PT88824B - Processo para a producao de mutante do factor de crescimento acido de fibroblastos - Google Patents
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Description
Breve descrição das ilustrações
A figura I e um diagrama do plasmideo pKK223-3» que contem um gene que codifica para o r-aFGF mutante.
A figura 2 compara as estabilidades relativas do haFGF recombinante do tipo selvagem e de vários mutantes, na presença de heparina (a) e sem heparina (B).
Fundamentos da descoberta
A descoberta de substâncias que controlam o crescimento de células animais, nomeadamente de células humanas, e o seu mecanismo de acção é, actualmente, um assunto de maior importância na investigação biomédica sobre reparação de tecidos e cura de ferimentos. Os factores de crescimento de fibroblastos (FGFs), mitogénicos para vários tipos de células incluindo muitas das células de origem mesodórmica, têm sido identificados e foi sugerida a possibilidade de induzirem a mitose o que tem como resultado a reparação de tecidos. À actividade mitogénica dos fibroblastos foi inicialmente observada em extractos de tecido do sistema nervoso central. Mitogeneos de fibroblasto do cérebro foram pela primeira vez descritos por Trowell et al.,
J. Exp. Biol. 16; 60-70 (1939) e por Hoffman, Growth 4:361-376 (l94o). No seguimento dos trabalhos anteriores foi demonstrado que extractos pituitários possuem também uma acti-4vidade mitogénica potente sobre células fibroblastoidest Amelin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70: 2702-2706 (1973)·
A purificação parcial dos factores de crescimento pituitários e cerebrais mostrou que estes possuem actividade mitogenica para uma grande variedade de tipos de células diferenciadas incluindo células vasculares endoteliais, Gospodarowicz et al., Natl. Câncer. Inst, Monogr. 48: 109-130 (1978). 0 factor de crescimento de fibroblastos foi inicial mente considerado como sendo consttiuido por um único pepti do, formado a partir da proteina basica da mielina após proteolise limitada. Poi reoentemente demonstrado que o FGF existe em duas formas, FGF ácido (aFGP) e PGF básico (bFGF) e que ambas as formas podem ser isoladas e purificadas a partir do cerebro humano, Thomas and Gimenez-Gallego, TIBS 11: 81-84 (1986). Numerosos tipos de células respondem à estimulação com aFGF ou bFGF sintetizando DNA e dividindo-se, tais como fibroblastos primários, células endoteliais vasculares e da córnea, condrocitos, osteoblastos, mioblastos, musculos lisos, células gliais e neuroblastos, Esch. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 6507-6511 (1985);
Kuo et al.. Fed. Proc. 44: 695 (1985); Gensburger et al.. C.R. Acad. Sc. Paris 3θ3: 465-468 (1986). 0 aFGF puro do cerebro bovino actua não só como um potente mitogeneo para as eteilas endoteliais vasculares em cultura mas também induz o crescimento in vivo de vasos sanguíneos, Thomas, et. al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 6409-6413 (1985). A actividade mitogenica do aFGF purificado também pode ser utilizada para promover a cura de ferimentos, Thomas, U.S. Patent 4, 444, 760, factor de crescimento acido de fibroblastos foi originalmente purificado até à homogeneidade a partir de cérebro bovino com base na sua actividade mitogenica para fibroblastos de BALB/e 3T3, Thomas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 357-361 (1984). Este
Este factor de crescimento de origem cerebral foi purificado e denominado várias vezes em múltiplos laboratoriais com base na : actividade mitogenica para células endoteliais vasculares e astrogliais (factor de crescimento de células endoteliais e factor de crescimento astroglial l), origem (factor de crescimento de retina, factor de crescimento de alho II e, talvez, o factor de crescimento de cerebro) e capacidade de ligação a heparina-Sepharose (factor de crescimento de ligação à heparina da classe I e factor de crescimento alfa de ligação à heparina), Thomas and Gimenez-Gallego IIBS 11: 81-84 (1986).
A sequência de aminoácidos de aFGF bovino foi determinada, considerada possuidora de grande homologia com o FGF básico e relacionada com os mitogeneos de fibroblastos interleuquina 1-alfa e 1-beta, Gimenez-Gallego et al»,Science 230: :1385-1388 (1985)« A sequência completa de aminoácidos do aFGF humano foi determinada a partir da proteina purificada, Gimenez-Gallego et. al., Biochem. Biophy. Res. Com. 138:
: 611-617 (1986) e a partir do gene, Jaye et al.. Science 233: 541-545 (1986).
aFGF nativo, purificado a partir do cerebro ou recombinante (r-aFGF) requere a coadministração de heparina para uma óptima estimulação de fibroblastos Balb/C 3T3 e de células endoteliais vasculares em cultura. Os aFGF de cerebro ou recombinante possuem uma acti vidade de somente cerca de 1% a 5%· Nessas células em cultura, na ausência de heparina, se comparada com a actividade óptima na presença de heparina. Embora as doses requeridas para a actividade máxima de aFGF sejam relativamente baixas é preferível administrar aFGF em heparina uma vez que esta pode provocar efeitos secundários nocivos. 0 aFGF puro, para alem das condições padrão que destroem a actividade da neLor parte das proteinas tais como temperaturas elevadas, pH e presença de proteases á também lábil â liofilização e oxidação. 0 aFGF puro forma, através de ligações dissulfidicas provocadas por oxidação, ligações dentro das suas próprias cadeias ou entre cadeias diferentes e pode ser recuperado na sua forma activa por redução dissulfidica com ditiotreitol 20 mM. A heparina pode inibir a agregação de aFGF provocada pela formação de ligações dissulfidicas intermoleculare 5 Este glicosaminoglicano heterogeno também é reconhecido como sendo capaz de proteger o aFGF da desnaturação pelo calor e da degradação proteolitica pela tripsina. Consequentemente tanto heparina exógena ou endógena são necessárias para a actividade in vivo associada á reparação de tecidos. 0 presente invento coloca ao dispor formas mutantes únicas de aFGF recombinante que possuem uma actividade biologica aumentada na ausência de heparina se comparada com aFGF nativo.
Objectivo do invento
É, consequenetmente, um objecti vo do presente invento a conversão, através de mutação, de genes de aFGF bovinos e humanos capazes de codificarem para proteinas que são mais activas na ausência de heparina do que a proteína nativa ou recombinante. Outro objectivo é a incorporação de genes específicos em vectores de clonagem apropriados* Um objectivo adicional ó a transformação de um hospedeiro apropriado em cada um dos vectores recombinantes e a indução da expressão de genes de aFGF mutantes específicos. Outro objectivo é a isolação e purificação de aFGF bovino e humano biologicamente activo. Estes e outros objectivos do presente invento ficarão claros a partir da seguinte descrição.
Resumo do Invento
Novos genes que codificam para aFGF bovino e humano são construídos. Os genes únicos têm origem em genes que codificam para aFGF bovino e humano recombinante nativo através de mutações pontuais especificas. Cada gene construído é inserido num vector de expressão que é usado para transformar um hospedeiro apropriado. As células transformadas hospedeiras produzem um aFGF mutante recombinante unico, humano ou bovino, o qual é purificado e possui uma actividade biológica aumentada ou melhorada na ausência de heparina se comparada com formas não mutadas.
Descrição detalhada factor de crescimento acido de fibroblastos existe sob várias formas microheterogénicas que são isoladas a partir de tecidos de várias origens e tipos de células que se sabe conterem aFGrF. As formas microheterogenicas que são usadas dizem respeito a um único produto de um gene, o qual é uma proteina produzida a partir de uma única unidade de um gene de DNA que é modificada estruturalmente a seguir à tradução. Estas modificações estruturais, contudo, não resultam em nenhumas alterações significativas da actividade biologica do peptido. Actividade biologica e biologicamente activo são termos aqui usados alternadamente e definidos como a capacidade do aFGrF nativo, recombinante ou mutante recombinante para estimular a síntese de DNA em fibroblastos Balb/C 3T3 em repouso tal como descritos no Exemplo 7, para estimular qualquer dos tipos de células descritos acima ou para efectuar qualquer uma das funções dest
critas no meio cientifico. As modificações podem ter lugar quer in vivo quer durante o processo de isolamento e purificação. A modificação in vivo resulta na, mas não é a isso limitada, acetilação da extremidade N, proteolise, glicolisação ou fosforilação. A proteolise pode incluir a exoproteo lise, no caso de um ou mais aminoácidos terminais serem, sequencialmente, clivados enzimaticamente de forma a produzir formas microheterogenicas possuidoras de menos aminoacidos do que o produto do gene original. A proteolise também pode incluir a modificação endoproteolitica resultante da acção de endoproteases que clivam o peptido em locais específicos ao longo da sequência de aminoácidos. Modificações similares podem cirrer durante o processo de purificação o que resulta da mesma forma na produção de formas microhetero genicas. A modificação mais frequente que ocorre durante a purificação é a proteolise a qual é reduzida ao minimo pelo uso de inibidores de proteoses. Na maior parte das circunstâncias, uma mistura de formas microheterogenicas está presente apés a purificação de aFGF nativo. 0 aFGF nativo dz respeito ao aFGF isolado e purificado a partir de tecidos ou células que contenham aFGF.
invento considera a inclusão de todas as formas microheterogenicas animais do factor de crescimento acido de fibroblastos. As formas microheterogenicas de aFGF escolhidos incluem o bovino e a humana. A forma microheterogenica de aFGF bovino preferida inclui uma forma de 154 aminoácidos, uma forma de l4o aminoácidos e uma forma de 134 aminoácidos. A forma de 140 aminoácidos está representada na Tabela 1, Gimenez-Gallego et al., Science 230: 1385-1388 (1985) e é a preferida de entre todas as espécies bovinas.
Tabela I
Sequência de aminoácidos de aFGF Bovino
10 20 PheAsnLeuProLeuGl yAsnTyrLysLysProLysLeuLeuTyrCysSerAsnGl yGlyTyrPheLeuArglleLeu
40 50
ProAspGl yThrVal AspGl yThrLysAspArgSerAspGl nHi sll eGl nLeuGl nLeuCysAl aGl uSerll eGI yGT u
70 80
VaiTyrlleLysSerThrGluThrGlyGlnPheLeuAlaMetAspThrAspGlyLeuLeuTyrGlySerGlnThrProAsn
100
G1uGluCysLeuPheLeuGluArgLeuGluGluAsnHi sTyrAsnTbrTyrll eSerLysLysHi sAlaGluLysHisTrp
110 120 130 PheValG1yLeuLysLysAsnGlyArgSerLysLeuGlyProArgThrHi sPheGlyGlnLysAlalieLeuPheLeuPro
140
LeuProValSerSerAsp
A sequência de nucleotidos da forma de l4o aminoácidos, re combinante, de aFGF bovino é representada na Tabela II.
Tabela II
Sequência de Nucleotidos de aFG-Γ Bovino
20 40 60 80
AATTCATGTTCAATCTGCCACTGGGTAATTACAAAAAGCCAAAGCTTCTTTACTGCTCTAACGGTGGTTACTTTCTCCGC
GTACAAGTTAGACGGTGACCCATTAATGTTTTTCGGTTTCGAAGAAATGACGAGATTGCCACCAATGAAAGAGGCG
100 120 140 160
ATCCTGCCAGATGGTACCGTGGACGGCACCAAAGATCGTTCTGATCAACATATTCAACTGCAGCTGTGCGCCGAATCTAT TAGGACGGTCTACCATGGCACCTGCCGTGGTTTCTAGCAAGACTAGTTGTATAAGTTGACGTCGACACGCGGCTTAGATA
180 200 220 240C6GTGAAGTTTACATCAAATCTACCGAAACTGGTCAATTCCTTGCCATGGACACTGATGGCCTGCTGTACGGATCCCAGA GCCACTTCAAATGTAGTTTAGATGGCTTTGACCAGTTAAGGAACGGTACCTGTGACTACCGGACGACATGCCTAGGGTCT
260 280 300 320
CCCCAAACGAGGAGTGCCTTTTCCTGGAGCGCCTGGAGGAAAACCATTACAACACCTACATCTCTAAAAAGCATGCTGAG GGGGTTTGCTCCTCACGGAAAAGGACCTCGCGGACCTCCTTTTGGTAATGTTGTGGATGTAGAGATTTTTCGTACGACTC
340 360 380 400
AAACATTGGTTCGTAGGCCTTAAGAAAAATGGCCGCTCTAAACTGGGCCCTCGTACTCACTTTGGTCAAAAAGCTATCCT TTTGTAACCAAGCATCCGGAATTCTTTTTACCGGCGAGATTTGACCCGGGAGCATGAGTGAAACCAGTTTTTCGATAGGA
420 440
GTTCCTGCCACTGCCAGT6AGCTCTGACTAATAGATATCG CAAGGACGGTGACGGTCAÇTCGAGACTGATTATCTATAGCAGCT
-III ν'
A forma de 154 aminoácidos inclui os seguintes aminoácidos adicionais; Ala-Glu-Gli-Glu-Tre-Tre-Tre-Fen-Tre-Ala-Leu-Tre-Glu-Lis, com a extremidade carboxil em Lis ligada à extremidade onde está situado o aminoácido Fen. Na primeira posição da forma de l4o aminoácidos. 0 residuo do aminoácido terminal alanina da forma de 154 aminoácidos de aFGF bovino pode ser acetilado. A forma de 134 aminoácidos é idêntico à forma de l4o aminoácidos excepto que os 6 primeiros aminoácidos da extremidade amino foram removidos. Quando aFGF nativo é isolado as quantidades relativas das formas microheterogenicas variam, dependendo do processo usado, mas geralmente contêm duas destas formas» aFGF humano exibe uma microheterogeneidade similar ao aFGF bovino. As formas microheterogenicas preferidas de aFGF humano incluem uma forma de 154 aminoácidos, uma forma de 140 aminoácidos e uma forma de 139 aminoácidos. A forma humana de l4o aminoácidos difere da bovina em onze aminoácidos, tal como está representada na TABELA VIII. A forma de 154 aminoácidos contém a sequência exacta da forma humana de l4o aminoácidos mais os l4 aminoácidos adicionais associados à forma bovina de 154 aminoácidos, com uma excepção, 0 aminoácido na posição cino da extremidade N ou na posição -10 como determinada pelo aminoacido l40 Fen na forma humana é a isoleucina e é substituída por treonina na forma bovina. A sequência terminal N humana adicional de l4 aminoácidos éi Ala-Glu-Gli-Glu-Ile-Tre-Tre-Fen-Tre-Ala-Leu-Tre-Glu-Lis. Os aminoácidos adicionais da forma de 154 aminoácidos são numerados a partir de Ala terminal N, -l4, até à Lis terminal carboxil -1* 0 residuo de alanina na extremidade amino na posição -l4 pode ser acetilada. A terceira forma de aFGF humano contém 139 aminoácidos e é equivalente à forma humana de l4o aminoácidos mas com o residuo Fen na extremidade amino removido. 0 residuo de aspargina na extremidade amino pode ser desanimada para formar acido aspartico na forma de aFG-F de 139 aminoácidos humanos. As formas de l4o e de 139 aminoácidos são as mais preferidas dentre as formas microheteropenicas humanas. A forma de l4o aminoácidos é apresentada na Tabela III, Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 138: 6ll-617 (1986).
Tabela III
Sequencia de aminoácidos de aPGT humano
10 20 PheAsnLeuProProGlyAsnTyrLysLysProLysLeuLeuTyrCysSerAsnGlyGlyHi sPheLeuArglleLeu
40 50
ProAspGI yThrVal AspGI yThrArgAspArgSerAspGl nHi sll eGI nLeuGl nLeuSerAl aGI uSerVal G1 yGl u
70 80
VaiTyrlleLysSerThrGluThrGl yGlnTyrLeuAlaMetAspThrAspGlyLeuLeuTyrGlySerGlnThrProAsn
100
G1uGluCysLeuPheLeuGluArgLeuGluGluAsnHi sTyrAsnThrTyrlleSerLysLysHisAlaGIulysAsnT rp
110 120 130
PheVal GlyLeuLysLysAsnGlySerCysLysArgGlyProArgThrHisTyrGl yGlnLysAlalleLeuPheLeuPno
140
LeuProValSerSerAsp
A sequência de aminoácidos da forma de l^O nucleotidos, re combinante, de aPGP humano ê mostrada na Tabela IV.
Tabela IV
Sequência de Núcleotidos de aFGF humano
20 40 60 80 aattcatgttcaatctgccaccgggtaattacaaaaagccaaagcttctttactgctctaacggtggtcactttctccgc gtacaagttagacggtggcccattaatgtttttcggtttcgaagaaatgacgagattgccaccagtgaaagaggcg
100 120 140 160 atcctgccagatggtaccgtggacggcaccagagatcgttctgatcaacatattcaactgcagctgtccgccgaatctgt taggacggtctaccatggcacctgccgtggtctctagcaagactagttgtataagttgacgtcgacaggcggcttagaca
180 200 220 240 cggtgaagtttacatcaaatctaccgaaactggtcaataccttgccatggacactgatggcctgctgtacggatcccaga gccacttcaaatgtagtttagatggctttgaccagttatggaacggtacctgtgactaccggacgacatgcctagggtct
260 280 300 320 ccccaaacgaggagtgccttttcctggagcgcctggaggaaaaccattacaacacctacatctctaaaaagcatgctgag ggggtttgctcctcacggaaaaggacctcgcggacctccttttggtaatgttgtggatgtagagatttttcgtacgactc
340 360 380 400 aaaaattggttcgtaggccttaagaaaaatggcagctgtaaacgcggccctcgtactcactatggccaaaaagctatcct tttttaaccaagcatccggaattctttttaccgtcgacatttgcgccgggagcatgagtgataccggtttttcgatagga
420 440 gttcctgccactgccagtçagctctgactaatagatatcg caaggacggtgacggtcactcgagactgattatctatagcagct processo preferido para a obtenção de um gene que codifique para o aFGF de mamiferos e a sintese do proprio gene uma vez que isso permite a optimização da proteína traduzida e facilidade da mutagenização. 0 gene pode ser sintetizado com base na sequência de aminoácidos da forma microheterogenica de aFGF obtida de qualquer animal incluindo o homem. 0 método preferido consiste no uso da sequência de aminoácidos de aFGF bovino e mutagenizar a base da sequência pontulamente, quimicamente de modo a produzir genes de outras especies, Linemeyer et al., Biotechnol. 5: 960-965 (1987).
