PT1518930E - Métodos e composições para inibir o crescimento de células neoplásticas - Google Patents

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PT1518930E
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Robert D Klein
William I Wood
Audrey Goddard
Avi Ashkenazi
Mary Napier
Jean Yuan
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Description

ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Métodos e composições para inibir o crescimento de células neoplásicas"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos e composições para inibir o crescimento de células neoplásicas. Em particular, a presente invenção refere-se a composições antitumorais e métodos para o tratamento de tumores. A invenção refere-se também a métodos de pesquisa para identificar compostos inibidores do crescimento, e.g. antitumorais.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os tumores malignos (cancros) são a segunda maior causa de morte nos Estados Unidos, a seguir à doença cardíaca (Boring et al.f CA Cancel J. Clin., 43:7 (1993)). 0 cancro caracteriza-se pelo aumento do número de células anormais ou neoplásicas derivadas de um tecido normal que proliferam para formar uma massa tumoral, pela invasão de tecidos adjacentes por estas células de tumor neoplásicas e pela produção de células malignas que eventualmente se propagam através do sangue ou sistema linfático até nódulos linfáticos regionais e para locais distantes (metástases). Num estado canceroso, uma célula prolifera sob condições em que as células normais não iriam crescer. 0 cancro manifesta-se numa grande variedade de formas que se caracterizam por diferentes graus de invasão e agressividade.
Em EP 0 861 894 Al descrevem-se um polipéptido, referido como Delta-1 humano, e suas variantes, e seus anticorpos. 0 polipéptido é discutido em relação à supressão da diferenciação de células sanguíneas indiferenciadas e está indicado que se espera que seja utilizável em medicamentos e produtos medicinais.
Apesar dos avanços recentes na terapia do cancro, há uma grande necessidade de novos agentes terapêuticos capazes de inibir o crescimento de células neoplásicas. Deste modo, 2 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ constitui um objectivo da presente invenção identificar compostos capazes de inibir o crescimento de células neoplásicas, tais como células cancerosas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições para inibir o crescimento de células neoplásicas e suas utilizações. Mais particularmente, a invenção refere-se a composições para o tratamento de tumores, incluindo cancros, tais como cancro da mama, próstata, cólon, pulmão, ovários, rins e SNC, leucemia, melanoma, etc., em pacientes mamíferos, de preferência seres humanos, e utilizações relacionadas.
Num aspecto, a presente invenção refere-se a composições de matéria úteis para inibir o crescimento de células neoplásicas, compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido PR0172, ou um seu fragmento, como definido nas reivindicações, ou um seu agonista, em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável. Numa concretização preferida, a composição de matéria compreende uma quantidade inibidora do crescimento de um polipéptido PR0172, ou um seu fragmento. Noutra concretização preferida, a composição compreende uma quantidade citotóxica de um polipéptido PR0172, ou um seu fragmento. As composições de matéria podem conter um ou mais agentes inibidores de crescimento e/ou citotóxicos e/ou quimioterapêuticos, adicionais.
Noutro aspecto, como definido nas reivindicações, a invenção refere-se a um método in vitro para inibir o crescimento de uma célula de tumor compreendendo expor a célula a uma quantidade eficaz de um polipéptido PR0172 ou um seu fragmento.
Ainda noutra concretização, a invenção refere-se a um artigo de fabrico compreendendo: um recipiente; e uma composição compreendendo um agente activo contido no recipiente; em que a composição é eficaz para inibir o crescimento de células neoplásicas, e.g., crescimento de células de tumor, e o agente activo na composição é um polipéptido PR0172 ou um seu fragmento, como definido na 3 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ reivindicação 1. Artigos de fabrico semelhantes compreendendo um polipéptido PR0172 ou um seu fragmento numa quantidade que é terapeuticamente eficaz para o tratamento de um tumor, também estão no âmbito da presente invenção. Os artigos de fabrico compreendem um polipéptido PR0172 ou um seu fragmento, e um agente inibidor de crescimento, um agente citotóxico ou um agente quimioterapêutico, adicional.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As Figuras 1A-B mostram uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N0:1) de um ADNc de PR0172 de sequência nativa, em que a SEQ ID N0:1 é um clone designado aqui por "DNA35916-1161". A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:2) derivada da sequência codificante de SEQ ID N0:1 apresentada nas Figuras 1A-B.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 termo polipéptido ou proteína "PR0172" quando aqui utilizado inclui variantes do PR0172 de sequência nativa (que são definidas aqui). 0 polipéptido PR0172 pode ser isolado de uma variedade de fontes, tal como de tipos de tecido humano, ou de outra fonte, ou preparado por métodos recombinantes e/ou sintéticos.
Um "PR0172 de sequência nativa" compreende um polipéptido com a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido PR0172 derivado da natureza. Este polipéptido PR0172 de sequência nativa pode ser isolado da natureza, ou pode ser produzido por meios recombinantes e/ou sintéticos. 0 termo "PR0172 de sequência nativa" inclui especificamente formas truncadas ou segregadas que ocorrem naturalmente (e.g., uma sequência do domínio extracelular), formas variantes que ocorrem naturalmente (e.g., formas resultantes de splicing alternativo) e variantes alélicas que ocorrem naturalmente do polipéptido PR0172. Numa concretização da invenção, o polipéptido PR0172 de sequência nativa é um polipéptido PR0172 de sequência nativa maduro ou de tamanho total, como apresentado na Figura 2 (SEQ ID NO:2). Além disso, apesar do 4 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ polipéptido PR0172 apresentado na Figura 2 (SEQ ID N0:2) ser apresentado como começando com o resíduo de metionina aí designado por aminoácido de posição 1, é conceptível e possível que outro resíduo de metionina localizado, quer a montante, quer a jusante da posição de aminoácido 1 na Figura 2 (SEQ ID NO:2) possa ser utilizado como o resíduo de aminoácido de iniciação para o polipéptido PR0172. 0 "domínio extracelular" ou "ECD" de um polipéptido aqui descrito refere-se a uma forma do polipéptido que é essencialmente isenta dos domínios transmembranar e citoplasmático. Normalmente, um ECD de um polipéptido terá menos de cerca de 1% destes domínios transmembranares e/ou citoplasmáticos e preferencialmente terá menos de cerca de 0,5% destes domínios. Deve entender-se que quaisquer domínios transmembranares identificados para os polipéptidos da presente invenção são identificados de acordo com critérios utilizados por rotina na arte, para identificar esse tipo de domínio hidrófobo. As fronteiras exactas de um domínio transmembranar podem variar, mas muito provavelmente por não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer das extremidades do domínio, como inicialmente identificado e como apresentado nas figuras anexas. Assim, numa concretização da presente invenção, o domínio extracelular de um polipéptido da presente invenção compreende os aminoácidos 1 a X da sequência de aminoácidos madura, em que X é qualquer aminoácido no espaço de 5 aminoácidos de qualquer dos lados da fronteira domínio extracelular/domínio transmembranar. A localização aproximada do "péptido de sinal" dos polipéptidos PR0172 aqui descritos está indicada nas figuras anexas. Deve ter-se em conta, no entanto, que a fronteira C-terminal de um péptido de sinal pode variar, mas muito provavelmente por não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer dos lados da fronteira C-terminal do péptido de sinal, como aqui inicialmente identificado, em que a fronteira C-terminal do péptido de sinal pode ser identificada de acordo com critérios utilizados por rotina na arte para identificar esse tipo de elemento de sequência de aminoácidos (e.g., Nielsen et ai., Prot. Eng., 10_:l-6 (1997) e von Heinje et al., Nucl. Acids. Res., b4:4683-4690 (1986)). Além disso, também é reconhecido que, nalguns casos, a clivagem de uma sequência de 5 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ sinal de um polipéptido segregado não é totalmente uniforme, resultando em mais do que uma espécie segregada. Estes polipéptidos maduros, em que o péptido de sinal é clivado num espaço de não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer dos lados da fronteira C-terminal do péptido de sinal, como aqui identificado e os polinucleótidos que os codificam são contemplados na presente invenção. "Polipéptido variante de PR0172" significa um polipéptido PR0172 activo (outro que não o polipéptido PR0172 de sequência nativa) como definido a seguir, tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de (a) resíduos 1 ou cerca de 22 a 723 do polipéptido PR0172 apresentado na Figura 2 (SEQ ID NO:2), (b) X a 723 do polipéptido PR0172 apresentado na Figura 2 (SEQ ID NO:2) em que X é qualquer resíduo de aminoácido de 17 a 26 da Figura 2 (SEQ ID NO:2), ou (c) 1 ou cerca de 22 a X da Figura 2 (SEQ ID NO:2), em que X é qualquer resíduo de aminoácido do aminoácido 543 ao aminoácido 552 da Figura 2 (SEQ ID NO:2) ou (d) outro fragmento derivado especificamente da sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO:2).
Estas variantes de PR0172 incluem, por exemplo, polipéptidos PR0172 em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados, ou eliminados no terminal N ou C, bem como num ou mais domínios internos da sequência nativa.
Normalmente, uma variante de PR0172 terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência de aminoácidos, mais 6 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ preferencialmente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com (a) os resíduos 1 ou cerca de 22 a 723 do polipéptido PR0172 apresentado na Figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) X a 723 do polipéptido PR0172 apresentado na Figura 2 (SEQ ID NO:2), em que X é qualquer resíduo de aminoácido de 17 a 26 da Figura 2 (SEQ ID NO:2), ou (c) 1 ou cerca de 22 a X da Figura 2 (SEQ ID NO:2), em que X é qualquer aminoácido do aminoácido 543 ao aminoácido 552 da Figura 2 (SEQ ID NO:2), ou (d) outro fragmento derivado especificamente da sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO:2).
Normalmente, os polipéptidos variantes de PR0172 têm pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, muitas vezes pelo menos cerca de 20 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 30 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 40 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 60 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 70 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 80 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 90 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 100 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 150 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 200 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos 7 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ cerca de 250 aminoácidos de comprimento, mais frequentemente pelo menos cerca de 300 aminoácidos de comprimento, ou mais.
Como se pode ver a seguir, a Tabela 1 proporciona o código-fonte completo para o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. Este código-fonte pode ser compilado de forma rotineira para utilização num sistema operativo UNIX, para se obter o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2.
Adicionalmente, as Tabelas 2A-2B mostram exemplos hipotéticos para utilizar o método descrito a seguir para determinar a % de identidade de sequência de aminoácidos (Tabelas 2A-2B) e a % de identidade de sequência de ácido nucleico (Tabelas 2C-2D) utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2, em que "PRO" representa a sequência de aminoácidos de um polipéptido PEACH de interesse, hipotético, "proteína de comparação" representa a sequência de aminoácidos de um polipéptido contra o qual o polipéptido "PRO" de interesse está a ser comparado, "PRO-ADN" representa PROXXX- hipotético ou uma sequência de ácido nucleico que codifica para PROXXX- de interesse, "ADN de comparação" representa a sequência de nucleótidos de uma molécula de ácido nucleico contra a qual a molécula de ácido nucleico "PRO-ADN" de interesse está a ser comparada, "X", "Y" e "Z" representam, cada um, diferentes resíduos de aminoácido hipotéticos e "N", "L" e "V" representam, cada um, diferentes nucleótidos hipotéticos. 8 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Tabela 1 ι* * * C-C increaseá from 12 to 15
* Z is a ver age of EQ
* 8 is average of NO
* matth wilh stop is M; siep-stop = 0; I (joker) jnaiçh ** 0 V
Adelino _M -8 t* vate of a match wift a stcp *f int jfc*yf26}{20] - { !· A BC0EFGH11KI. MNO p 0 R S T /* A *í { 2.0,-2,0.0,4. L-L-l.0,-1,'2,-1, 0, _M, 1, 0,-2, 1, t* 8 *t {0, 3,4, 3,2,-5,0, 1,-2,0,0,-3,-2,2, M,4, 1,0, 0, /*C*/ {-2,4,15,-5,-5,4,-3,-3,-2,0,-5,4,-5,4 •,-5,4, C /* D V { 0, 3,-5, 4, 3,-6, i, 1,-2,0,0,4, 3, 2, _M,4, 2.4.0, Í*EV { 0, 2,-5, 3,4,-5,0, 1 ,-2,0,0,-3,-2. 1, M.-l, 2,-1,0, i* F */ (4,-5,4,-6,-5. 9,-5,-2, 1,0,-5.2.0.4, M.-5. ,-5,4,-3, 7*0 *7 ( 1,9,-3, 1,0,-5, 5.-2,-3,0,-2,4,-3,0, M,4, -1,-3. 1, /* H */ (-1. 1.-3, 1, 1,-2,-2, 6.-2,0,0,-2,-2, 2. _M, 0, 3,2,4, /*}♦/ {-1,-2,-2,-2,-2,1 ,-3,-2, 5,0,-2,2, 2,-2, ,-2,-2,-1, /* J */ { 0,0, 0,0.0, 0, 0,0,0.0,0,0, 0. 0, M.0, 0,0.0, i /*K*/ (-1,0,-5,0,0,-5,-2,0,-2,0, 5,-3, 0, lr M,4, 1, 3, 0. /* L */ {-2,-3,-6.4,-3, 2,4,-2, 2,0,-3, 6, 4,-3. M.-3, ,-2,-3,-3, (-1,-2.-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0,4, 6,-2, M.-2, -1,0.-2, f*WV { 0,2,4, 2,1.4,0, 2,-2,0,1,-3,-2,2, M,4, 1,0,1, t* Q *( Oí.Jki.Jvi.JM, M._M, 0, M, M,_ Μ, Μ. Μ, M, M,_M,_M}, /* p *1 { 1,-1.-3.-1,1,-5,-1. Ô.-2, 0,-1,-3,-2.-1, _M, 6, ,0.0. 1. t* Q */ { 0, 1,-5, 2.2,-5,4, 3,-2,0, 1,-2,4, 1,, . M. 0. 4, },Ί,· i* R *1 (-2,0,4,-1,-1,4,-3, 2,-2,0. 3,-3.0,0, M 0 1, 6, 0, /* S *1 {1,0,0,0.0,-3, 1.4,4,0,0,-3.-2,1, Μ. 1. 4,0.2, /* T */ { 1,0,-2.0,0,-3,0,4,0, 0,0.4,4,0, M, 0,- 4,4, í, f*U*/ { 0, 0, 0, 0,0, 0,0, 0,0,0,0,0,0, 0,, M, 0,' 0, 0, 0, I f*VV { 0,-2,-2,-2,-2,4,4,-2,4,0.-2,2, 2,-2. M,4. -2.-2.-3, f*W*/ {-6,-5,-6,-7,-7,0,-7,-3,-5,0,-3,-2,4,4, JM.-6 ,-5,2,-2, t* X ♦/ { 0,0,0.0,0, 0, 0, 0. 0,0,0, 0, 0, 0,J*r 0, 0,0,0, i f* y *> f3,-3, 0,-4,-4, 7,-5,0,-1; 0,4,4 ,-2.-2451,-5,4,4,-3, I* Z V { 0, 1,-5,2.3.-5,0,2,-2,0,0,-2,-1, 1 Jm. 0. 3,0.0, u v w x y z v 1.0, 0,-6, 0,-3,0}. 0, 0,-2,-5,0,-3, Π, 1, -2, 0,-2,-8,0, 0,-5}( 0,0,-2,.7, 0,4,2}, Ô, 0,-2,-7, 0.-4, 3), .-3.0,-1,0, 0, 7,-5}, 0.0,-1,-7, 0,-5, 0}, -1,0,-2,-3,0, 0, 2), .0.0.4,-5,0.-1,-2}. 0,0,0,0,0.0.0}. 0, 0,-2,-3. 0,-4. 0}, ,-1.0.2,-2,0.-5,-2}. -1.0,2,-4, 0.-2,-1), 0,0,-2,-4.0.-2,1}, 0. 0,-1,-6,0,-5,0}. -1, 0,-2,-5.0,-4, 3), -1,0,-2, 2,0,4, 0}, 1.0, -1,-2,0,-3,0), 3.0. 0,-3, 0,-3, 0), X 0, 0,0, 0,0,0}, 0,0,4,-6,0.-2.-2), .-5. 0,-6,17,0.0,-6), 3.0, 0,0,0,0,0), -3,0,-2, 0. 0.10,4), 0,0,-2,-6,0.4.4) 1 518 930/ΡΤ 9 {* V #inciuác <sidio.h> #iuclttde <ctype.h> fttefine MAXJMP 1« /* max jumps in a diag *1 #define MAXGAP 24 1* dom continue to penalize gaps targer than «his *1 Ideftne JMPS 1Ô24 1* max jmps in an path *1 #<tefine MX 4 (* save if there’$ ai ieast MX-J bases sínce iast jmp ftdefint DMAT 3 /* value of matching bases *! &teííne DMIS 0 1* penaity for mismatched bases *f #define DÍNSO 8 /* penaity for a gap *1 #dcRtie DINSl 1 i* penaity per base *1 íWtfine PtNSO 8 f* penaity for a gap */ #defme PINSl 4 /* penaity per residue *1 struct jmp { short nJMAXJMPj; /* size of jmp (ncg for tfely) */ unsigned short x] MAXJMP]; f* base no, of jmp ín seq x *t Ϊ; f* iimits seq to 2*16 Ί *t struct diag { iru scorc: f* score at Iast jmp */ !o»g offset; /* offset of prev blocfc */ short ijmp; /* current jmp índex */ struct jmp jp; f* list of jmps */ struct path { int spc; /* number of leading spaccs *1 short nfJMPS]; /* size of jmp (gap) *1 }; int xjJMPSJ; /* loc of jmp (iast elem before gap) */ char *ofík; t* output file name */ char *namex[2j; /* seq ttames: getseqsQ */ char *prog; f* prog ítame for err msgs *1 char *seqx[2J; /* seqs: getseqsO */ int dmax; f best diag; nwQ */ int dntaxO; /* final diag */ int dna; /* set if dita: tnainO */ int endgaps; /* set if penalízing end gaps */ int gapx, gapy; 1* total gaps in seqs *1 int knO, leni; f* seq iens *1 int ngapx, ngapy; í* total size of gaps *7 int smax; 1* max score; nwQ */ to *xbre; 1* bitmap for matching */ tang offset; /* current offset ín jmp file *1 struct diag *dx; /* holds diagonais */ struct path PPf2j; !* boids paih for seqs */ ehar ♦callocO- *malloc{}, *tndexO· "strcpyO; char •getseqO. 'gjailocQ; 10 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ ι* NeMtleman-Wuroch alignmem program * * usage: progs filei ftle2 * where fitei and fi)e2 are two dna or two protein sequences. * The sequences can be in upper- or lower~ea.se an may camain ambiguity * Any íines begínning with or ‘ ‘ are ignored * Max file length ís 6SS3S (liroittd by unaigned short x ia the jmp struct)
* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU ís assumed to be DNA * Output ís irt the fite “align.oot* * * The program may creaie a tmp file in fmp to hoiti info about «scehack. * Original version developed trnder BSD 4.3 on a vax 8650 */
Mnclude *nw.h’ éíndttde "day.h* stalic dhvalflol = { 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0 i;
Static jAva!f26] = { 1, 2|(1 < <('D'-’A‘))|<1< <{'N'-'A')}, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1 < < 10, 1 < <31, 1 < < 12, 1<<13, 1<<14, 1< < 15, 1< <16, 1< <17, 1 < < 18,1 < <19,1< <20, 1< <21, I< <22, 1<<23, 1< <24, 1< <25!(1< <CE'~-A,)}!{l<<('Q,-'A')> h maín main(ac, av)
Snt ac; char *sv[f; { prog - ãv[0]; iftec := 3) { fprintfostdsrr, 'usage: %s fitei fite2\ii", prog); iprimf($nlen\rwhere fitei and file2 are two dna or two protein sequences.ln'); fprimftstderr/The sequeness can be ín upper- cr iower-caselrf): fpriiitf(stderr,'Any tines begínning with Y or '<* 3re ignaretfin”): fprintf(stderr, "Output ís ín the file \"atign,om\'\r"): exit(l); } namexíO] “ av(l); namexjl] - av|2j; seqx[0{ = getseq(namexíO{, &tenO); seqxllj => getseq(namexni. &íenl); xb.m = (dna)7 dbval: jtbval; eiKfgaps »0; /* 1 to penalize endgaps *1 oftle = "aiign.out'; /* output file v nw(); reailjtrtpsO; printO; /* fiií in the matrix, get the possible jrtp; */ /* get the actual jmps */ /* prini stais, alignment */ } eteanuplO); /* unlinfc any tmp files *1 11 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
/* do ih« atignment. mura bssi scere: mainG * dna; vaiue$ in Fiich and Sniiit», PNaS, 80, 1382-1385, 1983 * p»o: PAM 250 values * Whtn scbres are eqtsa), we prefer mismalcbes to any gap, prefer
* a new gap ιο extcndmg an ongoing gap, and prefer a gap m sci}X * to a gap trt s«j y, *f rwQ aw í
thar *px. *py; f* seqs and ptrs */ int *Rtkly, *<tely; 1* kecp track of dely *! iílt ntfclx, delx; 1* keep itaelt of delx */ ittt *!Hip; 1* for swapping rowO, rowl *t iftt mis; 1* score for eacta type */ ini in$0, insl; f* inseníon penaliies *f register íd; t* diagonal index */ n^sur 1* jmp index */ regtster *col0, rsx(I; !* score for curr, iast row */ register **,yy; t* índex imo seqs V de - (sfnici diag *)g_íallot{"to gel diags', íestQ+ienl +1, sizeofístfuct diag)); ndely =- (ím *)g_cai!oc(*io g«» ndely*. leni +1, sútcoffint)}; ddy = (im *)g_caííoc('ro get (fely". tenN-1, siieofíint)}; coIO = (in* +)g_rallocf to gel ce!0', íeni Ή, sfcweffltJt)); ai)! = («tf Igjrallocfta get coli", leni + i, siseeeRínf)); insO - (dna)? IMNSO : PINSO; insl - (dna}1? DINSl : FINSt; smax - Ί0Θ00: if (cndgaps) { for (cdO[OJ ~ deiyíOS ~ -insO, yy = l; yy < « leni; yy+ +) { colO(yy] = delytyyj = co!0{yy-l] - insl; ndely [yy} - yy; >
