, cancro cervical, cancro dos ovários, cancro do fígado, tal como carcinoma hepático e hepatoma, cancro da bexiga, cancro da mama, cancro do cólon, cancro colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim, tal como carcinoma de células renais e tumores de Wilms, carcinoma de células basais, melanoma, cancro da próstata, cancro vulvar, cancro da tiróide, cancro testicular, cancro do esófago, e vários tipos de cancro da cabeça e pescoço. Opcionalmente, o cancro expressará, ou terá associado com a célula cancerosa, TALL-1, APRIL, TACI ou BCMA. A título de exemplo, foi referido na literatura que os cancros do cólon, pulmão e melanoma expressam APRIL. Os cancros preferidos aqui para tratamento incluem linfoma, leucemia e mieloma, e seus subtipos, tais como linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica ou linfocítica aguda, linfoma não-Hodgkin e linfoma de Hodgkin, e leucemia mielóide aguda. 46

ΕΡ 1 255 558 /PT

Ο termo “doença imuno-relacionada" significa uma doença em que um componente do sistema imunitário de um mamífero causa, medeia ou contribui de outro modo para uma morbidez no mamífero. Também se incluem doenças em que a estimulação ou intervenção da resposta imunitária tem um efeito de melhoria na progressão da doença. Incluem-se neste termo as doenças auto-imunes, doenças inflamatórias imuno-mediadas, doenças inflamatórias não imuno-mediadas, doenças infecciosas e doenças de imunodeficiência. Exemplos de doenças imuno-relacionadas e inflamatórias, algumas das quais são imuno-mediadas ou mediadas por células T, que podem ser tratadas de acordo com a invenção, incluem lúpus eritematoso disseminado, artrite reumatóide, artrite crónica juvenil, espondiloartropatias, esclerose sistémica (esclerodermia), miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjõgren, vascularite sistémica, sarcoidose, anemia hemolítica auto-imune (pancitopenia imune, hemoglobinúria nocturna paroxística), trombocitopenia auto-imune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia imuno-mediada), tiroidite (doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocítica juvenil, tiroidite atrófica), diabetes mellitus, doença renal imuno-mediada (glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial), doenças desmielinizantes dos sistemas nervosos central e periférico, tais como esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré, e polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, doenças hepatobiliares, tais como hepatite infecciosa (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não hepatotróficos), hepatite activa crónica auto-imune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, e colangite esclerosante, doenças do pulmão inflamatórias e fibróticas, tal como doença inflamatória do intestino (colite ulcerativa: doença de Crohn), enteropatia sensível ao glúten, e doença de Whipple, doenças da pele auto-imunes ou imuno-mediadas, incluindo doenças de pele bolhosas, eritema multiforme e dermatite de contacto, psoríase, doenças alérgicas, tais como asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar e urticária, doenças imunológicas do pulmão, tais como pneumonias eosinofílicas, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite de hipersensibilidade, doenças associadas a transplante, incluindo rejeição de enxertos e doença de enxerto-versus-hospedeiro. As doenças infecciosas incluem SIDA 47 ΕΡ 1 255 558 /PT (infecçao por VIH) , hepatite A, B, C, D e E, infecçoes bacterianas, infecções fúngicas e infecções parasíticas. "Doença auto-imune" é aqui utilizado num sentido lato, geral, para designar distúrbios ou condições em mamíferos, em que a destruição de tecido normal ou saudável resulta de respostas imunitárias humorais ou celulares do indivíduo mamífero aos seus próprios constituintes tecidulares. Os exemplos incluem, mas não se lhes limitam, lúpus eritematoso disseminado, tiroidite, artrite reumatóide, psoríase, esclerose múltipla, diabetes auto-imune e doença inflamatória do intestino (IBD). 0 termo "agente citotóxico" tal como aqui utilizado, refere-se a uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa destruição das células e/ou provoca a destruição das células . 0 termo inclui isótopos radioactivos (e.g. I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterapêuticos, e toxinas, tais como toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, de plantas ou animais, ou seus fragmentos.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento da doença. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem adriamicina, doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, bussulfano, citoxina, taxóides, e.g. paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), e doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France), toxotere, metotrexato, cisplatina, melfalan, CPT-11, vinblastina, bleomicina, etoposido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatina, teniposido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (veja-se Pat. US N°. 4675187), melfalan e outras mostardas de azoto relacionadas. Também se incluem nesta definição agentes hormonais que actuam para regular ou inibir a acção hormonal, tais como tamoxifeno e onapristona.

Um "agente inibidor do crescimento", quando aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, quer in vitro, quer in vivo. Assim, 48

ΕΡ 1 255 558 /PT ο agente inibidor do crescimento é um que reduz significativamente a percentagem de células que sobre-expressam estes genes na fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (noutra altura que não a fase S), tais como agentes que induzem a paragem na fase G1 e paragem na fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina) , taxol, e inibidores topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido, e bleomicina. Os agentes que induzem paragem na fase G1 irão também arrastar para uma paragem na fase-S, por exemplo, agentes alquilantes de ADN, tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, informações of Câncer, metotrexato, 5-fluorouracilo, e ara-C. Outras podem ser encontradas em The Molecular Basis Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente p. 13. 0 termo "citóquina" é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população de células que actuam noutra célula como mediadores celulares. Exemplos destas citóquinas incluem linfóquinas, monóquinas, hormonas polipeptídicas tradicionais. Inclui-se nas citóquinas a hormona de crescimento, tal como hormona de crescimento humana, hormona de crescimento humana de N-metionilo e hormona de crescimento bovina; hormona paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas glicoproteicas - tais como a hormona estimuladora de foliculo (FSH), hormona estimuladora da tiróide (TSH), e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático; factor de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogénio da placenta; factor de necrose tumoral-α e β; substância inibidora de mulleriano; péptido associado a gonadotrofina de ratinho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento nervoso; factor de crescimento de plaquetas; factores de crescimento transformantes (TGF), tais como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento tipo insulina-I e II; eritropoietina (EPO); factores osteoinductores; interferões, tais como interferão-a, -β, e gama; factores estimulantes de colónias (CSF), tais como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulócitos-macrófagos 49

ΕΡ 1 255 558 /PT (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (IL), tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-β, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; e outros factores polipeptídicos incluindo LIF e ligando kit (KL) . Tal como aqui utilizado, o termo citóquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinante e equivalentes biologicamente activos das citóquinas de sequência nativa. II. Métodos e Materiais

Em geral, os métodos para modular a actividade de TALL-1, APRIL, TACI, e/ou BCMA em células de mamífero compreendem expor as células a uma quantidade desejada de antagonista ou agonista que afecta a interacção de TALL-1 ou APRIL com TACI ou BCMA. De preferência, a quantidade de antagonista ou agonista utilizada será uma quantidade eficaz para afectar a ligação e/ou actividade do ligando respectivo ou receptor respectivo para se obter um efeito terapêutico. Isto pode ser conseguido in vivo ou ex vivo de acordo, por exemplo, com os métodos descritos a seguir e nos Exemplos. Exemplos de condições ou distúrbios a ser tratados com estes antagonistas de TALL-1 ou antagonistas de APRIL incluem condições em mamíferos clinicamente designadas como doenças auto-imunes, incluindo, mas não se lhes limitando, artrite reumatóide, esclerose múltipla, psoríase e lúpus, ou outras condições patológicas em que a(s) resposta(s) de células B em mamíferos é anormalmente supra-regulada, tal como cancro. Como se pode ver nos Exemplos a seguir, as moléculas de imunoadesina de TACI inibiram substancialmente a doença artrítica induzida por imunização com colagénio tipo II, reduziram a inflamação das articulações e a formação de anticorpos anti-colagénio, preveniram a destruição de osso e cartilagem e bloquearam a estimulação de células T auto-reactivas. Estes resultados implicam o TACI na auto-imunidade mediada por células T e sugerem que o bloqueio ou inibição de interacções de TACI com TALL-1 e/ou APRIL pode ter utilidade terapêutica para doenças auto-imunes, tais como AR. Exemplos de condições ou distúrbios a ser tratados com agonistas de TACI ou agonistas de BCMA incluem imunodeficiência e cancro.

Também são descritos métodos de diagnóstico. Por exemplo, os antagonistas ou agonistas podem ser utilizados para 50 ΕΡ 1 255 558 /PT detectar os ligandos respectivos (TALL-1 ou APRIL) ou receptores (TACI ou BCMA) em mamíferos, que se sabe terem, ou se suspeita que têm uma condição patológica relacionada com TALL-1 ou uma condição patológica relacionada com APRIL. A molécula antagonista ou agonista pode ser utilizada, e.g., em imunoensaios para detectar ou quantificar TALL-1 ou APRIL numa amostra. Uma amostra, tal como células obtidas de um mamífero, pode ser incubada na presença de uma molécula antagonista ou agonista marcada e pode-se detectar o antagonista ou agonista marcado, ligado na amostra. Estes testes, incluindo vários procedimentos de testes clínicos, são conhecidos na especialidade, por exemplo, como descrito em Voller et al., Immunoassays, University Park, 1981.

A. MATERIAIS

Os antagonistas e agonistas que podem ser utilizados nos métodos incluem, mas não se lhes limitam, formas solúveis de receptores TACI e BCMA, imunoadesinas do receptor TACI e imunoadesinas do receptor BCMA, proteínas de fusão compreendendo TACI ou BCMA, formas de TACI ou BCMA modificadas de modo covalente, variantes do receptor TACI e variantes do receptor BCMA, anticorpos do receptor TACI ou BCMA e anticorpos de TALL-1 ou APRIL. São descritas a seguir várias técnicas que podem ser utilizadas para produzir antagonistas e agonistas.

Em geral, as composições podem ser preparadas utilizando técnicas recombinantes conhecidas na especialidade. A descrição a seguir refere-se a métodos para produzir estes polipéptidos por cultura de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com um vector que contém o ácido nucleico codificante e recuperação do polipéptido a partir da cultura de células (veja-se, e.g., Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)) . O ácido nucleico (e.g., ADNc ou ADN genómico) que codifica para o polipéptido desejado pode ser inserido num vector replicável para posterior clonagem (amplificação do 51

ΕΡ 1 255 558 /PT ADN) ou para expressão. Estão disponíveis ao público vários vectores. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se lhes limitam, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição, sendo cada uma descrita a seguir. São conhecidas na especialidade sequências de sinal, origens de replicação, genes marcadores, elementos potenciadores e sequências de terminação da transcrição opcionais que podem ser utilizados e estão descritos em maior detalhe na W09 7/25428 .

Os vectores de expressão e clonagem contêm normalmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ligado operativamente à sequência de ácido nucleico codificante. Os promotores são sequências não traduzidas localizadas a montante (5') do codão de iniciação de um gene estrutural (geralmente entre cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição e tradução de uma sequência de ácido nucleico particular, à qual estão ligados operativamente. Estes promotores são tipicamente de duas classes, indutíveis e constitutivos. Os promotores indutíveis são promotores que iniciam níveis aumentados de transcrição do ADN sob o seu controlo em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, e.g., a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Actualmente, é bem conhecido um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais. Estes promotores estão ligados operativamente ao ADN codificante removendo o promotor do ADN fonte por digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vector. São conhecidos na especialidade promotores adequados para utilização em hospedeiros procariotas e eucariotas e estão descritos em maior detalhe na W097/25428. A construção de vectores adequados contendo um ou mais dos componentes acima enumerados utiliza técnicas de ligação convencionais. Os plasmídeos isolados ou fragmentos de ADN são clivados, ajustados e ligados novamente na forma desejada para produzir os plasmídeos necessários. Para uma análise para confirmar as sequências correctas nos plasmídeos construídos, 52

ΕΡ 1 255 558 /PT as misturas de ligação podem ser utilizadas para transformar E. coli K12 estirpe 294 (ATCC 31,446) e os transformantes bem sucedidos seleccionados por resistência a ampicilina ou tetraciclina, como adequado. Os plasmídeos dos transformantes são preparados, analisados por digestão com endonucleases de restrição e/ou sequenciados utilizando técnicas convencionais conhecidas na especialidade [veja-se, e.g., Messing et al., Nucleic Acids Res., 9_:309 (1981); Maxam et al., Methods in Enzymoloqy, 6_5:499 (1980)].

Podem-se utilizar vectores de expressão que proporcionam a expressão transitória do ADN codificante em células de mamífero. Em geral, a expressão transitória envolve a utilização de um vector de expressão que é capaz de se replicar de forma eficaz numa célula hospedeira, de modo que a célula hospedeira acumula muitas cópias do vector de expressão e, por sua vez, sintetiza níveis elevados de um polipéptido desejado codificado pelo vector de expressão [Sambrook et al., supra]. Os sistemas de expressão transitória compreendendo um vector de expressão adequado e uma célula hospedeira, permitem a identificação positiva conveniente de polipéptidos codificados pelos ADN clonados, bem como a rápida pesquisa destes polipéptidos quanto a propriedades biológicas ou fisiológicas desejadas.

Outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptar a síntese do polipéptido desejado em cultura de células de vertebrado recombinante estão descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060; e EP 117.058.

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores aqui descritos incluem células procariotas, de levedura ou eucariotas superiores. Os procariotas adequados para este fim incluem, mas não se lhes limitam, eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli, tal como B. subtilis e B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P descrito na DD 266.710 publicado em 12 de Abril de 1989), 53

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Pseudomonas, tal como F. aeruginosa, e Streptomyces. De preferência, a célula hospedeira deverá segregar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas.

Além dos procariotas, os micróbios eucariotas, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros adequados para vectores de clonagem ou expressão. Células hospedeiras adequadas para a expressão de polipéptidos glicosilados são derivadas de organismos pluricelulares. Exemplos de todas estas células hospedeiras estão descritos também na W097/25428.

As células hospedeiras são transfectadas e preferencialmente transformadas com os vectores de expressão ou clonagem acima descritos e cultivadas em meio nutriente modificado como adequado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam para as sequências desejadas. A transfecção refere-se à incorporação de um vector de expressão por uma célula hospedeira, quer qualquer das sequências codificantes seja efectivamente expressa ou não. São conhecidos do perito na especialidade vários métodos de transfecção, por exemplo, CaPCq e electroporação. Uma transfecção de sucesso é geralmente reconhecida quando ocorre na célula hospedeira alguma indicação da operação deste vector.

Transformação significa introduzir ADN num organismo de um modo em que o ADN é replicável, quer como elemento extracromossómico, quer por integração no cromossoma. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas convencionais adequadas para estas células. 0 tratamento com cálcio utilizando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., supra, ou electroporação, são geralmente utilizados para procariotas ou outras células que contêm barreiras de parede celular substanciais. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformar algumas células de plantas, como descrito por Shaw et al., Gene, _23_:315 (1983) e WO 89/05859 publicado em 29 de Junho de 1989. Além disso, as plantas podem ser transfectadas 54

ΕΡ 1 255 558 /PT utilizando tratamento com ultra sons, como descrito na WO 91/00358 publicado em 10 de Janeiro de 1991.

Para células de mamífero sem estas paredes celulares, pode-se utilizar o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Na Pat. US N°. 4399216 foram descritos aspectos gerais de transformação de sistemas de células hospedeiras de mamífero. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76:3829 (1979). No entanto, podem-se também utilizar outros métodos para introduzir ADN nas células, tal como por micro-injecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, e.g., polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para transformar células de mamífero, veja-se Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988) .

As células procariotas podem ser cultivadas em meio de cultura adequado, como descrito de forma geral em Sambrook et al., supra. Exemplos de meios de cultura disponíveis no mercado incluem F10 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e meio de Eagle modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Qualquer destes meios pode ser suplementado como necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como a droga Gentamycin™) , elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na gama micromolar), e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Também se podem incluir quaisquer outros suplementos necessários a concentrações adequadas, que serão conhecidos dos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as previamente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão evidentes para o perito na especialidade. 55

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Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas de células de mamífero podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 19 91) .

Os polipéptidos expressos podem ser recuperados do meio de cultura como um polipéptido segregado, embora também possam ser recuperados de lisados de células hospedeiras quando produzidos directamente sem um sinal secretor. Se o polipéptido está ligado à membrana, ele pode ser libertado da membrana utilizando uma solução detergente adequada (e.g. Triton-X 100) ou a sua região extracelular pode ser libertada por clivagem enzimática.

Quando o polipéptido é produzido numa célula recombinante que não uma de origem humana, está isento de proteínas ou polipéptidos de origem humana. No entanto, é normalmente necessário recuperar ou purificar o polipéptido das proteínas ou polipéptidos de células recombinantes para obter preparações que são substancialmente homogéneas. Como um primeiro passo, o meio de cultura ou lisado pode ser centrifugado para remover restos celulares. A seguir descrevem-se exemplos de procedimentos de purificação adequados: por fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica ou numa resina de troca catiónica, tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; e colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes, tais como IgG.

As variantes do receptor TACI e variantes do receptor BCMA podem ser preparadas utilizando qualquer técnica adequada na especialidade. As variantes do receptor podem ser preparadas introduzindo alterações de nucleótidos adequadas no ADN receptor e/ou por síntese do polipéptido receptor desejado. Os peritos na especialidade deverão ter em conta que alterações dos aminoácidos podem alterar os processos pós-tradução do receptor, tais como alterar o número ou posição de locais de glicosilação ou alterar as características de ancoragem na membrana. 56

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As variações no receptor de sequência nativa ou em vários domínios dos receptores aqui descritos podem ser feitas, por exemplo, utilizando qualquer das técnicas e linhas de orientação para mutações conservativas e não conservativas apresentadas, por exemplo, na patente US N°. 5364934. As variações podem ser uma substituição, eliminação ou inserção de um ou mais codões que codificam para o receptor que resultam numa alteração na sequência de aminoácidos do receptor, quando comparada com o receptor de sequência nativa. Opcionalmente, a variação é por substituição de pelo menos um aminoácido por qualquer outro aminoácido num ou mais dos domínios do receptor. As linhas de orientação para determinar qual o resíduo de aminoácido que pode ser inserido, substituído ou eliminado sem afectar de forma adversa a actividade desejada podem ser encontradas comparando a sequência do receptor com a de moléculas de proteína conhecidas homólogas e minimizando o número de alterações de sequência de aminoácidos feitas em regiões de homologia elevada. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado de substituir um aminoácido com outro aminoácido com propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, tais como a substituição de uma leucina por uma serina, i.e. substituições de aminoácidos conservativas. As inserções ou eliminações podem ser opcionalmente na gama de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada fazendo sistematicamente inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos na sequência e testando as variantes resultantes quanto à actividade exibida pela sequência nativa de tamanho completo ou madura.

Proporcionam-se aqui fragmentos de polipéptido TACI ou BCMA. Estes fragmentos podem ser truncados no terminal N ou terminal C ou podem não ter resíduos internos, por exemplo quando comparados com uma proteína nativa de tamanho completo. Alguns fragmentos não têm resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma actividade biológica desejada do polipéptido receptor. Opcionalmente, os fragmentos de polipéptido TACI ou BCMA compreendem variantes de eliminação 57

ΕΡ 1 255 558 /PT de ECD em que um ou mais resíduos de aminoácido foram eliminados do terminal N ou terminal C da sequência ECD do receptor, de preferência estas variantes de eliminação de ECD têm pelo menos uma actividade biológica em comparação com a sequência de receptor nativa.

Os fragmentos TACI ou BCMA podem ser preparados por qualquer uma de várias técnicas convencionais. Os fragmentos peptídicos desejados podem ser quimicamente sintetizados. Uma abordagem alternativa envolve produzir fragmentos de receptor por digestão enzimática, e.g., tratando a proteína com uma enzima que se sabe clivar proteínas em locais definidos por resíduos de aminoácido particulares, ou digerindo o ADN com enzimas de restrição adequadas e isolando o fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve isolar e amplificar um fragmento de ADN que codifica para um fragmento de polipéptido desejado, por reacção em cadeia com polimerase (PCR) . Os oligonucleótidos que definem os terminais desejados do fragmento de ADN são utilizados nos iniciadores 5' e 3' na PCR.

As substituições conservativas de interesse são apresentadas na Tabela 1 sob o título substituições preferidas. Se estas substituições resultam numa alteração na actividade biológica, então introduzem-se alterações mais substanciais, designadas por substituições exemplo na Tabela 1, ou como descrito a seguir em relação às classes de aminoácidos, e pesquisam-se os produtos. 58

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Tabela 1

Resíduo Substituições exemplo Substituições original preferidas

Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; lys; arg gin Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; vai; met; clle.} phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile ;; vai .; met ; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; 3.13. / tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

As modificações substanciais na função ou identidade imunológica do polipéptido receptor são realizadas seleccionando substituições que diferem significativamente no seu efeito em manter (a) a estrutura do esqueleto do polipéptido na área de substituição, por exemplo, numa conformação de folha ou hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns: (D hidrófobo: norleucina, met, (2) hidrófilo neutro: cys, ser, (3) ácido: asp, glu; (4) básico: asn, gin, his, lys, (5) resíduos que influenciam a e (6) aromático: trp, tyr, phe ala, vai, leu, ile; thr; arg; orientação da cadeia: gly, pro; 59

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As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por um de outra classe. Estes resíduos substituídos também podem ser introduzidos em locais de substituição conservativa ou, mais preferencialmente, nos locais remanescentes (não conservativos).

