PT1959955E - Método para tratar o crescimento celular anómalo - Google Patents

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PT1959955E PT06820997T PT06820997T PT1959955E PT 1959955 E PT1959955 E PT 1959955E PT 06820997 T PT06820997 T PT 06820997T PT 06820997 T PT06820997 T PT 06820997T PT 1959955 E PT1959955 E PT 1959955E
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James Gail Christensen
Yahong Zou
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Description

1
DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA TRATAR O CRESCIMENTO CELULAR ANÓMALO"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se à utilização de (R)-3-[1-(2, 6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-5-(l-piperidin-4-il-lH-pirazol-4-il)-piridin-2-ilamina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, para o fabrico de um medicamento para tratar o crescimento celular anómalo num mamífero, em que o crescimento celular anómalo é mediado por quinase de linfoma anaplásico (ALK).
Antecedentes da Invenção 0 composto (A)-3-[1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-5-(l-piperidin-4-il-lH-pirazol-4-il)-piridin-2-ilamina representado pela fórmula 1
/~~NH
N—N
é uma potente molécula de baixo peso molecular inibidora da actividade de c-Met/HGFR (receptor do factor de crescimento de hepatócitos) quinase e de ALK (quinase de linfoma anaplásico). 0 composto 1 tem propriedades antitumorais que são mediadas farmacologicamente através da inibição de c-Met/HGFR que está envolvida na regulação do crescimento e da progressão metastásica de uma ampla variedade de tipos de tumor e ALK que está envolvida na patogénese de ALCL 2 (linfoma anaplásico de células grandes). O composto 1 é revelado no documento WO 2006/021884 (Pedido de Patente Internacional N° PCT/IB2005/002837) e (documento US 2006/0046991 Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 11/212.331). Adicionalmente, o racemato do compostos 1 é revelado no documento WO 2006/0128724 (Pedido de Patente Internacional N° PCT/IB05/002695) e (documento US 2006/0128724 (Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 11/213.039).
Os cancros humanos compreendem um conjunto diverso de doenças que colectivamente são uma das principais causas de morte nos paises desenvolvidos, a nivel mundial (American Câncer Society, Câncer Facts and Figures 2005. Atlanta: American Câncer Society; 2005). A progressão dos cancros é causada por uma série complexa de eventos genéticos e moleculares múltiplos que incluem mutações génicas, translocações cromossómicas e anomalias cariotípicas (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of câncer. Cell 2000; 100: 57-70). Embora as causas genéticas subjacentes do cancro sejam diversas e complexas, foi observado que cada tipo de cancro mostra traços comuns e capacidades adquiridas que facilitam sua progressão. Estas capacidades adquiridas incluem crescimento celular desregulado, capacidade sustentada para adquirir vasos sanguíneos (isto é, angiogénese) e capacidade das células de tumor para proliferar de forma local, assim como metastatizar a sitios de órgãos secundários (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of câncer. Cell 2000; 100: 57-70). Portanto, a capacidade para identificar novos agentes terapêuticos que 1) inibam os alvos moleculares que são alterados durante a progressão do cancro ou 2) tenham como alvo processos múltiplos que são comuns à progressão do cancro numa variedade de tumores representa uma necessidade não satisfeita.
Uma grande quantidade da literatura na área indica que 3 c-Met/HGFR é uma das RTK que mais frequentemente sofre mutações ou que então é activada de outra forma anómala em diversos cancros humanos (Christensen JG, Burrows J, Salgia R. c-Met as a target in human câncer and characterization of inibitors for therapeutic intervention. Câncer Letters 2005; 225: 1-26). Os tipos de tumores nos quais foi indicado que c-Met/HGFR estava geneticamente alterada por mutação ou amplificação génica incluem sem limitação indicações oncológicas com uma forte necessidade médica não satisfeita, tais como cancros renal, colorrectal metastásico, glioma, de pulmão de células não pequenas, gástrico e de cabeça e pescoço (Christensen JG, Burrows J, Salgia R. c-Met as a target in human câncer and characterization of inibitors for therapeutic intervention. Câncer Letters 2005; 225: 1-26).
Mutações de HGFR têm sido implicadas em carcinoma renal (veja-se, por exemplo, L. Schmidt, K. Junker, N. Nakaigawa, T. Kinjerski, G. Weirich, M. Miller, et al., Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Oncogene 1999; 18: 2343-2350; L. Schmidt, F.M. Duh, F. Chen, T. Kishida, G. Glenn, P. Choyke, et al., Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Nat. Genet 1997; 16: 68-73; L. Schmidt, K. Junker, G. Weirich, G. Glenn, P. Choyke, I. Lubensky, et al., Two North American families with hereditary papillary renal carcinoma and identical novel mutations in the MET proto-oncogene, Câncer Res. 1998; 58: 1719-1722). As mutações de HGFR têm sido associadas a carcinoma de cabeça e pescoço (veja-se, por exemplo, M.F. Di Renzo, M. Olivero, T. Martone, A. Maffe, P. Maggiora, A.D. stefani, et al., Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas, Oncogene 2000; 19: 1547-1555; D.M. Aebersold, O. Landt, S. Berthou, G. Gruber, K.T. Beer, R.H. Greiner, E. Zimmer, Prevalence and 4 clinicai impact of Met Yl253D-activating point mutation in radiotherapytreated squamous cell câncer of the oropharynx, Oncogene 2003; 22: 8519-8523). As mutações de HGFR têm sido associadas a carcinoma de pulmão (veja-se, por exemplo, P.C. Ma, T. Kijima, G. Maulik, E.A. Fox, M. Sattler, J.D. Griffin, et al., c-MET mutational analysis in small cell lung câncer: novel juxtamembrane domain mutations regulating cytoskeletal functions, Câncer Res. 2003; 63: 6272-6281; P.C. Ma, S. Jagdeesh, R. Jagadeeswaran, E.A. Fox, J.G. Christensen, G. Maulik, et al., c-MET expression/activation, functions, and mutations in non-small cell lung câncer, Proc. Am. Assoe. Câncer Res. 2004; 63: 1875.
Adicionalmente, as mutações de HGFR têm sido implicadas em outros indicações que incluem sem limitação carcinomas hepatocelulares infantis, cancro gástrico humano, cancro de estômago tipo cirroso, cancro colorrectal e melanoma maligno. (Veja-se, por exemplo, W.S. Park, S.M. Dong, S.E. Kim, E.E. Na, M.S. Shin, J.H. Pi, et al., Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas, Câncer Res. 1999; 59: 307-310; J.H. Lee, S.U. Han, H. Cho, B. Jennings, B. Gerrard, M. Dean, et al., A novel germ line juxtamembrane Met mutation in human gastric câncer, Oncogene 2000; 19: 4947-4953; A. Lorenzato, M. Olivero, S. Patane, E. Rosso, A. Oliaro, P.M. Comoglio, M.F. Di Renzo, Novel somatic mutations of the MET oncogene in human carcinoma metastases activating cell motility and invasion, Câncer Res . 2002; 62 : 7025-7030; H. Kuniyasu, W. Yasui, E. Kitadai, H. Yokozaki, H. Ito, E. Tahara, Frequent amplification of the c-met gene in scirrhous type stomach câncer, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992; 189: 227-232; M.F. Di Renzo, M. Olivero, A.
Giacomini, H. Porte, E. Chastre, L. Mirossay, et al., Overexpression and amplification of the met/HGF receptor 5 gene during the progression of colorectal câncer, Clin. Câncer Res. 1995; 1: 147-154; T. Hara, A. Ooi, M. Kobayashi, M. Mai, K. Yanagihara, I. Nakanishi, Amplification of c-myc, K-sam, and c-met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization, Lab. Invest. 1998; 78: 1143-1153). A relação de mutações de HGFR com função e potencial oncogénico também foi estabelecida (veja-se por exemplo, M. Jeffers, L. Schmidt, N. Nakaigawa, C.P. Webb, G. Weirich, T. Kishida, et al., Activating mutations for the met tyrosine kinase receptor in human câncer, Proc. Natl Acad. Sei. USA 1997; 94: 11445-11450; M. Jeffers, M. Fiscella, C.P. Webb, M. Anver, S. Koochekpour, G.F. Vande Woude, The mutationally activated Met receptor mediates motility and metastasis, Proc. Natl Acad. Sei. USA 1998; 95: 14417-14422) .
Finalmente, as mutações de HGFR têm sido implicadas em tumores de ratinhos e têm sido estudadas neles (veja-se por exemplo, H. Takayama, W.J. LaRochelle, R. Sharp, T. Otsuka, P. Kriebel, M. Anver, et al., Diverse tumorigenesis associated with aberrant development in mice overexpressing hepatocyte growth factor/scatter factor, Proc. Natl Acad. Sei. USA 1997; 94: 701-706; T. Otsuka, H. Takayama, R. Sharp, G. Celli, W.J. LaRochelle, D.P. Bottaro, et al., c-Met autocrine activation induces development of malignant melanoma and aequisition of the metastatic phenotype, Câncer Res. 1998; 58: 5157-5167; M.I. Gallego, B. Bierie, L. Hennighausen, Targeted expression of HGF/SF in mouse mammary epithelium leads to metastatic adenosquamous carcinomas through the activation of multiple signal transduction pathways, Oncogene 2003; 22: 8498-8508; C.R. Graveel, E. Su, L.M. Wang, M. Fiscella, T. Lino, c. Birchmeier, et al., Tumorigenic effects of activating Met mutations in a knock-in mouse model, Proc. Am. Assoe. Câncer Res. 2004; 44: 5102). 6 NPM-ALK, uma proteína de fusão oncogénica variante da quinase de linfoma anaplásico, que resulta de uma translocação cromossómica está envolvida na patogénese do linfoma anaplásico de células grandes humano (Pulford K, Morris SW, Turturro F. Anaplastic lymphoma kinase proteins in growth control and câncer. J Cell Physiol 2004; 199: 330-58). O papel da expressão aberrante de proteínas quiméricas de ALK constitutivamente activas na patogénese de ALCL foi bem definido (Weihua Wan, et al. Anaplastic lymphoma kinase activity is essential for the proliferation and survival of anaplastic large cell lymphoma cells. Blood First Edition Paper, prepublished online 27 de Outubro de 2005; DOI 10.1182/blood-2005-08-3254). A activação inapropriada de c-Met/HGFR (incluindo c-Met de tipo selvagem) também está envolvida na desregulação de múltiplos processos oncogénicos de tumor tais como mitogénese, sobrevivência, angiogénese, crescimento invasivo e especialmente no processo metastásico (Christensen et al, 2005) . Além disso, foi demonstrado que a expressão de c-Met e HGF, seu único ligando de alta afinidade, está relacionada com uma prognóstico negativo ou progressão metastática em vários dos principais cancros humanos (Christensen et al., 2005). NPM-ALK está implicado na desregulação da proliferação celular e apoptose em células de linfoma ALCL (Pulford et al., 2004).
Sumário da Invenção
Numa forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para tratar o crescimento celular anómalo em que o crescimento celular anómalo é mediado por quinase de linfoma anaplásico (ALK) num mamífero em necessidade de tal tratamento que compreende administrar a dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da fórmula 1: 7 /-ΝΗ 7 Ν-Ν
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em outra forma de realização, o mamífero é um ser humano. Em outra forma de realização, o mamifero é um cão.
Em mais outra forma de realização, o composto ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado como uma composição farmacêutica que compreende o composto da fórmula 1 e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1: Inibição competitiva para ATP da actividade de c-Met/HGFR quinase humana recombinante pelo composto 1.
Figura 2: Foi administrado a ratinhos atímicos portadores de tumores estabelecidos GTL-16 composto 1 por via oral na dose indicada ou somente veículo durante 11 dias. Figura 2A: estudos que investigam a inibição da fosforilação de c-Met/HGFR em GTL-16. Figura 2B: estudos que investigam a inibição do crescimento de tumor de GTL-16.
Figura 3: Foi administrado a ratinhos atímicos portadores de tumores estabelecidos U87MG (150 mm3) composto 1 por via oral na dose indicada ou somente veículo durante 9 dias. Figura 3A: estudos que investigam a inibição do crescimento de tumor. Figura 3B: estudos que investigam a inibição da fosforilação 8 de c-Met/HGFR.
Figura 4: Administração oral diária do composto 1 a ratinhos atimicos que possuem xenotransplantes de tumor GTL-16 estabelecido grande. Figura 4A: regressão de xenotransplantes de tumor GTL-16 estabelecido grande em ratinhos atimicos. Figura 4B: peso corporal do ratinho depois da administração oral diária do composto 1.
Figura 5: Administração oral diária do composto 1 a ratinhos atimicos que portam xenotransplantes de tumor PC-3 ou NCI-H441 estabelecidos. Figura 5A: regressão de tumor em ratinhos atimicos que portam NCI-H441 estabelecido. Figura 5B: regressão de tumor em ratinhos atimicos que portam xenotransplantes de tumor PC-3 estabelecido.
Figura 6: Eficácia antitumoral do composto 1 num modelo de linfoma dependente de NPM-ALK (modelo Karpas 299 de ALCL). Figura 6A: estudos que investigam a inibição do crescimento de tumor. Figura 6B: estudos que investigam a inibição da fosforilação de NPM-ALK.
Descrição Detalhada da Invenção A menos que se indique de outro modo, todas as referências no presente documento aos compostos da invenção incluem referências a sais, solvatos, hidratos e complexos dos mesmos e a solvatos, hidratos e complexos dos sais dos mesmos.
Definições
Como é utilizado no presente documento, a menos que se indique de outro modo, a expressão "crescimento celular anómalo" refere-se a crescimento celular que é independente dos mecanismos reguladores normais (por exemplo, perda de inibição de contacto).
Como é utilizado no presente documento, a menos que se 9 indique de outro modo, o termo "tratar", significa reverter, aliviar, inibir o progresso ou evitar o transtorno ou afecção ao qual dito termo é aplicado, ou um ou mais sintomas de dito transtorno ou afecção. 0 termo "tratamento", como é utilizado no presente documento, a menos que se indique de outro modo, refere-se ao acto de tratar como se define "tratar" imediatamente antes.
Como é utilizado no presente documento a expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" inclui sais de adição de ácidos e básicos (incluindo disais).
Os sais de adição de ácidos adequados são formados a partir de ácidos que formam sais não tóxicos. Os exemplos incluem os sais de acetato, aspartato, benzoato, besilato, bicarbonato/carbonato, bissulfato/sulfato, borato, camsilato, citrato, edisilato, esilato, formiato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hexafluorofosfato, hibenzato, cloridrato/cloreto, bromidrato/brometo, iodoidrato/iodeto, isetionato, lactato, malato, maleato, malonato, mesilato, metilsulfato, naftilato, 2-napsilato, nicotinato, nitrato, orotato, oxalato, palmitato, palmoato, fosfato/fosfato ácido/dihidrogenofosfato, sacarato, estearato, succinato, tartrato, tosilato e trifluoroacetato.
