PT1888100E

PT1888100E - Uso de isoformas de il-18bp para o tratamento e/ou prevenção de doenças inflamatórias neurológicas

Info

Publication number: PT1888100E
Application number: PT06763485T
Authority: PT
Inventors: Yolande Chvatchko; Yves Sagot; Anne Corbaz
Original assignee: Merck Serono Sa
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2011-12-15
Also published as: IL187839A0; AU2006254106A1; JP5048658B2; NO339540B1; HRP20110788T1; US8128920B2; WO2006128911A2; EP1888100A2; RS52192B; AU2006254106A8; CA2610691C; US20080233085A1; JP2008542340A; CA2610691A1; ES2376534T3; ATE530227T1; EP1888100B1; SI1888100T1; WO2006128911A3; PL1888100T3

Description

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DESCRIÇÃO "USO DE ISOFORMAS DE IL-18BP PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS NEUROLÓGICAS"

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção é geralmente no campo de doenças neurológicas associadas a neuro-inflamação. Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se com o uso de isoformas de IL-18BP que não se ligam a IL-18, tais como IL-18BPb e IL-18BPd, para o fabrico de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de uma doença inflamatória neurológica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Doenças neurológicas associadas com neuro-inflamação. A neuro-inflamação é uma caracteristica comum à maioria das doenças neurológicas. Muitos estímulos são viabilizadores de neuro-inf lamação, a qual pode ser induzida por sofrimento neuronal ou oligodendroglial, ou ser uma consequência de um traumatismo, de um dano do nervo central ou periférico ou de uma infeção vírica ou bacteriana. As principais consequências da neuro-inflamação são (i) secreção de várias quimiocinas inflamatórias pelos astrócitos; e (ii) o recrutamento de leucócitos adicionais, o que deverá estimular ainda mais os astrócitos. Em doenças crónicas neurodegenerativas tais como esclerose múltipla (EM) , Doença de Alzheimer (DA) ou esclerose lateral amiotrófica (ELA), pensa-se que a presença da neuroinflamação persistente participe na progressão da doença. As doenças neurológicas associadas com a neuro-inflamação podem também ser referidas como doenças neurológicas inflamatórias. 2

Doenças neurodegenerativas crónicas

Nas doenças neurodegenerativas crónicas, a patologia está associada com uma resposta inflamatória. Evidência recentes sugerem que a inflamação sistémica pode ter impacto no local da inflamação no cérebro doente conduzindo à síntese exagerada de citocinas inflamatórias e outros mediadores no cérebro, os quais podem por sua vez influenciam o comportamento (Perry, 2004). As doenças neurodegenerativas crónicas compreendem, entre outras, esclerose múltipla (EM) , Doença de Alzheimer (DA), Doença de Parkinson (DP) , Doença de Huntington (DH), esclerose lateral amiotrófica (ELA), atrofia de sistemas múltiplos (ASM), doença de prião e síndroma de Down. A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio envolvendo a deterioração das funções mentais resultantes de alterações nos tecidos cerebrais. Isto inclui o encolhimento dos tecidos cerebrais, não causados por perturbações dos vasos sanguíneos, demência degenerativa primária e atrofia cerebral difusa. A doença de Alzheimer é também chamada de demência senil/tipo de Alzheimer (DSTA). Evidência considerável adquirida ao longo da última década tem vindo a apoiar a conclusão de que a neuroinflamação está associada com a patologia da doença de Alzheimer (DA) (Tuppo e Arias, 2005) . É a causa mais comum de declínio intelectual com o envelhecimento. A incidência é aproximadamente de 9 em cada 10.000 pessoas. Este distúrbio afeta as mulheres um pouco mais frequentemente do que homens e ocorre principalmente em indivíduos mais velhos. A causa é desconhecida. Os fatores neuroquímicos qual podem participar no desencadear da doença incluem a falta de substâncias usadas pelas células nervosas para transmitirem os impulsos nervosos (neurotransmissores) , incluindo acetilcolina, somatostatina, substância P, e norepinefrina. 3

Os fatores ambientais incluem a exposição a alumínio, manganês, e outras substâncias. Os fatores infeciosos incluem as infeções por prião (organismos do tipo vírus) que afetam o cérebro e a espinal medula (sistema nervoso central). Em algumas famílias (representando 5 até 10 % dos casos) há uma predisposição hereditária para o desenvolvimento da doença, mas isto não segue estritamente os padrões da hereditariedade (Mendeliana). O diagnóstico geralmente é feito por exclusão de outras causas de demência. O início é caracterizado pelo comprometimento da memória, com perda progressiva da função intelectual. Pode haver alterações de humor, alterações na capacidade de linguagem, alterações na marcha, e outras alterações à medida que a doença progride. Há uma diminuição no tamanho (atrofia) dos tecidos do cérebro, dilatação dos ventrículos (os espaços no interior do cérebro), e depósitos no interior dos tecidos do cérebro.

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio do cérebro caracterizado por agitação e dificuldade em andar, nos movimentos, e na coordenação. A doença está associada com danos numa parte do cérebro que controla o movimento muscular. É também chamada paralisia agitante ou agitação da paralisia. A evidência crescente de estudos em humanos e animais tem sugerido que a neuroinflamação é um importante contribuinte para a perda neuronal na DP (Gao et al., 2003). A doença afeta aproximadamente 2 em cada 1.000 pessoas, e muitas vezes desenvolve-se após os 50 anos de idade. Afeta tanto homens como mulheres e é uma das doenças inflamatórias neurológicas mais comuns dos idosos. O termo "parkinsonismo" refere-se a qualquer condição que envolva uma combinação dos tipos de alterações no movimento observado na doença de Parkinson, as quais acontece serem a condição mais comum que causam este tipo de sintomas. O 4

Parkinsonismo pode ser causado por outras doenças ou por fatores externos (parkinsonismo secundário). A doença de Parkinson é causada pela deterioração progressiva das células nervosas da parte do cérebro que controla o movimento muscular (os gânglios basais e a área extrapiramidal). A dopamina, que é uma das substâncias usadas pelas células para transmitir os impulsos (transmissores), é normalmente produzida nesta área. A deterioração desta área do cérebro reduz a quantidade de dopamina disponível no corpo. Dopamina insuficiente perturba o equilíbrio entre a dopamina e outros transmissores, tais como acetilcolina. Sem dopamina as células nervosas não conseguem transmitir capazmente as mensagens, e isto resulta na perda de função muscular. A razão exata de as células do cérebro se deteriorarem é desconhecida. 0 distúrbio pode afetar um ou ambos os lados do corpo, com vários graus de perda de função. Adicionalmente à perda de controlo muscular, algumas pessoas com Doença de Parkinson tornam-se gravemente deprimidas. Embora a perda precoce de capacidade mental seja incomum, no caso de Parkinson grave a pessoa pode apresentar deterioração mental generalizada (incluindo demência, alucinações, e assim por diante). A demência pode também ser um efeito colateral das medicações usadas para tratar a doença. A doença de Huntington (DH) é uma doença hereditária, autossómica dominante neurológica inflamatória. A doença usualmente não se torna clinicamente notória até à quinta década de vida, e resulta em distúrbio psiquiátrico, distúrbio de movimento involuntário, e declínio cognitivo associado com progressão inexorável para a morte, tipicamente 17 anos após o aparecimento. 0 gene responsável pela Doença de Huntington é chamado de huntingtina. Está 5 localizado no cromossoma 4p, apresentando um meio eficaz de diagnóstico pré-clinico e ante-natal. A anomalia genética consiste num número excessivo de sequências de nucleotideos CAG repetidos em tandem. Outras doenças com repetição de CAG incluem, por exemplo, atrofias musculares espinais (AME) , tais como a doença de Kennedy, e na maioria das ataxias cerebrais autossómicas dominantes (ACADs) que são conhecidas como ataxias espinocerebelares (AECs) na nomenclatura genética. Na DH, não é conhecido como este gene amplamente expresso, resulta na morte neuronal seletiva. Para além disso, a análise da sequência não revelou qualquer homologia óbvia com outros genes conhecidos e nenhum motivo estrutural ou domínios funcionais foram identificados que claramente possam fornecer esclarecimentos sobre a sua função. Em particular, a questão de como estes genes são amplamente expressos causando a morte neuronal seletiva permanece sem resposta. A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é um distúrbio que causa a perda progressiva de controlo nervoso dos músculos voluntários devido à destruição das células nervosas no cérebro e espinal medula. A Esclerose Lateral Amiotrófica, também chamada de Doença de Lou Gehrig, é um distúrbio envolvendo a perda do uso e controlo dos músculos. Os nervos que controlam estes músculos atrofiam-se e desaparecem, o que resulta na perda de tecido muscular devido à falta de estímulo nervoso. Embora a origem da causa da ELA permaneça desconhecida, a neuroinflamação pode desempenhar um papel fundamental na ELA (Consilvio et al., 2004) . A força muscular e a coordenação decrescem, começando pelos músculos voluntaries (aqueles sob controlo consciente, tais como os músculos dos braços e das pernas). A extensão da perda do controle muscular continua a progredir, e mais e mais grupos de músculos ficam 6 envolvidos. Pode haver uma perda de estimulação nervosa dos músculos semi-voluntários, tais como os músculos que controlam a respiração e a deglutição. Não há qualquer efeito na capacidade para pensar ou raciocinar. A causa é desconhecida. A ELA afeta aproximadamente 1 em 100.000 pessoas. Parece em alguns casos ocorrer em famílias. O distúrbio afeta mais os homens que as mulheres. Os sintomas usualmente não se desenvolvem até à idade adulta, frequentemente não antes dos 50 anos de idade. A atrofia de sistemas múltiplos (ASM) é uma doença neurodegenerativa esporádica, que ocorre nos adulto de etiologia desconhecida. A condição pode ser única entre as doenças neurodegenerativas crónicas pelo papel proeminente, se não primário, desempenhado pela célula oligodendroglial no processo patogénico. Os dados indicam um papel dos genes relacionado com a inflamação no risco de ASM (Infante et al., 2005) . A principal diferença em relação à Doença de Parkinson é que os doentes de ASM não respondem ao tratamento com L-dopa. A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória desmielinizante do sistema nervoso central (SNC) que tem um ciclo de surto recidiva-remissão ou uma evolução progressiva. A EM não é a única doença desmielinizante. O seu equivalente no sistema nervoso periférico (SNP) é a poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crónica (CIDP). Além disso, há distúrbios monofásicos, agudos, tais como a poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória designada síndroma de Guillain-Barré (SGB) no SNP, e a encefalomielite disseminada aguda (EMDA) no SNC. Tanto a EM como a SGB são síndromes heterogéneos. Na EM diferentes agressões exógenas, juntamente com fatores genéticos podem resultar num curso da doença que, finalmente, preenche os 7 critérios de diagnóstico. Em ambas as doenças, a lesão axonal pode adicionar-se a uma lesão primariamente desmielinizante e causar déficits neurológicos permanentes. A EM é um distúrbio autoimune no qual os leucócitos do sistema imune lançam um ataque contra a matéria branca do sistema nervoso central (SNC). A matéria cinzenta pode também estar envolvida. Embora a etiologia precisa da EM não ser conhecida, os fatores contributivos podem incluir genética, infeção bacteriana e virica. Na sua manifestação clássica (85% de todos os casos), é caracterizada por fases alternantes recidivantes/de remissão, que correspondem a episódios de disfunção neurológica que permanecem durante várias semanas seguidas de recuperação substancial ou completa (Noseworthy, 1999). Os períodos de remissão crescem menos ao longo do tempo. Muitos doentes entram depois numa fase final da doença caracterizada pela gradual perda de função neurológica com recuperação parcial ou nula. Esta é chamada de EM secundária progressiva. Uma pequena proporção (~15% de todos os doentes de EM) sofre um gradual e ininterrupto declinio da função neurológica a seguir ao aparecimento da doença (EM progressiva primária). Os mecanismos moleculares subjacentes à patogenia da EM parecem derivar de fatores genéticos e ambientais, incluindo infeções virais e bacterianas. Estes mecanismos promovem migração aumentada dos linfócitos T e macrófagos através da barreira hemato-encefálica e no tecido do SNC. Elementos genéticos e ambientais conduzem a um influxo aumentado das células inflamatórias através da barreira hemato-encefálica. Isto resulta na migração aumentada de linfócitos T autoreativos e macrófagos para o tecido do SNC. A secreção de citocina pelas células T ativa células que apresentam antigénios (APCs). Quando as células T autoreativas no contexto de moléculas de MHC de classe II nas APCs encontram 'antigénios EM' putativos, muitas vezes proteínas constituintes da bainha de mielina, elas podem tornar-se ativadas. Vários mecanismos subsequentes podem por sua vez atuar para danificar os oligodendrócitos e a mielina. A citotoxicidade mediada por complemento e por anticorpos pode causar a maioria dos danos em alguns doentes, enquanto que a sinalização de Fas-ligando, e a libertação de citocinas pró-inflamatórias como TNF-a por células T CD4+ podem atacar a substância branca em outros. Os macrófagos ativados podem também desempenhar um papel através de fagocitose aumentada e fator de secreção. Isto causa desmielinização generalizada e subsequente perda de eficiência de condução entre os axónios do SNC. Os mecanismos de reparação subsequentes podem, no entanto, dar origem à remielinização uma vez que o processo inflamatório seja resolvido. Os axónios remielinizados dos doentes de EM são reconhecidos patologicamente pela aparência fina dos revestimentos em torno dos axónios remielinizados. Canais de sódio adicionais e um repertório anormal de canais de iões são muitas vezes encontrados inseridos na membrana axonal desmielinizada, tentando compensar a perda de eficiência de condução. Estes padrões aberrantes de expressão sugerem que a EM pode também incluir uma canalopatia. Percursos oligodendrogliais podem aumentar a remielinização nas lesões de EM. A doença de prião e o Síndroma de Down mostraram também envolver neuroinflamação (Eikelenboom et al., 2002; Hunter et al., 2004).

