PT1532131E

PT1532131E - Compostos motilidos

Info

Publication number: PT1532131E
Application number: PT03755757T
Authority: PT
Inventors: Robert Mcdaniel; Daniel Santi; Brian Metcalf; Christopher Carreras; Yaoquan Liu; Eduardo J Rodriguez
Original assignee: Pfizer
Priority date: 2002-08-29
Filing date: 2003-08-26
Publication date: 2009-02-18
Also published as: WO2004019879A8; JP4796300B2; US20040138150A1; EP1532131A4; CA2492846A1; CN100363359C; US6946482B2; EP1532131A2; CN1665799A; EP1532131B1; CA2492846C; WO2004019879A2; WO2004019879A3; DE60325377D1; ES2316805T3; CY1108808T1; KR20050038594A; JP2005537317A; AU2003273254B2; AU2003273254A1

Description

1

DESCRIÇÃO "COMPOSTOS MOTILIDOS"

DOMÍNIO TÉCNICO A presente invenção proporciona agentes procinéticos com propriedades farmacológicas e farmacocinéticas superiores para o tratamento de doenças da motilidade gastrintestinal. A invenção insere-se nos domínios da química, química médica, medicina, biologia molecular e farmacologia.

TÉCNICA ANTERIOR A motilidade gastrintestinal ("GI") regula o movimento normal do material ingerido através do intestino para garantir uma absorção adequada de nutrientes, electrólitos e fluidos. 0 trânsito adequado através do esófago, estômago, intestino delgado e cólon depende da regulação regional da pressão intraluminal e dos diversos esfíncteres que regulam o movimento de progressão e impedem o refluxo dos conteúdos gastrintestinais. 0 padrão de motilidade GI normal pode ser desregulado por diversas circunstâncias, incluindo doenças e intervenções cirúrgicas.

Entre as perturbações da motilidade gastrintestinal refere-se, por exemplo, a gastroparesia e a patologia do refluxo gastroesofágico ("GERD") . A gastroparesia é o retardamento do esvaziamento do conteúdo do estômago. Os sintomas da gastroparesia incluem a indigestão, azia, náuseas e vómitos. A gastroparesia aguda pode ser causada, por exemplo, por fármacos (v.g., opiatos), enterite virai e hiperglicemia, sendo o problema resolvido, normalmente, mediante o tratamento da doença subjacente, em vez da perturbação da motilidade. As causas mais vulgares da gastroparesia crónica estão associadas à diabetes de longa 2 duração ou à pseudo-obstrução idiopática, frequentemente com a designada dispepsia "sem úlcera" ou "funcional". A GERD abrange o conjunto das diversas manifestações clinicas de refluxo dos conteúdos do estômago e duodenais para o esófago. Os sintomas mais frequentes são a azia e a disfasia; também pode ocorrer perda de sangue devido à erosão esofágica. A GERD pode estar associada a uma tonicidade diminuta e a um relaxamento inadequado do esfíncter esofágico inferior e ocorre com gastroparesia em cerca de 40% dos casos. Na maior parte dos casos, pressupõe-se que a GERD possa ser tratada com agentes que reduzam a libertação de irritantes acídicos pelo estômago (v.g., Prilosec) ou agentes que aumentem a tonicidade do esfincter esofágico inferior (v.g., Cisapride). Outros exemplos de patologias cujos sintomas compreendem a motilidade gastrintestinal debilitada são a anorexia, a estasia da vesicula biliar, paralisia pós-operatória do ílio, escleroderma, pseudo-obstrução intestinal, gastrite, emese e obstipação crónica (inércia do cólon).

Estas patologias GI são tratadas, geralmente, com agentes procinéticos que aumentam a motilidade propulsora. Os motilidos são compostos macrólidos, tais como a eritromicina e seus derivados, que são agonistas do receptor da motilina. As provas da utilidade clinica potencial dos motilidos são a sua capacidade para induzirem a fase III dos Complexos Motores Migratórios ("MMC") . A designação MMC refere-se às quatro fases (I-IV) de actividade eléctrica apresentada pelo estômago e pelo intestino delgado no estado de jejum. A contracção muscular ocorre nas fases III e IV, coincidindo com uma onda peristáltica que impele os conteúdos entéricos distalmente durante o jejum. Outros efeitos clinicamente relevantes incluem: aumento da peristalsia esofágica e da pressão LES em voluntários normais e em pacientes com GERD; aceleração do esvaziamento gástrico em pacientes com paresia gástrica; 3 estimulação das contracções da vesícula biliar em voluntários normais, em pacientes após a remoção de pedras da vesícula e em diabéticos com neuropatia autonômica.

As eritromicinas são uma família de antibióticos macrólidos obtidos por fermentação dos actinomicetes Saccharopolyspora erythraea (anteriormente designados por Streptomyces erythreus) . A eritromicina A, vulgarmente utilizada como antibiótico, é o elemento mais abundante e importante da família.

Eritromicina A Eritromicina B Eritromicina C Eritromicina D

Ra = OH Rb= Me Ra = H Rb= Me Ra = OH Rb = H Ra = H Rb = H

Desde 1950 que se sabe que a eritromicina A (1) provoca efeitos secundários GI, tais como náuseas, vómitos e desconforto abdominal. A eritromicina A é objecto de uma degradação catalisada por ácidos no estômago, formando inicialmente 8, 9-anidro-6,9-hemiacetal 2 (também conhecido por éter enólico da eritromicina A) e passando depois a espirocetal 3, conforme ilustrado no esquema A. Os efeitos secundários GI são explicados, sobretudo, pela actividade agonista da motilina na própria eritromicina A e no hemiacetal 2. (O espiroacetal 3 é inactivo). 4

ESQUEMA. A

Omura et al., "Gastrointestinal motor-stimulating activity of macrolide antibiotics and the structure-activity relationship," J. Antibiotics (1985) 38: 1631-2, descrevem a capacidade relativa da eritromicina A, 9-di-hidroeritromicina A, e de outros macrólidos para estimularem a contracção intestinal em cães conscientes. Nesta experiência, concluiu--se que a 9-di-hidroeritromicina A era 65% tão activa como a eritromicina numa dose de 1 mg/kg. Uma vez que a 9-di--hidroeritromicina não consegue formar um éter enólico, é evidente que a formação de éter enólico não é essencial para a actividade dos motilidos. A eritromicina A é utilizada, frequentemente, para tratar patologias da motilidade, ainda que a sua actividade antibacteriana cause preocupações no que diz respeito à geração de microrganismos resistentes. Uma vez que a 9-di-hidroeritromicina também revela actividade antibacteriana, há preocupações semelhantes com a sua utilização, enquanto motilido. 5

Foi já preparado um conjunto diversificado de análogos do éter enólico da eritromicina, enquanto motilidos, incluindo EM-523 (4); EM-574 (5); LY267, 108 (6); GM-611 (7) e ABT-229 (8) cujas estruturas estão apresentadas adiante. Ver as patentes de invenção norte-americanas n°s 5 578 579, 5 658 888, 5 922 849, 6 077 943 e 6 084 079. 5

(5) R = isopropilo

Como exemplos de outros motilidos relevantes refere-se os éteres enólicos das lactamas e os derivados epoxídicos das lactamas. Ver as patentes de invenção norte-americanas n°s 5 712 253, 5 523 401, 5 523 418, 5 538 961 e 5 554 605. O documento WO-A-00/63225 descreve macrólidos representados por uma fórmula de Markush que se sobrepõe parcialmente à fórmula estrutural (I) da presente invenção, 6 e descreve também a sua utilização como agentes antimicrobianos. 0 documento US-B2-6 437 151 descreve eritromicinas com substituintes particulares na posição C-13 e a sua utilização, inter alia, para a redução da motilidade gástrica.

Apesar da elevada potência dos éteres enólicos da eritromicina, enquanto motilidos, a sua instabilidade metabólica tem impedido o seu desenvolvimento para fins clínicos. Além disso, os compostos tais como os 7 e 8 revelam uma dessensibilização dos receptores da motilina, tanto em experiências à base de células como em experiências de contractilidade de tiras musculares. Esta dessensibilização pode indiciar uma diminuição de eficácia após a administração de várias doses do motilido.

Deste modo, há a necessidade de encontrar novos compostos motilidos que tenham uma menor actividade antibacteriana, uma maior estabilidade metabólica e menor dessensibilização dos receptores. A presente invenção proporciona análogos de 9-di-hidroeritromicina que satisfazem esta necessidade.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

De acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção proporciona compostos de fórmula estrutural (I):

OH

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que o símbolo R1 representa um grupo alquilo (Ci-Cio) substituído ou não 7 substituído, um grupo alcenilo(C2-C10) substituído ou não substituído, um grupo alcinilo(C2-C10) substituído ou não substituído, um grupo arilo substituído ou não substituído ou um grupo heterocíclico substituído ou não substituído; o símbolo R2 representa 0 átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcinilo (C2-C5) substituído ou não substituído, um grupo arilo substituído ou não substituído ou um grupo heterocíclico substituído ou não substituído; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 ou R4 considerados conjuntamente formam um grupo 0-0(=0)-0, com a condição de no caso de (a) o símbolo R1 representar o grupo etilo e (b) o símbolo R3 representar o grupo OH ou os radicais R3 e R4 considerados em conjunto formarem o grupo 0-C(=0)-0, então o símbolo R2 não representa nem o átomo de hidrogénio nem o grupo metilo.

De acordo com um segundo aspecto, a invenção proporciona um composto para tratar uma patologia da motilidade gástrica num paciente que padeça disso.