Os sais básicos adequados são formados a partir de bases que formam sais não tóxicos. Os exemplos incluem os sais de alumínio, arginina, benzatina, cálcio, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, magnésio, meglumina, olamina, potássio, sódio, trometamina e zinco.
Para uma revisão sobre os sais farmaceuticamente aceitáveis adequados, veja-se "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use por stahl e Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Alemanha, 2002).
Um sal farmaceuticamente aceitável dos compostos da invenção pode ser preparado facilmente misturando entre si soluções do composto e o ácido ou base desejados, conforme 10 seja apropriado. O sal pode precipitar a partir da solução e ser recolhido por filtração ou pode ser recuperado por evaporação do solvente. O grau de ionização no sal pode variar desde completamente ionizado até quase não ionizado.
Os compostos da invenção podem existir tanto em formas solvatadas como não solvatadas. O termo "solvato" é utilizado no presente documento para descrever um complexo molecular que compreende o composto da invenção e uma ou mais moléculas solventes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, etanol. O termo "hidrato" é empregado quando o solvente é água. Os solvatos farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a invenção incluem hidratos e solvatos nos quais o solvente de cristalização pode ser substituído isotopicamente, por exemplo, d20, d6-acetona, dê-DMSO. A invenção também inclui compostos marcados isotopicamente, que são idênticos ao composto 1, excepto em que um ou mais átomos são substituídos por um átomo que tem uma massa atómica ou número de massa diferente da massa atómica ou número de massa habitualmente achado na natureza. Os exemplos de isótopos que podem ser incorporados em compostos da invenção incluem isótopos de hidrogénio, carbono, nitrogénio, oxigénio, fósforo, enxofre, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 1SN, 180, 170, 31P, 32P, 35S, 18F e 36C1, respectivamente. Os compostos da presente invenção e os sais farmaceuticamente aceitáveis de ditos compostos, que contêm os isótopos mencionados anteriormente e/ou outros isótopos de outros átomos, estão dentro do âmbito desta invenção. Certos compostos marcados isotopicamente da presente invenção, por exemplo, aqueles nos quais são incorporados isótopos radioactivos tais como 3h e 14C, são úteis nos ensaios de distribuição tissular de fármacos e/ou substrato. Os isótopos tritiados, isto é, 3H e carbono 14, isto é, 14C, são preferidos particularmente por sua facilidade de preparação e capacidade de detecção. Ademais, a substituição com isótopos mais pesados tais como 11 deutério, isto é, 2H, pode proporcionar certas vantagens terapêuticas que resultam de uma estabilidade metabólica maior, por exemplo semivida in vivo melhorada ou requisitos de dosagem reduzidos e, portanto, podem ser preferidos em algumas circunstâncias. Um composto 1 da presente invenção marcado isotopicamente pode ser preparado geralmente levando a cabo os procedimentos descritos para os compostos não marcados, substituindo um reagente marcado isotopicamente facilmente disponível por um reagente não marcado isotopicamente.
Também estão incluídos dentro do âmbito da invenção complexos tais como clatratos, complexos de inclusão de fármaco em hospedeiro nos quais, ao contrário dos solvatos mencionados anteriormente, o fármaco e o hospedeiro estão presentes em quantidades estequiométricas ou não estequiométricas. Também estão incluídos complexos do fármaco que contêm dois ou mais componentes orgânicos e/ou inorgânicos que podem estar em quantidades estequiométricas ou não estequiométricas. Os complexos resultantes podem estar ionizados, parcialmente ionizados ou não ionizados. Para uma revisão de ditos complexos, veja-se J Pharm Sei, 64 (8), 1269-1288 por Haleblian (agosto de 1975). Administração oral
Os compostos da invenção podem ser administrados por via oral. A administração oral pode implicar deglutição, de modo que o composto entra no tracto gastrointestinal ou pode ser empregada administração bucal ou sublingual pela qual o composto entra na corrente sanguínea directamente desde a boca.
As formulações adequadas para administração oral incluem formulações sólidas tais como comprimidos, cápsulas que contêm partículas, líquidos ou pós, pastilhas (incluindo recheadas de líquido), gomas de mascar, multi e nano partículas, geles, solução sólida, lipossomas, filmes (incluindo muco-adesivos), óvulos, pulverizações e 12 formulações líquidas.
As formulações líquidas incluem suspensões, soluções, xaropes e elixires. Ditas formulações podem ser utilizadas como cargas em cápsulas moles ou duras e incluem tipicamente um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água, etanol, polietilenoglicol, propilenoglicol, metilcelulose ou um óleo adequado e um ou mais agentes emulsionantes e/ou agentes de suspensão. As formulações líquidas também podem ser preparadas pela reconstituição de um sólido, por exemplo, a partir de uma hóstia.
Os compostos da invenção podem ser utilizados também em formas farmacêuticas de dissolução rápida e desintegração rápida tais como as descritas em Expert Opinion in Therapeutic Patents, 11 (6), 981-986 por Liang e Chen (2001) .
Para formas farmacêuticas em comprimidos, dependendo da dose, o fármaco pode compor desde 1% em peso até 80% em peso da forma farmacêutica, mais tipicamente desde 5% em peso até 60% em peso da forma farmacêutica. Além do fármaco, os comprimidos geralmente contêm um desintegrante. Os exemplos de desintegrantes incluem glicolato de amido de sódio, carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose de cálcio, croscarmelose de sódio, crospovidona, polivinilpirrolidona, metilcelulose, celulose microcristalina, hidroxipropilcelulose substituída com alquilo inferior, amido, amido pré-gelatinizado e alginato de sódio. Geralmente, o desintegrante compreenderá desde 1% em peso até 25% em peso, preferentemente desde 5% em peso até 20% em peso da forma farmacêutica.
Os aglutinantes geralmente são utilizados para proporcionar qualidades coesivas a uma formulação de comprimido. Os aglutinantes adequados incluem celulose microcristalina, gelatina, açúcares, polietilenoglicol, gomas naturais e sintéticas, polivinilpirrolidona, amido pré-gelatinizado, hidroxipropilcelulose e 13 hidroxipropilmetilcelulose. Os comprimidos podem conter também diluentes, tais como lactose (monohidrato, monohidrato seca por pulverização, anidra e similares), manitol, xilitol, dextrose, sacarose, sorbitol, celulose microcristalina, amido e fosfato de cálcio dibásico dihidrato.
Os comprimidos também podem incluir opcionalmente agentes tensioactivos, tais como laurilsulfato de sódio e polisorbato 80 e emolientes tais como dióxido de silício e talco. Quando estão presentes, os agentes tensioactivos estão tipicamente em quantidades desde 0,2% em peso até 5% em peso do comprimido e os emolientes tipicamente desde 0,2% em peso até 1% em peso do comprimido.
Os comprimidos também contêm geralmente lubrificantes tais como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearato de zinco, estearilfumarato de sódio e misturas de estearato de magnésio com laurilsulfato de sódio. Os lubrificantes geralmente estão presentes em quantidades desde 0,25% em peso até 10% em peso, preferentemente desde 0,5% em peso até 3% em peso do comprimido.
Outros ingredientes convencionais incluem antioxidantes, colorantes, agentes aromatizantes, conservantes e agentes de mascaramento do sabor.
Os comprimidos de exemplo contêm até aproximadamente 80% em peso de fármaco, desde aproximadamente 10% até aproximadamente 90% em peso de aglutinante, desde aproximadamente 0% em peso até aproximadamente 85% em peso de diluente, desde aproximadamente 2% em peso até aproximadamente 10% em peso de desintegrante e desde aproximadamente 0,25% até aproximadamente 10% em peso de lubrificante.
As misturas de comprimido podem ser comprimidas directamente ou mediante rolos para formar comprimidos. As misturas de comprimido ou porções das misturas podem como alternativa ser granuladas por via húmida, por via seca ou 14 em fusão, ser solidificada em fusão ou se extruída antes da preparação do comprimido. A formulação final pode incluir uma ou mais camadas e pode estar revestida ou não revestida; ou encapsulada. A formulação de comprimidos é discutida em detalhe em "Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1" por H. Lieberman e L. Lachman, Mareei Dekker, N. E., N.E., 1980 (ISBN 0-8247-6918-X).
As formulações sólidas para administração oral podem ser formuladas para ser de libertação imediata e/ou modificada. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, por pulsos, controlada, dirigida e programada.
As formulações de libertação modificada adequadas são descritas na Patente dos Estados Unidos N° 6.106.864. Podem ser encontrados detalhes de outras tecnologias de libertação adequadas tais como dispersões de alta energia e partículas osmóticas e revestidas em Verma et al., Pharmaceutical Technology On-line, 25 (2), 1-14 (2001). A utilização de goma de mascar para conseguir libertação controlada é descrita no documento WO 00/35298. Administração Parentérica
Os compostos da invenção podem também ser administrados directamente à corrente sanguínea, no músculo ou num órgão interno. Os meios adequados para administração parentérica incluem via intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular e subcutânea. Os dispositivos adequados para administração parentérica incluem injectores de agulha (incluindo micro-agulha), injectores sem agulha e técnicas de infusão.
As formulações parentéricas são tipicamente soluções aquosas que podem conter excipientes tais como sais, hidratos de carbono e agentes de tamponamento (preferentemente a um pH desde 3 até 9), mas, para algumas 15 aplicações, podem ser formuladas de forma mais adequada como uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca para ser utilizada junto com um veiculo adequado tal como água estéril, sem pirógenos. A preparação de formulações parentéricas em condições estéreis, por exemplo, por liofilização, pode ser conseguida facilmente utilizando técnicas farmacêuticas convencionais bem conhecidas para os peritos na especialidade. A solubilidade dos compostos da invenção utilizados na preparação de soluções parentéricas pode ser aumentada pela utilização de técnicas de formulação apropriadas, tais como a incorporação de agentes potenciadores da solubilidade.
As formulações para administração parentérica podem ser formuladas para ser de libertação imediata e/ou modificada. Formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, por pulsos, controlada, dirigida e programada. Deste modo os compostos da invenção podem ser formulados como um sólido, semisólido ou um liquido tixotrópico para administração como um depósito implantado que proporciona libertação modificada do composto activo. Os exemplos de ditas formulações incluem endopróteses vasculares revestidas de fármaco e microesferas de PGLA.
Administração Tópica
Os compostos da invenção também podem ser administrados por via tópica à pele ou a mucosa, isto é, por via dérmica ou transdérmica. As formulações típicas para este propósito incluem geles, hidrogeles, loções, soluções, cremes, pomadas, pós de utilização externa, compressas, espumas, filmes, pensos cutâneos, hóstias, implantes, esponjas, fibras, bandagens e microemulsões. Também podem ser utilizadas lipossomas. Os veículos típicos incluem álcool, água, óleo mineral, vaselina líquida, vaselina branca, glicerina, polietilenoglicol e 16 propilenoglicol. Podem ser incorporados potenciadores da penetração; veja-se, por exemplo, J Pharm Sei, 88 (10), 955-958 por Finnin e Morgan (Outubro de 1999) . Outros meios de administração tópica incluem distribuição por electroporação, iontoforese, fonoforese, sonoforese e injecção com micro-agulha ou sem agulha (por exemplo Powderject™, Bioject™, etc.).
As formulações para administração tópica podem ser formuladas para ser de libertação imediata e/ou modificada. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, por pulsos, controlada, dirigida e programada.
Administração por inalação/Intranasal
Os compostos da invenção também podem ser administrados por via intranasal ou por inalação, tipicamente em forma de um pó seco (só, como uma mistura, por exemplo, numa mistura seca com lactose ou como uma partícula de componente misto, por exemplo, misturado com fosfolípidos, tais como fosfatidileolina) a partir de um inalador de pó seco ou como um pulverizador em aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferentemente um atomizador que usa electrohidrodinâmica para produzir uma névoa fina) ou nebulizador, com ou sem a utilização de um propulsor adequado, tal como 1,1,1,2-tetrafluoretano ou 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano. Para utilização intranasal, o pó pode incluir um agente bioadesivo, por exemplo, quitosano ou ciclodextrina. 0 recipiente pressurizado, bomba, pulverizador, atomizador ou nebulizador contém uma solução ou suspensão do composto ou os compostos da invenção que compreende, por exemplo, etanol, etanol aquoso ou um agente alternativo adequado para dispersão, solubilização ou prolongamento da libertação do activo, um propulsor ou propulsores como solventes e um tensioactivo opcional, tal como trioleato de sorbitano, ácido oleico ou um ácido oligoláctico. 17
Antes da utilização num pó seco ou uma formulação de suspensão, o produto farmacêutico é micronizado até um tamanho adequado para distribuição mediante inalação (tipicamente menos de 5 micrómetros). Isto pode ser conseguido por qualquer método de trituração apropriado, tal como moinho de jacto em espiral, moinho de jacto em leito fluido, processamento fluido supercrítico para formar nanoparticulas, homogeneização de alta pressão ou secagem por pulverização.
As cápsulas (feitas, por exemplo, a partir de gelatina ou HPMC), os blister e cartuchos para utilização num inalador ou um insuflador pode ser formulados para conter uma mistura de pó do composto da invenção, uma base de pó adequada tal como lactose ou amido e um modificador do desempenho tal como I-leucina, manitol ou estearato de magnésio. A lactose pode ser anidrida ou em forma do monohidrato, preferentemente o segundo. Outros excipientes adequados incluem dextrano, glucose, maltose, sorbitol, xilitol, frutose, sacarose e trehalose.
Uma formulação de solução adequada para utilização num atomizador utilizando electrohidrodinâmica para produzir uma névoa fina pode conter desde 1 μρ até 20 mg do composto da invenção por activação e o volume de activação pode variar desde 1 μΐ até 100 μΐ. Uma formulação tipica inclui um composto da invenção, propilenoglicol, água estéril, etanol e cloreto de sódio. Os solventes alternativos que podem ser utilizados em lugar de propilenoglicol incluem glicerol e polietilenoglicol.
Podem ser adicionados aromatizantes adequados, tais como mentol e levomentol ou adoçantes, tais como sacarina ou sacarina de sódio às formulações da invenção dirigidas a administração intranasal/inaladas.
As formulações para administração inalada/intranasal podem ser formuladas para ser de libertação imediata e/ou modificada utilizando, por exemplo, ácido poli(DL-láctico- 18 coglicólico (PGLA). As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, por pulsos, controlada, dirigida e programada.
No caso de inaladores e aerossóis de pó seco, a unidade de dosagem é determinada por meio de uma válvula que distribui uma quantidade medida. As unidades de acordo com a invenção são dispostas tipicamente para administrar uma dose medida ou "descarga" que contém uma quantidade desejada do composto da invenção. A dose diária total pode ser administrada numa dose única ou, mais habitualmente, como doses divididas ao longo do dia.
Administração Rectal/Intravaginal
Os compostos da invenção podem ser administrados por via rectal ou vaginal, por exemplo, em forma de supositório, pessário ou enema. A manteiga de cacau é uma base de supositório tradicional, mas podem ser utilizadas diversas alternativas conforme seja apropriado.
