PT1739178E - Libertação de péptidos trifólios - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

LIBERTAÇÃO DE PÉPTIDOS TRIFÓLIOS A presente invenção refere-se ao campo de sistemas de libertação de proteína in vivo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à secreção in vivo de péptidos trifólios por microrganismos, de um modo preferido estirpes bacterianas, de um modo preferido estirpes não patogénicas, de um modo preferido estirpes não invasivas, de um modo preferido estirpes de grau alimentar, os métodos para a libertação de péptidos trifólios que utilizam os referidos sistemas e a utilização dos referidos sistemas de expressão de péptido trifólio para o tratamento de distúrbios inflamatórias do tracto gastrointestinal. 0 Lactococcus lactis é uma bactéria de ácido láctico, não patogénica, gram-positiva, que pode sobreviver no intestino (Klijn et al., 1995). Não é certo se a L. lactis também pode ser metabolicamente activa em todos estes ambientes. A expressão do fragmento C da toxina do tétano por Lactococcus lactis, com vista à vacinação foi descrita por Wells et al. (1993b) e Robinson et al. (1997) . Alem disso, foi demonstrado que, quando as preparações de bactérias de L. lactis, tratadas por engenharia, para expressarem quer a interleucina-2 ou a interleucina-6, em conjunto com o fragmento C da toxina do tétano (TTFC), foram administradas intranasalmente a murganhos, mais do que 10 vezes, foi produzida mais anti-TTFC do que depois da administração semelhante de estirpes que expressam apenas TTFC (pedido de patente internacional publicada como WO 97/14806). Estes resultados comprovam a utilização de um vector de vacina 1 bacteriana experimental não invasiva, que segrega citocina, para aumentar as respostas imunitárias a um antigénio co-expresso. Também foi descrita uma abordagem para ligar fragmentos heterólogos de proteina na parede da célula e, por este modo, visualizá-los na superfície de L. lactis, possivelmente levando a propriedades de vacinação mais potentes (WO 9709437 Steidler, Remaut, Wells).

Os péptidos trifólios são segregados por células de muco epiteliais e são estáveis em ambiente ácido. Estes péptidos contribuem para a protecção da mucosa (formação de um gel por cima do epitélio) e estão provavelmente implicados na reparação da mucosa danificada pela estimulação da migração epitelial (Playford et al., 1996). A produção de péptidos trifólios aumenta localmente em regiões onde o dano ocorre tal coma em úlceras gástricas e na colite (Wright et al., 1990). Babyatsky et al. (1996) mostraram que a administração de péptidos trifólios recombinantes reduz o dano nesses sítios. Em contradição com a maior parte das outras proteínas que são importantes para a protecção da mucosa (tal coma o factor de crescimento epidérmico), a maior parte dos estudos demonstraram que os péptidos trifólios causam muito pouca ou nenhuma proliferação (Playford et al., 1996). Três membros desta família de péptidos trifólios foram identificados em seres humanos e originalmente designados por: pS2 (gene indutor dos estrogénios do cancro da mama, O. Lefebvre, 1993), SP (péptido espasmolítico) e ITF (factor trifólio intestinal). Na presente nomenclatura o pS2 é renomeado como TFF1, SP como TFF2 e ITF como TFF3 (ver por exemplo Wong et al., 1999). Esta nova nomenclatura será utilizada em todas as partes do presente texto. 2

Em seres humanos, murganhos e ratos o TFF1 e o TFF2 são predominantemente encontrados no estômago enquanto o TFF3 é predominantemente encontrado no duodeno e no cólon. Wong et al. (1999) deu uma visão geral recente dos péptidos trifólios. 0 conteúdo deste artigo é incorporado, como referência, na presente descrição.

Pensa-se que o TFF1 actua através de um receptor da superfície da célula (Tan et al., 1997). A utilização de proteínas ou de péptidos trifólios par o tratamento de distúrbios e danos do tubo digestivo, incluindo a boca, o esófago, o estômago, e o intestino grosso e delgado, bem como para a protecção e o tratamento de tecidos que estão fora do tubo digestivo estão descritos nos documentos WO 97/38712 e WO 92/14837. Estas proteínas podem ser utilizadas quer para tratar lesões nestas áreas ou para inibir a formação de lesões. Estas lesões podem ser causadas por: terapia de radiação ou quimioterapia para o tratamento do cancro, qualquer outro fármaco incluindo álcool o qual danifica o tubo digestivo, exposição acidental a radiação ou a uma substância cáustica, infecção, um distúrbio digestivo incluindo, mas não se limitando a dispepsia não ulcerosa, gastrite, úlcera péptica ou duodenal, cancro gástrico, linfoma de MALT, síndroma de Menetier, doença de refluxo gastro-esofágico, doença de Crohn, colite ulcerosa e colite aguda de origem química, bacteriana ou obscura.

Os péptidos trifólios são especialmente úteis para tratar a colite aguda. 0 ITF também tem sido utilizado em combinação com o EGF (factor de crescimento epidérmico) para tratar úlceras 3 do tracto gastrointestinal. As experiências ín vitro e in vivo mostraram que as actividades que curam a ferida de EGF são marcadamente aumentadas pelo tratamento de EGF em combinação com o ITF, sem aumentar a acção proliferativa de EGF (Chinery and Playford, 1995). A doença inflamatória do intestino é o nome do grupo para uma variedade de inflamações gastrointestinais. Pertencem a este grupo a enterite, a colite, as inflamações de, respectivamente, a mucosa do duodeno ou do cólon. A doença de Crohn (enteritis regionalis) e a colite ulcerosa (colitis ulcerosa) estão intimamente relacionadas com as doenças recorrentes, crónicas e espontâneas do tracto gastrointestinal. Estas doenças são imunologicamente mediadas e têm causas ambientais e genéticas. Sartor (1995) descreve os diferentes aspectos da doença inflamatória do intestino. A doença de Crohn foi estudada, em particular, por exemplo, por Herfath e Sartor, (1994), Cominelli et al. (1994) e MacDermott (1989). A presente invenção tem por objectivo o que se estabelece em um qualquer e em todos os itens (i) a (viii) que se seguem: (i) A utilização de uma bactéria recombinante não patogénica e não invasiva transformada com o ADN de codificação de um péptido trifólio e capaz de libertar um péptido trifólio no tubo digestivo de um ser humano ou de animal para a preparação de um medicamento para o tratamento de lesões ou que inibe a formação de lesões do tubo digestivo causadas pela radioterapia ou pela quimioterapia usada para o tratamento do cancro, uma droga que danifica o aparelho digestivo, incluindo o álcool, a exposição acidental a radiação ou a uma 4 substância cáustica, infecção, distúrbios digestivos, incluindo, mas não se limitando a úlcera não dispépsica, gastrite, úlcera péptica ou duodenal, cancro gástrico, linfoma de MALT, sindrome de Menetier ou sindrome ou doença do refluxo gastro-esofágico. (ii) A utilização, conforme se estabeleceu antes em (i) , em que as lesões do tubo digestivo são causadas por terapia de radiação ou quimioterapia usadas para o tratamento do cancro. (iii) A utilização, conforme se estabeleceu antes, em um qualquer de (i) ou (ii), em que o tubo digestivo inclui a boca, o esófago, o estômago, o intestino delgado e o intestino grosso. (iv) A utilização, conforme se estabeleceu antes em um qualquer de (i) a (iii) , em que as lesões são nas superfícies da mucosa. (v) A utilização, conforme se estabeleceu antes em um qualquer de (i) a (iv), em que a referida bactéria não patogénica e não invasiva é uma estirpe bacteriana de grau alimentar, de preferência uma estirpe bacteriana gram-positiva. (vi) A utilização, conforme se estabeleceu antes em (v) , em que a referida estirpe bacteriana é uma espécie Lactococcus ou uma espécie de Lactobacillus. (vii) A utilização, conforme se estabeleceu antes em (vi) , em que a referida estirpe bacteriana é uma Lactococcus lactis 1. 5 (viii) A utilização, conforme se estabeleceu antes em um qualquer de (i) a (vii) , em que o referido péptido trifólio é TFF1.

As matérias providenciadas pela presente invenção pertencem assim especificamente à descrição da presente memória descritiva. A presente memória descritiva descreve um processo para libertar péptidos trifólios para tratar distúrbios gastrointestinais e uma composição farmacêutica para tratar distúrbios gastrointestinais. A presente memória descritiva descreve, mais em particular, um microrganismo que liberta um péptido trifólio in vivo. Preferencialmente, o referido microrganismo é uma estirpe bacteriana, não patogénica, de preferência não invasiva, de preferência uma estirpe de grau alimentar, mais preferencialmente uma estirpe bacteriana gram-positiva, de um modo mais preferido, uma estirpe bacteriana que fermenta o ácido láctico, preferencialmente uma espécie de Lactococcus ou de Lactobacillus que expressa um péptido trifólio in vivo. A presente invenção é assim aplicável a qualquer uma das espécies de Lactococcus ou de Lactobacillus ou às subespécies seleccionadas a partir da lista que compreende Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, 6

Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus

Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus, Lactobacillus aviarius subsp. aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei subsp. alactosus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus casei subsp. tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, confusus, Lactobacillus coryniformis, coryniformis subsp. coryniformis, coryniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus subsp. curvatus, Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis,

Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, helveticus, Lactobacillus heterohiochii, hilgardii, Lactobacillus homohiochii, iners, Lactobacillus intestinalis, jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans,

Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus,

Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus minor,

Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus i murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus paracasei subsp. tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei subsp. camosus, Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius subsp. salícíníus, Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus uli, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali, Lactobacillus yamanashiensis subsp. Yamanashiensis e Lactobacillus zeae. Não foi óbvio, a partir da capacidade de Lactococcus lactis para libertar um antigénio heterólogo ou a sua capacidade de produzir moléculas tais como IL-2 e IL-6 in vitro e in vivo, que as bactérias seriam um veiculo apropriado para a libertação de outros tipos de péptidos ou polipéptidos in vivo. Além disso, não se sabe se os referidos péptidos trifólios expressos pelas referidas estirpes bacterianas produzirão um efeito benéfico em doenças inflamatórias do tracto gastrointestinal, tal como a doença inflamatória do intestino ou a colite aguda. 8 É por isso surpreendente que possa ser demonstrado na secção dos exemplos presentes que as estirpes bacterianas são capazes de expressar péptidos trifólios, in vivo, quando presentes no tubo gastrointestinal e exercem um efeito de cura em situações de colite aguda. A título de exemplo, clonaram-se os fragmentos de RCP que contêm o TFFI de murganho na região de codificação. Preparam-se os vectores recombinantes que compreendem estes clones de RCP, sob o controlo de um promotor e da sequência de sinal de Lactococcus lactis. As estirpes de Lactococcus lactis transformadas foram preparadas para expressar péptidos trifólios de TFFI de murganho. Foi ainda demonstrado, num sistema de modelo de murganhos in vivo, que o mTFFl recombinante produzido por estas bactérias pode exercer, surpreendentemente, efeitos de cure na parte distai do cólon inflamado. A presente invenção refere-se, em particular, a uma estirpe bacteriana que liberta péptido trifólio in vivo. A presente invenção também tem por objecto uma bactéria que liberta TFFI in vivo. A presente invenção também se refere a partes ou variantes de qualquer péptido trifólio. As referidas partes referem-se a partes biologicamente activas as quais podem ser geradas através de processos conhecidos dos especialistas na técnica. Estas partes vão geralmente conter pelo menos 10 aminoácidos contíguos, tipicamente pelo menos 20 aminoácidos contíguos, mais tipicamente pelo menos 30 aminoácidos contíguos, normalmente pelo menos 40 aminoácidos contíguos e, de um modo preferido, pelo menos 50 aminoácidos contíguos. As referidas variantes referem-se 9 a variantes que têm a mesma actividade biológica tal como os péptidos trifólios mencionados antes.

As estirpes bacterianas, tal como descritas aqui, também podem expressar proteínas recombinantes adicionais as quais são benéficas para o tratamento de qualquer distúrbio enfrentado. A presente invenção ainda tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende um microrganismo que expressa um péptido trifólio como definido antes.

Vantajosamente, a composição farmacêutica aqui descrita é preferencialmente apropriada para ser aplicada a superfícies de mucosas.

As composições farmacêuticas aqui descritas para terem uma utilização de acordo com a presente invenção podem compreender, para além do microrganismo, um excipiente, veículo, tampão, estabilizante, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ou outros materiais bem conhecidos dos especialistas na técnica. Esses materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente activo. A natureza exacta do veículo ou de outro material pode depender da via da administração. Os especialistas nesta técnica são bem capazes de preparar soluções apropriadas. A presente invenção também tem por objecto um processo para libertar o péptido trifólio para o tracto gastrointestinal compreendendo a administração de um microrganismo como definido antes. 10 A presente invenção também se refere à utilização de um microrganismo, tal como definido antes, para o fabrico de um agente para a libertação do péptido trifólio no tracto gastrointestinal. A presente invenção tem ainda por objecto um processo para o tratamento de doenças gástricas e/ou intestinais e/ou distúrbios que compreendem a administração de um microrganismo como definido antes. A presente invenção tem ainda por objecto um processo para o tratamento de doenças gástricas e/ou intestinais e/ou distúrbios que compreendem a administração de um microrganismo como definido antes.

As proteínas trifólios expressas pelas estirpes bacterianas, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizadas quer para tratar lesões nessas áreas ou para inibir a formação de lesões causadas par doenças e distúrbios gastrointestinais. A expressão "doenças e/ou distúrbios gástricos e/ou intestinais" refere-se a todos os tipos de doenças e/ou distúrbios gástricos, intestinais e gastrointestinais, de preferência doenças e distúrbios inflamatórias gastrointestinais agudos. Estas doenças são, preferencialmente, distúrbios gastrointestinais agudos de origem química, bacteriana ou obscura. Pertencem a este grupo enterite, colite, incluindo, mas não se limitando as crises agudas da doença de Crohn e inflamações de colite ulcerosa, respectivamente, da mucosa do duodeno ou do cólon. Também está incluído aqui a doença do viajante. A expressão "doenças e/ou distúrbios gástricos e/ou intestinais" pode também estar relacionada, preferencialmente, com doenças 11 crónicas e que espontaneamente recorrentes do tracto gastrointestinal tal como a doença de Crohn (enteritis regionalis) e a colite ulcerosa (colítís ulcerosa). A expressão "doenças e/ou distúrbios gástricos e/ou intestinais" refere-se, particularmente, a doenças que implicam lesões em superfícies de mucosas. Como tal, os estados de doença a serem tratados pelos processos e pelas composições farmacêuticas aqui descritas podem também incluir distúrbios e danos do tubo digestivo, incluindo a boca, o esófago, o estômago e o intestino delgado e o grosso, bem como para a protecção e o tratamento de tecidos que estão fora do tubo digestivo. Estas lesões podem ser causadas por: terapia de radiação ou quimioterapia para o tratamento do cancro, qualquer outro fármaco incluindo álcool o qual danifica o tubo digestivo, exposição acidental a radiação ou a uma substância cáustica, infecção, um distúrbio digestivo incluindo, mas não se limitando a dispépsia não ulcerosa, gastrite, úlcera péptica ou duodenal, cancro gástrico, linfoma de MALT, síndroma de Menetier, doença de refluxo gastro-esofágico e doença de Crohn. A presente invenção refere-se assim à utilização de um microrganismo, tal como descrito antes para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças e/ou distúrbios gástricos e/ou intestinais. A presente invenção também se refere à utilização de um microrganismo tal como descrito antes para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias gastrointestinais agudas, colite aguda, crises agudas da doença de Crohn e colite ulcerosa e para o tratamento de doenças crónicas e que ocorrem 12 espontaneamente do tracto gastrointestinal que compreende a doença de Crohn (enteritis regionalis) e a colite ulcerosa (colitis ulcerosa). A presente invenção refere-se ainda à utilização de um microrganismo, tal como descrito antes para a preparação de um medicamento para inibir a formação de lesões causadas por doenças e/ou distúrbios gástricos e/ou intestinais. A administração do microrganismo pode ser feita oralmente ou por meio de qualquer outro processo conhecido na técnica que permita que o microrganismo entre nos locais desejados a serem tratados, tal como por exemplo, anal, vaginal. 0 microrganismo pode ser aplicado num meio nutritivo, isto é, um meio que contém uma substância ou substâncias que sustêm (pelo menos in vitro) a actividade metabólica do microrganismo. Essas substâncias podem manter a viabilidade se não houver crescimento do microrganismo. Essas substâncias podem incluir uma fonte de energia tal como a glicose, aminoácidos, etc. 0 indivíduo ao qual o microrganismo é administrado pode ser um ser humano ou um animal.

Num contexto terapêutico, isto é, em que o efeito biológico da libertação do polipéptido num indivíduo e benéfico para esse indivíduo, a administração é feita de preferência, numa 'quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico' sendo isto suficiente para mostrar o benefício para o paciente. Tal benefício pode ser pelo menos a melhoria de um sintoma. A quantidade real administrada e a taxa e o período de administração decorrido, vai depender do objectivo da administração, por exemplo o efeito biológico pretendido tendo em vista a natureza e a 13 gravidade do problema e é objecto da optimização de rotina. As prescrições do tratamento, por exemplo decisões sobre a dosagem etc., estão dentro da responsabilidade de médicos de clinica geral e de outros médicos.

Pode-se administrar, de acordo com a presente invenção, uma composição que compreende microrganismos, tal como descritos aqui, isoladamente ou em combinação com outros tratamentos, quer simultaneamente ou em sequencialmente. A presente invenção também tem por objecto um processo para produzir um microrganismo que liberta um péptido trifólio in vivo, tal como definido antes, que compreende a transformação de um microrganismo com um vector recombinante que comporta uma sequência de codificação de um polipéptido trifólio, sob o controlo de um promotor conveniente e uma sequência de sinal de segregação bacteriana apropriada. A referida sequência de sinal de secreção bacteriana pode ser qualquer sequência conhecida na técnica para executar a referida função. Preferencialmente, para L. lactis, o referido sinal de secreção é a sequência de sinal de secreção de usp45 de L. lactis. A referida sequência do promotor pode ser de qualquer promotor que permita a expressão da referida sequência de codificação no referido microrganismo. Os exemplos dados na secção de exemplos incluem o conhecido promotor T7 do fago de E. coli indutivel e o promotor PI constitutivo conhecido de L. lactis. A presente invenção também tem por objecto um vector recombinante que compreende pelo menos uma parte de um 14 péptido trifólio que codifica a sequência sob o controlo de um promotor conveniente e de uma sequência de sinal de secreção conveniente. 0 referido vector recombinante pode ser utilizado para libertar, in vivo, pelo menos uma parte de uma sequência de péptido trifólio a qual pode exercer um efeito de cura em áreas danificadas das superfícies de mucosas. A presente invenção ainda tem por objecto um vector recombinante, tal como definido antes, que tem uma sequência de nucleótidos como representado por qualquer uma das de SEQ ID Nos 1, 2 ou 4.