De acordo com um terceiro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que incorpora um composto da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico

De acordo com um quarto aspecto, os compostos de fórmula estrutural (I) da presente invenção são utilizados para a preparação de um medicamento para tratar uma patologia da motilidade gástrica num paciente. A invenção descreve também uma célula hospedeira recombinante que produz 11-desoxieritromicina (particularmente 11-desoxieritromicina B) conjuntamente com os genes de policetido-sintase modificados que expressam e os vectores que são utilizados para os conceber. As 11-desoxieritromicinas são úteis como intermediários para a síntese de compostos da presente invenção. A célula hospedeira recombinante possui um gene eryAl arquitectado por substituição do dominio cetorredutase no seu módulo 2 com uma cassete que contém um dominio de desidratase, um dominio de enoil-redutase e um dominio de cetorredutase. A invenção descreve também um método para a produção de 11-desoxieritromicinas, o qual consiste em criar em cultura a referida célula hospedeira recombinante.

MODOS PARA EXECUTAR A INVENÇÃO

Definições

As definições dos termos adiante apresentadas aplicam-se aos termos no sentido em que são utilizados na presente memória descritiva e nas reivindicações anexas, a não ser que o contexto indique claramente outra significação. 0 termo "alquilo" designa um radical hidrocarbonado de cadeia linear ou ramificada que possui um número especificado de átomos de carbono na cadeia ou então, no caso de o número de átomos de carbono não estar especificado, possui até 5 átomos de carbono na cadeia. 0 termo "alcenilo" designa um radical hidrocarbonado de cadeia linear ou ramificada que possui pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e um número especificado de átomos de carbono na cadeia ou então, no caso de o número de átomos de carbono não estar especificado, possui até 5 átomos de carbono na cadeia. 0 termo "alcinilo" designa um radical hidrocarbonado de cadeia linear ou ramificada que possui pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e um número especificado de átomos de carbono na cadeia ou então, no caso de o número de átomos de carbono não estar especificado, possui até 5 átomos de carbono na cadeia.

Os termos "alquilarilo", "arilalquilo", "heterocicloalquilo", "alquil-heteroarilo", "alquil-heterocilo" designam um grupo arilo, heterociclico ou heteroarilo, consoante o caso, ligado 9 directamente a um radical alquilo, tal como um grupo benzilo ou fenetilo. 0 termo "arilo" designa um sistema de anéis hidrocarbonado aromático biciclico que possui entre 6 e 12 átomos de carbono na parte do anel, tal como um radical fenilo, naftilo e bifenilo, sendo cada um deles facultativamente substituído em uma ou em várias posições. 0 termo "cicloalquilo" designa um sistema de anéis hidrocarbonado, cíclico, saturado e facultativamente substituído, contendo de preferência entre 1 e 3 anéis e entre 3 e 7 átomos de carbono por anel, em que cada um deles pode estar ainda fundido com um anel carbocíclico (C3-C7) insaturado. Como exemplos de sistemas de anéis cicloalquilo refere-se os seleccionados entre ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, ciclooctilo, ciclodecilo, ciclododecilo e adamantilo.

Os termos "halogéneo" ou "halo" designam átomos de flúor, cloro, bromo e iodo. 0 termo "heterociclo" ou "heterocíclico" designa um sistema de anéis aromático ou não aromático, totalmente saturado ou insaturado, facultativamente substituído, por exemplo, pode ser um sistema de anéis monocíclico possuindo entre 4 e 7 lados, biciclico possuindo entre 7 e 11 lados ou tricíclico possuindo entre 10 e 15 lados, o qual possui pelo menos um heteroátomo pelo menos num anel que contenha um átomo de carbono. O termo "heteroarilo" designa um grupo heterocíclico em que o sistema de anéis é arilo. Cada anel do grupo heterocíclico contendo um heteroátomo pode ter 1, 2 ou 3 heteroátomos seleccionados entre N, O e S, em que os átomos N e S podem ser facultativamente oxidados e o átomo N pode ser facultativamente quaternizado.

Como exemplos de sistemas de anéis heterocíclicos monocíclicos refere-se os seleccionados entre pirrolidinilo, pirrolilo, indolilo, pirazolilo, oxetanilo, pirazolinilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, oxazolilo, 10 oxazolidinilo, isoxazolinilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolidinilo, furilo, tetra-hidrofurilo, tienilo, oxadiazolilo, piperidinilo, piperazinilo, 2-oxopiperazinilo, 2--oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, 2-oxazepinilo, azepinilo, 4-piperidonilo, piridinilo, N-oxo-piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, tetra-hidropiranilo, tetra-hidrotiopiranilo, tetra-hidrotiopiranil-sulfona, morfolinilo, tiomorfolinilo, tiomorfolinil-sulfóxido, tiomorfolinil-sulfona, 1,3-dioxolano e tetra-hidro-1,1--dioxotienilo, dioxanilo, isotiazolidinilo, tietanilo, tiiranilo, triazinilo e triazolilo. Os grupos heterociclicos preferenciais são os seleccionados entre piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirroilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tienilo, furanilo, quinolinilo e isoquinolinilo. A expressão "sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" designa um sal de um composto adequado para formulação farmacêutica. Os sais adequados, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, compreendem os sais de adição de ácidos que podem ser obtidos, por exemplo, misturando uma solução de um composto com uma solução de um ácido aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, por exemplo, seleccionado entre ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido benzóico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fosfórico e ácido carbónico. Se um composto suportar um ou vários radicais acídicos, os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico podem ser obtidos tratando uma solução do composto com uma solução de uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, por exemplo, seleccionada entre hidróxido de lítio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de tetra-alquil-amónio, carbonato de 11 litio, carbonato de sódio, carbonato de sódio, amónia e alquilaminas.

Se um grupo se caracterizar por ser substituído (por exemplo, "alquilo substituído", "alcenilo substituído", etc.), tal grupo pode ter um ou vários substituintes seleccionados independentemente, de preferência entre um e cinco e mais preferencialmente um ou dois. Subentende-se que os substituintes e os padrões de substituição podem ser escolhidos por qualquer especialista na matéria para obter compostos que sejam quimicamente estáveis e que possam ser sintetizados por técnicas conhecidas na especialidade e também pelos métodos aqui explicitados. Como exemplos de substituintes adequados refere-se os seleccionados entre alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, halogéneo, trifluorometoxi, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi, cicloalquiloxi, heterociclo-oxi, alcanoílo, alcanoiloxi, amino, amónio alquilamino quaternário, aralquilamino, cicloalquilamino, heterocicloamino, dialquilamino, alcanoilamino, tio, alquiltio, cicloalquiltio, heterociclotio, ureído, nitro, ciano, carboxi, carboxilalquilo, carbamilo, alcoxicarbonilo, alquiltiono, ariltiono, alquilsulfonilo, sulfonamido e ariloxi, para além daqueles aqui especificados. 0 substituinte ainda pode ser substituído, por exemplo, por átomos de halogéneo ou grupos hidroxi, alquilo, alcoxi, arilo, arilo substituído, alquilo substituído e aralquilo substituído. A não ser que sejam indicados especificamente estereoisómeros particulares (v.g., por uma ligação a negrito ou a traço interrompido num estereocentro relevante numa fórmula estrutural), considera-se incorporados no âmbito da invenção todos os estereoisómeros, tanto os compostos purificados como as suas misturas. Salvo quando especificado de outro modo, estão abrangidos pela presente invenção todos os enantiómeros, diastereómeros, isómeros geométricos individuais e suas combinações e misturas. As 12 formas cristalinas polimórficas e os solvatos também estão abrangidos no âmbito da presente invenção. É possível preparar pró-fármacos dos compostos da presente invenção. Tais pró-fármacos são, em geral, derivados funcionais dos compostos que são facilmente convertíveis in vivo no composto pretendido. Os procedimentos convencionais para a selecção e preparação dos derivados de pró-fármacos adequados estão descritos, por exemplo, na obra "Design of Prodrugs", Bundgaard, ed., Elsevier, 1985.

Compostos e Métodos

De acordo com uma variante, a invenção proporciona compostos que possuem a fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa um grupo alquilo (C1-C10) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C10) substituído ou não substituído, um grupo alcinilo (C2-C10) substituído ou não substituído, um grupo arilo substituído ou não substituído ou um grupo heterocíclico substituído ou não substituído; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou um grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam um grupo 0-0(=0)-0, com a condição de no caso de o símbolo R1 representar o grupo etilo e o símbolo R3 representar o grupo OH ou os radicais R3 e R4 considerados em conjunto formarem um grupo 0-0(=0)-0, então o símbolo R2 não representa nem o átomo de hidrogénio nem o grupo metilo.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa um grupo alquilo(C1-C5) substituído ou não substituído; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C5) substituído ou não 13 substituído, um grupo alcenilo (C2-C5) substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo (C2-C5) substituído ou não substituído; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam um grupo 0-0(=0)-0, com a condição de no caso de (a) o símbolo R1 representar o grupo etilo e (b) o símbolo R3 representar o grupo OH ou os radicais R3 e R4 considerados em conjunto formarem o grupo 0-0(=0)-0, então o símbolo R não representa o átomo de hidrogénio nem o grupo metilo.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos que possuem a fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa o grupo etilo; o símbolo R2 representa um grupo alquilo(C2-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo(C2-C5) substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo(C2-C5) substituído ou não substituído; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa o grupo etilo; o símbolo R2 representa um grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R representa o grupo etilo substituído; o símbolo R representa o átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2_Cs) substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo (C2_Cs) 14 substituído ou não substituído; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa o grupo fluoroetilo ou azidoetilo; o símbolo R2 representa um grupo etilo, um grupo alquilo (C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C5) substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo (C2-C5) substituído ou não substituído; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa o grupo etilo substituído; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou um grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa o grupo fluoroetilo ou azidoetilo; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou um grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa o grupo propilo; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio, um grupo alquilo(C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C5) 15 substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo (C2-C5) substituído ou não substituído; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R representa o grupo propilo; o símbolo R representa o átomo de hidrogénio ou um grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa o grupo vinilo, butilo, benzilo, but-3--en-l-ilo, fenilo ou 4-hidroxifenilo; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio, um grupo alquilo(C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C5) substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo (C2-C5) substituído ou não substituído; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que o símbolo R1 representa o grupo vinilo, butilo, benzilo, but-3--en-l-ilo, fenilo ou 4-hidroxifenilo; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou um grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou então os radicais R3 e R4 considerados conjuntamente formam o grupo 0-0(=0)-0.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos de fórmula estrutural (I) em que os 16 símbolos R3 e R4 representam independentemente o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, o símbolo R1 representa um grupo seleccionado entre etilo, 2-fluoroetilo e 1-propilo; e o símbolo R2 representa um grupo seleccionado entre metilo, etilo, isopropilo e 2-butilo; com a condição de no caso de o de o símbolo R1 representar o grupo etilo e o símbolo R3 representar o grupo OH, então o símbolo R2 não representa ao grupo metilo.