Os genes sintéticos são baseado:; na sequência de aminoácidos bovinos determinada, descrita por Gimenez-Gallego et al., Science 230: 1385-1388 (1985) e a sequência de aminoácidos humana descrita por Gimenez-Gallego et al., Brochem. Biophys. Res. Comm,, 138:611-617 (1986) e representada nas Tabelas I e III. A sequência de aminoácidos unica da forma bovina de aFGF de l4o aminoácidos deriva da tradução reversa da sequência de aminoácidos através de uma técnica semelhante à de Itakura et al., Science 198: 1056-1063 (1977). As várias sequências de nucleotidos novos correspondem à sequência de aminoácidos nativo de aFGF bovino e são mostradas na Tabela seguinte:
Tabela V
10 15 20
| Phe Asn Leu TTQ AAQ CTN | Pro Leu Gly Asn | Tyr Lys Lys | Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly | |||||||||||||||
| CCN | CTN GGN AAQ TTP | TAQ | AAP | AAP | CCN | AAP | CTN CTN TAQ TGQ TCN AAQ GGN GGN | |||||||||||
| TTP | TTP | TTP | AGQ | |||||||||||||||
| 25 | 30 | 35 | 40 | |||||||||||||||
| Tyr Phe | Leu | Arg | Ile | Leu | Pro | Asp | Gly | Thr | Vai | Asp | Gly | Thr | Lys Asp | Arg | Ser | Asp | Gin | |
| TAQ TTQ | CTN | CGN | ATQ | CTN | CCN | GAQ | GGN | ACN | GTN | GAQ | GGN | ACN | AAP | GAQ | CGN | TCN | GAQ | CAP |
| TTP | AGP | ATA | TTP | AGP | AGQ | |||||||||||||
| 45 | 50 | 55 | 60 | |||||||||||||||
| His Ile | Gin | Leu | Gin | Leu | Cys | Ala | Glu | Ser | Ile | Gly | Glu | Vai | Tyr | Ile | Lys | Ser | Thr | Glu |
| CAQ ATQ | CAP | CTN | CAP | CTN | TGQ | GCN | GAP | TCN | ATQ | GGN | GAP | GTN | TAQ | ATQ | AAP | TCN | ACN | GAP |
| ATA | TTP | TTP | AGQ | ATA | ATA | AGQ | ||||||||||||
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||||
| Thr Gly | Gin | Phe | Leu | Ala | Met | Asp | Thr | Asp | Gly | Leu | Leu | Tyr Gly | Ser | Gin | Thr | Pro | Asn | |
| ACN GGN | CAP | TTQ | CTN. GCN | ATG | GAQ | ACN | GAQ | GGN | CTN | CTN | TAQ GGN | TCN | CAP | ACN | CCN | AAQ |
TTP TTP ΤΤΡ AGQ
| 85 | 90 | 95 | 100 | ||||||||||||||||
| Glu | Glu | Cys | Leu | Phe | Leu | Glu | Arg | Leu | Glu | Glu | Asn | Hi s | Tyr | Asn | Thr | Tyr | Ile | Ser | Lys |
| GAP | GAP | TGQ | CTN | TTQ | CTN | GAP | CGN | CTN | GAP | GAP | AAQ | CAQ | TAQ | AAQ | ACN | TAQ | ATQ | TCN | AAP |
| TTP | TTP | AGP | TTP | ATA | AGQ | ||||||||||||||
| 105 | 110 | 115 | 120 | ||||||||||||||||
| Lys | Hi s | Ala | G1 u | Lys | His | Trp | Phe | Vai | Gly | Leu | Lys | Lys | Asn | Gly | Arg | Ser | Lys | Leu | Gly |
| AAP | CAQ | GCN | GAP | AAP | CAQ | TGG | TTQ | GTN | GGN | CTN | AAP | AAP | AAQ | GGN | CGN | TCN | AAP | CTN | GGN |
| TTP | AGP | AGQ | TTP | ||||||||||||||||
| 125 | 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||||
| Pro | Arg | Thr | Hi s | Phe | Gly | Gin | Lys | Ala | Ile | Leu | Phe | Leu | Pro | Leu | Pro | Vai | Ser | Ser | Asp |
| CCN | CGN | ACN | CAQ | TTQ | GGN | CAP | AAP | GCN | ATQ | CTN | TTQ | CTN | CCN | CTN | CCN | GTN | TCN | TCN | GAQ |
| AGP | ATA | TTP | TTP | TTP | AGQ | AGQ |
| onde Q = C ou T, | ||
| P = ,A | ou | G, e |
| N = A, | T r -u t | C, ou G |
gene bovino é construído com uma porção guia que contem um único sitio de clivagem para enzimas de restrição e um codão para metionina na extremidade N como sitio de inicio de tradução, 0 gene contém ainda uma cauda que contem codões de paragem da tradução na vizinhança uns dos outros e dois de clivagem para enzimas de restrição, A redundância do código genetico permite a escolha de sequências de bases o que, por sua vez, permite a incorporação de sítios de clivagem para enzimas de restrição únicos ao longo do gene, A sequência de bases do gene bovino preferida com a localização dos sitios de clivagem para enzimas de restrição é representada na tabela seguinte:
Η >
(ϋ ι—I 0) rQ (ϋ Η
| U φ | μ- α | 3 |
| (Λ | ο μ- | <ζ |
| □) U | £ 6 | α |
| < | α | ο |
| Ο. | Π— | < |
| (Λ | < | Π— |
| < | Ο | ο |
| ΙΛ | < | μ- |
| < | μ- | |
| ς. | • α | ο |
| χ Π— | CJ < | |
| »» | ο | Ο |
| ι- | ο | α |
| Ο | ο | α |
| Ο. | α | ο |
| ΙΛ | < | μ- |
| < | Ο | α |
| Γ“ | Ο | U |
| <η | Ο Ι- | < |
| > | Ο ο | ο |
| L | «— α | ο |
| -C | ο | ο α |
| μ— | < | μ- c |
| >> | μ- | < ο. |
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| ο | ο | α |
| Ο. | μ- | < |
| (Λ < | • 3 | μ- α |
| Ο | ι—η < | μ- |
| U | (*> Ο | ο |
| X | ι—j ο | Ο |
| 3 | Ο | α |
| Φ -4 | μ- ο | 3 |
| Φ | ο | ο |
| γ- | μ- | < |
| η-< | < | μ— |
| Ο) | ο α | ο ι-ι |
| U | οο ο | α |
| < | ο | ο <—ι |
| 3 | CJ | ο |
| Φ | μ- | < |
| _i | α | ο |
| Φ | μ- | |
| -C | μ- | rf |
| α. | μ— | rf |
| ι» | ο | ο |
| >» | • < | μ- |
| Η- | π- | < |
| > | ι- | < |
| r— | ο | α |
| Ο | ο | α |
| >, | μ- | < |
| ί- | Ο | α |
| Ο | Ο | α |
| C | α | ο |
| (Λ | < | μ- |
| < | ο < | μ- |
| U Φ | GA | |
| ΙΖ> | ι- | < |
| «Λ | Ο | ο |
| >, | Ο | α |
| CJ | ί- | < |
| α | ο | |
| >» | < | μ- |
| Η- | α | < |
| 3 | • π- | »α, |
| Φ | ι- α | 3 |
| □ | μ- | < α |
| Φ | ι- | < -Μ |
| -J | α | Ο w |
| Λ | ο | ο -α |
| >» | < | μ- c |
| _1 | < | μ- ·γ- |
| Ο | μ- ι | |
| U | ο α | ο |
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| ΙΛ | ο | ο |
| >. | < | μ- |
| -J | < | μ- |
| (Λ | < | μ- |
| >» | < | μ- |
| —1 | < | μ- |
| α | ο | |
| >> | γ-ι < | μ- |
| μ- | . μ- | < |
| ε | ι—ι μ- | < |
| ΙΛ | < | ι— |
| < | < | μ- |
| >1 | Π— | < |
| Γ— | Ο | Ο ί—» |
| Ο | Ο | α οα |
| 3 | Ο | α <-* |
| Φ -1 | Ι- Ο | ã |
| Ο | Ο < | μ— |
| U | 04 α | ο |
| Ο. | Ο | ο |
| 3 | Ο | α |
| Φ —J | μ- α | 3 |
| C | Π— | < |
| ΙΛ | μ- | |
| < | < | π- |
| Φ | Ο | ω |
| -C | • μ- | < |
| 0. | I— | |
| 4-» | ο | α |
| Φ | μ- | < |
| Σ | < | μ— ** |
| α | Ο Μ | |
| μ- | α | |
| μ- | ο | |
| < | α | |
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| U | (3 | ||||
| χ | α ο | ||||
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| Γ— | CM | < | μ- | ||
| ο | L. | ο | |||
| U | U | tn | I—♦ | ||
| φ | |||||
| <Λ | 3 < | Β | |||
| >> | Φ | ||||
| /— | C0 | ||||
| Ο | Γ α | ||||
| U | • | α ο | |||
| >» | < | 1- | |||
| μ— | Η | < | |||
| 3 | Ο Ο | ||||
| Φ | μ· | < | |||
| —1 | α ο | ||||
| 3 | ο α | ||||
| Φ | μ- | «< | |||
| —1 | ο ο | ||||
| >» | α | (3 | |||
| r— | Ο | ο α | |||
| Ο | CM | Ο α | |||
| α. | CM | μ- | < | ||
| (Λ | < | μ- | |||
| < | ο α | ||||
| U | μ- | < | |||
| χ: | α ο | ||||
| ί- | < | μ- | |||
| ο. | α ω | ||||
| (Λ < | , | ο | ο | ||
| 4-> | ο α | I—I | |||
| Φ | μ- | < | Ο | ||
| Σ | < | μ- | υ | ||
| Π3 | α ο | ζ | |||
| Γ— | α ω | ||||
| < | ο α | ||||
| 3 | μ- | 1—1 | |||
| Φ | μ- | C0 | |||
| — | α ο | 1—1 | |||
| Φ | Ο | α | ο | ||
| -C | Ο | μ- | < | ||
| CL | 04 | Π— | < | ||
| C | < | μ— | |||
| γ— | < | μ- | |||
| ω | α | α | |||
| >» | μ- | < | |||
| ί- | γ—, | <3 | α | ||
| Ο | Ρ% | ο | α | ||
| U χ: | 1—1 | μ- α | 3 | ||
| μ- | < | μ- | |||
| 3 | < | μ- | |||
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| U | α | <3 | |||
| U | 13 | ||||
| μ- | < | Π- | |||
| U | μ- | < | |||
| Φ | α | (3 | |||
| 00 | α | μ— | < | ||
| ΙΛ | C0 | < | α | ||
| >» | <£ | ι- | |||
| —1 | < | ι- | |||
| φ | α | ο | |||
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| >» | < | μ- | |||
| μ- | μ- | < | |||
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| r— | < | I— | |||
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| ο | <3 | α | |||
| φ | α | ο | |||
| ο | α | < | |||
| μ-1 | νθ | < | π- | ||
| U | 1— | μ- | < | ||
| Φ | α | ο | l-Η | ||
| α | < | 4- | |||
| 3 | rf | μ- | C | ||
| r- | rf | μ— | f— | ||
| Ο | (3 | α | X | ||
| Í0 | α | ο | |||
| α | C3 | ||||
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| (Λ | α | ο | ο | ||
| >» | ο | α | 1—1 | ||
| α | ί- | < | |||
| 3 | α | α | μ-« | ||
| Φ | 1—» | ί- | 3 | μ-« | |
| —1 | ΙΩ | α | 3 | ||
| C | I—J | <3 | α | > | |
| < | μ— | α_ | |||
| ω | α | ο | >-4 | ||
| 3 | ο | (3 | α | ||
| Φ | μ- | 3 | V) | ||
| —1 | «— | α | a. | ||
| C | «ί | π- | |||
| ί- | < | μ· | |||
| Ο | α | ο | |||
| φ | μ- | < | |||
| Γ— | μ- | ||||
| μ-ι | < | I- | |||
| VI | μ- | < | |||
| ·*— | • | < | μ— | ||
| X | α | <3 | |||
| C | «I | μ- | |||
| < | μ· | ||||
| <3 | α | ο | μ-4 | ||
| α. | μ- | < | r· | ||
| (Λ | á | π— | u | ||
| < | α |
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| (Λ | < Ρ | |||||
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| < | 3 3 | |||||
| >. | α | 3 | ||||
| Γ“ | 3 3 | |||||
| 3 | 3 3 | |||||
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| < | Ρ | |||||
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| —1 | Ρ | |||||
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| 3 Φ 3 | Ρ Ο Ρ Τ 3 | 4 | Η-4 | |||
| Ο | >» | ΓΩ 3 | 3 | 3 | ||
| Γ” | α | ο | 3 | |||
| 3 | 3 | 3 | </) | |||
| Γ— | < | Ρ | ||||
| Φ | Ρ | < | ||||
| > | 3 | 3 | ||||
| Φ X | -Η | AG | ||||
| X | • Ρ | < | ||||
| α_ | 3 | 3 | ||||
| U | 3 | 3 | ||||
| Ρ | Ρ | < | ||||
| σι | Ρ | < | ||||
| •ι— | < | Ρ | ||||
| X | 3 | 3 | ||||
| «Λ | <C | Ρ | ||||
| < | ρ | |||||
| < | Ρ | |||||
| 3 | Ο ο | 3 | 1—1 | |||
| r~ | 04 < | Ρ | 04 | |||
| 3 | ΓΩ 3 | ο | ||||
| Α3 | Ρ | < | 1_4 | |||
| ι—“ | 3 | 3 | ||||
| <ε | 3 | 3 | ρ | |||
| • | t/l | ρ | «τ | X | ||
| Ρ | «Ρ— | < | Ρ | ο. | ||
| X | 3 | 0Ω | ||||
| fí | σι | m | 3 | 3 | ||
| ο | >> | Γ—· | • < | Ρ | ||
| ο | Γ— | < | Ρ | |||
| Ο | ω | ΙΡ | < | Ρ | ||
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| U | Ι- | < | ||||
| Η | Φ | Ο | 3 | |||
| ΙΩ | Ρ | < | ||||
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| U | ο 3 | 3 | ||||
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| (D | Ρ | Ρ | < | |||
| L· | 3 | 3 | ||||
| ο | X | Ο | 3 | |||
| ρΜ (0 | Ρ C | < 3 | ||||
| Η | ω C | < < | Ρ ί- | |||
| • 3 | Ο | |||||
| < | Ρ | |||||
| Ρ | Ρ | < | ||||
| σ) | Ρ | < | ||||
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| C σι | Ρ | |||||
| < | < | Ρ | ||||
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| 3 | ο | |||||
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| 3 | ο | 3 | ||||
| 3 | ο | ο | ||||
| Φ | Ρ | < | ||||
| _Ι | ο | 3 | ι—ι | |||
| cn | ο | 3 | k—| | |||
| U | 3 | Ο | Φ | |||
| < | • 3 | 3 | Φ | |||
| 3 | 3 | 3 | X | |||
| τ— | á | Ρ | ||||
| <~2 | <3 | |||||
| 3 | 3 | 3 | ||||
| Φ -J | Ρ ο | á | r-t | |||
| Φ | 3 | 3 | α | |||
| X | Ρ | rf | ||||
| α. | Ρ | rf | i-U | |||
| 3 | Ο Ρ | rf | ||||
| Φ | 3 Ρ | rf | ||||
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| σι | 3 | 3 | ||||
| >» | <3 | 3 | ||||
| 3 | <—I | Ρ | < | |||
| 3 | σι | ο | 3 | |||
| f* 3 | á | Ρ ο | ||||
| □ | 3 | 3 | ||||
| 3 | • á | Ρ 3 | ||||
| ο | C | 3 | 3 | |||
| C0 | (4 | ρ | ||||
| < | <? | Ρ | ||||
| Ο | Ρ | |||||
| U | 3 | 3 | ||||
| ο. | ο | 3 |
| Ρ | Ρ |
| Ο | Γ_ |
| 3 | Φ |
| < | </> |
| Ο <3 <3 | |
| ’Τ 3 3 | |
| Ό* Ρ < | > |
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| Ρ < | Ο |
| <Χ Ρ | υ |
| 3 3 | ω |
| < Ρ |
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| Η | • < | |||
| Φ | U | ) 3 | ||
| σ> | Η | <Χ | Ρ | |
| U | 3 3 | u | ||
| Φ | 3 3 | |||
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| γ— | 04 3 3 | |||
| <β | ST Η | * < | r—ι | |
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| U | Ρί | ) 3 | l__J | |
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| 3 | Γ— | 3 3 | ||
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| _J | U | 3 | ||
| Ο | • < | Ρ | ||
| U | 3 3 | |||
| α. | L· | 3 | ||
| 3 | 3 3 | |||
| Φ | Ρ | < | ||
| 3 | 3 | 3 | ||
| Φ | 3 3 | |||
| X | Ρ | < | ||
| α_ | Ρ | <C | ||
| 3 | 3 3 | |||
| Φ | β Ρ | |||
| 3 | 0 3 3 | |||
| Φ | 3 3 | |||
| Γ— | Ρ | < | ||
| Ρ | < | Ρ | ||
| π3 Ρ“· | Ρ 3 | |||
| < | 3 | 3 | ||
| «Λ | < | Ρ | ||
| >» | < | Ρ | ||
| 3 | • < | ρ | ||
| C | < | Ρ | ||
| Γ“ | < | |||
| 3 | 3 | 3 | ||
| >» | Ρ | < | ||
| r^· 3 | -9 | |||
| Φ | Ρ | |||
| X | ρ | rf | ||
| α. | ρ | rf | ||
| <4 | Ο 3 | 3 | ||
| •1“ | G0 < | Ρ | ||
| X | ΓΩ 3 | 3 | ||
| L X | Ρ 3 | á | ||
| Ρ | < | Ρ | f-t | |
| Ο) | Ρ | < | <3· | |
| 3 | 3 | |||
| < | 3 | 3 | ||
| ο V | rn | Ρ • 3 | ã | |
| α_ | ΓΩ | 3 | 3 | P |
| >ι | 3 | 3 | ro | |
| Ρ | 13 | 3 | 3 | Q. |
| 3 | 3 | 3 | < | |
| 3 | 3 | 3 | ||
| Φ 3 | Ρ 3 | á |
A sequência do gene para cada cadeia da molécula de cadeia dupla é dividida ao acesso em 8 sequências de nucleotidos. Os oligonucleotidos são construídos com finais sobrepostos para permitir a formação de DNA de cadeia dupla. A tabela seguinte contem um dos muitos arranjos possíveis de oligonucleotideos que é usado para produzir o gene aFG-F bovino.