Os exemplos seguintes servem simplesmente para ilustrar a presente invenção e não devem ser interpretados coma limitando, de nenhuma forma, a presente invenção.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: Visão geral dos plasmidos utilizados.

Figura la: Mapas esquemáticos dos plasmidos pL2mTFFlvl e pTlmTFFl. 0 T7 é o principal promotor tardio de T7 de colifago (Studier e Moffatt, 1986) . Pl é o promotor de Lactococcus tal como em Waterfield et al., (1995), usp45S é um fragmento de ADN que codifica o péptido de sinal de secreção da proteína Usp45 de Lactococcus (van Asseldonck et al., 1990), tfflm é um fragmento de ADN que codifica a parte madura de TFF1 de murino, tfflvlm é um fragmento de ADN que codifica um TFF1 de murino maduro truncado (a que faltam dois resíduos aa de terminais amino), Cm é o marcador de selecção de cloranfenicol, Em e o marcador de selecção de 15 eritromicina. Para pPICmTFFl: PPMF é o factor de emparceiramento α de pré-produção de Saccharomyces cerevisiae; o promotor A0X1 é o promotor da oxidase do álcool; o termo A0X1 significa o terminador da oxidase do álcool; HIS4 é o gene da desidrogenasse de histidol; Ori é uma origem de replicação de Escherichia coli; AOXfr é um fragmento do 3' do gene da oxidase do álcool; AmpR é o gene de resistência à ampicilina. Todos os componentes são do plasmido pPIC9 (Invitrogen).

Figura 1b: Sequência de ADN do plasmido pL2mTFFlvl (SEQ ID NO 1).

Figura 1c: Sequência de ADN do plasmido (SEQ ID NO 2) .

Figura Id: Sequência de ADN do plasmido pPICmTFFl (SEQ ID NO 3).

Figura 2: EGPA-SDS (electroforese em gel de poliacrilamida e sulfato de dodecilo e sódio). As diferentes fracções de proteina derivam do meio de células MG1820 de L. lactis [pILPOL] (controlo), MG1820 [pILPOL; pL2mTFFlvl], MG1363 [pTREXl] ou MG1363 [pTlmTFFl]. As duas faixas do lado esquerdo contêm proteínas marcadoras em que o peso molecular é dado em kDa. As proteínas foram visualizadas utilizando a coloração com azul de Coomassie.

Figura 3: Representação das classificações histológicas da parte distai do cólon. Gráfico de topo do lado esquerdo: dano de epitélio (parte distai do cólon) . Gráfico de topo do lado direito: infiltração inflamatória (parte distai do cólon). Gráfico do fundo: soma das 16 classificações histológicas dos gráficos do topo (parte distai do cólon) .

Figura 4: Representação das classificações histológicas da parte distai do cólon de murganhos saudáveis (controlo) ou de murganhos com colite DSS aguda sem tratamento (DSS) ou depois de tratamento com células de MG1363, MG1363 [pTREXI] ou MG1363 [pTITFFlm].

Figura 5: Titulações da citocina pro-inflamatória em tecidos do cólon com inflamação aguda. Interleucina-ΐβ no cólon distai (esquerda) e o interferão-γ no cólon médio e distai (direita) de murganhos saudáveis (controlo) ou de murganhos com colite DSS aguda sem tratamento (DSS) ou depois de tratamento com células de MG1363, MG1363 [pTREXI] ou MG1363 [pTITFFlm].

Figura 6: EGPA-SDS de fracções de proteína a partir do meio de Pichia pastoris seleccionado (GST115::pPICmTFFl) e do controlo negativo. 0 clone produtor de mTFFl que foi além disso utilizado para a produção de mTFFl é indicado por uma ponta de seta. As proteínas foram visualizadas por se utilizar a coloração com azul de Coomassie.

Figura 7: A: Modelo de filtração em gel de TFFIm purificado (Superdex 75; Pharmacia) . A proteína de TFFIm eluída em dois picos com a maioria a estar presente nas fracções 14, 15, 16 (dímero) e 20 (monómero) . A identidade da proteína nestas fracções foi mostrada como sendo a mTFFl por EGPA-SDS (inserção). As proteínas foram visualizadas utilizando a coloração com azul de Coomassie. B: redução e não redução de mTFFl purificado por SDS-PAGE. As colunas da esquerda são marcadores da dimensão, das dimensões indicadas, coloração com azul brilhante de Coomassie. 17

Representação das

Figura 8: Representação das classificações histológicas da parte distai do cólon de murganhos tratados por injecção intraperitoneal (i. p.), inoculação oral (oral) e rectal (rectal), antes (pre), durante (du) ou depois (po) da instalação da colite induzida por DSS aguda. DSSdu representa as classificações de murganhos tratados com SBF de colite por DSS aguda induzida.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Clonagem e expressão de TTF1 de murganho (TTFlm) Meio de cultura O GM17 é M17 (Difco, Detroit) complementado com 0,5 p/v % de glicose. O meio M9 contém, por litro: 6g de

Na2HP04, 3 g de KH2P04, 1 g de NH4C1, 0,5 g de NaCl, 2 mmole de MgS04, 0,1 mmole de CaCl2 e 5 g de Casitone (Difco). Ο M9B é M9 complementado com 2,1 g de NaHC03 e 2,65 g de Na2C03 por litro. O GM9B é M9B complementado com 0,5 % p/v de glicose. O LM9B é M9B complementado com 0,5 % p/v de lactose.

Quando apropriado, os antibióticos, eritromicina (Er) ou cloranfenicol (Cm), foram adicionados aos respectivos meios em concentrações finais de 5 yg/ml cada um. A designação utilizada para indicar a presença de antibiótico é, por exemplo, GM17Er, LM9BCm, etc. Os meios sólidos continham 1,2 % de agar. Técnicas de ADN recombinante

As enzimas que modificam o ADN e as endonucleases de restrição foram utilizadas em condições padrão e nos 18 tampões recomendados pelos fabricantes. As técnicas gerais de clonagem molecular e a electroforese do ADN e das proteínas foram realizadas de acordo com procedimentos padrão. 0 L. lactis foi transformado por electroporação de células que cresceram na presença de glicina (Wells et al., 1993a). 0 ADN de plasmido foi purificado por rotina utilizando o estojo de plasmido da Qiagen.

Amplificação de TFFlm por RCP A reacção de RCP foi realizada num plasmido contendo o ADNc de TFFlm (Lefebvre, 1993) utilizando iniciadores de oligonucleótido de TFFlSm e TFFlAm. 0 iniciador de TFFlSm corresponde aos primeiros 18 nucleótidos do da hélice paralela de TFFlm desde o primeiro nucleótido atrás da sequência de sinal. 0 iniciador TFFlAm é complementar dos últimos 26 nucleótidos da hélice paralela de TFFlm incluindo o codão de paragem e introduz um local extra de restrição Spel. TFFlSm: 5'-CAGGCCCAGCCCAGGCC -3' (SEQ ID NO 4) TFFlAm: 5'-GCACTAGTTAGAAGGGACATTCTTCTTCTTG AG-3' (SEQ ID NO 5) em que ACTAGT em TFFlAm representa um local Spel. A amplificação por RCP foi realizada utilizando a polimerase de ADN Vent™ (New England Biolabs (Beverly, EUA) a qual dá um produto de RCP que transporta extremidades cegas. A mistura da RCP consistiu em 2 unidades de polimerase de ADN de Vent™, 10 μΐ de tampão de Vent (termopol), 4 μΐ dXTP's (máximo 0,5 mM), 5 μΐ (0,5 μΜ) de cada iniciador, 1 μΐ (50 ng) do ADM matriz e 74 μΐ de H20. Realizaram-se seis reacções diferindo nas suas concentrações finais de MgS04, ajustadas a 0, 1, 2, 3, 4 e 5 mM respectivamente. Os ciclos de amplificação de RCP foram: T0 para 300" a 94 °C, Ti 19 para 45" a 94 °C, T2 para 30" a 60 °C, T3 para 20" a 72 °C, T4 para 10" a 20 °C. Estes ciclos, de Ti a T3, foram realizados 30 vezes. A amplificação de RCP com estes iniciadores produziu o gene para TFFlm maduro ao qual falta a sequência de sinal e que inclui um local adicional de restrição de Spel. Depois da verificação através de electroforese em gel, o fragmento amplificado apareceu como uma banda na variação de comprimento esperada. A extremidade de 5' da sequência de TFFlm contém duas sequências-alvo possíveis complementares ao iniciador dianteiro. Como consequência, dois fragmentos de 202 pares de bases e 208 pares de bases respectivamente podem ser amplificados a partir do ADNc de TFF1 através da utilização dos iniciadores mencionados. Não se espera que estes fragmentos sejam separados por electroforese em gel de agarose.