Doenças inflamatórias neurológicas após uma infeção

Algumas neuropatias tais como, por exemplo, encefalomielite desmielinizante disseminada aguda seguem-se geralmente a uma infeção virai ou vacinação virai (ou, muito raramente, vacinação bacteriana), sugerindo uma causa imunológica para 9 a doença. As neuropatias periféricas Inflamatórias agudas que se seguem a uma vacinação virai ou à sindrome de Guillain-Barré são doenças desmielinizantes semelhantes com a mesma imunopatogénese presumida, mas afetam apenas as estruturas periféricas. A mielopatia associada a HTLV, uma doença da medula espinal lentamente progressiva associada com a infeção das células T pelo vírus linfotrópico humano, é caracterizada pela fraqueza espástica de ambas as pernas.

As infeções do sistema nervoso central são infeções extremamente graves, a meningite afeta as membranas que envolvem o cérebro e a medula espinal; a encefalite afeta o próprio cérebro. Os vírus que infetam o sistema nervoso central (cérebro e espinal medula) incluem herpesvírus, arbovírus, coxsackievírus, echovírus, e enterovírus. Algumas destas infeções afetam primariamente as meninges (os tecidos que recobrem o cérebro) e resultam em meningite; outras afetam primariamente o cérebro e resultam em encefalite; muitas infetam tanto as meninges como o cérebro e resultam em meningoencefalite. A meningite é muito mais comum em crianças do que a encefalite. Os vírus afetam o sistema nervoso central de duas maneiras. Podem infetar diretamente e destruir as células durante a doença aguda. Após recuperação da infeção muitas vezes a resposta imune do corpo à infeção muitas vezes causa danos secundários às células que envolvem os nervos. Este dano secundário (encefalomielite pós-infeciosa) conduz a que a criança continue a ter sintomas várias semanas após recuperação da doença aguda.

Doenças inflamatórias neurológicas após lesões 10 A lesão do SNC induzida por afeções agudas incluindo traumatismo, hipóxia e isquémia podem afetar tanto a matéria cinzenta como a matéria branca. A lesão do SNC envolve neuro-inflamação. Por exemplo, a infiltração de leucócitos no SNC após traumatismo ou inflamação é mediada em parte pela regulação para cima da quimiocina MCP-1 nos astrócitos (Panenka et al., 2001) . 0 traumatismo é uma lesão ou dano do nervo. Pode ser traumatismo da espinal medula, que é o dano da medula espinal, que afeta todas as funções nervosas que são controladas na lesão e abaixo do nivel da lesão, incluindo o controlo muscular e da sensibilidade, ou traumatismo do cérebro, tal como o traumatismo causado por lesão craniana fechada. A hipóxia cerebral é uma falta de oxigénio especificamente nos hemisférios cerebrais, e mais tipicamente o termo é usado para referir a falta de oxigénio em todo o cérebro. Dependendo da gravidade da hipóxia, os sintomas podem variar desde confusão até dano irreversível do cérebro, coma e morte. O acidente vascular é geralmente causado pela redução do fluxo sanguíneo (isquémia) do cérebro. É também chamado de doença ou acidente vascular cerebral. É um grupo de distúrbios cerebrais envolvendo a perda das funções cerebrais que ocorre quando é interrompido o fornecimento de sangue a qualquer parte do cérebro. O cérebro requer cerca de 2 0% do sangue em circulação no corpo. O fornecimento primário de sangue ao cérebro é através de 2 artérias no pescoço (artérias carótidas) , as quais depois se ramificam dentro do cérebro em múltiplas artérias em que cada fornece uma área específica do cérebro. Mesmo uma 11 breve interrupção do fluxo de sangue pode causar diminuição da função cerebral (déficit neurológico). Os sintomas variam com a área do cérebro afetada e comummente incluem problemas como alterações na visão, alterações na fala, diminuição do movimento ou da sensibilidade numa parte do corpo, ou alterações no nível de consciência. Se o fluxo de sangue é diminuído durante mais que escassos segundos, as células do cérebro na área são destruídas (enfartadas) causando a lesão permanente dessa área do cérebro ou mesmo a morte. Um acidente vascular cerebral afeta cerca de 4 em cada 1.000 pessoas. É a terceira principal causa de morte na maioria dos países desenvolvidos, incluindo os EUA. A incidência de AVC aumenta dramaticamente com a idade, com duplicação do risco a cada década após os 35 anos. Cerca de 5% das pessoas acima de 65 anos tiveram pelo menos um acidente vascular cerebral. O distúrbio ocorre em homens com mais frequência do que em mulheres. As causas de acidentes vasculares cerebrais isquémicos são os coágulos sanguíneos que se formam no cérebro (trombo) e os coágulos de sangue ou pedaços de placa aterosclerótica ou outro material que viaja para o cérebro proveniente de outro local (êmbolos). 0 sangramento (hemorragia) dentro do cérebro pode causar sintomas que mimetizam o acidente vascular cerebral. Acidentes vasculares secundários à aterosclerose (trombose cerebral) e acidentes vasculares cerebrais causados por embolia (coágulo de sangue em movimento) são os acidentes vasculares mais comuns. A lesão traumática do nervo pode ter relação tanto com o SNC como com o SNP. O traumatismo crânio-encefálico, também chamado simplesmente de traumatismo craniano ou traumatismo craniano fechado, refere-se a uma lesão onde há danos para o cérebro causados por um golpe externo na cabeça. Pode acontecer principalmente durante acidentes de carro ou de 12 bicicleta, mas também pode ocorrer como resultado de quase afogamento, ataque cardíaco, acidente vascular, e infeções. Este tipo de lesão traumática do cérebro geralmente é devido à falta de oxigénio ou do fornecimento de sangue ao cérebro e, portanto, pode ser referido como uma "lesão anóxica". A lesão cerebral ou o traumatismo craniano fechado ocorre quando há um golpe na cabeça como num acidente com um veículo a motor ou numa queda. Pode haver um período de inconsciência imediatamente após o trauma, o qual pode durar minutos, semanas ou meses. 0 dano cerebral primário ocorre no momento da lesão, principalmente nas zonas de impacto, em particular quando está presente uma fratura de crânio. Grandes contusões podem estar associadas a uma hemorragia intracerebral, ou acompanhadas por lacerações corticais. Lesões axonais difusas ocorrem com resultado de tensões de cisalhamento e de tração de processos neuronais produzidos por movimentos de rotação do cérebro dentro do crânio. Pode haver pequenas lesões hemorrágicas ou danos difusos dos axónios, que só podem ser detetadas microscopicamente. Os danos cerebrais secundários ocorrem como resultado do desenvolvimento de complicações após o momento da lesão. Incluem hemorragia intracraniana, lesão traumática das artérias extracerebrais, herniação intracraniana, lesão encefálica hipóxica ou meningite.

As lesões da espinal medula são responsáveis pela maioria dos internamentos hospitalares por paraplegia e tetraplegia. Mais de 80% ocorrem como resultado de acidentes de viação. Dois grupos principais de lesões são reconhecidos clinicamente: lesões abertas e lesões fechadas. As lesões abertas causam traumatismo direto da espinal medula e das raízes nervosas. As lesões perfurantes podem causar lesões extensas e hemorragia. As lesões fechadas representam a maioria das lesões espinais e são 13 geralmente associadas a uma fratura/luxação da coluna vertebral, as quais normalmente são evidenciáveis radiologicamente. Os danos da medula dependem da extensão das lesões ósseas e podem ser considerados em duas etapas principais: danos primários, que são contusões, transeções das fibras nervosas e necrose hemorrágica, e danos secundários, que são hematoma extradural, enfarte, infeção e edema.

Neuropatia periférica A neuropatia periférica é um síndroma de perda sensorial, fraqueza muscular e atrofia, diminuição dos reflexos dos tendões profundos, e sintomas vasomotores, sozinhos ou em qualquer combinação. A Neuropatia Periférica é associada à degeneração axonal, um processo também referido como degeneração de Wallerian. A neuro-inflamação desempenha um papel na degeneração de Wallerian (Stoll et al., 2002). A doença pode afetar um único nervo (mononeuropatia) , dois ou mais nervos em áreas separadas (mononeuropatia múltipla) ou muitos nervos simultaneamente (polineuropatia). O axónio pode ser afetado primariamente (por exemplo, na diabetes mellitus, doença de Lyme, urémia ou por agentes tóxicos) ou a bainha de mielina ou a célula de Schwann (por exemplo, em polineuropatia inflamatória aguda ou crónica, leucodistrofias, ou síndrome de Guillain-Barré). Os danos das pequenas fibras amielínicas e mielínicas resultam primariamente na perda da sensibilidade à temperatura e à dor; os danos das grandes fibras mielinizadas resultam em defeitos proprioceptivos ou motores. Algumas neuropatias (por exemplo, devidas à toxicidade de chumbo, uso da dapsona, doença de Lyme (causada por picada de carraça), porfiria, ou síndrome de Guillain-Barré) afetam primariamente as fibras motoras; outras (por exemplo devido 14 à ganglionite da raiz dorsal de cancro, hanseníase, SIDA, diabetes mellitus, ou intoxicação crónica por piridoxina) afetam primariamente os gânglios da raiz dorsal ou as fibras sensoriais, produzindo sintomas sensoriais. Ocasionalmente, os nervos cranianos também são envolvidos (por exemplo, no sindrome de Guillain-Barré, doença de Lyme, diabetes mellitus, e difteria). A identificação das modalidades envolvidas ajuda a determinar a causa. 0 traumatismo é a causa mais comum de uma lesão localizada num único nervo. A atividade muscular violenta ou distensão forçada de uma articulação pode produzir uma neuropatia focalizada, assim como pode repetir pequenos traumatismos (por exemplo, o segurar e apertar de pequenas ferramentas, vibração excessiva de martelos de ar) . A paralisia de pressão usualmente afeta os nervos superficiais (ulnar, radial, peroneal) em proeminências ósseas (e.g. durante o sono profundo ou durante a anestesia em pessoas magras ou caquéticas e frequentemente em alcoólicos) ou em canais estreitos (por exemplo, no síndroma do túnel do carpo). A paralisia de pressão pode também resultar de tumores, hiperostose óssea, gesso, muletas, ou posturas apertadas prolongadas (por exemplo, em jardinagem). A hemorragia em um nervo e a exposição ao frio ou à radiação podem causar neuropatia. A mononeuropatia pode resultar de invasão tumoral direta. A mononeuropatia múltipla é geralmente secundária a danos do colagénio vascular (por exemplo, poliarterite nodosa, SLE, síndroma de Sjogren, RA), sarcoidose, doenças metabólicas (por exemplo diabetes, amiloidose), ou doenças infeciosas (por exemplo, doença de Lyme, a infeção pelo HIV) . Os microrganismos podem causar mononeuropatia 15 múltipla por invasão direta do nervo (por exemplo, hanseniase). A polineuropatia devida a doenças febris agudas pode resultar de uma toxina (por exemplo, na difteria) ou de uma reação auto-imune (por exemplo no síndroma de Guillain-Barré), a polineuropatia que algumas vezes se segue a imunizações é, provavelmente, também auto-imune.

Os agentes tóxicos geralmente causam polineuropatia, mas por vezes uma mononeuropatia. Incluem emetina, hexobarbital, barbital, clorobutanol, sulfonamidas, fenitoína, nitrofurantoína, os alcaloides da vinca, metais pesados, monóxido de carbono, o fosfato de triortocresil, ortodinitrofenol, muitos solventes, outros venenos industriais, e determinados fármacos para a SIDA (por exemplo zalcitabina, didanosina). A neuropatia induzida por quimioterapia é um efeito colateral importante e grave de vários medicamentos quimioterapêuticos comummente usados, incluindo os alcaloides da Vinca (vinblastina, vincristina e vindesina), contendo fármacos de platina (cisplatina) e taxanos (paclitaxel). A indução de neuropatia periférica é um fator comum na limitação da terapia com medicamentos quimioterapêuticos.

As deficiências nutricionais e os distúrbios metabólicos podem resultar em polineuropatia. A deficiência em vitamina B é frequentemente a causa (por exemplo, alcoolismo, beribéri, anemia perniciosa, isoniazida induzida por deficiência de piridoxina, síndromas de má absorção, e hiperemese gravídica). A polineuropatia também ocorre no hipotiroidismo, porfiria, sarcoidose, amiloidose e urémia. 16 A diabetes mellitus pode causar polineuropatia sensório-motora distai (a mais comum), mononeuropatia múltipla e mononeuropatia focal (por exemplo, dos nervos cranianos oculomotor ou abducente). A polineuropatia devido a distúrbios metabólicos (por exemplo, diabetes mellitus) ou a insuficiência renal desenvolve-se lentamente, frequentemente ao longo de meses ou anos. Frequentemente começa com anomalias sensoriais nas extremidades inferiores que são muitas vezes mais graves distai do que proximalmente. Formigueiro periférico, dormência, dor em sensação de queimadura, ou deficiências na propriocepção articular e sensação vibratória são muitas vezes proeminentes. A dor é muitas vezes pior à noite e pode ser agravada pelo toque na área afetada ou por alterações da temperatura. Em casos graves, há sinais objetivos de perda sensorial, tipicamente com distribuição de meia e luva. 0 tendão de Aquiles e outros reflexos profundos do tendão estão diminuídos ou ausentes. Podem ocorrer úlceras indolores nos dedos ou nas juntas de Charcot quando a perda sensorial é profunda. Os déficits sensoriais ou proprioceptivos podem levar a alterações da marcha. 0 envolvimento motor resulta no enfraquecimento e atrofia do músculo distai. 0 sistema nervoso autónomo pode adicionalmente ou seletivamente estar envolvido, conduzindo a diarreia noturna, incontinência urinária e fecal, impotência, ou hipotensão postural. Os sintomas vasomotores variam. A pele pode ser mais clara e mais seca que o normal, às vezes com coloração escura; a sudorese pode ser excessiva. As alterações tróficas (pele lisa e brilhante, unhas com concavidades ou sulcos, osteoporose) são comuns em casos prolongados grave. 17 A polineuropatia nutricional é comum entre alcoólicos e desnutridos. A axonopatia primária pode levar à desmielinização secundária e destruição axonal nos nervos mais longos e maiores. No entanto não é claro se a causa é a deficiência de tiamina ou de outra vitamina (por exemplo, piridoxina, ácido pantoténico, ácido fólico). A neuropatia devida à deficiência em piridoxina geralmente ocorre apenas em pessoas que tomam isoniazida para a tuberculose; as crianças que são deficientes ou dependentes de piridoxina podem ter convulsões. 0 desgaste e fraqueza simétrica das extremidades é usualmente incipiente mas pode progredir rapidamente distais, por vezes acompanhada por perda sensorial, parestesia, e dor. Dores, cólicas, frio, ardor, e dormência na barriga das pernas e nos pés podem ser agravados pelo toque. Várias vitaminas podem ser dadas quando a etiologia é obscura, mas não têm nenhum beneficio comprovado.

