PT1553984E - Produção de um corante para a coloração de células no corpo humano ou no corpo de animais - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PRODUÇÃO DE UM CORANTE PARA A COLORAÇÃO DE CÉLULAS NO CORPO HUMANO OU NO CORPO DE ANIMAIS" O invento diz respeito à utilização de uma solução aquosa, fisiologicamente compatível, na qual é dissolvido um pigmento para a produção de um corante para a coloração de membranas no olho, quer do homem, quer de animais.

Através da WO 02/07693 A conhecem-se composições para a coloração de células epiteliais, por meio de pigmentos mitocondriais, em particular para o diagnóstico de tecido epitelial, cancerígeno ou pré-cancerígeno. Como pigmentos pode utilizar-se solução aquosa, tamponada de Machalite Green e Brilliant Green.

Através da GB-A-2.026.015 conhecem-se composições para a coloração de células que, entre outros, contêm 0,1 a 0,5% de um pigmento à base de trifenil-metano, sendo que estas composições podem ser preparadas sob a forma de soluções.

Através da EP-A- 0 037 905 conhece-se um método para a comprovação e determinação diferencial de diagnóstico de células leucémicas, no qual foi utilizado um -2- ΡΕ1553984 pigmento à base de trifenil-metano.

Além disso, através da WO 99/58160 conhece-se a utilização de azul tripano como pigmento. Este composto conhecido da classe dos pigmentos diazo é utilizado numa solução aquosa para a coloração da cápsula dianteira para uma operação à catarata no olho. Através da visualização da cápsula dianteira, o cirurgião identifica o contorno da capsulorhexis, com o que é facilitada a emulsificação do cristalino.

No caso do azul tripano, trata-se de uma substância citotóxica tal como é conhecida, por exemplo, através de Solomon K.D. et al. : Protective effect of the anterior lens capsule during extracapsular cataract extraction, OPHTHALMOLOGY, volume 96, n° 5, Maio 1989 (1989-05), 591-597 e Veckener M. et al.:Ocular toxicity study of trypan blue injected into the vitreous cavity of rabit eyes, Graefe's Arch Clin Ex Ophtalmol (2202) 239: 698-704. Assim, quando da utilização de azul tripano, imediatamente a seguir à operação às cataratas, é necessária a lavagem completa, em particular, da região do olho na qual o azul tripano foi utilizado como corante, a fim de se evitar uma permanência prolongada no corpo ou no olho.

Através da EUA-A-4.764.360, sabe-se que a um polimerizado de elevado peso molecular, que forma um veiculo, se deve adicionar um pigmento com um peso -3- ΡΕ1553984 molecular de, pelo menos, 10.000.

Deste modo, deverá evitar-se que o pigmento penetre no tecido circundante do corpo. O pigmento deve tingir apenas o veiculo de elevado peso molecular.

Além disso, para a visualização de deficiências que abrangem toda a retina, nos casos de remoção da mesma, sabe-se já como injectar o pigmento azul patenteado via intravítrea ( E. Kutchera, "Vitalfaerbung der abgehobenen Netzhaut und ihre defekte", Albrech v. Graefes Arch. Klin.exp.Ophtal. 178, 72,87 (1969 —)). Para a injecção via intrevítrea, foi utilizada uma solução de azul patenteado e ácido hialurónico a 0,47%. A visualização da remoção da retina é extremamente morosa e só se consegue ao fim de alguns dias após a injecção. O objectivo do invento é conseguir a produção de um corante isento de citotoxicidade, que seja adequado para a visualização de membranas com função de delimitação ou separação, ou de membranas nos olhos do homem ou de animais, formadas em consequência de doenças.

De acordo com o invento, este objectivo é conseguido através das caracteristicas da reivindicação 1. As reivindicações dependentes contêm aperfeiçoamentos vantajosos do invento.