Tabela VII
| OLIGO-1 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 58 |
| 5' AATTCATGTT | CAATCTGCCA | CTGGGTAATT | ACAAAAAGCC | AAAGCTTCTT | TACTGCTC 3' |
| OLIGO-2 10 | 20 | 30 | 40 | 45 | |
| 5' AGAAGCTTTG | GCTTTTTGTA | ATTACCCAGT | GGCAGATTGA | ACATG 3' | |
| OLIGO-3 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 5' TAACGGTGGT | TACTTTCTCC | GCATCCTGCC | AGATGGTACC | GTGGACGGCA | CCAAAGATCG 3’ |
| 0LIG0-4 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 59 |
| 5' TGCCGTCCAC | GGTACCATCT | GGCAGGATGC | GGAGAAAGTA | ACCACCGTTA | GAGCAGTAA 3' |
| OLIGO-5 10 | 20 | 30 | 40 | 46 | |
| 5' TTCTGATCAA | CATATTCAAC | TGCAGCTGTG | CGCCGAATCT | ATCGGT 3' | |
| 0LIG0-6 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 65 |
| 5' GTAAACTTCA | CCGATAGATT | CGGCGCACAG | CTGCAGTT6A | ATATGTTGAT | CAGAACGATC TTTGG 3' |
| OLIGO-7 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 67 |
| 5' GAAGTTTACA | TCAAATCTAC | CGAAACTGGT | CAATTCCTTG | CCATGGACAC | TGATGGCCTG CTGTACG 3 |
| 0LIG0-8 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 62 |
| 5' GATCCGTACA | GCAGGCCATC | AGTGTCCATG | GCAAGGAATT | GACCAGTTTC | GGTAGATTTG AT 3' |
| 0LIG0-9 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 52 |
| 5' GATCCCAGAC | CCCAAACGAG | GAGTGCCTTT | TCCTGGAGCG | CCTGGAGGAA | AA 3' |
| OLIGO-IO 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 58 |
| 51 GTTGTAATGG | TTTTCCTCCA | GGCGCTCCAG | GAAAAGGCAC | TCCTCGTTTG | GGGTCTGG 3' |
| OLIGO-11 10 | 20 | 30 | 40 | 48 | |
| 5' CCATTACAAC | ACCTACATCT | CTAAAAAGCA | TGCTGAGAAA | CATTGGTT 3' | 1 |
| 0LIG0-12 10 | 20 | 30 | 40 | 46 | |
| 5' GGCCTACGAA | CCAATGTTTC | TCAGCATGCT | TTTTAGAGAT | GTAGGT 3‘ | |
| OLIGO-13 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 53 |
| 5' CGTAGGCCTT | AAGAAAAATG | GCCGCTCTAA | ACTGGGCCCT | CGTACTCACT | TTG 3' |
| 0LIG0-14 10 | 20 | 39 | 40 | 50 | 55 |
| 5‘ GCTTTTTGAC | CAAAGTGAGT | ACGAGGGCCC | AGTTTAGAGC | GGCCATTTTT | CTTAA 3' |
| 0LIG0-15 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 56 |
| 5' GTCAAAAAGC | TATCCTGTTC | CTGCCACTGC | CAGTGAGCTC | TGACTAATAG | ATATCG 3' |
| OLIGO-16 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
5' TCGACGATAT CTATTAGTCA GAGCTCACTG GCAGTGGCAG GAACAGGATA 3'
Os oligonucleotidos ilustrados na Tabela VII estão presentes meramente como um exemplo de subunidades de oligonucleotidos e não devem ser interpretados como limitantes destas. A sequencia de bases composta que mostra a sobreposição e arranjo dos oligonucleotidos está ilustrada na Tabela II.
gene bovino é reunido em duas etapas: primeiro a metade correspondente à porção da extremidade N da proteina e segundo a metade da extremidade C. Geralmente, os oligonucleotidos são tratados com cinasa de polinucleotidos de T4 na presença de ATP ou de ATP marcado 32 com P. Durante a primeira reacção de cada etapa» os oligonucleotidos que formam uma das cadeias do gene são tratados com cinasa com excepção do oligonúcleotido mais próximo da extremidade 5*. Na segunda reacção os oligonucleotidos que formam a segunda cadeia são tratados com cinasa, com excepção do oligonucleotido mais proximo da extremidade 5’* Após o tratamento com cinasa os oligonucleotidos são usados sendo que cerca de 1$ dos oligonucleotidos adicionados são marca32 dos com P com vista a uma posterior identificação dos produtos. A fusão é levada a cabo num tampão apropriado como por exemplo um que contém, mas não é limitado na sua composição por, cerca de 6o mM Tris, pH 7,6 aproximadamente, cerca de 5 mM ditiotreitol (DTT), cerca de 10 mM MgCl2 e cerca de 30 pM ATP, a cerca de 90°C durante 4 minutos seguida de passagem rápida para cerca de ÓO^C e arrefecimento lento ate cerca de 30^0. A ligação é levada a cabo num tampão apropriado como por exemplo que contém, mas não é limitado na sua composição por, cerca de 6o mM TRIS, pH 7,6 aproximadamente, cerca de 10 mM DTT, cerca de 10 mM MgCl2, cerca de lmM ATP e cerca de 0,03 unidades de ligase de DNA de T4, a cerca de 202C durante cerca de 1 hora e meia.
Os oligonucleotidos ligados são purificados por electroforese através de um gel de poliacrilamida seguido de precipitação com etanol. Os oligonucleotidos são redissolvidos num tampão que contém cerca de 20 μΐ de formamida a cerca de 80$, cerca de 50 mM TBIS-borato com pH a cerca de 8,3» cerca de 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), cerca de 0,1$ (p/V) de cianol de xileno e cerca de 0,1$ (p/V) de azul de bromofenol. Cada amostra é aquecida a cerca de 9O5C durante cerca de 3 minutos e submetido a electroforese através de um gel de policarilamida-ureia 10$ a cerca de 75 watts durante cerca de 5 horas. As bandas de 231 bases de extremidade N são removidos, reunidas e eluidas a cerca de 4SC em cerca de 0,5M acetato de amónia que contém lmM EDTA a um pH próximo de 8. As bandas da extremidade C de 209 bases são tratadas da mesma forma.
As sequências sintéticas do gene que codifica quer para as porções da extremidade N quer para as da extremidade C de aFG-F são incorporadas no plasmideo pBR322. É especialmente desejado e planeado que no âmbito deste invento seja incluido o uso de outros plasmideos nos quais o gene para o aEGE pode ser incorporado e que permitem a expressão do gene do aFGF. Os oligonucleotidos religados, cerca de 300 fmole e cerca de 100 fmole da extremidade N de 231 pares de base recoljiida, são ligados cada um a cerca de 100 fmole de EcoRI-BamHl pBR322 de cerca de 3,9 kilobases (Kb) purificado através de um gel de agarose, no caso da extremidade N. A extremidade C de 209 pb é construida da mesma forma usando BamHl-Sall pBR322. A ligação é levada a cabo snm tampão que contém cerca de 25 mM TRIS, a um pH aproximado de 7,8, cerca de 1 mM DTT, cerca de 10 mM MgCl^, cerca de 0,4 mM ATP, com cerca de 1 unidade de ligase de DNA de T4 durante cerca de 1 hora a cerca 20^0. Cada vector ligado a metade do gene é usado para transformar células bacterianas competentes, tais como B.coli RR1 (Bethesda Research Laboratories, BRL) segundo os procedi-26-
mentos dos fornecedores. As células transformadas são seleccionadas para o crescimento na presença de ampicilina e testadas para a presença quer do fragmento EcoRl-BamHl de 231 pares de bases (pb) inserido quer para o fragmento inserido BamBT-SalL de 209 pb, através de análise por restricção de Mini-lisados de preparações do plasmideo,
A sequência de DNA dos clones que contêm os fragmentos inseridos do tamanho apropriado é determinado usando a técnica de sequenciação quimica de DNA de Maxam and Gilbert, Proc. Natl, Acad, Sei, USA 74: 560-564 (1977).
gene sintético final de eompr mento total do aFGF foi clonado por clivagem do clone que contem a metade com a extremidade N, com as enzimas de restrição BamHE, e Sall, seguida de tratamento com fosfatase alcalina e ligação deste com o fragmento purifiçado através de gel, de 209 pb BamHI-SalI que contêm a metade da extremidade C, Este material ligado é usado para transformar células RR1 competentes como anteriormente.
A expressão do gene aFGF sintético e acompanhada de um diferente numero de sistemas de expressão de promotores, 1§ desejado e planeado que no âmbito deste invento sejam incluidos os usos de outros sistemas de expressão de promotores para a expressão do gene aFGF intacto. A construção preferida usa o promotor tac de E, coli, um hibrido entre regiões do promotor de trp e do promotor lac tal como descrito por deBarr et al,, Proc, Natl. Acad, Sei. USA 80: 21-25 (1983)· 0 plasmideo pKK223-3 (Pharmacia) que contém o promotor tac e o sinal de terminação da transcrição mnB de rRNA foi modificado com o inttuito de remover o sitio de restrição da enzima Sall derivado de pBR322. 0 sinal de terminação RRNB de rRNA permite a expressão de promotores fortes, tal como foi demonstrado por Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 28: 4936-4740 (1981) e por Brosius, Gene 27: 1Ó1-172 (1984).
DNA do plasmideo pKK 223-3 é clivado com enzimas de restrição de modo a produzir um fragmento de DNA de 2,7 kb para gerar o clone pKK2.7. 0 gene de aFGF respectivo é clivado a partir do vector pBR322 que o contém e transferido para o plasmideo pKK2.7 após a restrição de pKK2.7 com EcoRI e SaH. 0 recombinante resultante, representado na fig. 1, é usado para transformar células de E.coli JM 105 (Pharmacia) ou DHS (BRL) e é expresso.
A mutagenização especifica num sitio é um modo eficiente para converter a sequência de ami pioácidos de aFGF de uma espécie animal numa sequência de aminoácidos de aFGF de outras espécies. A descrição seguinte diz respeito à conversão mutagenica especifica num sitio de aFGF bovino da forma de l4o aminoácidos (numerada de acordo com a forma nativa) em aFGF humano, tendo em consideração, contudo, que este processo pode ser usado para converter aFGF de qualquer especie de mamíferos noutro de qualquer outra espécie. A única limitação desta conversão á o facto de ambas as sequências de aminoácidos dos aFGFs deverem ser conhecidos. A tabela seguinte é uma lista de aminoácidos que devem ser substituidos e respectiva localização no mapa de aminoácidos de aFGF bovino, Tabela VI, no qual as substituições são feitas:
Tabela VIII
| Localização | Aminoácidos Substituídos | |
| do AminoÁcido | aFGF humano | para aFGF bovino |
| 5 | Pro | Leu |
| 21 | His | Tyr |
| 35 | Arg | Lys |
| 47 | Ser | Cys |
| 51 | Vai | Ile |
| 64 | Tyr | Phe |
| 106 | Asn | His |
| 116 | Ser | Arg |
| 117 | Cys | Ser |
| 119 | Arg | Leu |
| 125 | Tyr | Phe |
Tal como na sequência do gene bovino, oito oligonucleotidos que representam a sequência do gene humano são construidos segundo o mesmo procedimento usado para os oligonucleotidos bovinos. A tabela seguinte contém um dos muitos possíveis arranjos de oligonucleotidos que é usado para produzir o gene de aFGP humano.
TABELA IX
OLIGO-1
5' CTGCCACÇGGGTAATTAC 3'
OLIGO-2
5’ CGGTGGTCACTTTCTCCG 3‘
OLIGO-3
5' CGGCACCAGAGATCGTTC 3'
OLIGO-4
5' GCAGCTGTÇCGCCGAATCTGTCGGTGAAG 3'
OLIGO-5
5' CTGGTCAATACCTTGCCATGG 3'
OLIGO-6
5' GCTGAGAAAAATTGGTTCG 3'
OLIGO-7
5' GGCCGCGTTTACAGCTGCCATTTTTCTTAAGG 3'
OLIGO-8
5' CGTACTCACTATGGÇCAAAAAGCTATCC 3' gene bovino sintético de aFGF clonado é convertido num gene humano sintético de aFGF através de uma série de mutações pontuais dirigidas.
A mutagene dirigida de oligonucleotidos do gene clonado per mite a alteração da sequência de bases de aFGF bovino de tal modo que a sequência de aminoácidos resultante contém os aminoácidos substituidos indicados na Tabela VIII e é de aFGF humanos. A delecção é feita no gene bovino de modo a remover a fenilalinina amino terminal para a produção da forma microheterogenica de aFGF humano de 139 aminoácidos. Uma mutação pontual é levada a cabo para substituir a aspar gina da posição dois por ácido âspártico. Em alternativa, a aspargina é desanimada para formar ácido aspartico. Os métodos para levar a cabo estes procedimentos estão descritos abaixo ou são conhecidos no meio cientifico. A mutagenese dirigida de oligonucleotidos é realizada usando processos padrão conhecidos no meio, Zoller and Smith, Methods in Enzymology, 100; 468-500 (1983)? Morris et al.. Nucleic Acids Research, 11: 5103-5112 (1983); Zoller and Smith,
DNA 2,: 479-488 (1984). As mutações pontuais de conversão de bovino para humano são levadas a cabo através de mutagenese de oligonucleotidos dirigido e padronizada e são mostradas na Tabela seguinte. A localização da base mutagenizada pode ser observada na Tabela X.
Tabela X
Localização da base
112
148
159
199
324
354
358
364
365 382
| Base aFGF humano | substituída . para aFGF bnvinn | Aminoácido humano correspondente |
| C | T | Pro |
| C | T | His |
| G | A | Arg |
| C | G | Ser |
| G | A | Vai |
| A | T | Tyr |
| A | C | Asn |
| A | c | Ser |
| G | c | Cys |
| G | T | Arg |
| C | G | Arg |
| A | T | Tyr |
Para facilitar a mutagenese do gene aFGF bovino, este é transferido para o vector padrão M13 mpl9, que é uift vector de bacteriófago de DNA de cadeia simples. 0 plasmídeo pKK-aFGF bovino é clivado com EcoRl e Sall e o fragmento de 440 pb resultante é purificado através de um gel» A RF do DNA do vector M13 mpl9 é clivada com as mesmas duas endonucleases e as extremidades são subsequentemente desfosforiladas com fosfatase alcalina bacteriana.
DNA do vector e o DNA do fragmento do gene de aFGF são ligados e a mistura é usada para transformar células de 33. coli DH5. Um clone fágico contendo o gene aFGF bovino é seleccionado e denominado, M13mpl9-baFGF.
Os oligomeros humanos representados na Tabela IX são fosforilados e ligados individualmente ao DNA Ml3mpl9-baFGF de cadeia simples do fago. Moléculas de cadeia dupla fechados em circulo são preparadas usanc ligase de DNA de T4 e o fragmento kleno» de polimerase I de DNA, Cada uma das preparações foi usada para transformar células JM105 competentes e as placas transformantes resultantes são seleccionados por hibridação com um oligomero apropriado que é marcado usando cinasa de polinucleotidos.
DNA de cadeia simples é isolado de um clone fágico que contém as mutações do oligomero humano 4 e o processo acima descrito é repetido usando o oligomero humano 5 de modo a gerar um clone que contenha os mutações dos oligomeros 4 e 5 ao mesmo tempo.