As neuropatias hereditárias são classificadas como neuropatias sensório-motoras ou neuropatias sensoriais. A doença de Charcot-Marie-Tooth é a neuropatia sensório-motora hereditária mais comum. As neuropatias sensório-motoras menos comuns começam ao nascimento e resultam numa deficiência maior. Em neuropatias sensoriais, que são raras, a perda de dor distai e da sensibilidade à temperatura é mais proeminente do que a perda da sensação vibratória e da postura. 0 principal problema é mutilação podai devido à intensidade da dor, com frequentes infeções e osteomielite. As neuropatias hereditárias incluem também neuropatia intersticial hipertrófica e doença de Dejerine-Sottas. A malignidade pode ser também causar polineuropatia via gamopatia monoclonal (mieloma múltiplo, linfoma), invasão 18 amilóide, ou deficiências nutricionais ou como um síndroma paraneoplásico.

Apesar das várias etiologias, tais como agentes infeciosos ou ataques auto-imunes, todas as doenças neurológicas inflamatórias causam perda da função neurológica e podem levar à paralisia e morte. Embora estejam disponíveis alguns agentes terapêuticos que reduzem as crises inflamatórias em algumas doenças neurológicas inflamatórias, há a necessidade de desenvolver novas terapias que possam levar à recuperação da função neurológica. 2. Sinalização de STATs 0 papel da sinalização de STATs como modulador de resposta pro- e anti-inflamatória foi descrito em muitos sistemas biológicos (Pfitzner et al., 2004). A ativação de STAT2 pode ser mediada por interferão-β (INF-β) . O promotor de STAT2 tem um elemento de resposta estimulada por interferão (ISRE) (Yan et al., 1995) . Em astrócitos humanos, a ativação de STAT2 diminui a indução da quimiocina MCP-1 (Hua et al., 2002). Quimiocinas como a MCP-1 direcionam o recrutamento de leucócitos para os locais de inflamação e podem também participar na regulação da produção de citocinas pelas células T auxiliares naives. 0 efeito benéfico de IFN-β via redução da produção de MCP- 1 em doentes de EM foi confirmado em experiências ex vivo (Comabella et al., 2002).

As atividades fisiológicas associadas com MCP-1 têm sido extensivamente estudadas por meio de animais transgénicos e outros modelos animais que demonstram que a MCP-1 controla o recrutamento de monócitos e de outros tipos de células 19 (astrócitos, por exemplo) em muitas doenças infeciosas, inflamatórias e auto-imunes, bem como a expressão de citocinas relacionadas com as respostas das auxiliares T. Foi mostrado que a MCP-1 também mostrou mediar as infeções parasitárias causadas por Trichinella spiralis (Conti e DiGioacchino, 2001) . Portanto, em muitas situações patológicas, a MCP-1 é pensada para aumentar a resposta inflamatória por ativação dos macrófagos. A ativação de STAT2, levando a uma diminuição da indução de MCP-1, e a uma forma promissora de tratar distúrbios associados a neuro-inflamação. 3. A proteína de ligação IL-18 (IL-18BP)

Em 1989, foi descrita uma atividade de soro induzida por endotoxina que induz o interferão-γ (IFN-γ) obtido a partir de células do baço de ratinho (Nakamura et al., 1989). O fator responsável por essa atividade foi chamado fator de indução IFN-γ (IGIF) e mais tarde na interleucina-18 (IL-18). A sequência de cDNA humano para IL-18 foi relatada em 1996 (Ushio et al., 1996). A IL-18 recombinante induz IFN-γ mais fortemente do que faz o IL-12, aparentemente através de um passo separado (Micallef et al., 1996). O IL-18 não induz IFN-γ por si só, mas funciona primariamente como um co-estimulante com mitógenos ou IL-2. O IL-18 aumenta a proliferação de células T, aparentemente através de uma via dependente do IL-2, e aumenta a produção de citocinas Thl in vitro e exibe sinergismo quando combinado com IL-12 em termos da produção de IFN-γ aumentada (Maliszewski et al., 1990) . O IL-18 desempenha um papel potencial na imunorregulação ou na inflamação por aumento da atividade funcional do ligando Fas nas células Thl (Conti et al., 1997). O IL-18 é também expresso no córtex suprarrenal e portanto pode ser uma secreção neuro- 20 imunomoduladora, desempenhando um papel importante na orquestração do sistema imune após uma experiência estressante (Chater, 1986). Além disso, a expressão de IL-18 é regulada de forma anormal em ratinhos NOD autoimunes e estreitamente associada com o desenvolvimento de diabetes (Rothe et al., 1997). In vivo, a IL-18 é formada por clivagem de pro-IL-18, e na produção de IFN-γ em P. acnes e letalidade mediada por LPS. A IL-18 madura é produzida a partir do seu precursor pela enzima de conversão de IL-Ιβ (enzima de conversão IL-lbeta, ICE, caspase-1). O recetor IL-18 consiste pelo menos de dois componentes, cooperando na ligação do ligante. Sítios de ligação de alta e de baixa afinidade para IL-18 foram encontrados em células T estimuladas com IL-12 de murinos sugerindo um complexo recetor de cadeia múltipla (Yoshimoto et al., 1998). Duas sub-unidades recetoras foram identificadas até agora, pertencendo ambas à família do recetor IL-1 (Parnet et al., 1996) . O sinal da transdução de IL-18 envolve a ativação de NF-κΒ (DiDonato et al., 1997).

Recentemente, uma proteína solúvel com uma alta afinidade para IL-18 foi isolada de urina humana, e os cDNAs humano e de ratinho foram descritos (Novick et al., 1999c) (WO 99/09063). A proteína foi designada proteína de ligação IL-18 (IL-18BP) . O IIL-18BP não é o domínio extracelular de um dos receptores IL-18 conhecidos, mas uma proteína secretada, que circula naturalmente. Esta pertence a uma nova família de proteínas secretadas. A família inclui ainda várias proteínas codificadas de Poxvírus que têm uma alta homologia a IL-18BP (Novick et al., 1999b) . O IL-18BP é constitutivamente expresso no baço, pertence à superfamília 21 das imunoglobulinas, e tem homologia limitada ao receptor de IL-1 tipo II. 0 seu gene foi localizado no cromossoma humano llql3, e não foi encontrado nenhum exão que codifica um domínio da transmembrana na sequência genómica de 8,3 kb (Novick et al., 1999a).

Quatro isoformas de IL-18BP humano e duas de ratinho, resultantes de splicing de mRNA foram encontradas em várias bibliotecas de cDNA e foram expressas, purificadas, e avaliadas quanto à ligação e neutralização das atividades biológicas de IL-18 (Kim et al., 2000b). A isoforma de IL-18BP humano (IL-18BPa) exibiu a maior afinidade para IL-18 com uma taxa de associação rápida, uma taxa de dissociação lenta, e uma constante de dissociação (K(d)) de 399 pM. A IL-18BPc partilha o domínio Ig do IL-18BPa excepto para os 29aminoácidos C-terminais; a K(d) de IL-18BPC é 10 vezes menor (2,94 nM) . No entanto, a IL-18BPa e IL-18BPc neutralizam IL-18 >95% a um excesso molar de dois. As isoformas humanas IL-18BPb e IL-18BPd não têm um domínio Ig completo e não têm a capacidade de ligar ou neutralizar IL-18. 0 modelo molecular identificou um grande sítio de ligação eletrostática e hidrofóbica misto ligado no domínio Ig do IL-18BP, o qual poderia explicar sua alta afinidade de ligação ao ligante (Kim et al., 2000a). IL-18BPa e IL-18BPc atuam como inibidores de IL-18, estas isoformas foram propostas como terapêuticas potenciais para o tratamento de doenças associadas com uma resposta imune ligada com a atividade IL-18. No entanto, o efeito benéfico das isoformas de IL-18BP em doenças não associadas a IL-18 não foi ainda sugerido. Para além disso, a significância biológica das isoformas IL-18BPb e IL-18BPd é fracamente entendida na técnica anterior. 22

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É objeto da presente invenção fornecer novos meios para o tratamento e/ou prevenção de uma doença neurológica inflamatória. A presente invenção é definida pelo conjunto das reivindicações anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra esquematicamente a estrutura do gene IL-18BP humano e das isoformas IL-18BPa, IL-18BPb, IL-18BPc e IL-18BPd emenda humanas. A Fig. 2 mostra a sequência de aminoácidos das isoformas IL-18BPa, IL-18BPb, IL-18BPc e IL-18BPd humanas. A Fig. 3A mostra o efeito das IL-18BPb e IL-18BPd na translocação nuclear STAT2 nas células de astroglioma U373 humanas. A Fig. 3B mostra o efeito da IL-18BPd na translocação nuclear STAT1, STAT2 e STAT3. Os controlos são: translocação induzida por IFNy para STAT1, e translocação induzida por IFNP para STAT2 e STAT3. A significância foi calculada em relação a células não estimuladas, *p<0,01, ** p< 0,0 01.

A Fig. 4 mostra o efeito de IL-18 e IL-18BPa na translocação nuclear STAT2 nas células U373. O controlo positivo é a translocação induzida por IFN. A significância foi calculada em relação a poços não estimulados, *p<0,01 , **p<0,001. A Fig. 5A mostra o efeito de IL-18BPb na secreção de MCP-1 por células U373 estimuladas por IL-Ιβ e IFNy, 48 h após estimulação. A significância foi calculada em relação a células estimuladas não tratadas com IL-18BPb, *p<0,05, **p<0,005, ***p<0,001. A Fig. 5B mostra o efeito de IL-18BPb na secreção de IL-6 pelas células U251 estimuladas por IL-Ιβ e IFNy, 24 h 23 após estimulação. A significância foi calculada em relação a células estimuladas não tratadas com IL-18BPb, *p<0,01 **p<0,005, ***p<0,001.

A Fig. 6 mostra o efeito de IL-18BPb & IL-18BPd na apoptose induzida por Trail nas células L929. A significância foi calculada em relação a células estimuladas por TRAIL, *p<0,05 **p<0,005. A Fig. 7 mostra a expressão da IL-18BPd em vários tecidos de humanos. A expressão GAPDH foi usada como um controlo interno.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS A SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência de aminoácido da isoforma IL-18BPb. A SEQ ID NO: 2 corresponde à sequência de aminoácido da isoforma IL-18BPd. A SEQ ID NO: 3 corresponde à sequência de aminoácido da isoforma IL-18BPa. A SEQ ID NO: 4 corresponde à sequência de aminoácido da isoforma IL-18BPc.

As SEQ ID NO: 5-12 correspondem às sequências de nucleótidos dos primers usados no Exemplo 5.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

No quadro da presente invenção, verificou-se que as IL-18BPb e IL-18BPd diminuíram a secreção tanto na citocina pro-inflamatória IL-6 como na quemocina MCP-1 nas células astrogliais co-estimuladas por IL-Ιβ e IFN-γ.

Para além disto, foi mostrado que a menos que as IL-18a e IL-18c, IL-18BPb e IL-18BPd induzam a translocação nuclear STAT2 nas células do glioblastoma, sendo STAT2 um fator que atua como um modulador da resposta inflamatória. 24 A invenção é também baseada na constatação de que as IL-18BPb e IL-18BPd protegem significativamente as células do fibroblasto da apoptose induzida por Trail. A evidência experimental aqui apresentada fornece uma nova possibilidade de tratamento das doenças neurológicas e/ou inflamatórias.

[A invenção, portanto, diz respeito ao uso de uma isoforma de IL-18BP que não se liga a IL-18 para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças neurológicas e/ou inflamatórias. 0 termo "IL-18BP", como aqui usado, refere-se a proteínas ligantes IL-18 como definido na WO 99/09063 ou em Novick et al. (1999) incluindo variantes de emenda e/ou isoformas de proteínas ligantes IL-18. O termo "IL-18BP", como aqui usado, abrange ainda muteínas, proteínas fundidas, derivados funcionais, frações ativas ou fragmentos, ou derivados circularmente permutados, ou os seus sais. Quatro isoformas humanas diferentes são conhecidas atualmente: IL-18BPa, IL-18BPb, IL-18BPc e IL-18BPd. Estas isoformas são definidas em Kim et al. (2000) . A IL-18BPb corresponde à SEQ ID NO: 1, a IL-18BPd corresponde à SEQ ID NO: 2, a IL-18BPa corresponde à SEQ ID NO: 3 e a IL-18BPc corresponde à SEQ ID NO: 4.