As variações podem ser feitas utilizando métodos conhecidos na especialidade, tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida para um local), varrimento com alanina e mutagénese de PCR. A mutagénese dirigida para um local [Cárter et al., Nucl. Acids Res., L3:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., _10_:6487 (1987)], mutagénese de cassete [Wells et al., Gene, 3_4:315 (1985)], mutagénese de selecção de restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)], ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no ADN clonado para produzir o ADN variante do receptor.

Também se pode utilizar análise de aminoácidos por varrimento para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. De entre os aminoácidos preferidos para o varrimento salientam-se os aminoácidos neutros, pequenos. Estes aminoácidos incluem alanina, glicina, serina e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido preferido para varrimento entre este grupo, pois elimina a cadeia lateral para além do carbono-beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante [Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. A alanina também é tipicamente preferida, pois é o aminoácido mais comum. Além disso, é frequentemente encontrada, quer em posições ocultas, quer expostas [Creigton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. , 150: 1 (1976)]. Se a substituição por alanina não origina quantidades adequadas da variante pode-se utilizar um aminoácido isotérico.

Também se podem utilizar formas solúveis de receptores TACI ou receptores BCMA como antagonistas. Estas formas solúveis de TACI ou BCMA podem compreender ou consistir em domínios extracelulares do receptor respectivo (e não possuir domínios transmembranares e intracelulares do receptor respectivo). Podem-se utilizar como antagonistas as próprias 60

ΕΡ 1 255 558 /PT sequências de domínio extracelular de TACI ou BCMA, ou estas podem ser modificadas como descrito a seguir (tal como por fusão com uma imunoglobulina, marcador epitópico ou fecho de correr de leucinas). Algumas regiões do domínio extracelular de TACI e BCMA foram descritas na literatura e podem ser também delineadas utilizando técnicas conhecidas do perito na especialidade. Os peritos na especialidade serão capazes de seleccionar, sem experimentação excessiva, uma sequência de domínio extracelular desejada, quer de TACI, quer de BCMA, para utilizar como um antagonista.

As moléculas de imunoadesina podem ser utilizadas nos métodos aqui descritos. As imunoadesinas do receptor TACI podem compreender várias formas de TACI, tal como o polipéptido de tamanho completo, bem como formas solúveis do receptor que compreendem uma sequência de domínio extracelular (ECD) ou um fragmento da sequência ECD. A molécula pode compreender uma fusão do receptor TACI com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da imunoadesina, esta fusão pode ser com a região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig incluem de preferência a substituição de uma forma solúvel (domínio transmembranar eliminado ou inactivado) do polipéptido receptor em vez de pelo menos uma região variável numa molécula de Ig. A fusão de imunoglobulina pode incluir as regiões charneira CH2 e CH3, ou as regiões charneira CHI, CH2 e CH3 de uma molécula de IgGl. Para a produção de fusões de imunoglobulina, veja-se também a patente US N° . 5426130 concedida em 27 de Junho de 1995 e

Chamow et al., TIBTECH, 14:52-60 (1996). A concepção mais simples e linear de uma imunoadesina combina o(s) domínio(s) de ligação da adesina (e.g. o domínio extracelular (ECD) de um receptor) com a região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Normalmente, quando se preparam as imunoadesinas da presente invenção, o ácido nucleico que codifica para o domínio de ligação da adesina será fundido no terminal C com o ácido nucleico que codifica para o terminal N de uma sequência de domínio constante de imunoglobulina, no entanto também são possíveis fusões N-terminais. 61

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Tipicamente, nestas fusões o polipéptido quimérico codificado irá reter pelo menos os domínios charneira, CH2 e Ch3 da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina, funcionalmente activos. Também são feitas fusões ao terminal C da porção Fc de um domínio constante, ou imediatamente N-terminais em relação ao CH1 da cadeia pesada ou na região correspondente da cadeia leve. 0 local preciso em que a fusão é feita não é crítico; são bem conhecidos locais particulares e estes podem ser seleccionados de modo a optimizar a actividade biológica, secreção ou características de ligação da imunoadesina. A sequência de adesina pode ser fundida com o terminal N da região Fc da imunoglobulina Gi (IgGi). É possível fundir toda a região constante de cadeia pesada com a sequência de adesina. No entanto, mais preferencialmente, utiliza-se na fusão uma sequência que tem início na região charneira imediatamente a montante do local de clivagem da papaína que define quimicamente a Fc de IgG (i.e. o resíduo 216, tomando o primeiro resíduo da região constante de cadeia pesada como 114) ou locais análogos de outras imunoglobulinas. A sequência de aminoácidos da adesina pode ser fundida com (a) a região charneira e CH2 e CH3 ou (b) os domínios CH1, charneira, CH2 e Ch3, de uma cadeia pesada de IgG.

Para imunoadesinas biespecíficas, as imunoadesinas são organizadas como multímeros e, em particular como heterodímeros ou heterotetrâmeros. Em geral, estas imunoglobulinas organizadas terão estruturas unitárias conhecidas. Uma unidade estrutural de quatro cadeias, básica, é a forma em que existem a IgG, IgD, e IgE. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas de peso molecular mais elevado; a IgM existe geralmente como um pentâmero de quatro unidades básicas mantidas em conjunto por pontes dissulfureto. A globulina IgA e ocasionalmente a globulina IgG, também podem existir na forma multimérica no soro. No caso do multímero, cada uma das quatro unidades pode ser a mesma ou diferente. Vários exemplos de imunoadesinas organizadas são apresentados esquematicamente a seguir: 62

ΕΡ 1 255 558 /PT (a) ACl-ACl; (b) ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, ou VlCl-ACh) ; (C) ACl-ACh- (ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh, OU VLCL-VHCH) (d) ACl-VhCh-(ACh, OU ACl-VhCh, ou VlCl-ACh) ; (e) VlCl-ACh-(ACl-VhCh, ou VlCl-ACh) ; e (f) (A-Y)n-(VlCl-VhCh) 2, em que cada A representa sequências de aminoácidos de adesina idênticas ou diferentes; VL é um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH é um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH é um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina; n é um inteiro superior a 1; Y designa o resíduo de um agente de reticulação covalente.

Para maior brevidade, as estruturas anteriores apenas apresentam características chave; não indicam os domínios de união (J) ou outros domínios das imunoglobulinas, nem são apresentadas ligações dissulfureto. No entanto, quando estes domínios são necessários para a actividade de ligação, deve entender-se que estes estão presentes nas localizações que normalmente ocupam nas moléculas de imunoglobulina.

Alternativamente, podem-se inserir sequências de adesina entre sequências de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina, de modo a obter uma imunoglobulina que compreende uma cadeia pesada quimérica. Nesta concretização, as sequências de adesina são fundidas com a extremidade 3' de uma cadeia pesada de imunoglobulina em cada braço de uma imunoglobulina, ou entre o domínio charneira e o domínio CH2, ou entre os domínios CH2 e CH3. Foram descritas construções semelhantes por Hoogenboom et al., Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991) .

Embora a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina não seja necessária nas imunoadesinas da presente invenção, pode estar presente uma cadeia leve de imunoglobulina quer associada de forma covalente a um polipéptido de fusão adesina-cadeia pesada de imunoglobulina, quer directamente fundida com a adesina. No primeiro caso, o ADN que codifica para uma cadeia leve de imunoglobulina é tipicamente 63

ΕΡ 1 255 558 /PT co-expresso com o ADN que codifica para a proteína de fusão de adesina-cadeia pesada de imunoglobulina. Aquando da secreção, a cadeia pesada híbrida e a cadeia leve serão associadas de forma covalente para se obter uma estrutura do tipo imunoglobulina compreendendo dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina ligados por ligações dissulfureto. Os métodos adequados para a preparação destas estruturas estão descritos, por exemplo, na Patente US N°. 4816567, concedida em 28 de Março de 1989.

As imunoadesinas são construídas, de modo muito conveniente, fundindo a sequência de ADNc que codifica para a porção de adesina, em fase com uma sequência de ADNc de imunoglobulina. No entanto, também se pode utilizar a fusão com fragmentos de imunoglobulina genómicos (veja-se, e.g. Aruffo et al. , Cell, 6_1:1303-1313 (1990); e Stamenkovic et al., Cell, 6_6:1133-1144 (1991)). Este último tipo de fusão requer a presença de sequências reguladores de Ig para expressão. Os ADNc que codificam para as regiões constantes de cadeia pesada de IgG podem ser isolados com base em sequências publicadas de bibliotecas de ADNc derivadas de baço ou linfócitos de sangue periférico, por técnicas de hibridação ou reacção em cadeia com polimerase (PCR). Os ADNc que codificam para a "adesina" e as partes de imunoglobulina da imunoadesina são inseridos uns atrás dos outros num vector plasmídico que dirige uma expressão eficiente nas células hospedeiras seleccionadas.

Exemplos destas sequências ECD solúveis incluem polipéptidos que compreendem os aminoácidos 2-166 da sequência de TACI apresentada na Figura 1 e descrita também nos exemplos a seguir. As imunoadesinas do receptor TACI podem ser produzidas de acordo com qualquer dos métodos descritos na especialidade.

As imunoadesinas do receptor BCMA podem ser construídas de um modo semelhante. Exemplos de sequências ECD solúveis para utilização na construção de imunoadesinas de BCMA podem incluir polipéptidos compreendendo os aminoácidos 5-51 da sequência de BCMA apresentada na Figura 2 e descrita também nos Exemplos a seguir.

ΕΡ 1 255 558 /PT 6 4 Ο receptor TACI ou BCMA pode ser modificado de forma covalente ligando o polipéptido receptor a um de uma variedade de polímeros não proteicos, e.g., polietilenoglicol (PEG) , polipropilenoglicol, ou polioxialquilenos, do modo descrito nas Patentes US Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337. Estas formas do receptor TACI ou BCMA tratadas com PEG podem ser preparadas utilizando técnicas conhecidas na especialidade.

Também estão descritas formas destas moléculas em "fecho de correr" de leucinas. "Fecho de correr de leucinas" é um termo utilizado na especialidade para designar uma sequência rica em leucina que potência, promove ou dirige a dimerização ou trimerização do seu parceiro de fusão (e.g. a sequência ou molécula com a qual o "fecho de correr" de leucinas está fundido ou ligado). Foram descritos na especialidade vários polipéptidos "fecho de correr" de leucinas. Veja-se, e.g., Landschulz et al., Science, 240:1759 (1988); Patente US 5.716.805; WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters, 344:1991 (1994); Maniatis et al., Nature, 341:24 (1989). Os peritos na especialidade terão em conta que uma sequência "fecho de correr" de leucinas pode ser fundida quer na extremidade 5', quer 3' da molécula de receptor TACI ou BCMA.

Os polipéptidos TACI ou BCMA também podem ser modificados de modo a formar moléculas quiméricas, fundindo o polipéptido receptor com outro polipéptido heterólogo ou sequência de aminoácidos. De preferência, este polipéptido heterólogo ou sequência de aminoácidos é um que actua oligomerizando a molécula quimérica: Uma molécula quimérica deste tipo pode compreender uma fusão do polipéptido receptor TACI ou BCMA com um polipéptido marcador que proporciona um epítopo ao qual se pode ligar selectivamente um anticorpo anti-marcador. O marcador epitópico está geralmente colocado no terminal amino ou carboxilo do polipéptido receptor. A presença destas formas de receptor marcado com epítopo pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Além disso, a utilização do marcador epitópico permite que o receptor seja rapidamente purificado por purificação por afinidade, utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao marcador epitópico. São bem conhecidos na especialidade vários polipéptidos marcadores e 65 ΕΡ 1 255 558 /PT seus anticorpos respectivos. Exemplos incluem marcadores de poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly) ; o polipéptido marcador flu HA e o seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., _8:2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al. Molecular and Cellular Biology, _5:3610-3616 (1985)]; e o marcador de glicoproteína D (gD) do vírus herpes simplex e o seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineering, ^3 (6):547-553 (1990)]. Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6_: 1204-1210 (1988)]; o péptido epitópico KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; um péptido epitópico de α-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o marcador peptídico de proteína do gene 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)].

Também se podem utilizar nos métodos anticorpos anti-receptor TACI, anticorpos anti-receptor BCMA, anticorpos anti-TALL-1 ou anticorpos anti-APRIL. Exemplos destas moléculas incluem anticorpos neutralizantes ou bloqueadores que podem inibir preferencialmente a ligação de TALL-1 ou APRIL aos receptores TACI ou BCMA. Os anticorpos anti-TACI, anti-BCMA, anti-TALL-1 ou anti-APRIL podem ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridomas, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256:995 (1975). Num método de hibridoma, um ratinho, um hamster, ou outro animal adequado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para produzir linfócitos que produzem, ou são capazes de produzir anticorpos que se irão ligar especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. 0 agente imunizante incluirá tipicamente o polipéptido TACI ou BCMA, ou o polipéptido TALL-1 ou APRIL ou uma sua proteína de fusão. Em geral, utilizam-se linfócitos de sangue periférico ("PBL") quando se pretendem células de origem humana, ou utilizam-se células de baço ou células de nódulos linfáticos quando se pretendem fontes de mamífero não humano. Os linfócitos são então fundidos com uma linha celular imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma 66 ΕΡ 1 255 558 /PT [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. As linhas celulares imortalizadas são normalmente células de mamífero transformadas, em particular células de mieloma originárias de roedores, bovinos e humanos. Normalmente utilizam-se linhas celulares de mieloma de rato ou ratinho. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura adequado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células imortalizadas, não fundidas. Por exemplo, se as células progenitoras não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT") substâncias que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As linhas celulares imortalizadas preferidas são as que se fundem de forma eficaz, suportam uma expressão de anticorpo de nível elevado, estável, pelas células que produzem anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio, tal como o meio HAT. As linhas celulares imortalizadas mais preferidas são linhas de mieloma de murídeo que podem ser obtidas, por exemplo, do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia e da American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. As linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma ratinho-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos [Kozbor, j. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, (1987) pp. 51-63]. O meio de cultura em que as células de hibridoma são cultivadas pode ser testado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra TACI, BCMA, TALL-1 ou APRIL. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um teste de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente com enzimas ligadas (ELISA). Estas técnicas e testes são conhecidos na especialidade. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem., 67

ΕΡ 1 255 558 /PT 107; 220 (1980). Opcionalmente, os anticorpos anti-TACI, anti- BCMA, anti-TALL-1 ou anti-APRIL terão uma afinidade de ligação de pelo menos 10 nM, de preferência de pelo menos 5 nM e mais preferencialmente de pelo menos 1 nM para o receptor ou ligando respectivo, tal como determinado num teste de ligação.

Após as células de hibridoma desejadas serem identificadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescidos por métodos convencionais [Goding, supra]. Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, o meio de Eagle modificado por Dulbecco e meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo na forma de ascites, num mamífero.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura ou fluido ascítico, por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, cromatografia em proteína A-Sepharose, em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais podem também ser obtidos por métodos de ADN recombinante, tais como os descritos na patente US 4816567. O ADN que codifica para os anticorpos monoclonais da invenção pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam para as cadeias pesada e leve de anticorpos de murídeo). As células de hibridoma da invenção servem como uma fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras, tais como células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína imunoglobulina, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O ADN também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência codificante para os domínios constantes de cadeia pesada e leve humana, no lugar das sequências de murídeo homólogas [Patente US N°. 4816567; Morrison et al., supra] ou ligando de forma covalente à sequência codificante de 68 ΕΡ 1 255 558 /PT imunoglobulina, toda ou parte da sequência codificante para um polipéptido não imunoglobulina. Este polipéptido não imunoglobulina pode ser utilizado para substituir os domínios constantes de um anticorpo da invenção, ou pode substituir os domínios variáveis de um local de combinação com antigénio de um anticorpo da invenção, para criar um anticorpo bivalente, quimérico.

Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Os métodos para preparar anticorpos monovalentes são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante da cadeia leve de imunoglobulina e a cadeia pesada modificada. A cadeia pesada está truncada geralmente em qualquer ponto na região Fc, de modo a impedir a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos por outro resíduo de aminoácido, ou são eliminados de modos a impedir a reticulação.

Os métodos in vitro também são adequados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos, em particular fragmentos Fab, pode ser realizada utilizando técnicas de rotina conhecidas na especialidade.

Podem-se isolar anticorpos ou fragmentos de anticorpo de bibliotecas de anticorpos em fagos produzidas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et ai., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et ai., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et ai., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murídeo e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas em fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de afinidade elevada (gama nM) por vaivém de cadeias (Marks et ai., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos de grandes dimensões (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 2_1:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpos monoclonais, para o isolamento de anticorpos monoclonais. 69

ΕΡ 1 255 558 /PT Ο ADN também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência codificante para os domínios constantes de cadeia pesada e cadeia leve humanos, no lugar das sequências de murídeo homólogas (Patente US N° . 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)), ou ligando de forma covalente à sequência codificante da imunoglobulina, toda ou parte da sequência codificante de um polipéptido que não imunoglobulina.

Tipicamente, estes polipéptidos que não imunoglobulina substituem os domínios constantes de um anticorpo, ou substituem os domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio do anticorpo, para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um local de combinação com o antigénio com especificidade para um antigénio e outro local de combinação com o antigénio com especificidade para um antigénio diferente.

Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido nele introduzidos de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são muitas vezes designados por resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada de acordo com o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo por CDR ou sequências de CDR de roedores no lugar de sequências correspondentes de um anticorpo humano. Deste modo, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US N°. 4816567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. A escolha dos domínios variáveis humanos, quer leves, quer pesados, a utilizar na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método designado por "melhor ajuste", a sequência do 70 ΕΡ 1 255 558 /PT domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra toda a biblioteca de sequências de domínio variável humanas, conhecidas. A sequência humana que é mais próxima da do roedor é então aceite como a sequência estrutural (FR) humana para o anticorpo humanizado (Sims et al. , J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Um outro método utiliza uma sequência estrutural particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves e pesadas. A mesma sequência estrutural pode ser utilizada para diferentes anticorpos humanizados (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8_9:4285 (1992); Presta et al. , J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Também é importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade elevada para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências mãe e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências mãe e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais estão normalmente disponíveis e são familiares para os peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas, seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite analisar o papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antigénio. Deste modo, os resíduos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências do receptor e importadas, de modo a obter a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o(s) antigénio(s) alvo. Em geral, os resíduos de CDR estão directamente e muito substancialmente envolvidos em influenciar a ligação ao antigénio.

Alternativamente, é agora possível produzir animais transgénicos (e.g., ratinhos) que são capazes, por imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, 71

ΕΡ 1 255 558 /PT foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada do anticorpo (JH) no ratinho mutante quimérico e da linha germinativa, resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do arranjo de genes de imunoglobulina da linha germinativa humana nestes ratinhos mutantes de linha germinativa irá resultar na produção de anticorpos humanos aquando da provocação com o antigénio. Veja-se, e.g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci-USA, 9_0:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255- 258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7_:33 (1993); e Duchosal et al., Nature, 355:258 (1992). Os anticorpos humanos também podem ser derivados de bibliotecas de apresentação em fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) ; Vaughan et al., Nature Biotech, 1^4:309 (1996) ) .

Tal como descrito nos Exemplos a seguir, foram preparados anticorpos anti-APRIL particulares. Quatro destes anticorpos, 3C6.4.2, 5G8.2.2, 5E8.7.4 e 5E11.1.2, foram depositados na

ATCC, e foram-lhes atribuídos os números de acesso PTA-1347, PTA-13 45, PTA-1344 e PTA-1346. Os anticorpos anti-APRIL poderão ter as mesmas características biológicas que os anticorpos monoclonais da invenção, segregados pelas linhas celulares de hibridoma depositadas com os números de acesso PTA-1347, PTA-1395, PTA-1344 ou PTA-1346. O termo "características biológicas" é utilizado para referir as actividades ou propriedades in vitro e/ou in vivo do anticorpo monoclonal, tal como a capacidade de se ligar a APRIL ou de bloquear ou reduzir substancialmente a ligação ou activação de TACI ou BCMA por APRIL. O anticorpo monoclonal anti-APRIL pode ter a mesma actividade bloqueadora que o anticorpo 3C6.9.2, tal como determinado pela sua capacidade de bloquear a ligação de APRIL a TACI ou BCMA. Um anticorpo monoclonal anti-APRIL pode-se ligar ao mesmo epítopo que o anticorpo 5G8.2.2, o anticorpo 5E8.7.4, o anticorpo 3C6.4.2 ou o anticorpo 5E11.1.2 descritos nos Exemplos a seguir. Esta propriedade de ligação do epítopo pode ser determinada, por exemplo, num teste de ligação de inibição competitiva, cujas técnicas são conhecidas na especialidade. Este anticorpo anti-APRIL irá, de preferência, inibir de forma competitiva a ligação quer do anticorpo 5G8.2.2, anticorpo 5E8.7.4, anticorpo 3C6.4.2 ou do anticorpo 5E11.1.2 a APRIL. É contemplado que se possam 72 ΕΡ 1 255 558 /PT construir anticorpos anti-APRIL quiméricos ou humanizados (tal como utilizando as técnicas descritas acima) utilizando ou incorporando fragmentos ou sequências de domínio seleccionados de qualquer um dos anticorpos anti-APRIL depositados, acima referidos.