Nos processos seguintes, as mutações das sequências de bovino para humanos nos clones de M13 foram associadas a um clone de pBR322. As RF de DNAs foram preparados a partir de clones que contêm modificações de bases especificadas pelos oligomeros humanos 1, 2, 6 e
8. 0 DNA do clone mutante humano 1 foi clivado com EcoRl, as extremidades foram desfosforiladas com fosfatase alcalina bacteriana e o DNA foi clivado com HindIII. 0 DNA do mu tanto humano 2 foi clivado com HindIII, tratado com fosfatase θ depois clivado com BamHI. 0 DMA do mutante humano 6 foi clivado com BamHI, tratado com fosfatase e clivado subsequentemente com Apal. Da mesma forma o DNA do mft&ante humano 8 foi clivado com Apa I, as extremidades foram desfosforiladas e o DNA foi clivado com Sall. Estas quatro preparações de DNA foram submetidas através de um gel de agarose a 2$ e os fragmentos de 45 pb, 190 pb, 135 pb e 70 pb dos DNAs mutantes que contêm as mutações humanas 1, 2, 6 e 8 respectivamente, foram eluidos do gel. Volumes de cada fragmento são ligados colectivamente a um fragmento de 3,7 kb EcoRI-Sall de pBR322, purificado através de gel, usando ligase de DNA de T4 e utilizantes para transformar células competentes de E. coli DHS (BRL) segundo o meúodo descrito pelo fornecedor. Um clone que contém as mutações especificadas por todos os quatro oligomeros 1 mutantes é seleccionado por hibridação com sondas marcadas radioactivamente preparadas a partir de cada um dos oligomeros. 0 fragmento de DNA Kpnl-BamHl de l4o pb isolado a partir da RF do DNA do clone de M13 mutante humano clivado é ligado aos produtos da clivagem endonucleasica deste DNA mutante humano 1-2-6-8 e usado para transformar células DHS competentes por forma a gerai* um clone com as mutações 1-2-3-6-8 humanas. Os fragmentos gerados por digestão com Bam Hl e Pst 1 deste último clone são ligados aos fragmentos gerados por digestão com Bam Hl e Pst 1 da RF de DNA do clone M13 humano 4-5 e a mistura da ligação é usada para t lansformai* células competentes DHS. Um clone contendo as mutações humanas 1-2-3-4-5-6-8 é seleccionado por hibridação de oligomeros e o fragmento de DNA EcoRl-Sall do gene aFGF deste plasmideo recombinante é ligado à RF de DNA de M13 mp 18 (BRL) clivada com EcoRI e Sall e tratada com fosfatase. As células competentes DH5 são transformadas com este DNA ligado e as células transformadas são plaquedaa em células hospedeiros
JM 105 de forma a gerar um clone M13. 0 DNA fágico de oadeis. simples deste clone é ligado ao oligomero humano 7 e é obtido um clone M13 que contém todas as mutações desejadas, seguindo o processo descrito acima. 0 clone humano aFGF é designado por M13mpl8-haFGF.
aFGF puro na ausência de heparina torna-se menos activo, presumivelmente devido à geração de ligações dissulfidicas intramoleculares incorrectamente estabilizadas e de agregados formados através de ligações dissulfidicas intermoleculares. As ligações dissulfidicas covalentes são formadas entre si dois residuos de cisteina, quer em duas cadeias polipeptidicas separadas - ligações dissulfidicas intercadeias - quer em diferentes posições da mesma cadeia - ligações dissulfidicas intracadeia. No caso de iodinação oxidativa enzimatica, as moléculas activas podem ser recuperadas através da redução com 20 iriM ditiotreitol na presença de 3M cloreto de guanidina a um pH de cerca de 9,1· 0 presente invento utiliza a mutagenização dirigida a um sitio para a substituição especifics. ou delecção de aminoácidos capazes de formar ligações covalentes intramoleculares ou intermoleculares estranhas ou de aminoácidos sensíveis à oxidação. 0 termo substituição aqui referido diz respeito à troca deliberada na sequência de bases do DNA de aFGF, de tal modo que um aminoácido desejadc é substituído por outro aminoácido diferente do desejado -aminoácido não desejado. 0 aminoácido nãodesejado pode ser uni capaz de formar ligações covalentes não desejadas, especialmente ligações dissulfidicas, ou um que seja oxidavel pelo ar ou que possa diminuir a actividade biologica da molécula. 0 termo delecção aqui usado diz respeito à mudança deliberada na sequência de bases do DNA de aFGF tendo como resultado a eliminação do aminoácido desejado. 0 aminoácido primário associado à formação de ligações covalentes intramoleculares e intermoleculares é a cisteina, ao passo que os aminoácidos que são propensos à oxidação incluem a cisteina, a metionina e o triptofano. 0 residuo ou resíduos de cisteina podem ser substituídos por qualquer aminoacido que não forme ligações dissulfidicas. 0 aminoacido preferidc para a substituição da cisteina é a serina. Os aminoácidos propensos à oxidação são substituídos por qualquer aminoácido resistente à oxidação e que incluem, mas não são restringidos a alanina, valina, leucina e isoleucina.
invento é conhecido de forma a incluir mutações especificas num sitio, de um ou mais resiudos de cisteina e de qualquer residuo de metionina não terminal que possam tornar o aFGF nativo ou recombinante menos activo ou inactivo devido à formação incorrecta de ligações intramoleculares ou intramoleculares ou a modificações oxidativas. As proteínas recombinantes ou nativas, bovinas ou humanas contêm dois resíduos de cisteina em comum localizadas nas posições lá e 83 e um residuo de metionina comum localizado na posição 67 definida pela forma nativa de l4o aminoácidos quer de aFGF bovino quer de humano. Os aFGFs bovino e humano contêm cada um, um terceiro residuo de cisteina nas posições 47 © 117 respectivamente. Os resíduos de cisteina comuns são os mais possíveis responsáveis pela formação de ligações dissulfidicas uma vez que a localização dos resíduos de cisteina nas ligações dissulfidicas é altamente conservado em proteínas homólogas. Desta forma, os terceiros resíduos de cisteina que estão em diferentes locais nos aFGs bovino e humano não são, muito provabelmente, encontrados em ligações dissulfidicas em proteínas completamente activas. Considera-se que os novos aFGFs mutantes do presente invento incluem não só as formas substituídas nos resíduos não comuns de cisteina mas também aqueles que possuem todas as cisteinas deleccionadas, aquelas em que uma ou duas cisteinas foram substituídas ou deleccionadas e aquelas em que a metionina foi substituída ou delecionada.
A substituição ou delecção de qualquer uma, especialmente da única cisteina, de todas as cisteinas, de duas das três cisteinas ou de metionina no aFGF humano ou bovino através de mutagenese dirigida a um sitio pode ocorrer após a formação de ligações dissulfidicas intramoleculares ou intermoleculares e de formas oxidáveis.
A mutagenese especifica para um sitio é levada a cabo preferencialmente em R-aFGF bovino ou humano produzido a partir de DNA genomico, cDNA ou através da construção de genes que codificam para uma ou mais formas microheterogenicas da proteína baseadas nas formas micro heterogenicas de aFGF de especies de mamíferos incluindo o homem. 0 DNA genomico é extraído do cerebro de mamíferos ou das células pituitárias e preparado para clonagem quer pela fragmentação ao acesso de DNA de alto peso molecular segundo a técnica de Maniatis et al,, Cell 15: 687-701 (1978) quer pela clivagem com enzimas de restrição segundo o método de Smithies et al.. Science 202; 1284-1289 (1978). 0 DNA genémico é então incorporado num vector de clonagem apropriada, em geral trata-se do fago lambda de Ξ. coli; ver Maniatis et al.. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).
Para se obter cDNA que codifique para aFGF é extraído, de células que expressam aFGF, pelo método de Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. 69.; l408-l4l2 (1972), RNA que contenha poli(A). 0 cDNA é preparado usando transcriptase reversa e DNA polimerase segundo técnicas padrão descritas por Maniatis et al.. Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982). 0 cDNA é clonado num vector apropriado, geralmente pBR322, através de uma técnica semelhante a de Vewsink, et al. , Cell 3^: 315-325 (1974).
-38r'
DNA genomico clonal ou bibliotecas de cDNA são testadas para identificar os clones que contêm sequências de aFGF por hibridação com uma sonda de oligonucleotidos. A sequência de sonda de oligonucleotidos usada na hibridação é baseada na sequência de aminoácidos de aFGF determinada. Maniatis et al., Supra, Anderson and Kingston, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 80: 6838-6842 (1983) and Suggs et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 78: 6613-6617 (l98l) descrevem vários processos para testar clones genómicos e de cDNA. 0 processo preferido consiste em mutagenizar especificamente num ponto os genes humanos ou bovinos sintetizados como descrito acima.
A mutagenese especifica num sitio é levada a cabo num clone recombinante de cadeia simples de bacteriofago que codifique para aFGF humano ou bovino, tais como M13mpl8-haFGF ou M13mpl9-baFGF segundo os métodos de Zoller and Smith, Methods in Enzym. 100:468-500 (1983), Morris et al., Nucleic Acids Res. 11:51035112 (1983) e Zoller and Smith, DNA 3: 479-488 (1984). Três oligonucleotidos para cada especie são construídos de forma a especificarem codões de serina no lugar de cada um dos codões de cisteina do gene de aFGF humano nas posições 16, 83 β 117 e nas posições 16, 47 o 83 para o gene bovino.
É construído um oligonucleotido especifico de um codão de leucina e ó colocado no lugar do codão de metionina na posição 67 do aFGF humano ou bovino. Os oligomeros humanos sintetizados estão representados na tabela seguinte com as bases mutadas sublinhadas.
TABELA XI
Cisteina 1 (l6) 5’CCGTTAGAGGAGTAAAGAAGC 3’
Cisteina 2 (83) 5‘GGAAAAGGGACTCCTCG 3’
Cisteina 3 (ll7)5’CCGCGTTTAGAGCTGCC 3*
Metionina (67) 5’CCATCAGTGTCCAGGGCAAGG 3*
Oligomeros semelhantes são identificados para as regiões apropriadas do gene que codifica para aFGF bovino e as mutações especificas elaboradas como descrito abaixo.
Os oligomeros humanos são fosfori lados e ligados individualmente ao DNA de cadeia simples de M13mpl8-haFGF ou M13mpl9-baFGF. Uma segunda cadeia de DNA é sintetizada usando o oligomero ligado como iniciador. Cada gene mutagenizado para a cisteina é usado para transformar um hospedeiro apropriado como por exemplo, células competentes de E. coli DH5. As células transformadas são plaquedas numa camada de um hospedeiro aceitável para o virus M13 tal como as células de E.coli JM1O5. As placas transformadas são selecctonadas por hibridação com um oligomero marcado apropriado. As condições de hibridação são optimizadas para cada sonda tendo em vista a prevenção da retenção de hibridos que contenham mudanças numa única base. 0 DNA de cadeia simples é isolado a partir de colónias fágicas que contêm cada uma das mutações cisteina-serina e usado para sequencia ção segundo o método de Sanger et al.. Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 74:5463-5467 (1977)· As RF de DNAs são preparadas para cada clone clivado com EcoRI e Sall e purificado por eleetroforese através de um gel de agarose. Os fragmentos de 44o pb a inserir são ligados individualmente ao fragmento de DNA EcoRI-Sall de 2,7 kb do vector de expressão que contém um promotor tal pkk2.7. Os DNAs ligados são usados para transformar células competentes DH5 e os clones que contêm DNA com codões mutados para cisteina são seleccionados por hibridação com o oligomero apropriado. Cada fragmento do gene aFGF inserido é sequenciado pelo método de Maxam and Gilbert, Methods in Enzyraology 65: 499-560 (l98O) Os clones que contém uma única mudança de base em relação ao DNA humano original são deseignados: pkk-haFGF (Ser 16), pkk-haFGF (Ser 83) e pkk-haFGF (Ser 117); por outro lado os de DNA bovino são designados por pkk-baFGF (Ser l6), pkk-baFGF (Ser 47) e pkk-baFGF (Ser 83) segundo a localização da substituição na proteina.
A substituição de quaisquer dois ou de todos os três residuos de cisteina é acompanhado de mutações pontuais múltiplos ou da combinação de fragmentos de restrição dos recombinantes do tipo selvagem humano ou bovino e dos genes sintéticos mutantes (Ser 16), (Ser 47) (Ser 83) e (Ser 117), clonados em M13mpl9 no caso bovino M13mpl8 no caso humano e súbclonados em pkk2.7 como descrito acima. Deve ser entendido que as mutações múltiplas podem ser levadas a cabo tanto com os aFGF de uma sé mutação humanos com os bovinos descritos acima, contudo, a seguinte descrição incluirá somente aFGF humana. Os recombinantes pkk-haFGF (Ser 16,32) e pkk-haFGF (ser 16,32) são construídos introduzindo o fragmento de 0,23 kb EcoRI-BamHI de M13 mpl8 (Ser l6) em pkk2.7 seguido da inserção dos fragmentos de 0,2 kb BamBI-Sall quer de M13 mpl8 (Ser 83) quer de M13 mpl8 (Ser 117). 0 vector pkk27 é modificado de forma a remover o sitio BamHI acima do promotor tac ao mesmo tempo que é deixado o sitio BamHI na sequência multiclonal. Apés digestão com os correspondentes enzimas de res-
-4ltrição e subsequente ligação e transformação de um hospedeiro apropriado, os clones são seleccionados e testados de forma a conhecer aqueles que contêm plasmideos com o peso molecular esperado para os recombinantes e que é de cerca de 3,1 kb. Os hospedeiros baoterianos apropriados podem incluir mas não são limitados a B.coli DHS, JMlo( ou AB1899.
mutante haFGF (Serl6,83,117) é construído através da substituição do fragmento de 0,13 kb Sphl-Sall de pkk-haFGF (Ser 16,83) pelo correspondente fragmento de pkk-haFGF (Ser 117) que codifica para Ser em vez de cis na posição 117. 0 fragmento de 3kb-Sphl-Sall de pkk-haFGF (Ser 16,83) é purificado por electroforese preparartiva através de um gel de agarose, electroeluido e ligado ao fragmento de 0,13kb Sphl-Poll de pkk-haFGF (Ser 117) purificado a partir de um gel de poliacrilamida a 5$ da mesma forma, Os fragmentos purificados são ligados e os recombinantes seleccionados como descrito acima.
mutante pkk-haFGF (Ser 83-117) é construído por substituição do fragmento de 0,3kb Pstl de pkk-haFGF, a forma não mutagenizada, pelo fragmento pkk-haFGF (ser 16,83,117) que inclui os codões para Ser em vez de de cis nos posições 83 ® 117, usando as técnicas acima descritas. Os transformados são analisados por digestão com Pstl-Sall para determinar a orientação dos fragmentos ligados, todos os genes são sequenciados pelo método dideoxi de Songer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2^:5463-5467 (1977).
A expressão do gene aFGF mutado é acompanhado por um numero diferente de sistemas de expressão com promotores em diferente numero de células hospedeiras. É desejado e tentado que no campo abarcado por este invento estejam incluídos e uso de outras células hospedeiras e sistemas de expressão com promotores para a expressão de genes ãFGF mutagonizados intactos. As células hospedeiras incluem células bacterianas, leveduras, de insectos e de mamíferos. Os antigeneos também podem ser expressos em vírus. Apesar dos genes poderem ser expressos em numerosas células procariotas e várias células eucariéticas, as células hospedeiras preferidas são as de Escheridaia coli. Os vectores de expressão que podem ser usados para a expressão de aFGF mutado incluem, mas nao são limitados a, pBR322, J5La2311, pkc30, ptacl2,Ygtll, CheY, pASl, pLC24, pSB22ó, Sv4o e pkk223-3 sendo este último o preferido. Os vectores de expressão de Escherichia coli permitem geralmente a tradução do residuo de metionina ligado ao primeiro aminoácido da proteína desejada. Deve ser entendido que o presente invento inclui não sé o mutante R-aFGF com uma metionina terminal mas também o mutante R-aFGF em que a metionina terminal é removida apés a tradução em células de levedura, mamífero ou bactérias. 0 vector de expressão pode incluir na sequencia de DNA um ou mais cistrões adicionais que aumer. tam a expressão do gene aFGF, Schower, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 ϊ 8506-8310 (1986). 0 produto construído preferido usa o promotor tac de E. coli, um híbrido entre as regiões do promotor trp e do promotor lac como descrito por deBaer et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:21-25 (1983).
plasmideo pkk 223-3 (Pharmacia) que contem o promotor tac e o terminador de transcrição de rRNA RRNB foi modificado de modo a remover o sitio para a enzima de restrição Sall em pBR322. Foi demonstrado que o terminador rrhB de rRNA permite a expressão por promotores fortes, Gentz et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 4936-4940 (l98l); Brofins, Gene 2£: 161-172 (1984).
DNA do plasmideo pkk223-3 é clivado, cora enzimas de restrição de modo a produzir um fragmento de DNA de 2,7 kb, para gerar o clone pkk2»7· 0 gene sintético de aFGF é clivado a partir do seu vector pBR322 e transferido para o plasmideo pkk2.7 após a restrição do próprio pkk2.7 com EcoRl e Sall. 0 recombinante resultante mostrado na fig. 1, ó usado para transformar células de E. o o li JM105 (Pharmacia) ou DH5 (BRL) e expresso» vector com expressão aumentada preferido conterá uma sequência de nucleotidos, o primeiro cistrão e, acima do gene que codifica para a proteína desejada, o segundo cistrão» 0 primeiro cistrão conterá, de uma forma geral, uma sequência Shine-Dalfarno acima do codão de paragem. Um vector com expressão aumentado pode conter, mas não é limitado à seguinte sequência de nucleotidos:
AATTAIGTATCGATTAAATAAGGAGGAAT
TACATAGCTAAITTATTCCTGGTTATTAA (pKK2.7) (cistrão de 1,2 oligomeros) (aFGF) que é um primeiro cistrão eficaz para aumentar a expressão de aFGF mutante ou de tipo selvagem. 0 primeiro cistrão é inserido num pkk-haFGF construído, apropriado, no sitio EcoRl. À inserção do fragmento provoca a perda do sitio de clonagem EcoRi. 0 recombinante é usado para transformar uma célula hospedeira apropriada, como os descritos acima e, expresso. Este vector, constriido desta forma, provoca um aumento de cerca de dez vezes da expressão de aFGF mutante ou de tipo selvagem. Os plasmideos que contém o vector com expressão aumentada são designados por pKK2c-haFGF. 0 presente invento é contemplado de forma a incluir clones que contêm vectores com expressão aumentada, tais como: pKKac-haFGF
(Ser 16), PKK2c-haFGF (Ser 83), pKK2c-haFGF (Ser 117), pkk2c-haFGF (Ser 16,83), pkk2c-haFGF (ger 16,117), pkk2c-haFGF (Ser 83, 117), pkk2c-haFGF (Ser 16, 83, 117).