Como aqui usado, o termo "isoforma de IL-18BP que não se liga a IL-18" refere-se a uma isoforma de IL-18BP que não tem a capacidade de se ligar e/ou neutralizar IL-18 como definido em Kim et al. (2000) . O termo " isoforma de IL-18BP que não se liga a IL-18" refere-se a polipéptidos que correm naturalmente assim como a muteínas, sais, frações ativas derivadas funcionais de proteínas fundidas ou 25 derivados destas circularmente permutadas. Isoformas de IL-18BP que correm naturalmente que não se ligam a IL-18 incluem IL-18BPb humana e IL-18BPd humana. Uma "isoforma de IL-18BP que não se liga a IL-18" pode também referir-se a uma "isoforma de IL-18BP de acordo com a invenção". A capacidade de uma isoforma de IL-18BP para ligar IL-18 pode por exemplo ser medida usando um chip sensor BIAcore com IL-18 maduro imobilizado conforme divulgado, como descrito em Kim et al. (2000) . Um tal método permite o cálculo da média da constante de dissociação, da taxa de associação e da taxa de dissociação. A capacidade de uma isoforma de IL-18BP para neutralizar IL-18 pode, por exemplo, ser medida através da medição do efeito da isoforma de IL-18BP na atividade biológica de IL-18 num ensaio como, por exemplo, aqueles listados no parágrafo intitulado "Ensaios IL-18 em Humano e Ratinhos" nas páginas 1190-1191 de Kim et al. (2000). Como alternativa, a capacidade de uma isoforma de IL-18BP para neutralizar IL-18 pode ser medida como indicado no parágrafo intitulado "Titulação da Atividade de IL-18BP" na página 1192 de Kim et al. (2000). 0055 Os termos "tratar" e "prevenir", como aqui usados, devem ser entendidos como para prevenir, inibir, atenuar, melhorar ou reverter um ou mais sintomas ou causa(s) de doença neurológica inflamatória, assim como sintomas, doenças ou complicações que acompanham a doença neurológica inflamatória. Quando "se trata" a doença neurológica e/ou inflamatória, as substâncias de acordo com a invenção são dadas após o aparecimento da doença, a "prevenção" relaciona-se com a administração das substâncias antes de os sinais da doença poderem ser notados no doente. 26 0 termo "doenças neurológicas inflamatórias", como aqui usado engloba todas as doenças ou distúrbios, ou lesões neurológicos inflamatórios do SNC ou SNP conhecidos. De preferência, a referida doença neurológica inflamatória é uma doença neurológica associada com a neuro-inflamação, referida como "doença inflamatória neurológica". Estas doenças incluem aquelas descritas em pormenor nos "Antecedentes da invenção".

As doenças neurológica inflamatórias compreendem distúrbios ligados à disfunção do SNC ou SNP, tal como doenças relacionadas com a neurotransmissão, dor de cabeça, traumatismo da cabeça, infeções do SNC, distúrbios dos nervos neuro-oftalmológico e craniano, função e disfunção dos lobos cerebrais, distúrbios do movimento, torpor e coma, doenças desmielinizantes, delírio e demência, anomalias da junção craniocervical, distúrbios de convulsão, distúrbios da espinal medula, distúrbios do sono, distúrbios do sistema nervoso periférico, doença cerebrovascular, ou distúrbios musculares. Para as definições destes distúrbios ver, por exemplo, The Merck Manual for Diagnosis and Therapy, 17a Edição, publicado por Merck Research Laboratories, 1999.

De preferência, as doenças neurológicas inflamatórias da invenção são selecionadas a partir do grupo que consiste em lesão traumática do nervo, enfarte, doenças desmielinizantes do SNC ou SNP, neuropatias e doenças neurodegenerativas crónicas. A lesão traumática do nervo pode estar relacionada com o SNP ou o SNC, pode ser traumatismo do cérebro ou da espinal medula, incluindo paraplegia, como descrito nos "antecedentes da invenção" acima. 27 A trombose pode ser causada por hipóxia ou por isquémia cerebral. É também chamada de doença ou acidente cerebrovascular. A trombose pode envolver perda das funções cerebrais (déficits neurológicos) causada por uma perda de circulação de sangue em áreas do cérebro. A perda de circulação de sangue pode ser devida a coágulos de sangue que se formam no cérebro (trombo) , ou a pedaços de placa aterosclerótica ou outro material que viajem para o cérebro de outro local (êmbolos). As perdas sanguíneas (hemorragia) dentro do cérebro podem causar sintomas que mimetizam o acidente vascular. A causa mais comum de um acidente vascular é o acidente vascular secundário à aterosclerose (trombose cerebral), e, portanto, a invenção também se relaciona com o tratamento da aterosclerose. A Neuropatia Periférica pode estar relacionada com um síndroma de perda sensorial, fraqueza muscular e atrofia, diminuição dos reflexos tendinosos profundos, e sintomas vasomotores, sozinhos ou em qualquer combinação. A neuropatia pode afetar um único nervo (mononeuropatia), dois ou mais nervos em áreas separadas (mononeuropatia múltipla) ou muitos nervos simultaneamente (polineuropatia). 0 axónio pode ser afetado primariamente (por exemplo, na diabetes mellitus, doença de Lyme, ou urémia ou com agentes tóxicos) ou a bainha de mielina ou as células de Schwann (por exemplo, em polineuropatia inflamatória aguda ou crónica, leucodistrofias, ou síndroma de Guillain-Barré). Outras neuropatias que podem ser tratadas de acordo com a presente invenção, por exemplo, podem ser devidas à toxicidade por chumbo, uso de dapsona, picada da carraça, porfiria, ou síndroma de Guillain-Barré, e podem afetar primariamente as fibras motoras. Outras, tais como as causadas por ganglionite do cancro da raiz 28 dorsal de câncer, hanseniase, SIDA, diabetes mellitus, ou intoxicação crónica por piridoxina, pode afetar principalmente os gânglios da raiz dorsal ou as fibras sensoriais, produzindo sintomas sensoriais. Os nervos cranianos também podem estar envolvidos, como por exemplo, no síndroma de Guillain-Barré, doença de Lyme, diabetes mellitus, e difteria. A doença de Alzheimer é um distúrbio envolvendo deterioração nas funções mentais resultantes das alterações no tecido cerebral. Isto pode incluir encolhimento dos tecidos cerebrais, demência degenerativa primária e atrofia cerebral difusa. A doença de Alzheimer é também chamada de demência senil/tipo Alzheimer (DSTA). A doença de Parkinson é um distúrbio cerebral, incluindo agitação e dificuldade em andar, do movimento e da coordenação. A doença está associada a danos numa parte do cérebro que controla o movimento muscular, e é também chamada paralisia agitante ou paralisia tremente. A doença de Huntington é uma doença inflamatória neurológica hereditária, dominante autossómica. A anomalia genética consiste num número excessivo tandem repetido de sequências de nucleotideos CAG. Outras doenças com repetições de CAG incluem, por exemplo, atrofias musculares espinais (AME), tais como a doença de Kennedy, e a maioria das ataxias autossómicas dominantes do cerebelo (AADCs) que são conhecidas como ataxias espinocerebelares (AECs) quanto à nomenclatura genética. A Esclerose Lateral Amiotrófica, ELA, é uma doença que causa a perda progressiva do controle nervoso dos músculos voluntários, inclusive de destruição de células nervosas no 29 cérebro e medula espinal. A Esclerose Lateral Amiotrófica, também chamada de doença de Lou Gehrig, é um distúrbio que envolve a perda do uso e controle dos músculos. A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC) que leva a uma progressão recidivante remitente ou uma evolução progressiva. A EM não é a única doença desmielinizante. A sua contraparte no sistema nervoso periférico (SNP) é polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crónica (PDIC). Além disso, existem distúrbios monofásicos, agudos, como a polirradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória denominada síndroma de Guillain-Barré (SGB) no SNP e encefalomielite disseminada aguda (EMDA) no SNC.

As doenças neurológicas inflamatórias podem ainda ser devidas a doenças metabólicas congénitas. Numa forma de realização preferida da invenção, a doença neurológica e/ou inflamatória é, portanto, devida a um déficit metabólico congénito. Os distúrbios metabólicos congénitos abrangidos pela presente invenção podem ser, por exemplo, a diabetes, fenilcetonúria e outras aminoacidúrias, doença de Tay-Sachs, de Niemann-Pick, e de Gaucher, Síndroma de Hurler; doença de Krabbe e outras leucodistrofias. Podem afetar a bainha de mielina em desenvolvimento, principalmente no SNC.

As doenças neurológicas inflamatórias menos conhecidas também estão dentro do âmbito da presente invenção, tais como neurofibromatose, ou Atrofia de Sistemas Múltiplos (ASM) . Outros distúrbios que podem ser tratados de acordo com a presente invenção foram descritos em pormenor nos "Antecedentes da invenção" acima. 30

Numa forma de realização preferida adicional, a doença neurológica inflamatória é uma neuropatia periférica, o mais preferencialmente neuropatia diabética. Quimioterapia associada/neuropatias induzidas são também preferidas, de acordo com a presente invenção. O termo "neuropatia diabética" refere-se a qualquer forma de neuropatia diabética, ou a um ou mais sintoma (s) ou distúrbio (s) que acompanham ou são causados por neuropatia diabética, ou complicações de diabetes afetando os nervos, como descrito em pormenor nos "Antecedentes da invenção" acima. A neuropatia diabética pode ser uma polineuropatia. Na polineuropatia diabética, muitos nervos são afetados simultaneamente. A neuropatia diabética pode também ser uma mononeuropatia. Na mononeuropatia focal, por exemplo, a doença afeta um único nervo, como o nervo oculomotor ou o cranial abducente. Também pode ser uma mononeuropatia múltipla quando dois ou mais nervos são afetados em áreas separadas.

Numa forma de realização ainda mais preferida, a doença neurológica inflamatória é uma doença desmielizante. As doenças desmielinizantes de preferência compreendem estados de desmielinização do SNC, como encefalomielite desmielinizante aguda (EMDA) e esclerose múltipla (EM) , assim como doenças desmielinizantes do sistema nervoso periférico (SNP). A última compreende doenças tais como poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória crónica (CIDP e aguda, distúrbios monofásicos, tais como a poliradiculoneuropatia desmielinizante inflamatória designada síndroma de Guillain-Barré (SGB).

Uma forma de realização ainda mais preferida da invenção relaciona-se com o tratamento e/ou prevenção de uma doença neurodegenerativa. A doença neurodegenerativa é selecionada 31 a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e ELA. 0072 A isoforma de IL-18BP de acordo com a reivindicação 1 é selecionada a partir do grupo que consiste em: A) Um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 1; b) Um polipéptido compreendendo os aminoácidos 29 até 113 da SEQ ID NO: 1; c) Um polipéptido compreendendo os aminoácidos 78 até 113 da SEQ ID NO: 1; d) Um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 2; e) Um polipéptido compreendendo os aminoácidos 29 até 161 da SEQ ID NO: 2; f) Uma muteina de qualquer dos (a) , (b) , (d) ou (e) , em que a sequência de aminoácido tem pelo menos 75%, 80 %, 85%, 90 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com pelo menos uma das sequências em (a) até (e); g) Uma muteina de qualquer dos (a) até (e) a qual é codificada por uma sequência de ADN que hibridiza com o complemento da sequência de ADN nativo que codifica qualquer dos (a) até (e) sob condições de restrição moderadas ou sob condições de restrição elevadas; h) Uma muteina de qualquer dos (a) até (e) em que quaisquer alterações na sequência de aminoácido são substituições conservativas de aminoácidos das sequências de aminoácidos em (a) até (e); i) um sal ou uma proteína fundida, derivada funcional, fração ativa ou derivado permutado circularmente de qualquer de (a) até (h). 32 0 indivíduo perito na arte apreciará ainda que as muteínas, sais alélicos variantes, proteínas fundidas, derivados funcionais de uma isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção, frações ativas ou derivados circularmente permutados de uma isoforma de IL-18BP de ocorrência natural de acordo com a presente invenção, manterá uma atividade biológica similar, ou mesmo melhor, que a referida isoforma de ocorrência natural.

As frações ativas preferidas têm uma atividade que é igual ou melhor que a atividade da IL-18BPb ou IL-18BPd, ou que têm outras vantagens, tais como uma estabilidade melhor ou uma toxicidade ou imunogenicidade menor, ou que são mais fáceis de produzir em largas quantidades, ou mais fáceis de purificar. 0 indivíduo perito na arte apreciará que as muteínas, fragmentos ativos e derivados funcionais possam ser gerados por clonagem do correspondente cDNA em plasmídios apropriados e testarem-nas num ensaio de co-cultura, como mencionado acima.

As proteínas de acordo com a presente invenção podem ser glicosiladas ou não glicosiladas, podem ser derivadas de fontes naturais, tais como fluidos corporais, ou podem de preferência ser produzidas recombinantemente. A expressão recombinante pode ser realizada em sistemas de expressão procarióticos tais como E. coli, ou em eucarióticos, tais como células de inseto, e de preferência em sistemas de expressão de mamíferos, tais como células CHO ou células HEK.

Como aqui usado o termo "muteínas" refere-se a análogos de IL-18BPb ou IL-18BPd, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos naturais da isoforma IL-18-BP são substituídos por diferentes resíduos de aminoácidos, ou são excluídos, 33 ou um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados à sequência natural da isoforma IL-18-BP, sem alterar consideravelmente a atividade dos produtos resultantes, em comparação com a isoforma de IL-18BP tipo selvagem. Estas muteínas são preparadas por sínteses conhecidas e/ou por técnicas de mutagénese dirigidas ao sítio, ou qualquer outra técnica conhecida adequada para este fim. 0 termo "muteínas" engloba variantes alélicas de ocorrência natural de um polipéptido IL-18BPb da SEQ ID NO: 1 e/ou variantes alélicas de ocorrência natural de um polipéptido IL-18BPd da SEQ ID NO: 2.

As muteínas de uma isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção, que podem ser usadas de acordo com a presente invenção, ou os ácidos nucleicos que as codificam, incluem um conjunto finito de sequências substancialmente correspondentes como péptidos ou polinucleótidos de substituição que podem ser obtidos rotineiramente por um comum especialista na arte, sem grande experiência, com base nos ensinamentos e orientações aqui apresentadas.

As muteínas de acordo com a presente invenção incluem proteínas codificadas por um ácido nucleico, tal como um ADN ou ARN, as quais hibridam com o ADN ou ARN, que codificam uma isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção, sob condições de restrição moderadas ou elevadas. 0 termo "condições de restrição" refere-se a hibridação e subsequentes condições de lavagem, que aqueles com competências normais na técnica referem convencionalmente como "rigorosas". Ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 e 6.4 (1987, 1992), e Sambrook et al. (Sambrook, J. C, Fritsch, E.F., e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory 34

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Sem limitação, exemplos de condições rigorosas condições de lavagem incluem 12-20°C abaixo da Tm calculada para o híbrido em estudo, por exemplo, em 2 x SSC e SDS 0,5% por 5 minutos, 2 x SSC e 0,1% SDS por 15 minutos, 0,1 x SSC e SDS 0,5% a 37°C por 30-60 minutos e depois, de 0,1 x SSC e SDS 0,5% a 68°C por 30-60 minutos. Aqueles com competências normais nesta arte entenderão que as condições de restrição dependem também do comprimento das sequências de ADN, das sondas de oligonucleótidos (tais como 10-40 bases) ou sondas de oligonucleótidos mistas. Se são usadas sondas mistas, é preferível usar cloreto de tetrametil amónio (TMAC) em vez de SSC. Ver Ausubel, supra.