B. MÉTODOS DE TESTE

Podem-se realizar estudos de ligação ligando/receptor em qualquer método de teste conhecido, tal como testes de ligação competitiva, testes de sanduíche directos ou indirectos e testes de imunoprecipitação. Os testes baseados em células e modelos animais podem ser utilizados para compreender melhor a interacção entre os ligandos e receptores identificados aqui e o desenvolvimento e patogénese das condições e doenças aqui referidas.

Numa abordagem, as células de mamífero podem ser transfectadas com os ligandos ou receptores aqui descritos e a capacidade dos agonistas ou antagonistas estimularem ou inibirem a ligação ou actividade é analisada. As células adequadas podem ser transfectadas com o gene desejado e monitorizadas quanto à actividade. Estas linhas celulares transfectadas podem então ser utilizadas para testar a capacidade do(s) antagonista(s) ou agonista(s) inibir ou estimular, por exemplo, modular a proliferação de células B ou a secreção de Ig. As células transfectadas com a sequência codificante dos genes aqui identificados podem também ser utilizadas para identificar candidatos de drogas para o tratamento de doenças imuno-relacionadas ou cancro.

Além disso, podem-se utilizar culturas primárias derivadas de animais transgénicos nos testes à base de células. As técnicas para derivar linhas celulares contínuas a partir de animais transgénicos são bem conhecidas na especialidade [veja-se, e.g., Small et al., Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985)] .

Um teste baseado em células adequado é a adição de ligando marcado com epítopo (e.g., AP ou Flag) a células que têm ou expressam o receptor respectivo e análise da ligação (na presença ou ausência de antagonistas antecipados) por 73

ΕΡ 1 255 558 /PT coloração FACS com anticorpo anti-marcador. Noutro teste, é testada a capacidade de um antagonista inibir a proliferação de células B induzida por TALL-1 ou APRIL. As células B ou linhas celulares são cultivadas com TALL-1 ou APRIL na presença ou ausência de antagonistas antecipados e a proliferação de células B pode ser medida por incorporação de 3H-timidina ou pelo número de células.

Os resultados dos testes in vitro baseados em células podem também ser verificados utilizando modelos animais in vivo. Pode-se utilizar uma variedade de modelos animais bem conhecidos para melhor compreender o papel dos agonistas e antagonistas aqui identificados, no desenvolvimento e patogénese de, por exemplo, doença imuno-relacionada ou cancro, e para testar a eficácia dos agentes terapêuticos candidatos. A natureza in vivo destes modelos torna-os particularmente preditivos de respostas em pacientes humanos. Os modelos animais de doenças imuno-relacionadas incluem quer animais não recombinantes, quer recombinantes (transgénicos). Os modelos de animais não recombinantes incluem, por exemplo, modelos de roedores, e.g. de murideo. Estes modelos podem ser produzidos introduzindo células em ratinhos isogénicos, utilizando técnicas convencionais, e.g., injecção subcutânea, injecção na veia da cauda, implantação de baço, implantação intraperitoneal e implantação sob a cápsula renal. São conhecidos modelos animais, por exemplo, de doença de enxerto-versus-hospedeiro. A doença de enxerto-versus-hospedeiro ocorre quando se transplantam células imunocompetentes para pacientes imunossuprimidos ou tolerantes. As células dadoras reconhecem e respondem a antigénios do hospedeiro. A resposta pode variar desde inflamação grave com risco de vida a casos ligeiros de diarreia e perda de peso. Os modelos de doença de enxerto-versus-hospedeiro fornecem um meio para determinar a reactividade de células T contra antigénios de MHC e antigénios de transplante menores. Um procedimento adequado está descrito em detalhe em Current Protocols in Immunology, unidade 4.3.

Um modelo animal para rejeição de aloenxerto de pele é um meio para testar a capacidade das células T mediarem a 74 ΕΡ 1 255 558 /PT destruição de tecidos in vivo que é indicativa de, e uma medida do seu papel na imunidade antiviral e contra tumores. Os modelos mais comuns e aceites utilizam enxertos de pele da cauda de murideo. Experiências repetidas mostraram que a rejeição de aloenxerto de pele é mediada por células T, células T ajudantes e células T assassinas-efectoras e não por anticorpos. [Auchincloss, H. Jr. e Sachs, D. H., Fundamental Immunoloqy, 2a ed., W. E. Paul ed., Raven Press, Nova Iorque, 1989, 889-992]. Um procedimento adequado está descrito em detalhe em Current Protocols in Immunology, unidade 4.4. Outros modelos de rejeição de transplante que podem ser utilizados para testar as composições da invenção são os modelos de transplante de coração alogénico descritos por Tanabe, M. et al., Transplantation, (1994) 58:23 e Tinubu, S. A. et al., J. Immunol., (1994) 4330-4338.

Os modelos animais para hipersensibilidade do tipo retardado proporcionam também um teste da função imunitária mediada por células. As reacções de hipersensibilidade do tipo retardado são uma resposta imunitária in vivo mediada por células T, caracterizada por inflamação que não atinge um pico senão após um período de tempo que decorre após provocação com um antigénio. Estas reacções também ocorrem em doenças auto-imunes específicas de tecidos, tais como esclerose múltipla (MS) e encefalomielite auto-imune experimental (EAE, um modelo de MS). Um procedimento adequado está descrito em pormenor em Current Protocols in Immunology, unidade 4.5.

Um modelo animal para artrite é a artrite induzida por colagénio. Este modelo partilha características clínicas, histológicas e imunológicas com a artrite reumatóide auto-imune humana e é um modelo aceitável para artrite auto-imune humana. Os modelos de ratinho e rato caracterizam-se por sinovite, erosão da cartilagem e osso subcondral. Os compostos da invenção podem ser testados quanto à actividade contra a artrite auto-imune utilizando os protocolos descritos em Current Protocols in Immunology, acima, unidades 15.5. Veja-se também o modelo que utiliza um anticorpo monoclonal contra as integrinas CD18 e VLA-4, descrito em Issekutz, A. C. et al., Immunology, (1996) 88:569. O Exemplo 10 a seguir descreve também um modelo de murideo de CIA. 75

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Foi descrito um modelo de asma em que é induzida hiper-reactividade das vias respiratórias induzida por antigénio, eosinofilia pulmonar e inflamação, sensibilizando um animal com ovalbumina e provocando em seguida o animal com a mesma proteína fornecida por aerossol. Vários modelos animais (porquinho-da-índia, rato, primata não humano) apresentam sintomas semelhantes à asma atópica em humanos, após provocação com antigénios em aerossol. Os modelos de murídeo têm muitas das características da asma humana. Procedimentos adequados para testar as composições da invenção quanto à actividade e eficácia no tratamento da asma estão descritos em Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol- Biol., (1998) 18:777 e referências aí citadas.

Adicionalmente, os compostos da invenção podem ser testados em modelos animais para doenças do tipo psoríase. Os compostos da invenção podem ser testados no modelo de ratinho scid/scid descrito por Schon, Μ. P. et al., Nat. Med., (1997) 3:163, em que os ratinhos apresentam lesões da pele histopatológicas que se assemelham à psoríase. Outro modelo adequado é a quimera pele humana/ratinho scid preparada como descrito por Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path., (1995) 146 : 580 . São bem conhecidos vários modelos animais para testar a actividade anticancerosa de uma composição terapêutica candidata. Estes incluem o xenoenxerto de tumor humano em ratinhos nus atímicos, ou ratinhos scid/scid, ou modelos de tumor de murídeo genéticos, tais como ratinhos knock-out p53.

Os modelos animais recombinantes (transgénicos) podem ser manipulados introduzindo a porção codificante das moléculas aqui identificadas no genoma de animais de interesse, utilizando técnicas convencionais para produzir animais transgénicos. Os animais que podem servir como um alvo para a manipulação transgénica incluem, sem limitação, ratinhos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, ovelhas, cabras, porcos e primatas não humanos, e.g., babuínos, chimpanzés de macacos. As técnicas conhecidas na especialidade para introduzir um transgene nestes animais incluem a micro-injecção pronucleica (Hoppe e Wanger, Patente US N°. 4873191); transferência de genes mediada por retrovírus para linhas germinativas (e.g., 76

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Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 6148-615 [1985]); direccionamento de genes em células estaminais embrionárias (Thompson et al., Cell, 56, 313-321 [1989]); electroporação de embriões (Lo, Mol. Cell. Biol., 3_, 1803-1814 [1983]); transferência de genes mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell, 57, 727-73 11.9691). Para revisão veja-se, por exemplo, Patente US N°. 4736866.

Os animais transgénicos incluem os que são portadores do transgene apenas em parte das suas células (“animais mosaico"). O transgene pode ser integrado, quer como um transgene único, ou em concatâmeros, e.g., tandens cabeça-com-cabeça ou cabeça-com-cauda. A introdução selectiva de um transgene num tipo de célula particular também é possível seguindo, por exemplo, a técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 6232-636 (1992) . A expressão do transgene em animais transgénicos pode ser monitorizada por técnicas convencionais. Por exemplo, pode-se utilizar análise de transferência de Southern ou amplificação por PCR para verificar a integração do transgene. O nível de expressão de ARNm pode então ser analisado utilizando técnicas como hibridação in situ, análise de transferência de Northern, PCR ou imunocitoquímica. Os animais podem ser também analisados quanto a sinais de patologia de doença imunitária, por exemplo por análise histológica para determinar a infiltração de células imunitárias em tecidos específicos, ou a presença de tecido canceroso ou maligno.

Alternativamente, podem-se construir animais "knock-out" que têm um gene defeituoso ou alterado que codifica para um polipéptido aqui identificado, como resultado de recombinação homóloga entre o gene endógeno que codifica para o polipéptido e o ADN genómico alterado que codifica para o mesmo polipéptido introduzido numa célula estaminal embrionária do animal. Por exemplo, o ADNc que codifica para um polipéptido particular pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica para esse polipéptido, de acordo com técnicas estabelecidas. Uma porção do ADN genómico que codifica para um polipéptido particular pode ser eliminada ou substituída por outro gene, tal como um gene que codifica para um marcador seleccionável que pode ser utilizado para monitorizar a 77 ΕΡ 1 255 558 /PT integração. Tipicamente, incluem-se no vector várias quilobases de ADN flanqueador não alterado (em ambas as extremidades 5' e 3') [veja-se, e.g., Thomas e Capecchi, Cell, 5_1:503 (1987) para uma descrição de vectores de recombinação homóloga]. 0 vector é introduzido numa linha de células estaminais embrionárias (e.g., por electroporação) e seleccionam-se as células em que o ADN introduzido se recombinou de forma homóloga com o ADN endógeno [veja-se e.g., Li et al., Cell, 6_9:915 (1992)]. As células seleccionadas são então injectadas num blastocisto de um animal (e.g., um ratinho ou rato) para formar quimeras de agregação [veja-se e.g., Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Um embrião quimérico pode então ser implantado num animal fêmea adoptivo pseudo-grávido e o embrião levado a termo para criar um animal knock-out. A progénie que possui o ADN recombinado de forma homóloga nas suas células germinativas pode ser identificada por técnicas convencionais e utilizada para criar animais em que todas as células do animal contêm o ADN recombinado de forma homóloga. Os animais knock-out podem ser caracterizados, por exemplo, quanto à sua capacidade de se defender contra algumas condições patológicas e quanto ao seu desenvolvimento de condições patológicas, devido à ausência do polipéptido.

C. FORMULAÇÕES

Os antagonistas ou agonistas aqui descritos são de preferência utilizados num transportador. Transportadores adequados e suas formulações estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo et al. Tipicamente, utiliza-se no transportador uma quantidade adequada de um sal farmaceuticamente aceitável para tornar a formulação isotónica. Exemplos de transportadores incluem solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. 0 pH da solução é de preferência entre cerca de 5 a cerca de 8 e mais preferencialmente de cerca de 7,4 a cerca de 7,8. Os peritos na especialidade deverão ter em conta que alguns transportadores podem ser mais preferidos, dependendo, por exemplo, da via de administração e concentração do agente 78

ΕΡ 1 255 558 /PT administrado. 0 transportador pode ser na forma de uma formulação liofilizada ou solução aquosa.

Transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são preferencialmente não tóxicos para as células e/ou receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil- ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; glícidos, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sal, tais como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). A formulação pode também conter mais do que um composto activo, como necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência os que têm actividades complementares que não se afectam umas às outras de forma adversa. O antagonista ou agonista também pode ser incluído em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical

Sciences, 16a edição, Oslo, A. Ed. (1980). 79

ΕΡ 1 255 558 /PT

As formulações a ser utilizadas para administração in vivo deverão ser estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Podem-se preparar preparações de libertação controlada. Exemplos adequados de preparações de libertação controlada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, as quais são na forma de artigos moldados, e.g., películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação controlada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Pat. US N°. 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Apesar dos polímeros, tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico, permitirem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, alguns hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo menores.

D. MODOS DE TERAPIA

As moléculas de antagonista ou agonista aqui descritas são úteis para tratar várias condições patológicas, tais como doenças imuno-relacionadas ou cancro. Estas condições podem ser tratadas estimulando ou inibindo uma actividade seleccionada associada com TALL-1, APRIL, TACI ou BCMA num mamífero, por administração de um ou mais antagonistas ou agonistas. O diagnóstico em mamíferos das várias condições patológicas aqui descritas pode ser feito pelo médico especialista. Estão disponíveis na especialidade técnicas de diagnóstico que permitem, e.g., o diagnóstico ou detecção de cancro ou doenças imuno-relacionadas num mamífero. Por exemplo, os cancros podem ser identificados por técnicas, incluindo, mas não se lhes limitando, palpação, análises de sangue, raios-X, RMN e semelhantes. As doenças imuno-relacionadas também podem ser facilmente identificadas. No 80

ΕΡ 1 255 558 /PT lúpus eritematoso disseminado, o mediador central da doença é a produção de anticorpos auto-reactivos contra proteinas/tecidos próprios e a produção subsequente de inflamação imuno-mediada. São afectados clinicamente múltiplos órgãos e sistemas, incluindo o rim, pulmão, sistema musculosquelético, mucocutâneo, olho, sistema nervoso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, medula óssea e sangue. A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória auto-imune sistémica, crónica, que afecta principalmente a membrana sinovial de múltiplas articulações, com lesão resultante da cartilagem articular. A patogénese é dependente de linfócitos T e está associada com a produção de factores reumatóides, auto-anticorpos dirigidos contra IgG próprias, com a formação resultante de complexos imunitários que atingem níveis elevados no fluido das articulações e sangue. Estes complexos na articulação podem induzir a infiltração acentuada de linfócitos e monócitos na sinóvia e alterações sinoviais marcadas, subsequentes; o espaço/fluido articular é infiltrado por células semelhantes com a adição de numerosos neutrófilos. Os tecidos afectados são essencialmente as articulações, muitas vezes em padrão simétrico. No entanto, a doença extra-articular também ocorre, em duas formas principais. Uma forma é o desenvolvimento de lesões extra-articulares com doença articular progressiva e lesões típicas de fibrose pulmonar, vascularite e úlceras cutâneas. A segunda forma de doença extra-articular é a designada síndrome de Felty, que ocorre tardiamente no curso da doença AR, por vezes após a doença das articulações se ter tornado quiescente, e envolve a presença de neutropenia, trombocitopenia e esplenomegalia. Isto pode ser acompanhado de vascularite em múltiplos órgãos com formação de enfartes, úlceras da pele e gangrena. Os pacientes também desenvolvem muitas vezes nódulos reumatóides no tecido da subderme que reveste as articulações afectadas; em fases tardias, os nódulos têm centros necróticos rodeados por um infiltrado de células inflamatórias mistas. Outras manifestações que podem ocorrer na AR incluem: pericardite, pleurite, arterite coronária, pneumonite intersticial com fibrose pulmonar, querato-conjuntivite seca e nódulos reumatóides. 81

ΕΡ 1 255 558 /PT A artrite crónica juvenil é uma doença inflamatória idiopática, crónica, que começa muitas vezes em idade inferior a 16 anos. 0 seu fenótipo tem algumas semelhanças com a AR; alguns pacientes que são positivos para o factor reumatóide são classificados como tendo artrite reumatóide juvenil. A doença é subclassifiçada em três categorias principais: pauciarticular, poliarticular e sistémica. A artrite pode ser grave e é tipicamente destrutiva e leva a anquilose da articulação ou crescimento retardado. Outras manifestações podem incluir uveite anterior crónica e amiloidose sistémica.

As espondiloartropatias são um grupo de distúrbios com algumas características clínicas comuns e a associação comum com a expressão do produto do gene HLA-B27. Os distúrbios incluem: espondilite anquilosante, síndrome de Reiter (artrite reactiva), artrite associada com doença inflamatória do intestino, espondilite associada com psoríase, espondiloartropatia de início na juventude e espondiloartropatia indiferenciada. As características distintivas incluem sacroileíte com ou sem espondilite; artrite assimétrica inflamatória; associação com HLA-B27 (um alelo serologicamente definido do locus de HLA-B de MHC de classe I); inflamação ocular, e ausência de auto-anticorpos associados com outra doença reumatóide. A célula mais implicada como chave para a indução da doença é o linfócito T CD8+, uma célula que tem como alvo antigénios apresentados por moléculas de MHC de classe I. As células CD8+ podem reagir contra o alelo de HLA-B27 de MHC de classe I como se este fosse um péptido estranho expresso pelas moléculas de MHC de classe I. Foi posta a hipótese de um epítopo de HLA-B27 poder mimetizar um epítopo antigénico bacteriano ou outro epítopo microbiano e induzir assim uma resposta de células T CD8+. A esclerose sistémica (esclerodermia) tem uma etiologia desconhecida. Uma característica da doença é o endurecimento da pele, que é provavelmente induzido por um processo inflamatório activo. A esclerodermia pode ser localizada ou sistémica; as lesões vasculares são comuns e o dano de células endoteliais na microvasculatura é um fenómeno precoce e importante no desenvolvimento da esclerose sistémica; o dano vascular pode ser imuno-mediado. Está implicada uma base imunológica devido à presença de infiltrados de células 82

ΕΡ 1 255 558 /PT mononucleares nas lesões cutâneas e à presença de anticorpos anti-nucleares em muitos pacientes. 0 ICAM-1 é muitas vezes supra-regulado na superfície celular de fibroblastos em lesões da pele, sugerindo que a interacção de células T com estas células pode ter um papel na patogénese da doença. Outros órgãos envolvidos incluem: o tracto gastrointestinal: atrofia do músculo liso e fibrose resultando em peristaltismo/motilidade anormais; rim; proliferação de íntima subendotelial concêntrica que afecta as artérias arciformes e interlobulares pequenas com o resultante fluxo sanguíneo cortical renal reduzido, resulta em proteinúria, azotemia e hipertensão; musculosquelético: atrofia, fibrose intersticial; inflamação; pulmão: pneumonite intersticial e fibrose intersticial; e coração: necrose da banda de contracção, cicatrização/fibrose.

As miopatias inflamatórias idiopáticas, incluindo dermatomiosite, polimiosite e outras, são distúrbios de inflamação muscular crónica de etiologia desconhecida, resultando no enfraquecimento muscular. A lesão/inflamação muscular é muitas vezes simétrica e progressiva. Os auto-anticorpos estão associados com a maior parte das formas. Estes auto-anticorpos específicos de miosite são dirigidos contra, e inibem a função de componentes, proteínas e ARN envolvidos na síntese de proteínas. A síndrome de Sjogren é devida a inflamação imuno-mediada e destruição funcional subsequente das glândulas lacrimais e glândulas salivares. A doença pode ser associada com, ou acompanhada de doenças do tecido conjuntivo inflamatórias. A doença está associada com a produção de auto-anticorpos contra os antigénios Ro e La, que são ambos complexos de ARN-proteína pequenos. As lesões resultam em querato-conjuntivite seca, xerostomia, com outras manifestações ou associações, incluindo cirrose biliar, neuropatia periférica ou sensorial e púrpura palpável.