Construção de plasmidos

Utilizaram-se dois tipos diferentes de vectores como receptores para o péptido trifólio de TFFlm que codifica o fragmento de RCP. A estrutura primária dos dois vectores parentais - pTINX, derivado de pTREXl (Wells e Schofield, 1996) e pLET2NX, derivado de pLET2N (Steidler at al., 1995) - contém os seguintes elementos comuns: um promotor (T7 ou Pl), a sequência de sinal de secreção de usp45 de L. Lactis (van Asseldonk at al., 1990 e o pedido de patente europeia publicada com o No. 0 455 280), modificada para conter um local de restrição Nael que se sobrepõe à sequência que codifica o último resíduo aa (Steidler at al., 1995), e um local de restrição de Spel a jusante. Os plasmidos derivados de pTINX especificam a resistência à eritromicina; os plasmidos derivados de pLET2NX especificam 20 a resistência ao cloranfenicol. Os fragmentos de RCP foram tratados durante 1 hora a 37 °C utilizando 50 pL de solução de ADN, 10 pL de tampão de Sped, 50 unidades de SpeI, 10 unidades de quinase de polinucleótido T4 (Gibco BRL, Bethesda, EUA), ATP 0,5 mM, ajustado para pH 7,5 e 36 pL de H20. O vector pTlNX foi digerido durante 1 hora a 37 °C utilizando 10 a 20 pL de ADN, tampão de NaeI, 10 unidades de NaeI, 50 unidades de Spel, 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitelo (Boehringer, Mannheim, Alemanha) e 73 a 63 pL de H20. Depois de 30 minutos de incubação, adicionou-se novamente à mistura 50 unidades de Spel e 10 unidades de Nael. As enzimas de restrição foram inactivadas e extraídas a partir da mistura através de extracção com fenol/clorofórmio. Depois da digestão de restrição, a banda derivada de TFFlm, que compreende um fragmento de 195 pb e um fragmento de 201 pb, tal como descrito antes em "Amplificação por RCP de TFFl de murganho (TFFlm)" e as partes do vector foram excisadas a partir de gel de agarose. A seguir à ligação dos respectivos fragmentos de RCP com do vector durante, 45 minutos, a 16 °C utilizando a ligase de ADN T4 "pronta a usar" (Pharmacia Biotech, Reino Unido) obtiveram-se os plasmidos recombinantes contendo o cistrão de TFFlm como uma fusão em rede com a sequência de sinal de secreção de usp45, sob o controlo do promotor. O plasmido pTl TFFlm (figura 1 a), que contém o promotor PI constitutivo de L. lactis, resultou da ligação da parte purificada do vector Nael - Spel de pTlNX e do corte de Spel e do fragmento de RCP de 5' fosforilado. O plasmido pL2 TFFlvlm (figura 1 a), que contém o promotor T7 indutível de E. coli, resultou da ligação da parte purificada do vector NaeI - Spel de pLET2N e do corte 21 de Spel e do fragmento de RCP de 5' fosforilado. 0 promotor T7 só pode ser activado através da polimerase de ARN de T7 da mesma origem codificada, por exemplo, pelo plasmido pILPOL. Este plasmido está presente na estirpe MG1820 de L. lactis [pILPOL] (Wells et al., 1993c).

Para a análise estrutural transformou-se o plasmido pTITFFlm na estirpe MG1363 de L. lactis. As células cresceram em placas de GM17Er. As colónias cresceram em 2,5 mL de GM17Er e isolou-se o plasmido. Por meio de uma digestão analítica, comparou-se o modelo de restrição do vector pTINX (2 pL de ADN (pTINX), 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 pL de tampão de Spel e 15 pL de H20) e 0 plasmido recombinante isolado (5 pL de ADN, 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 pL de tampão de Spel, 0,25 pL de uma solução normal de 10 pg/mL de Rnase A, 12 pL de H20) . Os plasmidos foram cortados com EcoRI e Spel durante 1 h, a 37 °C. Nos plasmidos de referência, prevêem-se dois fragmentos lineares de 907 pb e 4999 pb. No pTITFFlm, prevê-se duas bandas de 499 pb e 4999 pb. Os tamanhos dos fragmentos obtidos experimentalmente, tal como visualizado através de electroforese em gel de agarose e de coloração com EtBr, foram consistentes com os comprimentos previstos. De cada plasmido recombinante, conservou-se uma cultura positiva em placas de GMl7Er para se obter colónias isoladas. Uma colónia foi posteriormente inoculada em 100 mL de meio de GM17Er e cresceu até à saturação. Recolheram-se as células foram e purificaram-se os plasmidos. A sue estrutura física foi verificada através da análise da enzima de restrição e de electroforese em gel de agarose. Além disso, a análise da sequência revelou que o cistrão de TFFlm tinha sido ligado perfeitamente na estrutura com a sequência líder de secreção de usp45. O pTITFFlm contém uma inserção de 208 pb a qual representa a sequência de 22 codificação completa do TFFlm maduro (como descrito antes em "A amplificação por RCP de TFFl de murganho (TFFlm)").

Para a análise estrutural, os plasmidos pL2TFFlvlm foram transformados na estirpe MG1820 [pILPOL]. As células cresceram em placas de GMl7Cm. As colónias cresceram em 2,5 mL de GM17Cm e isolaram-se os plasmidos. Por meio de uma digestão analítica, comparou-se o modelo de restrição do vector pLET2NX (2 pL de ADN (pLET2NX), 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 pL de tampão de SpeI e 15 pL de H2O) e o plasmido recombinante isolado (5 pL de ADN, 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 pL de tampão de Spel, 0,25 pL de uma solução normal de 10 pg/mL de Rnase A, 12 pL de H2O) . Os plasmidos recombinantes foram cortados com EcoRI e Spel durante 1 h, a 37 °C. Nos plasmidos de referência, prevêem-se dois fragmentos lineares de 907 pb e 4 650 pb. No pL2TFFlm, prevêem-se duas bandas de 499 pb e 4650 pb. Os tamanhos dos fragmentos obtidos experimentalmente, tal como visualizado através de electroforese em gel de agarose e de coloração com EtBr, foram consistentes com os comprimentos previstos. De cada plasmido recombinante, conservou-se uma cultura positiva em placas de GM17Cm para se obter cólonias isoladas. Uma colónia foi posteriormente inoculada em 100 mL de meio de GMl7Cm e cresceu até à saturação. Recolheram-se as células foram e purificou-se o plasmido. A sua estrutura física foi verificada através da análise da enzima de restrição e de electroforese em gel de agarose. Além disso, a análise da sequência revelou que o cistrão de TFFlm tinha sido ligado na estrutura com a sequência líder de secreção de usp45. A análise, além disso, mostrou que pL2mTFFlvl contém uma inserção de 202 pb (consequentemente a que faltam os dois primeiros resíduos aa dos terminais amino de TFFlm maduro; como descrito antes em "A amplificação por RCP de TFFl de 23 murganho (TFFlm)"). As sequências dos plasmidos recombinantes estão ilustradas nas figuras lb e lc. As suas sequências completas foram compiladas a partir das sequências publicadas das partes constitutivas. Além disso, as secções relevantes das sequências tal como os fragmentos de RCP e os pontos de junção da ligação foram experimentalmente verificadas.

Expressão da proteína em L. Lactis transformado

As estirpes de L. lactis foram transformadas com os plasmidos como construído antes. Para a transformação do plasmido de pTlTFFlm, utilizou-se a estirpe MG 1363 de L. lactis (Gasson, 1983) . Para a transformação do plasmido de pL2TFFlvlm, utilizou-se a estirpe MG 1820 de L. lactis (pILPOL) (Maeda e Gasson, 1986). A expressão das proteínas através destas estirpes transformação de L. lactis foi detectada por EGPA-SDS.

Para se prepararem as fracções de sobrenadante de cultura, as células cresceram durante 20 horas, a 28 °C, em cinco mL de meio de GM17Er para o plasmido pTlTFFlm ou meio de GM17Cm para o plasmido pL2TFFlmvl. As culturas foram diluídas a 1/100 em cinco mL quer de meio GM17Er ou GMl7Cm e cresceram durante 3 horas a 28 °C. As células foram recolhidas por centrifugação a 2800 rpm durante 20 minutos e novamente suspensas em cinco mL do meio apropriado, isto é, GM9BEr para as células MG1363 ou LM9BCm para as células MG1820 [pILPOL]. Depois de mais cinco horas de crescimento as células foram peletizadas. As proteínas presentes nas fracções do meio foram recuperadas através da extracção em fenol e da precipitação em etanol. 24

As proteínas expressas na fracção do sobrenadante da cultura de uma estirpe de controlo MG1820 de L. lactis comparadas com as estirpes MG1820 de L. lactis transformadas com [pILPOL; pL2TFFlvlm] e MG1363 de L. lactis transformada com [pTREXl; pTITFFlm] estão ilustradas na figura 2. Esta figura mostra uma banda extra de proteína com o tamanho apropriado (indicado pela ponta da seta) em MG1820 [pL2TFFlvlm] e em MG1363 [pTITFFlm] quando comparada com os controlos. Como se pode observar a partir desta figura, a expressão do gene recombinante é bastante baixa. Isto produz um resultado in vivo observado que surpreende, uma vez que outros utilizam os péptidos trifólios purificados em terapias para a reparação do dano gástrico e intestinal a níveis dramaticamente mais altos; por exemplo Tran et al. (1999) utilizaram diariamente a aplicação intrarectal do TTF2 recombinante humano, a níveis de 2,5 mg/kg de peso de corpo durante cinco dias pare se obter uma redução no índice inflamatório da colite experimentalmente instalada em ratos (administração intracolónica de ácido sulfónico de dinitrobenzeno em álcool).