Graças à utilização de um pigmento de -4- ΡΕ1553984 trifenilmetano, biocompatível, isento de veículos, numa solução aquosa fisiologicamente compatível, particularmente de cloreto de sódio, que, com um tampão, pode ser corrigida/ajustada para um pH de 6,8 a 7,8, em particular de cerca de 7,4, com o invento, é criado um corante para a coloração das membranas nos olhos do homem ou de animais. No caso do corante, trata-se de um pigmento não polímero de baixo peso molecular, solúvel na água. 0 corante a ser aplicado com o invento pode ser utilizado para verificação/ensaio da vitalidade, no entanto, contrariamente ao que acontece com os pigmentos de vitalidade tradicionais, com o pigmento biocompatível a ser aplicado no invento, além das células mortas para a distinção do material vivo, também as células vivas podem ser tingidas.

Como pigmento de baixo peso molecular, solúvel na água, utiliza-se um pigmento de trifenilmetano. 0 pigmento é utilizado isento de veículos. São exemplo deste tipo de pigmentos adequados o azul patenteado e o azul brilhante R, sendo que o último é conhecido pela coloração da proteína quando da electroforese em gel.

No caso do azul patenteado, trata-se, de preferência, de um azul patenteado V (C54H62CaN4Oi4S4, MG:1159,45) autorizado como pigmento para géneros alimentícios (azul L 3 = E 131).

Como tampão pode ser utilizado um tampão de -5- ΡΕ1553984 fosfato, hidrogenocarbonato ou de citrato cujo valor pH pode ser corrigido por meio de hidróxido de sódio. A concentração do pigmento biocompativel, por exemplo de azul patenteado V, em solução aquosa, situa-se, de preferência, entre 0,6 a 2,5 g/1, particularmente cerca de 1,2 g/1. Obtém-se um tingimento espontâneo das zonas pretendidas quer no corpo humano quer no corpo de animais. O corante pode ser utilizado para a coloração da cápsula do cristalino, particularmente da cápsula dianteira do cristalino, quando de uma operação às cataratas. A coloração é efectuada antes da capsulorhexis e da emulsificação do cristalino.

Para a coloração, a água da câmara é aspirada através de uma incisão corneai ou escleral, sob a forma de túnel e, em seguida, a câmara dianteira é enchida com um gás, particularmente ar. Com uma cânula, introduzem-se cerca de 0,3 ml de solução de corante, por exemplo de azul patenteado V, na câmara dianteira. Verifica-se a coloração da cápsula do cristalino que é limitada pelo bordo da pupila da iris. Ao fim de alguns segundos, a fim de se retirar o pigmento não necessário, a câmara dianteira é lavada com uma solução de cloreto de sódio.

Em seguida, para a execução da operação às cataratas, uma solução viscoelástica é, na forma tradicional, introduzida na câmara dianteira do olho. Devido à coloração azul da cápsula dianteira, os contornos -6- ΡΕ1553984 da capsulorhexis evidenciam-se com toda a nitidez, o que permite distinguir claramente do tecido cinzento do núcleo do cristalino. 0 corante também pode ser aplicado para a coloração da Membrana limitans interna ou, por exemplo, devido à formação de membranas em consequência de PVR (retinopatia proliferativa do vítreo), em particular membranas epiretinais na retina ou na superfície traseira da membrana que limita o corpo vítreo, especialmente no caso de cirurgia à retina e ao corpo vítreo.

