PT1506295E - Muteínas do factor de crescimento placentário do tipo 1, processo de preparação e sua aplicação - Google Patents

Description

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Descrição "Muteínas do factor de crescimento placentário do tipo 1, processo de preparação e sua aplicação"

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a muteinas estáveis do factor de crescimento placentário do tipo 1 (PLGF-1), à sua preparação e à sua utilização terapêutica e cosmética e a composições farmacêuticas e cosméticas contendo os ditos derivados. A invenção diz igualmente respeito à produção de anticorpos dos ditos derivados e à sua utilização no diagnóstico e tratamento de patologias tumorais e não tumorais.

Estado da Técnica 0 factor de crescimento placentário do tipo 1 (PLGF-1 do inglês "Placental Growth Factor") é uma glicoproteína angiogénica homodimérica. A actividade angiogénica diz respeito à forma dimérica, uma vez que a forma monomérica é inactiva. A sequência polinucleótidica completa que codifica para a proteína PLGF-1, conjuntamente com a sua sequência polipéptidica foi descrita por Maglione e Pérsico na Pat. EP-B-0550519 (WO-A-92/06194). A patente acima descreve um processo para produzir PLGF-1 em bactérias modificadas utilizando um sistema de expressão indutível, envolvendo o dito processo, após indução a lise bacteriana e extracção directa da proteína em bruto da solução do lisado. A proteína obtida deste modo apresenta níveis de actividade biológica baixos.

Um processo de extracção e purificação do factor placentário em bruto, obtido por expressão em bactérias é 2 descrito por Maglione et al. no pedido de patente de invenção WO2003/066676. 0 processo envolve uma série de passagens de extracção, renaturação e purificação que no seu todo tornam possível obter a proteína pura numa forma essencialmente dimérica, isto é na sua forma mais activa. É de facto conhecido que a forma monomérica da proteína é biologicamente inactiva, e adquire apenas funções angiogénicas após restauração da forma dimérica.

Contudo, os presentes inventores observaram que a proteína na forma dimérica é parcialmente instável e dá origem em solução aquosa durante armazenamento, ou processamento a formas multiméricas que mostram menor actividade biológica e por esta razão são menos adequadas a utilização terapêutica, devido à incerteza das doses e actividade biológica. 0 objectivo da presente invenção é por isso resolver o problema da baixa estabilidade química/biológica de PLGF-1 que se observa principalmente, quando esta última é conservada em soluções aquosas.

Sumário da Invenção A invenção está baseada na constatação inesperada de que derivados da proteína natural PLGF-1 com modificações na sua sequência polipéptídica, envolvem especificamente a substituição, ou eliminação de pelo menos um resíduo de cisteína, apresentam uma estabilidade química significativamente acrescida, mantendo ao mesmo tempo a sua actividade biológica original essencialmente inalterada. À luz desta verificação, um primeiro objecto deste documento é representado por uma muteína na forma monomérica do factor de crescimento placentário do tipo 1 (PLGF-1) humano ou animal compreendendo a substituição ou eliminação na sequência do polipéptido da proteína do tipo selvagem de 3 pelo menos um dos nove resíduos de cisteína (Cys) aí contido. A dita substituição ou eliminação não afecta o processo de dimerização essencial para obter a proteína na sua forma biologicamente activa, mas evita a multimerização da sua forma monomérica.

Entre os vários resíduos de cisteína verificou-se que a eliminação, ou substituição de um resíduo presente na porção do terminal-C, e especificamente na posição 142 da sequência polipéptídica completa, isto é, compreendendo a proteína madura PLGF-1 e o péptido de sinalização correspondente é especialmente eficaz. Na concretização preferida da invenção, o resíduo Cys 142 é substituído por um resíduo de glicina (Gly). Esta substituição produz uma muteína da forma monomérica de PLGF-1 que possui capacidade de dimerização inalterada, mas é basicamente incapaz de gerar produtos de multimerização. Assim como as modificações descritas acima, as muteínas de acordo com a invenção podem conter outras eliminações, substituições ou adições de um ou vários aminoácidos da proteína do tipo selvagem, desde que as ditas modificações não alterem as características funcionais da própria muteína.

Um segundo objecto da invenção é por isso representado por uma muteína do factor PLGF-1 na forma dimérica, preferencialmente purificada de tal forma de modo a compreender essencialmente apenas o dímero. A dita muteína pode igualmente ser a proteína madura ou a pré-proteína, compreendendo um péptido de sinalização na porção N-terminal.

Um outro objecto da invenção é a sequência nucleótidica compreendendo o ADN que codifica para a muteína apropriada. A sequência é caracterizada por um codão TGC ou TGT que codifica para uma cisteína de aminoácido na sequência PLGF-1 natural ser eliminado, ou modificado. Numa concretização preferida da invenção o 4 codão correspondente à cisteína é substituído por um codão GGC, GGT ou GGA ou GGG, codificando todos para o aminoácido glicina (Gly). É preferencialmente a base de timidina (T) na posição 382 (codão TGC) da sequência SEQ ID N°:l que é substituída pela guanidina base (G) para gerar o codão GGC.

Um outro objecto da invenção é um sistema de expressão compreendendo a sequência nucleótidica observada acima, ladeada por sequências não traduzidas controlando e regulando a expressão. 0 sistema pode ser induzido em células procarióticas, preferencialmente células bacterianas. A expressão encontra-se sob o controlo de um promotor indutível e pode ser induzida, através de compostos adequados. Células hospedeiras modificadas utilizando o sistema de expressão observado acima são também objecto da presente invenção. Estas são células procarióticas, preferencialmente células bacterianas tais como E. coli. A invenção também cobre processos de produção da sequência nucleótidica, em que o ADN que codifica para a muteína é produzido pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como iniciador oligonucleótidos que foram modificados de forma adequada em relação à sequência proteica do tipo selvagem. Preferencialmente o oligonucleótido da SEQ ID N° 3 é utilizado como iniciador directo 5'-3' e a sequência e o oligonucleótido da sequência SEQ ID N°4 é utilizado como iniciador inverso 5'-3' .

Um outro objecto da invenção é um processo de produção e extracção da muteína em que células hospedeiras, preferencialmente bacterianas, modificadas utilizando o sistema de expressão de acordo com a invenção são cultivadas num meio de cultura adequado, a expressão da proteína é induzida por um indutor adequado, as células são isoladas e lisadas e a muteína é extraída a partir da 5 mistura de lise. Durante o passo de fermentação e antes da indução do passo de expressão, as células são cultivadas até ser atingido uma elevada densidade óptica (DO) do meio de cultura. A expressão da proteina é posteriormente induzida pela adição de agentes de indução adequados. Durante os passos subsequentes as células são lisadas para libertar os materiais endocelulares no meio de cultura, especificamente material nucleico e corpos de inclusão, estes últimos são solubilizados e a proteina obtida desta forma é renaturada na forma dimérica. 0 processo de extracção e de purificação pode compreender passos opcionais adicionais para purificação da proteína dimérica. Numa concretização preferida o processo compreende pelo menos um passo de purificação adicional na cromatografia de permuta iónica ou de fase reversa. Numa outra concretização o processo compreende uma cromatografia inicial de permuta aniónica seguida por cromatografia de fase reversa. A muteína obtida utilizando a produção, extracção e processo de purificação de acordo com a invenção contém menos do que 98,5% de proteína activa e não mais do que 1,5% da forma monomérica. A forma activa consiste essencialmente na forma dimérica e contém apenas traços da forma multimérica. Testes de estabilidade salientam a elevada estabilidade durante a armazenagem e durante o processamento típico da muteína na forma dimérica.

Descrição das figuras

Figura 1: A figura apresenta o perfil electroforético por SDS-PAGE de PLGF-1CG após resuspensão em soro fisiológico a 20 mg/ml e armazenagem a 4-8°C durante 40 dias. O perfil é comparado com o perfil da muteína imediatamente após solubilização. (M) indica as referências de peso molecular; (1) indica a PIGF-1CG (3 microgramas) solubilizada na 6 solução fisiológica a uma concentração de 20 mg/ml e congelada (controlo); (2) indica PIGF-ICG (3 microgramas) solubilizada na solução fisiológica a uma concentração de 20 mg/ml e armazenada a 4-8°C durante 40 dias.

Figura 2: A figura apresenta os dados da tabela 2 expressos na forma de gráfico.

Figura 3: A figura apresenta o perfil electroforético de SDS-PAGE da muteina PLGF-1CG solubilizado em gel de Carbopol a 0,2 mg/ml e armazenada a 4-8°C durante 170 dias. (M) indica as referências de peso molecular; (1) indica PIGF-ICG (2 microgramas) solubilizadas em gel de carbopol a uma concentração de 0,2 mg/ml e armazenada a 4-8°C durante 170 dias; (2) indica PIGF-ICG (2 microgramas) solubilizadas em gel de carbopol a uma concentração de 0,2 mg/ml e arrefecida (controlo).

Figura 4: A figura apresenta o perfil electroforético de SDS-PAGE da forma nativa de PLGF-10CG solubilizada em gel de Carbopol a 0,2 mg/ml e armazenada a 4-8°C durante 150 dias. (M) indica as referências de peso molecular (1) indica PLGF-1 (2 microgramas) solubilizada em gel de carbopol a uma concentração de 0,2 mg/ml e armazenada a 4-8°C durante 150 dias; (2) indica PIGF-ICG (2 microgramas) solubilizadas em gel de carbopol a uma concentração de 0,2 mg/ml e arrefecida (controlo).

Figura 5: A figura é uma ilustração esquemática do processo para construção do plasmideo pET3PLGFlCG que codifica para a muteina PLGF-1 denominada PLGF-1CG.