£Oi0[0) - 0; !r Watennan Eufl Mailt Biol 84 V \ else for (yy *» l; yy < - leni; yy + +) dety[yy] = -insO; í* 1ííí in maith matra */ for (p* » seqxfOJ, xx «= 1; xx < => íenQ; px + +, xx+ +) { /* tmualiit tirst entry ín çol *! ir (endgaps) { if {x* 1) colífOl - delx = >{ííis<t+ínsl); else cotlfOj « delx = coSOfO) - insl; ttdelx - xx; Ϊ else { coIS(O) = 0; delx - insO; nielx = 0; } 12 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ ,nw for {py = seqx(l], yy = í; yy < =» fent;py++.yy + +) { mis - cotOJyy-l); tf (dna) mis + = (sbfDÍ*px-'A'}&xbmj*py-'A’])? DMAT : DMIS; else mís + = _day[*px-’A‘][*py-'A']; 1* update penatty for dei in x seq; * favor new dei over ongong dei * ignore MAXGAP tf weighttng endgaps */ if (cndgaps 11 ndelylyy) < MAXGAP) { if {colO(yy) - insO > » dely[yy]) { deiylyy) « colOlyy] - (insO+ insl); ndelylyy] = 1; } else { delylyy] -- insl; tidelylyyj + +; í } else { if (colOlyy] - (insO+insl) > = deiylyy]) { detyíyy} = colOJyy] - {ínsG+insl); ndelylyy} = í; } else ndeiy{yy] + +; } /* update penalty for del in y seq; * favor new dei over ongong del */ if (endgaps j | ndelx < MAXGAP) { if (cotl{yy-lj - insO > & delx) { ddx ~ colllyy-1] - (insO+insl); ndelx = 1; ) else { delx -= insl; ndelx+ +; > }else{ if(coll[yy-l]' (insO+insl) > - delx) { delx - coli{yy-l} - (ÍnsG+insl); ndelx « 1; } else ndelx+ + ; } I* pick the maximum scorc; we re favoring * mis over any del and delx over ddy */ 13 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ ...mv «t = χχ - yy + leni -1; if (mis > - delx £t& mis > » ífetylyy]) colilyy] = mis; eis® íí (dei* > = dely[yy}> { cuiilyyl - delx; ij = tís[íd).íjmp; if (dx[idS.jp.n|Oj M (!dna 11 (ndeís > «= MAXJMP && xx > dxfidj.jp. xlijj + MX) ! I mis > dxfidJ.score+DJNSO)) { dx[idj.ijmp++; if (+ tij >= MAXJMP) { wnicfmps(kl); ij = dxfidj.tjmp = 0; dxíidl.uffsei = offsei, offsw + = sweofístruci jmpj + $ixMf(o(Tset); í } dxftdj.jp.nfij] >= ndelx: dxftdj.jp.xfíj] « xx; dxfidj.&core = delx; } etse { coUiyy] - delyfyy): ij = dxfid].íjmp;
if (í)xlíti],jp.n[0) && (!dna | ] (ndelyfyyj > = MAXJMP &&xx > dxfidj.jp. xfijj-tMX) S| mis > dx(id].scQie+DÍNSO)) { dx[idj.tjmp+ +; if(++ij >- MAXJMP) { wràejmpsfíd); ij = dx[idj,i|>np = 0; dxjtdj.offset = offsei; offset +- sixeoRstrurt jmp) + siztoffofftíi); } } dxfidj.jp.njij] S -nddyfyy): dxfidj.jpxfijj « xx; dxftdj.score = dclyjyy); } if (xx =<<= Ien0&&yy < leni) { /* fas? col *1 if (endgaps) colltyyl -* in$CI·· insl*(Ienl yy); if (coilfyyj > smax) { smax = aollfyyj; dmax = id; > Ϊ } if (endgaps && xx < lenO) eollfyy-lj = ms0-irisl*(íen0 xx); if (collfyy-)] > smax) { smsx <= coltfyy-l]; dmax = id; } tmp »» colO; colO = cell; cal 1 = imp: } (vuidj free{(char +indely); (void) free((Ehar *)cld>), (void) free((cfsar *)coiO); (void) íree((char *)coll); } 14 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ /* * príntO — oniy routíne vísiblç riutside this module * * stattc:
* getmatO - trace back best path, coum matches: príntO
* pr atignQ · print altgnmem of descri bed in array p|j·. ptirtiO
* cfumpWockO - dump a block of liaes wiih numbers, stars: pr_atígnO
* numsO - put out a number line: dumpbloctO
* putlincO -- put out 3 line (name, (num), seq, [mim}): dumpbtockO
* starsO - -put ã line of stars: dumpblockQ
* stripiutmeO - strip any path and preftx from a seqname V finduds 'nw.ls* #deftne SPC 3 ídefin* P LINE 256 /* maximum output line */ ídefine PSPC 3 1* space beíween name or num and seq */ extern jday[26)[26]; int ofen: )* set otttpm line iength */ FILE *fx; príntO (* output file */ i mt Jx, ly, firstgâp, lastgap; /* overlap */ if {{fx - fopeníoftfe. V’}) = = 0) { fprtnt)(suleiT,*%.y can't write %5\»\ prog, ofilel; cleanup(i): } fprintílíx, ' <first sequence; %$ llength = %d}\n”, namex(01, tenO); fpnmíltx, * < second sequence: %í (length «« %d)\nw, namex(i), leni): olett - 60;
Ix = tenO; ly = leni; fiístgap = lastgap * 0; if (dmax < leni - i) { f* ieading gap in x */ pp[0].spc » firstgap **> leni - dmax -1; ly = ppfOj.spe; } els« if (dtnax > leni -1) { f* Ieading gap in y */ pp[l),spc - (irstgap => dnwx - {leni · 1); lx-= ppjllspc; > if (dmaxO < lenO -1) { I* trailíng gap in x *t lastgap = tenO - dmaxO -1:
Ix = lastgap; else if (dmaxO > lenO -!){/* trailíng gap ia y */ lastgap » dmaxO - <leaO - I); !y -*> lastgap; } gewnatflx, ly, firstgap. lastgap); prjiiignO; } 15 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ /*
* trace back ihe b&ss path, cotmt maiches V static getmat(ix, ly, firsigap. lastgap) ín< tx, ty; i* ím ftrsigap, iasgap; t* getmat í int char doublc registo-registo char “core* (rair.us endgaps) V leatíing traiiing overtap *! ran, iO, il, siíO, siíl; outx(32(; pci; nO, nl; *p0, *pl:
t* gel total matches, score V 10 = (1= sirO = stzf = 0; pD " seqx[G) + ppfl).spc; pi = seqxfil + ppJOJ.spc; nO ppflj.spc + 1; nl = pp{0).spc 4- 1; nm = 0; while ( *p0 && *pí } { if (sírfí) { p}+ +; ni + +;
StíO-S } elsc if (sittl) { pO++: o0+ +1 > else { if (xbm[*fsG«'A’3&xbiní*pKA'i) nm+ +; if (,,0++ == pp[0|.s[i0j> sizO = pp[Ojn[iO+ +]; if (ni + + = = pp(ll-x(il}) sizl = pp[l}.n(il + +]; p0+ + ; pl+ + ; > } /* ρα lionwlogy * if penalizirsg endgaps, base is lhe shcrter seq * else, toock off overttartgs and iake shoner cure */ if (endgaps) fx = (ienO < leni)? JíbO : leni; eJse tx = flx < |y)? Ix ; ty; pct = IÔO,*(doublt;moi/{doubk))x: tprmtt(fx, tprirttfífx," < %d matehSs in an overlap of %á: %2í percení simiiarityxn*, ran, (ran == 1)? ; *es", Jx, pct); 16 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ íprintf(f*. ' <gaps in firsi sequence: %â\ gapx); ,, ,getmat if {gapx} { (veid) sprir.ifíom, " (%d SsSs)', ngapx, (*»)? *base":"»eàdue*, {ngapx = = ]}? **;V); fpriMf{fx,”S$’, cuix); fprjntfífx, *, gaps in second serjuenee: Sd", gapy): >f (liãpy) { (veid) sprimffomx, ’ (%d SsSs}’, ngapy, (dna)? "baseViesidue*, (ngapy *= 1)7 ""rV}; fprinif(fx,"%s", outx): if (<Jna)
Iprintfffx, ‘bi-escore: %d (tmicb ~ %d. mismaich = %d, gappenaky s Sd + %à ptt hase)Wi', smax, DMAT, DMlS. DINSO, DlNSi); else fprímíffx, *\n < score: %d (Dayhoff PAM 250 mairix, gap persalty = %ú + %tl per rcstdue)\n", anax, PINSO. PINSi); if (endgaps) fprtnif{fx. ’ < endgaps penaiizcd. fcít endgap; Sd &s%s, right endgap: %d %s%s\iT, firslgap, (<tna)7 "hasc" : 'tesidue", (fitstgap «* 1)? ; "a', lasigap. <<Jr»)? "base": "residue", (lasigap ==!)?'"'; 's'); tlse , ’<endgaps noi pen*iized\n‘); siatic mn; stafic Imax; static ij|2J; siatir nt[2]; siatic static sir|2); static char *PSJ2J; static char *põ[2}; static char out|2J{P Í.1NF.); static char siarfP iInEí; P * prim aligiimeiii of described in siruct path pp[] *1 stãlk pr_atsgn() ( !* matehes in core -- for checking *1 /* lengtbs of stripped nie names *! 1* jmp index for a path */ /* number íl sLart of turrem liftí */ t* currtnt ciem number - for gapping */ /* pir to currcm elsrrtcm *t I* pir to next output cisar Slot */ /* ouiput tine *! I* set by sursQ */ pralign I* char coum */ i»l 00; im more; regsster i; for (i = 0, Imax = 0; * < 2; > + +) { nn - stripnarnw[namcx|j)); if (nn > Imax)
Imax - nu; nc[i) - l; ni[i) =- í; SÚji] “ ij(i] “ 0; psji) = seqxji], po[tJ = out|i): 17 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ ...prallgn for {nn = nnt = 0, more = !; more; ) { for {i = more = 0; i < 2; i+ +} { /* * 4o we have more of ihis sequeníe'? */ if {!*ps[i)) catttinue; more++; if (ppí ij.spc) { !* ieading space */ >[i]++ - ' pp[i},spe~; } else íf (siz(il) { '* m a gap */ “po[i]+ + = ste|tl~; } elít { !* we>e putting a seq eiemem */ *po[il» *psf·); if (isiower{*ps[i))} *ps{i] = íouppér(*pSlil); po{í] + +; !»$>+ + : /* * are we at itent gap for this seq? */ if(ni{ij = = ppíi].x|íj!i)l; { /* * we nced to mcrge all gaps * at this lotatinu */ sÍ2[i] = ppfi].n[ij[ij'“+]; wbtte(ni{i) == pp['),*[ijlil)> siitíil += ppli].ntijn) + +]; } ni[i]++; } } if {++nn - - olen j J Imote && nn) { dempblockO; for (i — 0; i < 2; i+ +) poft] = outfí]; nn — 0; > ) > t* * dump a block of lines. including numbcrS, stars: pf_aligíi(j *f SUíttc dumpblock
títimpblocfcQ { rígister i; for (i = 0; t < 2; i+ + ) *pofi1— = '\0‘; 18 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ ...dumpblock (void) puicí "Vn1. fu): for (i “ Q: t < 2: j+ +) { if Couvíi] && ! = ' ' 11 *(po{i]) !=''>) í if<i — = 0) nums(i); if <i == 0&& scarsfj; puilinefi); íf(i = = 0 && fpriMKfx, siar); if (í == 1) numsftk ) y } /*
* ?ut oul a number Hnc: dumpbftsckO V StâtíC num;.íix) nums iní ix; f* intlci tu ítutl ! hoidinj seq line */ { cl) ar nlaK'[PL!Nít'j; registor >.j; refiíitEr char “pn, *px, *py; for {pn *< nline, i = 0; i < !raax+P_SPC; > + + , pn++) *pn = ' for (i - ncfíx), py = o»n{ÍJt}; *py; py + + , pn++) { if t*py == '' II *py =” *pn = '" ; élit { íf (i%10 “= Ô | j (i == ! && itcfUJ 1=> 1)) { j » <i < 0)? -i: i; for fpx = pn; j; j / --- 10, px) *px » j%!0 * ’0’; if {i < (1) >* ^ v;
J abe *pn - ‘ 5 ΐ+ + ; y } *pn = ’W'; nc[íx] = i; for (pn = nlirie; *pn; pa+ +) (voíd) pntó(*pí), fx); (void) piacíW, fx): } /* * pul Oui a lira (nârte. fnuoi], wq, fjiuniJ): dumpblocJtO •t
Statit pmline(tx) putline ial ix; { 19 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ ...putline ilt) ι; register ctar *px; for(px = namexjíx], i = 0; *px !- px + +, >++) (void) putc(*px, f*); for(; i < Imax+PSPC; i+*r) (void) puicf ", fx); /* íhese couih from I r * ni[] is currem clemrnt {from !) * hcQ is Mtnber at san of currenl line */ for (px » out{ix|; *px; px++) {void) putc{*px&Ox7l\ fx); (voui) puicCln', fx); } f* * ρω a line of siars (seqs always in oin|0j. cui[ll)- dumpblockO */ statk suno stars { int t; rogister char *p0, *p I. cx, *px; if ('*om{í.í] | j (*oui[Ô) =«· && '{poíO]) “=='> K !*otu[J) Π (*out[f3 “(po[IJ) == ' *)) retum; p\ - star: for {i ~ fmax+P_SPC; i:>-) ♦px++ SE ' ΓοτφΟ = ouilOKp! - ouiM; *p0&& *pl; p0+ + . pi+ +) { ií (isalphafpO) &tk isalp)ia(*pl)) { if (xbin[*pO-A']&xbm!*pl-'A’j) { cx = om+ + ; } ds«ifí!to&& jtoy(*pÕ-’A'][*pI-'A'] > 0} cx * V; e!se cx » ' } «la* cx - ’ *px+ + = cx; } *px+ + = 'ta'; *px = ’\0’; } 20
ΕΡ 1 518 930/PT I* * srijj paih « prefix from pa, muns len; pr_âiígn(}
V siatíc stripname síripname(fm)
char *pB; !* fite teme (ffljy be psih) V i r«gister etor *jw, *py; py ** 0; for (pi => pu: *ρχ· px+ +} if (*px = = T) py px + 1; iffjíy) (voíd) arcpyfpn, py); ríteroSsirienípn)); }
21 ΕΡ 1 518 930/PT /* * cieâmipQ - cleanup arty tmp file * getseqO - read in scq, set dna. len. maxfe» 1 g sallocy - callccf) wiih error checlítn * readjmpsÇ) - get lhe good jmps, from tmp file if necessary * «ritejmpsO - wrtie a fillt-d ariay of jmps to 3 tmp fite: mvO ·/ /finclude "nw,!>· /Hndude < sys/filc.h > char *jname = l7tmp/hoingXXXXXXh: I* tmp file for jmps *1 FILE *% int cteanupO'· í* cleanup tmp file “1 long Í5eek0: /* * remove any tmp fite if vjt blfiw */ clesiuiptí) int í;{ *<S) (void) utdmkfjname); exil(i);) cleanup i* * rcad, return ptr to seq, set dra, len, maAlen *sfclp tines sianingwiík';'. '<\or ‘>* * seq tn «pper or lower case V char *
getseqffile, len) char *file; int *ten;{ char register char int RLE /* file name */ t* seq ten *1 ItneflttM), *pScq: *pi, *py; natgc, den; *fp. getseq if <(fp = iopenflilu, V» =- 0) { fprji)tf(stderr,"íí5; Câ)Vt read %sin", prog, file); exii(l);} tlen * natge = 0; while (fgetsfiine, 1024, fp)J { if(*ιϊ« == ·;· [j *iine C |f *line = =* '>') continue: forfpx « fine: *px !- 'W; p*+-+) íf (isupper(*px) 11 istéwei{1px)) if ((pseq = m.íH<i:<(uitsigned)(ílcn ·) 6))) »= 0} { fprinif(stderr,'%S: malloef) fbilerf to get %ô bytes for %s\n', prog, ilen+6, fite): exit(l); } pseqílj - pseq[lj - pseq|2J = pseq}3} = '\0'; 22
ΕΡ 1 518 930/PT ...getseq py = pseq + 4; *len « llen; rewind(fp); while (fg«s(line, 1024, fp)) {
If {Mine ~ = 11 *li«e - = 1 <' 11 Mine H - ' > ’) continue; for (px » tine; *px! » ’\n‘; px +) { if(isLpper(*ps)> *py+ + “ ’ps; else if {islow«(*px» *py + ·+ = ttwpperCpx); if (jmlexrATGCir, *{py· t))) ftâtgc + t; > } *py+ + » '\0‘; ♦py = 30'; (yoí<S) fdose(fp); dna - natgc > filen/3); returntpxeq +4); } char * g^calloc g_eal!oc(msg, nu, se) châr *m?g: /* prograi», caliing rautíne */ int nx, se; 1* number and siee of elemetus ’/ { char *pxr *caHoc(>; if ((px - cal!oe/{unsigned)nx, (isnsigncd)u)) - - 0} { if (*msg> { nx, se); tprintf(sttterr, "%s: g_caílO£0 faited se« %<l)\sT, prog, msg., exit(l); } } returnfpx); ) y* * gel final jmps f;oin dxll ortmp fite, set pp[|r reseidmáx: m&inQ *t readjinps
readjmpsO l int fd = -1: inl sàe, i0.il; regíster i,j, xx; if(©{ (voíd) telose(fj); if «fd = open(jnamc. O^RDONLY. 0» < Ú) { fpriníffstderr, *%s: cani epenO %sin’, prog. jiumsr); cleanup(t); } ) for (t = Í0 = il » 0. dmaxO = cru», xx = lenO;; i + + ) { while{5) { for (j = dxfdmaxj.í.iinp; j > = 0 && dxfdmax] jp.xljj > = xsí j—> 23 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ ...readjmps if (j < Ο && dx|djnaxJ.offset && fj) { (voíd) iseekift), dx|dmax].ofisct, 0}; (voíd) readffd, (cbar '•J&dxJdíjiaxyp, sizcof(struct jrip);: (void) readífd, (char *)&dx[dmx3.offset. sizeoffdxídniiixj.oftsei)): dx|dfnax).ijrnp = MAXJMP-1; ) eiií break; } if 0 > = JMPS) { fprinifCaderr, “%s: roo irany gaps in 3lignmemin·, prog); cicâriupd); > >ro >“0>{ siz = í!í'dmaxj jp.n[jJ; xx = dxfdrnaxj.jp.xfjj; dmax +* sá; íf (siz < 0) { t* gap ín second seq */ PPlilntiU = -siz; xx > ···· sá; í* id = xx ~ yy + leni -1 */ pplU,x[íl3 » xx - dmax + íenl -1; gapy+ +; ngapy -= sá; f* ignore MAXGAP whcn «foing erwfgaps */ siz - (-si? < MAXGAP 11 endgâps)? ~siz ; MAXGAP, ii + +; } etse íf (siz > 0) { /* gap in fírsi wq */ ppfOJ nfiO] - siz, pp[0],x[s0] = xx; gapx+ 4 ; ngapx + ~ siz; /* ignore MAXGAP whcn doing sndgaps */ siz = {siz < MAXGAP S f endgaps)? siz; MAXGAP; i0+ +; } > else bresk; > I* rcverse the order of jmps *! for (j = 0, iO-*; j < íO; j * +, ιΟ-j { í = pp[0J.K[jj. pp[0],n[}] = ppfOj.nfíO]; pp[0].n[iÔj = í; i = ppP.xLjj; ppioi.x(j) = pp{0).x(s0], pp{0),xiiO] * t; } for (j « 0, it-:j < íi; j+ + , il—) { i =, pp(U,n{jl; pp[l].n[j] = pp{l].n[il]; ppHWilJ “ i; i ~ PPÍi3.xÕ3; ppíU-x6] = ppt!].x[>!]; ρρΗΜΠ} = >; } íí(fd > = 0) (void) close(fd); ifíO)( (void) unlink(j«ame); fj = 0; oifsei = 0; > Ϊ 24 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ i*
* «frios s ittted jmp «ni» effs« of ihe pr*v obb <if jny); iwO V wriuympstfx) writejmps irn ix; { dar *«jki«np0: if (mktcmpOaame) < 0) ( fpriwf(s«<fm, ’%s: ca»‘< rotiímpO *Λ«", jfame>; cJ«mwj>0>; } if {{§ ~ foptí)(tname, *w ')> 0) { tpriwf(suk'>r, can i writt ^sto*. pwg, jnanw); ex«(i}* > } (void) fwrke<(char s«e<>f(stnitt jmpX l, fj); (voai) fwjitc({etiar *)&dJi{ix{,offj«r. 5WíOf(<ix{ixj-0.'fseij, I, fj); )
Tabela 2A PRO XXXXXXXXXXXXXXX (comprimento = 15 aminoácidos)
Proteína de comparação XXXXXYYYYYYY (comprimento = 12 aminoácidos) % de identidade de sequência de aminoácidos = (o número de resíduos de aminoácido com correspondência idêntica entre as duas sequências de polipéptido, tal como determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de resíduos de aminoácido do polipéptido PRO)= 5 dividido por 15 = 33,3%
Tabela 2B PRO XXXXXXXXXX (comprimento = 10 aminoácidos)
Proteína de comparação XXXXXYYYYYYZZYZ (comprimento = 15 aminoácidos) % de identidade de sequência de aminoácidos = (o número de resíduos de aminoácido com correspondência idêntica entre as duas sequências de polipéptido, tal como determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de resíduos de aminoácido do polipéptido PRO)= 5 dividido por 10 = 50% 25 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Tabela 2C PRO-ADN NNNNNNNNNNNNNN (comprimento = 14 nucleótidos) ADN de comparação NNNNNNLLLLLLLLLL (comprimento = 16 nucleótidos) % de identidade de sequência de ácido nucleico = (o número de nucleótidos com correspondência idêntica entre as duas sequências de ácido nucleico, tal como determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de nucleótidos da sequência de ácido nucleico PRO-ADN) = 6 dividido por 14 = 42,9%
Tabela 2D PRO-ADN NNNNNNNNNNNN (comprimento = 12 nucleótidos) ADN de comparação NNNNLLLW (comprimento = 9 nucleótidos) % de identidade de sequência de ácido nucleico = (o número de nucleótidos com correspondência idêntica entre as duas sequências de ácido nucleico, tal como determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de nucleótidos da sequência de ácido nucleico PRO-ADN) = 4 dividido por 12 = 33,3% "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências de polipéptido PR0172 aqui identificadas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácido numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido numa sequência de PR0172, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para obter a percentagem máxima de identidade de sequência e não considerando nenhuma substituição conservativa como parte da identidade de sequência. 0 alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de vários modos, que estão no âmbito dos conhecimentos na arte, por exemplo; utilizando programas de computador disponíveis ao público, tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na arte podem determinar os parâmetros adequados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar um alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão a ser comparadas. Para os fins aqui descritos, no entanto, os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são 26 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ obtidos como descrito a seguir, utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2, em que o código-fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1. 0 programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 é da autoria da Genentech Inc. e o código-fonte apresentado na Tabela 1 foi apresentado com documentação para o utilizador no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registado com o N°. de registo da U.S. Copyright TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível ao público através da Genentech, Inc. São Francisco do sul, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte proporcionado na Tabela 1. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, de preferência UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Para os fins aqui descritos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A em relação a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode ser dito, de forma alternativa, como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos em relação a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue:
100 vezes a fracção X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácido pontuados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento do programa de A e B e em que Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Deve ter-se em conta que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A em relação a B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B em relação a A. Como exemplos de cálculos de % de identidade de sequência de aminoácidos, as
Tabelas 2A-2B mostram como calcular a % de identidade de sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos designada por "proteína de comparação" em relação à sequência de aminoácidos designado por "PRO". 27 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Salvo especificamente referido em contrário, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos aqui utilizados são obtidos como acima descrito utilizando o proqrama de computador de comparação de sequências ALIGN-2. No entanto, a % de identidade de sequência de aminoácidos também pode ser determinada utilizando o programa de comparação de sequências NCB1-BLAST2 (Altschul et ai., Nucleic Acids Res., 25_: 3389-3402 (1997)). O programa de comparação de sequências NCB1-BLAST2 pode ser retirado da Internet em http://www.nc-bi.nlm.nih.gov. 0 NCBI-BLAST-2 utiliza vários parâmetros de pesquisa, sendo todos esses parâmetros de pesquisa ajustados para valores por defeito, incluindo, por exemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 e scoring matrix = BLOSUM62.
Em situações em que o NCBI-BLAST2 é utilizado para comparação de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A em relação a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode ser dito, de forma alternativa, como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos em relação a, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue:
100 vezes a fracção X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácido pontuados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências NCBI-BLAST2 nesse alinhamento de A e B do programa e em que Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Deve ter-se em conta que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A em relação a B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácidos de B em relação a A.