As vascularites sistémicas são doenças em que a lesão primária é inflamação e dano subsequente dos vasos sanguíneos, que resulta em isquemia/necrose/degeneração dos tecidos fornecidos pelos vasos afectados e disfunção eventual do órgão final, nalguns casos. Também podem ocorrer vascularites como 83

ΕΡ 1 255 558 /PT lesão ou sequela secundária a outras doenças mediadas por imuno-inflamação, tais como artrite reumatóide, esclerose sistémica, etc., em particular em doenças também associadas com a formação de complexos imunitários. As doenças no grupo de vascularite sistémica primária incluem: vascularite necrotizante sistémica: poliarterite nodosa, angeite alérgica e granulomatose, poliangeíte; granulomatose de Wegener; granulomatose linfomatóide; e arterite de células gigantes. Vascularites miscelânea incluem: sindrome do nódulo linfático mucocutâneo (MLNS ou doença de Kawasaki), vascularite do SNC isolada, doença de Behet, tromboangeite obliterante (doença de Buerger) e venulite cutânea necrotizante. Pensa-se que o mecanismo patogénico da maior parte dos tipos de vascularite acima enumerados é essencialmente devido à deposição de complexos de imunoglobulina na parede do vaso e indução subsequente de uma resposta inflamatória, quer via ADCC, activação do complemento, ou ambos. A sarcoidose é uma condição de etiologia desconhecida que se caracteriza pela presença de granulomas epitelióides em praticamente qualquer tecido no corpo; o envolvimento dos pulmões é particularmente comum. A patogénese envolve a persistência de macrófagos activados e células linfóides em locais da doença com sequelas crónicas subsequentes, resultantes da libertação de produtos activos local e sistemicamente, libertados por estes tipos de células. A anemia hemolítica auto-imune, incluindo anemia hemolítica auto-imune, pancitopenia imune e hemoglobinúria nocturna paroxística é o resultado da produção de anticorpos que reagem com antigénios expressos na superfície dos glóbulos vermelhos (e nalguns casos outras células sanguíneas, incluindo também plaquetas) e é um reflexo da remoção dessas células revestidas com anticorpo via lise mediada por complemento e/ou mecanismos mediados por ADCC/receptor de Fc.

Na trombocitopenia auto-imune, incluindo púrpura trombocitopénica, e trombocitopenia imuno-mediada noutros estados clínicos, ocorre a destruição/remoção de plaquetas como resultado da ligação ou de anticorpos, ou complemento a plaquetas e remoção subsequente por lise do complemento, mecanismos mediados por ADCC ou receptor de Fc. 84

ΕΡ 1 255 558 /PT A tiroidite, incluindo a doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocitica juvenil e tiroidite atrófica, são o resultado de uma resposta auto-imune contra antigénios da tiróide, com produção de anticorpos que reagem com proteínas presentes em, e muitas vezes específicas para a glândula tiróide. Existem modelos experimentais, incluindo modelos espontâneos: ratos (ratos BUF e BB) e galinhas (estirpe de galinhas obesas); modelos indutíveis: imunização de animais ou com tiroglobulina, antigénio microssómico da tiróide (peroxidase da tiróide). A diabetes mellitus tipo I ou diabetes dependente de insulina é a destruição auto-imune das células-β dos ilhéus pancreáticos; esta destruição é mediada por auto-anticorpos e células T auto-reactivas. Os anticorpos contra a insulina ou o receptor de insulina também podem produzir o fenótipo de não resposta a insulina.

As doenças renais imuno-mediadas, incluindo glomerulonefrite e nefrite túbulo-intersticial, são o resultado de dano mediado por anticorpos ou linfócitos T no tecido renal, quer directamente como resultado da produção de anticorpos auto-reactivos ou células T contra antigénios renais, ou indirectamente como resultado da deposição de anticorpos e/ou complexos imunitários no rim, que são reactivos contra outros antigénios não renais. Assim, outras doenças imuno-mediadas que resultam na formação de complexos imunitários também podem induzir doença renal imuno-mediada, como uma sequela indirecta. Ambos os mecanismos imunitários directo e indirecto resultam numa resposta inflamatória que produz/induz o desenvolvimento de lesões em tecidos renais, com falha resultante da função do órgão e, nalguns casos, progressão para insuficiência renal. Ambos os mecanismos imunitários, humoral e celular, podem estar envolvidos na patogénese das lesões.

Pensa-se que as doenças desmielinizantes dos sistemas nervosos central e periférico, incluindo esclerose múltipla; polineuropatia desmielinizante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré; e polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, têm uma base auto-imune e resultam na desmielinização 85

ΕΡ 1 255 558 /PT dos nervos como resultado de dano causado nos oligodendrócitos ou na mielina, directamente. Na MS há evidências que sugerem que a indução e progressão da doença é dependente de linfócitos T. A esclerose múltipla é uma doença desmielinizante que é dependente de linfócitos T e tem, ou uma evolução de recaida-remissão ou uma evolução progressiva crónica. A etiologia é desconhecida; no entanto, as infecções virais, predisposição genética, meio ambiente, e auto-imunidade, todos contribuem. As lesões contêm infiltrados de células da microglia predominantemente mediadas por linfócitos T e macrófagos infiltrantes; os linfócitos CD4+ são o tipo de célula predominante nas lesões. 0 mecanismo de morte celular de oligodendrócitos e desmielinização subsequente não é conhecido, mas é provavelmente dirigido por linfócitos T. A doença do pulmão inflamatória e fibrótica, incluindo pneumonias eosinofilicas, fibrose pulmonar idiopática, e pneumonite de hipersensibilidade pode envolver uma resposta imuno-inflamatória desregulada. A inibição desta resposta seria um beneficio terapêutico. A doença da pele auto-imune ou imuno-mediada, incluindo doenças da pele bolhosas, eritema multiforme e dermatite de contacto, são mediadas por auto-anticorpos, cuja génese é dependente de linfócitos T. A psoriase é uma doença inflamatória mediada por linfócitos T. As lesões contêm infiltrados de linfócitos T, macrófagos e células processadoras de antigénios e alguns neutrófilos.

As doenças alérgicas, incluindo asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar e urticária, são dependentes de linfócitos T. Estas doenças são predominantemente mediadas por inflamação induzida por linfócitos T, inflamação mediada por IgE ou uma combinação de ambas.

As doenças associadas a transplantes, incluindo a rejeição de enxertos e a doença de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), são dependentes de linfócitos T; a inibição da função de linfócitos T origina melhoras. 86

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Outras doenças em que a intervenção da resposta imunitária e/ou inflamatória é benéfica são as doenças infecciosas, incluindo, mas não se lhes limitando, infecção virai (incluindo mas não se limitando a SIDA, hepatite A, B, C, D, E e herpes), infecção bacteriana, infecções fúngicas e infecções por protozoários e parasitas (moléculas (ou derivados/agonistas) que estimulam o MLR podem ser utilizadas terapeuticamente para melhorar a resposta imunitária aos agentes infecciosos), doenças de imunodeficiência (moléculas/derivados/agonistas) que estimulam o MLR podem ser utilizadas terapeuticamente para melhorar a resposta imunitária para condições de imunodeficiência herdada, adquirida, induzida por infecção (tal como infecção por VIH) ou iatrogénica (i.e. por quimioterapia) e neoplasia. 0(s) antagonista(s) ou agonista(s) pode ser administrado de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, como um bolus ou por infusão continua durante um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação. Opcionalmente, a administração pode ser efectuada através de infusão por mini-bomba utilizando vários dispositivos disponíveis no mercado. Os antagonistas ou agonistas também podem ser utilizados em técnicas de terapia génica que foram descritas na especialidade.

As dosagens eficazes e esquemas para administrar antagonistas ou agonistas podem ser determinados empiricamente e estas determinações estão no âmbito dos conhecimentos na especialidade. Podem-se utilizar dosagens únicas ou múltiplas. Pensa-se actualmente que uma dosagem ou quantidade eficaz de antagonista ou agonista utilizada isolada pode ser na gama de cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia. O escalonamento de dosagens inter-espécies pode ser realizado de um modo conhecido na especialidade, e.g., como descrito em Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8_:1351 (1991) .

Quando se utiliza a administração in vivo de um agonista ou seu antagonista, as quantidades de dosagem normal podem variar de cerca de 10 ng/kg até cerca de 100 mg/kg de peso 87 ΕΡ 1 255 558 /PT corporal do mamífero ou mais, por dia, de preferência cerca de 1 pg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. A linha de orientação quanto a dosagens particulares e métodos de fornecimento é proporcionada na literatura; veja-se, por exemplo, Pat. US Nos. 4657760; 5206344; ou 5225212. Prevê-se que diferentes formulações serão eficazes para diferentes compostos de tratamento e diferentes distúrbios, que a administração tendo como alvo um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar de fornecimento de um modo diferente de outro órgão ou tecido. Os peritos na especialidade entenderão que a dosagem de agonista ou antagonista que deve ser administrada dependerá, por exemplo, do mamífero que irá receber o agonista ou antagonista, da via de administração e de outras drogas ou terapias administradas ao mamífero.

Dependendo do tipo de células e/ou gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (e.g. 0,1-20 mg/kg) de anticorpo antagonista ou anticorpo agonista é uma dosagem candidata inicial para administração, quer seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dose diária típica pode variar entre cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores acima mencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, poderão ser úteis outros regimes de dosagem.

Opcionalmente, antes da administração de qualquer antagonista ou agonista, o mamífero ou paciente pode ser testado para determinar os níveis de actividade de TALL-1 ou APRIL ou TACI ou BCMA. Este teste pode ser realizado por ELISA ou FACS de amostras de soro, ou leucócitos de sangue periférico.

Pode-se utilizar nos métodos um único tipo de antagonista ou agonista. Por exemplo, pode-se administrar um antagonista de TALL-1, tal como uma molécula de imunoadesina do receptor TACI. Alternativamente, o médico especialista pode optar por utilizar uma combinação de antagonistas ou agonistas nos métodos, e.g., uma combinação de uma imunoadesina do receptor TACI e um anticorpo anti-APRIL. Pode também ser desejável 88 ΕΡ 1 255 558 /PT utilizar um antagonista duplo, i.e. um antagonista que actua para bloquear ou inibir quer TALL-1, quer APRIL. Esta molécula de antagonista pode, por exemplo, ligar-se a epítopos conservados entre TALL-1 e APRIL ou TACI e BCMA. É contemplado que se possam utilizar ainda outras terapias nos métodos. A terapia, ou mais terapias podem incluir, mas não se lhes limitam, administração de terapia de radiação, citóquina(s) , agente(s) de inibição do crescimento, agente(s) quimioterapêutico(s), agente(s) citotóxico(s), inibidores de tirosina-quinase, inibidores de ras farnesil-transferase, inibidores de angiogénese e inibidores de quinase dependente de ciclina que são conhecidos na especialidade e definidos mais em particular na secção I acima. Adicionalmente, as terapias baseadas em anticorpos terapêuticos que se direccionam para antigénios de tumor, tais como Rituxan™ ou Herceptin™, bem como anticorpos anti-angiogénicos, tais como anti-VEGF. A preparação e esquemas de dosagem para agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante, ou como determinado empiricamente pelo médico especialista. A preparação e esquemas de dosagem para esta quimioterapia também estão descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). 0 agente quimioterapêutico pode preceder, ou suceder à administração de, e.g., um antagonista, ou pode ser administrado em simultâneo com este. 0 antagonista também pode ser combinado com um composto anti-estrogénio, tal como tamoxifeno ou um anti-progesterona, tal como onapristona (veja-se EP616812) em dosagens conhecidas para estas moléculas.

Poderá ser desejável administrar também anticorpos contra outros antigénios, tais como anticorpos que se ligam a CD20, CDlla, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, ou em adição, dois ou mais anticorpos que se ligam ao mesmo, ou a dois ou mais antigénios diferentes aqui descritos podem ser co-administrados ao paciente. Por vezes, pode ser benéfico administrar também uma ou mais citóquinas ao paciente. Os antagonistas aqui descritos podem ser co-administrados com um 89 ΕΡ 1 255 558 /PT agente inibidor do crescimento. Por exemplo, o agente inibidor do crescimento pode ser administrado primeiro, seguido de um antagonista da presente invenção. 0 antagonista ou agonista (e uma ou mais outras terapias) pode ser administrado concorrente ou sequencialmente. Após administração do antagonista ou agonista, as células tratadas in vitro podem ser analisadas. Quando houve um tratamento in vivo, um mamífero tratado pode ser monitorizado de vários modos bem conhecidos do médico especialista. Por exemplo, podem-se testar marcadores de actividade de células B, tal como a produção de Ig (não específica ou específica do antigénio)

III. MÉTODOS DE PESQUISA

Podem-se utilizar métodos para pesquisar moléculas para identificar as que podem actuar como agonistas ou antagonistas da interacção APRIL/TACI/BCMA ou da interacção TALL-1/TACI/BCMA. Estas moléculas podem compreender moléculas pequenas ou polipéptidos, incluindo anticorpos. Exemplos de moléculas pequenas incluem, mas não se lhes limitam, péptidos pequenos ou moléculas tipo péptido, de preferência péptidos solúveis e compostos orgânicos ou inorgânicos não peptídicos, sintéticos. Os testes de pesquisa para candidatos a droga são concebidos para identificar compostos ou moléculas que se ligam a, ou complexam com os polipéptidos ligando ou receptor aqui identificados, ou interferem de outro modo com a interacção destes polipéptidos com outras proteínas celulares. Estes testes de pesquisa irão incluir testes passíveis de pesquisar bibliotecas químicas com elevado rendimento, tornando-os particularmente adequados para identificar candidatos a drogas de moléculas pequenas.

Os testes podem ser realizados numa variedade de formatos, incluindo testes de ligação proteína-proteína, testes de pesquisa bioquímicos, imunoensaios e testes baseados em células, que estão bem caracterizados na especialidade.

Os testes para, por exemplo, antagonistas, são comuns na medida em que requerem o contacto do candidato a droga com um polipéptido ligando ou receptor aqui identificado, sob 90

ΕΡ 1 255 558 /PT condições e durante um tempo suficiente para permitir que estes dois componentes interajam.

Em testes de ligação, a interacção é a ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura reaccional. Numa concretização particular, o polipéptido ligando ou receptor aqui identificado ou o candidato a droga é imobilizado numa fase sólida, e.g., numa placa de microtitulo, por ligações covalentes ou não covalentes. A ligação não covalente é geralmente realizada revestindo a superfície sólida com uma solução do polipéptido ligando ou receptor e secando. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, e.g., um anticorpo monoclonal específico para o polipéptido ligando ou receptor a ser imobilizado, pode ser utilizado para o ancorar a uma superfície sólida. O teste é realizado adicionando o componente não imobilizado, que pode ser marcado por um marcador detectável, ao componente imobilizado, e.g., a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reacção está completa, os componentes não reagidos são removidos, e.g., por lavagem e os complexos ancorados na superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não imobilizado transporta um marcador detectável, a detecção do marcador imobilizado na superfície indica que ocorreu complexação. Quando o componente originalmente não imobilizado não transporta um marcador, a complexação pode ser detectada, por exemplo, utilizando um anticorpo marcado, que se liga especificamente ao complexo imobilizado.

Se o composto candidato interage com, mas não se liga a um polipéptido ligando ou receptor particular aqui identificado, a sua interacção com esse polipéptido pode ser testada por métodos bem conhecidos para a detecção de interacções proteína-proteína. Estes testes incluem abordagens tradicionais, tais como, e.g., reticulação, co-imunoprecipitação e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso, as interacções proteína-proteína podem ser monitorizadas utilizando um sistema genético baseado em levedura, descrito por Fields e colaboradores (Fields e Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 88:9578-9582 (1991)) como descrito por Chevray e Nathans, Proc. Natl. Acad 91

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Sei. USA,, 89; 5789-5793 (1991). Muitos activadores da transcrição, tais como GAL4 de levedura, consistem de dois domínios modulares fisicamente discretos, um que actua como domínio de ligação a ADN, o outro funcionando como domínio de activação da transcrição. 0 sistema de expressão de levedura descrito nas publicações anteriores (geralmente designado por "sistema de dois híbridos") tira vantagem desta propriedade e utiliza duas proteínas híbridas, uma em que a proteína alvo está fundida com o domínio de ligação ao ADN de GAL4 e outra em que as proteínas activadoras candidatas estão fundidas com o domínio de activação. A expressão de um gene repórter GAL1-lacZ sob o controlo de um promotor activado por GAL-4 depende da reconstituição da actividade de GAL4 através da interaeção proteína-proteína. As colónias que contêm polipéptidos que interagem são detectadas com um substrato cromogénico para β-galactosidase. Está disponível no mercado, da Clontech, um kit completo (MATCHMAKER™) para identificar interacçóes proteína-proteína entre duas proteínas específicas, utilizando a técnica de dois híbridos. Este sistema também pode ser alargado para mapear domínios de proteína envolvidos em interaeções de proteína específicas, bem como para revelar resíduos de aminoácido que são cruciais para estas interaeções.

Os compostos ou moléculas que interferem com a interaeção de um polipéptido ligando ou receptor aqui identificado e outros componentes intra- ou extracelulares podem ser testados como se segue: normalmente prepara-se uma mistura reaccional contendo o produto do gene e o componente intra- ou extracelular, sob condições e durante um tempo que permite a interaeção e ligação dos dois produtos. Para testar a capacidade de um composto candidato inibir a ligação, a reacção é corrida na ausência e na presença do composto de teste. Adicionalmente, pode-se adicionar um placebo a uma terceira mistura reaccional, para servir como controlo positivo. A ligação (formação de complexo) entre o composto de teste e o componente intra- ou extracelular presente na mistura é monitorizada como descrito acima. A formação de um complexo na(s) reacção(ões) de controlo, mas não na mistura reaccional que contém o composto de teste, indica que o composto de teste interfere com a interaeção do composto de teste com o seu parceiro de reacção. 92

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Para testar antagonistas, o polipéptido ligando ou receptor pode ser adicionado a uma célula juntamente com o composto a ser pesquisado quanto a uma actividade particular e a capacidade do composto inibir a actividade de interesse na presença do polipéptido ligando ou receptor indica que o composto é um antagonista do polipéptido ligando ou receptor. Alternativamente, os antagonistas podem ser detectados combinando o polipéptido ligando ou receptor e um antagonista potencial com receptores do polipéptido ligados à membrana ou receptores recombinantes, sob condições adequadas para um teste de inibição competitiva. 0 polipéptido ligando ou receptor pode ser marcado, tal como por radioactividade, de modo que o número de moléculas de polipéptido ligadas ao receptor pode ser utilizado para determinar a eficácia do antagonista potencial. 0 gene que codifica para o receptor pode ser identificado por vários métodos conhecidos dos peritos na especialidade, por exemplo, adsorção-desadsorção do ligando e discriminação por FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). De preferência, utiliza-se clonagem de expressão, em que se prepara ARN poliadenilado a partir de uma célula que responde ao polipéptido ligando ou receptor e uma biblioteca de ADNc criada a partir deste ARN é dividida em conjuntos e utilizada para transfectar células COS ou outras células que não respondem ao polipéptido ligando ou receptor. As células transfectadas que são crescidas em lâminas de vidro são expostas a polipéptido ligando ou receptor marcado. 0 polipéptido ligando ou receptor pode ser marcado por uma variedade de meios, incluindo iodação ou inclusão de um local de reconhecimento para uma proteína-quinase específica do local. Após fixação e incubação, as lâminas são submetidas a análise autorradiográfica. Os conjuntos positivos são identificados e preparam-se subconjuntos que são novamente transfectados utilizando um processo interactivo de formação de subconjuntos e nova pesquisa, originando eventualmente um único clone que codifica para o receptor putativo.

Como abordagem alternativa, o polipéptido ligando marcado pode ser ligado por fotoafinidade com preparações de membrana ou extracto celular que expressam a molécula receptora. 0 material reticulado é resolvido por PAGE e exposto a uma 93

ΕΡ 1 255 558 /PT película de raios-X. 0 complexo marcado contendo o receptor pode ser excisado, resolvido em fragmentos peptídicos e submetido a micro-sequenciação de proteínas. A sequência de aminoácidos obtida por micro-sequenciação será utilizada para conceber um conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados, para pesquisar uma biblioteca de ADNc para identificar o gene que codifica para o receptor putativo. IV. Artigos de fabrico

Descreve-se um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. 0 artigo de fabrico compreende um recipiente e uma instrução. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. 0 recipiente contém uma composição que é eficaz para o diagnóstico ou tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa, ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). 0 agente activo na composição pode compreender antagonista(s) de TALL-1 ou antagonista(s) de APRIL, ou agonista(s) de TACI ou agonista(s) de BCMA. A instrução no, ou associada com o recipiente indica que a composição é utilizada para tratar a condição de escolha. 0 artigo de fabrico pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e inserções na embalagem com instruções de utilização.

Os exemplos seguintes são apresentados apenas para fins ilustrativos e não são limitativos. EXEMPLO 1

Identificação e clonagem de expressão de TACI, um receptor para o ligando TALL-1

Preparou-se uma proteína quimérica designada por "AP-TALL-1", utilizando fosfatase alcalina (AP) de placenta 94

ΕΡ 1 255 558 /PT humana fundida com o terminal N de um polipéptido TALL-1 que consiste dos aminoácidos 136-285 apresentados na Figura 3. A AP foi obtida por amplificação por PCR utilizando pAPtag-5 (Genehunter Corporation) como um modelo, e fundida e clonada no vector de expressão, pCMV-1 Flag (Sigma), com AP no terminal N de TALL-1. 0 AP-TALL-1 foi transfectado de forma transitória (utilizando reagente Lipofectamine; Gibco-BRL) e expresso em células 293 de rim embrionário humano (ATCC). 0 AP-TNF-alfa (Pennica et al., infra) foi preparado de modo semelhante. 0 AP-EDA (compreendendo os aminoácidos 241-391 de EDA; Srivastava et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 94:13069-13074 (1997)) também foi preparado de modo semelhante. O meio condicionado das células 293 transfectadas foi filtrado (0,45 micron), armazenado a 4°C num tampão contendo Hepes 20mM (pH 7,0) e azida de sódio 1 mM e utilizado para posteriores procedimentos de coloração de células.