Figura 6: A figura apresenta a actividade angiogénica de PLGF-1 do tipo selvagem e da muteina PLGF-1CG a concentrações acrescidas de substância. A actividade do factor de crescimento do fibroblasto básico bFGF é indicada como referência.

Figura 7: A figura apresenta o efeito da muteina PLGF-1CG nos danos isquémicos induzidos pela isoprenalina no tecido 7 cardíaco no coelho. 0 eixo x indica os dias de tratamento e o valor de AUC que representa a área total incluída na curva identificada pelas pontuações diárias ECG.

Lista de sequências: SEQ ID N°:l sequência nucleótidica para PLGF-1 do tipo selvagem sem péptido de sinalização. SEQ ID N°:2 sequência nucleótidica para PLGF-1 natural SEQ ID N°:3 sequência para o oligonucleótido utilizado como iniciador de sentido na PCR. SEQ ID N°:4 sequência para o oligonucleótido utilizado como iniciador anti-sentido no PCR.

Descrição Detalhada da Invenção A sequência completa de polipéptido do factor humano de PLGF-1 de 149 aminoácidos, conjuntamente com um fragmento de ADNc de 1645 nucleótidos compreendendo a sequência que codifica para o factor PLGF-1 são indicados na patente EP-B-0550519. Um plasmídeo facilmente acessível contendo a sequência nucleótida de 1645 bases foi também registado na ATCC sob o número de registo ATCC 40892. A sequência que codifica a pré-proteína encontra-se compreendida entre as posições 322 e 768 e é indicada neste documento como SEQ ID N°:l. A PLGF-1 na forma de pré-proteína do tipo selvagem é um polipéptido com 149 aminoácidos compreendendo um péptido de sinalização de 18 aminoácidos na posição N-terminal. A sequência para a proteína madura, delimitada pelas posições 19 e 149 é indicada nesta aplicação como SEQ ID N°:2. A dita sequência compreende 9 resíduos de cisteína (Cys) localizados nas posições 35, 60, 66, 69, 70, 77, 111, 113 e 125.

Nas muteínas de acordo com a invenção, pelo menos um dos ditos residuos de cisteína é eliminado ou substituído por outro resíduo, sendo a única condição que a muteina não afecte significativamente ou elimine a actividade da muteina na sua forma monomérica para gerar a forma dimérica biologicamente activa e terapeuticamente útil. Dados experimentais mostraram que o residuo eliminado ou substituído tem de preferência encontrar-se localizado na porção do terminal C da proteína e que o residuo óptimo para os fins da invenção é o da posição 125.

Muteinas do factor de crescimento placentário do tipo selvagem podem ser produzidos por sintese utilizando técnicas de sintese de polímeros conhecidas da literatura. Contudo, o processo preferido é a expressão da proteina em células hospedeiras geneticamente modificadas. Para este fim, as células são transformadas introduzindo um vector de clonagem e/ou um vector de expressão compreendendo uma inserção que corresponde ao gene PLGF-1 após modificação adequada. A preparação do ADN que codifica para as muteinas de acordo com a invenção é efectuada, através de mutagenese específica do local e implica mutação em ponto em codões correspondentes à cisteína, isto é TGC ou TGT. Estas mutações podem ser supressões ou substituições de uma ou várias bases, sem provocar um deslocamento na grelha de leitura a jusante da mutação. No caso de supressão um codão completo tem de ser por isso removido. Preferencialmente, uma mutação específica do local é uma substituição pontual de uma base num codão de cisteína, com a formação consequente de um novo codão. Neste sentido, a mutação vai resultar na substituição de um resíduo de cisteína por outro resíduo de aminoácido. 9 Várias técnicas conhecidas de mutagénese especifica do local podem ser utilizadas para preparar o adnc que codifica para a referida muteina.

Processos que podem ser utilizados são, por exemplo, mutagénese obtida com oligonucleótidos (Adelman et al. "DNA" 2:183, 1983), mutagénese PCR ((Leung et al. Technique 1:11-15, 1989) ou mutagénese de cassette (Wells et al. Gene 34: 315, 1985) .

Na concretização preferida da invenção, é efectuada a síntese do ADN mutante utilizando uma técnica de mutação, através da reacção em cadeia da polimerase (PCR). 0 ADNc que codifica para o factor PLGF-1 do tipo selvagem descrito na literatura ou quaisquer seus equivalentes provocados pela degeneração do código genético foi utilizado como molde para a PCR. Preferencialmente, pode ser utilizada apenas a porção que codifica para a proteína metionilada na posição N-terminal com ou sem péptido de sinalização; por exemplo a sequência reportada no presente documento como SEQ ID N°:l, ou seu equivalente compreendido no vector de expressão pET3PIGF-l correspondente à proteína sem o péptido de sinalização. O oligonucleótido 5'-3' (sentido) complementar à região que codifica para a porção N-terminal da proteína, e o oligonucleótido 5'-3'(anti-sentido) complementar à região da sequência compreendendo o codão de cisteína a ser mutado foram utilizados como iniciadores de PCR. 0 último oligonucleótido vai conter a substituição da base, ou substituições necessárias para introduzir a mutação necessária. Os iniciadores utilizados podem conter igualmente bases adicionais nas regiões 5' e 3' terminais para introduzir locais de restrição adequados para isolar e purificar a sequência mutada. 0 codão correspondente ao resíduo de cisteína pode ser substituído por um codão que codifica para qualquer aminoácido neutro, polar como Ser, Thr, Gin, ou Asn, ou não 10 polar, tal como Gly, Ala, Vai, Ile ou Leu. Aminoácidos preferidos são Gly e Ala.

Na concretização preferida o iniciador directo encontra-se representado pela sequência identificada como SEQ ID N°:3, enquanto que o iniciador inverso encontra-se representado pela sequência SEQ ID N°:4. A última compreende uma substituição T—»G na posição 382 da SEQ ID N:l, uma substituição que transforma o codão TGC da cisteina na posição 125 da SEQ ID N°:4 num codão GGC correspondente a uma glicina.

Um ADNc modificado de forma adequada é posteriormente cortado e inserido num vector de expressão sob o controlo de um sistema indutivel adequado compatível com a célula hospedeira.

Preferencialmente, são utilizados sistemas de vectores indutíveis compatíveis com células procarióticas. Exemplos destes sistemas são sistema de expressão pBAD (In vitrogen BV) em que a síntese de proteína é colocada sob o controlo do promotor araBAD e pode ser induzido em várias estirpes de E. coli utilizando arabinose;

Sistema de expressão T7 (In vitrogen BV ou Promega) em que a síntese proteica é controlada pelo promotor da ARN polimerase para o fago T7 e pode ser induzida utilizando lactose, isopropil-P-D-tiogalactopiranosido (IPTG) ou seus derivados ou seus análogos funcionalmente equivalentes. Neste caso é necessário utilizar derivados do tipo DE3 (B121(DE3) ou JM109 (DE3)) de E. coli, isto é aqueles que contêm uma cópia do gene para a ARN polimerase do fago T7 localizado sob o controlo de um promotor indutivel pela lactose.

Sistema de expressão Trc (In Vitrogen BV) em que a síntese de proteína é colocada sob o controlo do promotor híbrido trc. Este promotor foi obtido por fusão do promotor trp com promotores lac e pode ser induzido em várias estirpes de E. 11 coli, através de lactose ou seus equivalentes semelhantes (iptg):

Sistema de expressão Tac (Amersham biosciences) em que a síntese proteica é localizada sob o controlo do promotor tac. Neste sistema, a síntese proteica é induzida em estirpes de E. coli laclq (tipo JM105), através de lactose ou seus equivalentes semelhantes (IPTG);

Sistema de expressão PL em que a síntese proteica é colocada sob o controlo do promotor PL e pode ser induzido pela adição de triptofano. Neste caso a utilização de derivados de E. coli (GI724) contendo uma cópia do gene que codifica para o repressor cl do fago lambda é necessária, sob o controlo de um promotor indutível pelo triptofano. É obviamente possível expressar o ADNc modificado que codifica para a muteína em células hospedeiras eucarióticas derivadas da levedura ou a partir de organismos multicelulares. Neste caso, um sistema de expressão compatível com as ditas células será seleccionado.

Na concretização preferida da invenção a expressão é efectuada sob o controlo do sistema da ARN polimerase do fago T7 e induzido com isopropil-p-D-tiogalactopiranósido. 0 vector de expressão também compreende sequências adicionais que codificam para as funções normais necessárias para clonagem, selecção e expressão, tais como marcadores selectivos e/ou um local de poliadenilação e/ou uma sequência de regulação de transcrição. Células hospedeiras são por isso transformadas utilizando técnicas padrão bem conhecidas do perito no estado da técnica com o vector de expressão contendo o ADNc que codifica para a muteína necessária. Estas células podem ser procarióticas, eucarióticas, animais, humanas ou de células de plantas, em particular de células bacterianas, tais como de E. coli ou Bacillus, células de leveduras, 12 tais como Saccharomyces, ou células animais, tais como Vero, HeLa, CHO, COS. 0 microrganismo preferido é obtido por integração na estirpe comercialmente disponível [B12(DE3)pLysS] (Promega Corporation USA) do gene de uma muteína PLGF-1 humana.

As células modificadas utilizadas para produzir muteínas de acordo com a invenção são armazenadas antes de serem utilizadas na forma liofilizada para preservar a sua capacidade de expressão. Na altura da utilização, o material liofilizado é novamente solubilizado utilizando um tampão adequado.

