PT1982182E - Estrutura e método inovadores de um dispositivo de vareta de teste para determinação de um analito numa amostra utilizando o referido dispositivo de vareta - Google Patents

Description

Descrição

ESTRUTURA E MÉTODO INOVADORES DE UM DISPOSITIVO DE VARETA DE TESTE PARA DETERMINAÇÃO DE UM ANALITO NUMA AMOSTRA UTILIZANDO O REFERIDO DISPOSITIVO DE VARETA

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a dispositivos de vareta de teste e à sua utilização na análise de um analito numa amostra. A invenção refere-se, particularmente, a uma estrutura de um dispositivo de vareta de teste para a determinação de um analito numa amostra, em que foram tidos em especial atenção a estabilidade de armazenamento e o desempenho desse dispositivo.

ARTE ANTERIOR

[0002] A procura de testes de diagnóstico rápidos e fidedignos para análises clinicas está a aumentar. Actualmente, partes significativas dos testes diagnósticos empregues nas análises clínicos consistem em tiras de teste embebidas em vários compostos, criando assim um papel reactivo indiferenciado. Quando se utilizam estas tiras de teste, a tira de reacção é simplesmente posta em contacto com o material suspeito (e.g. um fluido corporal) criando assim uma alteração de cor ou uma alteração na intensidade de cor que é utilizada para verificar se um efeito em particular é ou não alcançado ou para determinar a quantidade de um analito presente na amostra.

Os métodos laboratoriais clínicos actualmente utilizados para o diagnóstico da condição fisiológica e nutricional, como por exemplo o diagnóstico de mastite, num animal baseiam-se sobretudo na SCO (contagem de células somáticas) 1 de, e.g., leite, e na diferenciação dos agentes patogénicos bacterianos nas amostras de leite.

[0003] Assim, os testes convencionalmente utilizados para a detecção de inflamação causada por mastite num animal têm consistido, até agora, em sistemas de líquidos relativamente complexos em que os tubos de ensaio, dispositivos de medição, luz ultra-violeta, padronização de instrumentos e os factores de correcção dependentes da temperatura fomentam a prevalência de leituras erradas.

[0004] A mastite afecta a integridade da estrutura da glândula mamária e danifica simultaneamente o epitélio secretor e as barreiras entre o leite e o sangue. Consequentemente, muitos componentes do leite são influenciados pela mastite. Os componentes principais, como gorduras, proteínas e lactose são reduzidos e várias enzimas são alteradas.

[0005] Outros factores, para além da determinação pela SCC, que podem ser utilizados como indicadores adequados para a inflamação causada pela mastite num animal podem ser a lactato desidrogenase (LDH) e/ou a N-acetil-glicosaminidase. A N-acetil-L-D-glicosaminidase, também denominada por N-acetil-glicosaminidase (NAGase), tem sido considerada como um dos melhores marcadores para a inflamação mamária. Para além disso, tem sido provado que outras enzimas no leite, como a LDH, podem ter um valor similar a esta enzima, assim como a NAGase pode ser utilizada como um indicador adequado de mastite.

[0006] Na arte anterior, tem sido desenvolvido um grande número de métodos para analisar analitos em amostras de fluidos. Estes métodos podem ser amplamente classificados 2 em dois tipos de sistema, nomeadamente um sistema de reacção, em que a reacção é realizada numa solução (também chamado de análise por via húmida) e um sistema de reacção em que a reacção é realizada num veiculo de fase sólida (também chamado de análise por via seca).

[0007] A reacção analítica baseada em técnicas de via húmida inclui um grande número de procedimentos, que diferem muito de um procedimento analítico do chamado método manual, no qual não é utilizada qualquer máquina, até à utilização de um instrumento analítico automático.