Adicionalmente, construiu-se uma forma de TALL-1 marcada com Flag no terminal N, num vector pCMV-1 Flag. Para promover a trimerização desta construção de TALL-1 marcado com Flag, inseriu-se uma forma trimérica da sequência fecho de correr de leucinas [Science, 262:1401-1407 (1993)] entre o marcador Flag e o TALL-1 (consistindo dos aminoácidos 136-285 da Figura 3), e esta construção foi designada por "Flag-LZP-TALL-1". A Flag-LZP-TALL-1 foi purificada utilizando gel de M2-agarose (Sigma) a partir de meio isento de soro de células 293 transfectadas com o plasmideo que expressa Flag-LZP-TALL-1.

Foi possível detectar facilmente a reactividade de AP quando o meio condicionado de AP-TALL-1, mas não o meio condicionado de AP controlo, foi aplicado a células IM-9 (ATCC) que exibem níveis elevados de actividade de ligação a TALL-1 (dados não apresentados). A Flag-LZP-TALL-1 purificada também se ligou a células IM-9, tal como determinado por análise FACS (dados não apresentados). Com relevância, a ligação de AP-TALL-1 a células IM-9 foi eficazmente bloqueada por pré-incubação com Flag-LZP-TALL-1 purificada, mas não com TNF-alfa purificado [preparado essencialmente como descrito em Pennica et al., Nature, 312:724-729 (1984)], sugerindo que ambas as formas de TALL-1 eram funcionais e que a ligação respectiva de AP-TALL-1 e Flag-LZP-TALL-1 a células IM-9 era específica. 95

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Para identificar um receptor para TALL-1, construiu-se uma biblioteca de expressão de ADNc no vector pRK5 (EP 307247, publicado em 15 de Março de 1989) utilizando ARNm PoliA+ derivado de células IM-9 [Flanagan et al., Cell, 63:185 (1990)]. Transfectaram-se (utilizando Lipofectamine) conjuntos de -1000 clones de ADNc (ADN Miniprep (Qiagen)) da biblioteca em células COS 7 (ATCC) em placas de 6 poços que após 36-48 horas foram incubadas com meio condicionado de AP-TALL-1, lavadas e coradas para actividade de AP in situ. Um conjunto positivo foi dividido em conjuntos de tamanho sucessivamente menor. Após três ciclos de pesquisa, identificou-se um único ADNc que codifica para uma actividade de ligação a AP-TALL-1. A sequenciação da inserção de ADNc revelou um único quadro de leitura aberto que se prevê que codifica para uma proteína de 265 aminoácidos. Este polipéptido de 265 aminoácidos (designado por "hTACI (265)" na Figura 6), quando alinhado com a sequência de TACI apresentada na Fig. 1 (designada por "hTACI" na Figura 6), revelou uma percentagem elevada de identidade de sequência, em particular na ECD. O alinhamento destas duas sequências de TACI é apresentado na Figura 6. Pensa-se que a forma de 265 aminoácidos de TACI pode ser uma variante de splicing da sequência de TACI apresentada na Figura 1.

Num teste in vitro, semearam-se células COS 7 (ATCC) em placas de 12 poços, 24 horas antes da transfecção. As células foram então transfectadas com 1 micrograma de TACI (a forma de 265 aminoácidos de TACI humano descrita acima, clonada no vector pRK5B, infra) ou vector plasmídico (pRK5B) isolado. 18-24 horas após a transfecção, as células foram incubadas com meio condicionado contendo AP-TALL-1; AP-TNF-alfa; ou AP-EDA durante 1 hora à temperatura ambiente e coradas para actividade de AP in situ, como descrito em Tartaglia et al., Cell, 83:1263-1271 (1995).

Como se pode ver na Fig. 7, verificou-se que o AP-TALL-1 (Fig. 7A) mas não o AP-TNF-alfa (Fig. 7B) ou AP-EDA (Fig. 7C) se liga a células COS 7 transf ectadas com TACI. O AP-TALL-1 não corou células transfectadas com vector plasmídico isolado (Fig. 7D) . A ligação de AP-TAhL-1 às células COS 7 transfectadas com TACI foi eficazmente bloqueada por uma forma 96 ΕΡ 1 255 558 /PT de TALL-1 marcada com Flag, mas não por uma forma de LIGHT marcada com Flag (Mauri et al., supra], outro homólogo de TNF (dados não apresentados). EXEMPLO 2

Ligaçao de TALL-1 ou APRIL a TACI-IgG e BCMA-IgG

Prepararam-se ligandos marcados com Flag como se segue. Subclonaram-se os aminoácidos 82-240 de LIGHT (Mauri et al., Immunity, 8_:21-30 (1998)) em pCMV-1 Flag (Sigma) utilizando um local Notl para fundir os aminoácidos 1-27 da sequência de sinal e marcadora Flag a montante da sequência LIGHT. Os aminoácidos 105-250 de APRIL (veja-se Fig. 4) foram clonados de modo semelhante em pCMV-1 Flag (Sigma), excepto que se utilizou um local de HindIII, resultando na fusão com os aminoácidos 1-24 da sequência de sinal e marcadora Flag. Os aminoácidos 124-285 de TALL-1 (veja-se Fig. 3) foram fundidos com os aminoácidos 1-27 da sequência de sinal e marcadora Flag, como descrito acima para Flag-LIGHT. Preparou-se AP-APRIL por clonagem dos aminoácidos 105-250 de APRIL (veja-se Fig. 4) num vector pCMV-1 Flag que codifica para fosfatase alcalina de placenta humana, de modo que a sequência codificante de APRIL foi fundida pelo terminal C a AP, enquanto que a AP foi fundida pelo terminal C a Flag. Preparou-se AP-TALL-1 clonando os aminoácidos 135-285 de TALL-1 (veja-se Fig. 3) no vector AP pCMV-1 Flag, como descrito acima para AP-APRIL. As proteínas marcadas respectivas foram então expressas em células 293 ou células CHO e purificadas utilizando resina anti-Flag M2 (Sigma).

Incubou-se 1 pg de Flag-LIGHT (controlo), Flag-APRIL, ou Flag-TALL-1, ou Flag-AP-APRIL, ou Flag-AP-TALL-1, purificado humano com 1 pg de imunoadesina humana purificada contendo a fusão IgGl-Fc da ECD de DcR3 (controlo; Pitti et al., Nature, 396:699-703 (1998)) ou TACI, ou BCMA durante a noite a 4°C, em duplicado. As imunoadesinas TACI-ECD.hFc foram preparadas por métodos descritos em Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 8_8:10535-10539 (1991). As construções de imunoadesina consistiam dos aminoácidos 2-166 do polipéptido TACI humano (veja-se Figura 1). As construções TACI-ECD foram expressas em células CHO utilizando uma sequência de sinal heteróloga (pre-pro-tripsina aminoácidos 1-17 de pCMV-1 Flag (Sigma)) e que 97 ΕΡ 1 255 558 /PT codifica para a região Fc de IgGl humana a jusante da seguência de TACI e em seguida purificou-se por cromatografia de afinidade de proteína A. As imunoadesinas BCMA-ECD foram preparadas pelos métodos descritos em Ashkenazi et al., como citado acima. As construções de imunoadesina consistiam dos aminoácidos 5-51 do polipéptido BCMA humano (veja-se Figura 2). As construções BCMA-ECD foram expressas em células CHO utilizando uma sequência de sinal heteróloga (pre-pro tripsina aminoácidos 1-17 de pCMV-1 Flag (Sigma)) e que codifica para a região Fc de IgGl humana a jusante da sequência de BCMA e em seguida purificou-se por cromatografia de afinidade de proteína A.

Um conjunto de reacções (Figura 8; Painéis A-C) foi submetido a imunoprecipitação pelo receptor-imunoadesina com proteína A-agarose (Repligen). 0 segundo conjunto de reacções (Figura 8; painéis D-F) foi submetido a imunoprecipitação pelo ligando marcado com Flag com mAc Anti-Flag-M2-agarose (Sigma). Os imunoprecipitados foram então analisados por transferência de Western com mAc anti-Flag M2 (Sigma) conjugado com peroxidase de rábano, para detectar os ligandos marcados com Flag (Figuras 8A-C) ou pAc de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase de rábano (Amersham) , para detectar receptor-imunoadesinas (Figuras 8D-F).

Os dados mostram que o Flag-LIGHT se ligou a DcR3-IgG, mas não a TACI-IgG ou BCMA-lgG. 0 Flag-APRIL e Flag-AP-APRlL ligaram-se a TACI-IgG e BCMA-lgG, mas não a DcR3-IgG. De um modo semelhante, o Flag-TALL-1 e Flag-AP-TALL-1 ligaram-se a TACI-IgG e BCMA-lgG, mas não a DcR3-IgG. Estes resultados de teste indicaram que o APRIL e TALL-1 se podem ligar, cada um, de um modo específico e estável a TACI e a BCMA.

Num teste de co-imunoprecipitação realizado de forma semelhante, incubou-se TACI-Fc (descrito no Exemplo 2), HVEM-Fc (Montgomery et al., supra); DR3-Fc (Chinnaiyan et al., Science, 274: 990 (1996); Marsters et al., Curr. Biol., 6gl669 (1996)); ou DR6-Fc (Pan et al., FEBS Letters, 431:351-356 (1998)) (1 pg/ml) com Flag-TALL-1 (1 pg/ml; preparado como descrito no Exemplo 2). Submeteu-se um conjunto de reacções a imunoprecipitação pela fusão receptor-Fc com proteína A Agarose; o segundo conjunto de reacções foi submetido a 98

ΕΡ 1 255 558 /PT imunoprecipitação pelo ligando, com anticorpo anti-Flag. As amostras foram analisadas por transferência de Western, como acima. 0 Flag-TALL-1 não foi detectado na co-imunoprecipitação de anti-Fc com as construções de fusão de Fc de HVEM, DR3, ou DR6 (Figura 8G) . Pelo contrário, o TACI-Fc não foi detectado nas co-imunoprecipitações de anti-Flag com HVEM-Fc, DR3-Fc, ou DR6-Fc (Figura 8H).

Realizaram-se outros testes para determinar se o TACI poderia actuar como receptor para outros membros da família de ligandos de TNF. As células COS 7 (ATCC) foram transfectadas de forma transitória (utilizando reagente Lipofectamine) com formas de membrana de vários ligandos da família de TNF. Entre os ligandos testados estavam APRIL, TALL-1, 4-1 BBL, CD27L, CD30L, CD40L, EDA, FasL, GITRL, LT-alfa, OX-40L, RANKL, TNF-alfa, TNF-beta e Apo2L/TRAIL. 0 TNF-alfa humano foi clonado no vector pRK5B (pRK5B é um precursor de pRK5D que não contém o local de Sfil; veja-se Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)). Para a detecção da expressão de TNF-alfa na superfície celular, inseriu-se um marcador Flag entre o aminoácido 70 e aminoácido 71 (utilizando a numeração de acordo com a sequência em Pennica et al., supra). Clonou-se individualmente uma região extracelular de TALL-1 (aa 75-285; veja-se Figura 3), 4-1BBL (aa 59-254; Goodwin et al. , Eur. J. Immunol., 23:2631-2641 (1993)), ligando CD27 (aa 40-193; Goodwin et al., Cell, 7_3:447-456 (1993)), ligando CD30 (aa 61-234; Smith et al.,

Cell, 73:1349-1360 (1993)), RANKL (aa 71-317; veja-se W098/28426) ligando Apo-2 (aa 40-281; veja-se W097/25428) ou Apo-3L (aa 46-249; veja-se WO99/19490 no local BamHI. Isto resultou num ligando quimérico com as regiões intracelular e transmembranares de TNF-alfa e a região extracelular dos vários ligandos. Para APRIL (veja-se Figura 4) e EDA (Srivastava et al., supra), utilizaram-se clones de ADNc de tamanho completo sem marcador Flag.

As células COS 7 transfectadas foram subsequentemente incubadas com imunoadesina TACI.ECD.hFC (preparada como descrito acima). As células foram incubadas com o TACI ECD-IgG (ou uma construção TNFRl-IgG preparada como descrito em Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 88:10535-10539 99

ΕΡ 1 255 558 /PT (1991)) a 1 pg/ml durante 1 hora em PBS. As células foram subsequentemente lavadas três vezes com PBS e fixadas com paraf ormaldeído a 4% em PBS. A coloração de células foi visualizada por incubação com anticorpo de cabra anti-humano biotinilado (Jackson Labs, a uma diluição de 1:200) seguido de Cy3-estreptavidina (Jackson Labs, a uma diluição de 1:200).

Para identificar ligandos potenciais de BCMA, fizeram-se experiências de ligação semelhantes, como acima descrito para TACI. Preparou-se uma imunoadesina BCMA.ECD.hFc como descrito acima.

De modo semelhante a TACI, o BCMA apenas interagiu com APRIL e TALL-1. Como se pode ver na Fig. 9A, o TACI-hFc e BCMA-hFc ligaram-se a células transfectadas com TALL-1 ou April, mas não TNF-alfa. Pelo contrário, o AP-TALL-1 ou AP-APRIL ligaram-se especificamente a células transfectadas com TACI ou BCMA (Fig. 9B). EXEMPLO 3

Indução da produção de IgM por TALL-1 e APRIL e inibição da indução por TACI-IgG e BCMA-IgG

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) num gradiente de Ficol, de acordo com as instruções do fabricante (meio LSM, ICN/Cappel, OH). Obtiveram-se então leucócitos de sangue periférico (PBL) a partir de PBMC utilizando remoção convencional de células aderentes a plástico. Os PBL foram plaqueados em placas de 48 poços (3 x 104 células/poço em 0,3 ml de meio RPMI1640 contendo FBS a 10%) e incubados durante 72 horas a 37°C, C02 a 5%, com PBS (controlo), ou IL-4 (100 ng/ml, controlo, R & D Systems, Minneapolis, MN) , ou Flag-TALL-1 (como descrito no Exemplo 2 acima) (1 pg/ml) . Para análise de inibição, as células foram incubadas com cada um dos anteriores em combinação com 20 yg/ml de TACI-IgG ou BCMA-IgG (preparado como descrito no Exemplo 2 acima), ou um controlo de imunoadesina com correspondência para o isotipo. Os sobrenadantes celulares foram recolhidos e analisados quanto aos níveis de IgM, utilizando um kit ELISA de IgM de acordo com as instruções do fabricante (Bethyl Laboratories, TX). 100

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Os resultados são apresentados na Figura 10. A IL-4, utilizada como controlo positivo, induziu a produção de IgM em comparação com o PBS controlo. O TALL-1 ou APRIL induziram uma produção de IgM pelo menos tão elevada quanto a de IL-4. A combinação de TALL-1 e APRIL não revelou mais indução de IgM em comparação com cada ligando isolado. O TACI-IgG não bloqueou o efeito de IL-4, mas bloqueou o efeito de TALL-1 e/ou APRIL completamente. O BCMA-IgG não bloqueou o efeito de IL-4, mas bloqueou o efeito de TALL-1 e/ou APRIL substancialmente, embora não completamente. A imunoadesina de controlo não bloqueou nenhum dos ligandos. Estes resultados mostram que o TALL-1 e APRIL podem induzir a produção de IgM em PBL. Além disso, os dados mostram que o TACI-IgG e BCMA-IgG podem bloquear os efeitos de TALL-1 ou APRIL na produção de IgM, confirmando a sua capacidade respectiva de se ligar a cada ligando e demonstrando a sua capacidade respectiva de bloquear a actividade do ligando em células alvo. EXEMPLO 4

A interacçao entre TALL-1 ou APRIL com TACI e/ou BCMA resulta na activação de NF-KB

Semearam-se células 293 (ATCC) 24 horas antes da transfecção, a 1 x 105 células/poço em placas de 12 poços e transfectaram-se com 0,25 pg de plasmídeo do gene repórter ELAM-luciferase, 25 ng de pRL-TK (Promega) e as quantidades indicadas de cada construção de expressão (veja-se Figura 11). A quantidade total de ADN transfectado foi mantida constante a 1 mg, por suplementação com vector pRK5B vazio (veja-se Exemplo 2) . Nalguns poços de teste, adicionaram-se ligandos marcados com Flag (preparados como descrito no Exemplo 2) nas concentrações indicadas, 4 horas após a transfecção. Noutros poços de teste, as células foram co-transfectadas com TALL-1 de tamanho completo (Fig. 3) ou RANKL (W098/28426). As células foram recolhidas 20-24 horas após a transfecção e determinou-se a actividade do gene repórter com o sistema de teste de repórter duplo de Luciferase (Promega).

Observou-se apenas uma activação mínima de NF-kB quando o TACI ou BCMA foi expresso isolado a níveis baixos (tal como a 101

ΕΡ 1 255 558 /PT 0,1 ng). A activação de NF-kB, no entanto, era bastante aumentada quer por adição de Flag-TALL-1 , quer de Flag-APRIL (Fig. 11A), ou por co-transfecção com TALL-1 ou APRIL de tamanho completo (Fig. 11B; 11C). O tratamento de células IM-9 não transfectadas com Flag-TALL-1 também resultou na activação de NF-kB (veja-se Fig. 11D) . As células IM-9 (ATCC) foram incubadas com Flag-TALL-1 (0,3 pg/ml) ou PBS isolado, ou em combinação com TACI-IgG ou TNFRl-IgG 20 pg/ml (preparado como descrito no Exemplo 2). A actividade de NF-kB foi medida por um teste de desvio de mobilidade electroforética, como descrito em Montgomery et al., Cell, 8_7:427-436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem., 272:14029 (1997); Chinnaiyan et al., Science, 274: 990 (1996);

Marsters et al., Curr. Biol., 6_:1669 (1996); Pan et al., FEBS Letters, 431:351 (1998).

Os dados sugerem que uma consequência fisiológica da interacção TALL-1/APRIL-TACI/BCMA é a activação da via do NF-kB. EXEMPLO 5

Inibição da formaçao do centro germinal e produção de anticorpos em ratinhos imunizados, tratados com TACI-IgG ou BCMA-IqG

Fizeram-se testes In vivo para determinar se o bloqueio da interacção TALL-l/TACI ou TALL-l/BCMA impossibilita respostas imunitárias humorais. Três grupos de ratinhos C57BL/6 fêmea com 6-8 semanas de idade foram imunizados intraperitonealmente (i.p.) com 100 pg de gama globulina de galinha conjugada com acetilo (NP23-CgG) (Biosource Technologies) precipitada em alúmen (4-hidroxi-3-nitrofenilo). Os grupos de animais foram tratados diariamente durante 14 dias com 50 pg de TACI-Fc ou BCMA-Fc (preparado como descrito no Exemplo 2) em 100 pl de solução salina (e os animais de controlo foram tratados com 100 pl de solução salina) por injecção i.p.

Após 14 dias, os soros dos ratinhos foram analisados quanto a IgM especifica de NP, IgGl de baixa afinidade e IgGl de afinidade elevada utilizando um método ELISA convencional. 102

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As IgGl específicas de NP, quer anticorpos de afinidade elevada, quer anticorpos totais (afinidade elevada e baixa) foram quantificados por ELISA em poços revestidos com albumina de soro bovino conjugada com NP2.5 e NP23, respectivamente. Os anticorpos ligados foram detectados com IgM ou IgGl de cabra anti-ratinho conjugada com AP (Pharmingen).

Os resultados são apresentados na Figure 12. O TACI-Fc e BCMA-Fc inibiram substancialmente a produção de anticorpos IgM específicos de NP, em comparação com o controlo (Fig. 12A) , indicando que as interacções TALL-l/TACI e TALL-l/BCMA (e interacções APRIL/TACI e APRIL/BCMA) são importantes durante a fase precoce de activação de células B que leva à secreção de IgM. O TACI-Fc e BCMA-Fc inibiram também as respostas de IgGl específica de NP de afinidade baixa e elevada (Fig. 12 B, C) , sugerindo que ambas as interacções TALL-l/TACI e TALL-l/BCMA (e ambas as interacções APRIL/TACI e APRIL/BCMA) também são importantes para troca de classe de Ig e maturação de afinidade.