Quando da remoção, por exemplo, de uma membrana epiretinal da retina, o pigmento, por exemplo, azul patenteado V em cerca de 0,3 ml da solução tampão indicada, aplicado por meio de uma cânula por cima da Pars plana, é, de forma selectiva, levado até à membrana a ser retirada. Antecipadamente, o corpo vítreo pode ser total ou parcialmente substituído por um enchimento de gás, tal como é utilizado, na forma tradicional, durante a cirurgia ao corpo vítreo ou à retina e, em particular, na cirurgia da mácula. Ao efectuar-se a coloração da membrana epiretinal pode, eventualmente, ocorrer uma coloração do tecido vizinho da retina com um grau de coloração mais fraco. Quando a membrana é retirada do tecido não tingido da retina, que se situa por baixo daquela, regista-se então um bom contraste. Após a coloração, enxagua-se a solução de corante excedente e o espaço vazio é preenchido com o substituto gasoso do corpo vítreo, atrás mencionado. Graças -7 - ΡΕ1553984 ao tingimento, quando da extracção da membrana, é possível trabalhar com um instrumento não iluminado ou apenas ligeiramente iluminado. Deste modo e se houver suficiente percepção do contraste, a toxicidade da luz é extraordinariamente reduzida. Particularmente no caso da aplicação em ligação com membranas epiretinais (Gliose epiretinal, "macular pucker", "surface wrinkling"), a utilização da solução de corante constitui um auxiliar precioso na procura e remoção das membranas.

Se, no caso do forâmen da mácula com aumento do tamanho do orifício, for necessário retirar a Membrana limitans interna, o tingimento desta membrana com a solução de corante tem sido considerado um benéfico agente auxiliar na procura e remoção desta membrana, durante a cirurgia ao corpo vítreo.

Além disso, com a solução de corante aquosa, também é possível tingir um material viscoso-elástico, por exemplo ácido hialurónico, que é utilizado como agente auxiliar na cirurgia oftalmológica. Com efeito, particularmente no caso de operações às cataratas, consegue-se uma melhoria do contraste do agente auxiliar viscoelástico perante o tecido intra-ocular, particularmente a íris do olho e o reflexo do fundo.

Comparativamente ao azul tripano tradicional, que tem efeitos teratogénicos ou mutagénicos (Cahen RL: Evaluation of the teratogenicity of drugs, Clin Pharmacol. -8- ΡΕ1553984

Ther, 1964, 5, 480-514 e Produktinformation BLURHEX ™, Dr. Agarwal's Pharma Ltd. Chennai (Indien)), a solução biocompatível de acordo com o invento, por exemplo de azul patenteado V ou de azul brilhante R, não possui qualquer citotoxicidade

Para comprovar a ausência de citotoxicidade, células de ratos L 929 e células ARPE-19 foram tratadas com o corante azul patenteado V, de acordo com o invento, com concentrações diferentes, durante 68 a 72 horas, no armário de regeneração. A vitalidade das células e uma citotoxicidade derivada foram determinadas quantitativamente por determinação do teor de proteínas das células de cultura tratadas, em comparação com as culturas de controlo não tratadas. 0 teor de proteínas é determinado colorimetricamente através de um método Standard.

Verifica-se, então, que, proporcionalmente a uma inibição de crescimento de mais de 30%, não existe uma citotoxicidade de valor significativo. O invento revelou-se ser particularmente vantajoso na execução de operações às cataratas com cataratas densas e/ou fundos muito pigmentados, nos quais o reflexo do fundo só está ligeiramente desenvolvido ou está mesmo ausente. Com a ajuda do corante consegue-se um bom contraste entre a cápsula dianteira colorida e o tecido de suporte. -9- ΡΕ1553984

Indicam-se, a seguir, exemplos de execução do corante em diversas soluções tampão.

Exemplo 1

Azul patenteado V com uma concentração de 1,2 g/1 numa solução tampão de fosfato 200 ml de solução contêm:

0,240 g de azul patenteado V 0,380 g de hidrogenofosfato dissódico (Na2HP04 x 2 H20) 0,060 g de di-hidrogenofosfato de sódio (Na2HP04 x 2 H20) 1,640 g de cloreto de sódio (NaCl)

Hidróxido de sódio para correcção do valor pH.

Exemplo 2

Azul patenteado V com uma concentração de 1,2 g/1 numa solução tampão de hidrogenocarbonato 200 ml de solução contêm:

0,240 g de azul patenteado V 0,420 g de hidrogenocarbonato de sódio (NaHCCb) 1,640 g de cloreto de sódio (NaCl)

Hidróxido de sódio para correcção do valor pH.