As formulações para administração rectal/vaginal podem ser formuladas para ser de libertação imediata e/ou modificada. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, por pulsos, controlada, dirigida e programada.
Administração Ocular
Os compostos da invenção também podem ser administrados directamente no olho ou no ouvido, tipicamente em forma de gotas de uma suspensão ou solução micronizada em solução salina estéril isotónica com pH ajustado. Outras formulações adequadas para a administração ocular e auricular incluem pomadas, implantes biodegradáveis (por exemplo, esponjas de gel absorvível, colagénio) e não biodegradáveis (por exemplo silicone), hóstias, lentes e sistemas de partículas ou vesiculares, tais como niossomas ou lipossomas. Um polímero tal como um ácido poliacrílico reticulado, álcool polivinílico, ácido hialurónico, um polímero celulósico, por exemplo, hidroxipropilmeticelulose, hidroxietilcelulose ou 19 metilcelulose ou um polímero de heteropolissacárido, por exemplo, goma gelana, pode ser incorporado junto com um conservante, tal como cloreto de benzalcônio. Ditas formulações também podem ser distribuídas por iontoforese.
As formulações para a administração ocular/auricular podem ser formuladas para ser de libertação imediata e/ou modificada. As formulações de libertação modificada incluem libertação retardada, prolongada, por pulsos, controlada, dirigida ou programada.
Outras Tecnologias
Os compostos da invenção podem ser combinados com entidades macromoleculares solúveis, tais como ciclodextrina e derivados adequados das mesmas ou polímeros que contêm polietilenoglicol, a fim de melhorar sua solubilidade, velocidade de dissolução, mascaramento do sabor, biodisponibilidade e/ou estabilidade para utilização em qualquer dos modos de administração mencionados anteriormente.
Os complexos de fármaco-ciclodextrina, por exemplo, resultam ser geralmente úteis para a maioria das formas farmacêuticas e vias de administração. Podem ser utilizados complexos tanto de inclusão como de não inclusão. Como uma alternativa à formação de complexos directa com o fármaco, a ciclodextrina pode ser utilizada como um aditivo auxiliar, isto é, como um veículo, diluente ou solubilizante. Para estes propósitos são utilizados de forma mais habitual alfa, beta e gama ciclodextrinas, exemplos das quais podem ser encontrados nas Publicações de PCT N° WO 91/11172, WO 94/02518 e WO 98/55148.
Dosagem A quantidade de composto activo administrado dependerá do sujeito a tratar, a gravidade do transtorno ou afecção, a taxa de administração, a disposição do composto e a discrição do médico que prescreve. No entanto, uma dosagem eficaz está tipicamente no intervalo de aproximadamente 20 0,001 a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal por dia, preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 35 mg/kg/dia, em doses únicas ou divididas. Para um ser humano de 70 kg, isto representaria uma quantidade de aproximadamente 0,07 a aproximadamente 7000 mg/dia, preferentemente de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 2500 mg/dia. Em alguns casos, os níveis de dosagem abaixo do limite inferior do intervalo antes indicado podem ser mais que adequados, enquanto que em outros casos podem ser utilizadas dose ainda maiores sem causar nenhum efeito secundário prejudicial, dividindo-se tais doses grandes tipicamente em várias doses mais pequenas para sua administração ao longo do dia.
Kit de partes
Na medida em que pode ser desejável administrar uma combinação de compostos activos, por exemplo, com o propósito de tratar uma doença ou afecção particular, está dentro do âmbito da presente invenção que duas ou mais composições farmacêuticas, contendo pelo menos uma delas um composto de acordo com a invenção, podem ser combinadas de forma conveniente em forma de um kit adequado para a administração conjunta das composições. Deste modo o kit da invenção inclui duas ou mais composições farmacêuticas separadas, contendo pelo menos uma delas um composto da invenção e um meio para conservar de forma separada ditas composições, tal como um recipiente, garrafa dividida ou embalagem de papel de alumínio dividido. Um exemplo de dito kit é o familiar recipiente de blister usado para a embalagem de comprimidos, cápsulas e similares. O kit da invenção é particularmente adequado para a administração de diferentes formas farmacêuticas, por exemplo, oral e parentérica, para administrar as composições separadas a diferentes intervalos de dosagem ou para titular as composições separadas entre si. Para ajudar ao seguimento da terapêutica, o kit inclui tipicamente instruções para sua 21 administração e pode ser proporcionado com um recordatório.
Exemplos
Ensaios In Vitro Materiais e Métodos Métodos In Vitro Métodos de Ensaio Bioquímico de Quinase
Os valores bioquímicos de K± do composto 1 para a inibição da c-Met/HGFR quinase foram determinados utilizando um procedimento geral para monitorizar a oxidação de NADH que é acoplada à renovação de ATP conforme o sequinte. Os compostos e reaqentes do ensaio de quinase são introduzidos em poços de ensaio e são incubados durante 10 minutos a 37°C. O ensaio é iniciado pela adição da enzima c-met/HGFR. Os inibidores de enzima reduzem a actividade medida da enzima. No ensaio espectrofotométrico acoplado contínuo a produção dependente do tempo de ADP pela quinase é determinada pela análise da velocidade de consumo de NADH pela medição da diminuição da absorvância a 340 nm. A medida que a enzima quinase produz ADP esta é reconvertida a ATP, por reacção com fosfoenol piruvato e piruvato quinase. Também se produz piruvato nesta reacção. O piruvato é convertido posteriormente em lactato por reacção com lactato desidrogenase, que simultaneamente converte NADH a NAD. NADH tem uma absorvância mensurável de 34 0 nm enquanto que NAD não. Portanto, o ponto final do ensaio é medido por espectofotometria a 340 nm nos pontos de tempo designados. Métodos de Ensaio Bioquímico de Quinase de Sinalização
Celular (Upstate)
As quinases foram pré-diluídas a uma concentração de trabalho lOx antes de sua adição no ensaio. Brevemente, os substratos foram dissolvidos e diluídos a soluções mãe de trabalho em água deionizada, separados de histona Hl (solução mãe de trabalho lOx em MOPS 20 mM pH 7,4), PDKtide 22 (solução mãe de trabalho lOx em Tris 50 mM pH 7,0) e ATF2 (que é armazenado tipicamente numa solução mãe de trabalho 20x em Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EGTA 0,1 mM, Brij-35 a 0,03%, glicerol a 50%, benzamidina 1 mM, pmsf 0,2 mM e mercaptoetanol a 0,1%). A enzima bioquímica de interesse é ensaiada depois num volume de reacção final de 25 μΐ que continha 5-10 mu da enzima seleccionada incubada com MOPS 8 mM a pH 7,0, EDTA 0,2 mM, EAIYAAPFAKKK 50 μΜ, acetato de Mg 10 mM e 32P-ATP (actividade específica de aproximadamente 500 cpm/pmol, concentração conforme seja requerido) . A reacção é iniciada pela adição da mistura de MgATP. Depois de uma incubação durante 40 minutos a temperatura ambiente, a reacção é interrompida pela adição de 5 μΐ de uma solução de ácido fosfórico a 3%. São aplicados pontualmente 10 μΐ da reacção numa tira de filtro P30 e se lava três vezes durante 5 minutos em ácido fosfórico 75 mM e uma vez em metanol antes da secagem e a contagem de cintilação.
Linhas Celulares
As linhas celulares utilizadas para avaliar o composto 1 em estudos in vitro foram as seguintes: carcinoma de pulmão humano A549, carcinoma gástrico humano GTL-16, carcinoma de cólon humano HT29, carcinoma de cólon humano Colo205, carcinoma renal humano A498, carcinoma renal humano 786-0, carcinoma de mama humano MBA-MD-231, células epiteliais de rim canino Madlin-Darby (MDCK), células MDCK desenvolvidas por engenharia genética para expressar P-glicoproteína (MDCK-MDRl), epiteliais de rim de ratinho mlMCD3, HUVEC (células endoteliais da veia umbilical humana); células NIH-3T3 desenvolvidas por engenharia genética para expressar c-met/HGFR de tipo selvagem e c-met/HGFR mutado humano incluindo HGFR-V1092I, HGFR-H1094R, HGFR-Y1230C e HGFR-M1250T. As linhas celulares utilizadas para avaliar a inibição da fosforilação de outras tirosinas quinases foram as seguintes: KARPAS 299, SU-DHL-1 e células de linfoma humano Jurkat, células endoteliais de veia 23 umbilical humana (HUVEC), células endoteliais macro vasculares humanas (HMVEC), células endoteliais da Aorta Porcina (PAE) desenvolvidas por engenharia genética para expressar VEGFR2, pdgfrP, TrkA e TrkB humanas; células nih-3T3 desenvolvidas por engenharia genética para expressar Ron, Axl, Sky humanas e quimera EGFR/Tie-2; células HEK293 desenvolvidas por engenharia genética para expressar irk humana, células de ovário de hamster chino (CHO-B) desenvolvidas por engenharia genética para expressar Ron humana, células BaF3 desenvolvidas por engenharia genética para expressar BCR-Abl humana. Todas as linhas celulares desenvolvidas por engenharia genética foram geradas em Pfizer, as células de carcinoma gástrico GTL-16 foram um presente do Dr. Paolo Comoglio (Escola Médica Universitária de Turim, Candiolo, Itália), HUVEC e HMVEC (Célula Endotelial Macrovascular Humana) foram adquiridas de Clonetics, Inc. (Walkersville, MD) e as restantes foram de ATCC (Manassas, VA) . A menos que se indique de outro modo, os reagentes de cultura celular foram obtidos de Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD). As células foram mantidas a 37°C numa atmosfera humidificada com C02 a 5-10% e foram mantidas utilizando técnicas de cultura celular convencionais.
Anticorpos e Factores de Crescimento
Foram utilizados anticorpos para avaliar o composto 1 em ELISA e estudos de imunotransferência in vitro como segue: anti-c-Met/HGFR humano total e anti-fosfo Zap70 foram de Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CA; anti-Ron total, anti-FGFRl total, anti-PDGFRP total, anti-Trk total, anti-Tie-2 total e anti-fosfotirosina (PY-20) foram de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; anti-Axl total e anti-c-Met/HGFR de ratinho total foram de R&D Systems, Minneapolis, MN; anti-IRK total de BD Pharmingen, San Diego, CA); anti-VEGFR2 de Novus Biologicals, Littleton, CO; anti-fosfo-c-Met/HGFR, anti-fosfo ALK e ALK total, anti-c-ABL total, 24 anti-fosfo Gabl e Gabl total, anti-fosfo AKT e AKT total, anti-fosfo MAPK44/42 e MAPK44/42 total, anti-fosfo Raf, Mek 1/2, P90RSK e STAT5 foram de Cell Signaling Technologies, Boston, MA. A maioria dos factores de crescimento utilizados em ensaios celulares foi de R&D Systems, Minneapolis, MN, excepto BDGF de GibcoBRL/invitrogen, Carlsbad, CA e egf de Roche Applied Science, Indianapolis, IN.
Ensaio de Fosforilação de Quinase Celular
Ensaios celulares (isto é, ELISA ou imunotransferência) utilizados para determinar directamente a capacidade do composto 1 para inibir fosforilação de quinase dependente de ligando ou constitutiva foram realizados utilizando uma variedade de células privadas de soro.
Preparação das células
As células foram semeadas em placas de 96 poços num meio de crescimento (meio complementado com soro bovino fetal-FBS a 10%) e foram cultivadas durante a noite a 37°C para facilitar a união a placas de ensaio. Depois da união, o meio de crescimento foi retirado e as células foram cultivadas em meios sem soro (com BSA a 0,04%). Foram realizadas diluições em série de composto 1, foram adicionados controlos apropriados ou concentrações designadas de composto 1 a cada poço e as células foram incubadas a 37°C durante 1 hora. Em experiências que investigam a fosforilação de RTK dependente de ligando, foram adicionados factores de crescimento correspondentes (por exemplo, HGF, MSP, Gas6, EGF, NGF, BDNF, insulina, VEGF ou PDGF BB) às células durante de 8 a 20 minutos. H2O2 foi utilizado para estimular a fosforilação de Axl humana em células HUVEC como foi descrito (Konishi, A., Aizawa, T. Mohan, A., Korshunov, V. A. e Berk, B. C., Hydrogen peroxide activates the Gas6-Axl patway in vascular smooth muscle cells. The Journal of Biological Chemistry, 279:28766-28770 (2004). A fosforilação de quinase constitutiva foi medida em 25 ausência de adição de ligando exógeno para linhas celulares com actividade de quinase activa de forma constitutiva (por exemplo, c-Met/HGFR em células GTL-16, NPM-ALK em células Karpas 299, Ron em células Ron-CHO-B e BCR-Abl em células BCR-Abl BaF3). Depois da incubação das células com composto 1 e/ou ligandos apropriados para os tempos designados, as células foram lavadas uma vez com NasVCh 1 mM em HBSS e depois foram lisadas utilizando tampão de lise (Cell Signaling Technologies, Boston MA).
Ensaio ELISA A fosforilação de proteínas quinases de interesse foi avaliada por meio de um método de ELISA de tipo sanduíche utilizando anticorpos de captura específicos para cada proteína e um anticorpo de detecção específico para os resíduos de tirosina fosforilada. Em cada ensaio de ELISA, foram transferidos lisados de proteínas gerados a partir de várias linhas celulares tratadas com os ligandos RTK apropriados e/ou composto 1 a uma placa de 96 poços que se revestiu previamente com os anticorpos correspondentes incluindo anti-c-Met/HGFR, -Ron, -Axl, -Sky, IR, -Tie2, -KDR, -PDGFRP, -Zap70, etc. As placas revestidas com anticorpos foram incubadas em presença de lisados de proteínas a 4°C durante a noite e foram lavadas com Tween 20 a 1% em PBS sete vezes. HPR-PY20 foi diluído (antifosfotirosina total conjugado com peroxidase de rábano silvestre, Santa Cruz Biothenology, Santa Cruz, CA) 1:500 em tampão de bloqueio (Pierce, Rockford, IL) e foi adicionado a cada placa durante 30 minutos. Então as placas foram lavadas de novo e foi adicionado substrato de TMB peroxidase (Bio-Rad laboratories, Hercules CA) para iniciar a reacção colorimétrica dependente de HRP. A reacção foi interrompida adicionando H2SO4 0,09 N. As placas foram medidas a DO-450 nm utilizando um espectrofotómetro. Os valores de CI50 foram calculados mediante ajuste de curvas concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros num 26 modelo baseado em Excel.