De acordo com uma outra variante, o símbolo R1 representa um grupo alquilo(C1-C5) substituído ou não substituído (de preferência etilo), o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH.

De acordo com uma outra variante da invenção, esta proporciona compostos que possuem as fórmulas estruturais seguintes.

OH

17 A invenção descreve também métodos para a preparação dos compostos de fórmula estrutural (I). De acordo com uma variante, os compostos de fórmula estrutural (I) são preparados a partir das correspondentes eritromicinas de fórmula estrutural (II), conforme ilustrado no esquema I.

17 O OH

ESQUEMA. 1

De acordo com esta variante, trata-se a eritromicina (II) com uma solução de boro-hidreto de sódio em metanol para se obter (9S)-9-hidroeritromicina, (III). 0 composto (III) é desmetilado, por exemplo, utilizando iodo e luz numa solução de metanol tamponada ou utilizando uma solução de N-iodo-succinimida em acetonitrilo, para se obter o composto (IV) . A alquilação do composto (IV) utilizando R2X, em que o símbolo R2 possui as significações definidas 18 antes e o símbolo X representa um átomo de halogéneo, de preferência bromo ou iodo, ou um sulfonato, de preferência triflato ou tosilato, na presença de uma base, tal como a N,N-diisopropiletilamina, proporciona os compostos de fórmula estrutural (I).

Em alternativa, a sequência dos passos de desmetilação/ /alquilação e o passo de redução com boro-hidreto podem ser invertidos, conforme ilustrado no esquema IA:

ESQUEMA AI

N -------!► V' í j

De acordo com uma outra variante da invenção, as eritromicinas (II) em que os radicais RJ e R4 considerados em conjunto formam o grupo 0-C(=0)-0 são preparadas conforme ilustrado no esquema 2. 19 ESQUEMA 2 19

A reacção da eritromicina (II), em que os símbolos R3 e R4 representam ambos o grupo OH, com um reagente de carbonilação, por exemplo, carbonato de etileno ou 1,1--carbonildiimidazol, na presença de uma base, por exemplo, carbonato de potássio ou 4-(dimetilamino)-piridina, proporciona o carbonato cíclico em 11,12. Os carbonatos cíclicos são convertidos depois nos produtos finais, de acordo com o método ilustrado no esquema 1.

As eritromicinas de fórmula estrutural (II) são preparadas conforme ilustrado no esquema 3 e estão descritas das patentes de invenção norte-americanas n°s 6 066 721, 6 261 816 e 6 395 710. 20 ESQUEMA. 3

Dito de forma abreviada, recorre-se a um tioéster dicetido de fórmula estrutural (V) que é fornecido a uma policetido-sintase (PKS) para ser produzido um policetido de fórmula estrutural (VI) . A preparação dos tioésteres dicetidos está descrita no documento WO 00/44717. Na presente invenção, a policetido-sintase é 6-desoxieritronolido-B--sintase ou uma 8,8a-desoxioleandolido-sintase. Há exemplos adequados de β-desoxieritronolido-B-sintase, por exemplo, em Saccharopolyspora erythraea, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 824 513, e em Micromonospora megalomicea, conforme descrito no documento WO 01/27284. Há um exemplo de 8,8a-desoxioleandolido-sintase que se encontra em Streptomyces antibioticus, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 6 251 636. Estas policetido--sintases são modificadas para impedir a incorporação das suas unidades iniciadoras naturais. Os métodos para mutacionar as policetido-sintases de modo a impedir a incorporação das unidades iniciadoras naturais, por exemplo, 21 por inactivação do módulo 1-cetossintase, estão descritos na patente de invenção norte-americana n° 6 066 721.

Embora o tioéster dicetido (V) possa ser fornecido a uma forma da policetido-sintase sem células, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 65 080 555, é mais conveniente introduzir o composto (V) numa cultura de um organismo em que haja expressão da policetido-sintase mutacionada. O organismo pode ser seleccionado entre actinomicetes, tais como Streptomyces ou Saccharopolyspora, de preferência Streptomyces coelicolor, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 6 066 721 e na publicação da PCT com o número WO 01/83803, ou pode ser diferente de actinomicetes, por exemplo, Escherichia coli ou Saccharomyces cerevesiae, conforme descrito no documento WO 01/31035. O policetido resultante (VI) é isolado facultativamente para ser separado do meio de cultura. No exemplo 1 subsequente descreve-se minuciosamente o método para a realização deste processo. Utilizando as policetido-sintases naturais são produzidos policetidos em que o símbolo R =OH.

De acordo com um método, a policetido-sintase natural foi mutacionada de modo a produzir um policetido em que R3=H. Os métodos para produção de policetido-sintases mutacionadas adequadas estão descritos, por exemplo, nas patentes de invenção norte-americanas n°s 6 391 594 e 6 403 775. O policetido (VI) é convertido numa eritromicina (II) mediante um conjunto de passos de transformação progressiva que compreendem a hidroxilação em C_6, a adição de micarose em 3-OH, a adição de desosamina em 5-OH, a hidroxilação em C-12 e a metilação em 3"-OH da micarose. Há outras formas de eritromicina que podem ser produzidas recorrendo ao subconjunto adequado de enzimas de transformação progressiva. Por exemplo, a eritromicina B (R4=H) é preparada omitindo a hidroxilação em C-12.

Esta transformação progressiva é efectuada muito convenientemente fornecendo o policetido (VI) a uma cultura 22 de um organismo em que tenha lugar a expressão de todas as enzimas necessárias para as transformações, por exemplo, um mutante de Saccharopolyspora erythraea, que possua uma policetido-sintase inactiva, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 6 395 710. No exemplo 2 subsequente descreve-se minuciosamente um método para a execução deste processo.

Os compostos de fórmula geral (I) são agonistas do receptor da motilina. O quadro 1 agrupa os valores CE50 para activação do receptor da motilina, conforme medido por meio de uma experiência de influxo de cálcio, tal como descrito por Carreras, et al., Anal. Biochem. 300, 146-151 (2002).

Quadro 1

Activação dos receptores de motilina

Composto de Ref. R1 R2 R3 R4 CE50 (μΜ) Eritromicina A 1 CH3CH2 CH3 OH OH 1,1 A 1 CH3CH2 ch3 OH OH 2,5 B CH3CH2 CH(CH3)2 OH OH 0,49 C FCH2CH2 ch3 OH OH 5 D FCH2CH2 CH2CH3 OH OH 2 E FCH2CH2 CH(CH3)2 OH OH 0,52 F CH3CH2CH2 ch3 OH OH 8,6 G CH3CH2CH2 CH(CH3)2 OH OH 1,4 H CH3CH2CH2 C(CH3)CH2 ch3 OH OH 3,3 J CH3CH2 CH(CH3)2 H H 0,16 1 Composto comparativo, não abrangido pela presente invenção

Determinou-se a actividade antibacteriana (quadro 2) efectuando ensaios de susceptibilidade in vitro em presença de Streptococcus pneumoniae ATCC 6301, que é uma estirpe sensivel aos macrólidos, recorrendo a métodos conhecidos na especialidade de microbiologia.

Quadro 2 Concentrações Minimas Inibidoras in vitro contra ATCC 6301

Composto CIM(pg/mL) 23 23 Eritromicina A 0,03 A 0,3 F 1 G >100 J >100

Os compostos foram testados para se avaliar a dessensibilização dos receptores da motilina, recorrendo ao ensaio de base celular descrito por Carreras et ai., US 2002/0192709 AI (2002), "Methods for Evaluating Efficacy". Conforme ilustrado no quadro 3 subsequente, os compostos revelaram fraca ou mesmo nenhuma dessensibilização após a exposição a concentrações de 1 ou 10 μΜ de cada composto testado.