Numa forma de realização preferida, qualquer das muteínas tem pelo menos 40% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 1 ou com a sequência da SEQ ID NO: 2 da lista de sequência anexa. Mais preferencialmente, tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou, o mais preferencialmente, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da mesma identidade.

Numa outra forma de realização preferida, essa muteína tem pelo menos 40% de identidade com a sequência de uma isoforma de IL-18BP de ocorrência natural que não se liga a IL-18BP. Mais preferencialmente, tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou, o mais preferencialmente, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da mesma identidade. A identidade reflete a relação entre duas ou mais sequências de polipéptidos ou duas ou mais sequências de 35 polinucleótidos, determinada pela comparação das sequências. Em geral, a identidade refere-se a uma correspondência exata nucleótido a nucleótido ou aminoácido a aminoácido de dois polinucleótidos ou duas sequências de polipéptidos, respetivamente, sobre o comprimento das sequências a serem comparadas.

Para sequências em que não há correspondência exata, pode ser determinada uma "% de identidade". Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. Isto pode incluir a inserção de "gaps" só numa ou em ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. Uma % de identidade pode ser determinada em todo o comprimento de cada uma das sequências a serem comparadas (chamado "alinhamento global"), que é particularmente adequado para sequências do mesmo ou de comprimento similar, ou sobre comprimentos mais curtos, comprimentos definidos (chamado "alinhamento local"), que é mais adequado para sequências de comprimento desigual. No quadro da presente invenção, a " % de afinidade" refere-se à percentagem de identidade global que foi determinada em todo o comprimento das sequências a serem comparadas.

Programas de computador conhecidos podem ser usados para determinar quando qualquer polipéptido particular é uma percentagem idêntica a uma sequência da presente invenção. Tais algoritmos e programas incluem, por exemplo TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, e CLUSTALW (Altschul et al. , 1990a; Altschul et al., 1997a; Higgins et al., 1996; Pearson e Lipman, 1988; Thompson et al., 1994) . As homologias de sequências de proteínas e ácidos nucleicos são de preferência avaliadas usando o Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"), que é bem conhecido na técnica (Altschul et 36 al., 1990b; Altschul βt al., 1997b; Karlin and Altschul, 1990b)) .

Os programas BLAST identificam as sequências homólogas através da identificação de segmentos similares, os quais são referidos aqui como "pares de segmentos de alto valor," entre uma consulta de sequência de amino ou ácido nucleico e uma sequência de teste que é obtida de preferência a partir de uma base de dados de sequências de proteínas ou ácidos nucleicos. Pares de segmentos de alto valor são preferencialmente identificados (i.e., alinhados) por meios de matriz de classificação, muitas das quais são conhecidas na arte. Uma matriz de classificação usada pode ser a matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992; Henikoff e Henikoff, 1993) . As matrizes PAM ou PAM250 podem também ser usadas {Ver, por exemplo, Schwartz e Dayhoff, eds, (1978) Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation). Os programas BLAST avaliam a significância estatística de todos os pares de segmentos de alto valor identificados, e de preferência seleciona aqueles segmentos que satisfazem um limite de significância especificado pelo utilizador, tal como uma percentagem de homologia especificada pelo utilizador. Preferencialmente, a significância estatística do par de segmentos de alto valor é avaliada usando a fórmula de significância estatística de Karlin (Karlin e Altschul, 1990a). Os programas BLAST podem ser usados com os parâmetros padrão ou com parâmetros modificados fornecidos pelo utilizador.

Um método preferido para determinar a melhor correspondência geral entre uma sequência de consulta (a sequência da presente invenção) e uma sequência objeto, também referida como um alinhamento global de sequência, 37 pode ser determinado usando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag (Brutlag et ai., 1990). Num alinhamento de sequência as sequências de consulta e objeto são ambas sequências de aminoácidos. O resultado do referido alinhamento de sequência global é em percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos usados num alinhamento de aminoácidos FASTDB são: Matriz=PAM 0, k-tupla=2, Penalização de não correspondência=l, Penalização de junção=20, Grupo de randomização=25, Comprimento=0, Pontuação de corte=l, Tamanho da janela=comprimento da sequência, penalização da abertura=5, Penalização do tamanho da abertura=0,05, Tamanho de Janela=247 ou o comprimento da sequência de aminoácido objeto, o que for menor.

Se a sequência objeto é mais curta que a sequência de consulta devido a deleções C ou N terminais, não devido às deleções internas, os resultados, em percentagem de identidade, devem ser corrigidas manualmente porque o programa FASTDB não leva em conta as truncações N e C terminais da sequência objeto quando se calcula a percentagem de identidade global. Para as sequências objeto truncadas nos terminais N e C, relativos à sequência de consulta, a percentagem de identidade é corrigida através do cálculo do número de resíduos da sequência de consulta que estão no terminal N e C da sequência objeto, que não são correspondentes/alinhados com o resíduo objeto correspondente, como uma percentagem das bases totais da sequência de consulta. Se um resíduo correspondente/alinhado é determinado pelos resultados do alinhamento de sequência FASTDB. Esta percentagem é depois subtraída da percentagem de identidade, calculada pelo programa FASTDB acima usando os parâmetros especificados, para chegar a uma pontuação final de percentagem de 38 identidade. Esta pontuação final de percentagem de identidade é a que é usada para os fins da presente invenção. Somente os resíduos N e C terminais da sequência objeto, que não são correspondentes/alinhados com a sequência de consulta, são considerados para os fins de ajustamento manual da pontuação da percentagem de identidade. Ou seja, somente os resíduos de aminoácidos de consulta fora dos resíduos N e C terminais mais afastados da sequência objeto.

Por exemplo, uma sequência objeto de 90 resíduos de aminoácidos é alinhada com uma sequência de consulta de 100 resíduo para determinar a percentagem de identidade. A deleção ocorre no terminal N da sequência objeto e portanto, o alinhamento FASTDB não corresponde/alinha com os primeiros resíduos no N terminal. Os 10 resíduos não emparelhados representam 10% da sequência (número de resíduos nos terminais N e C não correspondidos/número total de resíduos na sequência de consulta) assim 10% são subtraídos do valor da percentagem de identidade calculado através do programa FASTDB. Se os restantes 90 resíduos forem perfeitamente correspondentes a percentagem de identidade final deve ser 90%.

Variações preferidas para muteínas de acordo com a presente invenção são as que são conhecidas como substituições "conservativas". Substituições conservativas de aminoácido de isoformas de IL-18BP de acordo com a presente invenção, podem incluir aminoácidos sinónimos dentro do grupo que tem propriedades físico-químicas suficientemente similares esta substituição entre os membros do grupo irá preservar a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É evidente que as inserções e deleções dos aminoácidos pode também ser feita nas sequências acima definidas sem alterar a sua 39 função, particularmente se as inserções ou deleções envolverem somente alguns aminoácidos, por exemplo abaixo de trinta, e de preferência abaixo de dez, e não removem ou deslocam os aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo resíduos de cisteína. As proteínas e muteínas produzidas por essas deleções e/ou inserções cabem dentro dos pressupostos da presente invenção.

De preferência, os grupos de aminoácido sinónimos são os definidos na Tabela I. Mais preferencialmente, os grupos de aminoácido sinónimos são os definidos na Tabela II; e o mais preferencialmente os grupos de aminoácido sinónimos são os definidos na Tabela III.

TABELA I

Grupos de Aminoácido Sinónimos Preferidos Aminoácidos Grupos de Sinónimos

Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His Leu lie, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Vai Met, Tyr, Phe, lie, Leu, VAI Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly lie Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, lie Phe Trp, Met, Tyr, lie, Vai, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Vai, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Asn Gin, Asp, Ser, Asn

Lys

Glu, Gin, His, Arg, Lys 40 40 Asp Glu, Asn, Asp GIu Asp, Lys, Asn, Gin, His Met Phe, lie, Vai, Leu, Met Trp Trp

TABELA II

Grupos de Aminoácido Sinónimos Mais Preferidos

Aminoácidos Grupos de Sinónimos Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Vai Vai, Met, lie Gly Gly lie lie, Met, Phe, Vai, Leu Phe Met, Tyr, lie, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gin, Arg Gin Glu, Gin, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gin Met Met, Phe, lie, Vai, Leu Trp Trp

TABELA III

Grupos de Aminoácido Sinónimos os Mais Preferidos Aminoácidos Grupos de Sinónimos

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu, lie, Met

Pro

Pro 41 41 Thr Thr Ala Ala Vai Vai Gly Gly lie lie Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys His His Gin Gin Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met Trp Met

Leu

Exemplos da produção de substituições de aminoácido em proteínas que podem ser usadas para obter muteinas de uma isoforma de IL-18BP que ocorre naturalmente de acordo com a presente invenção, para uso na presente invenção incluem quaisquer passos de métodos conhecidos, tais como os apresentados nas patentes US 4,959,314, 4,588,585 e 4,737,462, de Mark et al; 5,116,943 de Koths et al., 4, 965, 195 de Namen et al; 4,879, 11 1 de Chong et al; e 5,017,691 de Lee et al; e as proteínas substituídas por lisina apresentadas na patente US No. 4,904,584 (Shaw et al) . O termo "proteína fundida" refere-se a um polipéptido compreendendo uma isoforma de IL-18BP que ocorre naturalmente de acordo com a presente invenção, ou uma muteína ou um seu fragmento, fundida com outra proteína, que, por exemplo, tem um tempo de permanência prolongado 42 nos fluidos corporais. A isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção pode portanto ser fundida com outra proteína, polipéptido ou afins, por exemplo uma imunoglobulina ou um seu fragmento. As porções Fc de imunoglobulina são particularmente adequadas para a produção de proteínas de fusão Ig di ou multiméricas. A isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção pode por exemplo ser ligada a porções de uma imunoglobulina de modo a produzir a isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção dimerizada pela porção Ig Fc. Numa outra forma de realização, a sequência da isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção é fundida a um péptido sinal e/ou a uma sequência líder permitindo uma secreção aumentada. A sequência líder pode, por exemplo, corresponder ao pré-propéptido IgSP-tPA divulgado no Pedido PCT PCT/EP2004/052302. "Derivados funcionais" como aqui usado, cobrem derivados de isoformas de IL-18BP que ocorrem naturalmente de acordo com a presente invenção, e suas muteínas e proteínas fundidas, os quais podem ser preparados a partir de grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos ou nos grupos N ou C terminais, por meios conhecidos na arte, e são incluídos da invenção enquanto se mantêm farmaceuticamente aceitáveis, i.e. não destroem a atividade da proteína que é substancialmente similar à atividade de IL-18BPb e/ou IL-18BPd, e não confere propriedades tóxicas às composições que os contêm.

Estes derivados podem, por exemplo, incluir cadeias laterais de polietilenoglicois, que podem mascarar os sítios antigénicos e estender a permanência das isoformas de IL-18BP nos fluidos corporais. Outros derivados incluem os ésteres alifáticos dos grupos carboxilo, amidas dos 43 grupos carboxilo por reação com amónia ou com aminas primárias ou secundárias, derivados N-acilo de grupos amina livres dos resíduos de aminoácidos formados com metades de acilo (por exemplo, grupos alcanoílo ou grupos aroílo carbocíclicos) ou derivados O-acilo de grupos hidroxilo livres (por exemplo os de resíduos de serilo ou treonilo) formados com metades acilo.

As "frações ativas" de isoformas de IL-18BP que correm naturalmente de acordo com a presente invenção, muteínas e proteínas fundidas, a presente invenção cobre qualquer fragmento ou precursores da cadeia de polipéptido da molécula de proteína sozinha ou com moléculas ou resíduos associados ou a eles ligados, por exemplo resíduos açúcar ou fosfato, ou agregados da molécula de proteína ou resíduos de açúcar por si sós, desde que a dita fração tenha atividade substancialmente semelhante à da IL-18BPb e/ou IL-18BPd. 0 termo "sais" aqui refere-se tanto a sais de grupos carboxilo como a sais de adição de ácido de grupos amina de uma isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção ou análogos dos mesmos. Sais de um grupo carboxilo podem ser formados por meios conhecidos na arte e incluem sais inorgânicos, por exemplo, de sódio, cálcio, amónio, sais férricos ou de zinco, e similares, e sais com bases orgânicas formados como aqueles, por exemplo, com aminas, tais como a trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaína e similares. Sais de adição de ácido incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. É claro que qualquer desses tais sais deve manter 44 a atividade biológica da isoforma de IL-18BP relevantes para a presente invenção.

Derivados funcionais de isoformas de IL-18BP de acordo com a presente invenção isoformas de IL-18BP de acordo com a presente invenção podem ser conjugados com polímeros com vista a melhorar as propriedades da proteína, tais como a estabilidade, a meia-vida, biodisponibilidade, tolerância pelo corpo humano, ou imunogenicidade. Para atingir este objetivo, uma isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção pode ser ligada por exemplo, a Polietilenoglicol (PEG) . A PEGilação pode ser realizada através de métodos conhecidos, descritos na WO 92/13095, por exemplo.

Portanto, numa forma de realização preferida da presente invenção, a isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção é PEGilada.

Numa forma de realização mais preferida da invenção, a proteína fundida compreende uma fusão imunoglobulina (Ig). A fusão pode ser direta, ou através de um péptido ligante curto que pode ser tão curto como 1 até 3 resíduos de aminoácidos de comprimento ou mais comprido, por exemplo, 13 resíduos de aminoácidos de comprimento. O referido ligando pode ser um tripéptido da sequência E-F-M (Glu-Phe-Met), por exemplo, ou uma sequência ligando de 13-aminoácido compreendendo Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introduzidos entre a sequência da isoforma de IL18BP e a sequência de imunoglobulina, por exemplo. A proteína de fusão resultante tem propriedades melhoradas, tal como uma permanência nos fluidos corporais prolongada no tempo (meia-vida) , ou uma atividade específica aumentada, um nível de expressão aumentado. A 45 fusão Ig pode também facilitar a purificação da proteína fundida.