Imunotransferência A capacidade do composto 1 para inibir a fosforilação da quinase celular também foi medida mediante um método de imunotransferência. As células foram tratadas com diluições de composto 1 em meio sem soro e foram lisadas para a extracção de proteinas como foi descrito anteriormente. Os lisados celulares foram normalizados para a concentração de proteína mediante ensaio de BSA (Pierce, Rockford, IL) e foram utilizados anticorpos específicos para inmunoprecipitar as proteínas de interesse. As proteínas inmunoprecipitadas foram separadas mediante SDS-PAGE e foi realizada uma imunotransferência com anticorpos antifosfotirosina para determinar os níveis relativos de proteínas fosforiladas em cada concentração de fármaco. Este método de inmunotransfêrencia também foi utilizado para determinar os níveis totais de proteína para as moléculas de interesse.
Proliferação celular e ensaios de sobrevivência Ensaio de proliferação celular
As células de tumor foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade baixa em meio de crescimento (meio complementado com soro bovino fetal-FBS a 10%) e foram cultivadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte, o meio de crescimento foi retirado e as células foram cultivadas em meio sem soro (FBS a 0% e BSA a 0,4%). Foram realizadas diluições seriadas de composto 1, foram adicionados controlos apropriados ou concentrações designadas de composto 1 a cada poço e as células foram incubadas a 37°C durante de 24 a 72 horas. Depois foi realizado um ensaio de MTT (Promega, Madison, wi) para determinar os números de células relativos. Os valores de CI50 foram calculados por ajuste de curva de concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros.
Ensaio de Apoptose/sobrevivência celular 27
Foram semeadas células GTL-16 em placas de 96 poços a 40.000 células/poço. Foram adicionadas concentrações designadas de PF-02341066 ou veículo aos poços em meios sem soro. As células foram incubadas a 37°C, com CO2 a 5% durante 48 horas. Foi utilizado o kit de ELISA de apoptose de ADN de cadeia simples (Chemicon International) para detectar apoptose.
Ensaio de sobrevivência de HUVEC estimulado com HGF
As células HUVEC (passagem 3) foram cultivadas até a confluência em meio EGM2 (Walkersville, MD) . As células foram semeadas em placas de 96 poços em meio EGM2 a alta densidade (de 20.000 a 30.000/poço) e foram incubadas durante 5 a 6 horas para possibilitar a união celular. Depois da união, as células foram cultivadas em meio sem soro (Cell Applications, San Diego, CA) durante a noite a 37°C com C02 a 5%. No dia seguinte, as células foram expostas ao meio de privação de alimento (Cell Applications, San Diego, CA) durante 5 horas. O composto 1 foi diluído em série num meio sem soro e foram adicionados os controlos apropriados ou as concentrações designadas do composto 1 a cada poço. Depois de uma hora, foi adicionado HGF recombinante humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) aos poços designados para conseguir uma concentração final de 100 ng/ml. Depois foi realizado um ensaio de MTT (Promega) depois de 48 a 72 horas para determinar os números de células relativos. Os valores de CI50 foram calculados mediante ajuste de curva de concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros.
Ensaios de migração celular e invasão dependentes de HGF Ensaios de migração e invasão de matriqel de células NCI-H441 O efeito do composto 1 na migração celular e a invasão de matrigel em carcinoma de pulmão de células não pequenas humano de NCI-H441 estimulado por HGF foi determinado utilizando um sistema de migração e invasão celular 28 disponível no mercado (BD Biosciences, San Jose, CA) . As células em fase de crescimento logarítmico foram tripsinizadas e suspensas num meio sem soro (com BSA a 0,04%) a uma densidade de 400.000 células/ml. O composto 1 foi diluído de forma seriada em meio sem soro, concentrações designadas foram adicionadas às células em suspensão e as células foram incubadas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Foram adicionadas células em suspensão com o controlo designado ou tratadas (0,5 ml) a cada câmara de migração ou invasão (isto é, insertos de placa). Ademais, foi adicionado HGF 25 ng/ml (0,75 ml) ao poço inferior de cada placa acompanhante como um quimio-atractor para atrair células dos insertos de placas de câmara de migração ou invasão inseridos na parte superior da placa acompanhante e as células foram incubadas a 37°C durante 22 horas. As células que invadiram ou migraram ao poço inferior da placa foram fixadas a seguir e os núcleos foram tingidos (LDAP1 1 μρ/πα em MeOH a 100%) durante 15 minutos a 37°C. As células foram lavadas duas vezes posteriormente utilizando solução de TBS. Foram tomadas cinco imagens microscópicas de cada poço e foi determinado o número de células para migração ou invasão em cada condição utilizando software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) . Os valores de CI50 foram calculados mediante ajuste de curva de concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros.
Ensaio de invasão de matriqel de HUVEC
Foi utilizado um sistema acea rt-CES (ACEA biologicals, San Diego, CA) para determinar o efeito do composto 1 na invasão de matrigel de HUVEC in vitro. Foram revestidas placas de 96 poços electrosensoras ACEA com 50 μΐ de fibronectina a 0,001% e HGF 100 ng/ml em PBS e foram incubadas a 37°C durante uma hora e a 4°C durante 30 minutos. Depois de lavar cada placa com PBS a 4°C, foi diluído o matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) 1:40 em 29 meio de privação de alimento (SM, Cell Applications, San Diego, CA), complementado com HGF (100 ng/ml) e/ou diferentes concentrações de composto 1, foram adicionadas (50 μΐ) aos poços designados e foi permitido que solidificasse a 37°C durante 2 horas. As células HUVEC foram cultivadas em meio sem soro (Cell Applications, San Diego, CA) durante 5 horas e depois em SM durante 2 horas. As células foram recolhidas posteriormente em SM a 60.000 células/ml e foram tratadas com HGF 100 ng/ml e/ou a concentração apropriada de composto 1 durante 30 minutos a 37°C. A suspensão de células HUVEC (100 μΐ) em condições designadas foi transferida à parte superior da camada de matrigel nos poços designados da placa de ACEA revestida. A placa de acea foi conectada depois com a estação do dispositivo ACEA a 37°C, 95% de ar: 5% de C02 e foi monitorizada em tempo real mediante um analisador de sensor de ACEA durante 48 horas. Os sensores electrónicos incluídos no fundo das placas de ACEA detectaram as células HUVEC que invadiram através do matrigel. O número relativo (índice celular) de células HUVEC invasoras foi determinado utilizando software integrado ACEA RT-CES™. Os valores de CI50 foram calculados por ajuste de curva de concentração-resposta utilizando um método analítico de quatro parâmetros.
Ensaio de dispersão de células MDCK
Foram semeadas células MDCK a densidade baixa (25 células/poço) numa placa de 96 poços em meio complementado com FBS a 10% e foram cultivadas até que apareceram pequenas colónias de 10-15 células. As células foram estimuladas depois com HGF (50 ng/ml) em presença de diversas concentrações de composto 1 diluído em meio de crescimento. Depois de uma incubação durante a noite, foram fixadas as colónias e foram tingidas com cristal de violeta a 0,2% em formalina tamponada a 10% e foram avaliadas com respeito a sua dispersão em cada concentração de forma visual. 30
Ensaio de germinação vascular de HMVEC
Foram adicionadas quinhentas HMVEC a meio EGM-2 que continha meticelulose a 0,24% e foram transferidas a placas de 96 poços de fundo em u para formar esferóides durante a noite. Os esferóides foram recolhidos e foram misturados em solução de fibrinogénio 2 mg/ml que continha FBS a 4-8% ± composto em placas de 48 poços revestidas com trombina (2 ml de 5.000 U/ml). O gel de fibrina tridimensional resultante foi coberto com EGM-2 que continha FBS a 4-8% e foi incubado a 37°C, 95% de ar /5% de C02. A formação de tubo endotelial foi observada diariamente num microscópio invertido. Foram capturadas imagens no dia 7 com uma câmara digital (Olympus BX60) conectada ao microscópio. Foi adicionado composto 1 a várias concentrações e a germinação vascular foi avaliada visualmente.
Ciclo celular e Análise de Apoptose por meio de Citometria de Fluxo O efeito do composto 1 na distribuição de ciclo celular dependente de NPM-ALK e a apoptose das células de linfoma humano foram avaliados por meio de análise de citometria de fluxo (FACSCalibur, BC Biosciences, San Jose, CA) . Foram tratadas células de linfoma humano Karpas 299 e SUDHL-1 com composto 1 durante 24 a 48 horas em meio de crescimento (RPMI + FBS a 10%) . As células foram lavadas duas vezes com PBS, foram fixadas e permeabilizadas com solução de BDCytofix/Cytoperm durante 20 minutos a 4°C. Foi avaliada a distribuição do ciclo celular e apoptose das células de linfoma utilizando o kit de reagente de adn Ciclo Test Plus (BD Biosciences). Utilizando este kit as células foram lavadas duas vezes com BD Perm lx/tampão de lavagem, foi adicionado detergente não iónico e tripsina para isolar os núcleos, foi adicionado iodeto de propidio para visualizar o conteúdo de ADN e as células foram analisadas por meio de citometria de fluxo. O conteúdo de ADN (análise de ploidia para determinar a percentagem do número de células em cada 31 ciclo celular) foi avaliado utilizando Cell Quest Pro e foi analisado com software ModFit LT (BD Biosciences). 0 máximo apoptótico (A0) foi definido como o pico que aparece nos números de canais inferiores menores que o pico G0/Gi como foi descrito (Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del-Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. S., Lassota, P., e Traganos, F., Cytometry 13:795-808 (1992)). Também foi determinada a apoptose pela análise citométrica de fluxo utilizando coloração de Annexina V-FITC (BD Biosciences, San Jose, CA) e também foi analisado utilizando FACSCalibur. Métodos In Vivo Linhas celulares A menos que se indique de outro modo, os reagentes de cultura celular foram obtidos de Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) . As células foram mantidas a 37°C numa atmosfera humidificada com C02 a 5-10% e foram passadas utilizando técnicas de cultura celular convencionais. As células U87MG (gliobastoma humano), NCI-H441 (adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas humano), PC-3 (adenocarcinoma de próstata humana) foram obtidas e foram cultivadas como está recomendado pela colecção americana de culturas tipo (Bethesda, MD).
Modelos de Xenotransplante Subcutâneo em Ratinhos Atímicos
Foram obtidos ratinhos fêmeas ou machos nu/nu ou SCID/Beige (de 5 a 8 semanas de idade) de Harlan (Madison, WL) ou Charles River (Wilmington, MA) . Os animais foram mantidos em condições de ambiente limpo em jaulas de filtro superior estéril com leito de terra Alpha/Dri/bed-o-cob albergados em grades ventiladas filtradas por HEPA. Os animais receberam ração de roedor estéril e água ad libitum. As células para implantação em ratinhos atímicos foram recolhidas e sedimentadas por centrifugação a 450xg durante 5-10 minutos. Os sedimentos celulares foram lavados uma vez e foram resuspensos em solução salina tamponada com fosfato estéril ou em meio sem soro. As células de tumor foram 32 complementadas com matrigel a 30-50% (BD Biosciences, San Jose CA) para facilitar a implantação do tumor e o crescimento das células de tumor seleccionadas como xenotransplantes. As células (2-5x 106 em 100 μΐ) foram implantadas SC na região lateral posterior do ratinho e se permitiu que crescessem até o tamanho designado antes da administração do composto para cada experimento. O tamanho de tumor foi determinado medindo com calibradores electrónicos e foi calculado o volume de tumor como o produto do seu comprimento x largura2 x 0,4.
Estudo de Modulação de Alvo Ex Vivo (PK/PD)
Processamento de Tumor e Plasma para Estudos
Farmacodinâmicos in Vivo
As células de tumor que expressam c-Met/HGFR ou alk fosforilado de forma constitutiva foram implantados por via subcutânea em ratinhos atimicos e se permitiu que crescessem sem tratamento até um tamanho de 300-800 mm3. Aos ratinhos foi administrado composto 1 como uma dose oral única (para estudos de PK/PD agudos) ou dose orais múltiplas (para estudos de PK/PD de estado estacionário) aos níveis de dose designados. Nos tempos indicados depois da administração de composto 1, os ratinhos foram sacrificados individualmente de forma humanitária, foi isolada uma amostra sanguínea do ventrículo cardíaco esquerdo utilizando uma seringa preparada com sulfato de heparina e os tumores foram ressecados. As amostras de plasma foram analisadas com respeito a concentração de composto 1 utilizando análise de emcl . Os tumores ressecados foram congelados instantaneamente em gelo seco, foram pulverizados utilizando um crio almofariz arrefecido em nitrogénio líquido e foram lisados em tampão de lise celular lx frio (Cell Signaling Technologies, Boston MT) . As proteínas foram extraídas do lisado de tumor e as concentrações de proteína foram determinadas utilizando um ensaio de BSA (Pierce, Rockford, IL). O nível de proteínas totais e/ou fosforiladas de 33 interesse em cada amostra de tumor foi determinado utilizando um método de captura de ELISA como é descrito a seguir.
Ensaios de ELISA para a Avaliação de Inibição
Farmacodinâmica em Alvos de Quinase
Em cada ensaio de elisa, os lisados de proteínas que foram gerados a partir de tumores tratados com veiculo ou composto 1 foram transferidos a uma placa de 96 poços que se revestiu previamente com anticorpos de captura anti-c-Met/HGFR (Zymed Lab/Invitrogen, Carlsbad, CA) ou anti-ALK (Cell Signaling Technologies, Boston MT) . As placas revestidas com anticorpo foram incubadas em presença de lisados de tumor a 4°C durante a noite e foram lavadas com Tween 20 a 1% em PBS sete vezes. Foi diluido HRP-PY20 (antifosfotirosina total conjugado com peroxidase de rábano, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 1:500 em tampão de bloqueio (Pierce, Rockford, IL) e foi adicionado a cada placa durante 30 minutos. As placas foram lavadas de novo e foi adicionado substrato de peroxidase TMB (Bio-Rad laboratories, Hercules CA) para iniciar a reacção colorimétrica dependente de HRP. As reacções foram interrompidas mediante a adição de H2S04 0,09 N. A densidade óptica (DO) de cada poço de veículo ou tratamento foi medida a 450 nm utilizando um espectrofotómetro. A fosforilação total de c-Met/HGFR ou ALK em tumores extirpados de animais tratados com composto 1 foi comparada com a de tumores ressecados de animais tratados com veículo no mesmo ponto de tempo se baseando nas leituras de DO. Nesta avaliação, a inibição da fosforilação do alvo de quinase pelo composto 1 em tumores foi calculada utilizando a seguinte equação: % de Inibição = 100-[(DO média tratados/ DO média não tratados) x 100].
Imunotransferência O método de imunotransferência também foi utilizado 34 para determinar o estado de fosforilação de quinase relativo e os niveis de proteina total nas amostras de tumor para a proteína de interesse. Os ratinhos portadores de tumores foram tratados com diferentes doses de composto 1, foram preparados lisados de tumor e amostras de proteínas como foi descrito anteriormente. Foram utilizados anticorpos específicos para imunoprecipitar proteínas de interesse. As proteínas imunoprecipitadas foram separadas mediante SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpos antifosfotirosina ou totais.