[0008] Contudo, essa análise por via húmida é basicamente realizada na forma de uma solução aquosa e requer alguns passos de manuseamento que envolvem vários problemas. Um problema que pode surgir relaciona-se com a quantidade aumentada de água presente, que pode causar um aumento do consumo de energia. Para além disso, pode ser necessária grande perícia na realização do ensaio para realizar as operações, sendo, portanto, necessárias grandes quantidades de tempo e trabalho, e os licores residuais produzidos podem causar poluição ambiental, requerendo, por conseguinte, mais manuseamento.

[0009] Por outro lado, os métodos analíticos que utilizam ensaios por via seca para as reacções analíticas também têm sido amplamente utilizados, e estes são geralmente praticados na forma de papel de filtro indiferenciado ou outros materiais porosos impregnados com um ou mais reagentes capazes de gerar um sinal detectável.

[0010] A patente US 3.867.259 (por Forgione) revela um dispositivo de teste de diagnóstico (vareta de teste) para determinar a concentração de LDH em soros. O dispositivo 3 compreende um material bíbulo que inclui o resíduo seco resultante da impregnação do material bíbulo com (i) um sal de tetrazólio (ii) um preventor de efeito cromático, (iii) um anti-oxidante, (iv) diaforase e (v) um dinucleótido de nicotinamida e adenina.

[0011] Lippenheide et al. (1995) descrevem a medição de LDH no leite utilizando técnicas de análise por via húmida e seca. Lippenheide et al. concluíram que se pode alcançar uma elevada precisão e exactidão e manuseamento fácil ao empregar uma análise química por via seca comparativamente à análise química por via húmida, contudo, Lippenheide et al. não descrevem uma estrutura específica do dispositivo de vareta. Apesar das recomendações de Lippenheide et al., é verdade que os dispositivos de vareta de teste actualmente disponíveis no mercado e os dispositivos de vareta de teste descritos na arte anterior, como a patente US 3.867.259, como acima mencionado, consistem num material indiferenciado impregnado com um ou mais reagentes. Os dispositivos de vareta de teste que compreendem ambientes indiferenciados comprometem a estabilidade de armazenamento e o desempenho do(s) reagente(s) impregnado(s) já que a estabilidade de armazenamento óptima é raramente alcançada nas mesmas condições ambientais (e.g. pH e/ou teor de sal) como desempenho óptimo da vareta de teste.

Assim, ao empregar dispositivos de vareta de teste indiferenciados, o ambiente do material i.e. banda(s) de reacção, foi criado de forma a que o dispositivo de vareta apresente uma estabilidade de armazenamento aceitável (mas não óptima) e um desempenho aceitável (mas não óptimo).

[0012] A patente US 3.901.657 revela um dispositivo de múltiplas camadas adequado para a determinação colorimétrica da presença de um composto específico numa 4 solução de teste. 0 dispositivo de múltiplas camadas compreende, no minimo, uma camada exterior, uma camada opcional de barreira e uma camada interior adjacente à camada de barreira ou à camada exterior. 0 dispositivo de múltiplas camadas é um ensaio químico utilizado para a determinação de morfina.

[0013] A patente US 4.732.736 revela um elemento analítico de múltiplas camadas para a detecção de peróxido de hidrogénio. 0 elemento analítico de múltiplas camadas compreende um material funcional de peroxidase, um dador de hidrogénio e um acoplador, em que o material funcional de peroxidase e o dador de hidrogénio estão dispostos em camadas diferentes de forma a que estejam separados um do outro, mas que sejam capazes de interagir quando um líquido é aplicado ao elemento analítico. Com a utilização do elemento analítico, o dador de hidrogénio é utilizado pela peroxidase presente no material funcional de peroxidase.

[0014] A patente US 4.959.305 revela um dispositivo de teste de zonas múltiplas para determinação de um analito num meio de teste líquido. 0 teste de zonas múltiplas compreende uma zona de reacção e uma zona de detecção - o teste de zonas múltiplas compreende um anticorpo que se liga ao analito rotulado com um grupo químico detectável.