Durante a fase precoce de uma resposta de anticorpos específicos do antigénio, as células B diferenciam-se em células que formam anticorpos (AFC). Isto ocorre em áreas extrafoliculares do baço, compostas por bainhas linfóides periarteriolares (PALS) [Gray et al., Immunology, 65:73 (1988): NacLennan, Ann. Rev. Immunol., 1_2 : 117 (1988)], onde ocorre subsequentemente a troca de classe de Ig. As regiões associadas a PALS foram comparadas entre baços de ratinhos imunizados com NP23-CgG tratados durante 10 dias com Ig de controlo, TACI-Fc, ou BCMA-Fc, de modo semelhante ao descrito acima. Fez-se então a análise imuno-histoquimica das várias secções de baço. As secções de baço preparadas 10 dias após imunização e coradas com anti-IgGl conjugado com FITC são apresentadas na Figura 13-1 (Painel A) e Figura 13-2 (Painel A) . Como esperado, os ratinhos de controlo apresentavam um grande número de focos de AFC aglomerados que coraram intensamente com anti-IgGl e continham muitas células do tipo imunoblastos (Fig. 13-1, Painel A, esquerda). Pelo contrário, os ratinhos tratados com TACI-Fc apresentavam apenas algumas células positivas para IgGl isoladas, sem formação de focos de AFC (Fig. 13-1, Painel A, direita). Os ratinhos tratados com BCMA-Fc apresentaram igualmente apenas 103

ΕΡ 1 255 558 /PT algumas células positivas para IgGl isoladas, sem formação de focos de AFC (Fig. 13-2, Painel A) . Assim, as interacções TALL-l/TACI e TALL-l/BCMA (e APRIL/TACI e APRIL/BCMA) são importantes para a diferenciação extrafolicular de células B que precede a troca de classe de Ig em áreas do baço associadas a PALS.

Para estudar o papel potencial de interacções TALL-l/TACI e TALL-l/BCMA na maturação da afinidade do anticorpo, a formação de centros germinais (GC) foi analisada nos baços de ratinhos imunizados com NP23-CgG, no dia 14. Prepararam-se secções de baço, 14 dias após imunização e coraram-se com anti-PNA conjugado com FITC (fluorescência verde) e anti-IgM conjugado com vermelho Texas (fluorescência vermelha). Como esperado, os foliculos do baço dos controlos apresentavam uma coloração intensa com aglutinina de amendoim (PNA), uma lectina que se liga especificamente a células B de GC (Fig. 13-1, Painel B, esquerda). Em forte contraste, os foliculos de baço de ratinhos tratados com TACI-Fc eram destituídos de GC e apresentavam apenas algumas células com coloração de PNA, isoladas (Fig. 13-1, Painel B, direita). Os foliculos do baço de ratinhos tratados com BCMA-Fc também eram destituídos de GC e apresentavam apenas algumas células com coloração de PNA, isoladas (Fig. 13-2, Painel B).

Apesar da ausência de GC, não havia anomalias nas arquitecturas dos foliculos de baço de ratinhos tratados com TACI—Fc ou BCMA-Fc, tal como avaliado por coloração de secções de baço com hematoxilina e eosina, no dia 14 (Figura 13-1 -Painel C, esquerda (Controlos) e Painel C, direita (tratado com TACI-Fc); e Figura 13-1 Painel C (tratado com BCMA-Fc). Isto sugere que em ratinhos tratados com TACI-Fc ou BCMA-Fc, algumas células B foliculares se podem diferenciar em AFC, mas não conseguem prosseguir para formar GC. Assim, as interacções TALL-l/TACI e TALL-l/BCMA (bem como as interacções APRIL/TACI e APRIL/BCMA) parecem ser críticas para uma formação adequada de GC.

O bloqueio das interacções TALL-l/TACI e TALL-l/BCMA (ou interacções APRIL/TACI ou APRIL/BCMA) em ratinhos durante a imunização primária inibiu vários aspectos da resposta de células B: (a) a fase precoce da activação de células B 104 ΕΡ 1 255 558 /PT extrafolicular que leva à produção de IgM específica do antigénio; (b) a diferenciação de células B que leva à troca de classe de Ig; (c) a formação de GC do baço, onde ocorre a maturação da afinidade e onde são produzidas as células B de memória. Apesar da formação de GC ter sido bloqueada completamente por TACI-Fc ou BCMA-Fc, ocorreu alguma produção residual de IgM e IgGl e maturação de afinidade. Também se verificou noutros sistemas que as respostas de anticorpos atenuadas podem prosseguir, apesar da ausência de GC [veja-se, e.g., Matsumoto et al., Nature, 382:962 (1996); Kato et al., J. Immunol. , 160:4788 (1998); Futtere et al. , Immunity, _9:59 (1998) . É possível que outros factores além de TALL-1 ou APRIL e TACI ou BCMA medeiem a restante produção de anticorpos. Alternativamente, o tratamento com TACI-Fc ou BCMA-Fc seleccionado, in vivo, pode não ter sido suficiente para impedir todos os fenómenos de ligação de TALL-1/TACI, TALL-1/BCMA, APRIL/TACI ou APRIL/BCMA.

Estudos anteriores indicam que as interacções CD40L-CD40 [Foy et al., Ann. Rev. Immunol., 1_4:591 (1996)] e CD86-CD28/CTLA-4 [Han et al., J. Immunol., 155:556 (1995); Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol., 1_4:233 (1996)] são importantes para entrada de células B extrafoliculares em áreas GC e para o estabelecimento de GC. A inibição destas interacções através do knock-out de genes ou por tratamento com anticorpos bloqueadores ou fusões receptor-Fc diminui a produção de anticorpos e bloqueia a formação de GC [Lane et al., J. Exp. Med., 179 : 819 (1994); Durie et al., Immunol. Today, 15:406 (1994); Hathcock et al., Science, 262:905 (1993); Linsey et al., Science, 257:7992 (1992); Renshaw et al., J. Exp. Med., 180 : 1889 (1994); Xu et al., Immunity, _1:423 (1994); Kawabe et al., Immunity, jL:167 (1994); Foy et al., J. Exp. Med., 180:157 (1994)]. Existem algumas semelhanças notáveis entre os sistemas TALL-l/TACI, TALL-1/BCMA e CD40L-CD40: ambos os ligandos estão relacionados com TNF e são expressos em células T activadas e ambos os receptores são homólogos de TNFR que estimulam NF-KB e são expressos em células B. Assim, a interacção de TALL-1 ou APRIL com TACI ou BCMA pode mediar a ajuda de células T para as células B de um modo semelhante a CD40L e CD40. O TALL-1 pode também contribuir para a activação de células B por células dendríticas, que expressam o ligando TALL-1. Ao contrário dos ratinhos knock-out para CD40L e CD40 105

ΕΡ 1 255 558 /PT que exibem respostas de IgG deficientes, mas não de IgM, e ao contrário de pacientes deficientes para CD40L com sindrome de hiper-IgM [Callard et ai., Immunol. Today, 1^:559 (1993); Allen et al., Science, 259:990 (1993); Aruffo et al., Cell, j72_:291 (1993)], os ratinhos tratados com TACI-Fc ou BCMA-Fc apresentaram um défice acentuado na produção de ambas, IgM e IgG. Assim, é possível que o TALL-1 ou APRIL e TACI ou BCMA operem precocemente na activação de células B, de modo que o seu bloqueio impossibilita todas as fases da resposta humoral. Pelo contrário, o CD40L e CD40 podem operar mais tarde na activação de células B, de modo que o seu bloqueio impede apenas as fases tardias da resposta de anticorpos. EXEMPLO 6

Preparaçao de anticorpos monoclonais anti-APRIL

Imunizaram-se ratinhos Balb/c (obtidos da Charles River Laboratories) injectando 1,0 pg de Flag-APRIL (diluído em adjuvante MPL-TDM adquirido da Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 10 vezes em cada almofada da pata traseira. A imunização consistia de uma série de 6 injecções (uma injecção/semana durante 6 semanas). Os animais em seguida repousaram durante dois meses e deram-se injecções de imunização subsequentes uma vez por semana, durante 4 semanas. A proteína de fusão de APRIL marcada com Flag foi preparada como descrito no Exemplo 2 acima e purificada por cromatografia de afinidade em anti-Flag M2-agarose (Sigma).

Três dias após o reforço final removeram-se os nódulos linfáticos popliteais dos ratinhos e preparou-se uma suspensão de células individuais em meio DMEM (obtido da Biowhitakker Corp.) suplementado com penicilina-estreptomicina a 1%. As células dos nódulos linfáticos foram então fundidas com células de mieloma de murídeo P3x63AgU.l (ATCC CRL 1597) utilizando polietilenoglicol a 35% e cultivadas em placas de cultura de 96 poços. Os hibridomas resultantes da fusão foram seleccionados em meio HAT. Dez dias depois da fusão, os sobrenadantes da cultura de hibridoma foram pesquisados num ELISA para testar quanto à presença de anticorpos monoclonais que se ligam à proteína Flag-APRIL. Como um negativo para desprezar os anticorpos monoclonais que se ligam às porções Flag da molécula, os anticorpos monoclonais também foram 106 ΕΡ 1 255 558 /PT pesquisados quanto a qualquer liqaçao a Apo-3 marcado com Flag.

No ELISA, revestiram-se placas de microtitulo de 96 poços (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) adicionando 50 μΐ de Flag-APRIL ou Flag-Apo-3 a 0,25 pg/ml em tampão carbonato 50 mM, pH 9,6, a cada poço e incubando a 4°C durante a noite. As placas foram então lavadas três vezes com tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 a 0,05%). Os poços nas placas de microtitulo foram então bloqueados com 200 μΐ de albumina de soro bovino a 2,0% em PBS e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram então lavadas de novo três vezes, com tampão de lavagem.

Após os passos de lavagem, adicionaram-se 100 μΐ dos sobrenadantes de hibridoma, ou adicionaram-se várias concentrações de soros policlonais aos poços designados. Adicionaram-se 100 μΐ de meio condicionado de células de mieloma P3X63AgU.l a outros poços designados, como controlo. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora num aparelho agitador e em seguida foram lavadas três vezes com tampão de lavagem.

Em seguida, adicionaram-se 50 μΐ de anti-Fc de IgG de ratinho, de cabra, conjugado com HRP (adquirido da Cappel Laboratories), diluído 1:1000 em tampão de teste (albumina de soro bovino a 0,5%, Tween-20 a 0,05%, Timersol a 0,01% em PBS), a cada poço e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, num aparelho agitador. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem, seguido da adição de 50 μΐ de substrato (substrato de peroxidase para micropoços de TMB, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada poço e incubação à temperatura ambiente durante 10 minutos. A reacção foi parada adicionando 50 μΐ de solução de paragem de 1 componente de TMB (dietilglicol, Kirkegaard & Perry) a cada poço e a absorvância a 490 nm foi lida num leitor de placas de microtitulo.

Os sobrenadantes com teste positivo no ELISA foram então clonados duas vezes por diluição limitante. 107

ΕΡ 1 255 558 /PT

Como se pode ver na Figura 14A, verificou-se que os anticorpos 3C6.4.2, 5E8.7.4, 5E11.1.2 e 5G8.2.2 se ligam a

Flag-APRIL. EXEMPLO 7

Isotipagem de anticorpos anti-APRIL

Os isotipos dos anticorpos monoclonais anti-APRIL (veja-se Exemplo 6) foram determinados revestindo placas com anti-Ig de ratinho, de cabra específicos do isotipo (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) a 4°C durante a noite. Após os locais de ligação não específica serem bloqueados com BSA a 2%, adicionaram-se 100 μΐ de sobrenadantes de cultura de hibridomas ou 0,5 pg/ml de mAc purificados. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, as placas foram incubadas com anti-Ig de ratinho, de cabra conjugado com HRP durante 30 minutos à temperatura ambiente. O nível de HRP ligado à placa foi detectado utilizando substrato de HRP, como descrito acima.

Como se pode ver na Tabela na Figure 14B, verificou-se que os anticorpos anti-APRIL, 5E8.7.4, 5G8.2.2, e 3C6.4.2, são anticorpos do isotipo IgG2a. Verificou-se que o anticorpo anti-APRIL 5E11.1.2 é um anticorpo do isotipo igGl. EXEMPLO 8

Teste de ligação que mostra a actividade bloqueadora de mAc anti-APRIL

Revestiram-se placas de microtítulo (Nunc, Dinamarca) com 50 μΐ/poço de anticorpo de cabra anti-Fc humano (Boehringer Manheim) a 5 pg/ml em tampão carbonate durante a noite, a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 150 μΐ/poço de BSA a 2% em tampão PBS, durante 1 hora à temperatura ambiente. As imunoadesinas respectivas, BCMA-IgG ou TACI-IgG (preparadas como descrito no Exemplo 2 acima) foram adicionadas num volume de 50 μΐ/poço a 5 pg/ml em tampão de bloqueio e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Todos os anticorpos (que foram identificados na fusão descrita no Exemplo 6) foram diluídos a 1:100 e adicionaram-se 25 μΐ/poço à placa, 108 ΕΡ 1 255 558 /PT juntamente com 25 μΐ/poço de Flag-APRIL 2 pg/ml (veja-se Exemplo 2) e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. O sinal foi desenvolvido com incubações sucessivas com anticorpo anti-Flag biotinilado (Sigma Aldrich, Missouri) e peroxidase de rábano-estreptavidina (Amersham Life Science, Nova Jersey). Todos os passos excepto o primeiro foram precedidos por um passo de lavagem com PBS/Tween 20 a 0,01%.

Identificação do mAC % ligaçao máxima a BCMA DP % ligação máxima a BCMA DP 3C6.4.2 10 0 18 0 5E8.7.4 96 2 88 6 5E11.1.2 65 0 52 4 5G8.2.2 101 5 94 9 IgG Ctrl 100 0 100 0

Como se pode ver pela tabela acima, o anticorpo anti-APRIL 3C6.4.2 blogueou eficazmente a ligação de APRIL a BCMA e a TACI. No teste, o anticorpo SE11.1.2 também apresentava um bloqueio parcial de APRIL a BCMA e a TACI. EXEMPLO 9 ELISA de ligação competitiva

Para determinar se os anticorpos anti-APRIL 3C6.4.2, 5E8.7.4, 5E11.1.2 e 5G8.2.2 (descritos nos Exemplos acima) reconheceram o mesmo, ou epitopos diferentes, fez-se um ELISA competitivo como descrito em J. Immunol. Methods, 156:9-17 (1992) utilizando anticorpos anti-APRIL biotinilados. Os anticorpos monoclonais anti-APRIL foram biotinilados utilizando N-hidroxilsuccinimida como descrito em J. Immunol. Methods, 156:9-17 (1992). Os poços de microtitulo foram revestidos com 50 μΐ de Flag-APRIL 0,5pg/ml (Exemplo 2) em tampão carbonato 50 mM, pH 9,6, durante a noite, a 4°C. Após lavagem, os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 200 μΐ de BSA a 2%, durante 1 hora. Após lavagem, adicionou-se uma mistura de uma concentração óptima predeterminada de anticorpos anti-APRIL biotinilados e adicionou-se a cada poço um excesso de 100 vezes de anticorpos monoclonais não marcados. Após 1 hora de incubação à 109

ΕΡ 1 255 558 /PT temperatura ambiente, as placas foram lavadas e a quantidade de anticorpo anti-APRIL biotinilado foi detectada por adição de HRP-estreptavidina. Após lavagem dos poços de microtitulo, a enzima ligada foi detectada por adição do substrato e as placas foram lidas a 450nM com um leitor de placas ELISA.

Os resultados são apresentados na Figura 15. Os dados mostram que o anticorpo 3C6.4.2 e anticorpo 5E11.1.2 podem reconhecer epítopos partilhados, uma vez que os anticorpos 3C6.4.2 ou 5E11.1.2 não marcados foram capazes de inibir a ligação de ambas as formas biotiniladas dos anticorpos (Bio-3C6.4.2, Bio-5E11.1.2) . Ambos os anticorpos 3C6.4.2 e 5E11.1.2 reconhecem epítopos diferentes dos reconhecidos por 5E8.7.4 e 5G8.2.2, uma vez que nenhum dos anticorpos bloqueou a ligação de Bio-5E8.7.4 e Bio-5G8.2.2. Além disso, os anticorpos 5E8.7.4 e 5G8.2.2 foram capazes de bloquear apenas o seu próprio anticorpo biotinilado, mas não outros. Deste modo, entre os quatro anticorpos monoclonais testados, parecem ter sido detectados três epítopos principais em APRIL. EXEMPLO 10

Efeitos da imunoadesina de TACI no modelo de artrite de murídeo

Realizou-se um teste in vivo num modelo de murídeo de artrite induzida (CIA) para determinar se a inibição da interacção de TACI com os seus ligandos podia impedir a progressão de CIA. A artrite reumatóide (AR) é uma doença auto-imune em que a membrana sinovial de múltiplas articulações pode ficar inflamada, levando à destruição de tecidos da articulação, incluindo osso e cartilagem. A sinóvia da AR pode ser de natureza altamente inflamatória e caracteriza-se tipicamente por infiltração de linfócitos e células mononucleares, activação de células T e células que apresentam o antigénio (APC), secreção de imunoglobulinas (Ig) de células B e produção de citóquinas pró-inflamatórias [Potocnik et al., Scand. J. Immunol., 3_1:213 (1990); Wernick et al., Arthritis

Rheum., 2_8:742 (1985); Ridley et al., Br. J. Rheumatology, 152:2613 (1994); 29:84 (1990); Thomas et al., J. Immunol., 110

ΕΡ 1 255 558 /PT

Thomas et al.r J. Immunol., 156;3074 (1996)]. A sinóvia inflamada de forma crónica é normalmente acompanhada de infiltração massiva de células T CD4 [Pitzalis et al., Eur. J. Immunol., 1_8:1397 (1988); Morimoto et al., Am. J. Med. , 84:817 (1988)] . A artrite induzida por colagénio (CIA) é um modelo animal para a AR humana que se assemelha à doença humana e pode ser induzida em estirpes susceptiveis de ratinhos, por imunização com colagénio tipo II heterólogo (CII) [Courtenay et al., Nature, 283:665 (1980); Cathcart et al., Lab. Invest., 54:26 (1986)]. Quer as células T CD4, quer os anticorpos contra CII são necessários para desenvolver CIA. A transferência de anti-CII para animais não previamente imunizados leva apenas a uma histopatologia parcial que é bastante diferente da CIA e não se desenvolvem os sintomas completos de CIA [Holmdahl et al., Agents Action, 1_9:295 (1986)]. Pelo contrário, a transferência adoptiva quer de células T CD4, quer de anticorpos anti-CII a partir de ratinhos imunizados com CII, para receptores não previamente imunizados reconstitui completamente os sintomas de CIA clássica [Seki et ai., J. Immunol., 148:3093 (1992)]. O envolvimento quer de células T, quer de anticorpos na CIA também é consistente com as observações histopatológicas de articulações inflamadas na CIA. Assim, os agentes que bloqueiam as funções de células B ou células T, ou inibem citóquinas pró-inflamatórias induzidas por células T, podem ser eficazes para prevenir ou tratar a artrite. De facto, a depleção de células T CD4, bloqueio de interacções CD40-CD40L, neutralização de TNF-alfa ou bloqueio de receptores de IL-1 podem todos levar à prevenção de CIA em ratinhos [Maini et ai., Immunol. Rev., 144:195 (1995); Joosten et al., Arthritis Rheum., 3_9:797 (1996); Durie et ai., Science, 261:1328 (1993)] .

No estudo dos requerentes, imunizaram-se dois grupos de ratinhos (ratinhos DBA/1 machos de 7 a 8 semanas de idade (Jackson Laboratory)) intradermicamente com 100 pg de colagénio tipo II de bovino (BCII) (Sigma Chemical Co.) emulsionado em adjuvante de Freund completo (CFA) (Difco). Os ratinhos foram em seguida provocados de novo com BCII em adjuvante de Freund incompleto, 21 dias mais tarde. Desenvolveu-se nos animais uma doença drástica com sinais 111

ΕΡ 1 255 558 /PT clínicos de artrite que progrediu para uma forma mais grave com o tempo. Começando no dia 24, um grupo de ratinhos foi injectado com 100 yg de TACI-Fc três vezes por semana, intraperitonealmente, durante seis semanas (N=9) e um segundo grupo recebeu 100 yg de IgG de murídeo como controlo (N=10). A construção TACI-Fc foi preparada utilizando iniciadores baseados na sequência de TACI humana (aqui descrita) para amplificar o ADNc de TACI de ratinho a partir de uma biblioteca de baço de ratinho. Clonou-se um produto de PCR de cerca de 0,45 kb. Subsequentemente, isolou-se um clone de ADNc contendo o quadro de leitura aberto completo de TACI de ratinho, a partir da mesma biblioteca (número de acesso da GenBank AF257673). O TACI-Fc de murideo foi construído clonando o domínio extracelular de TACI de ratinho (aminoácidos 2-129) entre uma sequência de sinal de pró-tripsina e a sequência de Fc de IgGl de ratinho e a imunoadesina foi preparada como descrito nos Exemplos acima. Os animais foram então monitorizados quanto a sinais clínicos de artrite e no final do estudo, como descrito a seguir, foi realizado um exame radiológico e histopatológico.

Os ratinhos foram examinados diariamente quanto a sinais de inflamação das articulações e classificados como se segue: 0, normal; 1, eritema e inchaço ligeiro confinado à articulação do tornozelo; 2, eritema e inchaço ligeiro estendendo-se desde o tornozelo até às articulações metatársica/metacárpica; 3, eritema e inchaço moderado, estendendo-se desde o tornozelo até às articulações metatarsofalângica/metacarpofalângica; 4, eritema e inchaço grave, estendendo-se desde o tornozelo até aos dedos. A pontuação artrítica máxima por pé é de 4 e a pontuação máxima da doença por ratinho é de 16; a pontuação artrítica média foi calculada a partir de todos os animais no grupo.