Os anticorpos utilizados em estudos de imunotransferência são os seguintes: anti c-Met/HGFR humano total de Zymed/invitrogen, Carlsbad, CA; anti-fosfo-c-Met/HGFR, anti-fosfo alk e alk total, anti-fosfo Gabl e Gabl total, anti-fosfo AKT e AKT total e anti-fosfo MAPK44/42 e MAPK44/42 total, STAT5 foram de Cell Signaling Technologies, Boston, MA.
Implantação de mini-bomba osmótica para estudos de infusão in vivo
As mini-bombas Alzet 1003D e 1007D foram obtidas de Durect Corporation (Cupertino, CA) . As mini-bombas foram carregadas com soluções de concentrações designadas de composto 1 e foram preparadas em solução salina estéril a 37°C até que alcançaram o equilíbrio as 4 ou 5 horas. As bombas foram implantadas cirurgicamente por via subcutânea conforme as instruções do fabricante na área torácica dorsal esquerda dos ratinhos portadores de tumores em sua região lateral direita. A incisão foi fechada utilizando grampos cirúrgicos que foram retirados depois de 5-7 dias quando a incisão da pele estava completamente curada. A cirurgia de substituição de bomba foi levada a cabo num momento designado para os estudos que requeriam tempo de infusão e volume de fármaco que excedia a capacidade da bomba. Histologia e Imunohistoquímica do Tumor (IHC)
As amostras de tumor a avaliar com respeito a critérios 35 de valoração imunohistoquímicos foram recolhidas e fixadas em formalina tamponada a 10% com inibidores de protease e fosfatase durante 24 horas antes de serem transferidas a etanol a 70%. As amostras de tumor foram incrustadas em parafina posteriormente e foram cortadas secções de 4 μΜ e foram fixadas em lâminas de microscópio. A desparafinização e recuperação do antígeno (baseado em EDTA) foram realizadas seguindo as instruções do fabricante utilizando uma câmara de recuperação antigénica disponível no mercado (Biocare Medicai, N° de Cat DC2001) . As amostras congeladas de OCT dos tumores também foram recolhidas e seccionadas para coloração com CD-31. Para imunocoloração, foram incubadas as lâminas com os anticorpos primários e depois os anticorpos secundários e foram visualizados utilizando um método colorimétrico (DAO Envision-HARP, kit DAB, DAO, Carpentaria, CA), ou um método fluorométrico (Alexa 488 ou Alexa 635, Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad CA) . Todas as secções imunocoloridas foram contracoloridas utilizando hematoxilina. Também foi utilizado um módulo de coloração automatizado Ventana Discovery XT (Ventana Medicai Systems, Tucson, AZ) para levar a cabo uma coloração histológica seguindo as instruções do fabricante. As secções coloridas foram analisadas utilizando um microscópio Olympus e a análise quantitativa da coloração de secção foi realizada utilizando o sistema ACIS (Automated Cellular Imaging, Clarient, Irvine CA) . Patologistas internos também analisaram as lâminas utilizando métodos clínicos convencionais.
Os anticorpos utilizados em estudos imunohistoquímicos incluíram anti-fosfo-c-Met/HGFR de Biosource internationals/lnvitrogen, Carlbad, CA; anti-K67 de Dacocytomation, Carpenteria, CA; anti-CD31 de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.
Dados e resultados
Potência enzimática de composto 1 contra o c-Met/HGFR RTK 36 (não forma parte da invenção)
Foi demonstrado que o composto 1 é um potente inibidor competitivo para ΆΤΡ da actividade quinase de c-Met/HGFR humano recombinante com uma K± média de 4 nM. 0 composto 1 inibiu a actividade quinase de c-Met/HGFR num ensaio enzimático bioquímico com uma Ki de 3 nM. Para investigar a selectividade da quinase em relação com c-Met/HGFR, o composto 1 foi avaliado adicionalmente em ensaios bioquímicos de exploração de quinase contra um grupo de >120 quinases recombinantes. Nestas explorações bioquímicas de selectividade de quinase preliminares, foi identificado um subconjunto de quinases contra o qual o composto 1_ mostrou actividade de modo que a selectividade para c-Met/HGFR foi estimada que era menor de 100 vezes em comparação com c-Met/HGFR. A actividade do composto 1 contra estes acertos de quinase potenciais foi avaliada adicionalmente em estudos de seguimento em ensaios definitivos de selectividade de quinase baseados em células (Quadro 1). Os valores bioquímicos de Ki de composto 1 para a inibição da quinase de c-Met/HGFR foram determinados monitorizando a oxidação de NADH que está acoplada à renovação de ATP. Os compostos e os reagentes de ensaio de quinase foram introduzidos em poços de ensaio e foram incubados durante 10 minutos a 37°C e a reacção foi iniciada pela adição do c-Met/HGFR. NADH foi medida por meio de espectrofotometria a 340 nm nos pontos de tempo designados.
Selectividade de Quinase de Composto 1 em Ensaios Baseados em Células (não forma parte da invenção)
A selectividade do composto 1 foi avaliada num grupo de ensaios de actividade de quinase baseados em células para as quinases seleccionadas que eram acertos potenciais em ensaios bioquímicos e outras RTK relacionadas (por exemplo, RON, SKY, ir) . Em estudos baseados em células, o composto 1 era mais de 1000 vezes selectivo para RTK 37 divididas por VEGFR2 e PDGFRP, mais de 200 vezes selectivo para IR e Lck e aproximadamente de 40 a 60 vezes selectivo para Axl, Tie2, TrkA e TrkB, todos em comparação com c-Met/HGFR (A549 CI50 = 8,6 nM). Para investigar se um intervalo de 50 vezes era suficiente para a selectividade de c-Met/HGFR in vivo, o composto 1 foi avaliado com respeito a sua capacidade para inibir a fosforilação de Tie-2 em xenotransplantes de C6 em ratinhos atimicos. Neste estudo, no foi observada uma inibição significativa da fosforilação de Tie-2 em nenhum ponto de tempo depois de uma dose oral única de 50 mg/kg (que representa CI99 para a inibição de c-Met/HGFR durante 24 horas) ou 100 mg/kg. Isto indica que a inibição de Tie-2, Axl ou TrkA e B seria improvável em doses até 2 vezes maiores que os niveis de dose associados com uma inibição completa de c-Met/HGFR durante 24 horas. O composto 1 era de 20 a 30 vezes selectivo para a RON quinase que representa um alvo oncológico potencialmente benéfico devido a 1) sua sobreexpressão e mutação em cancros seleccionados e 2) a ausência de fenótipo adverso em ratinhos deficientes em RON. Ao contrário das RTK anteriormente mencionadas, 0 composto 1 demonstrou um valor de CI50 quase equivalente (24 nM) contra uma forma oncogénica da proteína de fusão de ALK RTK (quinase de linfoma anaplásico), NPM-ALK, uma proteína de fusão oncogénica variante da ALK RTK (quinase de linfoma anaplásico), que resulta de uma translocação cromossómica que está envolvida na patogénese de linfoma de células grandes anaplásico humano (ALCL, numa linha celular de linfoma humano (Erro, Fonte de referência não encontrada.1)).
Inibição Farmacodinâmica de Actividade de RTK de c-Met/HGFR em células (não forma parte da invenção)
Para confirmar que a actividade enzimática potente se traduzia na inibição de c-Met/HGFR em células, foi avaliada a capacidade do composto 1 para inibir a fosforilação de 38 cMet/HGFR num grupo de linhas celulares de tumor e endoteliais. 0 composto 1 inibiu a autofosforilação de tirosina total estimulada por HGF ou constitutiva de c-Met/HGFR de tipo selvagem com um valor médio de Ci5o de 11 nM ao longo de um grupo de linhas celulares de tumor e endoteliais humanas (Quadro 1) . 0 composto 1 demonstrou um valor similar em células epiteliais de ratinho mlMCD3 (Ci50 = 5 nM) (Quadro 1) .
Potência do Composto 1 frente a Mutações de Sitio Activo de cMet/HGFR em células (não forma parte da invenção)
Foram identificadas mutações activadoras de c-Met/HGFR em vários cancros humanos e estas proporcionam uma forte lógica para estudos clínicos de prova de hipótese baseada em provas experimentais e precedentes clínicos com outros alvos de RTK. Embora não seja predito que as mutações de c-Met/HGFR no domínio extracelular ou justamembrana afectem à união do composto ao sítio activo, é possível que mutações no domínio de quinase causem uma perda de actividade. Para abordar este problema, foi avaliada a CI50 de fosforilação de RTK em células NIH3T3 tratadas com composto 1 desenvolvidas por engenharia genética para expressar c-Met/HGFR de tipo selvagem ou uma série de mutações de sítio activo de c-Met/HGFR representativas. Nestes estudos, o composto 1 mostrou actividades melhoradas ou similares contra mutantes de sítio de união a ATP (V1092I, 19 nM e H1094R, 2,2 nM) ou mutantes de laço P (M1250T, 15 nM) em comparação com o receptor de tipo selvagem (12,6 nM) (Quadro 1) . 0 composto 1 também mostrou de forma potente uma potência comparável na inibição da fosforilação c-Met em células NCI-H69 (CI50: 13 nM) e HOP92 (CI50: 16 nM) que expressavam as variantes de justamembrana de c-Met endógenas R988C e T1010I, respectivamente (Quadro 1) . Ao contrário, foi observada uma mudança significativa na potência (10 vezes) frente aos mutantes de laço de activação (Y1230C, 127 nM e Y1235D, 92 nM) em comparação 39 com o receptor de tipo selvagem (Quadro 1). 40
Quadro 1
Ensaio CI50 nM Relação de Selectividaded Actividade Bioquímica in Vitro enzima c-Met/HGFR (Ki, nM)a 4 NA Actividade Celular In Vitro Fosforilação de c-Met em linhas celulares de tumor humanas (CIsó) b,c 11 NA Fosforilação de c-Met em células epiteliais IMCD3 de ratinhos (C150) b 5 NA Fosforilação de c-Met WT em células NIH3T3 (CI50)b 13 NA Fosforilação de c-Met mutante V1092I em células NIH3T3 (CI50)b 19 NA Fosforilação de c-Met mutante H1094R em células NIH3T3 (CI50)b 2 0, IX Fosforilação de c-Met mutante Y1235D em células T47D (CI50)b 92 8X Fosforilação de c-Met mutante M1250T em células NIH3T3 (ci50)b 15 NA Fosforilação de c-Met em células NCI-H69 que expressam c-Met variante R988C (CI50)b 13 NA Fosforilação de c-Met em células HOP92 que expressam c-Met variante ΊΊ0101 (CI50)b 16 NA 41 (cont)
Ensaio CI50 nM Relação de Selectividaded Fosforilação de NPM-ALK em células de linfoma Karpas299 humanas (CI50)b 24 2X Actividade Celular contra Quinases Não Alvo In Vitro Fosforilação de RON estimulada por MSP em células NIH-3T3-RON (CIsó média)b 189 17X Fosforilação de RON em células RON-GYRB (CI50 média)b 298 27X Fosforilação de Axl estimulada por Gas6 em células NIH-3T3-Axl (C15o média) b 322 29X Fosforilação de Tie-2 estimulada por ligando em células NIH-3T3-Tie-2/EGFR (CI50 média) b 448 41X Fosforilação de TrkA estimulada por NGF em células Trk A-PAE (C15o média) b 580 53X Fosforilação de TrkB estimulada por BDNF em células Trk B-PAE (C15o média)b 399 36X Fosforilação de BCR-Abl em células BCR-AbI-BaF3 (CI50 média)b 1159 >100X 42 (cont)
Ensaio CI50 nM Relação de Selectividaded Fosforilação do receptor de insulina estimulada por insulina em células 293-IRK (C15o média)b 2887 >250X Fosforilação de Zap70 dependente de Lck estimulada por CD3 em células Jurkat (CI50 média)b 2741 >250X Fosforilação de Sky estimulada por Gas6 em células NIH-3T3-Sky (C150 média) b >10000 -1000X Definições a Ki para inibição da enzima c-Met/HGFR determinada por monitorização da oxidação de NADH acoplada a renovação de ATP. b os valores de CI50 foram determinados depois da exposição de diversas linhas celulares a várias concentrações de PF-02341066 durante 1 hora e medindo a fosforilação em lisados de proteína celular mediante ELISA. Os valores de CI50 foram gerados mediante ajuste de curvas utilizando uma análise de quatro parâmetros. c valor de CI50 médio derivado do valor de CI50 meio para a fosforilação de c-Met/HGFR ao longo de um grupo de 7 linhas celulares de tumor humanas (isto é, A549, MDA-MB-231, GTL-16, HT29, 786-0, Colo-205, A498). d a CI50 de c-Met de células c média foi utilizado para calcular a relação de selectividade com respeito aos ensaios celulares. 0 índice de selectividade foi calculado como CI50, (c-Met) /CI50, (alvo) . WT = Tipo selvagem
Efeito do Composto 1 em Fenótipos Oncoqénicos Dependentes de c-Met/HGFR ou NPM- ALK em células (não forma parte da invenção)
Ensaios Fenotípicos c-Met/HGFR foi implicada na desregulação do crescimento, migração e invasão celular de uma variedade de células de tumor e células endoteliais de tumor enquanto que NPM-ALK está implicado na desregulação da proliferação celular e apoptose em células de linfoma alcl. Numa série 43 de ensaios funcionais baseados em células, o composto 1 inibiu de forma potente o crescimento de células de carcinoma gástrico GTL-16 humanas, induziu a apoptose das células GTL-16, inibiu a migração e invasão de células de carcinoma de pulmão NC1-H441 humano estimulada por HGF através de uma matriz de matrigel e inibiu a mobilidade/dispersão celular de MDCK estimulada por HGF. (Quadro 2) 0 composto 1 também inibiu a proliferação de células Karpas 299 ou SU-DHL-1 ALCL que expressam uma proteína de fusão NPM-ALK devido a uma translocação cromossómica t2;5. A inibição do crescimento pelo composto 1 nestas células de linfoma positivas para NPM-ALK foi associada com uma detenção do ciclo celular em G0/Gi e indução da apoptose. Para investigar também a actividade anti-angiogénica potencial, o composto 1 inibiu a sobrevivência e invasão de matrigel de células endoteliais HUVEC mediada por HGF assim como a tubulogénese de células endoteliais HMVEC em geles de fibrina. Estes dados demonstram a capacidade do composto 1 para inibir funções dependentes tanto de c-Met/HGFR como de NPM-ALK em células que expressam c-Met/HGFR ou NPM-ALK activadas, respectivamente. Ademais, estes dados sugerem que a eficácia antitumoral do composto 1 pode ser mediada por efeitos directos no crescimento ou sobrevivência celular de tumor, assim como em mecanismos anti-angiogénicos. 44
Quadro 2
Ensaio Concentraçãc nM 5 de PF-02314066 ng/ml Fenótipos de Células De tumor Proliferação (ensaio de MTT) de células de carcinoma gástrico GTL-16 (CI50 média) 9,7 4,4 Apoptose (ensaio de ADNmc) de células de carcinoma gástrico GTL-16 (CI50 média) 8,4 3,8 Migração de câmara de Boyden de células NSCLC NCI-H441 estimulada por HGF (CI50 média) 11 5 Invasão de Matrigel de células NSCLC NCI-H441 estimulada por HGF (CI50 média) 6,1 2,7 Dispersão de colónias celulares MDCK estimulada por HGF (CI50 média) 16 7 Sobrevivência de células endoteliais HUVEC estimulada por HGF (ensaio de MTT) (CI50 média) 11 5 Invasão de Matrigel de células HUVEC estimulada por HGF (C150 média) 35 16 Tubulogénese de células endoteliais HMVEC em geles de fibrina (CI50 estimada) 80 36 Definições: NSCLC= cancro de pulmão de células não pequenas; MDCK= rim canino Madin-Darby; ALCL= linfoma de células grandes anaplásico; HUVEC= células endoteliais da veia umbilical humana; HMVEC= células endoteliais microvasculares humanas 45
Estudos In Vivo Dados e Resultados
Inibição do alvo quinase in vivo e inibição do crescimento de tumor (não forma parte da invenção)
Selecção do Modelo De tumor
Foram utilizados modelos de xenotransplante de tumor dependente de c-Met/HGFR para avaliar a relação da inibição de alvo c-Met/HGFR, inibição do crescimento de tumor e exposição a plasma do composto 1 in vivo. Devido à falta de activação parácrina de c-Met/HGFR humano expressada por xenotransplantes de tumor por HGF de ratinho expressada por células mesenquimais de ratinho, os modelos de xenotransplante humano que mostravam actividade de c-Met/HGFR constitutiva foram utilizados como segue: 1) o modelo de carcinoma gástrico humano GTL-16 ou de carcinoma renal Caki-1 que expressa níveis elevados de c-Met/HGFR constitutivamente activo, 2) o modelo de glioblastoma humano U87MG ou de carcinoma de próstata humana PC-3 que expressa HGF e c-Met/HGFR que compreende um laço autócrino ou 3) co-implantação de células de tumor humanas (por exemplo, NSCLC NCI-H441) com fibroblastos MRC5 humanos para proporcionar uma fonte de HGF humano bioactivo desde o compartimento do estroma de tumor para restabelecer a activação parácrina específica de espécie de c-Met/HGFR. Relação de inibição de c-Met/HGFR com a Eficácia Antitumoral Depois de Administração Oral em Tumores GTL-16
Foi administrado a ratinhos atímicos que portavam tumores GTL-16 estabelecidos (250 mm3) o composto 1 por via oral na dose indicada ou somente veículo durante 11 dias. Para os estudos que investigam a inibição da fosforilação de c-Met/HGFR em GTL-16 (Figura 2A), os ratinhos foram sacrificados de forma humanitária ao final do estudo nos pontos de tempo designados depois da administração, foram ressecados e os tumores foram congelados e a fosforilação foi quantificada nos grupos com veículo e tratados mediante 46 ELISA. A inibição da fosforilação do alvo quinase mediante composto 1 em tumores foi calculada como: % de inibição = 100-[(DO média tratados/DO média não tratados)] X 100. Para estudos que investigam a inibição de crescimento de tumores GTL-16 (Figura 2B), o volume de tumor foi medido mediante calibradores nos dias indicados com a mediana do volume de tumor ± epm indicada para grupos de 15 ratinhos. Os valores percentuais (%) mostrados são a % de inibição de crescimento de tumor medido no dia 20 para ratinhos tratados com o fármaco em comparação com os tratados com veiculo e é calculado como: 100*{1-[ (tratado dia 20 -tratado dia 10) / (Controlo dia 20 - controlo dia 10)]}. Um * indica que a mediana dos volumes de tumor é significativamente menor no grupo tratado versus o controlo (P < 0,001) conforme foi determinado utilizando uma análise da variância de uma via (veja-se a Figura 2B).