As células hospedeiras modificadas são então cultivadas em meio de cultura líquido. Apesar de uma larga gama de meios de cultura conhecidos encontrarem-se comercialmente disponíveis e poderem ser utilizados eficazmente o passo de fermentação de acordo com a invenção é preferencialmente efectuado num meio de cultura livre de qualquer material de origem animal ou humana, de modo a evitar, qualquer risco de infecção. Extractos de levedura (Difco) adicionados com um ou vários antibióticos adequados representam o meio mais adequado para o processo. 0 passo de fermentação pode ser precedido por um passo de pré-inoculação em que o microrganismo liofilizado é suspenso no meio de cultura e sujeito a incubação consecutiva e passos de diluição destinados a obter uma quantidade óptima de células de microrganismos na cultura. A fermentação é efectuada no meio de cultura mencionado acima, a uma temperatura adequada para o microrganismo, normalmente de aproximadamente 37°C, na presença de uma percentagem de 02 dissolvido, em relação a uma saturação com ar entre 20% e 40%, preferencialmente 30%. O pH durante a cultura é mantido a valores óptimos para o microrganismo a ser utilizado que normalmente será neutro, ou ligeiramente ácido ou alcalino (6,4 a 7,4). Além 13 disso, dado que o processo de fermentação ocorre com agitação, a utilização de agentes de anti-tensioactivos é vantajosa. À medida que a fermentação progride é acompanhada por um aumento na densidade óptica do meio de cultura. Por isso, a densidade óptica a 600 nm é o parâmetro utilizado de acordo com a invenção para monitorizar o progresso do processo. A densidade celular e por isso a densidade óptica atingida na cultura ao mesmo tempo que a expressão é induzida tem de ser suficientemente elevada para garantir o elevado rendimento da proteína expressa. Apesar das densidades ópticas a 600 nm (DO600 ) mais elevada do que 0,2 já poderem ser utilizadas, densidades ópticas até 50 podem ser obtidas graças aos meios de cultura utilizados. Densidades que excedem 18 são preferíveis para obter níveis de produção de muteína elevados. Densidades entre 16 e 20 deram óptimos resultados. A fermentação é então mantida nas condições referidas acima até estes valores de densidade óptica serem atingidos, depois a expressão da proteína é induzida.

Pode ser utilizado qualquer agente ou condição química-física capaz de induzir mecanismos de expressão da muteína heteróloga nas células dos microrganismos a serem utilizados. No caso específico da estirpe bacteriana BL21(DE3) pLysS modificado com um plasmídeo de expressão contendo o promotor T7 do fago, a expressão é induzida com lactose, ou seus derivados, tal como isopropil-β-tiogalactopiranósido (IPTG) numa concentração adequada, que é de aproximadamente 1 mM. A duração da indução pode variar de acordo com as necessidades. Foram obtidos bons resultados em períodos de várias horas, preferencialmente de 3 a 4 horas; no processo óptimo a indução é mantida durante 3 horas e 20 minutos utilizando uma percentagem de O2 dissolvido equivalente a aproximadamente 10%. 14

Amostras de células são retiradas antes de e após indução e sujeitas ao controlo de técnicas analíticas tais como electroforese por SDS-PAGE para determinar os resultados da indução.

Quando a expressão da proteína atingiu os níveis necessários, as células foram separadas do meio de cultura, por exemplo por centrifugação, e sujeitas a um processo de extracção. 0 processo de extracção prevê um passo inicial de lise celular. Com efeito, quando a muteína é expressa em bactérias permanece segregada no interior da célula hospedeira na forma de corpos de inclusão. Os processos de lise podem ser efectuados utilizando congelamento/descongelamento, prensa francesa, ultra-sons (sonicação), ou técnicas semelhantes conhecidas, em soluções de lise contendo concentrações adequadas de agentes tensioactivos, preferencialmente Triton X100 em concentrações de 0,5% a 1%. A técnica preferida, quando se utiliza a estirpe bacteriana BL21(DE3)pLysS é a técnica de congelamento/descongelamento que numa concretização preferida é repetida durante pelo menos dois ciclos consecutivos.

Atendendo que a muteína PLGF é libertada em meio de lise expresso pela célula hospedeira, isto é na forma monomérica biologicamente inactiva, a lise é seguida de um passo de renaturação, pelo menos em parte, consistindo em dimerização do monómero. Renaturação da muteína é obtida adicionando concentrações adequadas de pares de oxidação-redução à solução diluída, seguida de um período de incubação de 10 a 30 horas, preferencialmente de 18 a 20 horas a uma temperatura entre 10°C e 30°C, preferencialmente 20°C com agitação. Exemplos destes pares são: cistina/cisteína, cistamina/cisteamina, 2-hidróxietildissulfureto/2-mercaptoetanol ou glutationa na 15 forma oxidada e reduzida. 0 último representa o agente preferido e é utilizado, na forma oxidada, a uma concentração de 0,1 a 2,5 mM, preferencialmente 0,5 mM e, na forma reduzida, de 0,25 a 6,25 mM, preferencialmente 1,25 mM.

No caso em que a muteina PLGF-1 expressa é libertada no meio de lise na forma de corpos de inclusão, o passo de renaturação é precedido por uma passagem de solubilização. A fracção contendo os corpos de inclusão é solubilizada num tampão de desnaturação contendo agentes de desnaturação conhecidos, tais como ureia, isotiocianato de guanidina, cloridrato de guanidina. Preferencialmente, a solução desnaturante é uma solução de ureia numa concentração desnaturante, por exemplo 8 M. Para acelerar o processo de solubilização pode ser vantajoso sujeitar a fracção contendo os corpos de inclusão a homogeneização ou a ultra-sons (sonicação). A solução contendo as proteínas é posteriormente diluída com o próprio tampão e/ou com uma solução diluente até se atingir uma medida de densidade óptica a 280 nm de aproximadamente 0,5 DO280 . Soluções diluídas adequadas contêm sais e polietileno glicol (PEG) e possuem um pH alcalino (pH de aproximadamente 8). A libertação de muteina PLGF-1 no meio de lise é normalmente acompanhada pela libertação de vários componentes e substâncias endocelulares do microrganismo, acima de tudo o material nucleico que pode afectar ou interferir com o processo de purificação de proteína. Para evitar este problema, a suspensão/solução obtida directamente da lise celular pode ser sujeita a um passo de processamento adicional opcional e preliminar constituído por fragmentação do dito material. Este resultado é obtido, através de agentes enzimáticos, tais como ADNases (natural ou recombinante tal como Benzonase), agentes químicos, tais como ácido desoxicólico, ou agentes físico-mecânicos, tais 16 como ultra-sons (sonicação), agitação rápida com lâminas, por exemplo num misturador. Fragmentação física de ADN é efectuada em volumes adequados de solução de lavagem contendo agentes quelantes e detergentes, por exemplo EDTA e Triton X100, e é preferencialmente repetido durante vários ciclos, alternados com diluição, centrifugação e eliminação do sobrenadante de modo a remover, qualquer componente celular ou substância da fracção contendo os corpos de inclusão.

Apesar da muteína PLGF-1 após renaturação poder já ser renaturada é preferencialmente sujeita a pelo menos um passo de purificação utilizando qualquer uma das técnicas bem conhecidas do perito no estado da técnica para purificação de material proteico. Com este objectivo a muteína pode ser sujeita a filtração por gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, HPLC, cromatografia de fase reversa e/ou electroforese em gel. Técnicas preferidas são cromatografia de permuta aniónica e de fase reversa. Quando é necessário obter um nível extremamente elevado de purificação, por exemplo adequado para utilização terapêutica, pelo menos duas das técnicas mencionadas acima são combinadas em sequência. A solução contendo a muteína parcialmente renaturada, isto é, parcialmente na forma dimérica pode ser carregada numa resina de permuta aniónica de modo a enriquecer a mistura com a forma dimérica e libertá-la de contaminantes bacterianos. Pode ser utilizada qualquer matriz adequada comercialmente disponível para cromatografia de permuta aniónica desde que as suas características de capacidade, carga e fluxo sejam compatíveis com um processo industrial. Numa concretização preferida é utilizada uma resina de elevado fluxo, por exemplo sefarose Q Fast Flow (Amersham biosciences) ou uma equivalente. 17

As resinas utilizadas permitem que volumes de amostra da solução proteica sejam carregadas com um volume de carga/volume de coluna em proporções variando de 1:1 a 10:1. São utilizadas proporções vol/vol perto de 10:1, na medida em que permitem que a utilização da coluna seja optimizada. O processo completo de cromatografia pode ser efectuado vantajosamente automaticamente, através de um sistema computorizado controlado por um programa adequado, por exemplo o sistema de software FPCL (Amersham biosciences).

Numa variante do processo observado acima, a muteina parcialmente renaturada pode ser purificada por cromatografia de fase reversa.

Neste caso, uma solução diluída adequada contendo a muteina parcialmente renaturada isto é parcialmente na forma dimérica e parcialmente na forma monomérica pode ser carregada em qualquer matriz cromatográfica adequada parcialmente disponível para a utilização indicada. Preferencialmente é utilizada uma resina que possui uma granulometria de modo a garantir uma exploração óptima da capacidade de absorção da matriz conjuntamente com facilidade de empacotamento da própria coluna. Exemplos destas matrizes são as resinas RP Source 15 ou RP Source 30 (Amersham biosciences). Todas as soluções de equilíbrio, lavagem e eluição são soluções hidro-orgânicas compreendendo diferentes percentagens de um solvente orgânico. Exemplos destas soluções são soluções compreendendo etanol, metanol, ou acetonitrilo. Preferencialmente, são utilizadas soluções hidroalcoólicas compreendendo percentagens acrescidas de etanol. Vantajosamente, o processo cromatográfico completo de fase reversa é efectuado automaticamente, através de um sistema computorizado que opera sob o controlo de um programa 18 adequado, por ex. o sistema de software FPCL Director Software (Amersham biosciences).