Adicionalmente, a % de identidade de sequência de aminoácidos também pode ser determinada utilizando o programa 28 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ de computador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymoloqy, 266:460-480 (1996)). A maioria dos parâmetros de pesquisa de WU-BLAST-2 é ajustada para valores por defeito. Os que não são ajustados para valores por defeito, i.e. os parâmetros ajustáveis, são ajustados com os seguintes valores: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11, e scoring matrix = BLOSUM62. Para os fins aqui descritos, um valor de % de identidade de sequência de aminoácidos é determinado dividindo (a) o número de residuos de aminoácido idênticos correspondentes entre a sequência de aminoácidos do polipéptido PRO de interesse, tendo uma sequência derivada do polipéptido PRO nativo, e a sequência de aminoácidos de comparação de interesse (i.e., a sequência contra a qual o polipéptido PRO de interesse está a ser comparada, que pode ser um polipéptido variante de PRO) tal como determinado por WU-BLAST-2 por (b) número total de residuos de aminoácido do polipéptido PRO de interesse. Por exemplo, na frase "um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos A que tem, ou tendo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos B", a sequência de aminoácidos A é a sequência de aminoácidos de interesse de comparação e a sequência de aminoácidos B é a sequência de aminoácidos do polipéptido PRO de interesse. "Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipéptidos aqui descritos, significa um polipéptido que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu meio ambiente natural. De preferência, o polipéptido isolado é isento de associação com todos os componentes com os quais está naturalmente associado. Os componentes contaminantes do seu meio ambiente natural são materiais que iriam tipicamente interferir com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticas do polipéptido e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em concretizações preferidas, o polipéptido será purificado (1) até um grau suficiente para se obterem pelo menos 15 residuos N-terminais ou internos, da sequência de aminoácidos utilizando um sequenciador de copo giratório, ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE, sob condições não redutoras ou redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou, de preferência, com prata. Polipéptidos isolados incluem 29 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ polipéptidos in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do meio ambiente natural do PR0172 não estará presente. Normalmente, no entanto, o polipéptido isolado será preparado por pelo menos um passo de purificação. 0 termo "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência codificante ligada de forma operacional, num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação ao ribossoma. É conhecido que as células eucariotas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores.
Um ácido nucleico está "ligado de forma operacional" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou comando secretor está ligado de forma operacional ao ADN para um polipéptido se é expresso como uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou potenciador está ligado de forma operacional a uma sequência codificante se afecta a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está ligado de forma operacional a uma sequência codificante se está posicionado de modo a facilitar a tradução. Em geral, "ligado de forma operacional" significa que as sequências de ADN a ser ligadas são contíguas e, no caso de um comando secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os potenciadores não têm que ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em locais de restrição convenientes. Se estes locais não existem, utilizam-se adaptadores ou ligantes de oligonucleótidos sintéticos, de acordo com a prática convencional. 0 termo "marcado com epítopo", quando aqui utilizado, refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo um polipéptido PR0172 fundido com um "polipéptido marcador". 0 polipéptido marcador tem resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual se pode produzir um anticorpo, mas é suficientemente curto de modo a não interferir com a actividade do polipéptido com o qual está fundido. 0 polipéptido marcador é também, de preferência, 30 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ bastante único na medida em que o anticorpo não tem reacção cruzada substancial com outros epitopos. Os polipéptidos marcadores adequados têm geralmente, pelo menos seis resíduos de aminoácido e têm normalmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácido (de preferência entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácido).
Tal como aqui utilizado, o termo "imunoadesina" designa moléculas do tipo anticorpo que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efectoras dos domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é outra além do local de reconhecimento e de ligação ao antigénio de um anticorpo (i.e., é "heterólogo") e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A parte de adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo pelo menos o local de ligação de um receptor, ou um ligando. A sequência do domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3, ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. "Activo" ou "actividade" para os fins aqui descritos, refere-se a forma(s) de PR0172 que retêm uma actividade biológica e/ou imunológica do PR0172 nativo ou que ocorre naturalmente, em que actividade "biológica" se refere a uma função biológica (quer inibitória, quer estimuladora) causada por um PR0172 nativo ou que ocorre naturalmente, diferente da capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigénico que um PR0172 nativo ou que ocorre naturalmente possui, e uma actividade "imunológica" refere-se à capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epítopo antigénico que um PR0172 nativo ou que ocorre naturalmente possui. "Actividade biológica" no contexto de um anticorpo ou outro agonista que pode ser identificado pelos testes de pesquisa aqui descritos (e.g., uma molécula pequena orgânica ou inorgânica, péptido, etc.) é utilizada para designar a capacidade destas moléculas invocarem um ou mais dos efeitos 31 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ aqui enumerados em relação à definição de "quantidade terapeuticamente eficaz". Numa concretização especifica, "actividade biológica" é a capacidade de inibir o crescimento ou proliferação de células neoplásicas. Uma actividade biológica preferida é a inibição, incluindo atrasar ou parar completamente, do crescimento de uma célula de tumor alvo (e.g., cancro). Outra actividade biológica preferida é a actividade citotóxica que resulta na morte da célula de tumor alvo (e.g., cancro). Ainda outra actividade biológica preferida é a indução de apoptose de uma célula de tumor alvo (e.g., cancro). A frase "actividade imunológica" significa reactividade cruzada imunológica com pelo menos um epitopo de um polipéptido PR0172. "Reactividade cruzada imunológica" tal como aqui utilizado, significa que o polipéptido candidato é capaz de inibir competitivamente a actividade biológica qualitativa de um polipéptido PR0172 que tem esta actividade, com anti-soros policlonais criados contra o polipéptido PR0172 activo conhecido. Estes anti-soros são preparados de modo convencional injectando cabras ou coelhos, por exemplo, subcutaneamente, com o análogo activo conhecido em adjuvante de Freund completo, seguido de injecção intraperitoneal ou subcutânea de reforço em Freund incompleto. A reactividade cruzada imunológica é preferencialmente "especifica", o que significa que a afinidade de ligação da molécula com reactividade cruzada imunológica (e.g., o anticorpo) identificada, com o polipéptido PR0172 correspondente, é significativamente mais elevada (de preferência, pelo menos cerca de 2 vezes, mais preferencialmente pelo menos cerca de 4 vezes, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 6 vezes, muito preferencialmente pelo menos cerca de 8 vezes mais elevada) do que a afinidade de ligação dessa molécula a qualquer outro polipéptido nativo conhecido. "Tumor", tal como aqui utilizado, refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, quer malignas, quer benignas e a todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. 32 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se a, ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que se caracteriza tipicamente por um crescimento celular desregulado. Exemplo de cancro incluem, mas não se limitam a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares destes cancros incluem cancro da mama, cancro da próstata, cancro do cólon, cancro de células escamosas, cancro de pulmão de células pequenas, cancro de pulmão de células não pequenas, cancro dos ovários, cancro cervical, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim, cancro vulvar, cancro da tiróide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro da cabeça e pescoço. "Tratamento" é uma intervenção realizada com a intenção de prevenir o desenvolvimento ou alterar a patologia de um distúrbio. Deste modo, "tratamento" refere-se, quer a tratamento terapêutico, quer a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento incluem os que já têm o distúrbio, bem como aqueles em que se pretende prevenir o distúrbio. No tratamento de um tumor (e.g. cancro), um agente terapêutico pode diminuir directamente a patologia das células de tumor, ou tornar as células de tumor mais susceptíveis a tratamento por outros agentes terapêuticos, e.g. radiação e/ou quimioterapia. A "patologia" do cancro inclui todos os fenómenos que comprometem o bem-estar do paciente. Isto inclui, sem limitação, crescimento celular anormal ou incontrolado, metástases, interferência com o funcionamento normal das células vizinhas, libertação de citóquinas ou outros produtos secretórios a níveis anormais, supressão ou agravamento da resposta inflamatória ou imunológica, etc.
Uma "quantidade eficaz" de um polipéptido aqui descrito ou um seu agonista, em relação à inibição do crescimento de células neoplásicas é uma quantidade capaz de inibir, nalguma extensão, o crescimento de células alvo. O termo inclui uma quantidade capaz de invocar um efeito inibidor do crescimento, citostático e/ou citotóxico e/ou apoptose das células alvo. 33 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Uma "quantidade eficaz" de um polipéptido PR0172 ou um seu agonista para fins de inibição do crescimento de células neoplásicas, pode ser determinado empiricamente e de um modo rotineiro.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" em relação ao tratamento de um tumor, refere-se a uma quantidade capaz de invocar um ou mais dos efeitos seguintes: (1) inibição, nalguma extensão, do crescimento de tumor, retardamento e paragem completa do crescimento; (2) redução no número de células de tumor; (3) redução no tamanho do tumor; (4) inibição (i.e. redução, retardamento ou paragem completa) da infiltração de células de tumor em órgãos periféricos; (5) inibição (i.e. redução, retardamento ou paragem completa) de metástases; (6) aumento da resposta imunitária antitumoral que pode, mas não tem que, resultar na regressão ou rejeição do tumor; e/ou (7) alívio, nalguma extensão, de um ou mais sintomas associados com o distúrbio. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um polipéptido PR0172 ou um seu agonista para os fins de tratamento do tumor pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro.
Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um polipéptido PR0172 ou um seu agonista é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, em especial um tumor, e.g.f célula de cancro, quer in vitro ou in vivo. Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um polipéptido PR0172 ou um seu agonista para os fins de inibição do crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro.
Uma "quantidade citotóxica" de um polipéptido PR0172 ou um seu agonista, é uma quantidade capaz de provocar a destruição de uma célula, em especial um tumor, e.g., uma célula de cancro, quer in vitro ou in vivo. Uma "quantidade citotóxica" de um polipéptido PR0172 ou um seu agonista para os fins de inibição do crescimento de células neoplásicas pode ser determinada empiricamente e de um modo rotineiro. 0 termo "agente citotóxico" tal como aqui utilizado, refere-se a uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa destruição das células. 0 termo inclui 34 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ isótopos radioactivos (e.g. I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterapêuticos, e toxinas, tais como toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, de plantas ou animais, ou seus fragmentos.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto quimico útil no tratamento do tumor, e.g., cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem adriamicina, doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, bussulfano, citoxina, taxóides, e.g. paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), e doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França), toxotere, metotrexato, cisplatina, melfalan, vinblastina, bleomicina, etoposido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatina, teniposido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (veja-se Pat. US N°. 4 675 187), melfalan e outras mostardas de azoto relacionadas. Também se incluem nesta definição agentes hormonais que actuam para regular ou inibir a acção hormonal em tumores, tais como tamoxifeno e onapristona.
Um "agente inibidor do crescimento", quando aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, em especial um tumor, e.g. célula cancerosa, quer in vitro, ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento é um que reduz significativamente a percentagem de células alvo na fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (noutra altura que não a fase S), tais como agentes que induzem a paragem na fase G1 e paragem na fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxol, e inibidores topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido, e bleomicina. Os agentes que induzem paragem na fase G1 irão também arrastar para uma paragem na fase-S, por exemplo, agentes alquilantes de adn, tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, e ara-C. Outras informações podem ser encontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e
Israel, eds., Capitulo 1, intitulado "Cell cycle regulation 35 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ oncogens, and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente p. 13. 0 termo "citóquina" é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população de células que actuam noutra célula como mediadores celulares. Exemplos destas citóquinas incluem linfóquinas, monóquinas e hormonas polipeptídicas tradicionais. Inclui-se nas citóquinas a hormona de crescimento, tal como hormona de crescimento humana, hormona de crescimento humana de N-metionilo e hormona de crescimento bovina; hormona paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormonas glicoproteicas - tais como a hormona estimuladora de folículo (FSH), hormona estimuladora da tiróide (TSH), e hormona luteinizante (LH); factor de crescimento hepático; factor de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogénio da placenta; factor de necrose de tumor-α e β; substância inibidora de mulleriano; péptido associado a gonadotrofina de ratinho; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crescimento nervoso tais como NGF-β; factor de crescimento de plaquetas; factores de crescimento transformantes (TGF), tais como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento tipo insulina-I e II; eritropoietina (EPO); factores osteoindutores; interferões, tais como interferão-α, -β, e -y; factores estimuladores de colónias (CSF), tais como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulócito-macrófago (GM-CSF); e CSF de granulócito (G-CSF); interleucinas (IL), tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; um factor de necrose de tumor, tal como TNF-α ou TNF-β; e outros factores polipeptídicos incluindo LIF e ligando kit (KL). Tal como aqui utilizado, o termo citóquina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinante e equivalentes biologicamente activos das citóquinas de sequência nativa. O termo "prodroga" tal como utilizado neste pedido, refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente activa que é menos citotóxica para as células de tumor em comparação com a droga mãe e é capaz de ser enzimaticamente activada ou convertida na forma mãe mais activa. Veja-se, e.g., Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375- 36 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 382, 615th. Meeting Belfast (1986) e Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). As prodrogas da presente invenção incluem, mas não se limitam a, prodrogas contendo fosfato, prodrogas contendo tiofosfato, prodrogas glicosiladas ou prodrogas contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras prodrogas de 5-fluorouridina que podem ser derivatizadas numa forma de prodroga para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam aos agentes quimioterapêuticos descritos acima. 0 termo "agonista" é utilizado no sentido mais lato e inclui qualquer molécula que mimetiza uma actividade biológica de um polipéptido PR0172 nativo aqui descrito. As moléculas de agonista adequadas incluem especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpo agonistas, fragmentos ou variantes de sequências de aminoácidos de polipéptidos PR0172 nativos, péptidos, moléculas orgânicas pequenas, etc. Os métodos para identificar agonistas de um polipéptido PR0172 podem compreender contactar uma célula de tumor com um agonista candidato e medir a inibição do crescimento da célula de tumor.
Administração "crónica" refere-se a administração do(s) agente num modo contínuo, ao contrário de um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico (actividade) inicial durante um período de tempo alargado. Administração "intermitente" é o tratamento que não é consecutivamente realizado sem interrupção, mas tem, pelo contrário, uma natureza cíclica. "Mamífero" para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de quinta e animais de zoológico, desporto ou animais de estimação, tais como cães, gatos, gado bovino, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, etc. De preferência, o mamífero é um humano.
Administração "em combinação com" um ou mais outros agentes terapêuticos inclui a administração simultânea (concorrente) e consecutiva por qualquer ordem. 37 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ "Transportadores" tal como aqui utilizado inclui transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos para a célula ou mamífero exposto a eles, nas dosagens e concentrações utilizadas. Muitas vezes, o transportador fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada a um pH, aquosa. Exemplos de transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois de glícidos, tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sal, tais como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos, tais como TWEEN™, polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS™.
Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos, que é útil para entregar uma droga (tal como um polipéptido PR0172) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são normalmente organizados numa formação em bicamada, semelhante à organização de lípidos das membranas biológicas.
Uma "molécula pequena" é aqui definida como tendo um peso molecular inferior a cerca de 500 Daltons. II. Composições e Métodos da invenção A. Polipéptidos PR0172 de tamanho total A presente descrição proporciona sequências de nucleótidos identificadas e isoladas que codificam polipéptidos designados no presente pedido por PR0172. Em particular, o ADNc que codifica o polipéptido PR0172 foi identificado e isolado, como descrito com mais pormenores nos Exemplos a seguir. 38 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Como descrito nos Exemplos a seguir, um clone de ADNc que codifica o polipéptido PR0172 foi depositado na ATCC. A sequência de nucleótidos efectiva do clone pode ser facilmente determinada pelo perito na arte, por sequenciação do clone depositado, utilizando métodos de rotina na arte. A sequência de aminoácidos prevista pode ser determinada a partir da sequência de nucleótidos utilizando conhecimentos de rotina. Para o polipéptido PR0172 e ácido nucleico codificante aqui descritos, os requerentes identificaram o que se pensa ser a fase de leitura mais bem identificável com a informação de sequência disponível na altura. B. Variantes de PR0172
Além do polipéptido PR0172 de sequência nativa de tamanho total aqui descrito, é contemplado que se podem preparar variantes de PR0172. As variantes de PR0172 podem ser preparadas introduzindo alterações de nucleótidos adequadas no ADN de PR0172 e/ou por síntese do polipéptido PR0172 desejado. Os peritos na arte irão entender que as alterações de aminoácidos podem alterar processos pós-tradução do polipéptido PR0172, tais como a alteração do número ou posição dos locais de glicosilação, ou a alteração das características de ancoragem na membrana.
As variações no PR0172 de sequência nativa de tamanho total ou em vários domínios do PR0172 aqui descrito, podem ser feitas, por exemplo, utilizando qualquer uma das técnicas e linhas de orientação para mutações conservativas e não conservativas apresentadas, por exemplo, na patente US N°. 5 364 934. As variações podem ser uma substituição, eliminação ou inserção de um ou mais codões que codificam para PR0172, o que resulta numa alteração na sequência de aminoácidos do PR0172, em comparação com o PR0172 de sequência nativa. Opcionalmente, a variação é por substituição de pelo menos um aminoácido por qualquer outro aminoácido, num ou mais dos domínios do PR0172. A linha de orientação na determinação de qual o resíduo de aminoácido que pode ser introduzido, substituído ou eliminado sem afectar de forma adversa a actividade desejada, pode ser encontrada comparando a sequência do PR0172 com a de moléculas de proteína conhecidas, homólogas, e minimizando o número de alterações na sequência 39 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ de aminoácido feitas em regiões de homologia elevada. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado de substituir um aminoácidos por outro aminoácido com propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, tal como a substituição de uma leucina por uma serina, i.e., substituições de aminoácidos conservativas. As inserções ou eliminações podem ser opcionalmente na gama de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada fazendo sistematicamente inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos na sequência e testando as variantes resultantes quanto à actividade exibida pela sequência nativa de tamanho total ou madura.
Proporcionam-se aqui fragmentos do polipéptido PR0172. Estes fragmentos podem ser truncados no terminal N ou no terminal C ou podem não ter resíduos internos, por exemplo, quando comparados com uma proteína nativa de tamanho total. Alguns fragmentos não possuem resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma actividade biológica desejada do polipéptido PR0172.
Os fragmentos de PR0172 podem ser preparados por qualquer uma de várias técnicas convencionais. Os fragmentos de péptido desejados podem ser sintetizados quimicamente. Uma abordagem alternativa envolve produzir fragmentos de PR0172 por digestão enzimática, e.g., tratando a proteína com uma enzima conhecida para clivar proteínas em locais definidos por resíduos de aminoácido particulares, ou por digestão do ADN com enzimas de restrição adequadas e isolando o fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve isolar e amplificar um fragmento de ADN que codifica para um fragmento de polipéptido desejado, por reacção em cadeia com polimerase (PCR). Os oligonucleótidos que definem os terminais desejados do fragmento de ADN são utilizados nos iniciadores 5' e 3' na PCR. De preferência, os fragmentos do polipéptido PR0172 partilham pelo menos uma actividade biológica e/ou imunológica com o polipéptido PR0172 nativo apresentado na Figura 2 (SEQ ID NO:2).
Em concretizações particulares, as substituições conservativas de interesse são apresentadas na Tabela 3, sob o título substituições preferidas. Se essas substituições 40 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ resultam numa alteração na actividade biológica, então introduzem-se alterações mais substanciais, denominadas substituições exemplo na Tabela 3, ou, como melhor descrito a seguir com referência às classes de aminoácidos, e os produtos são pesquisados.
Tabela 3
Resíduo original Substituições exemplificativas Substituições preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; lys; arg gin Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; vai; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; vai; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu
As modificações substanciais na função ou identidade imunológica do polipéptido PR0172 são realizadas seleccionando substituições que diferem significativamente no seu efeito em manter (a) a estrutura do esqueleto do polipéptido na área de substituição, por exemplo, numa conformação de folha ou hélice, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos com base em propriedades de cadeia lateral comuns: EP 1 518 930/PT 41 (D hidrófobo: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrófilo neutro: cys, ser, thr ; (3) ácido: asp, glu; (4) básico: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a pro; e orientação da cadeia: (6) aromático: trp, tyr, phe
As substituições não conservativas implicarão trocar um membro de uma destas classes por um de outra classe. Estes residuos substituídos também podem ser introduzidos em locais de substituição conservativa ou, mais preferencialmente nos locais remanescentes (não conservativos).
As variações podem ser feitas utilizando métodos conhecidos na arte, tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida para um local), pesquisa de alanina e mutagénese de PCR. A mutagénese dirigida para um local [Cárter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., _10:6487 (1987)], mutagénese de cassete [Wells et al., Gene, 3_4:315 (1985)], mutagénese de selecção de restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)], ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no ADN clonado para produzir o ADN variante de PR0211, PR0228, PR0538, PR0172 ou PR0182.
Também se pode utilizar análise de aminoácidos de pesquisa para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. De entre os aminoácidos de pesquisa preferidos salientam-se os aminoácidos neutros, pequenos. Estes aminoácidos incluem alanina, glicina, serina e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido de pesquisa preferido entre este grupo, pois elimina a cadeia lateral para além do carbono-beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante [Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. A alanina também é tipicamente preferida, pois é o aminoácido mais comum. Além disso, ela é frequentemente encontrada, quer em posições enterradas, quer expostas [Creigton, The Proteins (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol, Biol., 150: 1(1976)]. Se a substituição de alalina não origina quantidades adequadas da variante pode-se utilizar um aminoácido isotérico. 42 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ C. Modificações de PR0172
As modificações covalentes de PR0172 estão incluídas no âmbito da presente invenção. Um tipo de modificação covalente inclui reagir resíduos de aminoácido alvo de um polipéptido PR0172 com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas, ou com os resíduos N- ou C-terminais de PR0172. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticular PR0172 com uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água, para utilização no método para purificar anticorpos anti-PR0172 e vice-versa. Os agentes de reticulação normalmente utilizados incluem, e.g., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, gluteraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidilo, tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais, tais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Outras modificações incluem desamidação de resíduos de glutaminilo e asparaginilo nos resíduos glutamilo e aspartilo correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente do polipéptido PR0172 incluída no âmbito da presente invenção compreende alterar o padrão de glicosilação nativo do polipéptido. "Alterar o padrão de glicosilação nativo" significa para os fins aqui descritos, eliminar uma ou mais porções de hidrato de carbono encontradas no PR0172 de sequência nativa (quer removendo o local de glicosilação subjacente, quer eliminando a glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos) e/ou adicionando um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no PR0172 de sequência nativa. Adicionalmente, a frase inclui alterações qualitativas na glicosilação das 43 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ proteínas nativas, envolvendo uma alteração na natureza e proporções das várias porções de hidrato de carbono presentes. A adição de locais de glicosilação ao polipéptido PR0172 pode ser realizada alterando a sequência de aminoácidos. A alteração pode ser feita, por exemplo, por adição de, ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina no PR0172 de sequência nativa (para locais de glicosilação ligada a 0) . A sequência de aminoácidos de PR0172 pode ser opcionalmente alterada por alterações ao nível do ADN, particularmente por mutação do ADN que codifica para o polipéptido PR0172 em bases pré-seleccionadas, de modo que serão produzidos codões que se irão traduzir nos aminoácidos desejados.