Os clones de expressão mutados crescem a. cerca de 37SG num meio de crescimento apropriado que é constituído por cerca de 1$ de triptona, cerca de 0,5$ de extracto de levdura, cerca de 0,5$ de NaCl, cerca de 0,4$ de glucose e cerca de 50 μg/ml de ampicilina. Quando a densidade óptica a 550 nm atinge cerca de 0,5, pode-se adicionar isopropil-B-D-tiogalactopiranosido (iPIG) até uma concentração final de cerca de 1 mm e o crescimento continua a cerca de 37SC até cerca de 24 horas. As células de um litro de meio de cultura são colhidos por centrifugação e ressuspensas num tampão de lavagem que contêm fosfato a cerca de 100 mM e cerca de 5 mg/ml de EDTA. Após a ressuspensão final é adicionado lisozima até cerca de 0,1 mg/ml e a suspensão é incubada em agitação suave a 3θ5θ durante cerca de 15 minutos. As células são colhidas por centrifugação e ressuspensas num tampão de disrupção que contém cerca de 100 mM fosfato de sódio a pH 6,0, cerca de 3 mM EDTA, cerca de 0,03 mM N-p-toluenossulfonil-2-fenil-alanina clorometil cetona (TPGK); cerca de 0,05 mM pepstatina A, cerca de 0,05 mM fenilmetilsulfonil fluorido (PMSF), cerca de 0,05 mM de leupeptina e cerca de 15 pg/ml de inibidor de tripsina pancreas bovino (bpTE). As células ou são imediatamente disruptas ou congeladas e guardadas a -7O2C e disruptas, imediatamente após descongelação, através de duas passagens por um compartimento de pressão francês a cerca de 20 000 psi a cerca de 420. 0 fluido sobrenadante e colhido após centrifugação e liofilizado.
Os aFGFs mutados são purificados até ã homogeneidade por um processo de cromatografia que compreende três passos, empregando uma matriz de troca de catiões, seguida de uma matriz de afinidade de Sepharose
-Heparina e seguida por cromatografia liquida de alta eficácia (HPLC) de fase reversa. Os fluidos sobrenadantes liofilizados são ressuspensos em tampão fosfato a cerca de 100 mH a cerca de pH 6,0 e adicionados ao permutador de catiões, de preferência CM-Sephadex que foi equilibrado no mesmo tampão. 0 CM-Sephadex é adicionado à razão de 6,5 ml de resina sedimentada por grama de proteina. A resina é colhida num funil poroso de vidro, e lavada três vezes com tampão fosfato salino a cerca de 100 raM de fosfato e cerca de 150 mM NaCl a pH cerca de 6. A resina é ressuspensa no mesmo tampãc empacotada na coluna, lavada e eluida com cerca de 600 mM de NaCl no tampão. A Sephase-Heparina é equilibrada com cerca de 10 mM tampão fosfato a cerca de pH 7,2 e adicionada ao eluido à razão de cerca de 1 ml de resina sedimentada por 1 mg de proteina, agitada suavemente durante cerca de 1 hora a cerca de 4° e o complexo resina-proteina é colhido num funil. A resina é ressuspensa no mesmo tampão e empacotada na coluna a cerca de 1-2 volumes de coluna por hora.
A coluna foi lavada num tampão que contém cerca de 10 mM de fosfato a cerca de pH 7,2 e cerca de 0,8 M NaCl e eluida com cerca de 1,5M NaCl no mesmo tampão. Cada proteina é colhida e purificada por HPLC de fase reversa. As fracções são aplicadas numa coluna de HPLC de fase reversa, cerca de C^, equilibrada com cerca de 10 mM ácido trifluoroacético (TFA) e eluido com um gradiente de cerca de 0 a cerca de 100% de 4 mM TFA, cerca de 0-67% CH^CN em cerca de 30 minutos.
A actividade mitogénica dos recombinante s mutados de aFGFs purificados é determinada por incorporação de H-Timidina em DNA por linha celular de fibroblastos, de preferência BALB/c 3T3 A31 (American Type Culture Collection). As proteinas mutantes dos plasmideos pkk-haFGF (Ser 16) e pKK-haFGF (ser 83) estimularam os fibroblastos a um nivel igual ou inferior ao do aFGF não mutado humano. A proteina mutante de pKK-HaFGF (Ser 117) mos-46trou uma aetividade estimuladora que é mais alta do que as formas não-mutadas na ausência de heparina.
Um ensaio mitogenico muito repro dutivel e controlado é requerido para comparar as actividades mitogenicas relativas especificas do haFGF de tipo selvagem e dos mutantes Cis e Ser. As culturas confluentes de células de Balb/C 3T3 em meio de cultura livre de soro foram estimuladas com diluições a 1:2 consecutivas até cerca de pelo menos da ordem de 3 log de concentração de aFGF e que cobrem um aumento completo da resposta em relação ao fundo do pico de síntese de DNA. Uma unidade estimuladora é calculada como a quantidade de aFGF por ml que gera metade da resposta máxima. A aetividade mitogénica especifica é o numero de unidades estimuladoras por mg de aFGF puro.
ensaio é padronizado mais adiante por diluição de soluções stock ate cerca de 50 pg aFGF/ml de ITA/CH^CN ou menos A diluição elimina qualquer efeito da concentração de tal forma que diferentes amostras podem ser comparadas.
A conversão de Cis117, quaisquer duas Cis ou todos os trás residuos de Cis em Ser resulta num aumento de 7 a 20 vezes na aetividade especifica da pro teina na ausência de heparina. Mesmo na presença de heparina, todos os quatro múltiplos mutantes são mais activos do que o R-aFGF humano de tipo selvagem (Ser 83,117) sendo cer ca de 2,7 vezes mais activos. Apesar da heparina estimular a aetividade de aFGF de tipo selvagem de 20 vezes, apenas potência a aetividade dos mutantes entre 3 θ 5 vezes.
A conversão de todos ou de quais quer dois dos três residuos de cis do aFGF humano em Ser re sulta num aumento de 7 a 20 vezes da aetividade especifica da proteína na ausência de heparina. Mesmo na presença de heparina, todos os quatro múltiplos mutantes são mais activos do que as formas não mutadas de haFGF, sendo o haFGF
Ser (83,117) cerca de 3 vezes mais àctivo.
aFGF recombinante mutado é util na promoção da reparação ou cura de, mas não limitada a, feridas de tecidos provocados por queimaduras, cortes ou lacerações e ulceras cutaneas assim como de feridas dos mus culos do esqueleto tais como fracturas ósseas, roturas de tendões ou ligamentos e inflamações de bolsas e tendões. Reparação de tecidos, tal como aqui ó usada, ó definida como a regeneração de tecido após estimulação de células da mesoderme, ectoderme ou neuroectoderme por aFGF. 0 r-aFGF mutado também é util na promoção da cura e regeneração da cartilagem ou tecidos da cartilagem. A administração de aFGF mutado para a reparação de tecido mole, incluindo tecido de córnea, será geralmente tópica, subcutânea, intra venosa ou intraocular. Os tecidos moles incluem todos os te eidos excepto os associados com o sistema de msuculos do esqueleto como descrito acima. Os novos peptidos podem ser administrados com ou sem heparina, preferivelmente sem heparina em quantidades de cerca de 0,1 a cerca de 100 ijig/ /cm /dia deste invento, da proteína, na área fétida quer topicamente quer subcutaneamente a cerca de 1 a 100 TjLg/cm^/ /dia. Os limites mais preferidos de aplicação na adminisp tração tópica é cerca de 1 a 10 pg/cm /dia.
A heparina é um glicosaminoglicamo sulfatado que consiste em partes iguais dos açucares D-glucosamina e D-ácido glucuronico que, são sulfatados em graus variáveis. Está comercialmente disponível numa forma não modificada bem como em solução para aplicação terapêutica directa. Quando a heparina é administrada com aFGF em aplicações tópicas ou subcutâneas a concentração preferida é de cerca de 3 a 3° vezes a quantidade (massa) de aFGF administrado por dia.
Para a reparação de musculos do esqueleto e cartilagem ou de feridas, o r-aFGF mutado é administrado preferencialmente no local da lesão quer durante a cirurgia quer por injecção. A implantação cirúrgica de formas que se libertam lentamente de aFGF mutado permitirá a libertação contínua do factor de crescimento durante um longo periodo de tempo. Métodos de formulação de aFGF mutado para libertação lenta são conhecidos. Os niveis de doseamento para as feridas do musculo do esqueleto serão de cerca de 10 a 100 ^g/cm^/dia.
mutante de r-aFGF é para além disto útil na promoção de uma reoaração mais facil do tecido vascular in vivo, tal como o crescimento de vasos sanguíneos (angiogenese), reparação de vasos (tal como a substituição de células endoteliais danificadas) e na estimulação do crescimento de células endoteliais em substratos apropriados para a produção de vasos sanguíneos para implantação. A actividade de angiogenese in vivo dos novos peptidos mutantes r-aFGF é acompanhada pela administração interne, como por exemplo subcutânea, de cerca de 1 a 1000 /íg/cm^/die. sendo a quantidade mais preferível entre 10 e 100 çig/cnr/digL 0s limites preferíveis de aplicação para reparação da superficie é de cerca de 100 ng a 100 yg/cm /dia sendo os limites mais preferíveis de aplicação de 1 a 10 pg/cm /dia. A reparação de vasos em larga escala é acompanhada de uma o unica dose de cerca de 0,1 a 100 ng/cnr ou da infusão conO tínua de 1 a 1000 pg/cnr/dia. 0 crescimento in vivo de células endoteliais em substractos apropriados para a produção de vasos sanguíneos é acompanhada pela administração de 1 a 10 ng/ml/dia.
mutante de r-aFGF é também útil na indução in vivo do activador de plasminogéneo por células endoteliais vasculares para o tratamento de ataques de trombose. Os ataques de trombose resultam da formação de trombos em vasos sanguíneos que podem resultar em acessos de trombose, trombose de veias funda, enfarte do miocardio e outras circunstâncias médicas que dão lugar â necrose de tecidos e muitas vezes à morte do paciente. A digestão dos coágulos formados e a prevenção da formação posterior de coágulos pode ser mediada pelo mutante r-aFGF que, desta forma, beneficia o tratamento de ataques de trombose. 0 pre-tratamento com o mutante r-aFGF também pode ser usado para prevenir a formação de coágulos em animais, incluindo o homem que possuem risco elevado de formação de coágulos. Os limites desejáveis de dosagem do mutante r-aFGF para, o tratamento de ataques de trombose é de cerca de 10 qg-10 mg/kg/ /dia.
r-aFGF mutado ou de tipo selvagem é também util na promoção da reparação de tecido nervoso central e periférico incluindo a manutenção e estimulação dos neurénios do hipocampo, dos neuronios que são danificados ou destruídos pela doença de Alzheimer e dos neurénios motores e sensores cuja destruição causa paralisia.
tecido nervoso danificado pode ser estimulado por aFGF mutado ou de tipo selvagem para a produção adicional de neurões por mitose de neuroblastos tendo em vista a regulação dos nervos danificados na área e a promoção de alto crescimento nervoso a partir dos neurénios. Os peptidos podem ser administrados como descrito para o caso da cura de feridas, do tecido mole ou do tecido do musculo do esqueleto.
Para aplicação tépica são usados vários excipientes farmacêuticos para administração do compo to activo deste invento. Tais excipientes incluem, mas não são limitados a, unguentos tais como petrolato hidrofílico ou polietileno glicol; massas que podem conter gomos tal como Êoma de xantão; soluções fais como alcolicas ou aquosas geis tais como hidroxido de alumínio ou geis de alginato
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de sódio; albuminas tais como as humanas ou de animais;
colageneos tais como o humano ou de animais; celuloses tais como os celuloses de alquilo, celuloses de hidroxialquilo e celuloses de alquilohidroxialquilo, por exemplo metilcelulose, hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose e hidroxipropilcelulose; poloxameros R tais como Pluronic Poliois exemplificados pelo Pluronic F-127; tetronicos tal como o tetronico 1508; alginatos tal como o alginato de sódio. Os excipientes farmacêuticos incluirão um ou mais dos compostos do aFGF mutado em quantidades de 0,1 a 100 pg/ml.
Para aplicações não tópicas o mutante r-aFGF é administrado em combinação com excipientes farmacêuticos aceitáveis ou diluentes tais como, tampão fosfato, salino, tampão fosfato salino, solução de Ringer ou semelhantes numa composição farmacêutica de acordo com a pratica farmacêutica usual.
A capacidade do aFGF mutado para estimular a divisão em vários tipos de células incluindo fibroblastos, células endoteliais vasculares ou de cornea ou semelhantes torna estes peptidos uteis como agentes farmacêuticos. Estes compostos podem ser usados no tratamento de feridas de mamíferos incluindo o homem através da administração do novo r-aFGF mutado a pacientes que necessitem de tal tratamento.
Os exemplos seguintes ilustram o presente invento sem contudo o limitarem a isso.
-51Γ'ι’ν~£EXEMPLO 1
Sintese de oligonucleotidos
Os oligonucleotidos foram sintetizados de acordo com a técnica descrita por Matteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191 (l98l); Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22: 1859-1862 (l98l).
As sequências de bases dos oligonucleotidos sintetizados estão representados nas Tabelas VII, IX e XI.
EXEMPLO 2
Montagem do gene aFGF
Os oligonucleotidos bovinos do Exemplo 1 foram montados como duas subunidades separadas, a metade da extremidade N (231 pb) e a metade da extremidade C (209 pb). As duas metades foram então combinadas para formar o gene sintético intacto, ver Tabela VI. Inicialmente os oligonucleotidos são tratados com linasa na seguinte mistura de reacção: 70 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 10 mM MgCl2, pM ATP, 0,3 unidades de cinase de polinucleotidos de T4 por μΐ e 2,5 pmoles de oligonucleotidos por μΐ. A mistura foi então incubada durante 1,5 horas a 375θ e durante uma hora suplementar, adicionando à mistura 0,2 unidades/ml de cinasa e ATP até atingir a concentração de 100 mM. Para marcações radioactivas a mistura inicial continha 37 nCi/μ! de
/Ç-32p_7-atp.
ν'
As fusões e ligações foram realizadas em duas reacções separadas. Em cada reacção, 100 pmole de cada um dos oito oligonucleotidos foi adicionado. Numa reacção, os oligonucleotidos que formam uma cadeia da metade do gene da extremidade C ou de extremidade N foram tratados com cinasa com excepção de oligonucleotido mais próximo da extremidade 5’. Na segunda feacção os oligonucleo tidos que formam a cadeia oposta são tratados com cinasa uma vez mais cora a excepção do oligonucleotido mais proximo da extremidade 5’. Desta forma, em cada reacção 3 oligonucleoti dos são tratados com cinasa e 5 não são. Após tratamento com cinasa, os oligonucleotidos foram usados, foi também 32 adicionada 1 pmole do oligonucleotido marcado com P para tornar possivel a identificação posterior dos produtos. Cada reacção continha 200 ^il de uma solução composta por 70 mM Tris pH 7,6, 5 iriM DTT, 10 mM MgCl^ e 30 çM ATP. Os oligonucleotidos foram fundidos por aquecimento a 9O2C durante 4 minutos, a reacção foi transferida imediatamente a seguir para 6osc e arrefecida lentamente até 3O2C. A ligação foi realizada num volume de 400 μΐ que contêm ÓO niM Tris pH 7,6 10 níM DTT, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP e 0,03 unidades de ligase de DNA de t4 por jil, incubando a mistura a 202C durante 1,5 horas.
A purificação dos oligonucleotido;! ligados foi realizada por electroforese através de um gel de poliacrilamida. Os oligonucleotidos lidados foram precipitados com etanol, redissolvidos em 20 μΐ de formamida a 80$, niM TRIS-borato pH 8,3, 1 mM EDTA, 0,1$ (P/V) cianol de xileno e 0,1$ (p/v) de azul de bromofenol* Cada amostra foi aquecida a 9O2C durante 3 minutos e submetida a electroforese através de um gel de ureia a 10$ - poliacrilamida a 75 watts durante 5 horas. As bandas de oligonucleotidos foram visualizadas por exposição do gel numa pelicula de raios X.
As bandas de 231 bases da extremidade N em cada reacção são cortadas do gel, reunidos e eluidos a 4sc em 1 ml de acetato de amónia 0,5M © EDTA lmM pH8. 0 DNA eluido foi precipitado com etanol e redissolvido em 30 V-l de TRIS pH 7,6 70 mM, 5 mM DTT e 10 mM MgCl^. As bandas de 209 bases da extremidade C foram eluidas da mesma forma.