Exemplo 2: Ensaio in vivo de MG1363 [pTlmTFFl]

Preparação de células para administração intragástrica

Os transformantes das estirpes MG1363 [pTREXl], MG1363 [pTITFFlm] de L. lactis, foram conservados em placas de GM17Er e cresceram, durante a noite, a 28 °C. Em cada caso uma única colónia cresceu posteriormente, durante a noite, a 28 °C em 15 mL de meio GM17Er. Adicionou-se, a esta cultura, 15 mL de glicerol a 100 %, para conservar as referidas células a -20 °C. Em cada dia, pode-se inocular a quantidade necessária de células para o tratamento de murganhos. Com esta finalidade, a cultura foi diluída a 25 1/200 em 10 mL de meio GM17Er. Depois de um mínimo de 20 horas de crescimento a 30 °C, recolheram-se as células por centrifugação durante 15 minutos a 2800 rpm. As células foram depois novamente suspensas em 1 mL de M9B sem antibiótico.

Ensaios in vivo em murganhos com colite aguda O efeito dos péptidos trifólios expressos a partir desta bactéria de L. lactis foi ensaiado em murganhos que sofrem de colite aguda. Vinte e um murganhos fêmeas Balb/c receberam DSS a 5 % (sulfato de dextrano e sódio) dissolvido na sua água potável durante 7 dias. Desta maneira, a colite aguda foi induzida (Kojouharoff et al., 1997) . Para as finalidades terapêuticas estes murganhos foram inoculados oralmente, diariamente, por meio de um catéter gástrico utilizando 100 pL de suspensão bacteriana (um mínimo de lxlO8 células) desde o dia 1 até ao dia 7 do tratamento com DSS. Como indicado, inocularam-se seis murganhos com células de MG1363 [pTREXl], inocularam-se seis murganhos com células de MG1363 [pTlTFFlm] e três murganhos não foram inoculados (controlo de DSS). No dia 8 depois da indução da colite sacrificaram-se os murganhos foram examinaram-se imunologicamente e histologicamente. O ensaio imunológico dos soros mostrou que os murganhos tratados não mostraram uma resposta imunitária face às proteínas expressas. Colheu-se o soro dos murganhos que foram sangrados no dia 8. Este soro foi analisado através de Western blotting para verificar se continha anticorpos contra as proteínas presentes nas fracções do meio das células de L. lactis. As fracções do meio utilizadas derivaram das estirpes MG1363 [pTREXl] e MG1363 [pTlmTFFl] de L. lactis. Um equivalente de 1 mL de fracções 26 concentradas de meio (extracção de fenol e precipitação de etanol) foi analisado através de electroforese em gel de poliacrilamida-SDS (20 %) . Depois da análise por blotting dos filtros de nitrocelulose, os filtros foram incubados durante 1 hora com as soluções de soro dos 4 grupos de murganhos. O soro foi diluído 500 vezes em 20 mL de tampão de bloqueio de nitrocelulose (Blotto: lOOml lOx SBF, 150ml de NaCl 1 M, 2ml de Triton X-100, 25 g de leite em pó sem gordura, água até a um volume total de 1 litro) . Como anticorpo secundário utilizou-se IgG de ovelha anti-murganho acoplada a peroxidase de armorácia (HRP). Utilizando soro diluído 500 vezes, não se detectou nenhum sinal. A análise histológica foi feita em clones dos murganhos tratados. Os clones foram cortados na direcção do comprimento e divididos em três porções iguais: as partes distai (mais perto do ânus), média e proximal. Estas partes do cólon foram analisadas histologicamente depois de uma fixação durante a noite em formaldeido a 3,7 % (em SBF), seguido do embebimento em parafina, assegurando o posicionamento vertical das amostras de tecido nos blocos de parafina. De cada amostra de tecido, foram feitas três secções longitudinais espessas paralelas de 3 ym, uniformemente espaçadas na parte superior da amostra. Estas secções transversais foram coradas com hematoxilina/eosina. A análise histológica foi executada de uma forma cega, significando que os marcadores nas lâminas foram cobertos antes da pontuação das secções. As lâminas que transportam as secções obtidas a partir dos vários grupos de murganhos foram misturadas aleatoriamente antes do exame ao microscópio. A cada lâmina atribuiu-se depois uma pontuação histológica (variando de 0 a 5), de acordo com a descrição sintomática como definido no quadro 1. 27

Para cada murganho e para cada parte do cólon, calculou-se a pontuação média das três secções. Nas partes distai e média do cólon, a inflamação, que consistia num dano epitelial e numa infiltração, foi a mais pronunciada Na parte proximal, praticamente não se observou inflamação. A média da pontuação histológica foi calculada tanto para a parte distai como para a parte média do cólon, por grupo de animais. A soma final da pontuação histológica é a soma das duas pontuações separadas (soma da pontuação = pontuação do dano epitelial + pontuação da infiltração) e é uma medida do grau de inflamação. A soma das pontuações histológicas da parte distai do cólon para cada um dos grupos de murganhos está ilustrada na figura 3. A partir das pontuações histológicas para a parte distai do cólon, como estabelecido na figura 3, pode-se concluir que há uma redução clara da inflamação depois da inoculação dos murganhos com células de L. lactis que produzem péptidos trifólios. Os murganhos que receberam as células de L. lactis transformadas de [pTITFFlm] mostram uma redução significativa da inflamação de mais de 65 %.

Como se pode ver, a partir da figura 3, a infiltração inflamatória e o dano epitelial na parte distai do cólon estão significativamente reduzidos depois da inoculação com estirpes de L. lactis recombinantes que segregam o polipéptido de TFFlm.

Estes resultados foram confirmados numa experiência separada que foi conduzida do mesmo modo, incluindo grupos maiores (tamanho do grupo =10) e mais grupos de controlo. A figura 4 mostra as pontuações histológicas (obtidas como descrito antes) de murganhos de controlo saudáveis (controlo) e de murganhos que receberam DSS, como descrito, 28 quer deixados sem tratamento (DSS), quer tratados (como descrito antes) com MG1363, MG1363 [pTlTREXl] ou MG1363 [pTImTFFI] como indicado. A experiência mostra uma redução clara e significativa da inflamação intestinal no grupo de murganhos tratados com MG1363 [pTITFFlm] A última experiência também foi avaliada por meio da determinação dos niveis de interleucina-ΐβ (IL-Ιβ e interferão-γ (IFN-γ), ambos citocinas pró-inflamatórias bem conhecidas dos especialistas. Os murganhos (n = 10) foram inoculados com as estirpes indicadas como descrito. Controlo = murganhos saudáveis, DSS = murganhos que recebem DSS a 5 % na água potável sem qualquer tratamento. O cólon foi preparado e isolaram-se as áreas com superfícies iguais por meio de perfurador (0=4 mm). Sobrepôs-se às amostras de tecido de cada grupo 500 yL de RPMI + soro bovino fetal a 10 % e incubou-se durante a noite, a 37 °C. Recolheu-se o sobrenadante e titulou-se o teor de citocina por meio de ELISA. A quantidade de IL-Ιβ e IFN-γ nos respectivos tecidos está ilustrada na figura 5. Os resultados mostram uma redução clara nestas citocinas pró-inflamatórias em grupos de murganhos tratados com MG1363 [pTITFFlm].

Exemplo 3: Comparação do tratamento com MG1363 [pTlTFFl] e TFFl purificado

Preparação de plasmidos

Para a expressão da forma de Pichia pastoris de TFFlm os requerentes prepararam o plasmido pPICTFFlm. Para isto, o gene TFFlm foi amplificado por RCP como descrito (amplificação de RCP de TFFl de murganho) . Este fragmento foi ligado no local de restrição aberto de NaeI de um derivado de pPIC9 (Invitrogen). A mistura de ligação é 29 transformada com MC1061 de E. coli e os clones correctamente reunidos foram identificados através de análise de restrição e de sequenciação de ADN (sequência como na figura ld) . No plasmido resultante, pPICTFFlm, a sequência de TFFlm funde-se na estrutura com o sinal de secreção prepro do factor de emparelhamento α de Sacharomices cerevisiae.

Expressão e purificação de TFFlm 0 plasmido de pPICFFlm foi transferido para GST115 de Pichia pastoris através de um processo como descrito em Logghe (1995) e os clones positivos, os quais tinham a unidade integrada de TFFlm no local de his4, foram seleccionados através de identificação por RCP. Estes clones positivos foram induzidos com metanol e examinados quanto à expressão pela análise de proteina do sobrenadante da cultura e um clone que mostrou, quando em comparação com o controlo negativo (negativo), uma expressão especialmente elevada de uma banda extra a 6,5 kDa (GST115::pPICTFFlm) foi conservado para um trabalho adicional (figura 6, indicada pela ponta da seta). A banda extra de proteina foi identificada como TFFlm pela sequenciação da proteina. 0 procedimento da expressão foi ampliado de forma optimizada e optimizado para uma cultura de 16 L e o TFFlm foi purificado a partir do sobrenadante da cultura.

Para isto, concentraram-se os sobrenadantes de GST115::pPICTFFlm induzidos por metanol por filtração tangencial (pró-fluxo M12 da Millipore, cortado a 3000 Da) e dialisou-se a pH 7,4 tampão de fosfato a 0,02 Μ. O TFFlm foi purificado a partir deste concentrado numa coluna permutadora de iões (coluna Q da Biorad). As proteínas foram eluidas a partir da coluna através de um gradiente de 30 sal isocracional. 0 TFFlm resultante era mais do que 99 % puro e foi mais concentrado. A preparação final contém menos do que 160 ng de LPS/mL. Esta quantidade de LPS está dentro dos limites aceitáveis e a proteína pS2 pode ser utilizada em futuras experiências.