Outro meio para aumentar o número de porções de hidrato de carbono no polipéptido PR0172 é por acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao polipéptido. Estes métodos estão descritos na arte, e.g., em WO 87/05330 publicado em 11 de Setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981). A remoção de porções de hidrato de carbono presentes no polipéptido PR0172 pode ser conseguida química ou enzimaticamente, ou por substituição mutacional de codões que codificam para resíduos de aminoácido que servem como alvos para a glicosilação. As técnicas de desglicosilação química são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys, 259:52 (1987) e por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática de porções de hidrato de carbono em polipéptidos pode ser conseguida utilizando uma variedade de endo- e exo-glicosidases, como descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Outro tipo de modificação covalente de PR0172 compreende ligar o polipéptido PR0172 a um de uma variedade de polímeros não proteicos, e.g., polietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, do modo apresentado nas patentes US Nos. 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192 ou 4 179 337. 44 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ Ο polipéptido PR0172 da presente invenção pode também ser modificado de modo a formar uma molécula quimérica compreendendo PR0172 fundido com outro polipéptido ou sequência de aminoácidos, heteróloqos.
Numa concretização, uma molécula quimérica deste tipo compreende uma fusão do polipéptido PR0172 com um polipéptido marcador que proporciona um epitopo ao qual um anticorpo anti-marcador se pode liqar selectivamente. 0 epitopo marcador é geralmente colocado no terminal amino ou carboxilo do polipéptido PR0172. A presença destas formas do polipéptido PR0172 marcadas com epitopo pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Além disso, a adição do epitopo marcador permite que o PR0172 seja facilmente purificado por purificação por afinidade, utilizando um anticorpo anti-marcador, ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao marcador epitópico. Vários polipéptidos marcadores e seus anticorpos respectivos são bem conhecidos na arte. Exemplos incluem marcadores de poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); o polipéptido marcador da gripe HA e o seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8_:2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 contra estes [Evan et al. Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; e o marcador de glicoproteina D (gD) do virus de herpes simples e o seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineerinq, 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido-Flag [Hopp et al., BioTechnoloqy, 6_: 1204-1210 (1988)]; o péptido de epitopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; um péptido de epitopo de α-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o marcador peptidico de proteína do gene 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8J_: 6393-6397 (1990)].
Numa concretização alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do polipéptido PR0172 com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também designada por "imunoadesina"), esta fusão pode ser com a região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig incluem, de preferência, a substituição de uma forma solúvel (domínio transmembranar eliminado ou inactivado) de um polipéptido 45 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ PR0172 no lugar de pelo menos uma região variável numa molécula de Ig. Numa concretização particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões charneira, CH2 e CH3 ou as regiões charneira, CHl, CH2 e CH3 de uma molécula de IgGl. Para a produção de fusões de imunoglobulina veja-se também a patente US N°. 5 428 130, concedida em 27 de Junho de 1995 . D. Preparação de PR0172 A descrição a seguir refere-se essencialmente à produção de PR0172 por cultura de células transformadas ou transfectadas com um vector contendo ácido nucleico de PR0172. Contempla-se, obviamente, que se podem utilizar métodos alternativos, que são bem conhecidos na arte, para preparar PR0172. Por exemplo, a sequência do polipéptido PR0172, ou suas porções, pode ser produzida por síntese de péptidos directa utilizando técnicas de fase sólida [veja-se e.g., Stewart et al., Solid-Phase Synthesis, W.H. Freeman Co., São Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. A sintese de proteínas in vitro pode ser realizada utilizando técnicas manuais, ou por automatização. A síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, utilizando um sintetizador de péptidos da Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando as instruções do fabricante. Podem-se sintetizar quimicamente, separadamente, várias porções de PR0172 e combiná-las utilizando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o polipéptido PR0172 de tamanho total. 1. Isolamento de ADN que codifica PR0172
Pode-se obter ADN que codifica para PR0172 a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se pensa possuir o ARNm de PR0172 e expressá-lo a um nível detectável. Assim, pode-se obter ADN de PR0172 humano de forma conveniente a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido humano, tal como descrito nos Exemplos. O gene que codifica para PR0172 também pode ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou por procedimentos de sintese conhecidos (e.g. síntese de ácidos nucleicos automatizada). 46 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
As bibliotecas podem ser pesquisadas com sondas (tais como anticorpos contra PR0172 ou oligonucleótidos de pelo menos cerca de 20-80 bases) concebidos para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por este. A pesquisa da biblioteca de ADNc ou genómica com a sonda seleccionada pode ser realizada utilizando procedimentos convencionais, tais como os descritos em Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Um meio alternativo para isolar o gene que codifica para PR0172 é utilizar metodologia de PCR [Sambrook et al., supra-, Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Os exemplos a seguir descrevem técnicas para pesquisar uma biblioteca de ADNc. As sequências de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deverão ter um tamanho suficiente e ser suficientemente não ambíguas para minimizar os falsos positivos. O oligonucleótido é preferencialmente marcado de modo a poder ser detectado por hibridação com o ADN da biblioteca que está a ser pesquisada. Os métodos de marcação são bem conhecidos na arte e incluem a utilização de marcadores radioactivos, tais como ATP marcado com 32P, biotinilação ou marcação enzimática. As condições de hibridação, incluindo rigor moderado e rigor elevado, são proporcionadas em Sambrook et al., supra.
As sequências identificadas nestes métodos de pesquisa de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicas, tais como a Genebank, ou outras bases de dados de sequências privadas. A identidade de sequência (quer ao nível de aminoácidos, quer de nucleótidos) dentro de regiões definidas da molécula ou ao longo da sequência de tamanho total pode ser determinada utilizando métodos conhecidos na arte e como aqui descrito. O ácido nucleico com a sequência codificante de proteína pode ser obtido por pesquisa de bibliotecas de ADNc ou genómicas seleccionadas, utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui descrita pela primeira vez e, se necessário, utilizando procedimentos convencionais de alongamento de iniciadores, como descrito em Sambrook et al., supra, para 47 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ detectar precursores e processar intermediários de ARNm que poderão não ter sido transcritos inversamente para ADNc. 2. Selecção e transformação de células hospedeiras
As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vectores de expressão ou clonagem aqui descritos para a produção de PR0172 e cultivadas em meio nutriente convencional modificado, como adequado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam para as sequências desejadas. As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e semelhantes, podem ser seleccionadas pelo perito na arte sem experimentação excessiva. Em geral, os princípios, protocolos, e técnicas práticas para maximizar a produtividade das culturas de células podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: A Praticai Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et ai., supra.
Os métodos de transfecção de células eucariotas e transformação de células procariotas são conhecidos dos peritos na arte, por exemplo, mediados por CaCl2, CaP04, lipossomas e electroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas convencionais adequadas para estas células. 0 tratamento de cálcio utilizando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et ai., supra, ou electroporação, é geralmente utilizado para procariotas. A infecção com Agrobacterium tumefaciens ê utilizada para transformação de determinadas células de planta, como descrito por Shaw et al., Gene 23:315 (1983) e WO 89/05859 publicada em 29 de Junho de 1989. Para células de mamífero sem estas paredes celulares, pode-se utilizar o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 22:456-457 (1978). Foram descritos aspectos gerais de transfecções do sistema de células hospedeiras de mamífero na patente US N°. 4.399.216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), /76^; 3829 (1979). No entanto, também se podem utilizar outros métodos para introduzir ADN nas células, tais como por micro-injecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou policatiões, e.g., polibreno, poliornitina. Para 48 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ várias técnicas de transformação de células de mamífero, veja-se Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores aqui descritos incluem células de procariotas, de levedura, ou de eucariotas superiores. Procariotas adequados incluem, mas não se limitam a eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. colí. Estão disponíveis ao público várias estirpes de E. colí, tais como E. coli K12 estirpe MM294 (ATCC 31,446); E. colí X1776 (ATCC 31, 537); E. coli estirpe W3110 (ATCC 27, 325) e K5 772 (ATCC 53,635). Outras células procariotas hospedeiras adequadas incluem Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans e Shígella, bem como Bacilli, tal como B. subtilis e B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P descrito na DD 266.710 publicada em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos. A estirpe W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro progenitor particularmente preferido, pois é uma estirpe hospedeira comum para fermentações de produtos de ADN recombinantes. De preferência, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a estirpe W3110 pode ser modificada para realizar uma mutação genética nos genes que codificam para proteínas endógenas do hospedeiro, em que exemplos destes hospedeiros incluem E. coli W3110 estirpe 1A2 que tem o genótipo completo tonA; E. coli W3110 estirpe 9E4, que tem o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 estirpe 27C7 (ATCC 55.244), que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT karf; E. coli W3110 estirpe 37D6, que tem o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan ; E. coli W3110 estirpe 40B4, que é a estirpe 37D6 com uma mutação de eliminação degP de não resistência a canamicina; e uma estirpe de E. coli com protease periplasmática mutante descrita na Patente US N°. 4 946 783 concedida em 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, são adequados métodos de clonagem in vitro, e.g., PCR ou outras reacções de polimerase de ácido nucleico. 49 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Além dos procariotas, os micróbios eucariotas, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores que codificam para PR0172. A Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariótico inferior normalmente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139.383 publicada em 2 de Maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente US N°. 4 943 529; Fleer et al., Bio/Technology, 9^:968-975 (1991)) tais como, e.g., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2): 737-42 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8_:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28_:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesía (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7^/5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicada em 31 de Outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladiuni (WO 91/00357 publicada em 10 de Janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983] ; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., _4:475-479 [1985]). As leveduras metilotróficas são aqui adequadas e incluem, mas não se limitam a leveduras capazes de crescer em metanol, seleccionadas dos géneros consistindo de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, e Rhodotorula. Uma lista de espécies que são exemplos desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
As células hospedeiras adequadas para a expressão de PR0172 glicosilado são derivadas de organismos pluricelulares. Exemplos de células invertebradas incluem células de insecto, tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células de planta. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e COS. 50 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Exemplos mais específicos incluem a linha CVl de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 3_6:59 (1977)); células de ovário de hamster chinês/DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, ΊΊ_·Λ21β (1980)); células de Sertoli de ratinho, (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23_: 243-251 (1980)); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51). A selecção da célula hospedeira adequada está no âmbito da especialidade na arte. 3. Selecção e utilização de um vector replicável O ácido nucleico (e.g. ADNc ou ADN genómico) que codifica para PR0172 pode ser inserido num vector replicável para clonagem (amplificação do ADN), ou para expressão. Vários vectores estão disponíveis ao público. O vector pode, por exemplo, ser na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula virai ou fago. A sequência de ácido nucleico adequada pode ser inserida no vector por uma variedade de procedimentos. Em geral, o ADN é inserido num local (s) de endonuclease de restrição adequado, utilizando técnicas conhecidas na arte. Os componentes de vector incluem geralmente, mas não se limitam a, um ou mais de entre uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vectores adequados contendo um ou mais destes componentes utiliza técnicas de ligação convencionais que são conhecidas do perito na arte.
O PR0172 pode ser produzido de forma recombinante, não só directamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo que pode ser uma sequência de sinal, ou outro polipéptido com um local de clivagem específico no terminal N da proteína madura ou polipéptido. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vector, ou pode ser parte do ADN que codifica para PR0172 que é inserido no vector. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou comandos de Enterotoxina II 51 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ estáveis ao calor. Para a secreção em levedura a sequência de sinal pode ser, e.g., o comando de invertase de levedura, comando do factor alfa (incluindo comandos de factor-α de Saccharomyces e Kluyveromyces, estando este último descrito na patente US N°. 5.010.182), ou comando de fosfatase ácida, o comando de glucoamilase de C. albicans (EP 362.179 publicada em 4 de Abril de 1990) ou o sinal descrito na WO 90/13646 publicada em 15 de Novembro de 1990. Na expressão em células de mamifero, podem-se utilizar sequências de sinal de mamífero para dirigir a secreção da proteína, tais como sequências de sinal de polipéptidos segregados, da mesma, ou de espécies relacionadas, bem como comandos secretores virais.
Quer os vectores de expressão, quer os de clonagem, contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Estas sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para clonar vectores em células de mamífero.
Os vectores de expressão e clonagem irão conter tipicamente um gene de selecção, também designado por marcador seleccionável. Os genes de selecção típicos codificam para proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos, não disponíveis de meios complexos, e.g. o gene que codifica para D-alanina racemase para Bacilli.
Um exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero é o que permite a identificação de células competentes para incorporar o ácido nucleico que codifica para PR0172, tal como DHFR ou timidina-quinase. Uma célula hospedeira adequada quando se utiliza o DHFR do tipo selvagem é a linha celular CHO deficiente em actividade de DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, ΊΊ_·Λ216 (1980). Um gene de selecção 52 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ adequado para utilização em levedura é o gene trpl presente no plasmideo de levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, ^:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura que não possui a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo ATCC N°. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85_:12 (1977)].
Os vectores de expressão e clonagem contêm normalmente um promotor ligado de forma operacional à sequência de ácido nucleico que codifica para PR0172, para dirigir a síntese de ARNm. Os promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procariotas incluem os sistemas promotores de β-lactamase e lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 282:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., _8:4057 (1980); EP 36.776] e promotores híbridos, tais como o promotor tac [deBoer et al., Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 8^:21-25 (1983)]. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos também irão conter uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada de forma operacional ao ADN que codifica para PR0172.
Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato-quinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem,, 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 1_:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofruto-quinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase.
Outros promotores de levedura que são promotores indutíveis com a vantagem adicional da transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com o metabolismo de azoto, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e 53 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Os vectores e promotores adequados para utilização na expressão em levedura estão melhor descritos na EP 73 657. A transcrição de PR0172 a partir de vectores em células hospedeiras de mamifero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de virus, tais como o virus de polioma, poxvirus de aves (UK 2.211.504 publicada em 5 de Julho de 1989), adenovirus (tal como adenovírus 2), virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma de aves, citomegalovirus, um retrovirus, virus de hepatite B e virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamifero heterólogos, e.g., o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desde que estes promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. A transcrição de um ADN que codifica para o PR0172 por eucariotas superiores pode ser aumentada inserindo uma sequência potenciadora no vector. Os potenciadores são elementos de ADN que actuam em cis, normalmente de cerca de 10 a 300 pb, que actuam num promotor para aumentar a sua transcrição. Muitas sequências potenciadoras são agora conhecidas de genes de mamifero (globina, elastase, albumina, oi-fetoproteina e insulina) . Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um potenciador de um virus de célula eucariota. Exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovirus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovirus. O potenciador pode ser sujeito a splicing no vector numa posição 5' ou 3' em relação à sequência codificante de PR0172, mas localiza-se de preferência num local 5' em relação ao promotor.
Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucariotas (leveduras, fungos, insectos, plantas, animais, humanos ou células nucleadas de outros organismos pluricelulares) também irão conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilizar o ARNm. Estas sequências estão normalmente disponíveis nas regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3', de ADN ou ADNc eucariótico ou virai. Estas regiões contêm segmentos de 54 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica para PR0172.
Ainda outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese de PR0172 em cultura de células de vertebrados, recombinantes, estão descritos em
Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al.,
Nature, 281:40-46 (1979); EP 117 060; e EP 117 058. 4. Detecção da amplificação/expressão de genes A amplificação e/ou expressão de genes pode ser medida numa amostra directamente, por exemplo, por transferência de Southern, transferência de Northern, convencionais, para quantificar a transcrição de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77g5201-5205 (1980)], dot blot (análise de ADN) ou hibridação in situ, utilizando uma sonda marcada de forma adequada, com base nas sequências aqui proporcionadas. Alternativamente, podem-se utilizar anticorpos que podem reconhecer dúplices específicas, incluindo dúplices de ADN, dúplices de ARN e dúplices híbridas de ADN-ARN, ou dúplices de ADN-proteína. Os anticorpos, por outro lado, podem ser marcados e o teste pode ser realizado estando a dúplex ligada a uma superfície, de modo que por formação da dúplex na superfície se pode determinar a presença de anticorpo ligado à dúplex. A expressão de genes, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecido e teste de cultura de células ou fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Os anticorpos úteis para a coloração imuno-histoquímica e/ou teste de fluidos de amostra podem ser ou monoclonais, ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. De forma conveniente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido PR0172 de sequência nativa ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas, ou contra uma sequência exógena fundida com ADN de PR0172 e que codifica para um epítopo de anticorpo específico. 55 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 5. Purificação do polipéptido
Podem-se recuperar formas de PR0172 a partir do meio de cultura ou de lisados de células hospedeiras. Se ligadas à membrana, elas podem ser libertadas da membrana utilizando uma solução detergente adequada (e.g., Triton-X 100), ou por clivagem enzimática. As células utilizadas na expressão de PR0172 podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelação-descongelação, aplicação de ultra-sons, rompimento mecânico ou agentes de lise celular.
Pode ser desejável purificar o PR0172 a partir de proteínas ou polipéptidos de células recombinantes. Os procedimentos seguintes são exemplos de procedimentos de purificação adequados: por fraccionamento numa coluna de troca iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica ou numa resina de troca catiónica, tal como deae; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes, tais como igG; e colunas quelantes de metal para ligar formas do PR0172 marcadas com epítopos. Podem-se utilizar vários métodos de purificação de proteína e estes métodos são conhecidos na arte e estão descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nova Iorque (1982). 0(s) passo de purificação seleccionado irá depender, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do PR0172 particular produzido. E. Identificação de proteínas capazes de inibir o crescimento e proliferação de células neoplásicas
As proteínas descritas no presente pedido foram testadas num painel de 60 linhas celulares de tumor actualmente utilizadas na pesquisa de investigação de identificação de drogas in vitro, orientada para doenças, do National Câncer Institute (NCI). O objectivo desta pesquisa é identificar moléculas que tenham actividade citotóxica e/ou citostática contra diferentes tipos de tumor. O NCI pesquisa mais de 56 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 10 000 novas moléculas por ano (Monks et al., J. Natl. Câncer Inst., 83_:151-166 (1991); Boyd, Câncer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10):1-12 ([1989]). As linhas celulares de tumor utilizadas neste estudo foram descritas em Monks et al., supra. As linhas celulares cujo crescimento foi significativamente inibido pelas proteínas do presente pedido estão especificadas nos exemplos.
Os resultados mostraram que as proteínas testadas apresentam actividades citostáticas e, nalguns casos e concentrações, actividades citotóxicas numa variedade de linhas celulares de cancro e são, portanto, candidatos úteis para terapia de tumor.
Também se podem utilizar outros testes baseados em células e modelos animais para tumores (e.g., cancros) para verificar as identificações da pesquisa de cancro do NCI e para melhor compreender a relação entre a proteína aqui identificada e o desenvolvimento e patogénese do crescimento celular neoplásico. Por exemplo, podem-se utilizar culturas primárias derivadas de tumores em animais transgénicos (como descrito a seguir) nos testes baseados em células aqui descritos, embora se prefiram linhas celulares estáveis. As técnicas para derivar linhas celulares contínuas a partir de animais transgénicos são bem conhecidas na arte (veja-se, e.g., Small et al., Mol. Cell. Biol., 5:642-648 [1985]). F. Modelos animais
Pode-se utilizar uma variedade de modelos animais bem conhecidos para melhor compreender o papel das moléculas aqui identificadas no desenvolvimento e patogénese de tumores e para testar a eficácia de agentes terapêuticos candidatos, incluindo anticorpos e outros agonistas dos polipéptidos nativos, incluindo agonistas de moléculas pequenas. A natureza in vivo destes modelos torna-os particularmente preditivos das respostas em pacientes humanos. Os modelos animais de tumores e cancros (e.g., cancro da mama, cancro do cólon, cancro da próstata, cancro do pulmão, etc.) incluem quer animais não recombinantes, quer recombinantes (transgénicos). Os modelos animais não recombinantes incluem, por exemplo, modelos de roedores, e.g., murídeo. Estes modelos podem ser produzidos 57 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ introduzindo células de tumor em ratinhos isogénicos utilizando técnicas convencionais, e.g., injecção subcutânea, injecção na veia da cauda, implantação de baço, implantação intraperitoneal, implantação sob a cápsula renal, ou implantação de ortopina, e.g., células de cancro do cólon implantadas em tecido colónico. (veja-se, e.g., publicação PCT N°. WO 97/33551, publicada em 18 de Setembro de 1997).
Provavelmente, a espécie animal mais frequentemente utilizada em estudos oncológicos é o ratinho imunodeficiente e, em particular, ratinhos atimicos. A constatação de que o ratinho atimico com hipo/aplasia podia ser utilizado com sucesso como hospedeiro para xenoenxertos de tumor humano levou à sua vasta utilização para este fim. 0 gene nu recessivo autossómico foi introduzido num grande número de estirpes congénicas distintas de ratinho atimico, incluindo, por exemplo ASW, A/He, AKR, BALB/c, BlO.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII e SJL. Adicionalmente, uma grande variedade de outros animais com defeitos imunológicos herdados, além do ratinho atimico, foram criados e utilizados como receptores de xenoenxertos de tumor. Para mais detalhes veja-se, e.g., The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven e B. Winograd, eds., CRC Press, Inc., 1991.
As células introduzidas nestes animais podem ser derivadas de linhas celulares de tumor/cancro conhecidas, tais como, qualquer das linhas celulares de tumor acima descritas e, por exemplo a linha celular B104-1-1 (linha celular NIH-3T3 estável, transfectada com o proto-oncogene neu); células NIH-3T3 transfectadas com ras-; Caco-2 (ATCC HTB-37); uma linha celular de adenocarcinoma de cólon humano de grau II moderadamente bem diferenciado, HT-29 (ATCC HTB-38), ou de tumores e cancros. As amostras de tumor ou células cancerosas podem ser obtidas de pacientes submetidos a cirurgia, utilizando condições convencionais, envolvendo congelação e armazenamento em azoto líquido (Karmali et al.f Br. j. Câncer, 48:689-696 [1983]).
As células de tumor podem ser introduzidas em animais, tais como ratinhos atimicos, por uma variedade de procedimentos. 0 espaço subcutâneo (s.c.) em ratinhos é muito 58 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ adequado para a implantação de tumores. Os tumores podem ser transplantados s.c. como blocos sólidos, como biópsias por agulha por utilização de um trocarte, ou como suspensões de células. Para implantação de blocos sólidos ou trocarte, introduzem-se fragmentos de tecido de tumor de tamanho adequado no espaço s.c.. As suspensões de células são preparadas de fresco a partir de tumores primários ou linhas celulares de tumor, estáveis e injectadas subcutaneamente. As células de tumor também podem ser injectadas como implantes subdérmicos. Nesta localização, o inoculo é depositado entre a parte inferior do tecido conjuntivo dérmico e o tecido s.c.. Boven e Winograd (1991), supra. Os modelos animais de cancro da mama podem ser produzidos, por exemplo, por implantação de células de neuroblastoma de rato (a partir do qual se isolou inicialmente o oncogene neu), ou células NIH-3T3 transformadas com neu, em ratinhos atimicos, essencialmente como descrito por Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83:9129-9133 (1986) .
De igual modo, podem-se produzir modelos animais de cancro do cólon passando células de cancro do cólon em animais, e.g., ratinhos atimicos, levando ao aparecimento de tumores nestes animais. Um modelo de transplante ortotópico de cancro do cólon humano em ratinhos atimicos foi descrito, por exemplo, por Wang et al., Câncer Research, 54_: 4726-4728 (1994) e Too et al., Câncer Research, 55_:681-684 (1995). Este modelo baseia-se no designado "METAMOUSE" comercializado pela AntiCancer, Inc., (San Diego, Califórnia).