Para avaliar a resposta PD de c-Met/HGFR ao composto 1, os tumores GTL-16 foram colhidos em vários pontos de tempo depois da administração oral do composto 1 em estudos de dose única e dose repetida (estado estacionário). O estado da fosforilação de c-Met/HGFR em tumores foi quantificado por meio de ELISA numa série de dose. Focando nos estudos de PD de estado estacionário (11 dias) para estabelecer uma correlação com a inibição do crescimento de tumor, o composto 1 demonstrou o seguinte como se mostra nas Figuras 2A e 2B: A 50 mg/kg/dia: uma inibição do crescimento de tumor de 100% relacionada com uma inibição completa da fosforilação de c-Met/HGFR em tumores GTL-16 mantida durante 24 horas (25 mg/kg - inibição quase completa da fosforilação e o crescimento de tumor). A 12,5 mg/kg/dia: inibição do crescimento de tumor do 60% relacionada com uma inibição do 80-90% da fosforilação de c-Met/HGFR a 1-8 horas que diminuiu 50-60% a inibição a as 16-24 horas. 47
A 6,25 mg/kg/dia: tendência não significativa à inibição do crescimento de tumor relacionada com uma inibição de 30-50% da fosforilação de c-Met/HGFR a 1-8 horas com um restabelecimento completo às 16 horas. Tumores U87MG
Aos ratinhos atimicos que portavam tumores U87MG estabelecidos (150 mm3) foi administrado o composto 1 por via oral na dose indicada ou somente veiculo durante 9 dias. Para os estudos que investigam a inibição do crescimento de tumor (Figura 3A), foi medido o volume de tumor mediante calibradores nos dias indicados com a mediana do volume de tumor ± EPM indicada para grupos de 10-12 ratinhos. Os valores percentuais (%) mostrados são a % da inibição do crescimento de tumor medida o dia 14 para ratinhos tratados com fármaco em comparação com tratados com veiculo e são calculados como: 100*{1-[ (tratados dia 14 - tratados dia 6) / (Controlo dia 14 - controlo dia 6)]}.
Um * indica que a mediana dos volumes de tumor é significativamente menor no grupo tratado versus o controlo (P < 0,001) conforme foi determinado utilizando uma análise da variância de uma via (veja-se a Figura 3A). Para estudos que investigam a inibição da fosforilação de c-Met/HGFR (Figura 3B), os ratinhos foram sacrificados de forma humanitária ao final do estudo 4 horas depois da administração do composto 1, foram ressecados e os tumores foram congelados e a fosforilação foi quantificada em grupos com veiculo e tratados mediante ELISA. A inibição da fosforilação da quinase alvo mediante composto 1 em tumores foi calculada como: % de inibição = 100-[(DO média tratados/DO média não tratados)] X 100. Não foi observada inibição farmacologicamente relevante da fosforilação de Tie-2 em xenotransplantes de U87MG a níveis de dose de até 100 mg/kg o que sugere que o composto 1 era selectivo para seus alvos pretendidos em níveis de dose similares. 48
Eficácia Antitumoral de Composto 1 em Modelos de Xenotransplante Humano (não forma parte da invenção) A eficácia antitumoral do composto 1 foi avaliada numa variedade de modelos de xenotransplante de tumores humanos representativos de indícios de cancro nos quais a desregulação de c-Met/HGFR está envolvida incluindo carcinoma gástrico GTL-16, glioblastoma U87MG NC1-H441 e carcinoma de próstata PC-3 (Quadro 4).
Modelo de carcinoma gástrico GTL-16
Utilizando o modelo de carcinoma gástrico GTL-16, o composto 1 demonstrou a capacidade para causar uma regressão notável de tumores estabelecidos grandes (> de 600 mm3) (Figura 4) . No presente estudo, as cortes de tratamento com composto 1 a 50 e 75 mg/kg/dia mostraram uma regressão de tumor média equivalente durante o programa de administração de 43 dias, o que proporcionou provas adicionais de que 50 mg/kg/dia representa o nível de dose eficaz máximo. Como se ilustra na Figura 4, a média da regressão de tumor a 50 ou 75 mg/kg/dia foi de 60% depois de 43 dias de administração do composto 1. No presente estudo, cada tumor diminuiu em massa durante o ciclo de 43 dias de administração de composto 1 a cada nível de dose, mostrando 9 dos 4 ratinhos uma diminuição > que 30% em massa de tumor (resposta parcial) e mostrando um animal uma resposta completa sem evidência do tumor inclusive depois do término do tratamento durante 10 dias.
Regressão de xenotransplantes de tumor GTL-16 grandes estabelecidos em ratinhos atímicos (Figura 4A) e peso corporal dos ratinhos (Figura 4B) depois da administração oral diária do composto 1. Foi administrado a ratinhos atímicos que portavam tumores GTL-16 estabelecidos (620 mm3) composto 1 por via oral aos níveis de dose indicados ou somente veículo durante 43 dias. Para investigar a eficácia antitumoral (Figura 4A), foi medido o volume de 49 tumor mediante calibradores nos dias indicados com a mediana do volume de tumor ± EPM indicada para grupos de 6-8 ratinhos. (Figura 4B) o peso médio dos ratinhos nos grupos de tratamento como composto 1 e controlo com veiculo são ilustrados no painel do lado direito.
Xenotransplantes de tumor de Modelo de NSCLC NCi-H441/Caki-l/PC-3
Foi administrado a ratinhos atimicos que portam xenotransplantes de tumor estabelecidos NCI-H441 (100 mm3) (Figura 5A), Caki-1 (Quadros 3A, 3B) ou PC-3 (Figura 5B) composto 1 por via oral à dose indicada ou somente veículos durante 38, 40 ou 20 dias, respectivamente. O volume de tumor foi medido mediante calibradores nos dias indicados com a mediana do volume de tumor + EPM. Um * indica que a mediana dos volumes de tumor é significativamente menor no grupo tratado versus o grupo controlo (P < 0,001) conforme foi determinado utilizando uma análise de variância de uma via (veja-se a Figura 5).
No modelo de NSCLC NCI-H441, uma regressão média do 43% de tumores estabelecidos foi observada a 50 mg/kg/dia depois de 38 dias de administração de composto 1 (Figura 5) . Neste estudo, cada tumor diminuiu em massa durante o ciclo de administração do composto 1 de 33 dias a 50 mg/kg/dia, exibindo 3 dos 11 ratinhos uma diminuição do > que 30% em massa de tumor (resposta parcial) e mostrando 3 animais uma resposta completa sem evidência do tumor (Figura 5). A eficácia antitumoral do composto 1 foi dependente de dose sendo observada a regressão de tumores estabelecidos em NCI-H441 a 50 mg/kg/dia e a inibição parcial do crescimento de tumor (inibição de crescimento de tumor do 57%) observada a 15 mg/kg/dia (Figura 5). A eficácia antitumoral do composto 1 observada no modelo de NCI-H441 era coerente com a inibição da fosforilação de c-Met/HGFR em tumores dos grupos de tratamento com composto 50 em comparação com os controlos tratados com veículo. No modelo do carcinoma renal Caki-1, foi observada uma diminuição de 53% no volume de tumor médio a 50 mg/kg/dia durante o ciclo de administração de 33 dias do composto 1 (Figura 5B) . No estudo de Caki-1, cada tumor diminuiu em volume em pelo menos 30% durante o ciclo de administração do composto 1 de 33 dias (Quadro 3B, Quadro 4) . Também foi investigada a eficácia antitumoral do composto 1 no modelo de xenotransplante de carcinoma de próstata PC-3 e foi observada a inibição quase completa do crescimento de tumor (inibição de crescimento de 84%) neste modelo.
Quadro 3A
Volume de tumor (mm3) Sujeitos Controlo Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Media EPM n 1 63 63 63 108 126 126 126 144 196 196 121 15,7 10 4 108 63 144 256 405 320 405 320 550 446 301,6 50,1 10 8 108 144 196 256 936 405 726 446 1268 700 518,4 120,7 10 12 126 365 196 256 1688 726 936 1008 1434 748,5 187, 9 9 15 196 550 352 365 1008 1372 640,4 185,8 6 18 172 864 256 486 444,4 154, 9 4 22 288 936 288 726 559,5 162,5 4 26 288 1268 365 650 642,5 222,4 4 29 221 405 1008 544,5 237,8 3 33 320 550 435 115 2 36 405 550 477,5 72,5 2 40 486 600 543 57 2 43 726 864 795 69 2 47 787 936 861,3 74,8 2 50 787 1108 897, 3 110,8 2 54 787 786,5 1 51
QUADRO 3B
Volume de tumor (mm3) Su; eitos Experimentais (Composto 1, 50 mg/kg) Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Média EPM n 1 63 63 63 108 108 126 126 172 172 196 119,5 15,4 10 4 32 63 63 108 108 196 126 126 172 196 118, 9 17, 9 10 8 18 40 14 40 32 75 40 63 63 75 45, 9 7 10 12 14 32 14 32 32 63 40 40 40 63 36,8 5,3 10 15 4 14 14 32 32 40 32 40 40 40 28,7 4,2 10 19 14 18 14 32 32 40 18 32 63 63 32,4 5,8 10 22 14 14 14 14 32 63 14 32 108 108 41 12,2 10 26 14 14 14 18 32 40 32 63 75 75 37,5 7,9 10 29 14 32 18 32 63 40 40 108 108 108 56,2 12 10 33 14 32 18 32 63 40 40 108 108 108 56,2 12 10 36 32 40 32 63 75 75 63 75 126 126 70,6 10,7 10 40 32 63 32 63 75 75 63 75 172 172 82 15,7 10 43 32 32 14 63 63 63 32 63 256 63 67,8 21,7 10 47 32 40 32 63 75 108 63 75 196 108 79,1 15, 6 10 50 32 63 40 63 108 108 63 108 196 172 95,1 17,2 10 54 63 63 40 14 108 75 40 75 172 172 82 16, 9 10
Relação da eficácia antitumoral com a inibição de c-Met/HGFR (não forma parte da invenção)
Foram realizadas uma série de estudos de eficácia antitumoral de resposta a dose e farmacodinámicos para demonstrar a relação entre a inibição do alvo c-Met/HGFR e a eficácia antitumoral. Para avaliar a inibição farmacodinâmica de c-Met/HGFR pelo composto 1, foram colhidos tumores de carcinoma gástrico GTL-16 a vários pontos de tempo depois da administração oral do composto 1. 0 estado de fosforilação de c-Met/HGFR foi quantificado por meio de ELISA numa série de dose. Nestes estudos, o composto 1 demonstrou uma relação forte de inibição dependente de dose e de tempo de c-Met/HGFR com a inibição 52 do crescimento de tumor. Quando se define a relação da PD alvo com a eficácia no modelo de GTL-16 as seguintes conclusões foram aparentes 1) a inibição completa de actividade c-Met/HGFR durante 24 horas é coerente com uma inibição completa do crescimento de tumor (50 mg/kg, 100% de TGI), 2) a inibição potente da actividade de c-Met/HGFR para somente uma porção do programação é coerente com uma eficácia subóptima (12,5 mg/kg, 60% de TGI), 3) a incapacidade para alcançar uma inibição > de 50% da actividade de c-Met/HGFR (3,125, 6,25 mg/kg) é coerente com uma falta de inibição do crescimento de tumor significativa (TGI) (Figuras 2A e 2B) . Um estudo de GTL-16 adicional demonstrou que as cortes de tratamento com composto 1 de 50 e 75 mg/kg/dia mostraram uma regressão de tumor média equivalente o que proporcionou provas adicionais de que 50 mg/kg/dia representa o nivel de dose de eficácia máxima (Figura 4 e Quadro 4) . Estas descobertas sugerem que a duração da inibição de c-Met/HGFR está directamente relacionada com a eficácia antitumoral do composto 1.