Quando duas ou mais técnicas de purificação são utilizadas uma após outra, a muteina pode ser obtida numa forma activa altamente purificada isto é, com a proteína essencialmente na forma dimérica, e sem qualquer contaminação pela forma monomérica. 0 produto obtido desta forma compreende menos do que 98,5% de forma activa, preferencialmente não menos do que 99,5%. A forma monomérica residual não excede 1,5%. Dado que a muteina é quimicamente estável, todos os produtos de multimerização estão limitados a traços. A proteína pura obtida de acordo com o processo descrito acima pode ser sujeita a outros passos de processamento, por exemplo ultrafiltração em membrana. Neste caso o produto é filtrado numa membrana com um limite de filtração (corte) mais baixo do que ou iqual a 30 kD e sujeito a diafiltração contra água acidulada com TFA até se atingir um factor de diluição de 1:106. O produto final obtido desta forma pode ser formulado de forma adequada com aditivos de liofilização e liofilizado para preservar a actividade biológica a níveis óptimos. Numa concretização prática da invenção, a muteina pode ser extraída de forma adequada, isolada e purificada de acordo com o processo de purificação descrito no pedido de patente de invenção internacional PCT/IT02/00065 (Geymonat) para purificar a proteína PLGF-1 do tipo selvagem, adaptando as condições operatórias se necessário. A estabilidade química das muteínas PLGF-1 de acordo com a invenção foi avaliada em testes em que a muteina liofilizada e a proteína PIGF-1 do tipo selvagem foram solubilizadas em solução salina ou formuladas num gel e armazenadas a uma temperatura de 4-8°C durante períodos de 40, 170 e 210 dias. Os resultados divulgados abaixo indicam claramente que a proteína na sua forma dimérica activa é 19 estável a todas as concentrações analisadas (20, 5 e 1 mg/ml) de modo a não apresentar tendência para precipitar ou multimerizar, de facto verificou-se que a concentração permanece nos valores iniciais. Pelo contrário, a concentração da forma dimérica da proteína do tipo selvagem diminui drasticamente após apenas alguns dias.

As muteinas de acordo com a invenção mostram conjuntamente com uma estabilidade quimica/biológica melhorada, uma actividade angiogénica comparável com a da proteína PLGF-1 do tipo selvagem. Esta actividade torna as muteinas PLGF-1 de acordo com a invenção adequadas para todas as aplicações terapêuticas e cosméticas da PLGF-1 natural conhecidas actualmente do estado da técnica. A acção angiogénica das muteinas PLGF-1 da invenção foi determinada utilizando técnicas conhecidas efectuadas in vivo ou in vitro. Em particular podem ser utilizados os testes da vascularização da córnea do coelho, ou da vascularização da membrana corioalantoide da galinha (CAM), como descrito por Maglione et al. "II Farmaco", 55, 165-167 (2000) .

Um segundo processo utilizado para avaliar a vascularização cutânea é a análise morfométrica computorizada de amostras de pele de animal, tal como descrito por Streit et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, Dezembro 21, 96(26), páginas 14888-14893). Secções cutâneas isoladas a partir de animais de laboratório, tratadas, ou não tratadas de acordo com a presente invenção foram coradas imuno-histoquimicamente utilizando anticorpos monoclonais anti-CD31 para utilização animal. As secções tratadas deste modo foram analisadas por microscópio electrónico para avaliar o número de células sanguíneas por mm2, as suas dimensões médias e a área relativa ocupada por elas. Foi avaliado o efeito angiogénico das muteinas no tecido do miocárdio e em particular no caso de isquémia ou 20 enfarto do miocárdio num modelo animal de isquémia cardíaca como descrito por Maglione et al. (supra). A actividade das muteínas de acordo com a invenção no tratamento do escleroderma foi avaliada num modelo animal como descrito por Yamamoto T et al. in Arch. Dermatol. Res. Nov. 2000, 292 (11), páginas 535 a 541. É induzido um estado de escleroderma em ratinhos C3H com bleomicina (100 mcg/ml) injectados diariamente por via subcutânea durante 3 semanas. Após 3 semanas, os animais foram sacrificados e amostras de pele de áreas tratadas foram sujeitas a análise histoquímica. O efeito do tratamento salienta acontecimentos histológicos que podem ser atribuídos a esclerotisação cutânea induzida pela bleomicina e, em particular, no espessamento da pele e níveis de hidroxiprolina elevados.

Os resultados revelados abaixo salientam a eficácia das muteínas PLGF-1 de acordo com a invenção no tratamento de todos aqueles estados degenerativos patológicos, ou naturais naquela área sujeita a melhoria como consequência do aumento da vascularização das áreas envolvidas. Uma primeira aplicação é o tratamento preventivo, ou curativo da isquémia e danos a seguir a acontecimentos isquémicos. Condições passíveis de serem adequadas a tratamento são a isquémia do tecido do miocárdio, enfarto do miocárdio, ictus isquémico e doenças do miocárdio crónicas, isquémia cerebral e ictus isquémico, isquémia intestinal isquémia periférica dos membros. Uma segunda aplicação terapêutica é o tratamento do escleroderma. Esta é uma doença que envolve o sistema microvascular, o tecido conjuntivo cutâneo e subcutâneo e o tecido conjuntivo de órgãos internos. A doença induz activação dos fibroblastos e produção excessiva e depósito de colagéneo no tecido e perivasal que contribui fortemente para a formação de fibrose e áreas de calcificação, e por isso, para o aparecimento de sintomas 21 induzidos pela doença. Em particular pode ser verificado por capilaroscopia que grandes quantidades de colagénio esclerotizado rodeiam os vasos da pele, provocando restrição do lúmen dos vasos. Um escleroderma circunscrito com envolvimento cutâneo pode ser distinguido, caracterizado por endurecimento e espessamento da pele devido a depósitos excessivos e inadequados de colagénio, e a um escleroderma progressivo sistémico em que os vasos sanguíneos encontram-se associados com a fibrose cutânea, conjuntamente com uma esclerose sistémica com lesões nos órgãos. A pele, principalmente a dos dedos e das mãos fica endurecida, espessa e edematosa. A doença encontra-se também presente ao nivel do miocárdio com insuficiência cardiaca, e ao nivel do sistema pulmonar, gastrointestinal, renal e osteomuscular. Alguns doentes também desenvolveram artropatias erosivas induzida por fibrose cutânea que complica grandemente a mobilidade das articulações. Maglione et al. reportaram (pedido de patente de invenção italiana RM2002A000119) no que diz respeito ao factor PLGF-1 do tipo selvagem, que a promoção da angiogénese, em particular da pele, como resultado do tratamento com composições contendo PLGF-1 possui um efeito benéfico no estado geral da esclerose induzida pela neomicina nos ratinhos. Foram observados os mesmos resultados em animais em que um estado de escleroderma tinha sido previamente induzido e tratado com muteínas de acordo com a invenção.

Uma terceira aplicação terapêutica é o tratamento que suporta o processo de cura em queimaduras, úlceras e feridas internas, ou cutâneas, particularmente durante os passos pós-operatórios.

Uma outra aplicação de acordo com a invenção diz respeito ao tratamento do fenómeno típico do envelhecimento da pele. Este tratamento, apesar de ser considerado essencialmente cosmético possui implicações terapêuticas 22 quando se entra em linha de conta com a deterioração precoce do tecido cutâneo devido a exposição prolongada à luz do sol (foto-envelhecimento) a radiação de outros tipos, ou agentes agressivos ambientais/atmosféricos.

Exame de amostras de pele foto-danif içada num microscópio electrónico revela uma morfologia microvascular típica que é caracterizada, entre outras coisas pela presença de capilares que são patologicamente dilatados e envolvidos em elastina ou rodeados por uma material denso amorfo. Verificou-se que a estimulação da vascularização da nova pele gera, em pele envelhecida naturalmente e precocemente um efeito modulador na matriz extra-celular responsável pelo tom da pele e espessura. A vascularização capilar acrescida é acompanhada por um aumento nos fibroblastos e na produção de colagéneo novo, seguida por uma melhoria geral na aparência da pele.

Uma outra aplicação dos compostos da invenção diz respeito à perda de cabelo.

Com efeito a vascularização melhorada da pele, especificamente na área perifolicular é acompanhada pela modulação do crescimento de apêndices cutâneos (cabelo, pelos do corpo, etc.) no sentido da prevenção da perda de cabelo e promoção da sua regeneração. A fase anagénica, que corresponde à fase de crescimento de cabelo é acompanhada por um aumento natural na vascularização do folículo capilar. A acção angiogénica local promove este aumento vascular e o crescimento consequente do cabelo. Análise morfométrica computorizada de secções de pele proximais dos folículos pilíferos dos animais tratados com as composições da invenção mostrou não só um aumento nas dimensões do lúmen do cabelo e densidade do cabelo e por isso um aumento geral na vascularização perifolicular, mas também um aumento nas dimensões do bolbo do cabelo e no diâmetro do próprio cabelo. 23 0 efeito de evitar a queda de cabelo de promover novo crescimento pode ser aplicado não apenas no caso de perda natural, mas também no caso de perda após estados clinicamente significativos, tais como alopécia, desordens hormonais, quimioterapia, radioterapia ou administração de medicamentos.

As indicações terapêuticas acima identificadas dizem respeito à administração directa, sistémica ou local de uma muteina do factor PLGF-1. Contudo, as muteinas da invenção podem também ser utilizadas para produzir anticorpos, fragmentos policlonais, monoclonais ou funcionalmente activos capazes de reconhecer o factor endógeno PLGF-1, especificamente aquelas regiões da sequência de aminoácidos contendo o local de ligação do PLGF-1 e o receptor. Anticorpos deste tipo são capazes de neutralizar a actividade angiogénica de PLGF-1 e encontram aplicação no tratamento de todas aquelas condições caracterizadas pela angiogénese patológica. Exemplos destas condições são desordens inflamatórias tais como artrite reumatoide, ou asma, edema, hipertensão pulmonar e a formação e desenvolvimento de tecido tumoral. Os próprios anticorpos podem ser utilizados como reagentes de imunodiagnóstico em processos para determinação qualitativa e quantitativa da produção de PLGF-1 endógena. Estes reagentes encontram aplicação no diagnóstico de todos aqueles estados patológicos acompanhados pela produção anormal de PLGF-1, tal como a formação e desenvolvimento de tecido tumoral.