Os tumores que se desenvolvem em animais podem ser removidos e cultivados in vitro. As células de culturas in vltro podem ser passadas para animais. Estes tumores podem servir como alvos para novos testes ou pesquisa de drogas. Alternativamente, os tumores resultantes da passagem podem ser isolados e o ARN das células pré-passagem e células isoladas após um ou mais ciclos de passagem analisados quanto a expressão diferencial de genes de interesse. Estas técnicas de passagem podem ser realizadas com quaisquer linhas celulares de tumor ou cancro conhecidas.
Por exemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21, e WEHI-164 são fibrossarcomas de ratinhos fêmea BALB/c, induzidos 59 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ quimicamente (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146:720 [1977]), que proporcionam um sistema modelo altamente controlável, para estudar as actividades antitumorais de vários agentes (Palladino et al., J. Immunol., 138:4023-4032 [1987]). Em resumo, as células de tumor são propagadas em cultura de células In vítro. Antes da injecção nos animais, as linhas celulares são lavadas e suspensas em tampão, a uma densidade celular de cerca de 10xl06 a lOxlO7 células/ml. Os animais são então infectados subcutaneamente com 10 a 100 μΐ da suspensão celular, deixando decorrer uma a três semanas para aparecer um tumor.
Adicionalmente, o carcinoma de pulmão de Lewis (3LL) de ratinhos, que é um dos tumores experimentais mais amplamente estudados, pode ser utilizado como um modelo de tumor de investigação. A eficácia neste modelo de tumor foi correlacionada com efeitos benéficos no tratamento de pacientes humanos diagnosticados com carcinoma do pulmão de células pequenas (SCCL). Este tumor pode ser introduzido em ratinhos normais por injecção de fragmentos de tumor de um ratinho afectado ou de células mantidas em cultura (Zupi et al., Br. J. Câncer, 41, supl. 4:309 [1980]), e há evidências que indicam que o tumor pode ser iniciado por injecção de mesmo uma única célula e que uma proporção muito elevada de células de tumor infectadas sobrevive. Para mais informação acerca deste modelo, veja-se Zacharski, Haemostasis, 16:300-320 [1986]).
Uma forma de avaliar a eficácia de um composto de teste num modelo animal num tumor implantado, é medir o tamanho do tumor antes e depois do tratamento. Tradicionalmente, o tamanho dos tumores implantados foi medido com um calibrador deslizante em duas ou três dimensões. A medição limitada a duas dimensões não reflecte de forma precisa o tamanho do tumor, deste modo, este é normalmente convertido no volume correspondente utilizando uma fórmula matemática. No entanto, a medição do tamanho do tumor é muito imprecisa. Os efeitos terapêuticos de um candidato de droga podem ser melhor descritos como um atraso de crescimento induzido por tratamento e atraso de crescimento especifico. Outra variável importante na descrição do crescimento do tumor é o tempo de duplicação do volume do tumor. Também estão disponíveis 60 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ programas de computador para o cálculo e descrição do crescimento do tumor, tal como o programa descrito por Rygaard e Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animais, Wu e Sheng eds., Basel, 1989, 301. Deve referir-se, no entanto, que a necrose e respostas inflamatórias após o tratamento podem resultar efectivamente num aumento do tamanho do tumor, pelo menos inicialmente. Assim, estas alterações deverão ser cuidadosamente monitorizadas, por uma combinação de um método morfométrico e análise de citometria de fluxo.
Os modelos animais recombinantes (transgénicos) podem ser manipulados introduzindo a porção codificante dos genes aqui identificados no genoma de animais de interesse, utilizando técnicas convencionais para produzir animais transgénicos. Os animais que podem servir como um alvo para a manipulação transgénica incluem, sem limitação, ratinhos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, ovelhas, cabras, porcos e primatas não humanos, e.g., babuínos, chimpanzés e macacos. As técnicas conhecidas na arte para introduzir um transgene nestes animais incluem a micro-injecção pronucleica (Hoppe e Wanger, Patente US N°. 4 873 191); transferência de genes mediada por retrovírus para linhas germinativas (e.g., Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 6148-615 [1985]); direccionamento de genes em células estaminais embrionárias (Thompson et al., Cell, 56, 313-321 [1989]); electroporação de embriões (Lo, Mol. Cel. Biol., 3, 1803-1814 [1983]); transferência de genes mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell, 57, 727-73 11.9691). Para revisão veja-se, por exemplo, Patente US N°. 4 736 866.
Para os fins da presente invenção, os animais transgénicos incluem os que transportam o transgene apenas em parte das suas células ("animais mosaico"). O transgene pode ser integrado, quer como um transgene único, ou em concatâmeros, e.g., organizados uns a seguir aos outros cabeça-com-cabeça ou cabeça-com-cauda. A introdução selectiva de um transgene num tipo de célula particular também é possível seguindo, por exemplo, a técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 6232-636 (1992). A expressão do transgene em animais transgénicos pode ser monitorizada por técnicas convencionais. Por exemplo, pode-se 61 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ utilizar análise de transferência de Southern ou amplificação por PCR para verificar a integração do transgene. 0 nivel de expressão de ARNm pode então ser analisado utilizando técnicas como hibridação in situ, análise de transferência de Northern, PCR ou imunocitoquimica. Os animais são também analisados quanto a sinais de desenvolvimento de tumor ou cancro. A eficácia de anticorpos que se ligam especificamente aos polipéptidos aqui identificados e outros candidatos de droga pode ser testada também no tratamento de tumores animais espontâneos. Um alvo adequado para estes estudos é o carcinoma de células escamosas (SCC) orais de felino. 0 SCC oral de felino é um tumor maligno altamente invasivo que é a malignidade oral mais comum em gatos, representando mais de 60% dos tumores orais referidos nesta espécie. Raramente forma metástases para locais distantes, embora esta baixa incidência das metástases possa ser apenas um reflexo dos curtos tempos de sobrevivência dos gatos com este tumor. Estes tumores não são normalmente passíveis de cirurgia, essencialmente devido à anatomia da cavidade oral felina. Actualmente, não há nenhum tratamento eficaz para este tumor. Antes de entrar no estudo, cada gato é submetido a um exame clinico completo, biópsia e é pesquisado por tomografia computadorizada (TC). Os gatos diagnosticados com tumores de células escamosas sublinguais são excluídos do estudo. A lingua pode ficar paralisada como resultado deste tumor e mesmo que o tratamento mate o tumor, os animais poderão não ser capazes de se alimentar. Cada gato é tratado repetidamente, durante um maior período de tempo. Serão tiradas fotografias dos tumores diariamente, durante o período de tratamento e em cada nova análise subsequente. Após o tratamento, cada gato é submetido a outro varrimento de TC. Os varrimentos de TC e radiogramas torácicos são avaliados a cada 8 semanas em seguida. Os dados são avaliados quanto a diferenças na sobrevivência, resposta e toxicidade em comparação com grupos de controlo. Uma resposta positiva poderá necessitar de evidências de regressão do tumor, de preferência com melhoria da qualidade de vida e/ou maior esperança de vida. 62 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Adicionalmente, também se podem testar outros tumores animais espontâneos, tais como fibrossarcoma, adenocarcinoma, linfoma, condroma, leiomiossarcoma de cães, gatos, e babuinos. De entre estes, o adenocarcinoma mamário de cães e gatos é um modelo preferido, dado que a sua aparência e comportamento são muito semelhantes aos de humanos. No entanto, a utilização deste modelo é limitada pela ocorrência rara de deste tipo de tumor em animais. G. Testes de pesquisa para candidatos a drogas
Os testes de pesquisa para candidatos a drogas são concebidos para identificar compostos que se ligam de forma competitiva a, ou complexam com o(s) receptor dos polipéptidos aqui identificados, ou que sinalizam de outro modo através deste receptor (es) . Estes testes de pesquisa irão incluir testes passíveis de uma pesquisa de bibliotecas químicas com rendimento elevado, tornando-os particularmente adequados para identificar candidatos a drogas de pequenas moléculas. As moléculas pequenas contempladas incluem compostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos, incluindo péptidos, de preferência péptidos solúveis, fusões (poli)péptido-imunoglobulina e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos poli- e monoclonais e fragmentos de anticorpo, anticorpos de cadeia simples, anticorpos anti-idiotipo e versões quiméricas ou humanizadas destes anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo. Os testes podem ser realizados numa variedade de formatos, incluindo testes de ligação proteína-proteína, testes de pesquisa bioquímicos, imunoensaios e testes baseados em células, que estão bem caracterizados na arte.
Em testes de ligação, a interacção é a ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura reaccional. Numa concretização particular, um receptor de um polipéptido codificado pelo gene aqui identificado ou o candidato a droga é imobilizado numa fase sólida, e.g., numa placa de microtítulo, por ligações covalentes ou não covalentes. A ligação não covalente é geralmente realizada revestindo a superfície sólida com uma solução do polipéptido e secando. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, e.g., um anticorpo monoclonal, específico para o polipéptido a ser 63 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ imobilizado pode ser utilizado para o ancorar a uma superfície sólida. 0 teste é realizado adicionando o componente não imobilizado, que pode ser marcado por um marcador detectável, ao componente imobilizado, e.g., a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reacção está completa, os componentes não reagidos são removidos, e.g., por lavagem e os complexos ancorados na superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não imobilizado transporta um marcador detectável, a detecção do marcador imobilizado na superfície indica que ocorreu complexação. Quando o componente originalmente não imobilizado não transporta um marcador, a complexação pode ser detectada, por exemplo, utilizando um anticorpo marcado, que se liga especificamente ao complexo imobilizado.
Se o composto candidato interage com, mas não se liga a um receptor particular, a sua interacção com esse polipéptido pode ser testada por métodos bem conhecidos para a detecção de interacções proteína-proteína. Estes testes incluem abordagens tradicionais, tais como, e.g., reticulação, co-imunoprecipitação e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso, as interacções proteína-proteína podem ser monitorizadas utilizando um sistema genético baseado em levedura, descrito por Fields e colaboradores (Fields e Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 88:9578-9582 (1991)) como descrito por Chevray e Nathans, Proc. Natl. Acad Sei. USA, 89: 5789-5793 (1991) . Muitos activadores da transcrição, tais como GAL4 de levedura, consistem de dois domínios modulares fisicamente discretos, um que actua como domínio de ligação a ADN, o outro funcionando como domínio de activação da transcrição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações anteriores (geralmente designado por "sistema de dois híbridos") tira vantagem desta propriedade e utiliza duas proteínas híbridas, uma em que a proteína alvo está fundida com o domínio de ligação ao ADN de GAL4 e outra em que as proteínas activadoras candidatas estão fundidas com o domínio de activação. A expressão de um gene repórter GAL1-lacZ sob o controlo de um promotor activado por GAL-4 depende da reconstituição da actividade de GAL4 através da interacção proteína-proteína. As colónias que contêm polipéptidos que interagem são detectadas com um substrato cromogénico para 64 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ β-galactosidase. Está disponível no mercado, da Clontech, um kit completo (MAT C HMAKE R™) para identificar interacções proteína-proteína entre duas proteínas específicas, utilizando a técnica de dois híbridos. Este sistema também pode ser alargado para mapear domínios de proteína em interacções de proteína específicas, bem como para revelar resíduos de aminoácido que são cruciais para estas interacções. H. Composições farmacêuticas
Os polipéptidos da presente invenção, anticorpos agonistas que se ligam especificamente a proteínas aqui identificadas, bem como outras moléculas identificadas pelos testes de pesquisa aqui descritos, podem ser administrados para o tratamento de tumores, incluindo cancros, na forma de composições farmacêuticas.
Quando se utilizam fragmentos de anticorpo, é preferido o fragmento inibidor menor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Por exemplo, com base nas sequências de região variável de um anticorpo, podem-se conceber moléculas de péptido que retêm a capacidade de se ligar à sequência de proteína alvo. Estes péptidos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia de ADN recombinante (veja-se, e.g., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 7889-7893 [1993]). A formulação aqui descrita pode também conter mais do que um composto activo, como necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência os que têm actividades complementares que não se afectam umas às outras de forma adversa. Alternativamente, ou em adição, a composição pode compreender um agente que potência a sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citóquina, agente quimioterapêutico ou agente inibidor do crescimento. Estas moléculas estão adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos.
As formulações terapêuticas dos polipéptidos aqui identificados, ou seus agonistas, são preparadas para armazenamento misturando o ingrediente activo tendo o grau de pureza desejado, com transportadores, excipientes ou 65 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis, opcionais (Reminqton's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. [1980]), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzilico; alquilparabenos, tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; glícidos, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (e.g. complexos de Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). A formulação aqui descrita pode também conter mais do que um composto activo, como necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência os que têm actividades complementares que não se afectam umas às outras de forma adversa. Alternativamente, ou em adição, a composição pode compreender um agente citotóxico, citóquina, ou agente inibidor do crescimento. Estas moléculas estão adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos.
Os ingredientes activos também podem ser incluídos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, 66 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas em Reminqton's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A. Ed. (1980) .
As formulações a ser utilizadas para administração in vivo deverão ser estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes ou depois de liofilização e reconstituição.
As composições terapêuticas aqui descritas são geralmente colocadas num recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou frasco com uma rolha perfurável por meio de uma agulha de injecção hipodérmica.
Podem-se preparar preparações de libertação controlada. Exemplos adequados de preparações de libertação controlada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, as quais são na forma de artigos moldados, e.g., películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação controlada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinilico)), polilactidos (Pat. US N°. 3 773 919), copolimeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolimeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico. Apesar dos polímeros, tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico, permitirem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, alguns hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo menores. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um tempo prolongado, eles podem-se desnaturar ou agregar, como resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda de actividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Podem-se delinear estratégias racionais para a estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, quando se verifica que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através da interpermuta tio-dissulfureto, a estabilização pode ser conseguida modificando resíduos de sulfidrilo, 67 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o teor de humidade, utilizando aditivos adequados, e desenvolvendo composições de matriz de polímeros especificas. I. Métodos de tratamento É contemplado que os polipéptidos da presente invenção e seus agonistas, incluindo anticorpos, péptidos e agonistas de moléculas pequenas, possam ser utilizados para tratar vários tumores, e.g., cancros. Exemplos de condições ou distúrbios a ser tratados incluem tumores benignos ou malignos (e.g., carcinomas renal, do figado, rim, bexiga, mama, gástrico, ovariano, colorrectal, da próstata, pancreático, do pulmão, vulvar, da tiróide, hepático; sarcomas; glioblastomas; e vários tumores da cabeça e pescoço); leucemias e malignidades linfóides; outros distúrbios, tais como distúrbio neuronal, glial, de astrócitos, hipotalâmico e outros glandular, macrofágico, epitelial, estromal e blastocélico; e distúrbios inflamatórios, angiogénicos e imunológicos. Os agentes antitumorais da presente invenção (incluindo os polipéptidos aqui descritos e agonistas que mimetizam a sua actividade), e.g., anticorpos, péptidos e moléculas orgânicas pequenas) são administrados a um mamífero, de preferência um humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bólus, ou por infusão contínua durante um período de tempo, ou pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, intra-ocular, intra-arterial, intralesional, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou por inalação.
Podem-se combinar outros regimes terapêuticos com a administração dos agentes anticancerosos da presente invenção. Por exemplo, o paciente a ser tratado com estes agentes anticancerosos pode também receber terapia de radiação. Alternativamente, ou em adição, pode-se administrar um agente quimioterapêutico ao paciente. A preparação e esquemas de dosagem para estes agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante, ou como determinado empiricamente pelo perito na arte. A preparação e esquemas de dosagem para esta quimioterapia também estão descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . 0 agente quimioterapêutico pode 68 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ preceder, ou suceder à administração do agente antitumoral da presente invenção, ou pode ser administrado em simultâneo com este. Os agentes anticancerosos da presente invenção podem ser combinados com um composto anti-estrogénio, tal como tamoxifeno, ou um anti-progesterona, tal como onapristona (veja-se EP616812) em dosagens conhecidas para estas moléculas.
Poderá ser desejável administrar também anticorpos contra antigénios associados a tumores, tais como anticorpos que se ligam a ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, ou em adição, dois ou mais anticorpos que se ligam ao mesmo, ou a dois ou mais antigénios associados a cancro diferentes podem ser co-administrados ao paciente. Por vezes, pode ser benéfico administrar também uma ou mais citóquinas ao paciente. Numa concretização preferida, os agentes anticancerosos aqui descritos são co-administrados com um agente inibidor do crescimento. Por exemplo, o agente inibidor do crescimento pode ser administrado primeiro, seguido da administração de um agente anticanceroso da presente invenção. No entanto, também é contemplada a administração simultânea ou administração do agente anticanceroso da presente invenção primeiro. As dosagens adequadas para o agente inibidor de crescimento são as actualmente utilizadas e podem ser diminuídas devido à acção combinada (sinergia) do agente inibidor de crescimento e o anticorpo aqui descritos.
Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem adequada de um agente antitumoral aqui descrito dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da gravidade e evolução da doença, do facto de o agente ser administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, do historial clínico do paciente e da resposta ao agente e do critério do médico assistente. 0 agente é adequadamente administrado ao paciente de uma só vez, ou ao longo de uma série de tratamentos. As experiências animais proporcionam uma linha de orientação fiável para a determinação de doses eficazes para terapia humana. 0 escalonamento de doses eficazes inter-espécies pode ser realizado seguindo os princípios estipulados por Mordenti, J. e Chappell, W. "The use of interspecies scaling in 69 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al.r Eds., Pergamon Press, Nova Iorque 1989, pp. 42-96 .
Por exemplo, dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (e.g. 0,1-20 mg/kg) de um agente antitumoral é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, quer seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão continua. Uma dose diária tipica pode variar entre cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores acima mencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, poderão ser úteis outros regimes de dosagem. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas e testes convencionais. A linha de orientação quanto a dosagens e métodos de fornecimento particulares é proporcionada na literatura; veja-se, por exemplo, Pat. US Nos. 4 657 760; 5 206 344; ou 5 225 212. Prevê-se que diferentes formulações serão eficazes para diferentes compostos de tratamento e diferentes distúrbios, que a administração tendo como alvo um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar de fornecimento de um modo diferente de outro órgão ou tecido. J. Artigos de fabrico
Noutra concretização da invenção, é proporcionado um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o diagnóstico ou tratamento dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabrico compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para o diagnóstico ou tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa, ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). O agente activo na composição é um agente antitumoral da presente invenção. O rótulo no, ou associado com o recipiente indica que a composição é utilizada para diagnosticar ou tratar a condição 70 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ de escolha. Ο artigo de fabrico pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos informativos com instruções de utilização.
Os exemplos seguintes são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção em nenhum modo.
EXEMPLOS
Os reagentes disponíveis no mercado referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante, salvo indicação em contrário. A fonte das células identificadas nos exemplos seguintes e ao longo do pedido por números de acesso da ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, VA.
EXEMPLO I
Isolamento do clone de ADNc que codifica para PR0172 (A) PR0172
As sequências de domínio extracelular (ECD) (incluindo a sequência de sinal de secreção, se existente) de cerca de 950 proteínas segregadas conhecidas da base de dados pública Swiss-Prot foram utilizadas para pesquisar bases de dados EST. As bases de dados EST incluíam bases de dados de EST públicas (e.g., GenBank) e uma base de dados de EST privada (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, CA). A pesquisa foi realizada utilizando o programa de computador BLAST ou BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)] como comparação das sequências de proteína de ECD com uma tradução de 6 fases das sequências EST. As comparações que resultam numa pontuação BLAST de 70 (ou nalguns casos, 90) ou superior, que não codificavam para proteínas conhecidas foram agrupadas e organizadas em sequências de ADN de consenso com o 71 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ programa "phrap" (Phil Green, Universidade de Washington, Seattle, Washington).
Uma sequência de consenso de ADN foi organizada em relação a outras sequências EST utilizando phrap, como acima descrito. Esta sequência de consenso é aqui designada por DNA28765. Nalguns casos, a sequência de consenso deriva de uma sequência de ADN de consenso intermediária que foi alongada utilizando ciclos repetidos de BLAST e phrap para alongar essa sequência de consenso intermediária tanto quanto possivel, utilizando as fontes das sequências EST discutidas acima.
Com base na sequência de consenso DNA28765, sintetizaram-se oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR uma biblioteca de ADNc que continha a sequência de interesse e 2) para utilizar como sondas para isolar um clone da sequência codificante de tamanho total para PR0172. Os iniciadores de PCR de sentido directo e inverso têm normalmente de 20 a 30 nucleótidos e são muitas vezes concebidos para originar um produto de PCR com cerca de 100-1000 pb de comprimento. As sequências sonda têm tipicamente 40-55 pb de comprimento. Nalguns casos, sintetizam-se oligonucleótidos adicionais quando a sequência de consenso é superior a cerca de 1-1,5 kpb. De modo a pesquisar várias bibliotecas quanto a um clone de tamanho total, pesquisou-se ADN das bibliotecas por amplificação por PCR, como descrito por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Bioloqy, supra, com o par de iniciadores de PCR. Utilizou-se então uma biblioteca positiva para isolar clones que codificam para o gene de interesse, utilizando a sonda oligonucleotidica e um dos pares de iniciadores.