[0015] A patente US 2004/219694 revela um dispositivo de ensaio de fluxo lateral de enzimas e um kit de testes para a determinação de analitos numa amostra de teste. A invenção relaciona-se ainda com um método de fluxo lateral para a determinação de analitos ao utilizar directamente o analito como substrato enzimático.

[0016] A patente US 2005/260695 revela composições, kits e 5 métodos úteis para a detecção de mastite num animal. Estes agentes e métodos são destinam-se principalmente a um método de detecção da presença de mastite, incluindo mastite sub-clinica, em vacas, que envolve incubar uma amostra de leite da vaca com um agente que se liga à lactoferrina, e.g. um anticorpo monoclonal especifico para a lactoferrina, detectando depois a lactoferrina ligada.

[0017] A patente US 4.438.067 revela uma tira de teste para a determinação colorimétrica por imersão e leitura de substâncias dissolvidas em líquidos. Estas tiras são compostas por uma base de suporte inerte coberta por uma camada de esferas poliméricas nas quais os reagentes são incorporados. A reacção de cor ocorre dentro das próprias esferas, o que melhora a sensibilidade e reprodutibilidade dos testes.

[0018] A patente US 4.454.094 revela um indicador com o qual se pretende detectar pelo menos uma substância de teste num meio de teste, que compreende um transportador e um sistema de reacção que consiste em pelo menos um primeiro e um segundo reagente, aplicados separadamente no transportador, sendo o primeiro reagente destinado a passar por difusão para o segundo reagente através de uma parte do transportador, impregnado pelo meio de teste, enquanto reage à substância de teste. O indicador caracteriza-se pelo facto de o primeiro reagente ser aplicado dentro de pelo menos uma localização limitada, enquanto o segundo reagente é aplicado pelo menos numa localização a uma distância variável da localização do primeiro reagente.

[0019] A patente FR 2.191.734 revela um elemento analítico integral apto para ser usado na análise de líquidos, tendo o elemento pelo menos duas camadas sobrepostas, incluindo 6 uma camada de propagaçao e uma camada de reagente, no contacto dos fluidos.

[0020] A patente US 2003/073073 revela um método e um dispositivo imuno-analitico para a detecção rápida e simultânea de múltiplos microorganismos nos fluidos biológicos de animais produtores de leite que sofrem de mastite. Este método é baseado numa técnica de imunoensaio de fluxo lateral realizada para detectar antigénios específicos para múltiplos agentes infecciosos conhecidos por causarem e/ou serem encontrados em casos de mastite.

[0021] Deste modo, pode ser relevante fornecer um dispositivo de vareta de teste, como um dispositivo de vareta diferenciado, que simultaneamente apresenta estabilidade de armazenamento e desempenho melhorados durante o ensaio, comparativamente aos dispositivos de vareta de teste convencionais produzidos.

Consequentemente, existe uma necessidade de um dispositivo de vareta melhorado, como um dispositivo de vareta diferenciado em que a estabilidade de armazenamento e/ou desempenho do mesmo tenham sido significativamente melhorados, fornecendo assim ambientes de bandas de reacção diferenciados, cada um optimizado para melhorar significativamente a estabilidade de armazenamento e o desempenho do(s) reagente(s) e, consequentemente, o dispositivo de vareta. Esta necessidade foi resolvida pela presente invenção, que é discutida de forma mais completa abaixo.

RESUMO DA PRESENTE INVENÇÃO

[0022] Deste modo, o objectivo da presente invenção é, num primeiro aspecto, fornecer uma estrutura de um dispositivo de vareta de teste para determinação de um analito numa 7 amostra. De preferência, o dispositivo de vareta melhorado refere-se a um dispositivo de vareta de teste diferenciado para a determinação de um analito numa amostra.