Exemplo 3

Azul patenteado V com uma concentração de 1,2 g/1 - 10- ΡΕ1553984 numa solução tampão de citrato 200 ml de solução contêm: 0,240 g de azul patenteado V, 0,216 g de citrato trissódico (C6H5Na307 x 2 H20), 1,640 g de cloreto de sódio (NaCl)

Hidróxido de sódio para correcção do valor pH.

Exemplos de execução idênticos, de acordo com os Exemplos 1, 2 e 3 podem também ser preparados com azul brilhante R com uma concentração de 1,2 g/1.

De preferência , no caso das soluções tampão, o valor pH é corrigido por meio de hidróxido de sódio. No entanto, também é possível ajustar a própria solução para o valor pH pretendido (neutro, ligeiramente ácido, ligeiramente alcalino), dentro da gama preferida de 6,8 a 7,8. A correcção da concentração do azul patenteado, de preferência, para 0,6 a 2,5 g/1, em particular para 1,2 g/1, é efectuada por meio de uma quantidade correspondente de azul patenteado V.

Lisboa, 26 de Janeiro de 2009

Claims (11)

1. ΡΕ1553984 - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma solução aquosa, fisiolo-gicamente compatível, na qual está dissolvido um pigmento biocompatível de trifenilmetano, para a preparação de um corante para coloração da cápsula do cristalino de um olho ou para a coloração das membranas a retirar do olho em caso de cirurgia à retina ou ao corpo vítreo.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o corante é preparado para a coloração da cápsula dianteira do cristalino, quando de uma operação à catarata no olho.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o corante é preparado para a coloração das membranas que se formam em consequência de doença na retina do olho.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o corante é preparado para a coloração de membranas epiretinais.
5. 5. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que o corante é preparado para a coloração de uma solução viscoelástica utilizada na cirurgia oftalmológica.
6. 6. Utilização de acordo com uma das -2- ΡΕ1553984 reivindicações 1 a 4, em que o pigmento é dissolvido num tampão neutro, ou ligeiramente ácido ou ligeiramente alcalino.
7. 7. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, em que o pigmento é dissolvido num tampão com um valor pH de 6,8 a 7,8.
8. 8. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 7 em que é utilizado um tampão de fosfato, hidrogenocarbonato ou de citrato.
9. 9. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 8 em que a concentração do pigmento na solução tampão é de 0,3 a 2,5 g/1, em particular cerca de 1,2 g/1.
10. 10 . Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 9 em que, como pigmento, é utilizado azul patenteado V.
11. 11 . Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 10 em que, como pigmento, é utilizado azul brilhante R. Lisboa, 26 de Janeiro de 2009 -1 - ΡΕ1553984 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição • WO 0207693 A « WO 9958160 A • GB 2026015 A 1 US 4764360 A • EP 0037905 A citada na Descrição Literatura que não é de patentes * E. KUTCHERA, VstaísattiuiXf der abgehobenen Netzhai.i1 und shre Defekte. AbretAí sr Gíaefes.Aefj. klm. &φ. OpMtaí., 1969, vol 178, 72. 87 * CAHEN RL. Evaíuaffors of lhe teratogeoicíty of drugs. C/íh PharmacoL Ther, 1964, vol. 5, 480-514 ProdLfkíioformation BLURHEX Dr. AgarwaFs Phar-Ltd. 1 SOLOMON K.D. et al. Protedtve effeci of lhean®e- rôr Seres capsule dttring exSracapsular caiaract ex-fracfen. OPHTHALhfOLQGY, Ma 1099, vol. 96 (5), SS1-537 • VECKENER II. et al. Ocular íoxicity síudy cf trypsn bloe irtjeeted insto the vitreous caviíy of rabít eyes. Graefels Afdj C-lin Ex Ophthsímol, 2002, vol. 239, 69&-704