Sintetizaram-se iniciadores de PCR (sentido directo e inverso):
Iniciador de PCR de sentido directo 5'-GGATCTCGAGAACAGCTACTCC-3' (SEQ ID NO:3)
Iniciador de PCR de sentido inverso 5'-TCGTCCACGTTGTCGTCACATG-3' (SEQ ID NO:4) 72 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Adicionalmente, construiu-se uma sonda de hibridação oligonucleotidica sintética a partir da sequência de consenso DNA28765 que tinha a seguinte sequência de nucleótidos:
Sonda de hibridação 5'-AAATCTGTGAATTGAGTGCCATGGACCTGTTGCGGACGGCCCTTGCTT-3' (SEQ ID NO:5) 0 ARN para construção das bibliotecas de ADNc foi isolado a partir de tecido de rim fetal humano. As bibliotecas de ADNc utilizadas para isolar os clones de ADNc foram construídas por métodos convencionais, utilizando reagentes disponíveis no mercado, tais como os da Invitrogen, San Diego, CA. 0 ADNc foi iniciado com oligo dT contendo um local Notl, ligado por extremidades lisas a adaptadores Sall tratados com hemiquinase, clivado com Notl, separado por tamanhos adequados por electroforese em gel e clonado numa orientação definida num vector de clonagem adequado (tal como pRKB ou pRKD; pRK5B é um precursor de pRK5D que não contém o local Sfil; veja-se, Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) nos locais únicos Xhol e Notl. A sequenciação de ADN dos clones isolados como descrito acima originou a sequência de ADN de tamanho total para um polipéptido PR0172 de tamanho total (aqui designado como DNA35916-1161 [Figura 1A-B, SEQ ID NO:l]) e a sequência de proteína derivada para esse polipéptido PR0172. O clone de tamanho total identificado acima continha uma única fase de leitura aberta com um local de iniciação da tradução aparente, nas posições de nucleótido 38-40 e um sinal de terminação nas posições de nucleótido 2207-2209 (Figuras 1A-B, SEQ ID NO:l). O polipéptido precursor previsto tem 723 aminoácidos de comprimento. A análise da sequência de PR0172 de tamanho total apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO:2) evidencia a presença de uma variedade de domínios polipeptídicos importantes, em que as localizações dadas para esses domínios polipeptídicos importantes são aproximadas como descrito acima. A análise da sequência de PR0172 de tamanho total evidenciou o seguinte: um péptido de sinal de cerca do aminoácido 1 a cerca do aminoácido 21; um domínio transmembranar de cerca do aminoácido 548 a cerca do 73 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ aminoácido 568; um local de N-glicosilação de cerca do aminoácido 477 a cerca do aminoácido 481; um local de fosforilação de proteina-quinase dependente de AMPc e GMPc de cerca do aminoácido 660 a cerca do aminoácido 664; locais de fosforilação por caseina-quinase II de cerca do aminoácido 93 a cerca do aminoácido 97, de cerca do aminoácido 131 a cerca do aminoácido 135, de cerca do aminoácido 154 a cerca do aminoácido 158, de cerca do aminoácido 203 a cerca do aminoácido 207, de cerca do aminoácido 342 a cerca do aminoácido 346, de cerca do aminoácido 344 a cerca do aminoácido 348, de cerca do aminoácido 369 a cerca do aminoácido 373, de cerca do aminoácido 457 a cerca do aminoácido 461, de cerca do aminoácido 483 a cerca do aminoácido 487, de cerca do aminoácido 495 a cerca do aminoácido 499, de cerca do aminoácido 659 a cerca do aminoácido 663, de cerca do aminoácido 670 a cerca do aminoácido 674, de cerca do aminoácido 671 a cerca do aminoácido 675 e de cerca do aminoácido 698 a cerca do aminoácido 702; locais de fosforilação por tirosina- quinase de cerca do aminoácido 176 a cerca do aminoácido 185 e de cerca do aminoácido 252 a cerca do aminoácido 261 ! locais de N-miristoilação de cerca do aminoácido 2 a cerca do aminoácido 8, de ( cerca do aminoácido 37 , a cerca do aminoácido 43, de cerca do aminoácido 40 a cerca do aminoácido 46, de cerca do aminoácido 98 a cerca do aminoácido 104, de cerca do aminoácido 99 a cerca do aminoácido 105, de cerca do aminoácido 262 a cerca do aminoácido 268, de cerca do aminoácido 281 a cerca do aminoácido 287, de cerca do aminoácido 282 a cerca do aminoácido 288, e i de cerca do aminoácido 303 a cerca do aminoácido 307, de cerca do aminoácido 310 a cerca do aminoácido 316, de cerca do aminoácido 328 a cerca do aminoácido 334, de cerca do aminoácido 340 a cerca do aminoácido 346, de cerca do aminoácido 378 a cerca do aminoácido 384, de cerca do aminoácido 387 a cerca do aminoácido 393, de cerca do aminoácido 512 a cerca do aminoácido 518, de cerca do aminoácido 6 76 a cerca do aminoácido 682, de cerca do aminoácido 683 a cerca do aminoácido 689, de cerca do aminoácido 695 a cerca do aminoácido 701; locais de hidroxilação de , ácido aspártico e asparagina de cerca do aminoácido 343 a cerca do aminoácido 355, de cerca do aminoácido 420 a cerca do aminoácido 432, de 74 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ cerca do aminoácido 458 a cerca do aminoácido 480; um local de fixação de lípidos de lipoproteínas de membrana procariotas de cerca do aminoácido 552 a cerca do aminoácido 563; e assinaturas de padrão de cisteínas de domínio do tipo egf de cerca do aminoácido 243 a cerca do aminoácido 255 i, de cerca do aminoácido 247 a cerca do aminoácido 286, de cerca do aminoácido 314 a cerca do aminoácido 326, de cerca do aminoácido 352 a cerca do aminoácido 364, de cerca do aminoácido 391 a cerca do aminoácido 403, de cerca do aminoácido 429 a cerca do aminoácido 441, de cerca do aminoácido 467 a cerca do aminoácido 479 e de cerca do aminoácido 505 a cerca do aminoácido 517. O clone DNA35916-1161 foi depositado na ATCC em 28 de Outubro de 1997 e foi-lhe atribuído o N°. de depósito ATCC 209419.
Uma análise da base de dados Dayhoff (versão 35.45 SwissProt 35), utilizando a análise de alinhamento de sequências BLAST e FastAsequence da sequência de tamanho total apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO:2), evidenciou 89% de identidade de sequências entre a sequência de aminoácidos de PR0172 e a proteína de ratinho delta-1. EXEMPLO 2
Expressão de PR0172 em E. coli
Este exemplo ilustra a preparação de uma forma não glicosilada de PR0172 por expressão recombinante em E. coli. A sequência de ADN que codifica para PR0172 é inicialmente amplificada utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores deverão conter locais de enzimas de restrição que correspondem aos locais das enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado. Pode-se utilizar uma variedade de vectores de expressão. Um exemplo de um vector adequado é o pBR322 (derivado de E. coli} veja-se Bolívar et âl., Gene, 2_:95 (1977)) que contém genes para resistência a ampicilina e tetraciclina. O vector é digerido com enzimas de restrição e desfosforilado. As sequências amplificadas por PCR são então ligadas no vector. O vector irá 75 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ incluir de preferência sequências que codificam para um gene de resistência a antibióticos, um promotor trp, um comando poli-His (incluindo os primeiros seis codões STII, a sequência poli-His e o local de clivagem para enteroquinase), a região codificante de PR0172, o terminador de transcrição lambda e um gene argU. A mistura de ligação é então utilizada para transformar uma estirpe de E. coli seleccionada, utilizando os métodos descritos em Sambrook et al., supra. Os transformantes são identificados pela sua capacidade de crescer em placas LB e as colónias resistentes a antibiótico são então seleccionadas. 0 ADN plasmidico pode ser isolado e confirmado por análise de restrição e sequenciação de ADN.
Os clones seleccionados podem ser crescidos durante a noite em meio de cultura liquido, tal como caldo LB suplementado com antibióticos. A cultura durante a noite pode ser subsequentemente utilizada para inocular uma cultura em maior escala. As células são então crescidas até uma densidade óptica desejada, durante a qual o promotor de expressão é accionado.
Após cultura das células durante mais algumas horas, as células podem ser recolhidas por centrifugação. 0 sedimento celular obtido por centrifugação pode ser solubilizado utilizando vários agentes conhecidos na arte e a proteína PR0172 solubilizada pode então ser purificada utilizando uma coluna quelante de metal, sob condições que permitem uma ligação forte da proteína. 0 PR0172 pode ser expresso em E. coli numa forma marcada com poli-His, utilizando o procedimento seguinte. 0 ADN que codifica para PR0172 é inicialmente amplificado utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores irão conter locais de enzimas de restrição que correspondem aos locais de enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado e outras sequências úteis que proporcionam uma iniciação da tradução eficaz e fiável, a purificação rápida numa coluna de quelação de metal e a remoção proteolítica com enteroquinase. As sequências marcadas com poli-His, amplificadas por PCR são então ligadas num vector de expressão que é utilizado para 76 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ transformar um hospedeiro E. coli baseado na estirpe 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Os transformantes são primeiro crescidos em LB contendo carbenicilina 50 mg/ml a 30°C com agitação, até se atingir uma D06oo de 3-5. As culturas são então diluídas 50-100 vezes em meio CRAP (preparado misturando 3,57 g de (NH4)2S04, 0,71 g de citrato de sódio-2h20, 1, 07 g de KC1, 5,36 g de extracto de levedura da Difco, 5,36 g de hicase SF Sheffield em 500 ml de água, bem como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucose a 0,55% (p/v) e MgS04 7 mM) e crescidas durante aproximadamente 20-30 horas a 30°C, com agitação. As amostras são removidas para verificar a expressão por análise de SDS-PAGE e o volume de cultura é centrifugado para sedimentar as células. Os sedimentos celulares são congelados até purificação e re-enrolamento. A pasta de E. coli de fermentações de 0,5 a 11 (sedimentos de 6-10 g) é ressuspensa em 10 volumes (p/v) de tampão guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Adiciona-se sulfito de sódio sólido e tetrationato de sódio para se obterem concentrações finais de 0,1 M e 0,02 M, respectivamente, e a solução é agitada durante a noite a 4°C. Este passo resulta numa proteína desnaturada com todos os resíduos de cisteína bloqueados por sulfitolização. A solução é centrifugada a 40.000 rpm numa Ultracentrífuga Beckman durante 30 min. O sobrenadante é diluído com 3-5 volumes de tampão de coluna de quelato de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) e filtrado através de filtros de 0,22 mícron, para clarificar. O extracto clarificado é carregado numa coluna de quelato de metal Ni2+-NTA de 5 ml da Qiagen, equilibrada no tampão da coluna de quelato de metal. A coluna é lavada com tampão adicional contendo imidazolo 50 mM (Calbiochem, grau Utrol), pH 7,4. A proteína é eluída com tampão contendo imidazolo 250 mM. As fracções que contêm a proteína desejada são reunidas e armazenadas a 4°C. A concentração de proteína é estimada pela sua absorvância a 280 nm utilizando o coeficiente de extinção calculado com base na sua sequência de aminoácidos.
As proteínas são enroladas de novo diluindo a amostra lentamente em tampão de re-enrolamento preparado de fresco, que consiste de: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, ureia 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM e EDTA 1 mM. Os volumes de re- 77 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ enrolamento são seleccionados de modo a que a concentração de proteína final seja entre 50 a 100 microgramas/ml. A solução de re-enrolamento é agitada lentamente a 4°C, durante 12-36 horas. A reacção de re-enrolamento é neutralizada por adição de TFA a uma concentração final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de mais purificação da proteína, a solução é filtrada através de um filtro de 0,22 mícron e adiciona-se acetonitrilo numa concentração final de 2-10%. A proteína re-enrolada é cromatografada numa coluna de fase reversa Poros RI/H utilizando um tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição com um gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%.
Analisam-se alíquotas de fracções com absorvância A2so em geles de poliacrilamida com SDS e as fracções contendo proteína re-enrolada homogénea são reunidas. Em geral, as espécies re-enroladas de forma adequada da maioria das proteínas são eluídas nas concentrações mais baixas de acetonitrilo, uma vez que essas espécies são as mais compactas, tendo os seus interiores hidrófobos protegidos da interacção com a resina de fase reversa. As espécies agregadas são normalmente eluídas a concentrações de acetonitrilo mais elevadas. Além de separar formas de proteínas com o enrolamento errado, da forma desejada, o passo de fase reversa também remove a endotoxina das amostras.
As fracções que contêm o polipéptido PR0172 enrolado desejado são reunidas e o acetonitrilo é removido utilizando uma corrente suave de azoto, dirigida para a solução. As proteínas são formuladas em Hepes 20 mM, pH 6,8 com cloreto de sódio 0,14 Me manitol a 4%, por diálise ou filtração em gel, utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas no tampão de formulação e esterilizadas por filtração. EXEMPLO 3
Expressão de PR0172 em células de mamífero
Este exemplo ilustra a preparação de uma forma de PR0172 potencialmente glicosilada, por expressão recombinante em células de mamífero. O vector pRK5 (veja-se EP 307-247, publicado em 15 de Março de 1989) é utilizado como vector de expressão. 78 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Opcionalmente, ο ADN de PR0172 é ligado em pRK5 com enzimas de restrição seleccionadas para permitir a inserção do ADN de PR0172 utilizando métodos de ligação, tais como os descritos em Sambrook et al., supra. 0 vector resultante é designado por pRK5-PR0172.
Numa concretização, as células hospedeiras seleccionadas podem ser células 293. As células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são crescidas até à confluência em placas de cultura de tecidos em meio tal como DMEM suplementado com soro fetal de vitela e, opcionalmente, componentes nutrientes e/ou antibióticos. Misturam-se cerca de 10 pg de ADN de pRK5-PR0172 com cerca de 1 pg de ADN que codifica para o gene VA ARN [Thimmappaya et al., Cell, 31_:543 (1982)] e dissolve-se em 500 pl de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl2 0,227 Μ. A esta mistura adicionam-se, gota a gota, 500 pl de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaP04 1,5 mM, e deixa-se formar um precipitado durante 10 minutos a 25°C. O precipitado é suspenso e adicionado às células 293 e deixado assentar durante cerca de quatro horas a 37°C. O meio de cultura é removido por aspiração e adicionam-se 2 ml de glicerol a 20% em PBS, durante 30 segundos. As células 293 são então lavadas com meio isento de soro, adiciona-se meio fresco e as células são incubadas durante cerca de 5 dias.
Aproximadamente 24 horas após as transfecções, o meio de cultura é removido e substituído com meio de cultura (isolado) ou meio de cultura contendo 35S-cisteína 200 pCi/ml e 35S-metionina 200 pCi/ml. Após uma incubação de 12 horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado num filtro giratório e carregado num gel de SDS a 15%. O gel processado pode ser seco e exposto a película durante um período de tempo seleccionado para revelar a presença do polipéptido PR0172. As culturas que contêm células transfectadas podem ser submetidas a nova incubação (em meio isento de soro) e o meio é testado em bioensaios seleccionados.
Numa técnica alternativa, o PR0172 pode ser introduzido em células 293 de forma transitória, utilizando o método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad Sei., 1_2:7575 (1981). As células 293 são crescidas a uma densidade máxima num frasco giratório e adicionam-se 79 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 700 pg de ADN de pRK5-PR0172. As células são primeiro concentradas a partir do frasco giratório por centrifugação e lavadas com PBS. O precipitado de ADN-dextrano é incubado no sedimento celular durante quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20% durante 90 segundos, lavadas com meio de cultura de tecidos e reintroduzidas no frasco giratório contendo meio de cultura de tecidos, insulina de bovino a 5 pg/ml e transferrina de bovino a 0,1 pg/ml. Após cerca de quatro dias, o meio condicionado é centrifugado e filtrado para remover células e restos celulares. A amostra que contém PR0172 expresso pode então ser concentrada e purificada por qualquer método seleccionado, tal como diálise e/ou cromatografia em coluna.
Noutra concretização, o PR0172 pode ser expresso em células CHO. O pRK5-PR0172 pode ser transfectado em células CHO utilizando reagentes conhecidos, tais como CaPCp ou DEAE-dextrano. Como descrito acima, as culturas de células podem ser incubadas e o meio substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio contendo um marcador radioactivo, tal como 35S-metionina. Após determinação da presença de um polipéptido PR0172, o meio de cultura pode ser substituído por meio isento de soro. De preferência, as culturas são incubadas durante cerca de 6 dias e em seguida o meio condicionado é recolhido. O meio contendo o polipéptido PR0172 expresso pode ser então concentrado e purificado por qualquer método seleccionado. O PR0172 marcado com epítopo pode também ser expresso em células CHO hospedeiras. O PR0172 pode ser subclonado a partir do vector pRK5. A inserção do subclone pode ser submetida a PCR para fundir em fase com um marcador epitópico seleccionado, tal como um marcador poli-His, num vector de expressão de Baculovírus. A inserção de PR0172 marcado com poli-His pode ser então subclonada num vector dirigido por SV40 contendo um marcador de selecção, tal como DHFR, para selecção de clones estáveis. Por fim, as células CHO podem ser transfectadas (como descrito acima) com o vector dirigido por SV40. A marcação pode ser realizada, como descrito acima, para verificar a expressão. O meio de cultura contendo o PR0172 marcado com poli-His, expresso, pode então ser concentrado e purificado por qualquer método seleccionado, tal como por cromatografia de afinidade em quelato de Ni2+. 80 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ Ο PR0172 também pode ser expresso em células CHO e/ou COS por um procedimento de expressão transitória, ou em células CHO, por outro procedimento de expressão estável. A expressão estável em células CHO é realizada utilizando o seguinte procedimento. As proteínas são expressas como uma construção de IgG (imunoadesina) em que as sequências codificantes para as formas solúveis (e.g. domínio extracelular) das proteínas respectivas são fundidas com uma sequência da região constante de IgGl contendo os domínios charneira, CH2 e CH2 e/ou como uma forma marcada com poli-His.
Após amplificação por PCR, os ADN respectivos são subclonados num vector de expressão CHO utilizando técnicas convencionais descritas em Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Bioloqy, Unidade 3.16, John Wiley and Sons (1997). Os vectores de expressão CHO são construídos de modo a terem locais de restrição 5' e 3' compatíveis do adn de interesse, para permitir o vaivém conveniente de ADNc. O vector utilizado na expressão em células CHO é como descrito em Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), e utiliza o promotor precoce/potenciador de SV40 para dirigir a expressão do ADNc de interesse e di-hidrofolato-redutase (DHFR). A expressão de DHFR permite a selecção para a manutenção estável do plasmídeo após transfecção.
Introduzem-se doze microgramas do ADN plasmídico desejado em aproximadamente 10 milhões de células CHO utilizando reagentes de transfecção disponíveis no mercado Superfect® (Qiagen), Dosper® ou Fugene® (Boehringer Mannheim). As células são crescidas como descrito em Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 10“7 células são congeladas numa ampola para posterior crescimento e produção, como descrito a seguir.
As ampolas contendo o ADN plasmídico são descongeladas colocando num banho de água e misturando num vórtex. Os conteúdos são pipetados para um tubo de centrífuga contendo 10 ml de meio e centrifugados a 1000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante é aspirado e as células são ressuspensas em 10 ml de meio selectivo (PS20 filtrado em 0,2 pm com soro fetal de bovino a 5% diafiltrado em 0,2 pm) . As células são então 81 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ divididas em alíquotas num frasco giratório de 100 ml contendo 90 ml de meio selectivo. Após 1-2 dias, as células são transferidas para um frasco giratório de 250 ml cheio com 150 ml de meio de crescimento selectivo e incubadas a 37°C. Após mais 2-3 dias, semeiam-se frascos giratórios de 250 ml, 500 ml e 2000 ml com 3 χ 105 células/ml. O meio celular é trocado por meio fresco por centrifugação e ressuspensão em meio de produção. Embora se possa utilizar qualquer meio de CHO adequado, pode efectivamente utilizar-se um meio de produção descrito na Patente US N°. 5.122.469, concedida em 16 de Junho de 1992. Semeia-se um frasco giratório de produção de 3 1 a 1,2 χ 106 células/ml. No dia 0, determina-se o número de células e pH. No dia 1, retira-se uma amostra do frasco giratório e inicia-se a desgaseificação com ar filtrado. No dia 2, retira-se uma amostra do frasco giratório, a temperatura é alterada para 33°C, e adicionam-se 30 ml de glucose 500 g/1 e 0,6 ml de anti-espumante a 10% (e.g., emulsão de polidimetilsiloxano a 35%, emulsão Dow Corning 365 de grau médico) . Ao longo da produção, o pH é ajustado como necessário para o manter à volta de 7,2. Após 10 dias, ou até a viabilidade diminuir abaixo dos 70%, a cultura de células é recolhida por centrifugação e filtração através de um filtro de 0,22 pm. O filtrado é, ou armazenado a 4°C, ou imediatamente carregado em colunas, para purificação.
Para as construções marcadas com poli-His, as proteínas são purificadas utilizando uma coluna Ni2+-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adiciona-se imidazolo ao meio condicionado a uma concentração de 5 mM. O meio condicionado é bombeado para uma coluna Ni2+-NTA de 6 ml equilibrada em tampão Hepes 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,3 M e imidazolo 5 mM, a um fluxo de 4-5 ml/min, a 4°C. Após carga, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína é eluída com tampão de equilíbrio contendo imidazolo 0,25 Μ. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada num tampão de armazenamento contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) e armazenada a -80°C.
As construções de imunoadesina (contendo Fc) são purificadas a partir do meio condicionado, como se segue. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de Proteína A de 82 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 5 ml (Pharmacia) que foi equilibrada em tampão fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após carga, a coluna é lavada extensivamente com tampão de equilíbrio antes de eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada recolhendo fracções de 1 ml em tubos contendo 275 μΐ de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em tampão de armazenamento, como descrito acima para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade é determinada por geles de poliacrilamida com SDS e por sequenciação de aminoácido N-terminais, por degradação de Edman. O PR0172 foi expresso de forma estável em células CHO pelo método acima descrito. Adicionalmente, o PR0172 foi expresso em células CHO pelo procedimento de expressão transitória. EXEMPLO 4
Expressão de PR0172 em levedura O método seguinte descreve a expressão recombinante de PR0172 em levedura.
Primeiro, são construídos vectores de expressão de levedura para a produção ou secreção intracelular de PR0172 a partir do promotor ADH2/GAPDH. O ADN que codifica para PR0172 e o promotor são inseridos em locais de enzimas de restrição adequados no plasmídeo seleccionado, para dirigir a expressão intracelular de PR0172. Para secreção, o ADN que codifica para PR0172 pode ser clonado no plasmídeo seleccionado, juntamente com ADN que codifica para o promotor ADH2/GAPDH, um péptido de sinal de PR0172 nativo ou outro péptido de sinal de mamífero, ou, por exemplo, uma sequência de sinal/comando de secreção de factor alfa ou invertase de levedura e sequências ligantes (se necessário) para expressão de PR0172.
As células de levedura, tais como a estirpe ABI 10 de levedura, podem então ser transformadas com os plasmídeos de expressão descritos acima e cultivadas em meio de fermentação seleccionado. Os sobrenadantes de leveduras transformadas podem ser analisados por precipitação com ácido 83 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ tricloroacético a 10% e separação por SDS-PAGE, seguido de coloração dos geles com azul de Coomassie. O PR0172 recombinante pode ser subsequentemente isolado e purificado removendo as células de levedura do meio de fermentação por centrifugação e concentrando em seguida o meio, utilizando filtros de cartucho seleccionados. O concentrado contendo PR0172 pode ser ainda purificado utilizando resinas de cromatografia em coluna seleccionadas. EXEMPLO 5
Expressão de PR0172 em células de insecto infectadas com baculovírus O método seguinte descreve a expressão recombinante de PR0172 em células de insecto infectadas com baculovírus. A sequência que codifica para PR0172 é fundida a montante de um marcador epitópico contido num vector de expressão de baculovírus. Estes marcadores epitópicos incluem marcadores poli-His e marcadores imunoglobulina (tal como regiões Fc de IgG). Pode-se utilizar uma variedade de plasmídeos, incluindo plasmídeos derivados de plasmídeos disponíveis no mercado, tais como pVLl393 (Novagen). Em resumo, a sequência que codifica para PR0172 ou a porção desejada da sequência codificante de PR0172 (tal como a sequência que codifica para o domínio extracelular de uma proteína transmembranar, ou a sequência que codifica para a proteína madura no caso da proteína ser extracelular) é amplificada por PCR com iniciadores complementares às regiões 5' e 3'. O iniciador 5' pode incorporar locais de enzimas de restrição flanqueadores (seleccionados). O produto é então diferido com as enzimas de restrição seleccionadas e subclonado no vector de expressão. O baculovírus recombinante é produzido por co-transfecção do plasmídeo acima e ADN do vírus BaculoGold™ (Pharmingen) em células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponível no mercado da GIBCO-BRL). Após 4-5 dias de incubação a 28°C, os vírus libertados são recolhidos e utilizados para posteriores amplificações. A infecção virai e expressão de proteínas são realizadas como 84 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ descrito por 0'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) . O PR0172 marcado com poli-His expresso pode então ser purificado, por exemplo por cromatografia de afinidade em quelato de Ni2+ como se segue. Preparam-se extractos de células Sf9 infectadas com virus recombinantes, como descrito por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Em resumo, as células Sf9 são lavadas, ressuspensas em tampão de ultra-sons (Hepes 25 ml, pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol a 10%; NP-40 a 0,1%; KC1 0,4 M), e tratadas com ultra-sons duas vezes durante 20 segundos, em gelo. O material tratado com ultra-sons é clarificado por centrifugação, e o sobrenadante é diluído 50 vezes em tampão de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol a 10%, pH 7,8) e filtrado através de um filtro de 0,45 mm. Prepara-se uma coluna de agarose Ni2+-NTA (disponível no mercado da Qiagen) com um volume de leito de 5 ml, lava-se com 25 ml de água e equilibra-se com 25 ml de tampão de carga. O extracto celular filtrado é carregado na coluna a 0,5 ml por minuto. A coluna é lavada até uma A280 de linha de base com tampão de carga, altura em que é iniciada a recolha de fracções. Em seguida, a coluna é lavada com um segundo tampão de lavagem (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol a 10%, pH 6,0), que elui proteínas não especificamente ligadas. Após se atingir novamente a A28o de linha de base, a coluna é desenvolvida com um gradiente de imidazolo de 0 a 500 mM no segundo tampão de lavagem.