ν' ν'
Os oligonucleotidos purificados através do gel foram fundidos antes da sua transformação a 90sC durante 4 minutos seguida de arrefecimento lento até 202C. Presumindo uma recuperação de 5$ dos oligonucleotidos iniciais de partida, 300 fmole e 100 fmole de oligonucleotidos de 231 pb fundidos, recuperados, foram ligados cada um a 100 fmole do fragemento de DNA de pBR322 de 3,9 kb EcoRl-Bamlll em 20 jxl de TRIS pH 7,8 2$ mM, 1 mM DTT, 10 mM MgClg, 0,4 mM ATP em 1 unidade de ligase de DNA de T4 durante 1 hora a 2020. Os oligonucleotidos fundidos de 209 pb foram ligados no fragmento de DNA de pBR322 de 3,9 kb BamHl-Sall sob as mesmas condições dos fragmentos de 231 pares de base. As reacções de ligação foram diluidas a 1:5 ©m H^O e 1 ,ul da diluição foi usada para transformar 20 μΐ de células de E. coli RR1 (BRL) competentes como descrito pelos fornecedores. As bactérias transformadas foram seleccionadas parà o crescimento na presença de ampicilina e testadas para a presença dos fragmentos inseridos de 231 pb EcoRI-BamHl ou de 209 pb BamHl-Sall por análise de restrição de mini-lisados de preparação de plasmideos,
A sequência de DNA dos clones que contêm fragmentos inseridos do tamanho apropriado foi determinada usando as técnicas quimicas de sequenciação de DNA de Maxam and Gilbert, Proc. ]fat 1. Acad. Sei USA 74:560-564 (I977). Uma vez que nenhum dos clones de 231 pb possuir a sequência correcta, um clone que contem a sequência correc· ta foi preparado da seguinte forma. Um clone com a sequência correcta entre os sitios Kpn 1 e BamHl foi clivado com kpn 3 e com Sal 1 as quais clivam no vector pBR322, A banda de 400 pb foi purificada através de um gel e ligada à banda dè
3,8 kb kpn-Sall de um segundo clone que contem a sequência correcta entre os sitios Kpnl e EcoRI do fragmento inserido do gene aFGF. Após transformação, o clone resultante foi sequenciado para assegurar que a sequência desejada foi obtida.
Uma vez obtido um clone que contém a sequência correcta de 209 pb, não é necessária mais nenhuma manipulação desses clones» 0 gene final de aFGF sintético de comprimento completo foi clonado por clivagem da metade terminal N do clone com BamHl e Sall, tratamento com fosfatase alcalina e ligação», deste ao fragmento inserido de 209 pb BamHl-Sall da metade da extremidade C do clone e purificado através de gel. Este material ligado foi usado para transformar células RR1 competentes como anteriormente.
EXEMPLO 3
Mutagenese do gene aFGF bovino em gene aFGF humano
Para facilitar a mutagenese do gene aFGF bovino, o gene sintético do Exemplo 2 foi transferido para M13mpl9, um vector de bacteriofago de DNA de cadeia simples. Os procedimentos padrão para a mutagenese foram usados tal como descrito por Zoller and Smith, Methods in Enzymology, 100: 468-500 (1983); Morris et al.. Nucleic Acids Research 3Λ, 5103-502 (1983); Zoller and Smith, DNA 2,: 479-488 (1984). 0 plasmideo bovino pKK-aFGF foi clivado com EcoRI e Sall e o fragmento resultante de 440 pb foi pu-
rificado através de um gel de agarose como no Exemplo 2.
A RF do DNA do vector Ml3mpl9 (BRL) foi clivada com os mesmas duas endonucleases e as extremidades subsequentemente desfosforiladas em 100 μΐ de tampão TRIS pH 8,0 10 mM com 100 unidades de fosfatase alcalina bacterina. A ligação foi realizada usando 50 mg do DNA do vector tratado e 12 ng do fragmento de DNA do gene aFGF em 10 pl de TRIS pH 7,8 25 mM, 10 iriM MgCl^, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP com 2 unidades de ligase de DNA de T4 durante l6 horas a 4^0. A mistura de reacção foi diluida 1:5 em H^O e 1 pl da diluição foi usada para transformar 20 μΐ de células competentes de E. coli DH5 (BRL) segundo a descrição do fornecedor. As células foram semeadas com células hospedeiras E. coli JM 105 (Pharmacia) em 0,03$ X-gel e 0,3 mM IPTG; após incubação a 372C as placas incolores sao isoladas. Um clone fágico que contem o gene aFGF bovino foi seleccionado - M13mpl9-baFGF.
Oito oligonucleotidos foram projectados para especificar a sequência humana e sintetizados ver Tabela IX. 0 oligomero 8 contem uma mutação adicional na qual a Timina no sitio 386 no gene bovino é substituída por citosina no gene humano. Esta mutação permite a incorporação de ura sitio de restrição sem alterar a sequência de aminoácidos do aFGF humano.
Os oligomeros humanos 1,2,3,^,6 e 8 foram fosforilados e 15 pmoles de cada foram fundidos individualmente a 0,5 pmole de D NA fagico de cadeia simples de M13mpl9-baFGF em 10 μΐ de TRIS pH 7,5 20 iriM, 10 mM
MgClg, 50 mM NaCl, 1 mM DTT durante 10 minutos a 65SC seguido de 10 minutos a 23SC. As moléculas de cadeia dupla fechad circular foram então preparadas em 20 μΐ de TRIS pH 7,5 20 mM, 10 mM MgCl^, 25 mM NaCl, 5,5 miM DTT, 0,5 mM ATP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dTTP usando 1 unidade de ligase de DNA de T4 e 2 unidades do fragmento klenow da DNA polimerase I e incubado a 159C durante 17 horas. As preparações foram usadas cada uma para transformar células competentes JM1O5 e as placas transformadas resultantes foram seleccionadas por hibridação com o oligomero apropria 32 do que foi marcado radio act ivamente com P-ATP usando cina sa de polinucleotidos. As condições de hibridação foram optimizadas para cada sonda de forma a prevenir a formação de hibridos que contêm uma unica base trocada. 0 DNA de cadeia simples foi isolado a partir do clone fagico que contem as mutações do oligomero 4 humano e o procedimento acima foi repetido usando o oligomero humano 5 de modo a gerar um clone que contenha as mutações de ambos os oligomeros 4 e 5.
No procedimento seguinte, as mutações de bovino para humano da sequência nesses clones de M13 foram reunidos num clone de pBR322. As RF de DNA foram preparados a partir de clones que contêm as trocas de bases especificadas pelos oligomeros humanos 1, 2, 6 e 8 0 DNA do clone mutante humano 1 foi clivado com EcoRI, as extremidades foram desforiladas com fosfatase alcalina bacteriana e o DNA clivado com HindIII. 0 DNA mutante humano 2 foi clivado com HindIII, tratado com fosfatase e de seguida clivado com BamHI* 0 DNA do mutante humano 6 foi clivado com BamHI, tratado com fosfatase e clivado subsequente mente com Apal. Da mesma forma, o DNA do mutante humano 8 foi clivado com Apa 1, as extremidades foram desfosforiladas e o DNA foi clivado com Sal 1. Esta quatro preparações de DNA foram submetidos a eleetroforese através de agarose a 2/a e os fragmentos de 45pb, 190 pb, 135 pb e 70 pb dos DNAs mutantes que contêm as mutações humanas 1,2,6 e 8 respectivamente foram eluidos do gel. Aproximadamente 60 fmoles de cada fragmento foram ligadas colectivamente a cerca de 60 fmoles do fragmento de 3,7 kb EcoRI-Sall de pBR322 purificado através de gel, em 5 Jil de TRIS pH 7»8 25 mM, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP com 1,5 unidades
de ligase de DNA de t4 durante lé horas a 12^0. A mistura de reacção foi diluida 1:5 em H^O e 1 ,ul da diluição foi usado para transformar 20 qúL de células competentes de E. coli DH5 (BRL) como descrito pelo fornecedor. Um clone que contem as mutações especificadas pelos quatro oligomeros mutantes foi seleccionado por hibridação com sondas ra.dioactivas preparadas a partir de cada um dos oligomeros.
fragmento de DNA de l4o pb Kpnl-BamHl isolado a partir de RF de DNA clivada do clone M13 do mutante humano 3 foi ligado aos produtos de clivagem por endonuclease do DNA do mutante humano 1-2-6-8 e usado para transformar células competentes DH5 de forma a gerar um clone com as mutações humanas 1-2-3-6-8. Os fragmentos produtos de digestão com BamHl e Pstl deste ultimo clone foram ligados aos fragmentos de RF de DNA digeridos com BamHl e Pstl do clone de M13 humano 4-5 e a mistura da ligação foi usada para transformar células competentes DH5. Um clone que contém as mutações humanas 1-2-3-4-5-6-8 foi seleccionado por hibridação com um oligomero e o fragmento de DNA EcoRl-Sall do gene aFGF deste plasmideo recombinante foi ligado à RF de DNA de M13 mpl8 (BRL) tratada com fosfatase e clivada com EcoRI e Sall. Células competentes DH5 foram transformadas com este DNA ligado e as células transformadas foram semeadas em células hospedeiras JM105 de forma a gerar um clone de M13· 0 DNA fágico de cadeia simples deste clone foi fundido com o oligomero 7 humano e um clone de M13 que contem todas as mutações desejadas foi obtido seguindo o processo descrito acima. A RF de DNA foi preparada a partir deste clone e clivada com Sal 1 e EcoRI. A banda de 44o pb resultante foi purificada através de um gel e ligada ao fragmento de DNA de 2,7 kb EcoRl-Sall do vector de expressão com um promotor tac pKK 27. Este DNA foi usado para transfoi mar células competentes DH5 gerando deste modo um clone de expressão pKK-aFGF humano usado para a produção da forma humana de aFGF,
EXEMPLO 4
Mutagenese dos codões cisterna do gene aFGF
Um clone recombinante de bacteriofago de cadeia simples do aFGF humano, M13mp18-haFGF, do Exemplo 3 foi mutagenizado usando processos descritos por Zuller and Smith, Methods in Enzymology 100 : 468-500 (1983): Morris et al.. Nucleic Acids Research, 11:5103-5112 (1983); Zoller and Smith, DNA 3: 479-^88 (1984).
Três oligonucleonitos foram projectados de modo a especificar codões de serina no lugar de cada um dos codões de cisteina do gene aFGF humano nas posições 16,83 e 117· Os oligomeros sintetizados estão representados na Tabela XI comas bases mutadas sublinhadas.
Os oligomeros foram fosforilados e 15 pmoles de cada foram fundidos individualmente com 330 ng de DNA de cadeia simples de Ml3mp 18-haFGF em 10 yl de TRIS pH 7,5 20mM, lOmM MgCLg, 50 mM NaCl e 1 mM DTT durante dez minutos a 652C seguido de 10 minutos a 239C.
Uma segunda cadeia de DNA foi sintetizada usando o oligomero fundido como iniciador em 20 μΐ de TRIS pH 7,5 20 mM, mM MgCl2, 25 mM NaCl, 5p mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dTTP, usando 3 unidades de ligase de DNA de T4 e 0,4 unidades do fragmento klenoK de DNA polimerase I, por incubação a 12SC durante 17 horas. Cada uma das três preparações foi diluida a 1:5 em H^O e 1 pl da diluição foi usado para transformar aliquotas de 20 μΐ de células competentes de Ξ. coli DH5 (Bethesdá Research Labs) segundo a descrição do fornecedor. As células transformadas foram semeadas com células E. coli JM105 que actuam como células hospedeiras para o virus M13. As placas de bactérias transformadas resultantes foram seleccionadas por hibridação com um oligomero apropriado que foi marcado radioactivamente usando P-ATP e cinasa de polinucleotidos,
As condições de hibridação foram optimizadas para cada sonda de modo a prevenir a retenção de híbridos que contenham uma unica base trocada.
DNA de cadeia simples foi isolado de clones fagicos cada um contendo mutações de cisteina para serina, e em seguida usado para sequenciação segundo o método de terminação de cadeia com dideoxinucleotidos de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467 (1977). As RF de DNA foram então preparadas a partir de três clones, cada um contendo uma das mutações especificadas e, após eliminagem com EcoRl e Sal 1, os fragmentos inseridos do gene FGF libertados foram isolados por electroforese através de um gel de agarose. Os fragmentos inseridos, purificados, de 440 pb foram ligados cada um ao fragmento de DNA de 2,7 kb EcoRl-Sall do vector de expressão que contêm um promotor tac pIQÍ 2,7 em 10 μΐ de TRIS pH 7,8 25 mM, 10 mM MgCl^, 1 mM DTT, 0,4 mM ATP com 3 unidades de ligase de DNA de T4 durante 2 horas a 14^0. Os DNAs ligados foram usados para transformar células competentes DH5 e os clones que contêm DNA com os codões Cis mutados foram seleccionados por hibridação com um oligomero apropriado.
fragmento inserido do FGF no DNA do plasmideo destes clones foi completamente sequenciado usando o método químico de Maxam and Gilbert, Methods in Enzymology 65: 499-560 (I98O). Um clone continha somente a troca de uma base única do clone de expressão original de aFGF humano, gerando um codão de resina no lugar do codão de cisteina na posição 83 e θ designado por pKK-haFGF (Ser 83).
Os clones que contêm cada uma das outras duas mutações de cisteina para serina também continham trocas não especificas adicionais. Com o objectivo de gerar os mutantes de uma única base desejados foram realizados as seguintes ligações e transformações. 0 frag-6ο-
mento de DNA de 410 pb de HindIII do clone com o codão de serina na posição l6 foi isolado e ligado ao fragmento HindIII de 2,7 Rb do clone de expressão original pKK-haFGF.
fragmento de DNA de 230 pb Ncol-Sall do clone que contem o codão de serina na posição 117 foi isolado e ligado ao fragmento de 2,9 kb Ncol-Sall de pKK-haFGF. Cada uma destas aâiostras foi usada para transformar células DH5 competentes; foram usadas técnicas de hibridação e sequenciação para identificar os outros dois mutantes de uma só base desejados e designados por pKK-haFGF (Ser 16) e pKK-haFGF (Ser 117). Estes três clones foram usados para a produção das formas de aFGF humano Ser l6, Ser 83 © Ser 117.
Mutantes de aFGF humano dirigidos a um sitio com dois ou três resíduos de cisteina (Cis) convertidos em serina (ser) foram construídos por combinação de fragmentos de restrição de genes sintéticos mutantes Ser (ló), Ser 83 © Ser 117 © do tipo selvagem não mutado, foram clonados em pKK 2,7 e subclonados em Ml3mpl8 como descrito acima. Os recombinantes pIQC-haFGF (Ser 16,83) θ pKK-haFGF (Ser l6, 117) foram construídos por introdução do fragmento de 0,23 Rb EcoRl-BamHl de M13mpl8 (Ser l6), que inclui o codão para Ser 16, em pldc 2,7 seguido de inserção dos fragmentos de 0,2 kb BamHl-Sall quer de M13mpl8 (Ser 83) quer de M13 mpl8 (Ser 117). Uma vez que o vector pkk 2,7 contem dois sítios BamHl, um na sequência multiclonal e o segundo acima do promotor tac, foi usado nestas cons truções um vector pkk 2,7 modificado, no qual foi eliminado o segundo sitio BamHl. Após digestão com as correspondentes enzimas de restrição, subsequente ligação e transformação de células competentes Abl899 (E. coli Genetic Stock Center) os clones resistentes à ampicilina foram testados para os plasmideos com o peso molecular esperado para os recombinantes (3,1 kb).
mutante haFGF (Ser 16, 83, 117)
-6lfoi construído por substituição do fragmento de 0,13 kb Spbl-Sall de pkk-haFGF (Ser 16,83) pelo fragmento correspondente de pKK (Ser 117) que codifica para Ser no lugar de Cis na posição 117. 0 fragmento de 3kb Sph. 1-Sall de pkk (Ser 16,83) foi purificado por electroforese através de um gel preparativo de agarose, electroeluição e ligado ao fragmento de 0,13 kb Splil-Sall de pkk (Ser 117) purificado a partir de um gel de poliacrilamida a 5$ da mesma maneira. Os fragmentos purificados foram ligados e os recombinantes selecctonados para resistência à ampicilina apos transformação de células AB1899·
Para a construção de pKK-haFGF (Ser 83,117), o fragmento de 0,3 kb Pstl de pKK-haFGF foi substituído pelo menos fragmento de pKK-haFGF (Ser 16,83, 117) que inclui os codões para Ser em vez de Cis nas posições 83 e 117 usando, basicamente, a mesma estratégica. As ceíulas transformadas de AB1899 foram seleccionadas para resistência à ampicilina e analisadas por digestão com Pstl e Sall para determinar a orientação dos fragmentos ligados. Todos os genes mutantes foram sequenciados pelo método dideoxi usando reagentes para seque nciação Standard! zadas da USB Corp.
EXEMPLO 5
Expressão do gene sintético bovino aFGF
Os genes de aFGF intactos do
Exemplo 4 foram incorporados num plasmideo pkk 223-3 modificado. 0 plasmideo pkk 223-3 (Pharmacia) contém o promotor tac o qual é um hibrido entre regiões dos promotores trp e lac, de Baer et al.. Proc. Natl. Acad. Sei USA 80: 2125 (1983)· Este plasmideo também contem o sinal de terminação da transcrição rrnB de rRNA que é uma sequência de terminação forte capaz de permitir a expressão de promotores fortes, Gentz et al. ,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 4936-4940 (1981); Brosina, Gene 2£: 161-172 (1984). 0 plasmideo pKK 223-3 Foi modificado de forma a remover o sitio para a enzima de restrição Sall derivado de pBR322. Isto foi conseguido por clivagem do DNA do plasmideo pKK223-3 com Ndel e Narl seguido de tratamento do fragmento de DNA com o fragmento Klenow de DNA polimerase de modo a tornar as extremidades cegas e recircularização do fragmento de DNA de 2,7 kb para gerar o clone pKK 2,7. 0 gene afGF sintético foi então clivado do vactor pBR322 e transferido para pKK 2,7 após restrição deste vector de expressão com EcoRl e Sall. Esta construção posiciona a metionina inicial do gene sintético, 11 bases abaixo do sitio Shine-Dalgarno de ligação aos ribossomas. Os vectores recombinantes resultantes, como exemplificado na Figura 1, foram usados para transformar células de E. coli JM 105 e de E. coli DH5.