No seguimento da análise numa coluna de exclusão por dimensão de TFFlm purificado (Superdex 75; Pharmacia) os requerentes concluíram que 7,5 % do TFFlm está na forma monomérica e 92,5 % está na forma dimérica (figura 7A) . Isto foi confirmado por redução versus EGPA-SDS não redutora do TFFlm purificado (figura 7B).

Avaliação da actividade biológica de TFFl purificado

Uma característica bem conhecida da proteína de TFFl é que depois da administração da proteína a monocamadas de célula Caco-2 baixa significativamente a expressão da superfície de caderina-E (Liu et al., 1997). Os requerentes demonstraram um abaixamento de 10 % da expressão na superfície de caderina-E depois da preparação descrita antes de TFFlm ter sido administrada a monocamadas de Caco-2.

Tratamento da colite aguda em murinos com o TFFlm purificado:

Para a indução da colite aguda os murganhos receberam sulfato de dextrano e sódio a 6 % (DSS, PM 40 000) dissolvido em água potável, durante 7 dias (Kojouharoff et al., 1997). Os murganhos utilizados nas experiências foram combinados por idade e receberam, simultaneamente, o tratamento com DSS. Para os objectivos terapêuticos, trataram-se os murganhos diariamente com 50 yg de TFFlm em 31 200 yL de SBF antes da administração de DSS desde o dia 7 a 0 (grupos de pré-tratamento), durante a administração de DSS desde o dia 0 a 7 (grupos durante o tratamento) e depois da administração de DSS desde o dia 7 a 14 (grupos de pós-tratamento). Para estudar diferentes vias para libertar o TFFlm, os murganhos foram tratados com uma injecção intraperitoneal (i.p.), inoculação intragástrica e administração rectal em cada instalação. Os murganhos foram mortos no 8o dia depois de receberem água potável sem DSS durante um dia (grupos de pré-tratamento e os grupos durante o tratamento) e no 14° dia depois de receberem a água potável sem DSS durante sete dias (grupos de pós-tratamento) . Os grupos de controlo não tratados com DSS na água potável foram mortos no 8o dia e no 14° dia. Todos os grupos tinham 9 murganhos. Os resultados estão representados na figura 8 e mostram claramente que em nenhum regime de tratamento se observou qualquer melhoramento estatisticamente significativo. Isto torna a presente invenção, aqui descrita, surpreendente uma vez que se observou uma clara melhoria (figura 3 e 4). Isto significa que a libertação de TFFl através de L. lactis deu uma contribuição essencial pare o efeito terapêutico observado.

Quadro 1. Descrição sintomática das pontuações histológicas

Pontuação Dano no epitélio Infiltração inflamatória* 0 Morfologia normal Nenhuma infiltração 1 Perda de algumas células caliciformes Infiltração à volta da base dos foliculos 2 Perda comum de células caliciformes Infiltração que atinge as mucosas da Lamina muscularis 3 Perda dos foliculos Infiltração extensiva que atinge as mucosas da Lamina muscularis e espessamento da mucosa com edema proeminente 4 Perda abundante dos foliculos Infiltração que atinge as mucosas da Lamina das submucosas *A infiltração inflamatória inclui a infiltração dos granulócitos, macrófagos e linfócitos 32

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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw <120> Libertação de péptidos trifólios

<130> VIB-013-EP-DIV <140> < 141 > <150> 99870143.7 <151> 1999-07-05 <160> 5 <170> Patentin Ver. 2.1

<210> 1 <211> 5142 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <2 2 3> Descrição da sequência artificial: estrutura sintética: plasmido 37 <400> 1 gaattcgagc tcggtacccg gggatctcga tcccgcgaaa ttaatacgac tcactatagg 60 gagaccacaa cggcttccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca 120 tatgaaaaaa aagattatct cagctatttt aatgtctaca gtcatacttt ctgctgcagc 180 cccgttgtca ggtgtttacg cccaggccca ggcccaggcc caggaagaaa eatgtatcat 240 ggccccccgg gagaggataa attgtggctt ccccggtgtc accgcccagc agtgcacgga 300 gagaggttge tgttttgatg acagtgtccg gggattcccg tggtgettcc accecatggc 360 catcgagaac actcaagaag aagaatgtcc cttctaacta gtagatccgg ctgctaacaa 420 agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct 480 tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatg 540 acctgcaggc atgcaagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaáaac 600 cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctgatttcac 660 tttttgcatt ctacaaactg cataactcat atgtaaatcg ctccttttta ggtggcacaa 720 atgtgaggca ttttcgctct ttccggcgag gctagttacc cttaagttat tggtatgact 780 ggttttaagc gcaaaaaaag ttgcttttte gtacctatta atgtatcgtt ttagaaaacc 840 gactgtaaaa agtacagtcg gcattatctc atattataaa agccagtcat taggcctatc 900 tgacaattcc tgaatagagt tcataaacaa tcctgcatga taaccatcac aaacagaatg 960 atgtacctgt aaagatagcg gtaaatatat tgaattacct ttattaatga attttcctgc 1020 tgtaataatg ggtagaaggt aattactatt attattgata tttaagttaa acceagtaaa 1080 tgaagtccat ggaataatag aaagagaaaa agcattttca ggtataggtg ttttgggãaa 1140 caatttcccc gaaccattat atttctctac atcagaaagg tataaatcat aaaactcttt 1200 gaagtcattc tttacaggag tccaaatacc agagaatgtt ttagatacac catcaaaaat 1260 tgtataaagt ggctctaact tatcccaata acctaactct ccgtcgctat tgtaaccagt 1320 tctaaaagct glattlgagt ttatcaccct tgtcactaag aaaataaatg çagggtaaaa 1380 tttatatcct tcttgtttta tgtttcggta taaaacacta atatcaattt ctgtggttat 1440 actaaaagtc gtttgttggt tcaaataatg attaaatatc tcttttctct tccaattgtc 1500 taaatcaatt ttattaaagt tcatttgata igcctcctaa atttttatct aaagtgaatt 1560 taggaggctt acttgtctgc tttcttcatt agaatcaatc cttttttaaa agtcaatatt 1620 actgtaacat aaatátatat tttaaaaata tcccacttta tccaattttc gtttgttgaa 1680 ctaatgggtg ctttagttga agaaíaaaga ccacattaaa aaatgtggtc ttttgtgttt 1740 ttttaaagga tttgagcgta gegaaaaatc cttttctttc ttatcttgat aataagggta 1800 actattgccg ggatagactg taacattctc. acgcataaaa teccctttca ttttctaatg 1860 taaatctatt accttattat taattcaatt egctcataat taatcctttt tcttattacg 1920 caaaatggcc cgatttaagc acacccttta ttccgttaat gcgccatgac agccatgata 1980 attactaata ctaggagaag ttaataaata cgtaaccaac atgattaaca attattagag 2040 gtcatcgttc aaaatggtat gcgttttgac acatccacta tatatccgtg tcgttctgtc 2100 cactcctgaa tcccattcca gaaattctct agcgattcca gaagtttetc agagtcggaa 2160 agttgaccag acattacgaa ctggcacaga tggtcat&ac ctgaaggaag atctgattgc 2220 ttaactgctt tagttaagac cgaagcgctc gtcgtataac agatgcgatg atgcagacca 2280 atcaacárgg cacctgccat tgctacctgt acagtcaagg atggtagaaa tgttgtcggt 2340 ccttgcacac gaatattacg ccatttgcct gcatattcaa acagctcttc tacgataagg 2400 38 gcacaaatcg eatcgtggaa 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tgccgattgt atatccgatt tatatttatt tttcggtatt 3300 ttttattaaa acgtctcaaa atcgtttctg ggacgtttta gcgtttattt çgtttagtta 3360 tcggcataat cgttaaaaca ggcgttatcg tagcgtaaaa gcccttgagc gtagcgtgct 3420 ttgcagcgaa gatgttgtct gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc 3480 gcagcgtcct tctatttcgg ttggaggagg ctcaagggag tttgagggaa tgaaattccc 3540 tcatgggttt gattttaaaa attgcttgca attttgccga gcggtagcgc tggaaaattt 3600 ttgaaaaaaa tttggaattt ggaaaaaaat ggggggaaag gaagcgaatt ttgcttccgt 3660 actacgaccc cccattaagt gccgagtgcc aatttttgtg ccaaaaacgc tctatcccaa 3720 ctggctcaag ggtttgaggg gtttttcaat cgccaacgaa tcgccaacgt tttcgccaac 3780 gttttttata aatctatatt taagtagctt tattgttgtt tttatgatta caaagtgata 3840 cactaatttt ataaaattat ttgattggag ttttttaaat ggtgatttca gaatcgaaaa 3900 aaagagttat gatttctctg acaaaagagc aagataaaaa attaacagat atggcgaaac 3960 aaaaaggttt ttcaaaatct gcggttgcgg cgttagctat agaagaatat gcaagaaagg 4020 aatcagaaca aaaaaaataa gcgaaagctc gcgtttttag aaggatacga gttttcgcta 4080 cttgtttttg ataaggtaat atatcatggc tattaaaaat actaaagcta gaaattttgg 4140 atttttatta tatcctgact caattcctaa tgattggaaa gaaaaattag agagtttggg 4200 cgtatctatg gctgtcagtc ctttacacga tatggacgaa aaaaaagata aagatacatg 4260 gaatagtagt gatgttatac gaaatggaaa gcactataaa aaaccacact atcacgttat 4320 atatattgca cgaaatcctg taacaataga aagcgttagg aacaagatta agcgaaaatt 4380 ggggaatagt tcagttgctc atgttgagat acttgattat atcaaaggtt catatgaata 4440 tttgactcat gaatcaaagg acgctattgc taagaataaa catatatacg acaaaaaaga 4500 tattttgaac attaatgatt ttgatattga ccgctatata acacttgatg aaagccaaaa 4560 aagagaattg aagaatttac ttttagatat agtggatgac tataatttgg taaatacaaa 4620 agatttaatg gcttttattc gccttagggg agcggagttt ggaattttaa atacgaatga 4680 tgtaaaagat attgtttcaa caaactctag cgcctttaga ttatggtttg agggcaatta 4740 tcagtgtgga tatagagcaa gttatgcaaa ggttcttgat gctgaaacgg gggaaataaa 4800 atgacaaaca aagaaaaaga gttatttgct gaaaatgagg aattaaaaaa agaaattaag 4860 gacttaaaag agcgtattga aagatacaga gaaatggaag ttgaattaag tacaacaata 4920 gatttattga gaggagggat tattgaataa ataaaagccc ccctgacgaa agtcgcgacc 4980 tcgttctttt tttacctctc ggttatgagt tagttcaaat tcgttctttt taggttetaa 5040 atcgtgtttt tcttggaatt gtgctgtttt atcctttacc ttgtctacaa accccttaaa 5100 aacgttttta aaggctttta agccgtctgt acgttcctta ag 5142