Anticorpos ou os seus fragmentos capazes de reconhecer muteinas PLGF-1 são preparadas seguindo técnicas bem conhecidas do perito no estado da técnica, por ex. seguindo as técnicas descritas no pedido de patente WO-A-Ol/85796 para a produção de anticorpos específicos da proteína do tipo selvagem PLGF-1. 24 A presente invenção diz igualmente respeito a composições farmacêuticas contendo as muteínas descritas acima ou os anticorpos neutralizantes correspondentes como agentes activos, ou como reagentes de diagnóstico.

Qualquer formulação adequada para administração sistémica, ou local pode ser utilizada de acordo com a invenção. Em particular, o factor PLGF-1 pode ser administrado parenteralmente com um efeito sistémico ou local, ou topicamente na pele ou na mucosa com um efeito principalmente local. Um efeito sistémico é principalmente obtido por administração intravenosa, apesar de ser também possível a administração intraperitonial ou intramuscular. É obtido um efeito local por administração tópica, ou intramuscular, subcutânea, parenteral interarticular. As muteínas PLGF-1 podem igualmente ser administradas a nível local por electrotransporte ou ionoforese. Implantas subcutâneos podem igualmente ser utilizados quando é necessária libertação controlada ao longo de um período de tempo. Administração local do factor é também possível, apesar de ser menos fortemente recomendada tendo em vista a natureza delicada do produto activo.

Composições para uso sistémico ou parenteral local incluem soluções, suspensões, suspensões de lipossomas, emulsões a/o ou o/a. Composições para uso tópico incluem soluções, loções, suspensões, suspensões de lipossomas, a/o, o/a, a/o/a, emulsões o/a/o, geles, unguentos, cremes, pomadas e pastas. Numa concretização preferida a substância activa é formulada na forma liofilizada, misturada com aditivos de liofilização adequados e pronta para ser novamente solubilizada utilizando diluentes terapeuticamente aceitáveis. Aditivos de liofilização que podem ser utilizados são: tampões, polissacáridos, sacarose, manitol, inositol, polipéptidos, aminoácidos e qualquer outro aditivo compatível com a substância activa. 25

Numa concretização preferida da invenção, a substância activa é dissolvida num tampão fosfato (NaH2P04/H20-Na2HP04/2H20) numa quantidade tal que a proporção de muteina/fosfato após liofilização encontra-se compreendida entre 1:1 e 1:2. Diluentes adequados para uso parenteral são água, soro fisiológico, soluções de açúcar, soluções hidro-alcoólicas, diluentes oleosos, poliois, tais como glicerol, etileno ou propileno glicol, ou qualquer diluente compatível com o processo de administração em termos de esterilidade, pH, força iónica e viscosidade.

No caso de emulsões ou suspensões a composição pode conter agentes tensioactivos adequados do tipo não iónico, zwitteriónico, aniónico, ou catiónico habitualmente utilizado na formulação de medicamentos. Emulsões hidrofilicas o/a ou a/o/a são preferíveis para utilização parenteral/sistémica, em que as emulsões lipofílicas a/o ou o/a/o são preferíveis para utilização local ou tópica.

Além disso, as composições da invenção podem conter aditivos opcionais tais como agentes isotónicos, tais como açúcares ou polialcóois, tampões, agentes quelantes, antioxidantes, agentes antibacterianos.

As composições para uso tópico incluem formas líquidas ou semi-sólidas. As primeiras compreendem soluções ou loções. Estas podem ser aquosas, hidroálcoólicas, tais como etanol/água ou alcoólicas e são obtidas por solubilização da substância liofilizada.

Alternativamente, soluções da substância activa podem ser formuladas como geles por adição de agentes gelificantes conhecidos tais como: amido, glicerina, polietileno ou polipropileno glicol, poli(met)acrilato, álcool isopropílico, hidróxiestearato, CARBOPOZ®.

Outros tipos de composições para uso tópico são emulsões ou suspensões na forma de pomadas, pastas e cremes. São preferidas emulsões a/0, uma vez que 26 disponibilizam uma absorção mais rápida. Exemplos de excipientes lipofílicos são: parafina liquida, lanolina anidra, vaselina branca, álcool cetilico, álcool estearilico, óleos vegetais, óleos minerais. Podem ser vantajosamente utilizados agentes que aumentam a permeabilidade da pele, de modo a facilitar a absorção. Exemplos destes agentes são aditivos fisiologicamente aceitáveis tais como álcool polivinílico, polietilenoglicol ou dimetilsulfóxido (DMSO).

Outros aditivos utilizados nas composições tópicas são agentes isotónicos, tais como açúcares ou poliálcoois, tampões, agentes quelantes, antioxidantes, agentes antibacterianos, agentes espessantes agentes dispersantes.

Composições para utilização local ou sistémica com libertação controlada ao longo de um período de tempo podem ser igualmente utilizadas, e estas incluem polímeros tais como polilactato, poli(met)acrilato, polivinil-pirrolidona, metilcelulose, carboximetilcelulose e outras substâncias conhecidas do estado da técnica. Podem também ser utilizadas composições de libertação retardada na forma de implantes subcutâneos baseados, por exemplo, em polilactato ou outros polímeros biodegradáveis.

Apesar da substância activa ser já ela própria estável e estar preferencialmente embalada na forma liofilizada as composições farmacêuticas podem compreender vantajosamente substâncias estabilizadoras adicionais para as PLGF-1 muteínas na forma dimérica activa. Exemplos destas substâncias são: cisteína, cisteamina, ou glutationa. A dosagem da muteína depende da via de administração e da formulação escolhida. Para administração parenteral as quantidades variam de 1 mcg/kg/dia a 500 mcg/kg/dia, preferencialmente de 10 mcg/kg/dia a 200 10 mcg/kg/dia. Estas administrações são obtidas com composições farmacêuticas compreendendo 50 mcg a 30 mg por dose 27 unitária, preferencialmente de aproximadamente 500 mcg a 10 mg por dose. Demonstraram ser eficazes para uma aplicação terapêutica tópica quantidades que variam entre 0,1 mg a 10 mg por grama de composição. Composições cosméticas locais para o tratamento do envelhecimento da pele, ou de perda de cabelo compreendem preferencialmente de 0,01 mg a 0,09 mg de substância activa por grama de composição. A duração do tratamento varia de acordo com a patologia do efeito requerido. No caso do tratamento de escleroderma o período de aplicação varia entre 1 dia a 12 meses, de acordo com a gravidade da patologia. No caso do tratamento para o envelhecimento natural ou precoce da pele, o período de aplicação varia de 1 a 400 dias, preferencialmente durante pelo menos 30 dias. No caso do tratamento para evitar perda de cabelo ou para promover um novo crescimento de cabelo o período de tratamento varia igualmente de 1 a 400 dias. A invenção é descrita a seguir através de exemplos, cujo propósito é apenas ilustrativo e não limitativo.

Exemplo 1: Síntese do ADNc que codifica para a muteína A muteína PIGF-1 que nós designámos por P1GF-1CG, foi gerada por mutação da timidina (T) N° 382 (Sequência SEQ ID N°:l) em guanidina (G). Deste modo o codão TGC, nucleótidos 382-384 da sequência indicada acima codifica para uma cisteína foi transformada em GGC que codifica para uma glicina.

Do ponto de vista de um aminoácido a cisteina mutada em glicina na muteína PlGF-lCG encontra-se na posição 125 da SEQ ID N°:2 . 28

Para a síntese de ADN que codifica para a muteína foi aplicada a técnica de PCR (reacção em cadeia da polimerase). 0 vector de expressão pET3PLGFl que codifica para a proteína metionil P1GF-1 sem péptido de sinalização (EP-A-0 550519) foi utilizado como molde para a PCR. Na prática é a proteína PLGF-1 do tipo selvagem sem os primeiros 18 aminoácidos (péptido de sinalização) e com uma metionina na posição 1 (N-terminal) (SEQ ID N°2) . Os oligonucleótidos utilizados como iniciadores são os seguintes: oligol (iniciador de sentido) possuindo a sequência 5'-CTGGC GCATATGCTGCCTGCTGTGCCC-3'. Isto contém um local Ndel (sublinhado) e o codão de iniciação (em negrito); oligo2 (iniciador anti-sentido) possuindo a sequência 5'-GGTTACCTCCGGGGAACAGCATCGCCGCCCC-3'. Isto contém uma mutação T—>G (nucleótido sublinhado e em negrito) que transforma o codão TGC, que codifica para uma cisteína no codão GGC (em negrito) que codifica para uma glicina. A cadeia nucleótidica obtida após PCR efectuada com um ciclador génico Biorad foi sujeita a uma reacção final, a seguir digerida com a enzima de restrição Ndel. O fragmento obtido, com Ndel/ extremidades "rombas" foi clonado nas extremidades correspondentes Ndel/"rombas" do vector de expressão procariótico pET3 de acordo com protocolos padrão. Deste modo foi criado o plasmídeo pET3PLGFlCG que codifica para a muteína PLGF-1 conhecida como PLGF-1CG.