Os clones de expressão cresceram a 37QC em meio LB (1$ triptona, 0,5$ de extracto de levedura, 0,5$ de NaCl) contendo 0,4$ de glucose e 50 pg/ml de ampicilina. Quando a densidade éptia a 550 nm atingiu 0,5, foi adicionado IPTG até 1 mM e o crescimento é continuado durante 3 horas a 37SC. As células são colhidas por centrifugação a 10 000 g durante 20 minutos e as células de 1 litro de cultura são ressuspensas em tampão glicerol/fosfato salino 1:1 e congeladas rapidamente num banho de gelo/etanol e guardadas durante a noite a -70SC.
EXEMPLO 6
Vector de expressão aumentado
Niveis aumentados de expressão para as formas mutadas de aFGF do Exemplo 4 foram conseguidos por modificação do vector de expressão do Exemplo 3 de modo a introduzir um cistrão adicional acima da sequência que codifica para aFGF. Foram sintetizados dois oligonucleotidos com as sequências mostradas na pag 4o. Quando fundidos estes oligomeros fornecem extensões de 4 bases na extremidade 5’ que são complementares às extensões fornecidas pela clivagem com EcoRI, uma grelha de leitura aberta de 7 codões a seguir ao codão de iniciação da tradução ÀIG e antes do codão de paragem TAA e, um sitio Shine-Dalgarno de ligação aos ribossomas, adicional, localizado na grelha de leitura aberta acima do codão de paragem. Usando 1 pmole de cada oligomero, os oligomeros foram fundidos juntamente em 20 pl de tampão de ligasa de DNA por aquecimento a 70sC durante 10 minutos seguido de arrefecimento lento. A mistura fundida 0,3 pmole, foi ligada a 0,1 pmole de DNA do plasmideo pkk- haFGF clivado com EcoRI num volume final de 25 jxl contendo 3 unidades de ligase de DNA de T4 (Pharmacia) durante 2,5 horas a l4sc. 0 DNA ligado, 5 ng, foi usado para transformar células competentes de E. coli JM 105. As células transformadas foram testadas por analise de restrição uma vez que o sitio EcoRi é perdido durante a inserção, e por analise por imniunoblotn. 0 vector de expressão de um clone que demonstrou altos niveis de produção do FGF foi sequenciado pela técnica quimica de Maxam and Gilbert, supra, para verificar a inserção correcta das novas sequências do cistrão Subsequentemente, este vector de alta expressão pKK2c-haFGF foi transferido de E. coli DH5 través de processos de trans formação.
Com o objectivo de exprimir o gene mutante liaFGF (Ser 117), por exemplo, neste vector de alta expressão, o fragmento de 0,23 kb Ncol-Sall de pkk-liaFGF (Ser 117) foi ligado ao fragmento de 2,5 kb Ncol-Sall de pKKac-liaFGF e usado para transformar células competentes. Os outros haFGFs mutados foram transferidos para o vector de alta expressão com dois cistrões, de uma forma similar, substtituindo os fragmentos de restrição apropriados que contêm sequências do tipo selvagem de pIíE2c-liaFGF, por fragmentos de restrição análogos de h.aFGF mutado.
EXEMPLO 7
Extracção e purificação de aFGF mutado
As células congeladas do exemplo 5 foram descongeladas e ressuspensas, numa quantidade suficiente para perfazer 50 ml, em tampão fosfato pH 7,2 100 mM contendo 5 mg/ml de EDTA após o que foram colhidas por centii fugação a 28000 g durante 5 minutos. As células foram lavadas uma segunda vez, colhidos por centrifugação e ressuspensas em 50 ml do mesmo tampão. As extinções das três suspensões de estirpes de mutantes a 66o nm foram: estirpe pKK-haFGF (Ser 117), 103; estirpe pkk-haFGF (Ser 83), 59; estirpe pKK-haFGF (Ser l6), 108. A cada amostra foi adicionado 0,1 mg/ml de lisozima e incubada durante 15 minutos com agitação suave a 3020. As células foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em 50 ml de tampão de destruição que consiste em fosfato pH 6,0 100 mM, 3 mM EDTA, 0,05 mM TPCK, 0,05 mM Pepsatina A, 0,05 mM Leupeptina e 15 yg/ml de ΒΡΤ1. Cada suspensão celular é guardada a 420 e destruída por duas pasqagens através de um compartimento de pressão francês previamente arrefecido, a 20000 psi a 4-20. As suspensões celulares disruptas foram centrifugadas durante 15 minutos a 15 000 rpm num rotor SS-3^· Sorvall e durante 6o minutos a 45000 rpm num rotor 70 Ti numa ultracentrifuga Beckman a 4sc. Os fluidos sobrenadantes são colhidos e as extinções a 280 nm para um volume de 55 ml foram determinadas: pkk-haFGF (Ser 117), pKK-haFGF (Ser l6), 4o e pkk-haFGF (Ser 83), 23; as amostras foram congeladas a -7O2C.
Os fluidos sobrenadantes foram descongelados por adição de 200 ml de tampão fosfato pH 6,0 100 mM que continha CM-Sephadex à razão de 6,5 ml de resina sedimentada por grama de proteína (assumindo que a absorvância através de uma fenda de 1 cm de 1 mg/ml de proteina em solução é de 1,0). As amostras são colhidas num funil poroso de vidro e lavadas três vezes com 200 ml de tampão fosfato pH 6,0 100 mM que contem 150 mM NaCl, 0 bolo da resina foi ressuspenso em 200 ml do mesmo tampão, empacotado
-1 2 numa coluna, a 12 ml x hr por cm de secção, ArGA e lavadj à mesma velocidade com tampão fosfato 150 mM contendo 6θθ mM NaCl. As fracçóes que contêm a proteina são eluidas com o tampão 600 mM NaCl, reunidas e o pH ajustado a 7,2 e a condutividade ajustada com água desionizada a 10 jiS !6 cm · Heparina-Sepharose (preparada fresca) equilibrada com fosfa to pH 7,2 10 mM foi então adicionada à razão del ml de resiJi sedimentada por mg de proteina (usando o mesmo coeficiente de extinção assumido acima), a suspensão foi agitada suavemente durante 1 hora a 4SC e a resina colhida num funil, ressuspensa no mesmo tampão e empacotada numa coluna à razão de 1-2 volumes de coluna por hora. A coluna empacotada foi lavada com fosfato 10 mM, 0,8 M NaCl pH 7,2 à mesma velocidade até a extinção do eluido, a 280 nm, descer para um valor estável de cerca de 0,01 unidades épticas de absorvância acima do tampão de eluição após o que o tampão é mudado para fosfato 10 mM, 1,5 M NaCl pH 7,2. As fracçóes que contêm a proteina com o tampão 1,5 M (controlada pela extinção a 280 nm) é reunida, aplicada a uma coluna C^ de HPLC de fase reversa equilibrada com TFA 10 mM e eluida com um gradiente de 0-67$ de CH^CN em 3θ minutos.
Os dados da purificação dos diferentes estirpes é mostrado abaixo:
pKK-haFGF (Ser l6):
Às fracçoes 25-31 eluidas da coluna de CM-Sephadex com o tampão NaCl 0,6 M, num volume total de 24 ml e contendo 3,5 mg de proteína foi acrescentada agua desionizada até 125 ml (condutividade final: 7 mS/cm) e 4 ml de heparina -Sepharose foram adicionados. A coluna foi corrida a 6 ml/h. Âs fracçoes 55-57 eluidas com 1,5 M NaCl foram injectadas numa coluna C^. Desta coluna o pico maior foi colhido e possuia um conteúdo em proteína de 80 jig.
pKK-haFGF (Ser 83):
Às fracçoes 19-33 eluidos da C£ luna de CM-Sephadex com o tampão de 0,6 M NaCl num volume total de 4o ml e com um conteúdo em proteína de 4,0 mg foi adicionado água desionizada (condutividade final:10 mS/cm) até perfazer 150 ml e 4 ml de heparina - Sepharose. A coluna foi corrida a 6 ml/h. Às fracçoes 40-44 eluidas com 1,5 M NaCl foram injectadas numa coluna C^, Desta coluna foi colhido o pico maior com um conteúdo em proteína de 80 pg.
-68•çjjBa-arasnzcwaaEE
pKK-haFGF (Ser 117):
Às fracçoes 19-33 eluidas da coluna de CM-Sephadex com tampão 0,6 M de NaCl num volume total de 57 ml e um conteúdo em proteina de 11,4 mg foi adicionada água desionizada (condutividade final: 12 mS/cm) g.té perfazer 250 ml e 10 ml de heparina-Sepharose, A coluna foi corrida a 11 ml/h. As fracçoes 59-62, eluidas com 1,5 M NaCl, foram injectadas numa coluna C^· Desta coluna foi colhido o pico maior com um conteúdo em proteina de 6l4 &g·
Os produtos proteicos dos múltiplos mutantes foram purificados pelos mesmos processos· Todas as formas de aFGF, tipo selvagem recombinante e mutantes foram altamente purificados uma vez que apenas foram observadas bandas de 16 ICDa após redução e electroforese através de um gel de 15$ de poliacrilamida com SDS com apli cações 100 vezes superiores ao limite de detecção.
EXEMPLO 7
Actividade biológica do aFGF mutagenizado
A actividade biológica do r-aFGF purificado do Exemplo 6 foi avaliada usando um ensaio mitogenico de fibroblastos modificado a partir de Thomas et al.. J. Biol. Chem. 225: 5517-5520 (1980). Fibroblastos de Balb/C 3T3 A31 (American Type Culture Collection) foram 4 semeados a 3x10 células por 100 yl por compartimento em placas de cultura de 96 compartimentos num meio de cultura que contém 10¾ de soro de vitela inacbivado pelo calor e, incubados em 7¾ Co^ (pH 7,35 - 0,05). As células tornam-se completamente estacionárias por substituição do meio com soro de vitela inactivado pelo calor a 1,0¾ ó e 24 íjoras mais íarde. Às 55 horas apés as células terem sido semeadas foram adicionados 10 yl da amostra a testar com ou sem 5 jig de heparina e 0,11 yg de dexametasona, às 70 horas cada compartimento foi suplementado com 0,2 pCi de /metil- H 7“ -timidina (20 Ci/mole, New England Nuclear) e 0,3 Jig de tiraidina não marcada (Sigma) e, às 95 horas as células são procuradas para determinação da radioactividade incorporada no DNA. Cada ponto de resposta à dose é a média de quatro determinações. Os resultados com o mutante Ser-117, a única forma de mutante com actividade igual ou superior ao tipo selvagem, são mostrados na tabela seguinte·
TABELA XII
Respostas Mitogénicas de Fibroblastos de Balb/C 3T3 a aFGF Mutagenizado
| Dose (amt/ml) | tipo selvagem | Mutante Ser-117 | ||
| -hepari nS | +hepari n a | -hepari na | +heparina | |
| 3.16 pg | 1449 | 724 | 2055 | 883 |
| 10.0 pg | 1917 | 914 | 2662 | 1255 |
| 31.6 pg | 1547 | 1007 | 3076 | 2748 |
| 100 pg | 2263 | 2498 | 4833 | 8067 |
| 316 pg | 2647 | 14945 | 11505 | 44193 |
| 1.00 ng | 3975 | 54516 | 22869 | 66778 |
| 3.16 ng | 6400 | 68447 | 40487 | 60306 |
| 10.0 ng | 12665 | 61294 | 54163 | 56326 |
| 31.6 ng | 21843 | 56552 | 70670 | 59854 |
| 100 ng | 44744 | 66816 | 66802 | 63856 |
As 4 curvas de titulação são comparadas pelo seu crescimento semi-máximo. 0 WT na ausência de heparina não alcança um pico e, por isso, é assumida uma magnitude do pico semelhante ã dos outros 3 e o valor semi-máximo extrapolado.
TABELA XIII
Comparação das concentrações necessárias para uma estimula ção semi-máxima
Amostra
Heparina Cone, da estimulação 1/2 Máxima
WT ng/rnl 0,56 ng/ml
Ser-117 Mutante
2,3 ng/ml 0,20 ng/ml
Todas as diluições foram preparadas a partir duma solução mãe que contém 1,51 mg/ml de reagentes purificados. 0 mutante Ser-117 é pelo menos tão activo como o tipo selvagem na presença de heparina. À actividade do tipo selvagem é pelo menos 10 vezes mais dependente em heparina do que o mutante e, consequentemente, 9θ$ da(fependencia em heparina do aFGF de ¥T é eliminada no mutante Ser-117.
ensaio mitogeniao usado para avaliar a actividade biologica foi modificado da forma a poderem ser comparados os aFGF de tipo selvagem e mutagenizados, 0 soro de vitela inactivado pelo calor foi substitui do por 15$ de insulina-selenio-transferina (iTS), 0,4 gm de L-histidina, 50 yl de 1M etanolamina, 1,25 gm de albumina bovina de soro, por 5,35 mg de ácido linoleico por litro de 75$ DMED, 25$ de Ham F12 contendo penicilina-estreptimicina e 2-glutamina como descrito acima. Os ensaios de dose-resposta completa foram realizados como descrito acima com diluições sucessivas a 1:2 até pelo menos 3 log de ordem de concentração de aFGF, cobrindo o aumento completo da resposta em relação ao fundo através do pico de niveis de sintese de DNA. Todos os pontos de concentração foram feitos em quadruplicado, em células Balb/C 3T3 confluentes em placas de 96 compartimentos. Uma unidade estimuladora é calculada como a quantidade de aFGF por ml que gera a resposta semi-máxima. Á actividade mitogenica especifica é o numero de unidades estimuladoras por mg de aFGF puro. Todas as amostras de aFGF foram prediluidas a 50 yg/ml no mesmo solvente de TFA/CH^CN. As actividades do a aFGF de tipo selvagem ou mutagenizado são comparadas na Tabela seguinte.
TABELA XIV
| Amostra | Com Heparina | Sem Heparina | Vezes de Aumento |
| WT | 5,37 ng/ml (0,186 X 106) | 269 pg/ml (3,72 X 106) | 20,0 |
| Ser 16 | 33,9 ng/ml (0,.030 x 106) | 400 pg/ml (2,50 X 106) | 84,8 |
| Ser 83 | 4,36 ng/ml (0,229 X 106) | 251 pg/ml (3,98 x 106) | 17,4 |
| Ser 117 | 182 ng/ml (0,549 x 106) | 240 pg/ml (4,17 x 106) | 7^58 |
| Ser 16,83 | 800 pg/ml (1,25 x 106) | 195 pg/ml (5,13 x 106) | 4,10 |
| Ser 16,117 | 741 pg/ml (1,35 X 106) | 148 pg/ml (6,76 X 106) | 5,01 |
| Ser 83,117 | 295 pg/ml (3,39 X 106) | 100 pg/ml (10,0 x 106) | 2Z95 |
| Ser 16,83,117 | 427 pg/ml (2,34 X 106) | 107 pg/ml (9,35 X 106) | 3,99 |
X
As estabilidades relativas do haFGF recombinar.te de tipo selvagem, dos mutantes de uma só Ser e dos mutantes de múltiplos Ser foram determinadas. As actividades mitogénicas foram medidas após 0, 1 e 8 dias de incubação em soluções de DME livres de soro, normalmente usados para diluições em série das amostras que foram tamponadas a pH 7,3 com CO^ a 379C, contendo 1 mg/ml de albumina do soro humano. As amostras mitogénicas são guardadas a 512 mg/ml, com ou sem 500 pg/ml de heparina, equivalentes a concentrações 10 vezes, dos quais o mais alto ponto de concentração no ensaio é diluido. Cada ensaio foi guardado e ensaiado quer na presença quer na ausência de heparina.
As estabilidades relativas escaladas de forma a que cada actividade do dia 0 seja de 100^, são mostradas na Figura 2 em função do tempo de armazenamento. Na Fig. 2Ycorresponde ao tipo selvagem; A corresponde ao haFGF (Ser ló); 0 corresponde ao haFGF (ser 83);O corresponde ao haFGF (Ser 117 ); \7 corresponde ao haFGF (Ser ló,83);Δcorresponde ao haFGF (Ser ló,117)·Π corresponde ao haFGF (Ser 83,117);
corresponde ao haFGF (Ser 10,83,117).
A perda de actividade do tipo selvagem e de mutantes de haFGF na presença de heparina enquadra-se preferivelmente numa queda experimental, ver a Fig. 4a. As actividades de todos os mutantes excepto Ser (l6) sSo mais estáveis que as do tipo selvagem mitogenico. Os mutantes mais estáveis são Ser (16,83,117), Ser (117), Ser (ló,83), Ser (83,117), Ser (16,83) e Ser (83), Ser (ló) A estabilidade do Ser (83) foi apenas um pouco maior que a do tipo selvagem. As várias formas de aFGF são menos estáveis na ausência de heparina e, com a. aparente excepção do Ser (l6,83,117), o decaimento parece não ser uma função exponencial simples em relação ao periodo de tempo.
Uma amostra do vector de expres-75-
são pKK-haFGF (Ser 117) designada, por Α^-8-la 1 contendo um gene capaz de exprimir o mutante serina 117 em E. coli DM5 foi depositado na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA, em 30 de Setembro de 1987 sob o tratado de Budapeste e foi-lhe dado o numero 67522 da ATCC.
Claims (41)
- REIVINDICAÇÕES;1&. - Processo para a produção de formas microheterogenicas de um mutante recombinante humano, activo biologicamente, do factor de crescimento ácido de fibroblastos caracterizado por compreender os seguintes passos;a. inclusão num plasmideo, que contem a sequência de nucleotideos que codifica o mutante humano microheterogénico do factor de crescimento ácido de fibroblastos, da sequência a ser expressa por um hospedeiro que contem o plasmideo, seguido deb. incorporação do plasmideo num hospedeiro; ec. manutenção do hospedeiro que contem o plasmideo sob condições propicias para a expressão da sequência de nucleotideos que produz o mutante recombinante humano microheterogénico do factor de crescimento ácido de fibroblastos.