Quadro 3 Dessensibilização dos receptores de motilina Composto Actividade após a exposição ao composto (% retida da actividade original) Composto (1 μΜ) Composto (10 μΜ) F 100 100 G 100 lOÔ J 88 88

De acordo com um outro dos seus aspectos, a presente invenção prevê a utilização de compostos de fórmula estrutural (I) para a preparação de um medicamento para o tratamento da motilidade gástrica debilitada. Em geral, a utilização dos compostos da presente invenção consiste em administrar a um paciente que disso necessite uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção. Como exemplos ilustrativos de patologias que podem ser tratadas com os compostos da invenção refere-se as seleccionadas entre gastroparesia, refluxo gastroesofágico, anorexia, estasia da vesícula biliar, ílio paralítico pós-operatório, escleroderma, pseudo-obstrução intestinal, gastrite, emese e obstipação crónica (inércia do cólon). A quantidade terapeuticamente eficaz pode ser expressa em termos de dose diária total do composto ou compostos da presente invenção e pode ser administrada a um paciente de uma só vez ou em doses divididas. A dose diária total pode corresponder, por exemplo, a quantidades compreendidas entre cerca de 0,01 e cerca de 10 mg/kg de massa corporal, ou mais vulgarmente entre cerca de 0,1 e cerca de 2 mg/kg de massa corporal. As composições das doses singulares podem conter quantidades ou submúltiplos dessas quantidades que correspondam à dose diária. Em geral, os regimes de tratamento de acordo com a presente invenção consistem em administrar a um paciente que necessite de tais tratamentos uma quantidade compreendida entre cerca de 10 mg e cerca de 100 mg dos compostos da presente invenção por dia em doses singulares ou múltiplas.

De um modo típico, o composto da presente invenção irá fazer parte de uma composição ou preparação farmacêutica que pode assumir qualquer forma conveniente, por exemplo, no estado sólido, semi-sólido ou líquido. Em geral, a preparação farmacêutica irá conter um ou vários compostos da invenção enquanto ingredientes activos e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. De um modo típico, o ingrediente activo está misturado com um veiculo ou excipiente orgânico ou inorgânico adequado para aplicação externa, entérica ou parentérica. O ingrediente activo pode ser misturado, por exemplo, com os veículos não tóxicos, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, para a preparação de comprimidos, grânulos, cápsulas, supositórios, pessários, soluções, emulsões, suspensões e quaisquer outras formas adequadas para utilização. As formas de dosagem oral podem ser preparadas essencialmente conforme descrito por Hondo et al., 1987, "Transplantation Proceedings XIX", Supp. 6: 17-22.

Os veículos utilizáveis são seleccionados entre água, glicose, lactose, goma de acácia, gelatina, manitol, pasta de 25 amido, trissilicato de magnésio, talco, amido de milho, ceratina, silica coloidal, amido de batata, ureia e outros veículos convenientes para utilização no fabrico de preparações no estado sólido, semi-sólido ou líquido. Além disso, é possível utilizar agentes auxiliares de estabilização, espessamento e corantes e também perfumes. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser utilizados com hidroxipropil-metil-celulose, essencialmente conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 916 138, ou com um agente tensioactivo, essencialmente conforme descrito na patente de invenção EPO publicada com o n° 428 169.

Dito abreviadamente, a presente invenção proporciona compostos motilidos e a sua utilização, sendo ilustrada a seguir por meio de exemplos.

Exemplo 1

Este exemplo descreve a preparação de 15-metil-6--desoxieritronolido B (também designado por 13-propil-6-dEB ou 15-metil-6-dEB) que é um intermediário que serve para sintetizar determinados compostos da presente invenção. (Há outros eritronolidos que são designados de maneira análoga; por exemplo, o eritronolido com um átomo de flúor em vez de um grupo metilo na posição 15 recebe a designação de 15--flúor-6-dEB).

15-metil-6-desoxieritronolido B

Descongelou-se um frasco de 1 mL contendo CH999/pJRJ2 (Streptomyces coelicolor que contém uma PKS cujo domínio cetossintase do módulo 1 havia sido inactivado por mutação) proveniente de um banco de células de trabalho, tendo o 26 conteúdo do frasco sido acrescentado a 50 mL de Meio 1 num balão de centrifugação de 250 mL. O Meio 1 é constituído por amido de milho na concentração de 45 g/L; licor de infusão de milho na concentração de 210 g/L; levedura de cerveja inactivada e anidra na concentração de 10 g/L; e CaCCt na concentração de 1 g/L. Esterilizou-se esta solução mediante tratamento em autoclave durante 90 minutos a 121°C. Após a esterilização, acrescentou-se, antes da utilização, tiostreptona esterilizada e filtrada à razão de 50 mg/mL em DMSO a 100%, na concentração de 1 mL/L, e uma emulsão de silício B anti-espumante a 100% tratado em autoclave, na concentração de 1 mL/L (J.T. Baker).

Colocou-se o balão que continha as células descongeladas e o Meio 1 num aparelho de incubação/agitação mantido a 30±1°C e manteve-se a centrifugar a 175±25 r.p.m. durante 48±10 horas. Depois acrescentou-se a cultura de 50 mL a um balão de centrifugação de 2,8 L que continha 500 mL de cultura e depois utilizou-se para inocular uma fermentadora de 10 L contendo 5 L de Meio 1. Manteve-se a fermentadora regulada para uma temperatura de 30°C e a pH 6,5 por adição de H2SO4 2,5 N e NaOH 2,5 N com um regime de agitação de 600 r.p.m. e com um caudal de ar de 1-2 litros por minuto (L.p.m.). A regulação de espuma foi feita por adição de uma solução a 50% de anti-espumante B, conforme necessário. Deixou-se a cultura da fermentadora crescer nestas condições durante 24±5 horas.

Preparou-se uma fermentadora de 150 L esterilizando 100 L de Meio 1 a 121 °C durante 45 minutos. No final do período de crescimento, acrescentou-se, de forma asséptica, o conteúdo da fermentadora de 10 L a uma fermentadora de 150 L. Regulou-se a fermentadora para uma temperatura de 30°C e a pH 6,5 por adição de H2S04 2,5 N e NaOH 2,5 N, com oxigénio dissolvido por saturação com ar k 80% e com um regime de agitação entre 500-700 r.p.m., com um caudal de ar de 10-50 L.p.m. e/ou com uma regulação da contrapressão 27 para 0,1-0,4 bar. A regulação de espuma foi feita por adição de uma solução a 50% de anti-espumante B, conforme necessário.

Decorridas 35±5 horas, depois de o oxigénio dissolvido ter atingido um valor minimo e o teor em CO2 no gás proveniente da fermentadora ter atingido o valor máximo, acrescenta-se (±)-(2R*, 35*)-2-metil-3-hidroxi-hexanoil-N- -propionil-cisteamina (propil-dicetido) até se obter uma concentração final de 4 g/L. Prepara-se o propil-dicetido mediante dissolução em metil-sulfóxido à razão de 2:3 (entre o dicetido e DMSO) e depois esteriliza-se por filtração (filtro de nylon de 0,2 ym) . A produção de 15--metil-6-desoxieritronolido B (13-propil-6-dEB) cessa ao 8o dia e retira-se o produto da fermentadora. Faz-se a centrifugação do caldo de fermentação a 20500 g numa centrifugadora de modelo Alpha Lavai AS-26. O produto encontra-se predominantemente no sobrenadante; deita-se fora a massa celular centrifugada.

Após a centrifugação, efectua-se a extracção em fase sólida utilizando resina HP20 (Mitsubishi). O tamanho da coluna é escolhido com base no volume e titulação do sobrenadante, de modo a que não seja excedida a capacidade de carga de 15 g de 15-metil-6-dEB por cada litro de resina HP20. Faz-se passar o caldo centrifugado através do leito de resina com uma velocidade do caudal de 300120 cm/h. A pressão na coluna não deve exceder 15 psi. A seguir lava-se a resina com água numa quantidade igual a 2 volumes da coluna (VC) e depois com 2 VC de metanol a 30%, em qualquer dos casos com uma corrente de 300120 cm/h. Durante a eluição são recolhidas fracções de 1 VC. As fracções são depois analisadas e aquelas em que há produto são combinadas para se obter uma massa de produto contendo >95% do 15-metil-6-dEB original no caldo centrifugado. Esta massa de produto é reduzida a sólidos recorrendo a evaporação rotativa. Nesta fase a pureza do produto é de 5-35%. Remove-se 28 da massa do produto o material insolúvel em metanol, colocando em suspensão os sólidos em 3 L de metanol a 100%, por cada 100 L de volume do caldo original, misturando durante 20 minutos e filtrando. O passo de purificação final é uma operação de cromatografia utilizando a resina HP20SS (Mitsubishi). Escolhe-se o tamanho da coluna com base na quantidade de produto, de modo a que não seja excedida a capacidade de carga de 15 g de 15-metil-6-dEB por cada litro de resina HP20SS. A solução de metanol filtrada é diluida mediante a adição de igual volume de água. Faz-se passar a solução de metanol a 50% através do leito de resina com uma velocidade do caudal de 300120 cm/h. Depois lava-se a coluna com 2 VC de metanol a 50% com uma velocidade do caudal de 300120 cm/h. A eluição do produto é feita utilizando 12 VC de metanol a 70% com um caudal corrente de 300120 cm/h. Durante a eluição são recolhidas fracções de 1 VC. As fracções são depois analisadas e aquelas em que há >50 mg/L de 15-metil-6-dEB e que apresentam >20% de pureza cromatográfica são então combinadas. A massa de produto é reduzida a sólidos recorrendo a evaporação rotativa. A pureza do produto nesta fase é >65% e é adequada para bioconversão para se obter a eritromicina adequada. São preparados outros análogos modificados de 6-dEB recorrendo ao mesmo processo, utilizando o tioéster dicetido adequado em vez do propil-dicetido. Deste modo, prepara-se 15-flúor-6-dEB utilizando (1)-(2R*, 3S*)-5-flúor--2-metil-3-hidroxi-pentanoí1-N-propionil-cisteamina. Além do mais, as sínteses de 15-metil-6-dEB e 15-flúor-6-dEB estão explicadas por Ashley et al., no documento WO 00/44717 A2 (2002), cujo conteúdo se considera aqui incorporado por referência. 29

Exemplo 2

Este exemplo descreve a conversão de 15-metil-6--desoxieritronolido B em 15-metil-eritromicina A (fórmula estrutural II, R1 = -CH2CH2CH3; R3 = R4 = OH) . As técnicas de conversão também estão explicadas por Carreras et al., em J. Biotechnology, 92, 217-228 (2002).