Ademais, foi observado um efeito dependente de dose-dose similar do composto 1 em crescimento de tumor e fosforilação de c-Met/HGFR utilizando todos os modelos de tumor (GTL-16, U87MG e NC1-H441) e os programas de dosagem, o que apoia adicionalmente estas observações (Quadro 4). Em cada um destes estudos o nivel de dose de 50 mg/kg/dia resultou numa inibição do crescimento de tumor completa ou uma regressão de tumor (Quadro 4) . Ademais, foi observada uma relação dependente de dose entre a inibição da fosforilação de c-Met/HGFR e a eficácia antitumoral de cada modelo, o que apoia adicionalmente o conceito de maximizar o alcance e duração da inibição de c-Met/HGFR para conseguir uma eficácia completa. Colectivamente, estes estudos sugerem que uma inibição quase completa da fosforilação de c-Met/HGFR durante a duração do programa de administração é necessária para maximizar o beneficio 53 terapêutico e o alcance e duração da inibição da actividade c-Met/HGFR foi relacionado directamente com o nivel de eficácia antitumoral. Estes dados apoiam a existência de uma ligação entre a inibição do alvo farmacológico pretendido do composto 1, c-Met/HGFR e o grau de eficácia antitumoral.
Eficácia Antitumoral de Composto 1 num Modelo de Linfoma dependente de NPM-ALK Modelo de ALCL Karpas 299
Foi administrado a ratinhos SClD-beige que portavam tumores Karpas 299 estabelecidos (220 mm3) composto 1 por via oral na dose indicada ou somente veículo para os períodos de tempo designados. Para estudos que investigavam a inibição do crescimento de tumor (Figura 6A), foi medido o volume de tumor mediante calibradores nos dias indicados com a mediana do volume de tumor ± ETM indicada para os grupos 8-12 ratinhos. Os valores percentuais (%) mostrados são a % da inibição do crescimento de tumor medida o dia 23 para ratinhos tratados com fármaco em comparação com tratados com veículo e são calculados como: 100 * {1- [ (tratado dia 23 - tratado dia 12) / (controlo dia 23 -controlo dia 12)]}. Um * indica que a média dos volumes de tumor é significativamente menor no grupo tratado versus o controlo (P < 0,001) conforme foi determinado utilizando uma análise de variância de uma via. Para estudos que investigavam a inibição da fosforilação de NPM-ALK (Figura 6B) , os ratinhos foram sacrificados de forma humanitária ao final do estudo 4 horas depois da administração do composto foram ressecados e os tumores foram congelados e a fosforilação de ALK em tumores com veículo e tratados foi quantificada por meio de ELISA. A inibição da fosforilação da quinase alvo mediante o composto 1 em tumores foi calculada como: % de inibição = 100 - [(DO média tratados/DO média não tratados)] X 100.
Utilizando o modelo de alcl Karpas 299, o composto 1 54 demonstrou a capacidade para provocar uma regressão notável de tumores estabelecidos (> 200 mm3) (Figura 6A) . Neste estudo, a administração do composto 1 a 100 mg/kg/dia resultou numa regressão completa de tumores de todos os ratinhos nesta corte de dosagem aos 15 dias do inicio da administração do composto (Figura 6A) . Depois de 17 dias, foi interrompido o tratamento com composto 1 o que resultou num novo crescimento do tumor. Quando os tumores cresceram até um tamanho maior (> 600 mm3), o tratamento com composto 1 foi reiniciado durante 13 dias adicionais e foi demonstrado a regressão completa dos tumores uma vez mais (Figura 6A, Quadro 4). O efeito citorredutor do composto 1 é coerente com a observação de seus efeitos anti-proliferativos e apoptóticos contra células ALCL in vitro. A relação de inibição de fosforilação de NPM-ALK de tumor e a eficácia antitumoral também foi determinada a múltiplos niveis de dose e pontos de tempo. De forma similar as observações em modelos de tumor dependentes de c-MettHGFR, uma inibição quase completa (> do 90%) de inibição de actividade de NPM-ALK para o intervalo de dosagem completo (24 horas) é coerente com uma eficácia antitumoral máxima (regressão completa) a 100 mg/kg (Figura 6A e 6B) . A inibição completa da fosforilação de NPM-ALK (inibição < que 90% a 25 ou 50 mg/kg) é coerente com uma eficácia antitumoral submáxima (Figura 6A e 6B) . De forma similar a estudos em modelos de tumor dependentes de c-Met/HGFR, estes dados apoiam a união entre a inibição de outro alvo farmacológico pretendido do composto 1, NPM-ALK e o grau de eficácia antitumoral num modelo de tumor dependente de NPM-ALK. 55 QUADRO 4
Modelo (Tipo de tumor) Volume de Tumor Inicial (mm3) Dose e Programa (mg/kg) Efeito Global Valor P % de inibição do crescimento (Dia)1 Regressão2 PR CR Vs GTL-16 (Carcinoma Gástrico) 230 50, por dia 100% (dll) Não 2/15 Não <0,0001 230 25, por dia 89% (dll) Não Não Não <0,0001 230 12,5 por dia 60% (dll) Não Não Não 0,0013 230 6,25, por dia 34%(dll) Não Não Não 0,074 230 3,125, por dia 29%(dll) Não Não Não 0,144 230 25, 2 vezes ao dia 95%(dll) Não Não Não <0,0001 230 12,5, 2 vezes ao dia 84%(dll) Não Não Não <0,0001 230 6,25, 2 vezes ao dia 63%(dll) Não Não Não <0,0001 GTL-16 (Carcinoma Gástrico) 620 75, por dia Regressão 60% (d43) 6/8 Não <0,0001 620 50, por dia Regressão 60% (d43) 3/6 1/6 <0,0001 U87 MG (Glioblastoma) 170 50, por dia 97% (d9) Não 1/12 Não <0,0001 170 25, por dia 83% (d9) Não 1/12 Não <0,0001 170 12,5, por dia 71% (d9) Não Não Não <0,0001 170 6,25, por dia 50% (d9) Não Não Não 0,0003 170 3,125, por dia 34% (d9) Não Não Não 0,0454 H441 (NSCLC) 100 50, por dia Regressão 48% (d38) 3/11 3/11 <0,0001 100 15, por dia 59% (d9) Não Não 2/12 0,0013 56 (cont)
Modelo (Tipo de tumor) Volume de Tumor Inicial (mm3) Dose e Programa (mg/kg) Efeito Global Valor P % de inibição do crescimento (Dia)1 Regressão2 PR CR Vs PC-3 (Carcinoma de Próstata) 290 50, por dia 84% (d20) Não Não Não 0, 001 Caki-1 (Carcinoma Renal) 100 50, por dia Regressão 53% 7/1 0 3/10 0, 001 Karpas 299 (linfoma ALK) 220 100, por dia Regressão 100% (dl 6) Não 12/12 <0,0001 220 50, por dia 96% (dll) Nao Não Não <0,0001 220 25, por dia 57% (dll) Não Não Não <0,0001 540 100, por dia Regressão 90% (dl3) 3/3 Não <0,0001 Síntese do Composto 1 PLE é uma enzima produzida por Roche e vendida através de Biocatalytics Inc. como uma preparação de esterase em bruto de fígado de porco, conhecida comummente como PLE-AS (obtida de Biocatalytics como ICR-123, vendida como suspensão de sulfato de amónio). A enzima é classificada no registro CAS como uma "hidrolase de éster carboxílico, CAS N° 9016-18-6". O número de classificação enzimático correspondente é EC 3.1.1.1. Se sabe que a enzima tem uma especificidade de substrato ampla à hidrólise de uma ampla série de ésteres. A actividade lipase é determinada utilizando um método baseado na hidrólise de etil butirato de num titulado de pH. 1 UL (unidade de lipase) é a quantidade de enzima que libera 1 μιηοΐ de ácido butírico titulável por minuto a 22° C, pH 8,2. A preparação apresentada no presente documento (PLE-AS, como uma suspensão) habitualmente se apresenta como um líquido castanho-verde opaco com uma actividade declarada de > 45 57 UL/mg (conteúdo em proteína em torno a 40 mg/ml). (IS)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol
Foi preparado (IS)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etanol, mostrado como composto (S—1) nos seguintes esquemas, por uma combinação de hidrólise enzimática de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)acetato de etilo racémico, esterificação e hidrólise química com inversão de acordo com o Esquema B. O acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo racémico (composto A2) foi preparado de acordo com o Esquema A.
1- (2,6-dicloro-3-fluorofenil)etanol (Al) : borohidreto de sódio (90 mg, 2,4 mmol) foi adicionado a uma solução de 2', 6' -dicloro-3'-fluoro-acetofenona (Aldrich, n° de catálogo 52, 294-5) (207 mg, 1 mmol) em 2 ml de CH3OH anidro. A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante lhe depois foi evaporada, dando um resíduo oleoso incolor. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia flash (eluindo com EtOAc a 0^0% em hexanos), dando o composto Al em forma de um óleo incolor (180 mg; 0,88 mmol; rendimento de 86,5%); EM (IQPA) (M-H)“ 208; RMN ΧΗ (400 MHz, clorofórmio-D) δ ppm 1,64 (d, J = 6,82 Hz, 3 H) 3,02 (d, J = 9,85 Hz, 1 H) 6, 97 - 7, 07 (m, 1 H) 7,19 - 7,33 (m, 1 H) .
Acetato de 1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etilo (A2): Foram adicionados sequencialmente anidrido acético (1,42 ml, 15 mmol) e piridina (1,7 ml, 21 mmol) a uma solução do composto Al (2,2 g, 10,5 mmol) em 20 ml de CH2C12. A mistura 58 de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 12 h e depois foi evaporada, dando um resíduo oleoso de cor amarelada. 0 resíduo foi purificado por meio de cromatografia flash (eluindo com EtOAc a 7^9% em hexanos), dando o composto A2 em forma de um óleo incolor (2,26 g; 9,0 mmol; rendimento de 85,6%); RMN (400 MHz, clorofórmio-D) δ ppm 1,88 (d, J = 6,82 Hz, 3 H) 2,31 (s, 3 H) 6,62 (c, J = 6,82 Hz, 1 H) 7,25 (t, J = 8,46 Hz, 1 H) 7,49 (dd, J = 8,84, 5,05 Hz, 1 H).
Esquema B
A um balão com camisa calefactora de 50 ml equipado com um eléctrodo de pH, um agitador situado na parte superior e uma linha de adição de base (NaOH 1 M) foram adicionados 1,2 ml de tampão fosfato de potássio 100 mM a pH 7,0 e 0,13 ml de suspensão de PLE AS. Depois, foi adicionado gota a gota o composto A2 (0,13 g, 0,5 mmol, 1,00 equiv.) e a mistura resultante foi agitada a 59 temperatura ambiente durante 20 h, mantendo constante o pH da reacção a 7,0 usando NaOH 1 Μ. A conversão e o valor de ee da reacção foi monitorizado por meio de RP-HPLC, e foi interrompida depois de que fosse consumido 50% do material de partida (aproximadamente 17 horas nestas condições). Depois, a mistura foi extraída três vezes com 10 ml de acetato de etilo para recuperar tanto o éster como o álcool em forma de uma mistura de R-l e S-2.
Foi adicionado cloreto de metanosulfonilo (0,06 ml, 0,6 mmol) a uma solução de uma mistura de R-l e S-2 (0,48 mmol) em 4 ml de piridina numa atmosfera de nitrogénio. A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 3 h e depois foi evaporada, obtendo um óleo. À mistura foi adicionado água (20 ml) e depois foi adicionado EtOAc (20 ml x 2) para extrair a solução aquosa. As camadas orgânicas foram combinadas, secas, filtradas e evaporadas, dando uma mistura de R-3 e S-2. Esta mistura foi utilizada na seguinte etapa de reacção sem purificação adicional. RMN ΧΗ (400 MHz, clorofórmio-D) δ ppm 1,66 (d, J = 7,1 Hz, 3 H) 1,84 (d, J = 7,1 Hz, 3 H) 2,09 (s, 3 H) 2,92 (s, 3 H) 6,39 (C, J = 7,0 Hz, 1 H) 6,46 (c, J = 6,8 Hz, 1 H) 6,98 - 7,07 (m, 1 H) 7,07 - 7,17 (m, 1 H) 7,23 - 7, 30 (m, 1 H) 7,34 (dd, J = 8,8, 4,80 Hz, 1 H).