- 2&. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano, activo biologicamente de formas microheterogenicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos .
- 3- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano, activo biologicamente, de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos que compreende a substituição de um ou mais resíduos de cisteina nas posições l6, 83 θ 117, numerados de acordo com a forma microheterogénica nativa humana de l4o aminoácidos, por um aminoácido incapaz de formar ligações dissulfureto intramoleculares ou intermoleculares e, opcionalmente, tendo uma metionina adicional ligada ao vulgarmente considerado como primeiro aminoácido na extremidade N da referida forma heterogénica.
- 4®, - Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano das formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos em que o mutante do factor de crescimento ácido de fibroblastos é da forma microheterogánica de 154, l4o ou 139 aminoácidos.
- 5-. - Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano das formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos em que o aminoácido substituído é a serina.
- 6^, - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano, activo biologicamente, de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos que compreende a substituição de todas as três cisternas nas posições 16, 83 ® 117, numeradas de acordo com a forma microheterogénica nativa humana de ΐ4θ aminoácidos, por um aminoácido incapaz de foimar ligações dissulfureto intramoleculares ou intermoleculares e, opcionalmente, contendo uma metionina adicional ligada ao geralmente considera· do como primeiro aminoácido na extremidade terminal das referidas formas microheterogénicas.
- 7S. - Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos em que o mutante do factor de crescimento ácido de fibroblastos pertence à forma microheterogénica de 154, l4o ou 139 aminbácidos.
- 8®. - Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano de formas microheterogenicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos em que o aminoácido substituido é a serina.
- 95. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano, activo biologicamente, de formas microheterogenicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos que oompreende a substituição de dois quaisquer residuos de cisteina nas posições 16, 83 ou 117, numerados de acordo com a forma microheterogénica nativa humana de l4o aminoácidos, por um aminoácido incapaz de formar ligações dissulfureto int ramo le cu lares ou intermuleculares e, opcionalmente contendo uma metionina adicional ligada ao geralmente considerado como primeiro aminoácido na extremidade terminal N da referida forma microheterogénica.
- 10^. - processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano de formas microheterogenicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos em que o mutante do factor de crescimento ácido de fibroblastos pertence â forma microheterogénica de 154, l4o ou 139 aminoácidos.115. - Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano de formas microheterogenicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos em que o aminoácido substituido é a serina.-7912®. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano, activo biologicamente, de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos que compreende a substituição da cisteina da posição 117, numerados de acordo com o forma microheterogénica nativa humana de l4o aminoácidos, por um aminoãcido incapaz de formar ligações dissulfureto intramoleculares ou intermoleculares e, opcionalmente, contendo uma metionina adicional ligada ao vulgarmente considerado como primeiro aminoãcido na extremidade terminal N do referido mutante do factor de crescimento ácido de fibroblastos e que é detentor de maior actividade biologica do que o factor de crescimento ácido de fibroblastos nativo humano.
- 13®. - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factoide crescimento ácido de fibrobladbos é da forma microheterogénica de 154, l4o ou 139 aminoácidos.
- 14®. - Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos em que o aminoácido substituido é a serina.
- 15®. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano, activo biologicamente, de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos das reivindicações 1, 2, 5, 8 ou 11 em que o residuo de metionina na posição 67, numerado de acordo com a forma microheterogénica nativa humana de l4o aminoácidos, é substituido por um aminoácido não oxidável e, opcionalmente, contendo uma metionina adicional ligada ao geralmente considerado como primeiro aminoacido na extremidade terminal N das referidas formas microheterogénicas.léa. - processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do faotor de crescimento ácido de fibroblastos em que o amino ácido não oxidável pelo ar é a alanina, valina, leucina ou isoleucina.
- 17-» - Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o aminõácido ser a leucina.
- 18§·. - Processo, para a produção de uma sequência de nucleotideos caracterizado por se obter uma sequência que codifica o mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 3.
- 19&. - Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se produzir uma sequência de nucleotideos em que está ligado acima da referida sequência que codifica o mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos, um cistrão que aumenta a expressão do factor de crescimento ácido de fibroblastos.
- 20s. - Processo, para a produção de uma sequência de nucleotideos caracterizado por obter uma sequência que codifica o mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 6.—81-
- 21a. - Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se produzir uma sequência de nucleotidos em que está ligado acima da referida sequência que codifica o mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos, um cristão que aumenta a expressão do factor de crescimento ácido de fibroblastos.
- 22&. - Processo para a produção de uma sequência de nucleotidos caracterizado por se obter uma sequência que codifica o mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação9.
- 23a. - Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por se produzir uma sequência de nucleotidos em que está ligado acima da dita sequência que codifica para o mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos, um cristão que aumenta a expressão do factor de crescimento ácido de fibroblastos*
- 24 a. - Processo para a produção de uma sequência de nucleotidos caracterizado por se obter uma sequência que codifica o mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 12.
- 25a. - Processo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por se produzir uma sequência de nucleotidos em que está ligado acima da referida sequencia que codifica para o mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos, um cistão que aumenta a expressão do factor de crescimento ácido de fibroblastos.
- 26®. - Processo para a produção de uma sequência de nucleotidos caracterizado por se obter uma sequência que codifica o mutante recombinante humano de formas microheterogénica do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 15.
- 27-· - Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por se produzir uma se* quência de nucleotidos em que está ligado acima da referida sequência que codifica para o mutante recombinante humano de formas microheterogánicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos, um cistrão que aumenta a expressão do factor de crescimento ácido de fibroblastos.
- 28^. - Processo para a produção de uma composição farmacêutica para a reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e para a produção de activador do plasminogánio, caracterizado por se incluir na referida composição um veiculo farmacêutico e uma quantidade eficaz , do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 2.
- 29^. - Processo para a produção de uma composição farmacêutica para a reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e para a produção de activador do plasminogánio, caracterizado por se incluir na referida composição um suporte farmacêutico a uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo _ com a reivindicação 3.
- 30®. - Processo, para a produção de uma composição farmacêutica para a reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e para a produção de activador do plasminogénio, caracterizado por se incluir na referida composição um suporte farmacêutico e uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano microheterogénico do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 6.
- 31®. - Processo, para a produção de uma composição farmacêutica para a reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e para a produção de activador do plasminogénio, caracterizado por se incluir na referida composição um suporte farmacêutico e uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 9·
- 32®. - Processo para a produção de uma composição farmacêutica para a reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e para a produção de activador do plasminogénio, caracterizado por se incluir na referida composição um suporte farmacêutico e uma quantidade eficaz di mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos da reivindicação 12.
- 33®. - Processo para a produção de uma composição farmacêutica para a reparação de tecido mole, tecido muscular do esueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e para a produção de activador do plasminogénio, caracterizado por se incluir na referida composição um suporte farmacêutico e uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas mioroheterogénicos do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 15.
- 34a. - Método para a promoção da reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e da promoção da produção de activador do plasminogénio carac teriza.do por compreender a administração a um paciente que necessite de tal tratamento de uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 2, sendo as gamas de dosagem de substância activa as seguintes:a) Reparação de tecido molea.l) Administração tópica: cerca de 0,1 a cerca de 100 pg/ /cin /dia.ía»2) Administração subcutânea: cerca de 1 a cerca de 100 pg/O /cnr/dia.b) Reparação do tecido muscular do esqueleto e da cartilagem:b. l) Administração no local:cerca de 10 a cerca de 100 pg/ /cnr/dia.c) Angiogénese in, vivo:c. l) Administração subcutânea: cerca de 1 a cerca de 1000 pg/cnr /dia.c.2) Administração tópica: cerca de 100 ng a cerca de 100O pg/cnr/dia.d) Reparação de vasos grandesOd.l) Dose única: cerca de 0,1 a cerca de 100 ng/cm .d. 2) Infusão contínua: cerca de 1 a cerca de 1000 pg/cnr / /dia.e) Produção de activador de plasminogénioe. l) cerca de 10 jig a cerca de 10 mg/kg/dia.
- 35-. - Método para a promoção da reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e de promoção da produção de activador do plasminogénio caracterizado por compreender a administração a um paciente que necessite de tal tratamento de uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do faetor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 3, sendo a gama de dosagem de substância activa como referido na reivindicação 34.3ú&. - Método para a promoção da reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e de promoção da produção de activador do plasminogénio caracterizado por compreender a administração a um paciente que necessite de tal tratamento de uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do faetor de crescimento acido de fibroblastos obtido de acordo com a rei vindicação 6, sendo a gama de dosagem de substância activa como referido na reivindicação 34.
- 37-. - Método para a promoção da reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e da promoção da produção de activador do plasminogénio caracterizado por compreender a administração a um paciente que necessite de tal tratamento de uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 9, sendo a gama de dosagem de substância activa como referido na reivindicação
- 38 &. - Método para a promoção da reparação de tecido mole, tecido muscular do eqqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e de promoção da produção de activador de plasminogénio caracterizado por compreender a administração a um paciente que necessite de tal tratamento de uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 12, sendo a gama de dosagem de substância activa como referido na reivindicação 34.
- 39“· - Método para a promoção da reparação de tecido mole, tecido muscular do esqueleto, cartilagem, tecido vascular e tecido nervoso e de promoção da produção de activador do plasminogénio caracterizado por compreender a administração a um paciente que necessite de tal tratamento de uma quantidade eficaz do mutante recombinante humano de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos obtido de acordo com a reivindicação 15, sendo a gama de dosagem de substância activa como referido na reivindicação 34.
- 40^. - Processo para a produção de um mutante recombinante bovino, activo biologicamente de formas microheterogénicas do factor de crescimento ácido de fibroblastos caracterizado por compreender a substituição de um ou mais residuos de cisteina nas posições 16, 47 e 83, numerados de acordo com a forma microheterogánica nativa bovina de l4o aminoácidos por um aminoácido incapaz de formar ligações dissulfureto intramoleculares ou intermoleculares e, opcionalmente, contendo uma metionina adicional ligada ao geralmente considerado como primeiro aminoácido na extremidade terminal N da referida forma microheterogénica.4l&, - Processo, de acordo com a reivindicação 4o, caracterizado por se produzir um mutante recombinante bovino do factor de crescimento ácido de fibroblastos microbeterogénico da reivindicação 40 em que o residuo de metionina na posição 67, numerado de acordo com a for ma microheterogánica nativa bovina de l4o aminoácidos, á substituído por um aminoácido não oxidável pelo ar e, opcionalmente, contendo uma metionina adicional ligada ao que é geralmente considerado como primeiro aminoácido na extremidade terminal N das referidas formas microheterogánicas·
- 42&, - Processo para a produção de um mutante recombinante humano, biologicamente activo do factor de crescimento ácido de fibroblastos caracterizado por se incluir no referido mutante a seguinte sequência de aminoácidos:V-14 -10 -1 1Al a-Gl u—G7 y—G1 u-Π e-Thr-Thr-Phe-Thr-Al a-Leu-Thr-Gl u-Lys-Phe-Asn-Leu-Pro10 20 Pro-Gly-Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro-Lys-Leu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Asn-GI y-Gly-Ηϊ s-Phe30 40Leu-Arg-Ile-Leu-Pro-Asp-Gly-Thr-Val-Asp-Gly-Thr-Arg-Asp-Arg-Ser-Asp-Gln50Hi s-Π e-Gl n-Leu-Gl n-Leu-Ser-Al a-Gl u-Ser-Val -G1 y-Gl u-Val -Tyr-Il e-Lys-Ser-Thr60 70G1u-Thr-Gly-Gl n-Tyr-Leu-Ala-Met-Asp-Thr-Asp-Gly-Leu-Leu-Tyr-Gly-Ser-Gln80 90Thr-Pro-Asn-Gl u-Glu-Ser-Leu-Phe-Leu-GIu-Arg-Leu-Glu-Glu-Asn-Hi s-Tyr-Asn100 110 Thr-Tyr-Π e-Ser-Lys-Lys-Hi s-Al a-Gl u-Lys-Asn-T rp-Phe-Val-Gl y-Leu-Lys-Lys120 130Asn-Gly-Ser-Ser-Lys-Arg-Gly-Pro-Arg-Thr-His-Tyr-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu140Phe-Leu-Pro-Leu-Pro-Val-Ser-Ser-Asp e todas as suas formas microheterogénicas com, opcionalmente uma metionina adicional ligada ao que é geralmente considera do como primeiro aminoácido na extremidade terminal N da referida forma microlieterogénioa.
- 43a. - Processo, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano do factor de crescimento ácido de fibroblastos microheterogénico em que o resíduo de metionina na posição 67 é substituído por leucina.
- 44 a. - Processo para a produção de um mutante recombinante humano activo biologicamente do factor de crescimento ácido de fibroblastos, caracterizado por se incluir no referido mutante a seguinte sequência de aminoácidos:-14 -10 -1 1Ala-Glu-Gly-Glu-Ile-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-Glu-Lys-Phe-Asn-Leu-Pro10 20 Pro-Gly-Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro-Lys-Leu-Leu-Tyr-Cys-Ser-Asn-Gly-Gly-His-Pha30 40Leu-Arg-Il e-Leu-Pro-Asp-Gl y-Thr-Val-Asp-Gly-Thr-Arg-Asp-Arg-Ser-Asp-Gln50His-Ile-Gl n-Leu-Gln-Leu-Ser-Al a-Gl u-Ser-Val -G1 y-Glu-Val-Tyr-Ile-Lys-Ser-Thr60 70G1u-Thr-Gly-Gln-Tyr-Leu-Ala-Met-Asp-Thr-Asp-Gly-Leu-Leu-Tyr-Gly-Ser-Gln80 90Thr-Pro-Asn-Glu-Glu-Ser-Leu-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Glu-Glu-Asn-Hi s-Tyr-Asn100 noThr-Tyr-Πe-Ser-Lys-Lys-Hi s-Ala-Glu-Lys-Asn-T rp-Phe-Val-G1 y-Leu-Lys-Lys120130Asn-Gly-Ser-Ser-Lys-Arg-Gly-Pro-Arg-Thr-Hi s-Tyr-Gly-Gln-lys-Ala-Ile-LeuPhe-Leu-Pro-Leu-Pro-Val-Ser-Ser-Asp140 e todas as suas formas microheterogénicas com, opcionalmente uma metionina adicional ligada ao que é geralmente considerado como primeiro aminoácido na extremidade terminal N da referida forma microheterogénica.
- 45-. - Processo, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano do factor de crescimento ácido de fibroblastos microheterogánico em que o residuo de metionina na posição 67 é substituído por leucina.
- 46ã. - Processo para a produção de um mutante recombinante humano activo biologicamente do factor de crescimento ácido de fibroblastos caracterizado por se incluir no referido mutante a seguinte sequência de aminoácidos:-1 1Ala-Glu-Gly-Glu-Ile-Thr-Thr-Phe-Thr-Ala-Leu-Thr-G1u-Lys-Phe-Asn-Leu-Pro10 20 Pro-Gly-Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro-Lys-Leu-Leu-Tyr-Cys-Ser-Asn-Gly-Gly-His-Phe30 40Leu-Arg-Πe-Leu-Pro-Asp-Gly-Thr-Val-Asp-Gly-Thr-Arg-Asp-Arg-Ser-Asp-Gln50Hi s—Π e-Gl n-Leu-Gl n-Leu-Ser-Al a-Gl u-Ser-Val-Gly-Gl u-Val-Tyr-Π e-Lys-Ser-Thr60 70G1u-Thr-Gly-Gln-Tyr-Leu-Ala-Met-Asp-Thr-Asp-Gly-Leu-Leu-Tyr-Gly-Ser-Gln80 90Thr-Pro-Asn-Glu-Glu-Cys-Leu-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Glu-GIu-Asn-Hi s-Tyr-Asn100 noThr-Ty r-Π e-Ser-Lys-Lys-Hi s-Al a-Gl u-Lys-Asn-Trp-Phe-Val-Gl y-Leu-Lys-Lys120 130Asn-Gl y-Ser-Ser-Lys-Arg-Gly-Pro-Arg-Thr-His-Tyr-Gly-GIn-Lys-Ala-Ile-Leu140Phe-Leu-Pro-Leu-Pro-Val-Ser-Ser-Asp e todas as suas formas microlieterogénicas com, opcionalmente uma metionina adicional ligada ao que e geralmente considerado como primeiro aminoácido na extremidade terminal N da referida forma microheterogénica.γ- α-9247-. - Processo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por se produzir um mutante recombinante humano do factor de crescimento ácido de fibroblastos microheterogénico da reivindicação 46 em que o residuo de metionina ha posição 67 é substituído por leucina
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| US5348941A (en) * | 1992-04-01 | 1994-09-20 | Merck & Co., Inc. | Stabilizers for fibroblast growth factors |
| US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
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| CH717226B1 (it) * | 2020-07-14 | 2021-09-30 | Contrad Swiss Sa | Idrogel per applicazione topica efficace nel limitare la degenerazione di tendini e muscoli. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL90047A (en) * | 1982-10-19 | 1992-12-01 | Cetus Oncology Corp | Cysteine-depleted biologically active muteins other than interferon - ' |
| US4711848A (en) * | 1984-03-14 | 1987-12-08 | Zymogenetics, Inc. | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
| EP0593065B1 (en) * | 1985-09-12 | 2002-08-21 | Scios Inc. | Recombinant fibroblast growth factors |
| US4868113A (en) * | 1986-03-03 | 1989-09-19 | Rorer Biotechnology, Inc. | Recombinant DNA vector encoding human endothelial cell growth factor |
-
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Effective date: 19921015 |
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| MM4A | Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent |
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