[0023] A estrutura do dispositivo de vareta consiste em pelo menos uma banda de reacção que compreende um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir ao analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para o referido analito, de forma a fornecer um sinal detectável quando no estado humedecido. A pelo menos uma banda de reacção fornece um primeiro ambiente para o(s) reagente(s), permitindo assim uma melhor estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta quando num estado não humedecido. Para além disso, o dispositivo de vareta de teste consiste numa banda reguladora, que está em contacto com a pelo menos uma banda de reacção. A banda reguladora cria um segundo ambiente para o(s) reagente(s) quando está num estado humedecido, permitindo assim uma taxa de reacção aumentada entre o analito e os reagentes quando num estado humedecido. Em utilização, a amostra suspeita de conter o analito é aplicada à pelo menos uma banda de reacção do dispositivo de vareta de teste. A amostra migra para a pelo menos uma banda de reacção e solubiliza o(s) reagente (s) e, então, juntamente com o(s) reagente(s), migra da banda de reacção para a banda reguladora que está em contacto com a pelo menos uma banda de reacção. A banda reguladora, quando está num estado humedecido, cria um segundo ambiente que permite o aumento da taxa de reacção entre o analito e os reagentes, permitindo assim ao reagente e ao analito, ao derivado do referido analito ou ao composto detectável do referido analito, fornecer um sinal detectável que é directa ou indirectamente passível de observação através de 8 um instrumento ou aparelho adequado ou por inspecção visual.

[0024] Num aspecto da presente invenção, o dispositivo compreende: (i) um suporte sólido opcional, (ii) pelo menos uma banda de reacção que inclui um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir com o analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça um sinal detectável quando num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) referido(s) reagente (s), o referido primeiro ambiente permitindo uma melhor estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta quando está num estado não humedecido, (iii) uma banda reguladora que está em contacto com a pelo menos uma banda de reacção, criando um segundo ambiente para o (s) referido(s) reagente (s) quando num estado humedecido, o referido segundo ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o(s) reagente (s), e em que a amostra é aplicada a uma superfície do dispositivo de vareta de teste e o sinal detectável é detectado na mesma; em que a determinação do analito é baseada em enzimas; em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima (s); em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que se aproxima do valor de pH óptimo da(s) 9 enzima(s); e em que os diferentes ambientes têm diferentes valores de pH.

[0025] Noutro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para avaliar um analito numa amostra de leite. 0 método compreende os passos de: (i) aplicar a amostra de leite suspeita de conter o analito numa banda de reacção, (ii) permitir que a amostra migre para a banda de reacção que inclui um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir com o analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça um sinal detectável quando estiver num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), o referido primeiro ambiente permitindo uma melhor estabilidade de armazenamento do(s) reagente (s) e do dispositivo de vareta quando num estado não humedecido, (iii) permitir que a amostra, sozinha ou com o reagente, migre da banda de reacção para uma banda reguladora, estando a referida banda reguladora em contacto com a banda de reacção, a banda reguladora criando um segundo ambiente para o referido reagente num estado humedecido, o referido ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o reagente, e (iv) permitir que o reagente e o analito, o derivado do dito analito ou o composto indicador do mesmo forneçam um sinal detectável; em que a determinação do analito é baseada em enzimas; em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um 10 valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima(s); em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que se aproxima do valor de pH óptimo da(s) enzima(s); e em que os diferentes ambientes têm diferentes valores de pH.

[0026] Ainda noutro aspecto da presente invenção é fornecido um método para a preparação do dispositivo de vareta de teste da invenção. O método compreende os passos de: (i) fornecer uma banda de reacção através da impregnação de um primeiro material poroso com uma solução aquosa que inclui um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir ao analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça um sinal detectável quando num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), o referido primeiro ambiente permitindo uma estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta (ii) seguidamente, secar a banda de reacção, (iii) fornecer uma banda reguladora impregnando um segundo material poroso com uma solução aquosa, criando um segundo ambiente para o(s) referido(s) reagente (s) quando num estado húmido, o referido segundo ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o reagente, (iv) seguidamente, secar o segundo material poroso impregnado, e 11 (v) colocar a banda de reacção em contacto com a banda reguladora, opcionalmente num suporte sólido, para obter o dispositivo de vareta, e em que o dispositivo de vareta se baseia numa determinação baseada em enzimas e em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima(s) e em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que se aproxima do pH da(s) enzima(s) e em que os diferentes ambientes têm diferentes valores de PH.