Recolhem-se fracções de 1 ml e analisam-se por SDS-PAGE e coloração com prata, ou transferência de Western com Ni2+-NTA-conjugado com fosfatase alcalina (Qiagen). As fracções que contêm o PR0172 marcado com Hisio eluído são reunidas e dialisadas contra tampão de carga.
Alternativamente, a purificação do PR0172 marcado com igG (ou marcado com Fc) pode ser realizada utilizando técnicas cromatográficas conhecidas, incluindo, por exemplo, cromatografia em coluna de Proteína A ou proteína G.
Após amplificação por PCR, as sequências codificantes respectivas são subclonadas num vector de expressão de baculovirus (pb.PH.IgG para fusões de IgG e pb.PH.His.c para proteínas marcadas com poli-His), e o vector e ADN de 85 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ baculovírus Baculogold® (Pharmingen) são co-transfectados em 105 células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711), utilizando Lipofectina (Gibco BRL). pb.PH.IgG e pb.PH.His são modificações do vector de expressão de baculovírus disponível no mercado pVLl393 (Pharmingen), com regiões poliligantes modificadas para incluir as sequências marcadoras His ou Fc. As células são crescidas em meio TNM-FH de Hink suplementado com FBS a 10% (Hyclone) . As células são incubadas durante 5 dias a 28°C. O sobrenadante é recolhido e subsequentemente utilizado para a primeira amplificação virai, infectando células Sf9 em meio TNM-FH de Hink suplementado com FBS a 10% a uma multiplicidade de infecção (MOI) aproximada de 10. As células são incubadas durante 3 dias a 28°C. O sobrenadante é recolhido e a expressão das construções no vector de expressão de baculovírus é determinada por ligação por lotes de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de pérolas Ni2+-NTA (QIAGEN) para proteínas marcadas com histidina, ou pérolas de Protein-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas marcadas com IgG seguido de análise de SDS-PAGE comparando com uma concentração conhecida de padrão de proteína, por coloração com azul de Coomassie. O primeiro sobrenadante de amplificação virai é utilizado para infectar uma cultura de frasco giratório (500 ml) de células Sf9 crescidas em meio ESF-921 (Expression Systems LLC) a uma MOI aproximada de 0,1. As células são incubadas durante 3 dias a 28°C. O sobrenadante é recolhido e filtrado. A ligação por lotes e análise de SDS-PAGE são repetidas, como necessário, até se confirmar expressão da cultura do frasco giratório. O meio condicionado das células transfectadas (0,5 a 3 L) é recolhido por centrifugação para remover as células e filtrado através de filtros de 0,22 mícron. Para as construções marcadas com poli-His, a construção de proteína é purificada utilizando uma coluna de Ni2+-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adiciona-se imidazolo ao meio condicionado, a uma concentração de 5 mM. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de 6 ml de Ni2+-NTA equilibrada em tampão Hepes 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,3 M e imidazolo 5 mM a um fluxo de 4-5 ml/min, a 4°C. Após carga, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína é eluída com tampão de 86 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ equilíbrio contendo imidazolo 0,25 Μ. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada num tampão de armazenamento contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) e armazenado a -80°C.
As construções de imunoadesina (contendo Fc) de proteínas são purificadas a partir do meio condicionado, como se segue. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que foi equilibrada em tampão fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após carga, a coluna é bem lavada com tampão de equilíbrio antes de eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada recolhendo fracções de 1 ml para tubos contendo 275 ml de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em tampão de armazenamento como descrito acima para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade das proteínas é verificada por electroforese em gel de poliacrilamida com SDS (PEG) e sequenciação de aminoácidos N-terminais por degradação de Edman. O PR0172 foi expresso em células de insecto Sf9 infectadas com baculovírus.
Alternativamente, pode-se utilizar um procedimento de baculovírus modificado, incorporando células high-5. Neste procedimento, o adn que codifica para a sequência desejada é amplificado com sistemas adequados, tais como Pfu (Stratagene), ou fundido a montante (5' em relação a) de um marcador epitópico contido num vector de expressão de baculovírus. Estes marcadores epitópicos incluem marcadores poli-His e marcadores de imunoglobulina (tal como regiões Fc de IgG). Pode-se utilizar uma variedade de plasmídeos, incluindo plasmídeos derivados de plasmídeos disponíveis no mercado, tais como plE 1-1 (Novagen). Os vectores pIEl-1 e pIEl-2 são concebidos para expressão constitutiva de proteínas recombinantes a partir do promotor iel de baculovírus em células de insecto transformadas de forma estável(1). Os plasmídeos diferem apenas na orientação dos locais de clonagem múltiplos e contêm todas as sequências promotoras que se sabe serem importantes para a expressão de genes mediada por iel em células de insecto não infectadas, bem como o elemento 87 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ potenciador hr5. Ο plEl-1 e ρΙΕ1-2 incluem o local de iniciação de tradução e podem ser utilizados para produzir proteínas de fusão. Em resumo, a sequência desejada ou a porção da sequência desejada (tal como a sequência que codifica para o domínio extracelular de uma proteína transmembranar) é amplificada por PCR com iniciadores complementares às regiões 5' e 3'. O iniciador 5' pode incorporar locais de enzimas de restrição flanqueadores (seleccionados). 0 produto é então digerido com as enzimas de restrição seleccionadas e subclonado no vector de expressão. Por exemplo, os derivados de pIEl-1 podem incluir a região Fc de IgG humana (pb.PH.lgG), ou um marcador de 8 histidinas (pb.PH.His) a jusante (3'-em relação a) da sequência desejada. De preferência, a construção do vector é sequenciada para confirmação.
As células high-5 são crescidas até uma confluência de 50% sob as condições de 27°C, sem C02, sem pen/estrep. Para cada placa de 150 mm, misturam-se 30 pg de vector baseado em plE contendo a sequência com 1 ml de meio Ex-Cell (Meio: Ex-
Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences #14401-78P (nota: este meio é sensível à luz)), e num tubo separado, misturam-se 100 μΐ de CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL # 10362-010) (agitado num vórtex para misturar)) com 1 ml de meio Ex-Cell. As duas soluções são combinadas e deixadas a incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionam-se 8 ml de meio Ex-Cell aos 2 ml de mistura ADN/CellFECTiN e coloca-se uma camada destes em células high-5 que foram lavadas uma vez com meio Ex-Cell. A placa é então incubada no escuro durante 1 hora, à temperatura ambiente. A mistura ADN/CellFECTlN é em seguida aspirada e as células são lavadas uma vez com Ex-Cell para remover o excesso de CellFECTIN, adicionam-se 30 ml de meio Ex-Cell fresco e as células são incubadas durante 3 dias a 28°C. O sobrenadante é recolhido e a expressão da sequência no vector de expressão de baculovírus é determinada por ligação por lotes de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de pérolas Ni2+-NTA (QIAGEN) para proteínas marcadas com histidina, ou pérolas de Proteína-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas marcadas com IgG, seguido de análise de SDS-PAGE, comparando com uma concentração conhecida de padrão de proteína, por coloração com azul de Coomassie. 88 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ Ο meio condicionado das células transfectadas (0,5 a 3 1) é recolhido por centrifugação para remover as células e filtrado através de filtros de 0,22 micron. Para as construções marcadas com poli-His, a proteína compreendendo a sequência é purificada utilizando uma coluna de Ni2+-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adiciona-se imidazolo ao meio condicionado, a uma concentração de 5 mM. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de Ni2+-NTA de 6 ml equilibrada em tampão Hepes 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,3 M e imidazolo 5 mM a um fluxo de 4-5 ml/min, a 48°C. Após carga, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína é eluída com tampão de equilíbrio contendo imidazolo 0,25 Μ. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada num tampão de armazenamento contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) e armazenado a -80°C.
As construções de imunoadesina (contendo Fc) de proteínas são purificadas a partir do meio condicionado, como se segue. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que foi equilibrada em tampão fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após carga, a coluna é bem lavada vezes com tampão de equilíbrio antes de eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada recolhendo fracções de 1 ml para tubos contendo 275 ml de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em tampão de armazenamento, como descrito acima para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade da sequência é verificada por geles de poliacrilamida com SDS e sequenciação de aminoácidos N-terminais por degradação de Edman e outros procedimentos analíticos, como desejado, ou necessário. O PR0172 foi expresso utilizando o procedimento com baculovírus acima descrito, utilizando células high-5. EXEMPLO 6
Preparação de anticorpos que se ligam a PR0172
Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que se podem ligar especificamente a PR0172. 89 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
As técnicas para produzir os anticorpos monoclonais são conhecidas na arte e estão descritas, por exemplo, em Goding, supra. Os imunogénios que podem ser utilizados incluem PR0172 purificado, proteínas de fusão contendo PR0172 e células que expressam PR0172 recombinante na superfície celular. A selecção do imunogénio pode ser feita pelo perito na arte sem experimentação excessiva.
Ratinhos, tais como Balb/c são imunizados com o imunogénio PR0172 emulsionado em adjuvante de Freund completo e injectados, subcutânea ou intraperitonealmente numa quantidade de 1-100 microgramas. Alternativamente, o imunogénio é emulsionado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injectado nas almofadas das patas traseiras do animal. Os ratinhos imunizados levam em seguida um reforço 10 a 12 dias mais tarde, com imunogénio adicional emulsionado no adjuvante seleccionado. Em seguida, durante várias semanas, os ratinhos podem também levar um reforço com injecções de imunização adicionais. Podem-se obter periodicamente amostras de soro dos ratinhos por sangramento retro-orbital para testar em testes ELISA, para detectar anticorpos anti-PR0172.
Após se ter detectado um título de anticorpo adequado, os animais "positivos" para anticorpos podem ser injectados com uma injecção intravenosa final de PR0172. Três a quatro dias mais tarde os ratinhos são sacrificados e as células do baço são recolhidas. As células do baço são então fundidas (utilizando polietilenoglicol a 35%) com uma linha celular de mieloma de murídeo seleccionada, tal como P3X63AgU.l, disponível da ATCC, N°. CRL 1597. As fusões produzem células de hibridoma que podem ser em seguida plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células de baço.
As células de hibridoma serão pesquisadas num ELISA quanto à reactividade contra PR0172. A determinação de células de hibridoma "positivas" que segregam os anticorpos 90 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ monoclonais desejados contra PR0172 está no âmbito dos conhecimentos na arte.
As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c singeneicos, para produzir ascites contendo os anticorpos monoclonais anti-PR0172. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser crescidas em frascos ou garrafas rotativas de cultura de tecidos. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos nas ascites pode ser realizada utilizando precipitação com sulfato de amónio, seguida de cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, pode-se utilizar cromatografia de afinidade baseada na ligação de anticorpo a proteína A ou proteína G. EXEMPLO 7
Purificação de polipéptidos PR0172 utilizando anticorpos específicos
Os polipéptidos PR0172 nativos ou recombinantes podem ser purificados por uma variedade de técnicas convencionais na arte da purificação de proteínas. Por exemplo, o polipéptido pro-PR0172, o polipéptido PR0172 maduro ou o polipéptido pré-PR0172 são purificados por cromatografia de imunoafinidade utilizando anticorpos específicos para o polipéptido PR0172 de interesse. Em geral, uma coluna de imunoafinidade é construída por acoplamento covalente do anticorpo anti-polipéptido PR0172 a uma resina cromatográfica activada.
As imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soros imunes, quer por precipitação com sulfato de amónio, quer por purificação em Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De igual modo, os anticorpos monoclonais são preparados a partir de fluido ascítico de ratinho por precipitação com sulfato de amónio ou cromatografia em Proteína A imobilizada. A imunoglobulina parcialmente purificada é ligada de forma covalente a uma resina cromatográfica, tal como SEPHAROSE™ (Pharmacia LKB Biotechnology) activada com CnBr. O anticorpo é acoplado à resina, a resina é bloqueada e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante. 91 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Utiliza-se uma coluna de imunoafinidade deste tipo na purificação do polipéptido PR0172, preparando uma fracção das células contendo polipéptido PR0172 numa forma solúvel. Esta preparação é derivada por solubilização das células totais ou de uma fracção subcelular obtida por centrifugação diferencial, por adição de detergente ou por outros métodos bem conhecidos na arte. Alternativamente, o polipéptido PR0172 solúvel contendo uma sequência de sinal pode ser segregado em quantidade útil no meio em que as células são crescidas.
Uma preparação contendo polipéptido PR0172 solúvel é passada numa coluna de imunoafinidade e a coluna é lavada sob condições que permitem a absorvância preferencial do polipéptido PR0172 (e.g. tampões de força iónica elevada na presença de detergente). Em seguida, a coluna é eluida sob condições que rompem a ligação anticorpo/polipéptido PR0172 (e.g. um tampão de pH baixo, tal como aproximadamente pH 2-3 ou uma concentração elevada de um agente caotrópico, tal como ureia ou ião tiocianato) e o polipéptido PR0172 é recolhido. EXEMPLO 8
Pesquisa de drogas A presente invenção é particularmente útil para pesquisar compostos utilizando polipéptidos PR0172 ou seus fragmentos de ligação em qualquer uma de uma variedade de técnicas de pesquisa de drogas. 0 polipéptido PR0172 ou fragmento utilizado neste teste pode estar livre em solução, ou fixo num suporte sólido, ou ser transportado numa superfície celular ou estar localizado intracelularmente. Um método de pesquisa de drogas utiliza células hospedeiras eucariotas ou procariotas que são transformadas de forma estável com ácidos nucleicos recombinantes que expressam o polipéptido PR0172 ou o fragmento. As drogas são pesquisadas contra estas células transformadas em testes de ligação competitiva. Estas células, quer na forma viável, quer fixadas, podem ser utilizadas para testes de ligação convencionais. Pode-se medir, por exemplo, a formação de complexos entre um polipéptido PR0172 ou um fragmento e o agente a testar. Alternativamente, pode-se analisar a diminuição na formação de complexo entre o 92 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ polipéptido PR0172 e a sua célula alvo ou receptores alvo, causada pelo agente a testar.
Assim, a presente invenção proporciona métodos para pesquisar drogas ou quaisquer outros agentes que podem afectar uma doença ou distúrbio associados com o polipéptido PR0172. Estes métodos compreendem contactar este agente com um polipéptido PR0172 ou seu fragmento e testar (i) quanto à presença de um complexo entre o agente e o polipéptido PR0172 ou fragmento, ou (ii) quanto à presença de um complexo entre o polipéptido PR0172 ou fragmento e a célula, por métodos bem conhecidos na arte. Nestes testes de ligação competitiva, o polipéptido PR0172 ou fragmento são tipicamente marcados. Após uma incubação adequada, o polipéptido PR0172 livre ou o fragmento são separados dos que estão presentes na forma ligada e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma medida da capacidade do agente particular se ligar ao polipéptido PR0172, ou interferir com o complexo polipéptido PROl72/célula.
Outra técnica para a pesquisa de drogas proporciona uma pesquisa de alto rendimento para compostos com afinidade de ligação adequada para com um polipéptido e está descrita em detalhe em WO 84/03564, publicado em 13 de Setembro de 1984. Em resumo, sintetizam-se grandes quantidades de compostos de teste de péptidos pequenos, diferentes, sobre um substrato sólido tal como pregos de plástico ou alguma outra superfície. Tal como aplicado a um polipéptido PR0172, os compostos de teste peptídicos são reagidos com o polipéptido PR0172 e lavados. O polipéptido PR0172 ligado é detectado por métodos bem conhecidos na arte. O polipéptido PR0172 purificado pode também ser utilizado para revestir directamente placas para utilização nas técnicas de pesquisa de drogas anteriormente mencionadas. Adicionalmente, podem-se utilizar anticorpos não neutralizantes para capturar o péptido e imobilizá-lo no suporte sólido. A presente invenção também contempla a utilização de testes de pesquisa de drogas competitivos, em que anticorpos neutralizantes com capacidade de ligação ao polipéptido PR0172 competem especificamente com um composto de teste pela ligação ao polipéptido PR0172 ou seus fragmentos. Deste modo, os 93 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença de qualquer péptido que partilha um ou mais determinantes antigénicos com um polipéptido PR0172. EXEMPLO 9
Concepção racional de drogas 0 objectivo da concepção racional de drogas é produzir análogos estruturais de um polipéptido biologicamente activo de interesse (i.e. um polipéptido PR0172) ou de moléculas pequenas com as quais ele interage, e.g., agonistas, antagonistas ou inibidores. Qualquer destes exemplos pode ser utilizado para modelar drogas que são formas mais activas ou estáveis do polipéptido PR0172, ou que melhoram ou interferem com a função do polipéptido PR0172 in vivo (cf Hodgson, Bio/Technology, 9_: 19-21 (1991)).
Numa abordagem, a estrutura tridimensional do polipéptido PR0172 ou de um complexo polipéptido PR0172-inibidor, é determinada por cristalografia de raios-X, por modelação em computador ou, mais tipicamente, por uma combinação das duas abordagens. Ambas, a forma e carga do polipéptido PR0172, têm que ser determinadas para elucidar a estrutura e determinar o(s) local(ais) activo(s) da molécula. Menos frequentemente, pode-se obter informação útil a respeito da estrutura do polipéptido PR0172 por modelação baseada na estrutura de proteínas homólogas. Em ambos os casos, a informação estrutural relevante é utilizada para conceber moléculas do tipo polipéptido PR0172 análogas, ou para identificar inibidores eficazes. Exemplos úteis de concepção racional de drogas incluem moléculas que têm uma actividade ou estabilidade melhorada, como demonstrado por Braxton e Wells, Biochemistry, 3_1: 7796-7801 (1992) ou que actuam como inibidores, agonistas, ou antagonistas de péptidos nativos, como demonstrado por Athauda et al., Jj_ Biochem., 113:742-746 (1993) .
Também é possivel isolar um anticorpo especifico para o alvo, seleccionado por um teste funcional, como descrito acima, e em seguida resolver a sua estrutura de cristal. Esta abordagem, em principio, origina um núcleo de fármaco, sobre o 94 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ qual se pode basear a concepção subsequente da droga. É possível contornar a cristalografia de proteína produzindo anticorpos anti-idiotípicos (anti-id) para um anticorpo farmacologicamente activo, funcional. Tal como uma imagem num espelho de uma imagem num espelho, é esperado que o local de ligação dos anti-id seja um análogo do receptor original. 0 anti-id pode ser então utilizado para identificar e isolar péptidos de bancos de péptidos produzidos química ou biologicamente. Os péptidos isolados irão então actuar como núcleo de fármaco ("pharmacore").
Por meio da presente invenção podem-se disponibilizar quantidades suficientes do polipéptido PR0172 para realizar estudos analíticos, tal como cristalografia de raios-X. Além disso, o conhecimento da sequência de aminoácidos do polipéptido PR0172 aqui proporcionada irá fornecer uma linha de orientação para os que utilizam técnicas de modelação em computador, em vez de, ou em adição, à cristalografia de raios-X. EXEMPLO 10
Teste antitumoral in vitro A actividade antiproliferativa dos polipéptidos PR0172 foi determinada num teste de investigação, de pesquisa de drogas anticancerosas in vitro orientada pela doença, do National Câncer Institute (NCI), utilizando um teste de ligação do corante sulforrodamina B (SRB) essencialmente como descrito por Skehan et al., J. Natl. Câncer Inst., 82:1107-1112 (1990). As 60 linhas celulares de tumor utilizadas neste estudo ("o painel NCI"), bem como as condições para a sua manutenção e cultura in vitro foram descritas por Monks et al., J. Natl. Câncer Inst. 83:757-766 (1991). A finalidade desta pesquisa é avaliar inicialmente a actividade citotóxica e/ou citostática dos compostos de teste contra diferentes tipos de tumores (Monks et al., supra; Boyd, Câncer Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10):1-12 [1989]).
As células de aproximadamente 60 linhas celulares de tumor foram recolhidas com tripsina/EDTA (Gibco), lavadas uma vez, ressuspensas em IMEM e a sua viabilidade foi determinada. 95 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
As suspensões de células foram adicionadas por pipeta (volume de 100 μΐ) em placas de microtítulo de 96 poços separadas. A densidade celular para a incubação de 6 dias era inferior à da incubação de 2 dias, para evitar o sobre-crescimento. Deixou-se decorrer um período de pré-incubação dos inóculos de 24 horas a 37°C, para estabilização. Adicionaram-se diluições de duas vezes a concentração de teste pretendida no tempo zero, em aliquotas de 100 μΐ, aos poços da placa de microtítulo (diluição 1:2). Os compostos de teste foram analisados a 5 diluições semi-log (1000 a 100 000 vezes). As incubações ocorreram durante dois dias e seis dias numa atmosfera de C02 a 5% e humidade a 100%.
Após incubação, o meio foi removido e as células foram fixadas em 0,1 ml de ácido tricloroacético a 10%, a 40°C. As placas foram lavadas cinco vezes com água desionizada, secas, coradas durante 30 minutos com 0,1 ml de corante sulforrodamina B a 0,4% (Sigma) dissolvido em ácido acético a 1%, enxaguadas quatro vezes com ácido acético a 1% para remover o corante não ligado, secas e o corante foi extraído durante cinco minutos com 0,1 ml de base Tris 10 mM [tris(hidroximetil)aminometano], pH 10,5. A absorvância (DO) de sulf orrodamina B a 492 nm foi medida utilizando um leitor de placas de microtítulo de 96 poços com interface de computador.