Ainda numa outra forma de realização preferida, uma isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção é fundida à região constante de uma molécula Ig. De preferência, é fundida a regiões de cadeia pesada, tais como os domínios CH2 e CH3 do IgGl humano, por exemplo. Outras isoformas de moléculas de Ig também são adequadas para a produção de proteínas de fusão de acordo com a presente invenção, tais como isoformas IgG2 ou IgG4, ou outras classes Ig, como IgM, por exemplo. As proteínas de fusão podem ser monomérica ou multimérica, hetero ou homomultiméricas. A porção imunoglobulina da proteína fundida pode ser modificada de forma a não ativar a ligação complementar ou a cascata de complemento, ou ligar a receptores de Fc. A invenção refere-se ainda ao uso de uma combinação de uma isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção e um agente imunosupressor para o fabrico de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de uma doença neurológica e/ou inflamatória, para uso simultâneo, sequencial ou separado. Os agentes imunossupressores podem ser esteróides, metotrexato, ciclofosfamida, anticorpos anti-leucocitários (tais como CAMPATH-l),e semelhantes. A invenção relaciona-se ainda com o uso simultâneo, sequencial ou separada de: (i) uma isoforma de IL-18BP como definido na reivindicação 1; e (ii) um polipéptido selecionado a partir do grupo que consiste num interferão, osteopontina e clusterina 46 para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de uma doença neurológica e/ou inflamatória. 0 termo "interferão", como usado no presente pedido de patente, é entendido para incluir qualquer molécula definida como tal na literatura, compreendendo por exemplo quaisquer tipos de IFNs mencionados acima na secção "Antecedentes da invenção". 0 interferão pode de preferência ser humano, mas também derivado de outras espécies, desde que a atividade biológica seja similar à dos interferões humanos, e a molécula não seja imunogénica no homem. Em particular, quaisquer tipos de IFN-a, IFN-β e IFN-γ são incluídos na definição abaixo. 0 IFN-β, e mais especificamente o IFN^la, é o IFN preferido de acordo com a presente invenção. 0 termo "interferão-beta (IFN-β)", como usado na presente invenção, é entendido para incluir o interferão do fibroblasto humano, como obtido por isolamento a partir de fluidos biológicos ou como obtido por técnicas de ADN recombinante das células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas assim como os seus sais, derivados funcionais, variantes, análogos e fragmentos. Os interferões podem também ser conjugados a polímeros com vista a melhorar a estabilidade das proteínas. Um conjugado entre o interferão β e o poliol polietilenoglicol (PEG) foi descrito na W099/55377, por exemplo. "Osteopontina", como aqui usado, engloba também muteínas, fragmentos, frações ativas e derivados funcionais da osteopontina. Estas proteínas são descritas por exemplo na WO 02/092122. "Clusterina", como aqui usado, engloba também muteínas, fragmentos, frações ativas e derivados funcionais de 47 clusterina. Estas proteínas são descritas por exemplo na WO 04/084932.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, a isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção é usada numa quantidade de: a) cerca de 0,001 até 100 mg/kg de peso corporal; ou b) cerca de 0,01 até 10 mg/kg de peso corporal; ou c) cerca de 0,1 tol mg/kg de peso corporal; ou d) cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 mg/kg de peso corporal. A invenção relaciona-se ainda com o uso de uma molécula de ácido nucleico para fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença neurológica periférica, em que molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: a) Um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 1; b) Um polipéptido compreendendo os aminoácidos 29 até 113 da SEQ ID NO: 1; c) Um polipéptido compreendendo os aminoácidos 78 até 113 da SEQ ID NO: 1; d) Um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 2; e) Um polipéptido compreendendo os aminoácidos 29 até 161 da SEQ ID NO: 2; f) Uma muteína de qualquer dos (a), (b), (d) ou (e) , em que a sequência de aminoácido tem pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com pelo menos uma das sequências em (a) até (e); 48 g) Uma muteína de qualquer dos (a) até (e) que é codificada por uma sequência de ADN que híbrida com o complemento da sequência de ADN nativo que codifica qualquer de (a) até (e) sob condições de restrição moderadas ou sob condições de restrição elevadas; h) Uma muteina de qualquer dos (a) até (e) em que quaisquer alterações na sequência de aminoácidos são substituições de aminoácidos conservativas nas sequências de aminoácidos em (a) até (e); i) um sal ou uma proteína fundida, derivada funcional, fração ativa ou derivado permutado circularmente de qualquer dos (a) até (h). 0 ácido nucleico pode por exemplo ser administrado como uma molécula de nucleico nua, por exemplo por injeção intramuscular.

Pode ainda compreender sequências vetoras, tais como sequências virais, úteis para a expressão do gene codificado pela molécula de ácido nucleico no corpo humano, de preferência em células ou tecidos apropriados.

Portanto, numa forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência de vetor de expressão. As sequências de vetor de expressão são bem conhecidas na arte, compreendem outros elementos que servem para expressão do gene de interesse. Podem compreender sequências reguladoras, tais como sequências promotoras e aumento, sequências marcadoras de seleção, origens de multiplicação, e afins. Uma abordagem de gene terapêutico é portanto usada para tratar e/ou prevenir a doença. Vantajosamente, a expressão da isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção será então in situ. 49

Numa forma de realização preferida da invenção, o vetor de expressão pode ser administrado através de injeção intramuscular. 0 uso de um vetor para a induzir e/ou aumentar a produção endógena de uma isoforma de IL-18BP de acordo com a invenção numa célula normalmente silencia a expressão da referida isoforma de IL-18BP, ou que expressa as quantidades da referida isoforma de IL-18BP que não são suficientes, estão também contempladas de acordo com a invenção. 0 vetor pode compreender sequências reguladoras funcionais nas células desejadas para expressar a isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção. Essas sequências reguladoras podem ser promotoras ou aumentadoras, por exemplo. A sequência reguladora pode então ser introduzida no local apropriado do genoma por recombinação homóloga, deste modo ligando operacionalmente a sequência reguladora com o gene, a expressão do qual é necessário que seja induzida ou aumentada. A tecnologia é normalmente referida como "ativação do gene endógeno" (EGA), e é descrita por exemplo, na WO 91/09955. A invenção relaciona-se ainda com o uso de uma célula que foi geneticamente modificada para produzir uma isoforma de IL-18BP de acordo com a invenção no fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças neurologicamente periféricas. É também descrita uma célula que foi geneticamente modificada para produzir uma isoforma de IL-18BP de acordo com a invenção para o fabrico de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de doenças neurológicas. Deste modo, uma abordagem terapêutica da célula pode ser usada 50 com vista a aplicar um fármaco nas partes adequadas do corpo humano.

[0115] A invenção relaciona-se adicionalmente com composições farmacêuticas, particularmente úteis para prevenção e/ou tratamento de doenças neurológicas e/ou inflamatórias, que compreendem: a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma isoforma de IL-18BP de acordo com a invenção, ou de um seu agonista; b) um transportador farmaceuticamente aceitável; e opcionalmente c) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um imunosupressor. O imunosupressor pode por exemplo ser um polipéptido selecionado a partir do grupo que consiste em um interferão, osteopontina e clusterina. A definição de "transportador farmaceuticamente aceitável" é entendida para englobar qualquer transportador, o qual não interfere com a eficácia da atividade biológica do componente ativo e que é não tóxica para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, a(s) proteína(s) ativa(s) podem ser formuladas numa forma de dosagem unitária para injeção em veículos como soro fisiológico, solução de dextrose, albumina e solução de Ringer.

Os componentes ativos da composição farmacêutica de acordo com a invenção podem ser administrados a um indivíduo numa variedade de vias. As vias de administração incluem intradérmica, transdérmica (por exemplo em formulações de 51 libertação lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral, epidural, tópica, intratecal, retal, e intranasal. Quaisquer outras vias terapeuticamente eficazes de administração podem ser usadas, por exemplo absorção através de tecidos epiteliais ou endoteliais ou por terapia genética em que uma molécula de ADN que codifica o agente ativo é administrado a um doente (por exemplo via de um vetor) , o que faz com que o agente ativo seja expresso e segregado ín vivo. Para além disso, a(s) proteína(s) de acordo com a invenção podem ser administradas com outros componentes de agentes biologicamente ativos tais como tensoativos, excipientes, transportadores, diluentes e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Para administração parentérica (por exemplo intravenosa, subcutânea, intramuscular), a(s) proteína(s) ativa(s) podem ser formuladas como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável (por exemplo água, soro fisiológico, solução de dextrose) e aditivos que mantenham a isotonicidade (por exemplo manitol) ou a estabilidade química (por exemplo conservantes e tampões). A formulação é esterilizada através de técnicas comummente usadas. A biodisponibilidade da(s) proteína(s) ativa(s) de acordo com a invenção podem também ser melhoradas pelo uso da conjugação de procedimentos os quais aumentam a meia vida da molécula no corpo humano, por exemplo ligando a molécula a polietilenoglicol, como descrito no de Pedido de patente PCT WO 92/13095.

As quantidades terapeuticamente eficazes da(s) proteína(s) ativa(s) serão uma a função de muitas variantes, incluindo 52 do tipo de proteína, da afinidade da proteína, qualquer atividade citotóxica residual exibida pelos antaqonistas, a via de administração, a condição clínica do doente (incluindo a conveniência de manter um nível não tóxico da atividade endóqena da IL-18BP). A "quantidade terapeuticamente eficaz" é de modo a que quando administrada, a isoforma de IL-18BP de acordo com a presente invenção exerce um efeito benéfico na doença neurológica e/ou inflamatória. A dosagem administrada, como doses única ou múltipla, a um indivíduo varia de acordo com uma variedade de fatores, incluindo as propriedades farmacocinéticas de IL-18BP, a via de administração, as condições e característica do doente (sexo, idade, peso corporal, saúde, tamanho), da extensão dos sintomas, tratamentos simultâneos, frequência do tratamento e do efeito desejado. A isoforma de IL-18BP de acordo com a invenção pode de preferência ser usada numa quantidade de cerca de 0,001 até 10 mg/kg ou cerca de 0,01 até 5 mg/kg de peso corporal ou cerca de 0,1 até 3 mg/kg de peso corporal ou cerca de 1 até 2 mg/kg de peso corporal. Além disso as quantidades preferidas de IL-18BP são quantidades de cerca de 0,1 até 1000 pg/kg de peso corporal ou cerca de 1 até 100 pg/kg de peso corporal ou cerca de 10 até 50 μρ/kg de peso corporal. A via de administração, que é preferida de acordo com a invenção, é a administração por via subcutânea. A administração intramuscular é adicionalmente preferida de acordo com a invenção. 53

Noutras formas de realização preferidas, a isoforma de IL-18BP de acordo com a invenção é administrada diariamente ou em dias alternados.

As doses diárias são geralmente dadas em doses divididas ou em formas de libertação sustentada eficazes para obter os resultados desejados. As segundas ou as administrações subsequentes podem ser realizadas numa dose que é igual, menor que ou maior que a inicial ou a dose prévia administrada a um indivíduo. A segunda e a administração subsequente podem ser administradas durante ou antes do início da doença.

De acordo com a invenção, a isoforma de IL-18BP de acordo com a invenção pode ser administrada profilaticamente ou terapeuticamente a um indivíduo antes de, simultaneamente ou sequencialmente a outros regimes ou agentes terapêuticos (por exemplo regimes de fármacos múltiplos), numa quantidade terapeuticamente eficaz, em particular com um interferão. Os agentes ativos que são administrados simultaneamente com outros agentes terapêuticos podem ser administrado nas mesmas ou em composições diferentes. A descrição das formas de realização específicas acima revelarão mais plenamente a natureza geral da invenção que outras podem, por aplicação do conhecimento do especialista na arte (incluindo os conteúdos das referências aqui citadas), prontamente modificadas e/ou adaptadas para várias aplicações tais como formas de realização específicas, sem a experiência devida, sem se afastar do conceito geral da presente invenção. Portanto, pretende-se que essas adaptações e modificações estejam na gama de significado dos equivalentes das formas de realização divulgadas, com base nos ensinamentos e guias aqui 54 apresentados. É para ser entendido que a fraseologia ou terminologia aqui é para fins de descrição e não de limitação, de modo a que a terminologia ou fraseologia da presente especificação é para ser interpretada por um especialista à luz dos ensinamentos e guias aqui apresentados, em combinação com o conhecimento de um vulgar especialista na técnica.

Tendo já sido descrita a invenção, serão mais rapidamente entendidos como referência dos seguintes exemplos que são dados para ilustrar e não são entendidos como limitativos da presente invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Expressão recombinante de IL-18BPb e de isoformas d

As isoformas IL-18BPb e IL-18BPd, fundidas a um tag na suas extremidades C terminais para permitir a sua purificação, foram expressas nas células HEK e purificadas como se segue. 100 mL da amostra de meio de cultura contendo a proteína recombinante foram diluídos com 100 mL de tampão A frio (NaH2PC>4 a 50 mM; NaCl a 600 mM; 8,7 % (p/v) de glicerol, pH 7,5) . A amostra foi filtrada através de um filtro estéril de 0,22 μπι (Millipore, 500 mL unidade de filtro) e mantida num frasco de meio quadrado esterilizado (Nalgene). A purificação foi realizada a 4°C numa plataforma de trabalho VISION (Applied Biosystems) ligada a um carregador de amostras automático (Labomatic). O procedimento de purificação compreende dois passos de sequência: 55 cromatografia de afinidade especifica para o tag seguido por filtração em gel numa coluna (1,0 x 10 cm) de meio de Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia). O primeiro passo de cromatografia resultou na eluição da proteína recolhida numa fração de 1,6 mL.