Para análise radiológica no final do estudo, ambas as patas dianteiras e traseiras foram radiografadas utilizando um sistema de imagiologia de raios-X Faxitron (Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL) . Os dados foram digitalizados e prepararam-se imagens das radiografias. As radiografias foram então analisadas quanto a erosão do osso e inchaço de tecidos moles. Para análise histopatológica, as patas dos ratinhos foram excisadas, fixadas em formalina a 10%, descalcifiçadas e 112

ΕΡ 1 255 558 /PT embebidas em parafina. Prepararam-se secções das articulações (6-8 pm) e coraram-se com hematoxilina e eosina, utilizando métodos histoquímicos convencionais. A avaliação microscópica das patas artríticas foi realizada de um modo cego. As alterações artríticas nas articulações do tornozelo, metacarpofalângica/metatarsofalângica, interfalângica proximal foram analisadas quanto a erosão da cartilagem articular e osso subcondral. A Fig. 16A ilustra a progressão da doença em ratinhos tratados com TACI-Fc (círculos), ou ratinhos tratados com IgG controlo (caixas) e ratinhos tratados com solução salina (triângulos). Cada ponto dos dados representa uma média ± DP a partir de um total de 9 (para o grupo tratado com TACI-Fc) ou 10 (para grupos de controlo) ratinhos. As diferenças entre o grupo tratado com TACI-Fc e cada um dos outros dois grupos são estatisticamente significativas. Os ratinhos no grupo de controlo desenvolveram sintomas clínicos típicos de artrite, que começaram por volta do dia 30 e progrediram rapidamente para pontuações artríticas muito elevadas (Fig. 16A) . Pelo contrário, nos ratinhos tratados com TACI-Fc, a progressão da artrite estava acentuadamente inibida. A Fig. 16B mostra as pontuações da doença de pés individuais, 3 semanas após a segunda imunização. Cada ponto dos dados representa um pé individual. As diferenças entre os grupos de controlo e tratado com TACI-Fc são estatisticamente significativas. As pontuações artríticas nos ratinhos tratados com TACI-Fc atingiram apenas 1,0, e isso aconteceu apenas perto do fim do estudo, enquanto que no grupo de controlo as pontuações artríticas atingiram > 7,0. Estes dados demonstram claramente que a interacção de TACI com o seu ligando (s) é importante para o desenvolvimento de CIA. Para determinar se o tratamento dos ratinhos com TACI-Fc tinha qualquer efeito na histopatologia das articulações, no final do estudo fez-se o exame histopatológico das patas. No final do estudo (48 dias após a segunda imunização) , os ratinhos foram sacrificados e as suas articulações do tornozelo foram analisadas (coloração HE) para histologia.

No grupo de controlo, observou-se uma doença artrítica grave caracterizada por proliferação sinovial, infiltração massiva de leucócitos, formação de pinnus que resultou na 113

ΕΡ 1 255 558 /PT erosão de cartilagem articular e osso, como se pode ver na articulação interfalângica proximal (Fig. 17A). A Fig. 17A mostra uma articulação falângica de um ratinho de controlo, indicando sinovite grave, hiperplasia e destruição de cartilagem e osso. 0 espessamento sinovial, infiltração de leucócitos, degeneração da cartilagem articular e erosão periarticular também foram observados na articulação metacárpica (Fig. 17B) . A Fig. 17B mostra uma articulação falângica de um ratinho tratado com TACI-Fc, sem sinais de sinovite ou patologia de doença. Nos ratinhos tratados com TACI-Fc, não havia evidências de sintomas histopatológicos, indicando que o TACI-Fc não só bloqueia sintomas clínicos de CIA, mas também inibe sintomas histopatológicos (Fig. 17C,D). A Fig. 17C mostra uma articulação metacárpica de um ratinho de controlo com patologia de doença com sinais massivos de sinovite e a Fig. 17D mostra uma articulação metacárpica de um ratinho tratado com TACI-Fc, sem patologia de doença.

No final do estudo, ambas as patas dianteiras e traseiras dos animais foram também radiografadas e analisadas quanto às estruturas ósseas como descrito acima. No grupo de controlo eram evidentes sinais de destruição óssea massiva e desfiguração, enquanto que nos ratinhos tratados com TACI-Fc não se observaram sinais significativos de perda óssea ou desfiguração (Fig. 17E, F). A Fig. 17E mostra uma radiografia de um ratinho de controlo apresentando sinais de destruição óssea massiva e desfiguração. A Fig. 17F mostra uma radiografia de um ratinho de controlo tratado com TACI-Fc que não apresenta sinais significativos de perda óssea ou desfiguração. Quando se compararam as radiografias dos ratinhos tratados com TACI-Fc, com as dos ratinhos não previamente imunizados não se observaram diferenças aparentes, o que indica que o tratamento com TACI-Fc protegeu completamente os ratinhos contra o dano do osso e cartilagem (dados não apresentados).

Uma vez que se pensa que os anticorpos ant i-colagénio desempenham um papel importante no desenvolvimento da artrite, também se analisaram amostras de soro dos ratinhos para determinar se o tratamento dos ratinhos com TACI-Fc resultava na inibição de uma resposta imunitária humoral anti-colagénio. Para testar as respostas imunitárias humorais, os ratinhos 114

ΕΡ 1 255 558 /PT foram sangrados retro-orbitalmente 14 dias (Fig. 18A) e 47 dias (Fig. 18B) após a segunda imunização e analisados quanto à presença de anticorpos anti-colagénio.

Os níveis séricos de anti-BCII dos isotipos IgGl e IgG2a foram medidos num ELISA utilizando colagénio BCII como antigénio. Em resumo, revestiram-se placas de microtítulo com CII de bovino nativo 10 pg/ml, bloqueou-se e incubou-se com soros de teste diluídos em série. A IgG ligada foi detectada por incubação com anti-IgG de ratinho, de cabra conjugado com fosfatase alcalina (Pharmingen), seguido de substrato (fosfato de dinitrofenilo). Mediram-se as densidades ópticas a 450 nm num leitor de placas ELISA (Molecular Devices).

Os resultados são apresentados na Fig. 18. Cada ponto dos dados representa uma média ± DP de cinco ratinhos em cada grupo. O soro dos ratinhos no grupo de controlo revelou a presença de níveis elevados de IgGl e IgG2a anti-colagénio, enquanto que no grupo tratado com TACI-Fc, se observou uma inibição considerável de ambas IgGl e Ig2a anti-colagénio nos dias 14 e 47 após a segunda imunização. (Fig. 18A, B). A Fig. 18A mostra os níveis de IgGl e IgG2a anti-colagénio, 14 dias após a segunda imunização e a Fig. 18B mostra os níveis de IgGl e IgG2a anti-colagénio, 47 dias após a segunda imunização (barras brancas, ratinhos tratados com BSA; barras pretas, ratinhos tratados com TACI-Fc). Estes resultados sugerem que o tratamento com TACI-Fc pode atenuar o desenvolvimento de CIA, pelo menos em parte, bloqueando os anticorpos anti-colagénio.

Uma vez que ambas as células B e T específicas para o colagénio podem iniciar a CIA, fez-se um outro teste para analisar se a prevenção de CIA mediada por TACI-Fc também estava associada com a inibição de funções efectoras de células T. Os nódulos linfáticos e baços de ratinhos de controlo e tratados com TACI-Fc foram recolhidos no final do estudo e analisaram-se as respostas de memória de células T in vitro contra o colagénio e a produção de citóquinas efectoras. Os ratinhos imunizados com BCII foram sacrificados 47 dias após a segunda imunização, e recolheram-se os seus nódulos linfáticos inguinais e o baço. Prepararam-se suspensões de células individuais e as células foram cultivadas em placas de 96 poços a uma densidade de 115

ΕΡ 1 255 558 /PT

1 X ΙΟ6 células/ml (200 μΐ/poço) em DMEM contendo FCS inactivado pelo calor a 5%, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml, e 2-ME 2 x 10“5 M. As células foram cultivadas em meio, isolado ou na presença de várias concentrações de BCII. Para testar a proliferação de linfócitos (Fig. 18C), as células de nódulos linfáticos (1 x 106 células por poço) foram primeiro cultivadas durante 72 horas, seguido da adição de 1 yCi de [3H] timidina (International Chemical and Nuclear, Irvine, CA) durante as últimas 18 horas de uma cultura de 5 dias e a incorporação de radioactividade foi determinada por contagem de cintilação liquida (representada como cpm), utilizando um contador de placas-β Wallac.

As respostas de células T proliferativas contra colagénio pelos ratinhos tratados com TACI-Fc eram quase desprezáveis, em comparação com as dos ratinhos de controlo (Fig. 18C; ratinhos de controlo-caixas; ratinhos tratados com TACI-Fc-circulos) .

Para os testes de citóquinas, as células de nódulos linfáticos e baço foram cultivadas em 0,2 ml de meio com ou sem BCII; 1 x 106 células/ml (200 μΐ/poço) foram cultivadas no meio acima mencionado, isolado ou na presença de BCII. Os sobrenadantes foram recolhidos após 24 horas para testar quanto à secreção de IL-2 e 72 horas mais tarde para testar quanto à produção de IFN-gama, que se verificou ser o tempo de incubação óptimo para a determinação de citóquinas, e armazenou-se a -20°C até análise. Os níveis de IL-2 e IFN-gama foram detectados por um ELISA utilizando um kit da Pharmingen (San Diego, Califórnia). Geraram-se curvas padrão utilizando IL-2 e IFN-gama recombinante de ratinho. Quando se mediu a produção de IL-2 e IFN-gama pelas células T destes ratinhos, o grupo tratado com TACI-Fc (representado nas Fig. 18D e 18E por círculos) apresentava uma produção muito baixa destas citóquinas, enquanto que as células T do grupo de controlo (representado nas Fig. 18D e 18E por caixas) segregavam níveis significativos quer de IL-2, quer de IFN-gama (Fig. 18D (produção de IL-2), 18E (produção de IFN-gama)).

Estes dados sugerem que o tratamento de ratinhos com TACI-Fc não só inibiu a produção de anticorpos anti-colagénio, 116

ΕΡ 1 255 558 /PT mas também regulou as funções de células T efectoras. Assim, pensa-se que as interacções de TACI com o seu ligando (s) também são importantes nas respostas imunitárias mediadas por células T.

Uma vez que também se verificou que o receptor TACI é expresso em células T e está envolvido na activação de NF-AT associada com a activação de células T [von Bulow et al.,

Science, 278:138 (1997)], pensa-se que o bloqueio da interacção de TACI com o seu ligando (s) pode impedir directamente a activação de células T e as suas funções efectoras, que são necessárias, por exemplo, para a progressão de CIA em ratinhos.

Para determinar o papel directo de TACI na activação de células T, fez-se um teste in vitro da activação de células T específica do antigénio. A activação de células T pelo anticorpo anti-CD3 in vitro na presença de TACI-Fc foi analisada medindo a proliferação e produção de IL-2 por estas células T. As células de baço de ratinhos C57BL/6 adultos (Jackson Laboratory) foram cultivadas (1 X 106 por poço) em várias concentrações de anticorpo monoclonal anti-CD3 10 pg/ml (Pharmingen), com ou sem diferentes concentrações de TACI-Fc em meio, como descrito acima. A proliferação foi medida por incorporação de 3H-timidina como descrito acima. Também se montaram testes em paralelo para medir os efeitos de TACI-Fc na produção de IL-2 induzida pelo anticorpo anti-CD3 num sistema de cultura de 24 horas, como referido acima. Utilizou-se um ELISA para determinar os níveis de IL-2 nos sobrenadantes, utilizando anticorpos da Pharmingen e utilizando os seus protocolos recomendados. Para estudar os efeitos de TACI-Fc na estimulação in vitro de células transgénicas TCR, cultivaram-se 1 x 106 células de ratinhos transgénicos MBP-TCR adultos (criados a partir de um par de criação de animais obtido do Dr. Richard Flavell, Howard Hughes Medicai Institute, Universidade de Yale) na presença de MBP-Acl-11 10 pg/ml (um péptido de terminal NH2 sintético da proteína básica de mielina, com a sequência de aminoácidos ASQKRPSQRSK (SEQ ID NO:10) com o primeiro aminoácido acetilado), com ou sem diferentes concentrações de TACI-Fc em placas de 96 poços em meio DMEM suplementado com FCS a 5%, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml. 117

ΕΡ 1 255 558 /PT A proliferação foi medida por adição de 1 yCi de [3H] timidina (International Chemical and Nuclear, Irvine, CA) durante as últimas 18 horas de uma cultura de 5 dias e a incorporação de radioactividade foi medida por contagem de cintilação liquida. A Fig. 19A mostra a inibição da proliferação de células T não previamente estimuladas induzida por anticorpos anti-CD3, por TACI-Fc de um modo dependente da dose, enquanto que a Fig. 19B mostra a inibição da produção de IL-2 por células T não previamente estimuladas induzida por anticorpos anti-CD3, afectada por TACI-Fc de um modo dependente da dose. (Nas Fig. 19A e 19B, o tratamento com TACI-Fc é apresentado por círculos; os controlos são apresentados por caixas). A activação de proteína básica de mielina (MBP)-células T transgénicas TCR por antigénio in vitro na presença de TACI-Fc também foi analisada medindo a proliferação e produção de IL-2 por estas células T (como descrito acima). Mais uma vez, o TACI-Fc inibiu quer a proliferação, quer a produção de IL-2 por MBP-células T transgénicas TCR de um modo dependente da dose (dados não apresentados). Estes resultados demonstram que o receptor TACI está envolvido na activação de células T e que esta função por ser bloqueada com TACI-Fc. EXEMPLO 11

Efeitos da imunoadesina de TACI no modelo de murídeo de EAE 0 modelo de murídeo de EAE está descrito na literatura como um modelo para a esclerose múltipla humana [Grewal. et al., Science, 273:1864-1867 (1996).

Nos estudos dos requerentes imunizaram-se subcutaneamente dois grupos de 10 ratinhos cada (ratinhos transgénicos MBP-TCR macho e fêmea com 10 a 15 semanas de idade (descrito no Exemplo 10) com 10 yg de MBP Acl-11 (descrito no Exemplo 10 acima) em 100 μΐ de adjuvante de Freund completo (CFA) (Difco). Após a imunização inicial com Acl-11, injectaram-se intraperitonealmente 200 ng de toxina de tosse convulsa (List Biologicals, Campbell, CA) em 100 μΐ de solução salina em cada ratinho, às 24 horas e 48 horas. Começando no dia 2 até ao dia 24, injectou-se intraperitonealmente, diariamente, um grupo de 118

ΕΡ 1 255 558 /PT ratinhos com 100 yg de TACI-Fc (descrito no Exemplo 10) em 100 μΐ de solução salina estéril e um segundo grupo recebeu 100 yg de IgG de murideo em 100 yl de solução estéril, intraperitonealmente, cada dia. Os animais foram então monitorizados diariamente para o início da doença. Determinaram-se diariamente os sinais clínicos de encefalomielite alérgica experimental (EAE) e foi atribuída uma pontuação de 1 a 5 a cada ratinho, com base no sistema de índice de EAE estabelecido: 0= aspecto normal; 1= queda da cauda; 2= modo de andar anormal; 3= fraqueza dos membros; 4= paralisia envolvendo um membro (paralisia parcial dos membros traseiros); 5= paralisia envolvendo dois membros (paralisia total dos membros traseiros) . Este é um sistema de pontuação modificado do anteriormente descrito em Grewal et al., 273:1864-1867 (1996) .

Os resultados são apresentados na Figure 20. Os dados apresentados na Figure 20 indicam que os animais que recebem a IgG de controlo desenvolveram sintomas clínicos esperados de EAE; o início da doença nos ratinhos tratados de controlo ocorreu no dia 5 e atingiu níveis de pico no espaço de 10 dias. Pelo contrário, os ratinhos tratados com TACI-Ig não desenvolveram formas graves dos sintomas de EAE. A pontuação da doença era muito inferior à do grupo de controlo, atingindo apenas pontuações clínicas de 2 (que não progrediram para pontuações mais altas durante o estudo). Os resultados sugerem assim que o tratamento com TACI-Ig protegeu os ratinhos de desenvolverem EAE declarada.

Depósito de Material

Os materiais seguintes foram depositados na American Type Culture Collection, 10801 Universidade Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EUA (ATCC):

Material Dep. N°. ATCC Data de Depósito 3C6.4.2 PTA-1347 15 de Fev. de 2000 5E11.1.2 PTA-1346 15 de Fev. de 2000 5GB.2.2 PTA-1345 15 de Fev. de 2000 5E8.7.4 PTA-1344 15 de Fev. de 2000 119

ΕΡ 1 255 558 /PT

Estes depósitos foram feitos segundo as disposições do Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Efeitos de Procedimentos de Patentes e seus Regulamentos (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos a partir da data de depósito. Os depósitos serão disponibilizados pela ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, que assegura uma disponibilidade permanente e sem restrições da progénie da cultura do depósito ao público, após publicação da patente US pertinente, ou após disponibilização ao público de qualquer pedido de patente US ou estrangeira, aquele que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da progénie a quem determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks estar para isso qualificado, de acordo com a 35 USC § 122 e regras do Commissioner correspondentes (incluindo 37 CFR § 1.14 com referência particular a 886 OG 638). A cessionária do presente pedido de patente concordou que se uma cultura dos materiais depositados morrer, ou for perdida, ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos após notificação, por outros dos mesmos. A disponibilidade do material depositado não deve ser entendida como uma licença para a prática da invenção em contravenção dos direitos concedidos pela autoridade de qualquer governo, em acordo com as suas leis sobre patentes. A descrição escrita anterior é considerada suficiente para permitir a um perito na especialidade ponha em prática a invenção. A presente invenção não deve ser limitada no seu âmbito pelo exemplo aqui apresentado. De facto, várias modificações da invenção, adicionalmente às apresentadas e descritas aqui, serão evidentes para os peritos na especialidade a partir da descrição anterior e estão no âmbito das reivindicações anexas. 120

ΕΡ 1 255 558 /PT

Listagem de sequências <110> GENENTECH, INC.

MODULAR A

<120> UTILIZAÇÕES DE AGONISTAS E ANTAGONISTAS PARA ACTIVIDADE DE MOLÉCULAS RELACIONADAS COM TNF

<130> P1805R1 PCT <141> 2000-11-28 <150> US 60/182, 938 <151> 2000-02-16 <150> US 60/226,986 <151> 2000-08-22 <160> 14

<210 > 1 <211> 1377 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 açcatcctga gtaatgagtg gcctgggccg gagcaggcga ggtggccgga 50 gccgtgtgga ccaggaggag cgctttccac agggcctgtg gacgggggtg 100 gctatgagat cctgccccga agagcagtac tgggatcctc tgctgggtac 150 ctgcatg-ccc tgcaaaacca tttgcaacca tcagagccag cgcacctgtg 200 cagccttctg caggtcactc agctgccgca aggagcaagg caagttctat 250 gaccatctcc tgagggactg catcagctgt gcctccatct gtggacagca 300 CCCt33 Ç Câ £ tctçtgagaa caagctcagg agcccaatga 350 accttccacc agagctcsgg agacagcgga gtggagaagt tgaaaacaat 400 tcagacaact cgggaaggta ccaaggattg gagcacagag gctcagaagc 450 aagtccagct ctcccggggc tgaagctgag tgcagatcag gtggccctgg 500 tctacagcac gctggggctc tgcctgtgtg ccgtcctctg ctgcttcctg 5 50 gtggcggtgg cctgcttcct caagaagagg ggggatccct gctcctgcca 600 gccccgctca aggccccgtc aaagtccggc caagtcttcc caggatcacg 650 cgatggaagc cggcagccct gtgagcacat cccccgagcc agtggagacc 700 tgcagcttct gcctccctga gtgcagggcg cccacgcagg agagcgcagt 750 cacgcctggg acccccgacc ccacttgtgc tggaaggtgg gggtgccaca 800 ccaggaccac agtcctgcag ccttgcccac acatcccaga cagtggcctt 850 ggcattgtgt gtgtgcctgc ccaggagggg ggcccaggtg cataaatggg 900 ggtcagggag ggaaaggagg agggagagag atggagagga ggggagagag 950 121

ΕΡ 1 255 558 /PT aaagagaggt gggçagaggg gagagagata tgaggagaga gagacagagg 1000 aggcagaaag ggagagaaac agagaagaca gagaçggaga gagagacaaa 1050 gggagagaga gacagagggg sagagaggca çagaçggaea gaggcagaga 1100 aggaaagaga caggcagaga aggagagagg cagacaggga gagaggcags 1150 gagggagaga ggcagagaga cagagaggga gagagggaca gagagagata 1200 gagcaggagg tcggggcact ctgaatccca gttcccagtg cagctatagg 1250 tcgtcatcac ctaaccacac gtgcaataaa gtcctcgtgc ctgctgctca 1300 cagcccccga gagcccctcc tcctggagaa taaaaccttt ggcagctgcc 1350 cttcctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1377

<210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Vai 15 10 15

Asp Gin Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr Gly Vai Ala 20 25 30

Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly 35 40 45

Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser Gin Arg 50 55 60

Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin 65 70 75

Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala 80 85 90

Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu 95 100 105

Asn Lys Leu Arg Ser Pro Vai Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg 110 115 120