Este plasmídeo foi utilizado de acordo com técnicas conhecidas para transformar a estirpe de E. coli [B12(DE3)pLysS] (Promega Corporation USA) e produzir a estirpe hospedeira [B12(DE3)pLysS PLGF-1CG]. A técnica de construção utilizada para este plasmídeo é esquematizada na figura 5. 29

Exemplo 2: Produção, extracção e purificação da muteina PLGF-1CG 0 microrganismo [B121(DE3)pLysS PLGF-1CG] foi cultivado num fermentador utilizando como meio de cultura a solução SBM compreendendo:

Solução A (por 1 litro)

Extracto de levedura Bacto 34 g (Difco)

Sulfato de amónio 2,5 g

Glicerol 100 ml H20 q.b. para: 900 ml

Solução B (10X)(por 100 ml) KH2P04 1,7 g ΚΗ2Ρ04-3Η20 20 g ou KH2P04 15, 26 g H20 q.b. para: 100 ml

As soluções A e B são misturadas na forma estéril na altura da utilização. A expressão é induzida, através de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) 1 mM. A fermentação é precedida por um passo de pré-inoculação. Um tubo de microrganismo liofilizado é tomado e novamente suspenso em 1 ml de SBM+10C^g/ml ampicilina +34 μg/ml de cloroanfenicol, a suspensão é mais diluída e incubada a 37°C durante uma noite. Após diluição na mesma solução SBM adicionada com ampicilina e cloroanfenicol, o pré-inoculado é dividido por quatro recipientes de Erlenmeyer. O conteúdo de cada Erlenmeyer é incubado a 37°C durante 24 horas. Os conteúdos dos 4 Erlenmeyer são 30 misturados e a DO600 é lida, diluida 1/20 em água (50 μΐ + 950 μΐ de água).

Um volume de pré-inoculação estabelecido é então centrifugado durante 10 min. a 7500xg a 4°C em tubos estéreis. As bactérias são então novamente suspensas em 20 ml SBM + 200 μρ/ηιΐ de ampicilina + 10 μρ/ιηΐ cloroanfenicol por litro de fermentação, agitando a 420 rpm à ta durante 20 minutos. A fermentação é efectuada numa solução de SBM contendo 200 μρ/ml ampicilina, 10 μρ/ml de cloroanfenicol e uma quantidade adequada de agente anti-espumante, a uma temperatura de 37°C e na presença de (30%) de 02 dissolvido e a um valor de pH de entre 6,4 e 7,4. A indução é começada, quando o meio de cultura atinge uma densidade óptica a 600 nm (DO600) entre 16-20 unidades. O agente de indução utilizado é IPTG 1 mM na presença de 10% de 02 dissolvido (em relação à saturação do ar) . A duração da indução é aproximadamente 3 horas. A indução é controlada efectuando electroforese SDS-PAGE, carregando 20μ1 de solução de pré e pós-indução previamente fervida. O meio de cultura contendo as bactérias induzidas é então centrifugado a 7500xg durante 10 min, ou a 3000xg durante 25 min, a 4°C e o sobrenadante é rejeitado.

As células bacterianas são a seguir sujeitas a lise seguida de extracção e purificação dos corpos de inclusão. A lise bacteriana é efectuada, através de dois ciclos de congelamento/descongelamento a -80/37°C numa solução de lise contendo 1 mM de Mg2SO4+20 mM Tris-HCl pH8 +1% TritonxlOO. A mistura de lise é incubada à temperatura ambiente durante 30 min com agitação (250 rpm), e depois vertida para um misturador de capacidade adequada, dilui-se com uma quantidade de solução de lavagem contendo 0,5% de 31 tritonXlOO + 10 mM EDTA pH 8, equivalente a 3 ml por 450 DO600 de bactérias.

Se necessário, 0,4 μΐ de agente anti-espumante é adicionado a cada mililitro de amostra. A solução é misturada a uma velocidade máxima durante 1 minuto, ou até a amostra ficar homogénea. O conteúdo do misturador é então transferido para um recipiente de capacidade adequada diluído com 6,5 ml de solução de lavagem para cada 450 DO600 de bactérias, a suspensão obtida deste modo é centrifugada a 13000xg durante 45 min a 25°C e o sobrenadante é rejeitado. O processo completo de lavagem é repetido durante vários ciclos até se obter um agregado final contendo os corpos de inclusão da proteína expressa. A seguir a isto, o agregado contendo os corpos de inclusão é solubilizado em 7 ml de tampão desnaturado BD (8m de ureia, 50 mM de Tris pH 8, etilenodiamina 20 mM), depois a solução é diluída até a concentração final de ureia atingir 5 Μ. A renaturação da proteína é efectuada na solução obtida desta maneira por adição de glutationa reduzida (concentração final equivalente a 1,25 mM) e glutationa oxidada (concentração final equivalente a 0.5 mM) e incubação a 20°C durante 18-20 horas sob agitação.

No final do período de incubação é centrifugado durante 10 min a 20°C, lOOOOxg, e filtrado através de filtros de 0,45 ou 0,8 μηι. A muteína na forma renaturada, i.e. na sua forma dimérica é sujeita a purificação por cromatografia de permuta iónica. A solução de muteína é carregada numa resina de sefarose Q Fast-Flow (Amersham-biosciences) equilibrada com tampão A (20 mM) etanolamina-HCl pH 8,5) e eluída, após lavagem com 20% de tampão B (tampão A + 1M NaCl), correspondente a uma concentração de NaCl de 200 mM. 32 A muteína parcialmente purificada e levada a um grau mais elevado de pureza, através de cromatografia em fase reversa. Para este objectivo o pico de eluição da cromatografia de permuta iónica é diluído com uma solução contendo TFA e etanol de modo a que a amostra seja diluída 1,5 vezes e contenha 15% de etanol e 0,3% de TFA. A adição destas substâncias aumenta a ligação da muteína à resina de fase reversa. A solução é carregada em resina RP Source (Amersham-Bioscience) com um diâmetro médio de 15 ou 30 micron equilibrado com uma solução contendo 40% de etanol e 0,1% de TFA. A solução de lavagem remove a forma monomérica da muteína, enquanto que a forma dimérica é eluída com um gradiente acrescido de etanol até se atingir uma percentagem de 70% de etanol. O processo de purificação cromatográfico é monitorizado controlando a absorção a 280 nm das fracções eluídas. A solução de dímero obtida desta forma é armazenada a -20°C, e a seguir é ultradiafiltrada e liofilizada de acordo com técnicas conhecidas.

Exemplo 3 I: Estudo de estabilidade na muteína de PLG-1CG que transporta a substituição Cys 125 Gly. A muteína P1GF-1CG foi solubilizada em solução salina para concentrações teóricas de 20, 5 e 1 mg/ml. Simultaneamente a proteína PlGF-1 (sem mutação) foi também solubilizada em solução salina a uma concentração de 20 mg/ml. Todas as amostras foram armazenadas no refrigerador (4-8°C) até 40 dias. A concentração real foi determinada calculando a média dos valores obtidos a partir de 3 diluições independentes adequadas. O processo utilizado foi espectrofotometria 33 utilizando um comprimento de onda de 280 nm e sabendo que uma absorvância de IDO (densidade óptica), medida numa célula padrão de lcm de comprimento óptico, corresponde a uma concentração de P1GF-1 e P1GF-1CG equivalente a 1 mg/ml. Durante os dias após o início da experiência (tempo 0 na tabela 1), antes de efectuar as diluições adequadas para determinar a concentração, uma alíquota de cada amostra foi centrifugada a 13000 rpm numa microcentrífuga ALC 4212 durante 10 minutos e o sobrenadante foi utilizado para análise subsequente. Desta forma foram eliminados precipitantes possíveis e, consequentemente, os resultados dizem respeito à proteína que permanece apenas na solução.

Os resultados deste estudo são ilustrados na tabela 1, e mostram claramente que a muteína em todas as concentrações analisadas (20, 5 e 1 mg/ml), e pelo menos até 40 dias, é estável no sentido de que não tende a precipitar em quantidades tais de modo que se verifica que a concentração permanece nos valores iniciais. Pelo contrário, logo após 4 dias de armazenagem apenas 7,8% da proteína sem mutação armazenada a uma concentração de 20 mg/ml nas mesmas condições que a muteina permanece na solução. O valor ainda continua a descer (5,5%) após 12 dias. É importante salientar que mesmo após 24 horas de armazenamento a 4-8°C já se verifica uma precipitação abundante da proteína PlGF-1 sem mutação. 34

Tabela 1

Tempo arma- zena- do a 4-8sC (dias) Concentração média (mg/ml) P1GF- 1CG 20 mg/ml DP PIGF- 1CG 5 mg/ml DP PIGF- 1CG 1 mg/ml DP PIGF- 1 20 mg/ml DP 0 20,38 1,00 5, 43 0,04 1,07 0,02 20,14 0,18 4 19,69 0,57 5,25 0,27 0,98 0,08 1,57 0,10 12 20,46 0,54 5,28 0,19 1,00 0,01 1,11 0,01 26 20, 72 0,33 NA NA NA 40 20,32 0, 75 NA NA NA DP=Desvio Padrão 0 perfil de electroforese (composição monómero-dímero-polímero) para a muteína P1GF-1CG (Figura 1) é também substancialmente estável nas condições indicadas acima. Com efeito, a electroforese SDS-Page em condições não redutoras da proteina P1GF-1CG, solubilizada em solução salina a 20 mg/ml e congelada (controlo, linha 1 da figura 1) ou armazenada a 4-8°C durante 40 dias (amostra, linha 2 da figura 1), revela substancialmente apenas alterações minimas, representadas pelo desaparecimento da porção monomérica pequena e pela formação de uma quantidade extremamente pequena de trimero (<0,5% de dimero).