Para o segundo passo de cromatografia, a coluna de filtração em gel Sephadex G-25 foi regenerada com 2 mL de tampão D (NaCl a 1,137 M; KC1 a 2,7 mM; KH2P04 a 1,5 mM; Na2HPC>4 a 8 mM; pH 7,2), e subsequentemente equilibrada com 4 volumes da coluna do tampão C (NaCl a 137 mM; KC1 a 2,7 mM; KH2PO4 a 1,5 mM; Na2HPC>4 a 8 mM; 20% (p/v) de glicerol; pH 7,4) . A fração do pico eluído do primeiro passo foi automaticamente carregado através do carregador de amostra integrado do aparelho VISION na coluna de Sephadex G-25. A proteína foi eluída com o tampão C a uma taxa de fluxo de 2 mL/min. A amostra desalinizada foi recuperada numa fração de 2,2 mL. A fração foi filtrada através de um filtro de centrifugação de 0,22(im (Millipore) esterilizado, congelado e armazenado a -80°C. Uma alíquota da amostra foi analisada em SDS-PAGE (4-12 % de gel NuPAGE; Novex) por coloração comassie e Western blot com anticorpos anti-tag.

Coloração Comassie: o gel NuPAGE foi colorido em 0,1 % de azul coomassie R250 a solução de coloração (30 % de metanol, 10 % de ácido acético) à temperatura ambiente durante 1 hora, e subsequentemente descolorado numa solução de 2 0 % de metanol, 7,5 % de ácido acético até o fundo estar límpido e as bandas de proteína claramente visíveis.

Western blot: seguindo uma eletroforese, as proteínas foram eletrotransferidas do gel para a membrana de nitrocelulose a 290 mA durante 1 hora a 4°C. A membrana foi bloqueada com 56 5 % de leite em pó em tampão E (NaCl a 137 mM; KC1 a 2,7 mM; KH2PO4 a 1,5 mM; Na2HPC>4 a 8 mM; 0,1 % de Tween 20, pH 7,4) durante 1 h à temperatura ambiente. A membrana foi subsequentemente incubada durante a noite a 4°C com uma

mistura de 2 anticorpos policlonais anti-tag de coelho (G-18 e H-15, 0,2ug/mL cada; Santa Cruz) em tampão E compreendendo 2,5 % de leite em pó. Após uma hora suplementar de incubação à temperatura ambiente, a membrana foi lavada com tampão E (3x10 min), e incubada durante 2 horas à temperatura ambiente com um anticorpo de coelho conjugado a HRP secundário (DAKO, HRP 0399) diluído de 1/3000, em tampão E contendo 2,5 % de leite em pó. Após lavagem com tampão E (3 x 10 minutos), a membrana foi revelada com o kit ECL (Amersham Pharmacia) durante 1 min. A membrana foi subsequentemente exposta a um Hyperfilm (Amersham Pharmacia), o filme revelado, e a imagem de western blot analisada visualmente.

Ensaio de Proteína: a concentração de proteína foi determinada usando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce) com albumina de soro bovino como padrão. A média de recuperação de proteína foi 216 μg de IL-18 bp purificada por 500 mL de meio de cultura. EXEMPLO 2: Efeito das isoformas IL-18BPb e IL-18BPd na translocação nuclear STAT2 em células U373 do glioblastoma humano

Abreviaturas: STAT: Transdutor de sinal e ativador da transcrição U373: Células do glioblastoma de origem humana.

ArrayScan Sistema HCS (da Cellomics™) : Sistema de análise de imagem. 57

Unidades de translocação nuclear: A translocação nuclear foi medida usando o software "Citoplasma para Aplicação Translocação de Núcleo" (Sistema de Análise de Imagem, Sistema ArrayScan HCS, Cellomics™) . As unidades de translocação nuclear representam a medida da intensidade média do alvo na região nuclear, menos a intensidade media da região do citoplasma. As unidades de translocação nuclear são um valor médio para todas as células analisadas num dado poço (aproximadamente 100 células/poço). No software que foi usado, o nome da função é "MeanNuc-CytolntenDiff" e as unidades são "intensidade de fluorescência" . s.e,m.: erro padrão da média

Introdução O efeito de IL-18BPb e de IL-18BPd na biologia do astrócito foi avaliada. Uma série de ensaios com base na translocação do citoplasma para o núcleo dos fatores de transcrição tais como c-Jun, NFKB, STAT1, STAT2 e STAT3, foram realizados nas linhas de células U373 de astroglioma humano. Os controlos positivos foram: IL-Ιβ para ensaios c-Jun e NFKB, IFNY para ensaios STAT1 e STAT3, e ΙΡΝβ para ensaios STAT2.

Materiais e Métodos

As células U373 (ECACC, ref no: 89081403) foram semeadas a uma densidade de 4000 células/poço em placas de 96 poços (Packard ViewPlate™-96, pretas, catálogo No. 6005225) em 80μΙϋ de DMEM contendo 10% de FCS. As placas foram deixadas durante a noite a 37°C numa incubadora humidificada a 5% C02. No dia seguinte, 20μΕ do meio de cultura contendo a proteína a ser testada foram adicionados aos poços. Trinta minutos mais tarde, o meio foi removido, e as células foram fixadas com formaldeído a 3,7% (Sigma, catálogo No. 25,254-9) . 58

As células foram processadas por imunocoloração usando kits comerciais e de acordo com as instruções do fabricante. Para o ensaio c-Jun, foi usado o HitKit™ de ativação

Cellomics c-Jun (catálogo No. K01-0003-1). Para o ensaio NFKB, foi usado HitKit™ de ativação Cellomics NFKB (catálogo No. KOl-OOOl-1) . Para o ensaio STAT1, foi usado HitKit™ de ativação Cellomics STAT1 (catálogo No. K01-0002-1). Para o ensaio STAT2, foi usado HitKit™ de ativação Cellomics STAT2 (catálogo No. K01-0005-1). Para o ensaio STAT3, foi usado HitKit™ de ativação Cellomics ST AT 3 (catálogo No. K01-0008-1) .

Após imunocoloração, as placas foram lidas num aparelho Array-Scan II.

Controlos positivos: para os ensaios de translocação nuclear c-Jun e NFKB, 0,5 ng/mL de IL-Ιβ (sistemas R&D, catálogo No. 201-LB) foram usados como controlo positivo. Para o ensaio de translocação nuclear STAT2, 1000 IU/mL de ΙΓΝβ recombinante humano foram usados como controlo positivo. Para os ensaios de STAT1 e STAT3, 5000 IU/mL de IFNy recombinante humano (sistemas R&D, catálogo No. 285- IF-100) foram usados como controlo positivo.

Análise de dados

Os resultados foram expressos como unidades de translocação nuclear. Com vista a comparar os vários ensaios, os resultados foram também expressos como uma percentagem da estimulação máxima calculada com os controlos positivos (IL-Ιβ, IFNy eΙΡΝβ). As estatísticas foram realizadas usando o teste T de Student ou a análise de variância (ANOVA) e ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de Dunnett dependendo do número de grupos por ensaio. O limiar 59 de significância foi estabelecido a p < 0,05. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (s.e.m.).

Resultados A adição de IL-18BPb ou IL-18BPd às células U373 estimulou significativamente a translocação nuclear de ST AT 2 (Fig. 3a). A estimulação correspondeu a 30-50% da estimulação máxima atingida com ΙΕΝβ. IL-18BPb e IL-18BPd não induziram a translocação nuclear de STAT1, STAT3, c-Jun ou NFKB (Fig. 3b para os resultados obtidos em STAT1 e STAT3).

Os IL-18BPa recombinante humano, IL-18BPc recombinante humano e IL-18BPd recombinante de ratinho (o ortologo de IL-18BPa humano) foram também testados na translocação nuclear STAT2 em U373. Nenhuma dessas isoformas de IL-18BP e variantes estimularam a translocação de STAT2 (Fig. 4 para resultados obtidos com IL-18BPa e mlL-18BPd). 0 IL-18, o ligante natural para IL-18BPa e IL-18BPC, não induz translocação STAT2 ou (Fig. 4), destacando o fato de que o efeito obtido com IL-18BPb e d não é um efeito comum para todas as isoformas de IL-18BP.

Conclusões

Os ensaios acima mostram que IL-18BPb e IL-18BPd têm a capacidade de iniciar sinalização intracelular, induzindo translocação nuclear de STAT2 em células U373. A indução de translocação nuclear de STAT2 é especifica desde que os outros fatores de transcrição tais com c-Jun, NFKB; STAT1 e STAT3 não sejam induzidos. O facto de IL-18BPa e IL-18BPc não estimularem a translocação de STAT2, juntamente com a comparação da sequência de aminoácidos entre todas as isoformas (Fig. 2), sugere que os 36 carboxi-terminais de aminoácidos de IL-18BPb e IL-18BPd medeiam a especificidade 60 da resposta. Estes 36 carboxi-terminais de aminoácidos de IL-18BPb e IL-18BPd correspondem aos aminoácidos 78 até 113 da SEQ ID NO: 1. EXEMPLO 3: IL-18BPb & d atenuam a produção de IL-6 e MCP-1 em células U373 e U251 do glioblastoma humano

Introdução IL-6 e MCP-1 são quemocinas pro-inflamatórias. IL-Ιβ e IFNy estimulam a secreção de IL-6 e MCP-1 em células U373 and U251 do glioblastoma humano. Foi testado o efeito de IL-18BPb e IL-18BPd na secreção IL-6 e MCP-1 em células U373 ou U251 estimulada por IL-Ιβ IFNg.

Materiais e Métodos

As células U373 (ECACC, ref no: 89081403) ou as células U251 (Health Science Research Resources Bank (HSRRB) ref: U-251 MG) foram semeadas a uma densidade de 4000 células/poço em placas de 96 poços (Packard ViewPlate™-96, preto, cat. 6005225) em 100μ1 de DMEM contendo 10% de FCS. As células foram deixadas durante a noite a 37 °C numa incubadora humidificada 5% CO2. No dia seguinte, 2 0μ1 do meio de cultura contendo a proteína a ser testada foi adicionada aos poços juntamente com 80μ1 de meio contendo IL-Ιβ e IFNy. As concentrações finais de IL-Ιβ e IFNy foram as seguintes: 0, 1, 3, 10 e 30 μρ/πΛ. Vinte e quatro e 48 horas depois, 50μL de meio foram recolhidos. Os níveis de IL-6 e MCP-1 foram medidos usando kits de ELISA (R&D systems: Duoset Human IL-6, catálogo No. DY206; Duoset Human MCP-1, catálogo No. DY279).

Análise de dados 61

Os resultados foram expressos como pg de proteína por mL. As estatísticas foram realizadas usando o teste T de Student ou análise de variância (ANOVA) e ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de Dunnett dependendo do número de grupos por ensaios. O limite de significância foi estabelecido a p < 0,05. Os resultados foram expressos como a média ± o erro padrão da média (s.e.m.).

Resultados O tratamento das células U373 com IL-Ιβ induz a secreção tanto de IL-6 como MCP-1 de um modo dependente da dose. A adição suplementar de IFNy aumenta também a secreção tanto de IL-6 como MCP-1 (Fig. 5a) . Tratar as células com IL-18BPb ou IL-18BPd concomitantemente com IL-Ιβ +/- IFNy diminui significativamente o nível de secreção de IL-6 e de MCP-1 (Fig. 5a) num modo depende da dose. O mesmo efeito foi obtido com outras linhas de células astrogliais humanas, U251 (Fig. 5b) . Foi também mostrado que IL-18BPb sozinho ou IL-18BPd sozinho não induz a secreção de IL6 ou MCP-1 pelas células U251 ou U373.

Conclusões

Estas séries de ensaios demonstram a função anti-inflamatória de IL-18BPb e de IL-18BPd num modelo de resposta induzida IL-Ιβ e IFNy.

EXEMPLO 4: IL-18BPb e IL-18BPd protegem contra apoptose induzida por TRAIL

Introdução A capacidade de IL-18BPb e IL-18BPd para resgatar células a partir apoptose induzida por TRAIL foi investigada nas células L929, uma linha de células de fibroblasto de murmo. 62

Materiais e métodos

As células L929 de fibroblasto de ratinho (CCL-1) foram semeadas em placas de 96 poços a 20.000 células/poço em 100 μΐ de DMEM contendo 2% de FCS. As células foram incubadas durante a noite a 37 °C numa câmara de 5% de CO2 humidificado. No dia seguinte, o meio foi substituído por meio fresco contendo 1 pg/mL de actinomicina D (Fluka ref 01817) e 2ng/mL de TRAIL (R&D, recombinante humano Trail/TNFSIO Cat# 375-TEC) com vista a induzir a apoptose. Vinte e quatro horas depois, os níveis de LDH no sobrenadante foi determinados (Promega ref: G 179A). lOng/mL de Osteoprotegerina (R&D cat#:185-OS) foram usados como um controlo positivo.

Análise de dados

Os resultados são expressos como densidade ótica (OD) . As estatísticas foram realizadas usando a medida da análise de variância (ANOVA) e ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de Dunnett. O nível de significância foi fixado a p<0,05. Os resultados foram expressos como a média ± o erro padrão da média (s.e.m.).

Resultados

Adicionando a IL-18BPb ou d ao meio de cultura protege significativamente as células L929 da apoptose de induzida por Trail. O nível de proteção obtido com 30 pg/mL de IL-18BPb foi igual ao nível de proteção de 47% obtido com a Osteoprotegerina, e o nível de proteção obtido com 30 pg/mL de IL-18BPd foi igual a 55% do nível de proteção obtido com a Osteoprotegerina (Fig.6).

Conclusão

Estes ensaios mostram o papel de proteção de IL-18BPb e do IL-18BPd num ensaio de apoptose mediado por ensaio de morte 63 celular, da. Assim IL-18BPb e IL-18BPd exibem uma atividade anti-apoptótica nos fibroblastos. EXEMPLO 5: Expressão tecidual da isoforma IL-18BPd

Introdução

Uma análise de PCR em tempo real para a expressão de IL-18BPd foi realizada em vários tecidos humanos com vista a fornecer informação na sua distribuição nos tecidos.