[0027] A presente invenção será, em seguida, descrita em maior detalhe.

DIVULGAÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

[0028] Os inventores da presente invenção descobriram e desenvolveram uma nova estrutura de dispositivo de vareta de teste que obedece aos requisitos de estabilidade de armazenamento e de desempenho nos testes ou ensaios. Este dispositivo de vareta de teste pode ter a estrutura de um dispositivo de vareta diferenciado.

[0029] No presente contexto, o termo "diferenciado" refere-se a um dispositivo de vareta de teste com ambientes diferentes (e.g., diferentes valores de pH) na mesma vareta. Estes ambientes diferentes melhoram a estabilidade de armazenamento dos reagentes impregnados e da vareta e melhoram também a taxa de reacção da vareta no decurso da análise do analito. 0 termo "indiferenciado", pelo contrário, refere-se a um dispositivo de vareta de teste 12 que inclui apenas um ambiente no qual estão armazenados o(s) reagente(s) impregnado(s).

[0030] A estrutura do novo dispositivo de vareta para a determinação de um analito numa amostra compreende: (i) um suporte sólido opcional, (ii) pelo menos uma banda de reacção que inclui um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir com o analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça, num estado humedecido, um sinal detectável, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o (s) referido(s) reagente(s) quando está num estado humedecido, o referido primeiro ambiente permitindo, num estado não húmido, uma capacidade de armazenamento melhorada do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta, e (III) uma banda reguladora que está em contacto com a pelo menos uma banda de reacção, a banda reguladora criando um segundo ambiente para o(s) referido(s) reagente (s) quando num estado humedecido, o referido segundo ambiente permitindo o aumento da taxa de reacção entre o analito e o(s) reagente (s); em que a amostra é aplicada a uma superfície do dispositivo de vareta e o sinal detectável é detectado no mesmo; em que a determinação do analito é baseada em enzimas; em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima(s); em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que se aproxima do valor de pH óptimo da(s) enzima(s) e em que os diferentes ambientes têm valores de pH diferentes.

[0031] Pode ser preferido que o método e o dispositivo da presente invenção para a determinação do analito sejam baseados numa determinação baseada em enzimas. A actividade 13 das enzimas é fortemente afectada por alterações no pH do ambiente envolvente. No que se refere à dependência do pH, é geralmente sabido que cada enzima funciona melhor num determinado pH (o pH óptimo da enzima) e que a sua actividade diminui em valores acima ou abaixo desse valor, mas haverá alguma actividade enzimática nos valores de pH que se desviam deste valor de pH óptimo. Adicionalmente, os especialistas na arte sabem que este pH óptimo difere de uma enzima para outra e que o intervalo entre os diferentes valores de pH óptimos pode ser grande. Por exemplo, o pH óptimo normal para a maioria das enzimas humanas está entre 6 e 8, contudo, a enzima pepsina secretada no estômago, para digestão de proteínas, só está activa num meio ácido e o seu pH óptimo é 2, enquanto que o valor de pH óptimo para a tripsina, uma enzima que divide proteínas secretadas pelo pâncreas, tem um pH óptimo a 8,5. Assim, durante o ensaio poderá ser relevante fornecer um valor de pH que esteja tão próximo quanto possível do pH óptimo da enzima utilizada, para obter uma reacção rápida.