Descongela-se um frasco de 1 mL proveniente do banco de células experimentais K39-14V (um mutante eryA de S. erythraea que não consegue produzir 6-dEB) e acrescenta-se o conteúdo do frasco a 50 mL de Meio 2 num balão de 250 mL com separador. O Meio 2 é constituido por amido de milho na concentração de 16 g/L, dextrina de milho na concentração de 10 g/L, farinha de soja na concentração de 15 g/L, CaC03 na concentração de 4 g/L; licor de infusão de milho na concentração de 5 g/L, óleo de soja na concentração de 6 g/L, NaCl na concentração de 2,5 g/L e (NH4)2S04 na concentração de 1 g/L. Esta solução é esterilizada mediante tratamento em autoclave durante 60 minutos a 121°C, acrescentando-se antes da sua utilização uma emulsão de anti-espumante B de silício (J.T. Baker) tratada em autoclave e com uma concentração de 1 mL/L. O balão contendo as células descongeladas e o Meio 2 é colocado num aparelho de incubação/agitação e é mantido a 34±1°C e a 175±25 r.p.m. durante 48±10 horas. A cultura de 50 mL é depois acrescentada a um balão de centrifugação 2,8 L contendo 500 mL de Meio 2. Mantém-se o balão a incubar num aparelho de incubação/agitação a 3411°C e a 175125 r.p.m. durante 48110 horas. A cultura de 500 mL é depois utilizada para inocular uma fermentadora de 10 L contendo 5 L de Meio 2. Regula-se a temperatura da fermentadora para 34°C e a pH 7,0 mediante a adição de H2S04 2,5 N e NaOH 2,5 N, com um regime de agitação de 600 r.p.m. e com um caudal de ar de 1-2 L.p.m. . Regula-se a espuma mediante a adição de uma solução a 50% de anti-espumante B, conforme necessário. Deixa-se a cultura da 30 fermentadora desenvolver-se nestas condições durante 24±5 horas.

Prepara-se uma fermentadora de 150 L esterilizando 100 L de Meio 3 a 121 °C durante 45 minutos. O Meio 3 é constituido por amido de milho na concentração de 17,5 g/L; dextrina de milho na concentração de 16 g/L, farinha de soja na concentração de 16,5 g/L, CaCC>3 na concentração de 4 g/L; licor de infusão de milho na concentração de 6 g/L, óleo de soja na concentração de 3 g/L, NaCl na concentração de 3,5 g/L e (NH4)2S04 na concentração de 1 g/L. Após o periodo de desenvolvimento, transfere-se, de maneira asséptica, os conteúdos da fermentadora de 10 L para a fermentadora de 150 L. Regula-se a fermentadora para uma temperatura de 34°C e a pH 7,0 mediante a adição de H2SO4 2,5 N e NaOH 2,5 N, com oxigénio dissolvido ^80% por saturação com ar com um regime de agitação de 500-700 r.p.m., com um caudal de ar de 15-50 L.p.m. e/ou regulação da contrapressão para 0,1-0,4 bar. Regula-se a espuma mediante a adição de uma solução a 50% de anti-espumante B, conforme necessário.

Decorridas 2415 horas tem inicio o fornecimento de dextrina a 15% (p/v) com um caudal de 58-60 mL/h. A solução de dextrina é misturada continuamente durante o periodo de fornecimento. Decorridas 2415 horas acrescenta-se à fermentadora 25 g de 13-propil-6dEB. A substância 13-propil-6dEB é preparada dissolvendo 25 g de 13-propil-6dEB em 400-600 mL de etanol a 100% e filtrando depois (filtro de nylon de 0,2 pm) . A conversão de 13-propil-6dEB em 13-propil-eritromicina A cessa decorridas 60110 horas e depois recolhe-se o produto da fermentadora. Faz-se a centrifugação do caldo de fermentação a 20500 g numa centrifugadora de modelo Alpha Lavai AS-26. O produto encontra-se predominantemente no sobrenadante; deita-se fora a massa de células centrifugadas.

Após a centrifugação realiza-se a extracção em fase sólida, utilizando resina HP20 (Mitsubishi). O tamanho da 31 coluna é escolhido com base no volume e titulação do sobrenadante, de modo a que não seja excedida a capacidade de carga de 15 g de 15-metil-eritromicina A por cada litro de resina HP20. Ajusta-se o caldo centrifugado para pH 9,0 e faz-se passar através do leito de resina com uma velocidade do caudal de 275125 cm/h. A pressão na coluna não deve exceder 15 psi. A seguir lava-se a resina com água numa quantidade igual a 1 volume da coluna (VC) com uma velocidade do caudal de 275125 cm/h. A eluição do produto é feita utilizando 5 VC de metanol a 100% com uma velocidade do caudal de 275125 cm/h. Durante a eluição são recolhidas fracções de 1 VC. As fracções são depois analisadas e aquelas em que há produto são combinadas para se obter uma massa de produto. Esta massa de produto é reduzida a sólidos recorrendo a evaporação rotativa.

Remove-se da massa do produto o material insolúvel em metanol, colocando os sólidos em suspensão em 1 L de metanol a 100%, por cada 100 L de volume de caldo original, fazendo o ajustamento para pH 9,0 e filtrando. A massa de produto (filtrado) é reduzida a sólidos recorrendo a evaporação rotativa.

Extrai-se da massa de produto (sólidos) a substância 15-metil-eritromicina A mediante a adição de 2 L de uma mistura de hexano:acetona à razão de 4:1 por cada 100 L de volume do caldo original, misturando durante 20 minutos e filtrando. Os sólidos restantes são extraídos mais duas vezes da mesma maneira, sendo combinado os filtrados. A massa de produto é reduzida a sólidos recorrendo a evaporação rotativa. O passo de purificação final é uma operação de cromatografia utilizando a resina HP20SS (Mitsubishi). Escolhe-se o tamanho da coluna com base na quantidade de produto, de modo a que não seja excedida a capacidade de carga de 15 g de 15-metil-eritromicina A por cada litro de resina HP20SS. Os sólidos dos passos anteriores são 32 dissolvidos em 1 L de metanol por cada 100 L de volume do caldo original e acrescenta-se igual volume de água. Faz-se passar uma solução de metanol a 50% através do leito de resina com uma velocidade do caudal de 275125 cm/h. A seguir lava-se a coluna com 1 VC de metanol a 50% e depois com 3 VC de metanol a 60%, em qualquer dos casos com uma velocidade do caudal de 275125 cm/h. A eluição do produto é feita utilizando 3 VC de metanol a 70% e depois 10 VC de metanol a 75%, em qualquer dos casos com uma velocidade do caudal de 275125 cm/h. Durante a eluição são recolhidas fracções de 1 VC. As fracções são depois analisadas e aquelas em que há 15-metil-eritromicina A são combinadas. A massa de produto é reduzida a sólidos recorrendo a evaporação rotativa.

Faz-se a preparação de outras eritromicinas modificadas utilizando o mesmo processo e utilizando o análogo de 6-dEB adequado em vez de 15-metil-6-dEB. Assim, prepara-se 15--fluoroeritromicina A utilizando 15-flúor-6-dEB.

Exemplo 3

Este exemplo descreve um método geral para a preparação de (9S)-9-di-hidroeritromicinas (fórmula estrutural II), tomando como referência o Esquema 1.

Utiliza-se uma solução de eritromicina (0,36 mmol) em etanol/éter à razão de 1:3 (20 mL) que é arrefecida para -15°C e tratada com boro-hidreto de sódio (0,9 mmol). Deixa-se a mistura de reacção aquecer lentamente até à temperatura ambiente durante 4 horas. Destrói-se o excesso de boro-hidreto por adição de tampão fosfato a pH 6 e a seguir junta-se 10 mL de trietanolamina. Decorrida 1 hora, extrai-se a mistura com acetato de etilo, seca-se sobre MgS04, filtra-se e concentra--se até à secura, sob pressão reduzida. Purifica-se o produto por cromatografia em gel de silica, utilizando acetona:hexanos à razão de 1:1, contendo trietilamina a 1%. Utilizando este processo foram preparados os compostos a seguir indicados: 33 (9S)-9-di-hidroeritromicina A; (9S)-9-di-hidro-15-metileritromicina A; (95)-9-di-hidro-15-fluoroeritromicina A.

Exemplo 4

Este exemplo descreve um processo geral para a preparação de N-desmetil-(9S)-9-di-hidroeritromicinas (fórmula estrutural III), tomando como referência o Esquema 1.

Acrescenta-se tri-hidrato de acetato de sódio (139 mg) e iodo (52 mg) sequencialmente a uma solução da (95)-9-di--hidroeritromicina A (150 mg) em 10 mL de metanol: água à razão de 8:2. Acrescenta-se uma solução de LiOH 0,2 Μ (1 mL) em quatro porções, ao longo de 1 hora. Determina-se o momento em que a reacção está completa por análise cromatográfica de camada fina. Os reagentes em excesso são extintos por adição de uma solução saturada de tiossulfato de sódio e as substâncias voláteis são removidas sob pressão reduzida, sendo depois a mistura extraida com acetato de etilo. Lava-se a fase orgânica com uma solução saturada de NHCO3, seca-se sobre Na2S04, filtra-se e concentra-se para se obter o produto impuro. A cromato-grafia sobre gel de silica (acetona/hexanos + Et3N a 2%) proporciona o produto puro. Utilizando este processo foram preparados os compostos seguintes: N-desmetil-(9S)-9-di-hidroeritromicina A; N-desmetil-(9S)-9-di-hidro-15-metileritromicina A; N-desmetil-(9S)-9-di-hidro-15-fluoroeritromicina A.