Materiais e métodos

Os primers das SEQ ID Nos. 7-12 foram desenhados usando software Primer Express da PE Applied Biosystems (Foster City, CA) . As SEQ ID Nos. 5 e 6 correspondem a primers específicos para GAPDH (controlo de limpeza). As SEQ ID Nos. 7 e 8 correspondem a primers do intrão-GAPDH (controlo de contaminação de ADN). As SEQ ID Nos. 9 e 10 correspondem a primers que amplificam todas as isoformas de IL-18BP humano. A SEQ ID Nos. 11 e 12 correspondem os primers específicos para a isoforma hlL-18BPd. A potencial contaminação do ADN genómico foi excluída realizando PCR com primers específicos para intrão-GAPDH. A ausência de amplificação não específica foi confirmada por análise de produtos de PCR por eletroforese de gel de agarose. O PCR em tempo real foi realizado com 5μΕ/ροςο dos produtos de transcrição inversa (0,5ng de ARN total), 25μ]Ι/ροςο de SYBR Green PCR master mix (PE Applied Biosystems) com 0,5U/poço de N-glicosilase uracilo AmpErase e 30OnM de primers. O PCR foi realizado a 50°C durante 2 min e 95°C durante 10 min, e depois corrido durante 40 ciclos a 95°C durante 15 s e 60°C durante 1 min no Sistema de Deteção ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems) . As amostras de tecido com cDNA inverso transcrito foram assim 64 ampliadas e foram determinados os seus valores limites de ciclo. Todos os valores limites de ciclo foram normalizados para o valor limite do gene GAPDH de limpeza.

Resultados: A análise Taqman revelou diferenças substanciais na distribuição dos tecidos de IL-18BPd. 0 IL-18BPd foi predominantemente expresso no baço, pâncreas e placenta (80% ou mais da expressão de GAPDH) (Fig. 7).

Quando se usam primers de amplificação de mRNAs de todas as quatro isoformas de IL-18BP, os transcritos foram detetados no coração e nos músculos (resultados não mostrados). Curiosamente, o coração e os músculos eram desprovidos de mRNA IL-18BPd (Fig. 7) . Os transcritos IL-18BP detetados nestes órgãos provavelmente correspondem a mRNAs da isoforma IL-18BPa, a qual foi previamente demonstrado ser expressa nestes órgãos (Mallat et al., 2004).

Conclusão:

Estes resultados sugerem uma regulação dependente do órgão da expressão de IL-18BPd. Para além disso, confirmam o facto de a expressão IL-18BPd não ser um produto secundário do IL-18BPa.

Concluindo, a isoforma IL-18BPd exibe os seus próprios mecanismos de ação e o seu padrão de expressão.

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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

<120> USO DE ISOFORMAS DE IL-18BP PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS NEUROLÓGICAS <130> 1043 WO <150> 60/688,057 <151> 2005- -06- 07 <150> EP051048 >63.5 <151> 2005- -06- 03 <1 60> 12 <17 0> Patentln ver <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> SIGNAL <222> (D . . (28 í) <223> <4 0 0> 1 71

Met Arg His A$n Trp Thr Pro Asp Leu ser Pco Leu Trp Vai Leu Leu 1 5 10 15

Leu Cys Ala His Vai Vai Thr Lais Leu Vai Arg Ala Thr Pro Vai Ser 20 25 30

Gin Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Vai Arg Ser Thr Lys Asp Pro 35 40 45

Cys Pro Ser Gin Pro Pro Vai Phe Pro Ala Ala Lys Gin Cys Pro Ala 50 55 60

Leu Slu vai Thr Trp Pro Glu Vai Glu vai Pro Leu Ser Trp Ala Glu 65 70 75 80

Gly Ase Leu Ala Pro His Pro Arg Ser Pro Ala Leu Gin Pro Gin Gin 85 90 95

Ser Thr Ala Ala Gly Leu Arg Leu Ser Thr Gly Pro Ala Ala Ala Gin 100 105 uo

Pro

<210> 2 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> SIGNAL <222> (1)..(28) <223> <400> 2 »et Arg His asr Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro Leu Trp Vai Leu Leu 1 5 10 15

Leu Cys Ala

His Vai Vai Thr Leu Leu Vai Arg Ala Thr Pro Vai Ser 20 25 30

Gin Thr Thr 35

Thr Ala Ala Thr Ala Ser Vai Arg ser Thr 40 45

Lys Asp Pro

Cys Pro Ser Gin 50

Pro Pro Vai Phe Pro Ala Ala Lys Gin Cys 55 60

Pro Ala 72

Leu Glu Vai Thr Trp Pro Glu Vai Glu Vai Pro Leu hsn Gly Thr Leu 65 70 75 80

Ser Leu Ser Cys Vai Ala Cys Ser Arg Fhe Pro Asn Phe Ser lie Leu 90 85

Tyr Trp Leu Gly 100

Asn Gly Ser ?he

Ile Glu Hís Leu 105

Pro Gly Arg Léu 110

Trp Glu Gly Ser 115

Thr Ser Arg Glu 120

Arg Gly Ser Thr

Gly Trp Ala Glu 125

Gly Asn Leu Ala 130

Pro Bis Pro Arg 135

Ser Pro Ala Leu 140

Gin Pro Gin Gin

Ser Thr Ala Ala 145

Gly Leu Arg Leu 150

Ser Thr Gly Pro 155

Ala Ala Ala Gin 160

Pro

<210> 3 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> SIGNAL <222> (1)..(28) <223> <400> 3 Met Arg Sis Asn 1

Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro 5 10

Leu Trp Vai

Leu Cys Ala His 20

Vai Vai Thr Leu Leu Vai Arg 2 5

Ala Thr Pro 30

Gin Thr Thr Thr 35

Ala Ala Thr Ala Ser Vai Arg 40

Ser Thr Lys 4 5

Cys Pro Ser Gin 50

Pro Pro Vai Phe Pro Ala Ala 55

Lys Gin Cys 60

Leu Leu 15 vai Ser Asp Pro Pro Ala

Leu Glu Vai Thr Trp Pro Glu Vai Glu Vai Pro Leu Asn Gly Thr Leu 65 70 75 80 73

Ser Leu Ser Cys Vai 85 Ala Cys Ser Arg Phe 90 Pro Asn Phe Ser Ile 95 Leu Tyr Trp Leu Gly 100 Asn Gly Ser Phe Ile 105 Glu His Leu Pro Gly 110 Arg Leu Trp Glu Gly 115 Ser Thr Ser Arg Glu 120 Arg Gly Ser Thr Gly 125 Thr Gin Le u Cys Lys 130 Ala Leu Val Leu Glu 135 Gin Leu Thr Pro Ala 140 Leu His Ser Thr Asn 14 5 Phe Se r Cys Vai Leu 150 Val Asp Pro Glu Gin 155 Val Val Gin Arg His 160 Vai Vai Leu Ala Gin 165 Leu Trp Ala Gly Leu 170 Arg Ala Thr Leu Pro 175 Pro Thr Gin GlU Ala 180 Leu Pro Ser Ser His 18 5 Ser Ser Pro Gin Gin 190 Gin Gly

Leu Cys Ala His Vai Vai Thr Leu Leu Vai Arg Ala Thr Pro Vai Ser 20 25 30

Gin Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Vai Arg Ser Thr Lys Asp Pro 35 40 45

Cys Pro Ser Gin Pro Pro Vai Phe Pro Ala Ala Lys Gin Cys Pro Ala 50 55 60

Leu Glu Vai Thr Trp Pro Glu Vai Glu Vai Pro Leu Asn Gly Thr Leu 65 70 75 80 <210> 4 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> SIGNAL <222> <223> (D .. (28) <400> 4 Met Arg His Asn Trp Thr 1 5 10 15 74

Ser Leu Ser Cys Vai Ala Cys Ser Arg Phe Pro Asn Phe Ser Ile Leu 85 90 95

Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser Phe Ile Glu His Leu Pro Gly Arg Leu 100 105 110

Trp Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr Gly Thr Gin Leu 115 120 125

Cys Lys Ala Leu Vai Leu Glu Gin Leu Thr Pro Ala Leu His Ser Thr 130 135 140

Asn Phe Ser Cys Vai Leu Vai Asp Pro Glu Gin Vai Vai Gin Arg His 145 150 155 160

Vai Vai Leu Ala Gin Leu Trp Vai Arg Ser Pro Arg Arg Gly Leu Gin 165 170 175

Glu Gin Glu Glu Leu Cys Phe His Met Trp Gly Gly Lys Gly Gly Leu 180 185 190

Cys Gin Ser Ser Leu 195 <210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> primer <400> 5 22 gatgggattt ccattgatga ca <210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> primer <400> 6 gatgggattt ccattgatga ca

<210> 7 <211> 21 <212> ADN 22 75 <213> Artificial <22 0> <223> primer <4Ο0> 7 cctagtccca gggctttgat t 21 <210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> primer <400> 8 ctgtgctccc actcctgatt tc 22 <210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> primer <4Ο0> 9 tcccatgtct ctgctcattt agtc 24 <210> 10 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> primer <4 Ο 0> 10 aaccaggctt gagcgttcc 19 <210> 11 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> primer 76 <4 Ο 0> 11 28 acgcagagac tgctactaca tcttattc <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> primer <4 0 0> 12 21 cccggtcctt aatttgttcc t

Lisboa, 21 de Novembro de 2011

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uso de uma isoforma de IL-18BP que não tem a capacidade de se ligar a IL-18 e que induz translocação nuclear STAT2 para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença inflamatória neurológica, em que a referida isoforma de IL-18BP é caracterizada por uma sequência de aminoácidos contendo o aminoácido carboxi-terminal de IL-18BPb (SEQ ID No. 1) e IL-18BPd (SEQ ID No. 2) e é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) Um polipéptido compreendendo SEQ ID NO: 1; b) Um polipéptido compreendendo aminoácidos 29 a 113 da SEQ ID NO: 1; c) Um polipéptido compreendendo aminoácidos 78 a 113 da SEQ ID NO: 1; d) Um polipéptido compreendendo SEQ ID NO: 2/ e) Um polipéptido compreendendo, aminoácidos 29 a 161 da SEQ ID NO: 2; f) Uma muteina de qualquer (a) (b) , (d) ou (e) , em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com pelo menos uma das sequências em (a) até (e); g) Uma muteina de qualquer de (a) até (e) que é codificada por uma sequência de ADN a qual híbrida com o complemento da sequência de ADN nativa que codifica qualquer de (a) até (e) sob condições moderadamente rigorosas ou sob condições extremamente rigorosas; h) Uma muteina de qualquer de (a) até € em que quaisquer alterações na sequência de aminoácidos são substituições de aminoácidos conservativas nas sequências de aminoácidos em (a) até (e); 2 i) Um sal ou uma proteína fundida, derivado funcional, fração ativa ou derivado permutado circularmente de qualquer de (a) até (h), as muteínas, sais, proteínas fundidas, derivados funcionais, frações ativas ou derivados permutados circularmente de (f) até (i) mantendo uma atividade biológica semelhante ou mesmo melhor que a forma de ocorrência natural. 2. 0 uso de acordo com a reivindicação 1, em que a doença neurológica e/ou inflamatória é selecionada a partir do grupo que consiste em lesão traumática do nervo, trombose, doenças desmielinizantes do SNC ou SNP, neuropatias e doenças neurodegenerativas crónicas. 3. 0 uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a doença neurológica e/ou inflamatória é selecionada a partir do grupo que consiste em lesão traumática do nervo, trombose, doenças desmielinizantes do SNC ou SNP, neuropatias e doenças neurodegenarativas crónicas. 4. 0 uso de acordo com a reivindicação 3, em que a neuropatia periférica é neuropatia diabética. 5. 0 uso de acordo com a reivindicação 2, em que a doença neurodegenerativa crónica é selecionada a partir de esclerose múltipla (EM), doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (DH) e esclerose lateral amiotrófica (ELA) . 6. 0 uso de acordo com a reivindicação 3, em que a doença neurológica e/ou inflamatória é causada por um distúrbio metabólico congénito. 3 7. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 6, em que a referida isoforma de IL-18BP é fundida com uma molécula transportadora, um péptido ou uma proteína que promove a passaqem da barreira hemato-encefálica. 8. 0 uso de acordo com a reivindicação 7, em que a referida isoforma de IL-18BP é PEGilada. 9. 0 uso de acordo com a reivindicação 7, em que a referida isoforma de IL-18BP é fundida com um domínio (Ig) de imunoglobulina.

10. O uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido medicamento compreende ainda um polipéptido selecionado a partir do grupo que consiste em interferão, osteopontina e clusterina, para uso simultâneo, sequencial, ou separado.

11. O uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida isoforma de IL-18BP é usada numa quantidade de cerca de 0,001 até 100 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 0,01 até 10 mg/kg de peso corporal ou cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 mg/kg de peso corporal ou cerca de 0,1 até 1 mg/kg de peso corporal.

12. Isoforma de IL-18BP que não tem a capacidade de se ligar ou neutralizar IL-18 e que induz translocação nuclear STAT2, em que a referida isoforma de IL-18BP é caracterizada por uma sequência de aminoácidos contendo os 36 aminoácidos carboxi-terminais de IL-18BPb (SEQ ID No. 1) e IL-18BPd (SEQ ID No. 2) e é selecionada a partir do grupo que consiste em a) Um polipéptido compreendendo SEQ ID NO: 1/ 4 b) Um polipéptido compreendendo aminoácidos 29 a 113 da SEQ ID NO: 1; c) Um polipéptido compreendendo aminoácidos 78 a 113 da SEQ ID NO: 1; d) Um polipéptido compreendendo SEQ ID NO: 2/ e) Um polipéptido compreendendo, aminoácidos 29 a 161 da SEQ ID NO: 2; f) Uma muteina de qualquer (a) (b) , (d) ou (e) , em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com pelo menos uma das sequências em (a) até (e); g) Uma muteina de qualquer de (a) até (e) que é codificada por uma sequência de ADN a qual hibridiza com o complemento da sequência de ADN nativa que codifica qualquer de (a) até (e) sob condições moderadamente rigorosas ou sob condições extremamente rigorosas; h) Uma muteina de qualquer de (a) até (e) em que quaisquer alterações na sequência de aminoácidos são substituições de aminoácidos conservativas nas sequências de aminoácidos em (a) até (e); i) Um sal ou uma proteína fundida, derivado funcional, fração ativa ou derivado permutado circularmente de qualquer de (a) até (h), as muteínas, sais, proteínas fundidas, derivados funcionais, frações ativas ou derivados permutados circularmente de (f) até (i) mantendo uma atividade biológica semelhante ou mesmo melhor que a isoforma de ocorrência natural para uso no tratamento e/ou prevenção de uma doença inflamatória neurológica. Lisboa, 21 de Novembro de 2011