Exemplo 4 II: Estudo de estabilidade da muteina PLGF-1CG formulada em gel A muteina P1GF-1CG e a proteina P1GF-1 não mutada foram solubilizadas a uma concentração de 0,2 mg/ml num gel que é composto pelo seguinte:

1% P/V

Carbopol 940= NA= Não Analisado 35

35 15 mM

0,04% P/V 0,05% P/V

Acetato de sódio pH 4,4 EDTA sal dissódico

Metil paraben

Foi levada a um pH entre 5,5 e 6 utilizando NaOH/ ácido acético.

Os dois geles foram armazenados a 4-8°C. A vários intervalos de tempo foi retirada uma porção em duplicado dos dois geles (aproximadamente 0,2 ml) e pesada nas balanças analíticas.

Adicionou-se às amostras pesadas um volume, expresso em microlitros de 2 x tampão de amostra não redutora equivalente ao peso, expresso em miligramas da porção do gel.

Após agitação em vórtice durante 10 minutos e centrifugação a 13000 rpm (ALC 4214 microcentrifugados) durante mais 10 minutos, o sobrenadante foi retirado. Isto foi novamente centrifugado e o novo sobrenadante foi removido. Uma porção deste último, conjuntamente com padrões de quantidade foram analisados por electroforese SDS-PAGE não redutora. Após coloração, os geles de electroforese foram analisados utilizando um densitómetro para encontrar a concentração da forma dimérica das amostras analisadas.

Os resultados obtidos para vários intervalos de tempo e expressos como uma percentagem do dímero em relação ao presente no tempo zero, são indicados na Tabela 2 e expressos na forma gráfica na Figura 2. A partir destes dados pode-se verificar que a quantidade de dímero P1GF-1CG permanece constante até ao final dos 170 dias analisados, a de P1GF-1 cai para 71% após 150 dias, e para 55% após 210 dias. O perfil de electroforese (composição monómero-dímero-polímero) indica também que a muteína PIGF-1CG é 36 substancialmente estável nas condições indicadas acima (Figura 3) . Com efeito, a electroforese SDS-page em condições não redutoras da proteína PIGF-1CG, solubilizada num gel carbopol a 0,20 mg/ml e arrefecido (controlo, linha 2 da figura 3), ou armazenado a 4-8°C durante 170 dias (amostra, linha 1 da figura 3), não revela qualquer fenómeno de polimerização. Pelo contrário, estes fenómenos de multimerização são claramente evidentes para a proteína PIGF-1 não mutada, como ilustrado na figura 4 (comparar linha 1 -proteína armazenada a 4°-8°C durante 150 dias, com linha 2 -proteína congelada).

Tabela 2

Tempo armazenado a 4-8sC (dias) % Dímero Gel PIGF-1CG (muteína) Gel PIGF-1 0 100.00 100,00 30 108.00 NA 57 NA O OO 00 119 NA 72, 70 133 98, 70 NA 150 NA 71,10 170 101,50 NA 210 NA 54,90 N.A.= não analisado

Exemplo 5: Avaliação da actividade angiogénica da muteína PLGF-1CG A actividade angiogénica da muteína PLGF-1CG do factor PLGF-1 do tipo selvagem e, como referência positiva, do factor de crescimento do fibroblasto básico (bFGF) foram comparados utilizando o teste de vascularização da 37 membrana corioalantoide da galinha (CAM) já descrito por Maglione et al. ("II Farmaco" acima), várias quantidades de muteina e de factor do tipo selvagem (entre 0 e 3 mcg/esponja) foram absorvidos em esponjas de 1 mm3 de gelatina, implantadas posteriormente à superfície da CAMs. Após 12 dias, as regiões CAM em contacto com as amostras foram seccionadas, coloridas e o efeito angiogénico foi quantificado utilizando a técnica morfométrica conhecida como "contagem de pontos". As secções de CAM foram analisadas sob um microscópio numa grelha com 144 pontos de intersecção e os resultados foram expressos como a percentagem dos pontos de intersecção ocupados pelos capilares numa secção transversal (percentagem da área que é vascularizada). Os resultados, ilustrados na figura 6, apresentam essencialmente actividade angiogénica equivalente para a muteina e o factor do tipo selvagem.

Exemplo 6: Avaliação do efeito da muteina PLGF-1CG na isquémia cardíaca induzida pela isoprenalina. 0 efeito da muteina PLGF-1CG na isquémia cardíaca e enfarto foi avaliada num modelo animal de isquémia induzida, através de isoprenalina, como descrito por Maglione et al. (supra) em relação ao factor do tipo selvagem. A experiência foi efectuada em coelhos que foram tratados com uma dose única diária de 160 mcg/kg de muteina, ou com volumes equivalentes de apenas excipiente, administrado por via intravenosa nos dias 1 a 5. A isoprenalina foi administrada por via subcutânea nos dias 1 e 2. As características típicas do electrocardiograma (ECG) indicando os principais danos isquémicos, tal como a inversão da onda T, alargando a onda S e a proeminência da onda Q são decididamente mais marcadas nos animais tratados apenas com excipiente, em relação aos animais tratados com 38 a muteína a ser examinada. Variações no ECG dos animais tratados e não tratados foram avaliadas numa escala de pontos que vai de zero a seis, como divulgado abaixo: 0, sem lesão; 1, proeminência da onda S; 2 proeminência da onda T; 3 depressão do braço decrescente da onda T; 4, alargamento da onda S; 5, inversão da onda T; 6, proeminência da onda Q. A área total sob a curva definida pelos pontos ECG durante 5 dias do teste foi igualmente calculada para animais tratados e não tratados. Os resultados são ilustrados na figura 7 e apresentam uma redução significativa nos danos isquémicos nos animais tratados com a muteina PLGF-1CG. Os resultados sublinhados no perfil electrocardiográfico foram confirmados por observação macro e microscópica dos tecidos isquémicos. O dito exame mostra a presença das lesões isquémicas e alterações histológicas de severidade moderada em relação às observadas no tecido cardiaco dos animais tratados apenas com o excipiente.

Exemplo 7: Avaliação do efeito da muteina PLGF-1CG no escleroderma induzido pela neomicina

Neste estudo foi utilizado o modelo e escleroderma animal descrito por Yamamoto et al. (acima).

Um primeiro grupo de ratinhos C3H foi tratado com bleomicina (100 mcg/ml)injectados diariamente por via subcutânea durante 3 semanas. Três outros grupos de ratinhos C3H foram tratados da mesma maneira que acima referido, mas foi adicionado 0,1, 1 e 10 mcg/ml da muteína PIGF-1CG à injecção diária, respectivamente. Após 3 semanas de tratamento, os animais foram sacrificados e as amostras das áreas tratadas foram retiradas e sujeitas a análise histológica. O efeito do tratamento com PIGF-1CG a 1 e 10 mcg/ml, mas não a 0,1 mcg/ml, sublinha uma redução 39 significativa nos acontecimentos histológicos que podem ser atribuídos à esclerotização cutânea induzida pela bleomicina. Em particular, o espessamento da pele e os niveis de hidroxiprolina foram diminuídos significativamente em relação aos ratinhos tratados apenas com bleomicina.

Exemplo 8: Composições farmacêuticas i) Solução para uso parenteral 58 miligramas de muteína liofilizada contendo 25 mg de PLGF-1CG pura e 33 mg de tampão fosfato (10 mg NaH2P04/H20 e 23 mg de Na2HPC>4/2H20), e aproximadamente 125 ml de solução salina para utilização parenteral são empacotadas separadamente em frascos preparados para permitir a mistura de produto liofilizado com o diluente imediatamente antes da utilização. A concentração do princípio activo resultante após solubilização é aproximadamente 0,2 mg/ml. ii) Composição tópica na forma de gel:

Uma quantidade de substância liofilizada contendo 10 mg de substância activa é efectuada em 20 ml de solução a 10% de etanol hidroalcoólica contendo 20% de DMSO. A solução é então adicionada com um excipiente de gel adequado contendo os ingredientes seguintes:1% Carbopol 940, acetato de sódio 15 mM (pH 4,4), 0,04% p/v de EDTA dissódico, 0,05% p/v de metilparaben com um pH final compreendido entre 5,5 e 6.

Listagem das Sequências <110> Geymonat S.r.L.

<120> PLGF-1 muteína <130> BW285R 40 < 16 0 > 4 <170> Patentln Version 3.1 <210>1 <211>418

<212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221>CDS <222> (10)...(408) <223> Sequência sem o ADN que codifica para o péptido de sinalização da proteína de tipo selvagem. Nucleótidos 10 a 408 codificam para os aminoácidos 19-149 da proteína descrita na reivindicação 1 da EP0550519. 41 ctggcgcat atg ctg cct gcfc gtg cec cce cag cag tgg gec fctg tçt gçt Met Leu Pro Ma Vai Fro Fr o SIn Gin Trp Ma Leu Ser Ma 15 10 ggg aac gg c tcç tea gag gtg gaa gtg gta ccc ttc cag gaa gtg tgg Gly Asn Gly Ser Ser Glu Vai Glu Vai Vai Pro Phe Gin. Gin Vai Trp 15 20 25 30 ggc cgc age tac tgc cgc 333 ctg gag agg ctg gtg gac gtc 3*3 tcc Gly Mg Ser Tyz Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Vai Asp Vai Vai Ser 35 40 45 gag tac ccc age 333 3*3 gag CSC atg tfcc age cca tcc fegt gt-C tcc fila fyr Fro Ser Glu Vai Glu Ris Me“ Fhe Ser Pro Ser Cys Vai Ser 50 55 €0 ctg ctg cgc tgc acc ggc tgc tgc ggc gat gag âât ctg cac tgt gtg Leu Leu Axg Cys Thz Gly Cys Cys Gly Asp Glu Aso Leu His Cys vai es ?o 75 ceg gtg gag acg gee aat gtc acc atg cag ctc ctâ aag ate cgt tet Pro Vai Glu Thr Ala ASTi Vai Thr Mefc Gin Leu Leu Lys Ile Arg Ser 80 85 90 333 gae cgg CCC tcc tac 3*3 gag ctg acg ttc tet cag cac gtt cgc Gly Asp ftrg Pro Ser Tyr Vai Glu Leu Thz Fhe Ser Gin Ria Vai Azg 95 100 105 110 tgc gaa tge cgg cct ctg cgg gag aag atg sag ccg gaa agg tgc 9g« Cys Glu Cys Arg Fro Leu Arg Glu Lys fclefc Lys Fro Arg Cys Glv 115 120 125 gat gct gtt cce cgg 333 taa cccaggatee Asp Ala Vai Fro Azg Arg <210*2 130 42