[0032] Na presente invenção, o termo "primeiro ambiente" refere-se a uma condição em torno do reagente ou da combinação de reagentes na banda de reacção, quando num estado não humedecido, na qual a reactividade do reagente ou combinação de reagentes é reduzida em relação à reactividade sob condições óptimas (também quando num estado não humedecido). É óbvio que estas condições são diferentes dependendo da enzima presente e/ou da enzima a ser determinada como analito. As condições óptimas são conhecidas do especialista e podem ser encontradas na arte anterior. Numa modalidade preferida da presente invenção, a condição no primeiro ambiente pode ser fornecida regulando o valor do pH para um valor diferente do valor óptimo da enzima, e.g. pela remoção de um ácido ou de uma base. 14 [0033] Numa modalidade preferida da presente invenção, a condição no primeiro ambiente pode ser seleccionada para favorecer a estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) com capacidade de reagir ao analito para fornecer um sinal detectável.

[0034] 0 tempo de armazenamento para o dispositivo de vareta de teste da presente invenção pode ser substancialmente prolongado devido à nova estrutura do dispositivo de vareta. 0 tempo de armazenamento prolongado oferecido pela presente invenção refere-se a um tempo de armazenamento maior sem perda significativa de desempenho durante o ensaio. Assim, o tempo de armazenamento do dispositivo de vareta de teste da presente invenção pode ser pelo menos 15% superior ao de um dispositivo de vareta similar desenvolvido convencionalmente, por exemplo 20%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300% ou 500% mais longo.

[0035] Numa modalidade da presente invenção, a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima(s). Preferencialmente, o desvio do valor óptimo pode ser pelo menos de 0,5 unidades de pH, por exemplo 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 unidades de pH ou pelo menos 5 unidades de pH.

[0036] Na presente invenção, o termo "segundo ambiente" refere-se a uma condição no dispositivo de vareta de teste em torno do reagente ou combinação de reagentes fornecidos pela banda reguladora quando num estado húmido, na qual a reactividade do reagente ou combinação de reagentes (inicialmente impregnados na banda de reacção) se aproxima das condições óptimas da(s) enzima(s), de forma a melhorar 15 a reactividade das enzimas. Isto significa que a banda reguladora é fornecida para introduzir uma alteração no dispositivo de vareta de teste que leva os reagentes e/ou o analito de um estado substancialmente inactivo ou de um estado de actividade reduzida para um estado de actividade aumentada capaz de fornecer uma determinação fiável, reprodutível e fácil do analito.

[0037] Novamente, é óbvio que as condições óptimas são diferentes consoante a enzima esteja ou não presente e/ou dependendo da enzima a ser determinada como o analito, e as condições óptimas são conhecidas do especialista e podem ser encontradas na arte anterior. Numa modalidade preferida da presente invenção, a condição no segundo ambiente pode ser fornecida regulando o valor do pH para um valor próximo do pH óptimo da enzima, e.g. pela adição de um ácido ou de uma base.

[0038] Numa modalidade preferida da presente invenção, a condição no segundo ambiente é seleccionada de forma a favorecer o desempenho da reactividade do(s) reagente(s) com capacidade de reagir ao analito e fornecer um sinal detectável ou de forma a favorecer a taxa de reacção entre o analito e o(s) reagente(s) com a capacidade de reagir com o analito, fornecendo um sinal detectável.

[0039] Noutra modalidade da presente invenção, a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que se aproxima do pH óptimo da(s) enzima(s). De preferência, o valor do pH desvia-se do valor do pH óptimo menos de 2 unidades de pH, por exemplo menos de 1, 0,75, 0,5, 0,25, 0,1 ou 0,05 unidades de pH.

[0040] Quando o ensaio envolve duas ou mais enzimas com 16 diferentes valores óptimos, o segundo ambiente pode desviar-se da condição óptima, de forma a considerar todas as enzimas que participam no ensaio, para favorecer o ensaio do analito. Numa modalidade da presente invenção, o desvio do valor óptimo do pH pode ser inferior a 2 unidades de pH, por exemplo inferior a 1, 0,75, 0,5 0,25, 0, 1 ou 0,05 unidades de pH.