Gin Arg Ser Gly Glu Vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg 125 130 135

Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu 140 145 150

Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gin Vai Ala Leu Vai Tyr Ser 155 160 165

Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Vai Leu Cys Cys Phe Leu Vai 170 175 ' 180

Ale Vai Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys 185 190 195 122

ΕΡ 1 255 558 /PT

Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro Ala Lys Ser Ser G1 n 200 205 210 Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Vai Ser Thr Ser Pro Glu 215 220 225 Pro Vai Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro 230 235 240 Thr Gin C-lu Ser Ala Vai Thr Pro Π1 \l — — J Thr Pro Asp Pro Thr Cys 245 250 255 Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Vai Leu Gin Pro 260 265 270 Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Vai Cys Vai Pro 275 280 235 Ala Gin Glu Gly Gly Pro Gly Ala 290

<210> 3 <211> 995 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg 50 tgccgcgaag acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag 100 ttcattgttc tcaacattct agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt 150 cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc tgttctttct gtagctccct 200 tgttttcttt ttgtgatcat gttgcagatg gctgggcagt gctcccaaaa 250 tgaatatttt çacagtttgt tgcatgcttg cataccccgt caacttcgat 300 gttcttctaa tactcctcct ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt 350 gtgaccaatt cagtgaaagg aacgaatgcg attctctgga cctgtttggg 400 actgagctta ataatttct t tggcagtttt cgtgctaatg tttttgctaa 450 ggaagataag ctctgaacca ttaaaggacg agtttaaaaa cacaggatca 500 ggtctcctgg gcacggctaa cattgacctg gaaaagagca ggactggtga 550 tgaaattatt ctcccgagag gcctcgagta cacggtggaa gaatgcacct 600 gtgaaçactg caCcaagagc aaaccgaagg tcgactctga ccattgcttt 650 ccactcccag ctatggagga aggcgcaacc attcttgtca ccacgaaaac 700 gaatgactat tgcaagagcc tgccagctgc tttgaotgct acggagatag 750 agaaatcaat ttctgctagg taattaacca tttcgactcg agcagtgcea 800 ctttaaaaat cttttgtcag aatagatgat gtgtcagatc tctttaggat 850 gactgtattt ttcagttgcc gatacagctt tttgtcctct aactgtggaa 900 actctttatg tragatatat ttctctaggt tactgttggg agcttaatgg 950 tagaaacttc cttggtttca tçattaaagt ctttttcttt cctga 995 123

ΕΡ 1 255 558 /PT

<210> 4 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Leu Gin Met Ala Gly Gin Cys Ser Gin Asn Glu Tyr Phe Asp 15 10 IS

Ser Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gin Leu Arg Cys Ser Ser 20 25 30

Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gin Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Vai 35 40 45

Thr Asn Ser Vai Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu 50 55 60

Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Leu Ala Vai Phe Vai Leu Met Phe 65 70 75

Leu Leu Arg Lys Ile Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys 90 85 90

Asn Thr Gly Ser Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu 95 100 105

Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu 110 115 120

Tyr Thr Vai Glu Glu Cys Thr Cys Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys 125 130 135

Pro Lys Vai Asp Ser Asp His Cys Phe Pro Leu Pro Ala Met Glu 140 145 150

Glu Gly Ala Thr Ile Leu Vai Thr Thr Lys Thr Asn Asp Tyr Cys 155 160 165

Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser 170 175 180 lie Ser Ala Arg <210> 5 <211> 858 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atggatgact ccacagaaag gaaaagagaa gaaatgaaac aggaaagccc ctctgtccga accttgctgc tggcactgct ggagcagtca cgccttactt cttgccttaa 50 tgaaggagtg tgtttccatc ctcccacgga 100 tcctccaaag acggaaagct gctggctgca 150 gtcttgccgc ctcacggtgg tgtctttcta 200 124

ΕΡ 1 255 558 /PT ccaggtggcc gccctgcaag gggacctggc cagcctccgg gcagagctgc 250 agggccacca cgcggagaag ctgccagcag gagcaggagc ccccaaggcc 300 ggcttggagg aagctccagc tgtcaccgcg ggactgaaaa tetttgaacc 350 accagctcca ggagaaggca actccagtca gaacagcaga aataagcgtg 4 00 ccgttcaggg tccaçaagaa acagtcactc aagactgctt gcaactçatt 4 50 gcagacagtg aaacaccaac tatacaaaaa ggatcttaca catttgttcc 500 atggcttctc agctttaaaa ggggaagtgc cctagaagas aaagagaata 550 aaatattggt caaagaaact ggttactttt ttatatatgg tcaggtttta 600 tatactgata agacctacgc catgggacat ctaattcaga ggaagaaggt 650 ccatgtcttt ggggatgaat tgagtctggt gactttgttt cgatgtattc 700 aaaatatgcc tgaaacacta cccaataatt cctgctattc agctggcatt 750 gcaaaactgg aagaaggaga Cgaactccaa cttgcaatac caagagaaaa 800 tgcacaaata tcactggatg gagatgtcac attttttggt gcattgaaac 850 tgctgtga 858

<210> 6 <211> 285 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο Ο > 6

Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gin Ser Arg Leu Thr Ser Cys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Vai Ser Ile 20 25 30 Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro Ser Vai Arg Ser Ser Lys Asp Gly 35 40 45 Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys 50 55 60 Leu Thr Vai Vai Ser Phe Tyr Gin Vai Ala Ala Leu Gin Gly Asp 65 70 75 Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gin Gly His His Ala Glu Lys 80 85 90 Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala 95 100 105 Pro Ala vai Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro 110 115 120 Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gin Asn Ser Arg Asn Lys Arg Ala Vai 125 130 135 Gin Gly Pro Glu Glu Thr Vai Thr Gin Asp Cys Leu Gin Leu Ile 140 145 150 125

ΕΡ 1 255 558 /PT

Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gin Lys Gly Ser Tyr Thr Phe 155 160 165 Vai Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu 170 175 180 Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile 185 190 195 Tvr Gly Gin Vai Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His 200 205 210 Leu lie Gin Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser 215 220 225 Leu v'ã 1 Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gin Asn Met Pro Glu Thr Leu 230 235 240 Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu 24 5 250 255 Gly Asp Glu Leu Gin Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gin Ile 260 2 65 270 Ser Leu Asp Gly Asp Vai Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 275 280 285

<210> 7 <211> 1348 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 Ο Ο > 7 ggtacgaggc ttcctagagg gactggaacc taattctcct gaggctgagg 50 gagggtggag ggtctcaagg caacgctggc cccacgacgg agtgccagga 100 gcactaacag tacccttagc ttgctttcct cctccctcct ttttattttc 150 aagttccttt ctatttctcc ttgcgtaaca accttcttcc cttctgcacc 200 actgcccgta cccttaccco ccccgccacc tccttgctac cccactcttg 250 aeaccacagc tgttggcagg gtccccagct catgccagcc tcatcrcctt 300 tcttgctagc ccccaaaggg cctccaggca acatgggggg cccagtcaga 350 gagccggcac tctcagttgc cctctggttg agttgggggg cagctctggg 400 ggccgtggct tgtgccatgg ctctgctgac ccaacaaaca gagctgcaga 450 gcctcaggag agaggtoagc cggctgcagg ggacaggagg cccctcccag 500 aatggggaag ggtatccctg gcagagtctc ccggagcaga gttccgatgc 550 cctggaagcc tgggagaatg gggagagatc ccggaaaagg agagcagtgc 600 tcacccaaaa acagaagaag cagcactctg tcctgcacct agttcccatt 650 aacgccacct ccaaggatga ctccgatgtg acagaggtga tgtggcaacc 700 agctcttagg cgtgggagag gcctacaggc ccaaggatat ggtgtccgaa 750 126

ΕΡ 1 255 558 /PT tccaggatgc tggagtttat ctgetgtata gccaggtcct gtttcaagac 800 çtgactttca ccatgogtca ggtggtgtct cgagaaggcc ãaggaaggca 850 ggagactcta ttccgatgta taagaaatat gccctcccac ccggaccgga 900 cctacaacag ctgctatagc gcaggtgtct tccatttaca ccaaggggat 950 atcctgagtg tcataattcc ccgggcaagg gcgaasctta acctctctcc 1000 acatggaacc ttcctggggt ttgtgaaact gtgattgtgt tataaaaagt 1050 ggctcccagc ttggaagacc agggtgggta Cõtactggag acagccaaga noo gctçagcata taaaggagag ggaatgtgca gaaacagagg catcttcctg 1150 ggtttggctc cecgttcctc acttttccct tttcattccc accccctaga 1200 ctttgatttt acggatatct tgctcctgtt ccccatggao ctccgaattc 1250 ttgcgtgtgt gtagatgagg ggcgggggac gggcgccagg cattgttcag 1300 acctggtcgg ggcccactgg aagcatccag aacagcacca ccatctta 1348

<210> 8 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro 1 5 10 15 Gly Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Sar Val Ala 20 25 30 Leu Trp Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala 35 40 45 Met Ala Leu Leu Thr Gin Gin Thr Glu Leu Gin Ser Leu Arg Arg 50 55 60 Glu Val Ser Arg Leu Gin Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gin Asn Gly 65 70 75 Glu Gly Tyr Pro Trp Gin Ser Leu Pro Glu Gin Ser Ser Asp Ala 80 85 90 Leu Glu Ala Trp Glu Asn Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala 95 100 105 Val Leu Thr Gin Lys Gin Lys Lys Gin His Ser Val Leu His Leu 110 115 120 Vai Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu 125 130 135 Val Met Trp Gin Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gin Ala 140 145 150 Gin Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gin Asp Ala Gly val Tyr Leu Leu 155 160 165 127

ΕΡ 1 255 558 /PT

Tyr Ser Gin Val Leu Phe Gin ASp Val Thr Phe Thr Met Gly Gin 170 175 180 Val vai Ser Arg Glu Gly Gin Gly Arg Gin Glu Thr Leu Phe Arg 18S 190 195 Cys lie Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser 200 205 210 Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gin Gly Asp Ile Leu 215 220 225 Ser Val Ile Ile Pro Arg Ais Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro 230 235 240 His Gly Thr Phe Leu Gly ?he Val Lys Leu 245 250 <210> 9 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val 1 5 10 15 Asp Gin Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala 20 25 30 Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly 35 40 45 Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser Gin Arg 50 55 60 Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin 65 70 75 Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala 80 85 90 Ser Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu 95 100 105 Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg 110 115 120 Gin Arg Ser Gly Glu val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg 125 130 135 Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu 140 145 150 Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gin Val Ala Leu Val Tyr Ser 155 160 165 Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val Leu Cys Cys Phe Leu Val 170 175 180 Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys 185 190 195 128

ΕΡ 1 255 558 /PT

Gin Pro A.rg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro Ala Lys Ser Ser Gin 200 205 210 Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro val Ser Thr Ser Pro Glu 215 220 225 Pro Vai Glu Thr cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro 230 235 240 Thr Gin Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys 245 250 255 Ala Gly Arg Thr Ala Pro Pro Arg Glu Gly 260 265

<210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada. <400> 10

Ala Ser Gin Lys Arg Pro Ser Gin Arg Ser Lys 15 10

<210> 11 <211> 1377 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 tttttttttt trtttttttt gaggaagggc agctgccaaa ggttttattc 50 tccaggagga ggggctctcg ggggctgtga gcagcaggca cgaggacttt 100 attgcacgtg tggttaggtg atgacgacct acagctgcac tgggaactgg 150 gactcagagt gccccgacct cctgctctat ctctctctgt ccctctctcc 200 ccctctgtct ctctgcctct ctccctctct gcctctctcc ctctctgcct 250 ctctccttct ccgcctotct ctttccttct ctgcctcttt ccctctctgc 300 ctctcttccc ctctgtetct cEctccctct gtctctctct ccctctctgt 350 ctcctctgtt tctctccctt tctgcctcct ctgtctcrct ctcctcatat 400 ccccctcccc tctccccacc tctctttctc tctcccctcc tctccatctc 450 tctccccccc cctttccctc cctgaccccc atttacgcac ctgggccccc 500 ctcctgggca ggcacacaca caatgccaag gccactgtct gggatgtgtg 550 ggcaaggctg caggactgtg gtcctggtgt ggcaccccca ccttccagca 600 caagtggggt cgggggtccc aggcgtgact gcgctctcct gcgtgggcgc 650 cctçcactca gggaagcaga agctgcaggt ctccaccggc tcgggggatg 700 tgctcacaçg gctgccggct tccatcgcgt gatcctggga agacttggee 750 129

ΕΡ 1 255 558 /PT ggactttgac ggggccttga gcggggctgg caggagcagg gatcccccct 800 cttcntgaga aagcaggccs ccgccaccag gaagcagcag aggacggcac 850 acaggcagaç ccccagcgtg ctgtagacca gggccacctg atctgcactc 900 agctccagcc ccgggagagc tgçacttgct tctgagcctc tgtgctccaa 950 tccttggtac cttcccgagt tgtctgaatt gttttcaact tctccactcc 1000 gcrgtctcct gaçccctggt ggaaggttca ctgggctccc gagcttgttc 1050 tcacagaagt atgcacattç cttagggtgc tgtccacaga tggaggcaca 1100 gctgatgcag tccctcagga çatggtcata gaacttgcct tgctccttgc 1150 ggcagctgag tgacctgcao aaçgctacac aggtgcgctg gctctgatgg 1200 ttgcaaatgg “cttgcagga catgcagg^a cccagcagag gatcccagta 1250 ctgctcttcg gggcaçgatc tcatagccac ccccgtccac aggccctgtg 1300 gaaagcgctc ctcctggtcc acacggctcc ggccacctcg cctgctccgg 1350 cccaggccac tcattactca ggatgct 1377

<210> 12 <211> 995 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 12 tcaggaaaaa aaaagacttt aatcatgaaa ccaaggaagt ttctaccatt 50 aagctcccaa cagtaaccta gagaaatata tctaacataa agactttcca 100 cagttagagg acaaaaagct gtatcggcaa ctgaaaaata cagtcatcct 150 aaagagatct gacacatcat ctattctgac aaaagatttt taaagtggca 200 ctgctcgagt cgaaatggtt aattacctag cagaaattga tttctctatc 250 tccgcagcac tcaaagcagc tggcaggctc ttçcaatagt cattcgtttt 300 catggtgaca agaatggttg cgccttcctc catagctggg agtggaaagc 350 aatggtcaga gtcgaccttc ggtttgctct tgatgcagtc ttcacaggtg 400 cattcttcca ccgtgtactc gaggcctctc ggaagaataa tttcatcacc 450 agtcctgctc ttttccaggt caatgttagc cacgcccagg agacctgatc 500 ctgtgttttt aaactcgtcc tttaatggtt cagagcttat cttccttagc 550 aaaaacatta gcacgaaaac tgccaaagaa attattaagc tcagtcccaa 600 acaggtccag agaatcgcat tcgttccttt cactgaattg gtcacacttg 650 cattacaata acgctgacat gttagaggag gagtattaga agaacatcga 700 agttgacaag gtatgcaagc atgcaacaaa ctgtcaaaat attcattttg 750 130

ΕΡ 1 255 558 /PT aaacaaggga 800 acaagaattc 850 atgaacttcg 900 cggcacgtaa 950 gtctc 995 cacaaaaaga taatatctct gttgagaaca cgtgtcttcç ctaagtttga ggagcactgc ccagccatct gcaacatgat gctacagaaa gaacagcctg gaaggacaag cagaçcaaat gcagcaagag cagctagaat ccLgcttcgt gggttcttac gggggctgtc ggatttgaat accacatcta attcaagttt

<210 13 <211> 858 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 tcacagcagt ttcaatgcac caaaaaatgt gacatctcca tccagtgata 50 ttngtgcatt ttctcttggt attgcaagtt ggagttcatc tccttcttcc 100 agttttgcaa tgccagctga atagcaggaa ttattgggta gtgtttcagg 150 cacattútga atacatcgaa acaaagtcac cagactcaat tcatccccaa 200 agacatggac cttcttcctc tgaattagat gtcccatggc gtaggtctta 250 tcagtatata aaacctgacc atatataaaa aagtaaccag tttctttgac 300 caatatttta ttctcttctt cttctagggc acttceectt ttaaagctga 350 gaagccatgg aacaaatgtg taagatcctt tttgtatagt tggtgtttca 4 00 ctgtctgcaa tcagttgcaa gcagtcttga gtgactgttt cttctggacc 4 50 ctgaacggca cgcttatttc tgctgttctg actggagttg ccttctcctg 500 gagctggtgg ttcaaagat t ttcagtcccg cggtgacagc tggagcttcc 550 tccaagccgg ccttgggggc tcctgctcct gctggcagct tctccgcgtg 600 gtggccctgc agctctgccc ggaggctggc caggtcccct cgcagggcgg 650 ccacctggta gaaagacacc accgtgagac agcaagacag cagtgccagc 700 agcaaggttg cagccagcag ctttccgtct ttggaagatc ggacagaggg 750 gctttccttc cgtgggagga tggaaacaca ctccttcagt ttcatttctt 800 ctcttttctt aaggcaagaa tcatccat 858 otaaagcgtg actgctccct ttctgtggag 850

<210 > 14 <211> 1348 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 taagatggtg gtgctgttct ggatgcttcc agtgggcccc gaccaggtct 50 gaacaatgcc tggcgcccgt cccccgcccc tcatctacac acacgcaaga 100 attcgaagct ccatagggaa cagaagcaag atatccgtaa aatcaaagcc 150 131

ΕΡ 1 255 558 /PT taggggotgg gaatgaaaag ggaaaagcga ggaacgggga gccaaaccca 200 ggaagatgcc tctgttcctg cacattccct ctcctttata tactcagctc 250 ttggctgtct ccagtatgta cccaccctgg tcttccaagc tgggagccac 300 tttttataac acaatcacag tttcacaaac cccaggaagg ttccatgtgg 350 agagaggtta agtttcgccc ttgcccgggg aattatgaca ctcagaatat 400 ccccttogtg taaatggaag acacctgcgc tatagcagct gttgtaggcc 450 cggtccgggt gggagggcat acttcttata catcggaata gagtctcctg 500 ccttccttgg ccttctcgag acaccacctg acccatggtg aaagtcacgt 550 cttgaaacag gacctggcta tacagcagat aaactccagc atcctggatt 600 cggacaccat atccttgggc ctgtaggcct ctcccacçcc taagagctgg 650 ttgccacatc acctctgtca catcggagtc atccttggag gtggcgttaa 700 tgggaaccag gtgcaggaca gagtgctgct tcttctgttt ttgggtgagc 750 actgctctcc tfcttccggga tctctcccca ttctcccagg cttccagggc 800 atcggaactc tgctccggga gactctgcca gggataccct tccccattct 850 gggaggggcc tcctgtcccc tgcagccggc tcacctctct cctgaggctc 900 tgcagctctg tttgttgggt cagcagagcc atgacacaag ccacggcccc 950 cagagctgcc ccccaactca accagagggc aactgagagC gccggctctc 1000 tgactgggcc ccccatgttg cctggaggcc ctttgggggc tagcaagaaa. 1050 qqagatqaqq ctggcatgag ctggggaccc tgccaacagc tgtggtttca 1100 agagtggggt agcaaggagg tggcggggcg ggtaagggta cgggcagtgg 1150 tgcagaaggg aagaaggttg ttacgcaagg agaaataaaa aggaacttga 1200 aaataaaaag gagggaggag gaaagcaagc taagggtacc gttagtgctc 1250 ctggcactcc gtcgtggggc cagcgttgcc ttgagaccct ccaccctccc 1300 tcagcctcag gagaattagg ttccagtccc tctaggaagc ctcgtacc 1348

Lisboa

Claims (4)

1. ΕΡ 1 255 558 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal que é o anticorpo monoclonal 3C6.4.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1347; ou anticorpo monoclonal 5E8.7.4 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1344; ou anticorpo monoclonal 5E11.1.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1346 ou anticorpo monoclonal 5G8.2.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1345.
2. 2. Linha celular de hibridoma que produz o anticorpo monoclonal 3C6.4.2 e depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1347; ou o anticorpo monoclonal 5E11.1.2 e depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1346; ou o anticorpo monoclonal 5G8.2.2 e depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1345; ou anticorpo monoclonal 5E8.7.4 e depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1344.
3. 3. Anticorpo anti-APRIL quimérico que se liga especificamente ao polipéptido APRIL e compreende: (a) uma sequência derivada do anticorpo 3C6.4.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1347; ou (b) uma sequência derivada do anticorpo 5E11.1.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1346; ou (c) uma sequência derivada do anticorpo SG8.2.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1345; ou (d) uma sequência derivada do anticorpo 5E8.7.4 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1344.
4. 4. Anticorpo anti-APRIL humanizado que se liga especificamente ao polipéptido APRIL e compreende: (a) uma sequência derivada do anticorpo 3C6.4.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1347; ou ΕΡ 1 255 558 /PT 2/2 (b) uma sequência derivada do anticorpo 5E11.1.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-13 46; ou (c) uma sequência derivada do anticorpo 5G8.2.2 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1345; ou (d) uma sequência derivada do anticorpo 5B8.7.4 segregado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-1344. Lisboa,