Exemplo 5

Este exemplo descreve a preparação de N-desmetil-N-R2--(9S)-9-di-hidroeritromicinas, tomando como particular referência o Esquema 1, que são compostos de fórmula estrutural II (R3 = R4 = OH).

Utiliza-se uma mistura do análogo de N-desmetil-(95)-9--di-hidroeritromicina A (0,035 mmol), diisopropiletilamina 34 (62,5 yL) , R2I (1,3 mmol) e acetonitrilo (1 mL) , estan-quemente fechada e agitada a 70°C de um dia para o outro. Deixa-se a mistura arrefecer, dilui-se com uma solução aquosa de NaHCCt e extrai-se com acetato de etilo. Efectua-se a secagem do extracto sobre MgS04, filtra-se e evapora-se até à secura. Purifica-se o produto por cromatografia em gel de silica, utilizando hexanos/acetona a 2:1 + Et3N a 1%. De acordo com este processo foram preparados os compostos seguintes: (a) N-desmetil-N-etil-(9S)-9-di-hidro-15-fluoroeritromicina A, utilizando N-desmetil-(9S)-9-di-hidro-15-fluoroeritromicina A e iodeto de etilo; (b) N-desmetil-N-isopropil-(9S)-9-di-hidro-15-fluoroeritromicina A, utilizando N-desmetil-(9S)-9-di-hidro-15-fluoroeritromicina A e iodeto de isopropilo; (c) N-desmetil-N-isopropil-(9S)-9-di-hidro-15-metileritromicina A, utilizando N-desmetil-(9S)-9-di-hidro-15-metileritromicina A e iodeto de isopropilo; (d) N-desmetil-N-(2-butil)-(9S)-9-di-hidro-15-metileritromicina A, utilizando N-desmetil-(9S)-9-di-hidro-15-metileritromicina A e 2-iodobutano;

Exemplo 6

Este exemplo ilustra o passo de desmetilação do Esquema IA, com referência específica para a N-desmetil-15-metileritromicina A (compostos III'; R1 = 1-propilo; R3 = R4 = OH), embora se subentenda que este processo é genericamente aplicável aos outros compostos análogos.

Utiliza-se uma mistura de 15-metileritromicina A (composto III; R1 = 1-propilo; R3 = R4 = OH; 5,00 g, 6,15 mmol) e de tri-hidrato do acetato de sódio (4,18 g, 30,75 mmol) em metanol: água (8:2 V/V, 100 mL) agitada a 50°C. Depois acrescenta-se iodo (1,56 g, 6,15 mmol). Durante a reacção acrescenta-se hidróxido de sódio IN (6,15 mL) em pequenas porções. Determina-se o momento em que a reacção está 35 completa por análise cromatográfica de camada fina. Após a remoção do solvente, extrai-se a mistura três vezes com acetato de etilo e seca-se sobre sulfato de sódio. Obtém-se um produto impuro (4,97 g) com o aspecto de um sólido amarelo que foi utilizado no passo subsequente sem nenhuma purificação adicional.

Exemplo 7

Este exemplo ilustra o passo de alquilação do Esquema IA, com referência especifica para a N-desmetil-N-isopropil-15-metileritromicina A (composto IV, R1 = 1-propilo, R2 = isopropilo; R3 = R4 = OH) , embora se subentenda que o processo é genericamente aplicável a outros compostos análogos.

Utiliza-se uma mistura de N-desmetil-15-metileritromicina A impura, proveniente do exemplo anterior (2,50 g, 3,41 mmol), diisopropiletilamina (6,1 mL, 10 equivalentes), 2-iodopropano (10,2 mL, 30 equivalentes) em acetonitrilo (50 mL) aquecida em banho-maria a 70°C durante 24 horas. Acrescenta-se água e uma solução saturada de bicarbonato de sódio. Extrai-se a solução três vezes com acetato de etilo e seca-se sobre sulfato de magnésio. Purifica-se o produto impuro por cromatografia em coluna de gel de silica (hexano:acetona 3:1, trietilamina a 1%) para se obter N-desmetil-N-isopropil-15--metileritromicina A pura (1,80 g, rendimento de 75% nos dois passos). m/z: 777, 0 (MH) ; 13C- -NMR (CDC13) : 221,86, 175,62 103,11, 96,15, 83,30, 79, 85, 78,01, 75,10, 74,90, 74,59 72,58, 70,35, 68,91, 68,75, 65,48, 62,79, 52,49, 49,47 45,12, 44,76, 39,32, 38,43, 37,85, 34,96, 33, 06, 30,76 30,19, 26, 93, 21,48, 21,41, 20, 99, 20,46, 19,47, 18, 62 18,27, 16,15, 15,84, 14,00, 12,04, 9,01.

Exemplo 8

Este exemplo ilustra o passo de redução de carbonilo no Esquema IA, com referência particular para a N-desmetil-N- 36 -isopropil-15-metil-(9S)-9-di-hidroeritromicina A (composto I, R1 = 1-propilo, R2 = isopropilo; R3 = R4 = OH) , embora se subentenda que o processo é genericamente aplicável a outros compostos análogos.

Dissolveu-se N-desmetil-N-isopropil-15-metileritromicina A (1,74 g, 2,24 itimol) em metanol :éter (1:3 V/V, 50 mL) e depois arrefeceu-se para -20°C. Acrescentou-se boro-hidreto de sódio (189 mg, 5,0 mmol). A seguir deixou-se a mistura aquecer lentamente até à temperatura ambiente durante um período de 3 horas. Destruiu-se o excesso de boro-hidreto de sódio mediante a adição de tampão fosfato a pH 6,0, seguindo-se a adição de trietanolamina (10 mL) . Decorridos 30 minutos, extraiu-se a mistura com acetato de etilo e secou-se sobre sulfato de magnésio. Purificou-se o produto impuro por cromatografia em coluna de gel de sílica (hexano:acetona a 3:1- contendo trietilamina a 1%) . Obteve-se N-desmetil-N-isopropil-15-metil- -(95)-9-di-hidroeritromicina A pura (1, 63 g, rendimento de 93%). m/z: 779,0 (MH) ; 13C-NMR (CDC13) : 177,28, 102,59, 95, 81, 83,45, 82,76, 78,81, 77,86, 75,68, 75,03, 74, 67, 72,68, 70,38, 70,24, 69,26, 65,97, 62,28, 52,52, 49, 34, 44,83, 42,00, 36,78, 34,80, 34,37, 33,01, 31,96, 31,02, 30,76, 25, 46, 21,58, 21,28, 21,10, 20,41, 19,93, 19,74, 18,27, 16,37, 14,86, 14,30, 14,02, 9, 17.

Exemplo 9

Este exemplo descreve a construção de uma estirpe de Saccharopolyspora erythraea (K24-1/159-44), capaz de fazer a biosintese de 11-desoxieritromicinas, com referência particular para a 11-desoxieritromicina B, as quais são úteis como intermediários para a síntese de diversos compostos da presente invenção. É possível preparar 11-desoxieritromicina B numa única fermentação, numa célula hospedeira geneticamente modificada em que tenha lugar a expressão de uma versão modificada da sequência DEBS de genes (eryAI, eryAII e enyAIII). O gene 37 eryAI é modificado substituindo-se o domínio de cetorreductase no módulo 2 com uma cassete que contenha um domínio desidratase, um domínio enoilreductase e um domínio cetorreductase, por exemplo, provenientes do módulo 1 de PKS de rapamicina. Os métodos para a substituição de domínios foram descritos, por exemplo, por McDaniel no documento US 6 403 775 (2002) cujo conteúdo se considera aqui incorporado por referência. O gene eryAI manipulado é incorporado conjuntamente com os genes eryAII e eryAIII numa célula hospedeira competente para a produção de eritromicinas, logo que os genes de PKS manipulados tenham sido acrescentados. Em variantes preferenciais, estas células hospedeiras são "hospedeiras limpas", donde foram removidos os seus genes de PKS naturais. Como exemplos de células hospedeiras adequadas refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as células hospedeiras limpas de Saccharopolyspora erythraea K24-1 e as estirpes de Saccharopolyspora erythraea que possuem genes de PKS mutados, tais como as descritas por Santi et al., no documento US 2002/ 0004229 Al (2002). Na estirpe K24-1 os genes nativos eryAI, eryAII e eryAIII foram substituídos pelo local de fixação do fago attBI do actinofago Φ031, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 190 871 cujo conteúdo se considera aqui incorporado por referência, e seguido pelo promotor ermE*. Isto permite que os plasmídeos utilizados como vectores que possuem o local de fixação do fago attP complementar, conjuntamente com os genes que se pretende administrar, se integrem no cromossoma no local attB na presença de uma integrase de fagos. Como exemplos de vectores que são fagos integráveis adequados refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, o pSET152 e os seus derivados. A preparação da estirpe hospedeira inicial Saccharopolyspora erythraea K24-1 foi descrita por Santi et al., no documento US 2002/0004229 Al (2002), tendo essa estirpe sido depositada na Colecção Americana de Culturas 38

Tipo, caixa postal 1549, Manassas, Virgínia, 20108, USA, nos termos do Tratado de Budapeste de 12 de Março de 2003, com o número de admissão PTA-5061.