;211> 132 <212> PRT C213> Nome sa$S!1S <400>:·2 ffet Leu Pro ala Vai Fro Pro Gin Gin Trp Ala Leu Ser Ala Gly Asn 1 5 10 15

Gly Ser Ser Glu Vai Glu Vai Vai Pro Phe -Gin Glu Vai Trp Gly Arg 20 25 30

Sar Tyr Cys Arg· Ma Leu Glu &rg Leu Vai Asp Vai vai Ser Glu Tyr 35 40 45

Pro Ser Glu Vai Glu Kis Mefc Phe Ser Pro Ser Cys V«1 Ser leu Leu 50 55 50

Atrg Cys The Gly Cys Cys Gly Ãsp Glu &sn leu His Cys Vai Pro Vai 65 70 75 80

Glu Thr Ma Asn V*1 Thr Het Gin leu Leu Lya lie Arg Ser Gly h$p 85 30 3:5

Are Pro Ser Tyr Vai Glu leu Thr Phe Sar Gin Hís Vai ftrg Cys Glu 100 105 UO

Cys Rrg Pro Leu Axg Glu Lys Met lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala 115 120 125

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<21Q> 3 <211 >27 <212> DNA <'13> Artiísciat Sèquence <2L'G> «223» Fomató Prliusr fôratrspljfiasífcntíf feíiuroan PLGF-i prstem <4õC,:· ; C «ggegsata tgsígecígc tgtgccc 27 <M0> I <211» 31 43

«212» DMA «213» Artificial Ssqusnss *220» «223» Reverso Pílmêf for ampiiffcsíton <$ ths homao PU3F-1 protele <400> 4 ggftacctec ggggaacagc atcgocycce c 31

Lisboa, 16 de Fevereiro de 2011.

Claims (45)

1 Reivindicações 1. Muteína da forma monomérica do factor de crescimento placentário do tipo 1 (PLGF-1) humano, ou animal que envolve a substituição ou eliminação na sequência polipéptidica da proteina do tipo selvagem, pelo menos do resíduo de cisteína (Cys) na posição 142 da sequência polipéptidica da pré-proteína, correspondente à cisteína na posição 125 da SEQ ID N°:2, e que a dita substituição ou eliminação não afecta a formação do dímero biologicamente activo, mas impede a multimerização da dita forma monomérica.

2. Muteína de acordo com a reivindicação 1, em que o resíduo Cys na posição 142 é substituído por um resíduo de glicina (Gly).

3. Muteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 na forma de uma pré-proteína ou de uma proteína madura.

4. Muteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que um ou vários aminoácidos da proteína do tipo selvagem são eliminados, substituídos, ou adicionados sem modificação da actividade angiogénica da muteína.

5. Muteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sob a forma dimérica.

6. Muteína de acordo com a reivindicação 5, compreendendo pelo menos 98,5% da forma dimérica. 2

7. Sequência nucleótidica compreendendo o ADN que codifica para a muteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

8. Sequência nucleótidica de acordo com a reivindicação 7, em que um codão TGC ou TGT na sequência que codifica para PLGF-1 do tipo selvagem é eliminado, ou modificado.

9. Sequência nucleótidica de acordo com a reivindicação 8, em que um codão TGC ou TGT é substituído por um codão GGC, GGT, GGA ou GGG .

10. Sequência nucleótidica de acordo com a reivindicação 9, em que a base timidina na posição 382 da sequência SEQ ID N°:l, ou dos seus derivados formados por degenerescência do ADN é substituída pela base de guanidina.

11. Sistema de expressão compreendendo a sequência nucleótidica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10 flanqueada por sequências não traduzidas para o controlo e a regulação da expressão.

12. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 11, em que o sistema de expressão é um sistema de expressão indutível nas células bacterianas.

13. Sistema de expressão de acordo com a reivindicação 11, ou com a reivindicação 12, em que a expressão está sob o controlo de um promotor indutível.

14. Sistema de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, em que o sistema de expressão é um sistema de expressão da ARN polimerase do fago T7, e esta expressão é induzida pela lactose, isopropil-β-ϋ- 3 tiogalactopiranósido (IPTG), ou por análogos de expressão equivalente.

15. Célula hospedeira transformada por meio de um sistema de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14.

16. Célula de acordo com a reivindicação 15, em que a célula é uma célula bacteriana.

17. Célula bacteriana de acordo com a reivindicação 16 derivada de uma estirpe de E. coli.

18. Processo para a produção da sequência nucleótidica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, em que o ADN que codifica para a muteina é produzido pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como iniciadores oligonucleótidos que foram modificados de maneira adequada em relação à sequência nucleótidica do tipo selvagem.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, em que o oligonucleótido da SEQ ID N°:3 é utilizado como iniciador 5'-3' (sentido) e o oligonucleótido da sequência SEQ ID N° :4 é utilizado como iniciador 5'-3' (anti-sentido).

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a sequência de ADN que codifica para a proteína PLGF-1 sem a proteína de sinal é utilizada como matriz na reacção em cadeia da polimerase.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 em que a sequência de ADN obtida na reacção em cadeia da polimerase é submetida a uma reacção final, 4 depois digerida com as enzimas de restrição adequadas e clonada num vector adequado.

22. Processo de produção e de extracção de uma muteína do factor PLGF-1, em que as células hospedeiras de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17 são cultivadas num meio de cultura adequado, a expressão da proteína é induzida por meio de um indutor adequado, as células são isoladas e lisadas e a muteína é extraída da mistura de lise.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o meio de cultura compreende um ou vários agentes de selecção, um extracto de levedura, glicerol e sais de amónio, e está isento de substância de origem animal, ou humana.

24. Processo de acordo com a reivindicação 22, ou a reivindicação 23, em que as células são cultivadas antes da etapa de indução da expressão, até uma densidade óptica (DO) do meio de cultura situada entre 0,2 e 50 unidades a 600 nm seja atingida.

25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, em que a expressão é induzida pela lactose, por isopropil-p-tiogalactopiranósido (IPTG).

26. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, em que a lise das células é realizada por congelação/descongelação por meio de uma prensa francesa ou outras técnicas equivalentes.

27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, em que os corpos de inclusão libertados pela lise 5 são isolados por meio de pelo menos dois ciclos de centrifugação e por lavagem num tampão adequado.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, em que os corpos de inclusão são solubilizados num tampão de desnaturação contendo ureia, isotiocianato de guanidina, cloridrato de guanidina ou um outro agente de desnaturação e são facultativamente homogeneizados ou tratadas com ultra-sons.

29. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, em que após solubilização dos corpos de inclusão, a solução é diluida e a matéria proteica é renaturada sob a forma de dimero por adição à solução de agentes de oxido-redução e incubação durante 10 a 30 horas, 18 a 20 horas a uma temperatura de 10°C a 30°C, sob agitação.

30. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 29, compreendendo pelo menos uma etapa de purificação da proteina sob a forma de dimero.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, em que a etapa de purificação consiste numa cromatografia de permuta iónica.

32. Processo de acordo com a reivindicação 30 ou a reivindicação 31, em que a solução saída da etapa de renaturação é carregada numa coluna de permuta aniónica com uma proporção de volume de carga/volume de coluna de 1:1 a 10:1.

33. Processo de acordo com a reivindicação 30, ou a reivindicação 31, compreendendo uma etapa de purificação em coluna por cromatografia de fase reversa. 6

34. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 33, compreendendo uma passagem de ultrafiltração suplementar seguida de uma liofilização na presença, ou na ausência de aditivos adequados.

35. Muteina de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, utilizável num processo de tratamento terapêutico.

36. Muteina de acordo com a reivindicação 35 para o tratamento de doenças isquémicas.

37. Muteina de acordo com a reivindicação 36, para o tratamento da isquémia do tecido miocárdico, de um enfarto do miocárdio de um ictus isquémico e de doenças miocárdicas isquémicas crónicas, de uma isquémia cerebral e de um ictus isquémico, de uma isquémia intestinal e de uma isquémia periférica dos membros.

38. Muteina de acordo com a reivindicação 35 no tratamento da esclerodermia.

39. Muteina de acordo com a reivindicação 35 para o tratamento das úlceras cutâneas, das chagas, das queimaduras, tratamento após cirurgia.

40. Muteina de acordo com a reivindicação 35 para o tratamento do envelhecimento natural, ou precoce dos tecidos cutâneos.

41. Muteina de acordo com a reivindicação 35, para o tratamento da perda natural ou patológica de cabelo. 7

42. Composição farmacêutica contendo a muteina de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6 e um excipiente aceitável do ponto de vista farmacológico.

43. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42, adequada para uma utilização parenteral, tópica, oral, nasal, ou num implante.

44. Composição cosmética contendo muteina de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6 e um excipiente aceitável sob o ponto de vista cosmético.

45. Processo de preparação da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 42 ou da composição cosmética de acordo com a reivindicação 44, em que a muteina PLGF-1 se encontra associada a um excipiente aceitável a nivel farmacológico ou cosmético e com outros aditivos habituais. Lisboa, 16 de Fevereiro de 2011.