Foi adicionado acetato de potássio (0,027 g, 0,26 mmol) a uma mistura de R-3 e S-2 (0,48 mmol) em 4 ml de DMF numa atmosfera de nitrogénio. A mistura de reacção foi aquecida até 100°C durante 12 h. À mistura de reacção foi adicionado água (20 ml) e foi adicionado EtOAc (20 ml x 2) para extrair a solução aquosa. A fase orgânica combinada foi seca, filtrada e evaporada, dando um óleo de S-2 (72 mg, rendimento de 61% em duas etapas). Quiralidade ee: 97,6%. RMN XH (400 MHz, clorof órmio-D) δ ppm 1,66 (d, J = 7,1 Hz, 3 H) 2,09 (s, 3 H) 6,39 (c, J = 6,8 Hz, 1 H) 7,02 (t, J = 8,5 Hz, 1 H) 7,22 - 7,30 (m, 1 H) . 60
Foi adicionado lentamente metóxido de sódio (19 mmol; 0,5 M em metanol) ao composto S-2 (4,64 g, 18,8 mmol) numa atmosfera de nitrogénio a 0°C. A mistura resultante foi agitada a temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi evaporado e foi adicionado H2O (100 ml) . A mistura de reacção arrefecida foi neutralizada com acetato de sódio-ácido acético e solução tampão a pH 7. Foi adicionado acetato de etilo (100 ml x 2) para extrair a solução aquosa. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas e evaporadas, obtendo S-l em forma de um sólido de cor branca (4,36 g, rendimento de 94,9%); CFS-EM: 97% de ee. RMN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10H (400 MHz, clorofórmio-D) δ ppm 1,65 (d, J = 6,8 Hz, 3 H) 5,58 (c, J = 6,9 Hz, 1 H) 6,96 - 7,10 (m, 1 H) 7,22 - 7,36 (m, 1 H). 5-bromo-3-[1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-piridin-2-ilamina (racemato):
Br
F 1
Foi agitada 2,6-dicloro-3-fluoroacetofenona (15 g, 0,072 mol) em THF (150 ml, 0,5 M) a 0°C utilizando um banho de 2 gelo durante 10 min. Foi adicionado lentamente hidreto de 3 litio e aluminio (2,75 g, 0,072 mol). A reacção foi agitada 4 a temperatura ambiente durante 3 h. A reacção foi 5 arrefecida num banho de gelo e foi adicionado lentamente 6 gota a gota água (3 ml) seguido da adição de NaOH a 15% (3 ml) . A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 7 30 min. Foram adicionados NaOH a 15% (9 ml), MgS04 e a mistura foi filtrada para retirar os sólidos. Os sólidos 8 foram lavados com THF (50 ml) e o filtrado foi concentrado, 9 dando 1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etanol (14,8 g, 10
rendimento de 95%) em forma de um óleo de cor amarela. RMN 61 ΧΗ (400 ΜΗζ, DMSO-de) δ 1,45 (d, 3Η) , 5,42 (m, 2Η) , 7,32 (m, 1Η) , 7, 42 (m, 1Η) . 2. A uma solução agitada de trifenilfosfina (8,2 g, 0,03 mol) e DEAD (13,65 ml de uma solução a 40% em tolueno) em THF (200 ml) a 0°C foi adicionada uma solução de 1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etanol (4,55 g, 0,021 mol) e 3-hidroxi-nitropiridina (3,35 g, 0, 023 mol) em THF (200 ml). A solução de cor laranja brilhante resultante foi agitada numa atmosfera de nitrogénio a temperatura ambiente durante 4 horas, momento em que todos os materiais de partida haviam sido consumidos. O solvente foi retirado e o material bruto foi carregado em seco sobre sílica gel e foi eluido com acetato de etilo-hexanos (20:80), produzindo 3-(2, 6-dicloro-3-fluoro-benziloxi)-2-nitro-piridina (6,21 g, 0,021 mol, 98%) em forma de um sólido de cor rosa. RMN (CDC13, 300 MHz) Ô 1,8-1,85 (d, 3H) , 6,0-6,15 (c, 1H) , 7,0-7,1 (t, 1H), 7,2-7,21 (d, 1H) , 7,25-7,5 (m, 2H) , 8,0-8,05 (d, 1H) . 3. Uma mistura agitada de AcOH (650 ml) e EtOH (500 ml) foi suspensa em 3-(2,6-dicloro-3-fluoro-benziloxi)-2-nitro-piridina (9,43 g, 0, 028 mol) e lascas de ferro (15,7 g, 0,28 mol). A reacção foi aquecida lentamente a refluxo e foi deixada em agitação durante 1 h. A reacção foi arrefecida até temperatura ambiente e depois foram adicionados éter dietilico (500 ml) e água (500 ml) . A solução foi neutralizada cuidadosamente pela adição de carbonato de sódio. Os extractos orgânicos combinados foram lavados com NaHC03 sat. (2 x 100 ml), H20 (2 x 100 ml) e salmoura (1 x 100 ml) depois foram secos (Na2SC>4), filtrados e concentrados até a secura a vácuo, produzindo 3-(2,6-dicloro-3-fluoro-benziloxi)-piridin-2-ilamina (9,04 g, 0, 027 mol, 99%) em forma de um sólido de cor rosa claro. RMN (CDCI3, 300 MHz) ÔD1,8-1,85 (d, 3H) , 4,9-5,2 (s 1, 2H) , 6,7-6,84 (c, 1H) , 7,0-7,1 (m, 1 Η) , 7,2-7,3 (m, 1H) , 7,6-7,7 (m, 1H). 62 4. Uma solução em agitação de 3-(2,6-dicloro-3-fluoro-benziloxi)-piridin-2-ilamina (9,07 g, 0,03 mol) em acetonitrilo foi arrefecida até 0°C usando um banho de gelo. A esta solução foi adicionada em porções N-bromosuccinimida (NBS) (5,33 g, 0,03 mol). A reacção foi agitada a 0°C durante 15 min. A reacção foi concentrada até a secura a vácuo. O óleo escuro resultante foi dissolvido em EtOAc (500 ml) e foi purificado por meio de cromatografia em silica gel. Depois, os solventes foram retirados a vácuo, produzindo 5-bromo-3-(2,6-dicloro-3-fluoro-benziloxi)-piridin-2-ilamina (5,8 g, 0,015 mol, 51%) em forma de um sólido cristalino de cor branca. RMN XH (CDC13, 300 MHz) ÔDl, 85-1, 95 (d, 3H) , 4,7-5,0 (s a, 2H), 5,9-6,01 (c, 1H), 6,8-6,95 (d, 1H) , 7,01-7,2 (t, 1H) , 7,4-7,45 (m, 1 H), 7,8-7,85 (d, 1H). 5-bromo-3-[1(R)-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-piridin-2-ilamina:
Br
O isómero R enantioméricamente puro foi preparado como foi descrito anteriormente para 0 racemato, mas usando os materiais de partida enantioméricamente puros descritos anteriormente. RMN XH (400 MHz, DMSO-de) δ 1,74 (d, 3H), 6,40 (m, 1H), 6,52 (s 1, 2H) , 7,30 (m, 1H) , 7,48 (m, 1H), 7,5 6 (s, 1 H) ; EM 121/z 382 (M+l) . Éster terc-butílico do ácido 4-metanosulfoniloxi-piperidin-1-carboxílico (2) 63 loc
CH2CH2 OH
MsCI, NEt3 DMAP
Boc N.
OMs 2 A uma solução agitada de éster terc-butílico do ácido 4-hidroxi-piperidin-l-carboxilico (7,94 g, 39,45 mmol) em CH2CI2 (100 ml), arrefecida a 0°C, foi adicionado lentamente NEt3 (5,54 ml, 39,45 mmol) seguido de cloreto de metanosulfonilo (3,06 ml, 39,45 mmol) e DMAP (48 mg, 0,39 mmol). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. À mistura foi adicionado água (30 ml). A extracção com CH2CI2 (3 x 30 ml) seguida de secagem (Na2S04) e retirada do solvente a vácuo, proporcionou éster terc-butilico do ácido 4-metanosulfoniloxi-piperidin-l-carboxílico em forma de um sólido de cor branca (11,00 g, rendimento >99%). RMN ^ (CDC13, 400 MHz) δ 4,89 (m, 1H), 3,69 (m, 2H), 3,31 (m, 2H), 3,04 (s, 3H), 1,95 (m, 2H), 1,83 (m, 2H), 1,46 (s, 9H) . 4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il) -1H-pirazol-l-il]piperidin-l-carboxilato de terc-butilo
3 4 4-(4-iodo-lH-pirazol-l-il)piperidin-l-carboxilato de terc-butilo (3) 64
Foi adicionado em porções NaH (1,2 equiv., 0,68 mmol) a uma solução agitada de 4-iodopirazol (0,57 mmol) em DMF (2 1) a 4°C. A mistura resultante foi agitada durante 1 hora a 4°C e depois foi adicionado éster terc-butílico do ácido 4-metanosulfoniloxi-piperidin-l-carboxilico, composto 2 (1,1 equiv., 0,63 mmol). A mistura resultante foi aquecida até 100°C durante 12 h. A reacção foi extinguida com H20 e foi extraída várias vezes com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram secas, filtradas e concentradas, proporcionando um óleo de cor laranja. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica gel (eluindo com EtOAc a 5% em pentano), dando o composto 3 em forma de um sólido de cor branca (140 g, 66%) . 4-[4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il) -1H-pirazol-l-il]piperidin-l-carboxilato de terc-butilo (4)
Foram adicionados sequencialmente bis(pinacolato)diboro (1,4 equiv., 134 g, 0,52 mol) e acetato de potássio (4 equiv., 145 g, 1,48 mol) a uma solução do composto 3 (140 g, 0,37 mol) em 1,5 1 de DMSO. A mistura foi purgada várias vezes com nitrogénio e depois foi adicionado diclorobis(trifenilfosfino)paládio (II) (0,05 equiv., 12,9 g, 0,018 mol). A mistura resultante foi aquecida a 80°C durante 2 h. A mistura de reacção foi arrefecida até temperatura ambiente, foi filtrada através de um leito de celite e foi lavada com EtOAc. O filtrado foi lavado com NaCl saturado (500 ml x 2), seco sobre Na2S04, filtrado e concentrado. O resíduo foi purificado por meio de cromatografia em sílica gel (eluindo com EtOAc a 5% em hexanos), dando o composto 4 em forma de um sólido de cor branca (55 g, 40%). 3-[(R)-1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxil]-5-(1-piperidin-4-il-lfl-pirazol-4-il)-piridin-2-ilamina (1) 65
A uma solução agitada de 3-[(R)-1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-5-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2] dioxaborolan-2-il)-piridin-2-ilamina (15,22 g, 35,64 mmol) e éster terc-butílico do ácido 4-(4-bromo-pirazol-l-il)-piperidin-l-carboxílico (14,12 g, 42,77 mmol) em DME (143 ml) foi adicionado uma solução de Na2C03 (11, 33 g, 10692 mmol) em água (36 ml). A solução foi desgaseifiçada e foi carregada três vezes com nitrogénio. À solução foi adicionado Pd(PPh3)2Cl2 (1,25 mg, 1, 782 mmol). A solução de reacção foi desgaseif içada e foi carregada de novo três vezes com nitrogénio. A solução de reacção foi agitada num banho de óleo a 87°C durante aproximadamente 16 horas (ou até que foi consumido o pinacol éster de borano), foi arrefecida até temperatura ambiente e foi diluida com EtOAc (600 ml) . A mistura de reacção foi filtrada através de uma capa de celite e foi lavada com EtOAc. A solução de EtOAc foi lavada com salmoura, seca sobre Na2S04 e concentrada. O produto bruto foi purificado sobre uma coluna de silica gel eluindo com um sistema de EtOAc/Hexano (Coluna Biotage 90+: equilíbrio 600 ml de Hexanos a 100%, segmento 1: 2250 ml de EtOAc a 50%/Hexanos Linear, segmento 2: 4500 ml de EtOAc a 75%/Hexanos Linear, segmento 3: 4500 ml de EtOAc a 100%), proporcionando éster terc-butílico do ácido 4-(4 — {6-amino-5 - [ (J?) -1- (2, 6-dicloro-3-fluoro-fenil) -etoxi] -piridin-3-il}-pirazol-l-il)-piperidin-l-carboxílico (11,8 g, rendimento de 60%, pureza de -95%) com um FR de 0,15 (EtOAc a 50%/Hexanos). EM m/e 550 (M+l)+. 66 A uma solução de éster terc-butílico do ácido 4-(4-(6-amino-5-[(R)-1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-piridin-3-il}-pirazol-l-il)-piperidin-l-carboxílico (11,8 g, 21,45 mmol) em CH2C12 (59 ml, 0,2 M) foi adicionado HC1 4 N/Dioxano (21 ml) . A solução foi agitada durante a noite, formando um sólido. O sólido foi esmagado minuciosamente com uma barra de vidro e foi sonicado para libertar o material de partida preso no sólido. Foi adicionado mais quantidade de HC1 4 N/Dioxano (21 ml) e foi agitado durante mais 2 horas a temperatura ambiente, momento em que a análise por CLEM não mostrou material de partida. A suspensão foi filtrada num funil Buchner revestido com papel de filtro. O licor mãe foi guardado porque continha <5% de produto. O sólido foi transferido a um copo de 500 ml e foi adicionado HPLC água até que o sólido foi dissolvido completamente. O pH foi ajustado a 10 com a adição de Na2C03 sólido. A solução de água foi extraída com CH2C12 (5 x 200 ml) ou até que a análise por CLEM não mostrou produto na fase aquosa. A solução de CH2C12 foi seca sobre Na2S04 e concentrada. O produto bruto, redissolvido em CH2C12 (10 ml) e MeOH (1 ml), foi purificado sobre uma coluna de sílica gel eluindo com um sistema de CH2Cl2/MeOH/NEt3 (Coluna Biotage 40+: equilíbrio 600 ml de CH2C12 a 100% dando o subproduto, segmento 1: 1200 ml de MeOH al 10%/CH2C12 linear, segmento 2: 2400 ml de MeOH a 10%/CH2C12 por etapas, segmento 3: 2400 ml de MeOH a 9%/NEt3 a 1%/CH2C12) . As fracções desejadas foram recolhidas, proporcionando 3-[(R) -1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)- etoxil-5- (l-piperidin-4-il-l/í-pirazol-4-il) -piridin-2-ilamina (7,19 g, rendimento combinado de 75%, sólido de cor branca). EM m/e 450 (M+l) + . RMN ΧΗ (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7,92 (S, 1H), 7 ,76 (s, 1H), 7, 58 (m, 1H) , 7,53 (s, 1H) , 7,45 (m, 1H), 6,90 (s, 1 H) , 6,10 (m, 1 H) , 5,55 (s a, 2H), 4,14 (m, 1H), 3,05 (m, 2H) , 2,58 (m, 2H) , 1,94 (m, 2H) , 1,80 (d, 3H) , 1,76 (m, 2H) . 67 0 produto sólido 3-[ {R)-1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-5-(l-piperidin-4-il-lH-pirazol-4-il)-piridin-2-ilamina foi dissolvido em diclorometano e o solvente foi evaporado lentamente para gerar um sólido cristalino fino. Depois de secar a alto vácuo, foi confirmado que a amostra era uma única forma polimórfica cristalina A com um ponto de fusão de 194°C. 68
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • WO 2006021884 A [0002] • WO 2005002837 W [0002] • US 20060046991 A [0002] • US 11212331 B [0002] • WO 20060128724 A [0002] • WO 05002695 W [0002] • US 20060128724 A [0002] • US 11213039 B [0002] • US 6106864 A [0039] • WO 0035298 A [0039] • WO 9111172 A [0060] • WO 9402518 A [0060] • WO 9855148 A [0060]
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Lisboa, 28/12/2010

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de (R)-3-[1-(2,6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-5-(l-piperidin-4-il-lH-pirazol-4-il)-piridin-2-ilamina, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de crescimento celular anómalo num mamifero, em que 0 crescimento celular anómalo é mediado por quinase de linfoma anaplásico (ALK).
2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o mamífero é um ser humano.
3. A utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o mamifero é um cão.
4. A utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o composto ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado como uma composição farmacêutica que compreende (A)-3-[1-(2, 6-dicloro-3-fluoro-fenil)-etoxi]-5-(l-piperidin-4-il-lH-pirazol-4-il)-piridin-2-ilamina e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 28/12/2010 1/11 ο i(TJ L· T3 03 CD O Q. O O O L·. o LU CM O CD a 03 o > o O Ι α) ,—„ E 2 Z3 <03 L_ 03 5 CL
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25mg 50 mg 10Qmg Dose de composto 1 (m g/kg / dia,4 dias)F1G. 6B
PT06820997T 2005-12-05 2006-11-23 Método para tratar o crescimento celular anómalo PT1959955E (pt)

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