<210> 2 <211> 5505 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição da sequência artificial: estrutura sintética: plasmido <400> 2 39 gaactcgatt aagtcatctt acctctttta ttagtttttt cttataatct aatgataaca tmtataat taatctataa accatatccc tctttggaat caaaatttat tatctactcc tttgtagata tgttataata caagtatcag atctgggaga ccacaacggt ttcctactag aaataatttt gtttaacttt agaaaggaga tatacgcatg aaaaaaaaga ttatctcagc tattttaatg tetacagtta tactttetgc tgcagccccg ttgtcaggtg tttacgccca ggcccaggcc caggcccagg cccaggaaga aacatgtatc atggccccee gggagaggat aaattgtggc ttccccggtg tcaccgccca gcagtgcacg gagagaggtt gctgttttga tgacagtgtc cggggattcc cgtggtgctt ccaccccatg gccatcgaga acactcaaga agaagaatgt cccttctaac tagtagatxc ggctgetaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 40 cttgaggggt mttgctga aaggaggaac tatatccgga tgacctgcag gcaagctcta 660 gaatcgatac gattttgaag tggcaacaga taaaaaaaag cagtttaaaa ttgttgr.tga 720 acttttaaaa caagcaaata caatcattgt cgcaacagat 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gatattcacc gaacactagg 1620 gttgctcttg cacactcaag tcccgattca gcaattgctt aagctgccag cggaatgctt 1680 tcatcctaaa ccaaaagtaa acagtgtctt aataaaactt acccgccata ccacagatgt 1740 tccagataaa tattggaage tatatacgta ctttgtttca aaatgggtca atcgagaata 1800 tcgtcaactg tttactaaaa atcagtttca tcaagcaatg aaacacgcca aagtaaacaa 1860 tttaagtacc gttacttatg agcaagtatt gtctattttt aatagttatc tattatttaa 1920 cgggaggaaa taattctatg agtcgctttt gtaaatttgg aaagttacac gttactaaag 1980 ggaatgtaga taaattatta ggtatactac tgacagcttc caaggagcta aagaggtccc 2040 tagcgctctt atcatgggga agctcggatc atatgcaaga caaaataaac tcgcaacagc 2100 acttggagaa atgggacgaa tcgagaaaac cctetttacg ctggattaca tatctaataa 2160 agccgtaagg agacgggttc aaaaaggttt aaataaagga gaagcaatca atgcattagc 2220 tagaactatá ttttttggac aacgtggaga atttagagaa cgtgctctcc aagaccagtt 2280 acaaagagct agtgcactaa acataattat taacgctata agtgtgtgga acactgtata 2340 tatggaaaaa gccgtagãag aattãaaagc aagaggagaa tttagagaag atttaatgcc 2400 atatgcgtgg ccgttaggat gggaacatat caattttctt ggagaataca aatttgaagg 2460 attacatgac actgggcaaa tgaatttacg tcctttacgt ataaaagagc cgttttattc 2520 ttaatataac ggctcttttt atagaaaaaa tccttagcgt ggtttttttc cgaaatgctg 2580 gcggtacccc aagaattaga aatgagtaga tcaaattatt cacgaataga atcaggaaaa 2640 tcagatccaa ccataaaaac actagaacaa attgcaaagt taactaactc aacgctagta 2700 gtggatttaa tcccaaatga gccaacagaa ccagagccag aaacagaatc agaacaagta 2760 acattggatt tagaaatgga agaagaaaaa agcaatgact tcgtgtgagr ccntndataa 2820 tgcacgaaat cgttgcttat ttttttttaa aagcggtata ctagatataa cgaaacaacg 2880 aactgaatag aaacgaaaaa agagccatga cacatttata aaatgtttga cgacatttta 2940 taaatgcata gcccgataag attgccaaac caacgcttat cagttagtca gatgaactct 3000 txcctcgtaa gaagttattt aattaacttt gtttgaagac ggtatataac cgtactatca 3060 ttatataggg aaatcagaga gttttcaagt atctaagcta ctgaatttaa gaattgttaa 3120 gcaatcaatc ggaaatcgtt tgattgcttt ttttgtattc atttatagaa ggtggagttt 3180 gtatgaatca tgatgaatgt aáaacttata taaaaaatag tttattggag ataagaaaat 3240 tagcaaatat ctatacacta gaaacgttta agaaagagtt 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ggacaatgta gaattttttg 4140 atcctaatta ccgttattct ttcaaagaat ggcaagattg gtctttcaaa caaacagata 4200 ataagggctt tactcgttca agtctaacgg ttttaagcgg tacagaaggc aaaaaacaag 4260 tagatgaacc ctggtttaat ctcttattgc acgaaacgaa attttcagga gaaaagggtt 4320 taatagggcg taataacgtc atgtttaccc tctctttagc ctactttagt tcaggctatt 4380 caatcgaaac gtgcgaatat aatatgtttg agtttaataa tcgattagat caacccttag 4440 aagaaaaaga agtaatcaaa attgttagaa gtgccrattc agaaaactat caaggggcta 4500 atagggaata cattaccatt ctttgcaaag cttgggtatc aagtgattta accagtaaag 4560 atttatttgt ccgtcaaggg tggtttaaat tcaagaaaaa aagaagcgaa cgtcaacgtg 4620 ttcatttgtc agaatggaaa gaagatttaa tggcttatat tagcgaaaaa agcgatgtat 4680 41 acaagcctta tttagtgacg accaaaaaag agattagaga agtgctaggc attççtgaac 4740 ggacattaga taaattgcfg aaggtactga aggcgaatca ggaaattttc tttaagatta 4800 aattaggaag aaatggtggc attcaacttg ctagtgttaa atcattgttg ctatcgatca 4860 ttaaagtaaa aaaagaagaa aaagaaagct atataaaggc gctgacaaat tcttttgact 4920 tagagcatac attcattcaa gagactttaá acaagctagc agãacgccct aaaacggaca 4980 tacaactcga tttgtttagc tatgatacag gctgaaaata aaaeccgcac tatgccatta 5040 catttatatc tatgatacgt gtttgttttt tctttgctgt ttagcgaatg attagcagaa 5100 atatacagag taagatttta agggggagaa çgagagagta occcgaaaac 5160 ttttagttgg cttggactga acgaagtgag ggaaãggcta ctaãaãcgtc gaggggcagt 5220 gagagcgaag cgaacacttg attttttaat tttctatctt ttataggtca ttagagtata 5280 cttatttgtc ctataaacta tttagcagca taatagattt attgaatagg tcatttaagt 5340 tgagcatatt agaggaggaa aatcttggag aaatatttga agaacccgat tacatggatt $400 ggattagttc ttgtggttac gtggttttta actaaaagta gtgaattttt gatttttggt 5460 gtgtgtgtct tgttgttagt átttgctagt caaagtgatt aaata 5505