Os pKOS159-8 e pKOS159-10 são derivados do pSET152 contendo os genes eryA sob o controlo do promotor ermEp* e do par promotor-activador actIp/actII-ORF4, respectivamente. Efectuou-se a clonagem de um fragmento de Nsil de 35 kb proveniente do pKA0127 portador dos genes eryA e da região de actJp/actJJ-ORF4 no pKOS97-64c (um derivado de pSET152 que contém o promotor de ermEp* e um local λ cos) para se obter o pKOS159-10. O terminador transcricional fd do fragmento pKA0127 impede a expressão de todos os genes do promotor ermEp*P neste plasmídeo. O fragmento contendo o terminador fd e o segmento actIp/actII-ORF4 no pKOS159-10 foi removido por digestão com PacI e auto-ligação para gerar o pKOS159-8. Para a expressão dos genes eryA sob o controlo do seu promotor natural, construiu-se o pKOS159-31 mediante clonagem do fragmento de Ndel-Xbal portador dos genes eryA (e o local λ cos) provenientes do pKOS159-10 e o fragmento do flanco esquerdo de eryAI amplificado por PCR, digerido com Xbal-Ndelr indicado antes, no pSETl52 digerido com Xfoal. O pKOS159-33, que contém genes eryA provenientes de S. erythraea K41-135 foi construído de uma maneira análoga utilizando o fragmento de eryA proveniente de pKOS108-04. De igual modo, todos os plasmídeos de expressão de DEBS manipulados artificialmente foram produzidos utilizando pKOS159-31 como armação de suporte e com as enzimas de restrição adequadas para se remover dos plasmídeos existentes o fragmento de eryA geneticamente modificado. O pKOS159-44 é um plasmídeo derivado de pSET152 (Bierman et al., Gene 116, 43-49 (1992), "Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.M) que possui os genes eryA geneticamente modificados (KR2 —> rapDH/ER/KRl) sob o controlo do promotor eryAI (Rodriguez et al., J. Ind. 39

Microbio. Biotechnol., "Rapid Engineering of Polyketide Overproduction by Gene Transfer to Industrially Optimized Strains", publicado no ciberespaço como documento n° 10.1007/sl0295-003-0045-l (http://link.springer-ny.com) (16 Apr. 2003)). Isolou-se um fragmento de Ndel-Nsil de 30 kb (portador dos genes eryA geneticamente modificados) proveniente de pKOSll-66 (Xue et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 96, 11740-11745 (1999),"A multiplasmid approach to preparing large libraries of polyketides") e ligou-se a um fragmento de Ndel-Nsil de 8 kb proveniente de pHOS159-33 (Rodriguez et al., citado supra), contendo o vector pSET152, o promotor de eryAp e o local λ cos) . Acondicionou-se a mistura de ligação utilizando o extracto de acondicionamento 'Gigapack III Gold' (Stratagene) e utilizou-se para infectar E. coli XL-1 Blue. Os recombinantes foram seleccionados em placas de gelose LB contendo apramicina na concentração de 60 pg/mL. Isolou-se o ADN plasmidico do pKOS159-44 e confirmou-se por meio de digestões de restrição.

Preparou-se a estirpe K24-1 de S. erythraea que contém uma supressão cromossómica nos três genes eryA e a inserção dos locais attB para o fago φ031 de Streptomyces proveniente de Streptomyces lividans, seguida pelo promotor ermE* nos seus lugares, tendo sido para tal colhidos esporos de estirpes desenvolvidas em 1-2 placas Ml (por litro, 5 g de glicose, 5 g de triptona, 0,5 g de cloridrato de betaina, 5 g de amido de milho, 1 g de licor de infusão de milho (50%), 200 mg de MgS04*7H20, 2 mg de ZnS04*7H2<0, 0,8 mg de CuS04*5H20, 0,2 mg de CoCl2*6H20, 4 mg de

FeS04*7H20, 80 mg de CaCl2*6H20, 150 mg de KH2P04, 10 g de

NaCl, 20 g de gelose), filtrando os esporos através de algodão esterilizado e recolocando tudo em suspensão em 1 mL de uma solução de glicerol a 20%. As suspensões de esporos foram guardadas a -20°C. Acrescentou-se uma aliquota de 20 pL da suspensão de esporos a 5 mL de 2xYT e 40 manteve-se a incubar a 30°C com agitação. Decorrida 1 hora, efectuou-se a recolha dos esporos por centrifugação (células recipientes). As células dadoras foram preparadas transformando ET12567/pUZ8002 de E. coli com o pKOS159-44 e efectuando a sua selecção apenas em termos de resistência à apramicina. Com uma ponta fina retirou-se diversas colónias para fora da placa de transformação primária, tendo sido utilizadas para inocular 5 mL de LB com cloranfenicol (10 pg/mL), canamicina (100 pg/mL) e apramicina (60 pg/mL). Deixou-se as células a desenvolverem-se a 37°C durante 3-4 horas (D06oo de 0,4-0,6), efectuou-se a colheita por centrifugação, lavou-se em 5 mL de LB, centrifugou-se e recolocou-se tudo em suspensão em 100 pL de LB. A transferência por conjugação entre as células dadoras e as receptoras foi realizada recolocando em suspensão as células receptoras em 100 pL de suspensão dadora, tendo as células sido espalhadas sobre placas R5 (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual (The John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985) contendo ácido nalidíxico na concentração de 50 pg/mL, com incubação a 34°C durante 16 horas. As placas foram depois recobertas com 3 mL de gelose nutriente simples contendo 1 mg de ácido nalidíxico e 2 mg de apramicina. Foram observados ex-conjugantes K24-1/159-44 decorridas 48 horas de incubação suplementar. A estirpe K24-1/159-44 foi depositada na Colecção Americana de Culturas Tipo, Caixa Postal 1549, Manassas, Virgínia 20108, USA, nos termos do Tratado de Budapeste de 12 de Março de 2003 com o número de admissão PTA-5054. 41

Exemplo 10

Este exemplo descreve a biosintese de 11-desoxieritromicina B como intermediário para a sintese de determinados compostos da presente invenção, utilizando a estirpe descrita no exemplo anterior.

Foram praticadas as técnicas de fermentação descritas por Frykman et al., Biotechnol. Bioeng., 76,303-310 (2001) "Precursor-Directed Production of Erythromycin Analogs by Saccharopolyspora erythraea" e Rodriguez et ai., citado s upra.

Foram utilizados os meios seguintes: (a) meio VI inoculante contendo amido de milho na concentração de 16 g/L, dextrina na concentração de 10 g/L (D-2256, Sigma-Aldrich), farinha de soja na concentração de 15 g/L (S-9633, Sigma-Aldrich), cloreto de sódio na concentração de 2,5 g/L, licor de infusão de milho na concentração de 5 g/L, sulfato de amónio na concentração de 1 g/L (A-2939, Sigma-Aldrich), óleo de soja na concentração de 6 g/L (S-7381, Sigma-Aldrich) e carbonato de cálcio na concentração de 4 g/L (C-4830, Sigma-Aldrich). (b) Meio de fermentação F2 contendo amido de milho na concentração de 28 g/L, farinha de soja na concentração de 24 g/L, cloreto de sódio na concentração de 5,5 g/L, licor de infusão de milho na concentração de 8 g/L, sulfato de amónio na concentração de 1,5 g/L, óleo de soja na concentração de 4,5 g/L e carbonato de cálcio na 42 concentração de 6 g/L. Todos os meios foram esterilizados por tratamento em autoclave a 121°C durante 90 minutos. A experiência foi feita em dois balões inoculados, tomando um frasco de 1 mL de Saccharopolyspora erythrae K24-l/pKOSl59-44 proveniente de um banco de células congeladas, descongelando-as e acrescentando o conteúdo do frasco a 50 mL de Meio VI e fazendo a incubação a 34 °C durante 40-48 horas. Foram criados então dois inóculos secundários, transferindo aliquotas de 50 mL do balão de inoculo para 500 mL de meio VI e fazendo a incubação a 34°C durante 40-48 horas.

Efectuou-se a transferência das duas culturas secundárias de 500 mL de inoculo para uma fermentadora B. Braun B10 contendo 9 L de meio VI. Manteve-se a fermentadora a funcionar a 34°C com regulação para o valor de pH 7,0 mediante a adição de ácido sulfúrico 2,5 N e hidróxido de sódio 2,5 N. Fez-se o arejamento a 3 L.p.m. com agitação entre 600 e 800 r.p.m., mantendo a tensão do oxigénio dissolvido num valor superior a 40%. Efectuou-se a colheita depois de decorridas cerca de 24 horas. A seguir transferiu-se 10 L da cultura de inoculo da fermentadora para uma outra fermentadora B. Braun Biostat UD500 contendo 300 L de meio F2. Manteve-se a fermentadora Biostat UD500 a funcionar a 34°C com regulação para o valor de pH 7,0 mediante a adição de ácido sulfúrico 2,5 N e hidróxido de sódio 2,5 N. Fez-se a agitação a 200-300 r.p.m. com arejamento entre 40-250 L.p.m., mantendo a tensão do oxigénio dissolvido num valor superior a 40%. Injectou-se dextrina (150 g/L) com um caudal de 675 mL/h durante 24 a 98 horas. Acrescentou-se óleo de soja com um caudal de 64 mL/h durante 24 a 140 horas. Acrescentou-se n--propanol com um caudal de 26 mL/h durante 24 a 140 horas. Efectuou-se a colheita decorridas 180 horas. 43

Regulou-se a formação de espuma mediante a adição de uma solução a 50% de anti-espumante B (JT Baker) , conforme necessário. O caldo de fermentação foi clarificado por centrifugação e submetido a extracção de fase sólida, utilizando resina HP20 (Mitsubishi). A eluição do produto adsorvido foi feita com metanol e depois secou-se. O produto impuro foi então submetido a uma extracção liquido:liquido com acetato de etilo:água. Efectuou-se a secagem dos extractos combinados de acetato de etilo. Purificou-se o produto por cromatografia utilizando resina HP20SS e fazendo a eluição com metanol em gradiente escalonado entre 50% e 80%. Reuniu-se o produto que continha as fracções e secou-se para se obter 11-desoxieritromicina B. m/z: 702, 64 (MH); 13C-NMR (CDC13) : 219, 13, 175, 56, 102,48, 95,92, 82,73, 79, 40, 78,92, 77,79, 74,88, 72,52, 70,79, 68,80, 65,52, 65,13, 49,25, 45,98, 44,31, 43,40, 40,15 (2x) , 38,11, 37,20, 36,54, 34,79, 33,19, 28,52, 26, 37, 24,55, 21,37, 21,19, 18,54, 18,31, 15,69, 14,68, 11,96, 10,3 6, 9,16 ppm.