Uma amostra de teste é considerada positiva se apresenta um efeito inibidor do crescimento de pelo menos 40%, a uma ou mais concentrações. Os resultados são apresentados na Tabela 4 seguinte, em que as abreviaturas do tipo de células tumorais são como se segue: NSCL = carcinoma de pulmão de células não pequenas; SNC = sistema nervoso central EP 1 518 930/PT Composto Concentração Dias 96 Tabela 4 Tipo de Célula Tumoral Designação PR0172 1,25 nM 2 Mama T-470 PR0172 1,25 nM 6 NSCL NCI-H460 PR0172 1,25 nM 6 Cólon KM 12 PR0172 1,25 nM 6 SNC SF-295 PR0172 1,25 nM 6 Melanoma UACC-62 PR0172 1,25 nM 2 Mama MDA-MB-231/ATCC PR0172 1,25 nM 6 Leucemia CCRF-CEM PR0172 1,25 nM 6 Leucemia MOLT4 PR0172 1,25 nM 6 NSCL NCI-H46 0 PR0172 1,25 nM 6 Cólon HCT-116 PR0172 1,25 nM 6 Cólon HT29 PR0172 1,25 nM 6 SNC SF-295 PR0172 1,25 nM 6 SNC U251 PR0172 1,25 nM 6 Melanoma LOX IMVI PR0172 1,25 nM 6 Melanoma UACC-62 PR0172 1,25 nM 6 Ovário OVCAR-8 PR0172 1,25 nM 6 Renal RXF 393 PR0172 1,25 nM 6 Mama T-470
DEPÓSITO DE MATERIAL
Os materiais seguintes foram depositados na American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, EUA (ATCC):
Material N°. Dep. ATCC Data de depósito DNA35916-1161 209419 28 de Outubro de 1997
Estes depósitos foram feitos sob as condições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes e seus Regulamentos (tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos a partir da data de depósito. Os depósitos serão disponibilizado pela ATCC nos termos do tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a 97 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ ATCC, ο que assegura uma disponibilidade permanente e sem restrições da progénie da cultura do depósito ao público, após concessão da patente US pertinente, ou após disponíveis ao público qualquer pedido de patente US ou estrangeira, de acordo com o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da progénie a quem o agente de patentes e marcas registadas dos EUA determinar que tem direito, de acordo com a 35 USC §122 e regras do agente conformes com esta (incluindo 37 CFR §1.14 com referência particular a 886 OG 638) . 0 cessionário do presente pedido concordou que se uma cultura dos materiais depositados morrer, ou for perdida, ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos após notificação, com outros do mesmo. A disponibilidade do material depositado não deve ser entendida como uma licença para praticar a invenção, em contravenção dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo, em acordo com as suas leis sobre patentes. 0 fascículo escrito acima é considerado suficiente para permitir a um perito na arte praticar a invenção. A presente invenção não deve ser limitada no seu âmbito pela construção depositada, uma vez que a concretização depositada pretende ser apenas uma ilustração de alguns aspectos da invenção e outras construções que são funcionalmente equivalentes estão no âmbito da invenção, como definido nas reivindicações. 0 depósito de material não constitui admissão de que a descrição escrita aqui contida é inadequada para a prática de qualquer aspecto da invenção, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser entendida como limitando o âmbito das reivindicações às ilustrações específicas que representa. De facto, várias modificações em adição às apresentadas e descritas aqui serão evidentes para os peritos na arte a partir da descrição anterior. 98 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Listagem de sequências ANEXA <110> Genentech, Inc.
<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS NEOPLÁSICAS
<130> P1694R1 PCT <140> EP 04025897.2 <141> 1999-10-05 <150>EP 99970398.6 <151> 1999-10-05 <150> PCT/US99/23089 <151> 1999-10-05 <150> US 60/109, 080 <151> 1998-10-13
<210> 1 <211> 2933 <212> ADN <213> Homo sapíens < 4 0 0 > 1 tgggggcccc ccaggctcgc gcgtggagcg aagcagcatg ggcagtcggt 50 gcgcgctggc cctggcggtg ctctcggcct tgctgtgtca ggtctggagc 100 tctggggtgt tcgaactgaa gctgcaggag ttcgtcaaca agaaggggct 150 gctggggaac cgcaattgct gccgcggggg cgcggggcca ccgccgtgcg 200 cctgccggac cttcttccgc gtgtgcctca agcactacca ggccagcgtg 250 tcccccgagc cgccctgcac ctacggcagc gccgtcaccc ccgtgctggg 300 99 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ cgtcgactcc ttcagtctgc ccgacggcgg gggcgccgac tccgcgttca 350 gcaaccccat ccgcttcccc ttcggcttca cctggccggg caccttctct 400 ctgattattg aagctctcca cacagattct cctgatgacc tcgcaacaga 450 aaacccagaa agactcatca gccgcctggc cacccagagg cacctgacgg 500 tgggcgagga gtggtcccag gacctgcaca gcagcggccg cacggacctc 550 aagtactcct accgcttcgt gtgtgacgaa cactactacg gagagggctg 600 ctccgttttc tgccgtcccc gggacgatgc cttcggccac ttcacctgtg 650 gggagcgtgg ggagaaagtg tgcaaccctg gctggaaagg gccctactgc 100 acagagccga tctgcctgcc tggatgtgat gagcagcatg gattttgtga 750 caaaccaggg gaatgcaagt gcagagtggg ctggcagggc cggtactgtg 800 acgagtgtat ccgctatcca ggctgtctcc atggcacctg ccagcagccc 850 tggcagtgca actgccagga aggctggggg ggccttttct gcaaccagga 900 cctgaactac tgcacacacc ataagccctg caagaatgga gccacctgca 950 ccaacacggg ccaggggagc tacacttgct cttgccggcc tgggtacaca 1000 ggtgccacct gcgagctggg gattgacgag tgtgacccca gcccttgtaa 1050 gaacggaggg agctgcacgg atctcgagaa cagctactcc tgtacctgcc 1100 cacccggctt ctacggcaaa atctgtgaat tgagtgccat gacctgtgcg 1150 gacggccctt gctttaacgg gggtcggtgc tcagacagcc ccgatggagg 1200 gtacagctgc cgctgccccg tgggctactc cggcttcaac tgtgagaaga 1250 aaattgacta ctgcagctct tcaccctgtt ctaatggtgc caagtgtgtg 1300 gacctcggtg atgcctacct gtgccgctgc caggccggct tctcggggag 1350 gcactgtgac gacaacgtgg acgactgcgc ctcctccccg tgcgccaacg 1400 ggggcacctg ccgggatggc gtgaacgact tctcctgcac ctgcccgcct 1450 ggctacacgg gcaggaactg cagtgccccc gtcagcaggt gcgagcacgc 1500 accctgccac aatggggcca cctgccacga gaggggccac cgctatgtgt 1550 gcgagtgtgc ccgaggctac gggggtccca actgccagtt cctgctcccc 1600 gagctgcccc cgggcccagc ggtggtggac ctcactgaga agctagaggg 1650 ccagggcggg ccattcccct gggtggccgt gtgcgccggg gtcatccttg 1700 tcctcatgct gctgctgggc tgtgccgctg tggtggtctg cgtccggctg 1750 aggctgcaga agcaccggcc cccagccgac ccctgccggg gggagacgga 1800 gaccatgaac aacctggcca actgccagcg tgagaaggac atctcagtca 1850 gcatcatcgg ggccacgcag atcaagaaca ccaacaagaa ggcggacttc 1900 100 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ cacggggacc acagcgccga caagaatggc ttcaaggccc gctacccagc 1950 ggtggactat aacctcgtgc aggacctcaa gggtgacgac accgccgtca 2000 gggacgcgca cagcaagcgt gacaccaagt gccagcccca gggctcctca 2050 ggggaggaga aggggacccc gaccacactc aggggtggag aagcatctga 2100 aagaaaaagg ccggactcgg gctgttcaac ttcaaaagac accaagtacc 2150 agtcggtgta cgtcatatcc gaggagaagg atgagtgcgt catagcaact 2200 gaggtgtaaa atggaagtga gatggcaaga ctcccgtttc tcttaaaata 2250 agtaaaattc caaggatata tgccccaacg aatgctgctg aagaggaggg 2300 aggcctcgtg gactgctgct gagaaaccga gttcagaccg agcaggttct 2350 cctcctgagg tcctcgacgc ctgccgacag cctgtcgcgg cccggccgcc 2400 tgcggcactg ccttccgtga cgtcgccgtt gcactatgga cagttgctct 2450 taagagaata tatatttaaa tgggtgaact gaattacgca taagaagcat 2500 gcactgcctg agtgtatatt ttggattctt atgagccagt cttttcttga 2550 attagaaaca caaacactgc ctttattgtc ctttttgata cgaagatgtg 2600 ctttttctag atggaaaaga tgtgtgttat tttttggatt tgtaaaaata 2650 tttttcatga tatctgtaaa gcttgagtat tttgtgatgt tcgtttttta 2700 taatttaaat tttggtaaat atgtacaaag gcacttcggg tctatgtgac 2750 tatatttttt tgtatataaa tgtatttatg gaatattgtg caaatgttat 2800 ttgagttttt tactgttttg ttaatgaaga aattcctttt taaaatattt 2850 ttccaaaata aattttatga atgacaaaaa aaaaaaaaaa âãâãããââãã 2900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3ciââ3â33â3 aaa 2933
<210> 2 <211> 723 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2
Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Vai Leu Ser Ala Leu 15 10 15
Leu Cys Gin Vai Trp Ser Ser Gly Vai Phe Glu Leu Lys Leu Gin 20 25 30
Glu Phe Vai Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys tc an ac
J J 4U 4 D
Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe 50 55 60
Arg Vai Cys Leu Lys His Tyr Gin Ala Ser Vai Ser Pro Glu Pro 65 70 75 101 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Pro Cys Thr Tyr Gly Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp 80 85 90 Ser Phe Ser Leu Pro Asp Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser 95 100 105 Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe 110 115 120 Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu 125 130 135 Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile Ser Arg Leu Ala Thr Gin 140 145 150 Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser Gin Asp Leu His Ser 155 160 165 Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Cys Asp 170 175 180 Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys Arg Pro Arg 185 190 195 n T-» Asp Ala Phe Gly H jc phe Thr Owo -> m ,, Glu a m 1 ‘1- y Gly Glu Lys 200 205 210 Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro Ile 215 220 225 Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu Gin His Gly Phe Cys Asp Lys Pro 230 235 240 Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gin Gly Arg Tyr Cys Asp 245 250 255 Glu Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gin Gin O <? Λ L OU TCC LUJ ΊΤΛ c r v Pro Trp Gin Cys Asn Cys Gin Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys 275 280 285 Asn Gin Asp Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn 290 295 300 Gly Ala Thr Cys Thr Asn Thr Gly Gin Gly Ser Tyr Thr Cys Ser 305 310 315 Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp 320 325 330 Glu Cys Asp Pro Ser Pro Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp 335 340 345 Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly 350 355 360 Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys 365 370 375 Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser Pro Asp Gly Gly Tyr Ser 380 385 390 102 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
Cys Arg Cys Pro Vai Gly Tyr Ser Gly Phe Asn Cys Glu Lys Lys 395 400 405 Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn Gly Ala Lys Cys 410 415 420 Vai Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gin Ala Gly Phe 425 430 435 Ser Gly Arg His Cys Asp Asp Asn Vai Asp Asp Cys Ala Ser Ser 440 445 450 Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Vai Asn Asp Phe 455 460 465 Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala 470 475 480 Pro Vai Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr 485 490 4 95 Cys His Glu Arg Gly His Arg Tyr Vai Cys Glu Cys Ala Arg Gly 500 505 510 Φι»*- j-yj. m " ΓΜ ,, yiy Pro A* n 515 Cys uin DK λ L 117 Leu T U 520 Pro ΰΐν Leu Pro Pro 525 Gly Pro Ala Vai Vai Asp Leu Thr Glu Lys Leu Glu Gly Gin Gly 530 535 540 Gly Pro Phe Pro Trp Vai Ala Vai Cys Ala Gly Vai Ile Leu Vai 545 550 555 Leu Met Leu Leu Leu Gly Cys Ala Ala Vai Vai Vai Cys Vai Arg 560 565 570 Leu Arg Leu Gin Lys His Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg Gly e n c υ / O 580 585 Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn Leu Ala Asn Cys Gin Arg Glu Lys 590 595 600 Asp Ile Ser Vai Ser Ile Ile Gly Ala Thr Gin Ile Lys Asn Thr 605 610 615 Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp His Ser Ala Asp Lys Asn 620. 625 630 Gly Phe Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Vai Asp Tyr Asn Leu Vai Gin 635 640 645 Asp Leu Lys Gly Asp Asp Thr Ala Vai Arg Asp Ala His Ser Lys 650 655 660 Arg Asp Thr Lys Cys Gin Pro Gin Gly Ser Ser Gly Glu Glu Lys 665 670 675 Gly Thr Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu Arg Lys 680 685 690 Arg Pro Asp Ser Gly Cys Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr Gin 695 700 705
Ser Vai Tyr Vai Ile Ser Glu Glu Lys Asp Glu Cys Vai Ile Ala 710 715 720
Thr Glu Vai 723 103 ΕΡ 1 518 930/ΡΤ
<210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sonda Oligonucleotídica Sintética <400> 3 ggatctcgag aacagctact cc 22
<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sonda Oligonucleotídica Sintética < 4 0 0 > 4 tcgtccacgt tgtcgtcaca tg 22
<210> 5 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sonda Oligonucleotídica Sintética < 4 0 0 > 5 aaatctgtga attgagtgcc atggacctgt tgcggacggc ccttgctt 48
Lisboa

Claims (11)

  1. ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um agente no fabrico de um medicamento para inibição do crescimento de uma célula tumoral, em que o referido agente é: (i) um polipéptido PR0172, compreendendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com: (a) os residuos 1 ou cerca de 22 a 723, apresentados na Figura 2 (SEQ ID NO:2), (b) os residuos X a 723, apresentados na Figura 2 (SEQ ID NO:2), em que X é qualquer residuo de aminoácido de 17 a 26 da Figura 2 (SEQ ID NO:2), ou (c) os residuos 1 ou cerca de 22 a X da Figura 2 (SEQ ID NO:2), em que X é qualquer aminoácido do aminoácido 543 ao aminoácido 552 da Figura 2 (SEQ ID NO:2), em que a identidade de sequências é determinada ao longo da totalidade da sequência citada; ou (ii) um fragmento do polipéptido PR0172 apresentado na Figura 2 (SEQ ID NO:2), onde o agente possui actividade antiproliferativa no ensaio de descoberta de fármacos anticancerosos in vitro do NATIONAL CÂNCER INSTITUTE.
  2. 2. Método in vitro para inibição do crescimento de uma célula tumoral compreendendo a exposição da referida célula tumoral a uma quantidade eficaz de um agente tal como definido na reivindicação 1.
  3. 3. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 em que o nivel de identidade é de pelo menos 85%.
  4. 4. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 em que o nivel de identidade é de pelo menos 90%.
  5. 5. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 em que o nivel de identidade é de pelo menos 95%. ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 2/2
  6. 6. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 em que o polipéptido PR0172 compreende a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO:2).
  7. 7. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o polipéptido PR0172 consiste em: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO:2), (b) o domínio extracelular da sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID N0:2), ou (c) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID N0:2), a que falta o péptido de sinal.
  8. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido tumor é um cancro.
  9. 9. Utilização ou método de acordo com a reivindicação 8, em que o cancro é seleccionado do grupo constituído por cancro da mama, cancro dos ovários, cancro renal, cancro colorrectal, cancro do pulmão, cancro do sistema nervoso central, melanoma e leucemia.
  10. 10. Composição útil para a inibição do crescimento de células neoplásicas, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável, e compreendendo adicionalmente um outro agente inibidor do crescimento, agente citotóxico ou agente quimioterapêutico.
  11. 11. Artigo de fabrico compreendendo: um recipiente, uma composição, contida no recipiente, compreendendo um agente tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e compreendendo adicionalmente um outro agente inibidor do crescimento, agente citotóxico ou agente quimioterapêutico. Lisboa ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 1/3 FIGURA ΙΑ TGGGGGCCCCCCAGGCTCGCGCGTGGAGCGAAGCAGCATGGGCAGTCGGTGCGCGCTGGCCC TGGCGGTGCTCTCGGCCTTGCTGTGTCAGGTCTGGAGCTCTGGGGTGTTCGAACTGAAGCTG CAGGAGTTCGTCAACAAGAAGGGGCTGCTGGGGAACCGCAATTGCTGCCGCGGGGGCGCGGG GCCACCGCCGTGCGCCTGCCGGACCTTCTTCCGCGTGTGCCTCAAGCACTACCAGGCCAGCG TGTCCCCCGAGCCGCCCTGCACCTACGGCAGCGCCGTCACCCCCGTGCTGGGCGTCGACTCC TTCAGTCTGCCCGACGGCGGGGGCGCCGACTCCGCGTTCAGCAACCCCATCCGCTTCCCCTT cggcttcacctggccgggcaccttctctctgattattgaagctctccacacagattctcctg ATGACCTCGCAACAGAAAACCCAGAAAGACTCATCAGCCGCCTGGCCACCCAGAGGCACCTG ACGGTGGGCGAGGAGTGGTCCCAGGACCTGCACAGCAGCGGCCGCACGGACCTCAAGTACTC CTACCGCTTCGTGTGTGACGAACACTACTACGGAGAGGGCTGCTCCGTTTTCTGCCGTCCCC GGGACGATGCCTTCGGCCACTTCACCTGTGGGGAGCGTGGGGAGAAAGTGTGCAACCCTGGC TGGAAAGGGCCCTACTGCACAGAGCCGATCTGCCTGCCTGGATGTGATGAGCAGCATGGATT TTGTGACAAACCAGGGGAATGCAAGTGCAGAGTGGGCTGGCAGGGCCGGTACTGTGACGAGT GTATCCGCTATCCAGGCTGTCTCCATGGCACCTGCCAGCAGCCCTGGCAGTGCAACTGCCAG GAAGGCTGGGGGGGCCTTTTCTGCAACCAGGACCTGAACTACTGCACACACCATAAGCCCTG CAAGAATGGAGCCACCTGCACCAACACGGGCCAGGGGAGCTACACTTGCTCTTGCCGGCCTG GGTACACAGGTGCCACCTGCGAGCTGGGGATTGACGAGTGTGACCCCAGCCCTTGTAAGAAC GGAGGGAGCTGCACGGATCTCGAGAACAGCTACTCCTGTACCTGCCCACCCGGCTTCTACGG CAAAATCTGTGAATTGAGTGCCATGACCTGTGCGGACGGCCCTTGCTTTAACGGGGGTCGGT GCTCAGACAGCCCCGATGGAGGGTACAGCTGCCGCTGCCCCGTGGGCTACTCCGGCTTCAACTGT GAGAAGAAAATTGACTACTGCAGCTCTTCACCCTGTTCTAATGGTGCCAAGTGTGTGGACCT CGGTGATGCCTACCTGTGCCGCTGCCAGGCCGGCTTCTCGGGGAGGCACTGTGACGACAACG TGGACGACTGCGCCTCCTCCCCGTGCGCCAACGGGGGCACCTGCCGGGATGGCGTGAACGAC TTCTCCTGCACCTGCCCGCCTGGCTACACGGGCAGGAACTGCAGTGCCCCCGTCAGCAGGTG CGAGCACGCACCCTGCCAC.AATGGGGCCACCTGCCACGAGAGGGGCCACCGCTATGTGTGCG AGTGTGCCCGAGGCTACGGGGGTCCCAACTGCCAGTTCCTGCTCCCCGAGCTGCCCCCGGGC CCAGCGGTGGTGGACCTCACTGAGAAGCTAGAGGGCCAGGGCGGGCCATTCCCCTGGGTGGC CGTGTGCGCCGGGGTCATCCTTGTCCTCATGCTGCTGOTGGGCTGTGCCGCTGTGGTGGTCT GCGTCCGGCTGAGGCTGCAGAAGCACCGGCCCCCAGCCGACCCCTGCCGGGGGGAGACGGAG ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 2/3 FIGURA 1Β ACCATGAACAACCTGGCCAACTGCCAGCGTGAGAAGGACATCTCAGTCAGCATCATCGGGGC CACGCAGATCAAGAACACCAACAAGAAGGCGGACTTCCACGGGGACCACAGCGCCGACAAGA ATGGCTTCAAGGCCCGCTACCCAGCGGTGGACTATAACCTCGTGCAGGACCTCAAGGGTGAC GACACCGCCGTCAGGGACGCGCACAGCAAGCGTGACACCAAGTGCCAGCCCCAGGGCTCCTC AGGGGAGGAGAAGGGGACCCCGACCACACTCAGGGGTGGAGAAGCATCTGAAAGAAAAAGGC CGGACTCGGGCTGTTCAACTTCAAAAGACACCAAGTACCAGTCGGTGTACGTCATATCCGAG GAGAAGGATGAGTGCGTCATAGCAACTGAGGTGTAAAATGGAAGTGAGATGGCAAGACTCCC GTTTCTCTTAAAATAAGTAAAATTCCAAGGATATATGCCCCAACGAATGCTGCTGAAGAGGA GGGAGGCCTCGTGGACTGCTGCTGAGAAACCGAGTTCAGACCGAGCAGGTTCTCCTCCTGAG GTCCTCGACGCCTGCCGACAGCCTGTCGCGGCCCGGCCGCCTGCGGCACTGCCTTCCGTGACGT CGCCGTTGCACTATGGACAGTTGCTCTTAAGAGAATATATATTTAAATGGGTGAACTGAATT ACGCATAAGAAGCATGCACTGCCTGAGTGTATATTTTGGATTCTTATGAGCCAGTCTTTTCT TGAATTAGAAACACAAACACTGCCTTTATTGTCCTTTTTGATACGAAGATGTGCTTTTTCTA GATGGAAAAGATGTGTGTTATTTTTTGGATTTGTAAAAATATTTTTCATGATATCTGTAAAG CTTGAGTATTTTGTGATGTTCGTTTTTTATAATTTAAATTTTGGTAAATATGTACAAAGGCA CTTCGGGTCTATGTGACTATATTTTTTTGTATATAAATGTATTTATGGAATATTGTGCAAAT GTTATTTGAGTTTTTTACTGTTTTGTTAATGAAGAAATTCCTTTTTAAAATATTTTTCCAAA ATAAATTTTATGAATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA ΕΡ 1 518 930/ΡΤ 3/3 FIGURA 2 MGSRCALALAVLSALLCQVWSSGVFELKLQEFVNKKGLLGNRNCCRGGAGPPPCACRTFFRV CLKHYQASVSPEPPCTYGSAVTPVLGVDSFSLPDGGGADSAFSNPIRFPFOFTWPGTFSLII EALHTDSPDDLATBNPERIiISRIjATQRHIjTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGE GCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPICLPGCDEQHGFCDKPGECKCRVG WQGRYCDECIRYPGCLHGTCQQPWQCNCQEGWGGLFCNQDLNYCTHHKPCKNGATCTNTGQG SYTCSCRPGYTGATCELGIDECDPSPCKNGGSCTDLENSYSCTCPPGFYGKICELSAMTCAD GPCFNGGRCSDSPDGGYSCRCPVGYSGFNCEKKIDYCSSSFCSNGAKCVDLGDAYLCRCQAG FSGRHCDDNVDDCASSPCANGGTCRDGVNDFSCTCPPGYTGRNCSAPVSRCEHAPCHNGATC HERGHRYVCECARGYGGPNCQFLLPELPPGPAWDLTEKLEGQGGPFPWVAVCAGVILVIiML LLGCAAVWCVRLRLQKHRPPADPCRGETETMMNLANCQREKDISVSIIGATQIKNTWKKAD FHGDHSADKNGFKARYPAVDYNLVQDLKGDDTAVRDAHSKRDTKCQPQGSSGEEKGTPTTLR GGEASERKRPDSGCSTSKDTKYQSVYVISEEKDECVIATEV Péptido de sinal: Aminoácidos 1-21 Domínio transmembranar: Aminoácidos 548-568 Local de N-glicosilação: Aminoácidos 477-481 Local de fosforilação por proteína-quinase dependente de GMPc e AMPc: aminoácidos 660-664 Locais de fosforilação por caseína-quinase II: aminoácidos 93-97; 131-135; 154-158; 203-207; 342-346; 344-348; 369-373; 457-461; 483-487; 495-499; 659-663; 670-674; 671-675; 698-702 Locais de fosforilação por tirosina-quinase: Aminoácidos 176— 185; 252-261 Locais de N-miristoílação: Aminoácidos 2-8; 37-43; 40-46; 98-104; 99-105; 262-268; 281-287; 282-288; 301-307; 310-316; 328-334; 340-346; 378-384; 387-393; 512-518; 676-682; 683-689; 695-701 Locais de hidroxilação de ácido aspártico e asparagina: Aminoácidos 343-355; 420-432; 458-480 Local de fixação de lípidos de lipoproteínas de membranas procariotas: aminoácidos 552-563 Assinaturas de padrao de cisteínas de domínio semelhante a EGF: Aminoácidos 243-255; 274-286; 314- 326; 352-364; 391-403; 429-441; 467- 479; 505-517
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