<210> 3 <211> 8241 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: estrutura sintética: plasmido <400> 3 42 agatetaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttr ttgccatccg acatxcaeag 60 gtecattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaaec 180 agcccagtta ttgggcttga ttggagcteg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360 agtqtggggt caaatãgttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca tacegtttgt 540 cttgtttggt attgattgac gaatgcteaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aatacctgct 660 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttr tttatcatca ttattagctt 840 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900 caacttgaga agatcaaaãa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcet 960 tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact 1020 acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 1080 gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 1140 tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa 1200 agagaggctg aagcccaggc ccagçcccag gcccaggccc aggaagaaac atgtatcatg 1260 gccccccggg agaggataaa ttgtggcttc cccggtgtca ccgcecagea gtgcacggag 1320 agaggttgct gttttgatga cagtgtccgg ggattcccgt ggtgcttcca ccccatggcc 1380 atcgagaaca ctcaagaaga agaatgtccc ttctaactag tggcgtagaa ttccctaggg 1440 cggccgcgaa ttaattcgcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg ggcacttáçg 1500 agaagaecgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgcctgagag 1560 atgcaggctt catttttgat acttttttat ttgtaaccta tatagtatag gatttttttt 1620 gtcattttgt ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc agctgatgaa 1680 tatcttgtgg laggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt ggtatttccc 1740 actcctcttc agagtacaga agattaagtg agaagttcgt ttgtgcaagc ttatcgataa 1800 gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa 1860 atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg çaccgtcacc ctggatgctg taggcatagg 1920 cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc 1980 cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt 2040 tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg 2100 agccâctatc gactacgcga tcatggcgac cacacccgtc ctgtggatct atcgaatcta 2160 aatgtaagtt aaaatctcta aataattaaa taagtcccag tttctccata cgaaccttaa 2220 cagcattgcg gtgagcatct agaccttcaa cagcagccag atccatcact gcttggccaa 2280 tatgtttcag teectcagga gttacgtctt gtgaagtgat gaacttctgg aaggttgcag 2340 tgttaactcc gctgtattga cgggcatatc cgtacgttgg caaagtgtgg ttggtaccgg 2400 aggagtaatc tccacaactc tctggagagt aggcaccaac aaacàcagat ccagcgtgtt 2460 gtacttgatc aacataagaa gaagcattct cgatttgcag gatcaagtgt tcaggagcgt 2520 43 actgattgga catttccaaa gcctgctcgt aggttgcaae cgatagggtt gtagagtgtg 2580 caatacactt gcgtacaatt tcaacccttg gcaactgcac agcttggttg rgaacagcat 2640 cttcaattct ggcaagctcc ttgtctgtca tatcgacagc caacagaatc acctgggaat 2700 caataccatg ttcagcttga gacagaaggt ctgaggcaac gaaatctgga tcagcgtatt 2760 tatcagcaat aactâgaact tcagaaggcc cagcaggcat gtcaatacta cacagggctg 2820 atgtgtcatt ctgaaccatc atettggcag cagtaacgaa ctggtttcct ggaccaaata 2880 ttttgtcaca cttaggaaca gtttctgttc cgtaagceat agcagctact gcctgggcgc 2940 ctcctgctag rargararac ttaocacçaa cxttqtqggc aacgtagatg acttctgggg 3000 taagggtacc atccttctta ggtggagatg caaaaacaat ttctttgcaa ccagcaactt 3060 tggcaggaac acccagcatc agggaagtgg a&ggcagaat tgcggttcca ccaggaatat 3120 agaggccaac tttctcaata ggtcttgraa aacgagagca gactacacca gggcaagtct 3180 caacttgcaa cgtctccgtt agttgagctt catggaattt cctgacgtta tctatagaga 3240 gatcaatggc tctcttaacg ttatctggca attgcatasg ttcctctggg aaaggagctt 3300 ctaacacagg tgtxttcaaa gegaetccat caaacttggc agttagttct aaaagggctt 3360 tgtcaccatt ttgacgaaca ttgtcgacaa ttggtttgac taattccata atctgttccg 3420 ttttctggat aggacgacga agggcatctt caatttcttg tgaggaggce ttagaaacgt 3480 caattttgca caattcaata cgaccttcag aagggacttc tttaggtttg gattcttctt 3540 taggttgttc cttggtgtat cctggcttgg catetccttt ccttctagtg acctttaggg 3600 acttcatatc caggtttetc tcçacctcgt ccaacgtcac accgtacttg gcacatctaa 3660 ctaatgcaaa ataaaataag tcagcacatt cccaggctat atcttccttg gatttagctt 3720 ctgcaagttc atxagcttcc tccctaattt tagcgttcaa caaaacttcg tcgtcaaata 3780 accgtttggt ataagaacct tctggagcat tgctcttacg atcccacaag gtggcttcca 3840 tggctctaàg accctttgat tggccaaaac aggaagtgcg ttccaagtga cagaaaccaa 3900 cacctgtttg tccaaccaca aatttcaagc agtctccatc acaatccaat tcgataccca 3960 gcaacttttg agttgctcca gatgtagcac ctttatacca caaaccgtga cgacgagatt 4020 ggtagaetec agtttgtgtc cttatagcct ccggaataga ctttttggac gagtacacca 4080 ggcccaacga gtaattagaa gagtcagcca ccaaagtagt gaatagacca tcggggcggt 4140 cagtagtcaa agacgccaac aaaatttcac tgacagggaa ctttttgaca tcttcagaaa 4200 gttcgtattc agtagtcaat tgccgagcat caataatggg gattatacca gaagcaacag 4260 tggaagtcac atctaccaac tttgcggtct cagaaaaagc ataaaeagtt ctaciaccgc 4320 cattagtgaa acttttcaaa tcgcccagtg gagaagaaaa aggcacagcg atactagcat 4380 tagcgggcaa ggatgcaaet ttatcaacca gggtcctata gataacccta gcgcctggga 4440 tcatcctttg gacaactctt tctgccaaat ctaggtccaa aatcacttca ttgataccat 4500 tattgtacaa cttgagcaag ttgtcgatca gctcctcaáa ttggtcctct gtaacggatg 4560 actcaacttg cacattaact tgaagctcag tcgattgagt gaacttgatc aggttgtgca 4620 gctggtcagc agcataggga aacacggctt ttcctaccaa actcaaggaa ttatcaaact 4680 ctgcaacact tgcgtatgca ggtagcaagg gaaatgtcat acttgaagtc ggacagtgag 4740 tgtagtcttg agaaattctg aagecgtatt tttattatca gtgagtcaçt catcaggaga 4800 tcctctacgc cggacgcatc gtggccgacc tgcaggtegg catcaccggc gccacaggtg 4860 cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg 4920 ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg tcccgtggcc gggggactgt 4980 tgggcgccat ctcettgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc 5040 tactactggg ctgcttccta atgcaggagt egcataaggg agagcgtcga gtatctatga 5100 ttggaagtat gggaatggtg atacccgcat tcttcagtgt cttgaggtct cctatcagat 5160 tatgcccaac taaagcaacc ggaggaggag atttcatggt aaatttctct gacttttggt 5220 catcagtaga ctcgaactgt gagactatct cggttatgac agcagaaatg tccttcttgg 5280 agacagtaaa tgaagtccca ccaataaaga aatccttgtt atcaggaaca aacttcttgt 5340 ttcgaacttt ttcggtgcct tgaactataa aatgtagagt ggatatgtcg ggtaggaatg 5400 gagcgggcaa atgcttacct tctggacctt caagaggtat gtagggtttg tagatactga 5460 tgccaacttc agtgacaacg ttgctatttc gttcaaacca ttccgaatcc agagaaatca 5520 aagttgtttg tctactattg atccaagcca gtgcggtctt gaaactgaca atagtgtgct 5580 cgtgttttga ggtcatcttt gtatgaataa atctagtctt tgatctaaat aatcttgacg 5640 agccaaggcg ataaataccc aaatctaaaa ctcttttaaa acgttaaaag gacaagtatg 5700 tctgcctgta ttaaacccca aatcagctcg tagtctgatc ctcatcaact tgaggggcac 5760 tatcttgttt tagagaaatt tgcggagatg cgatatcgag aaaaaggtac gctgatttta 5820 aacgtgaaat ttatctcaag atctctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 5880 ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 5940 acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca 6000 gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta 6060 ctgagagtgc accatatgcg gtgxgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc 6Í2Ô atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt teggctgcgg 6180 cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 6240 gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcea ggaaccgtaa aaaggccgcg 6300 ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 6360 agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 6420 tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 6480 ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 6540 gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 6600 44 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 /140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8241 ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac ag&gttettg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacge gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatctttte tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta asfrastrra aagtatatat aaataaactt qqtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcàg gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcetc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa çcaaqtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttcctcgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaatagge gtatcacgag gccctttcgt cttcaagaat taattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctgact catgttggca ttgtgaaata gacgcagatc gggaacactg aaaaataaca gttattattc g

<210> 4 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <2 2 3> Descrição da sequência artificial: estrutura sintética: plasmido <400> 4 caggcccagc ccaggcc 17

<210> 5 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição da sequência artificial: estrutura sintética: iniciador 45 < 4 Ο Ο > 5 31 gcactagtta gaagggacat tcttcttctt g

Lisboa, 10 de Novembro de 2010. 46

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma bactéria recombinante não patogénica e não invasiva, transformada com o ADN de codificação de um péptido trifólio e capaz de libertar um péptido trifólio no tubo digestivo de um ser humano ou de animal, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de um medicamento para o tratamento de lesões ou para inibir a formação de lesões no tubo digestivo causadas pela radioterapia ou quimioterapia utilizadas no tratamento do cancro, uma droga que danifica o aparelho digestivo, incluindo o álcool, a exposição acidental a radiação ou a uma substância cáustica, infecção, distúrbios digestivos, incluindo, mas não se limitando a úlcera não dispépsica, gastrite, úlcera péptica ou duodenal, cancro gástrico, linfoma de MALT, sindrome de Menetier ou doença do refluxo gastro-esofágico.
2. 2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de as lesões do tubo digestivo serem causadas por terapia de radiação ou quimioterapia usadas para o tratamento do cancro.
3. 3. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o tubo digestivo incluir a boca, o esófago, o estômago, o intestino delgado e o intestino grosso.
4. 4. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de as lesões estarem serem nas superfícies das mucosas. 1
5. 5. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de a referida bactéria não patogénica e não invasiva ser uma estirpe bacteriana de grau alimentar, de preferência uma estirpe bacteriana gram-positiva.
6. 6. Utilização, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de a referida estirpe bacteriana ser uma espécie de Lactococcus ou Lactobacillos.
7. 7. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de a referida estirpe bacteriana ser Lactococcus lactis.
8. 8. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo facto de o referido péptido trifólio ser TFF1. Lisboa, 10 de Novembro de 2010. 2