Exemplo 11

Este exemplo descreve a conversão de 11-desoxieritromicina B em N-desmetil-N-isopropil-ll-desoxi-(9S)-9-di-hidroeritromicina B (composto I, R1 = etilo, R2 = isopropilo, R3 = R4 = H; composto J, Quadro 1), utilizando a metodologia do Esquema 1.

Efectuou-se a redução do composto 11-desoxieritromicina B (200 mg, 0,285 mmol) executando genericamente o processo do Exemplo 8 para se obter (9S)-9-di-hidroeritromicina B (94 mg, rendimento de 47%) . m/ z : 705,0 (MH) ; 13 C-NMR (CDCI3) : 176, 82, 102 , 38 , 95 , 82 , 83 ,04, 80,95, 80,23, 79, 01, 77,82, 74, 89, 72, 71, 70, 89, 69, 14, 66,04, 65,12, 49,28, 44, 67, 42, 23, 40, 28 (2x) , 37,36, 34, 81 (2x) , 33,50, 32,58 , 29, 39, 28, 90, 25, 29, 25, 17, 21, 53, 21,16, 20,04, 18,13, 17,98, 13, 82, 10, 59, 10,22, 9,24 * 44

Executando genericamente os processo dos Exemplos 6 e 7, converteu-se o composto 11-desoxi-(9S)-9-di-hidroeritromicina B (94 mg, 0,134 mmol) em N-desmetil-N-isopropil-ll-desoxi--(9S)-9-di-hidroeritromicina B (57 mg, rendimento de 58%). m/ z : 733,0 (MH); 13c- -NMR (CDCls) : 176, 98, 102, LO O LO LO LO 82, 33 , 81,11, 80 ,22, 78, 90, 77, 89, 74, 93, 72, 69, 70, 29, 69, 11 , 65, 98, 65 ,16, 52, 53, 49, 28, 44, 52, 42, 38, 37, 27, 34, 91 , 34,73, 33 ,38, 32 , 96, 32 ,60, 30 , 99 , 29 ,38, 25 ',18 (2x ) , 21,54, 21, 22, 21, 05, 20, 34, 19, 91, 18, 12, 17, 85, 13, 68 LO O \—1 io,: 21, í 3, 10 φ 45

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição us 5578579 A [0009] us 5658888 A [0009] us 5922849 A [0009] us 6077943 A [0009] us 6084079 A [0009] us 5712253 A [0010] us 5523401 A [0010] us 5523418 A [0010] us 5538961 A [0010] us 5554605 A [0010] wo 0063225 A [0011] us 6437151 B2 [0012] us 6066721 A [0052] [0052] us 6261816 A [0052] us 6395710 A [0052] wo 0044717 A [0052] us 5824513 A [0052] wo 0127284 A [0052] us 6251636 B [0052] us 6080555 A [0053] wo 0183803 A [0053] wo 0131035 A [0053] us 6391594 B [0054] us 6403775 B [0054] [0098] us 6395710 B [0056] [0053] 46 • US 20020192709 Al, Carreras [0059] • US 2002 Al [0059] [0098] [0099] • US 4916138 Al [0063] • EP 428169 A [0063] . wo 0044717 A2, Ashley [0073] • WO 2002 A2 [0073] • US 20020004229 Al, Santi [0098] [0099] • US 5190871 A [0098]

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • OMURA et al. Gastrointestinal motor-stimulating activity of macrolide antibiotics and the structure-activity relationship. J. Antibiotics, 1985, vol. 38, 1631-2 [0008] • Design of Prodrugs, Bundgaard. Elsevier, 1985 [0033] • CARRERAS et al. Anal. Biochem, 2002, vol. 300, 146-151 [0057] • HONDO et al. Transplantation Proceedings, 1987, vol. XIX (6), 17-22 [0062] • CARRERAS et al. J. Biotechnology, 2002, vol. 92, 217-228 [0074] • BIERMAN et al. Gene, 1992, vol. 116, 43-49 [0101] • RODRIGUEZ et al. Rapid Engineering of Polyketide

Overproduction by Gene Transfer to Industrially Optimized Strains. J. Ind. Microbio. Biotechnol., 16 April 2003, http://link.springer-ny.com [0101] • XUE et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1999, vol. 96, 11740-11745 [0101] • HOPWOOD et al. Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, 1985 [0102] • FRYKMAN et al. Precursor-Directed Production of

Erythromycin Analogs by Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Bioeng., 2001, vol. 76, 303-310 [0105]

Lisboa, 10/02/2009

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula estrutural (I)

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que o símbolo R1 representa um grupo alquilo(C1-C10) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C10) substituído ou não substituído, um grupo alcinilo (C4-C10) substituído ou não substituído, um grupo arilo substituído ou não substituído ou um grupo heterocíclico substituído ou não substituído; 0 símbolo R2 representa 0 átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C5 ) substituído ou não substituído, um grupo alcinilo (C2-C5 ) substituído ou não substituído, um grupo arilo substituído ou não substituído ou um grupo heterocíclico substituído ou não substituído; o símbolo R3 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; e o símbolo R4 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo OH, ou os radicais R3 ou R4 considerados em conjunto formam o grupo 0-C(=0)-0; com a condição de no caso de (a) o símbolo R1 representar o grupo etilo e (b) o símbolo R3 representar o grupo OH ou os radicais R3 e R4 considerados em conjunto formarem o grupo 0-C(=0)-0, então o símbolo R2 não representa nem o átomo de hidrogénio nem o grupo metilo. 2

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o simbolo R1 representa um grupo alquilo(Ci-Cio) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo(C2-C10) substituído ou não substituído, um grupo alcinilo(C2_Cio) substituído ou não substituído, um grupo arilo substituído ou não substituído ou um grupo heterocíclico substituído ou não substituído; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; e os símbolos R3 e R4 representam o grupo OH com a condição de no caso de o símbolo R1 representar o grupo etilo, então o símbolo R2 não representa nem o átomo de hidrogénio nem o grupo metilo.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que: o símbolo R1 representa um grupo alquilo(C1-C10) substituído ou não substituído; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C5) substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo(C2-C5) substituído ou não substituído; e os símbolos R3 e R4 representam o grupo OH, com a condição de no caso de o símbolo R1 representar o grupo etilo, então o símbolo R2 não representa nem o átomo de hidrogénio nem o grupo metilo.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o símbolo R1 representa o grupo etilo; o símbolo R representa o grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; e os símbolos R3 e R4 representam o grupo OH.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que: o símbolo R1 representa um grupo etilo substituído; 3 / 2 ο símbolo R representa o átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C5) substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo(C2-C5) substituído ou não substituído; e os símbolos R3 e R4 representam o grupo OH.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o símbolo R1 representa o grupo etilo; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou o grupo etilo, propilo, isopropilo ou 2-butilo; e os símbolos R3 e R4 representam o grupo OH.

7. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que: o símbolo R1 representa um grupo propilo; o símbolo R2 representa o átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C5) substituído ou não substituído, um grupo alcenilo (C2-C5) substituído ou não substituído ou um grupo alcinilo(C2-C5) substituído ou não substituído; e os símbolos R3 e R4 representam o grupo OH.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que os símbolos R3 e R4 representam independentemente o átomo de hidrogénio ou o grupo OH; o símbolo R1 representa um grupo seleccionado entre etilo, 2-fluoroetilo e 1-propilo; e o símbolo R2 representa um grupo seleccionado entre metilo, etilo, isopropilo e 2-butilo; com a condição de no caso de o símbolo RI representar o grupo etilo e o símbolo R3 representar o grupo OH, então o símbolo R2 não representa o grupo metilo.

9. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que os símbolos R1, R2, R3 e R4 possuem as significações que resultam das combinações explicitadas no quadro subsequente: 4 R1 R2 RJ R4 CH3CH2 CH(CH3)2 OH OH FCH2CH2 ch3 OH OH FCH2CH2 CH2CH3 OH OH FCH2CH2 CH(CH3)2 OH OH CH3CH2CH2 ch3 OH OH CH3CH2CH2 CH(CH3)2 OH OH CH3CH2CH2 C(CH3)CH2CH3 OH OH CH3CH2 CH(CH3)2 H H

10. Composto de acordo com a reivindicação 1, seleccionado entre o conjunto constituído por

OH

5

OH

11. Composto de acordo com a reivindicação 1, o qual possui a fórmula estrutural:

6

12. Composto de acordo com a reivindicação 1, o qual possui a fórmula estrutural:

13. Composição farmacêutica que contém um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, conjuntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

14. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, para utilização no tratamento de uma patologia de motilidade gástrica.

15. Utilização de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, para a preparação de um medicamento para tratar uma patologia gástrica num paciente. Lisboa, 10/02/2009