[0041] Numa modalidade preferida da presente invenção, o método e o dispositivo fornecidos envolvem uma determinação do analito baseada em enzimas. Isto inclui os tipos de ensaios em que uma ou mais enzimas são embebidas na pelo menos uma banda de reacção e o analito pode ou não ser uma enzima. Contudo, a determinação de um analito baseada em enzimas também se refere a ensaios em que o analito a ser determinado é uma enzima independentemente da presença ou ausência de uma enzima a ser embebida na banda de reacção. É preferível que o ensaio seja um em que uma enzima é embebida na pelo menos uma banda de reacção e o analito pode ou não ser uma enzima.

[0042] Os criadores da presente invenção também forneceram um novo método para testar um analito numa amostra de leite. O método compreende os passos de: (i) aplicar a amostra de leite suspeita de conter o analito numa banda de reacção, (ii) permitir que a amostra migre para a banda de reacção que inclui um reagente ou combinação de reagentes capazes de reagir com o analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça um sinal detectável quando estiver num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) 17 referido (s) reagente (s), o referido primeiro ambiente permitindo uma melhor estabilidade de armazenamento do(s) reagente (s) e do dispositivo de vareta de teste, (iii) permitir que a amostra, sozinha ou com o reagente, migre da banda de reacção para uma banda reguladora, estando a referida banda reguladora em contacto com a banda de reacção, a banda reguladora criando um segundo ambiente para o referido reagente num estado humedecido, o referido ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o reagente, e (iv) permitir que o reagente e o analito, o derivado do referido analito ou o composto indicador para o referido analito forneçam um sinal detectável, e em que a determinação do analito é baseada em enzimas; em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor óptimo do pH da(s) enzima(s); em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que aproxima o valor do pH da(s) enzima (s) e em que os diferentes ambientes têm diferentes valores de pH.

[0043] O sinal detectável pode ser qualquer substância passível de ser observada directa ou indirectamente através de qualquer tipo de meio visual ou instrumental. 0 meio instrumental pode ser e.g. um magnetómetro, um espectrofotómetro ou um leitor ELISA. Vários compostos adequados podem ser utilizados como composto produtor de cor. Na presente invenção, o composto corante pode ser seleccionado do grupo que consiste em cromogénios, catalisadores, compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes, marcadores radioactivos, metais, partículas magnéticas, partículas corantes, enzimas ou 18 substratos, partículas de látex polimérico orgânico, lipossomas ou outras vesículas que contêm substâncias produtoras de sinais e similares.

[0044] A amostra a ser testada pode ser aplicada ao dispositivo de vareta de teste quer aplicando a amostra ou subconjunto da mesma ao dispositivo de vareta de teste, quer colocando o dispositivo de vareta de teste num recipiente que contenha a amostra. No passo (i) é sugerida a aplicação da amostra suspeita de conter o analito ou de um subconjunto da mesma na banda de reacção.

[0045] Em alternativa, a amostra suspeita de conter o analito ou um seu subconjunto podem ser aplicados numa banda de aplicação separada que seja capaz de receber e distribuir a amostra (de preferência de forma substancialmente homogénea) pela banda de reacção e banda reguladora, respectivamente.

[0046] No presente contexto, o termo "banda de aplicação" refere-se a uma banda no dispositivo onde é aplicada a amostra líquida e que fornece uma absorção rápida da mesma e uma libertação rápida e consistente desta para a banda de reacção e/ou banda reguladora. Assim, o material utilizado na banda de aplicação pode ser seleccionado do grupo composto por uma membrana de nitrocelulose, uma celulose, um polímero como nylon, fluoreto de polivinilideno ou látex, fibras de vidro, fibras têxteis, fibras não têxteis e uma membrana de gel cromatográfico. 0 material utilizado no primeiro ambiente é, de preferência, uma fibra têxtil ou uma fibra de vidro não têxtil.

[0047] Quando uma amostra é aplicada na banda de aplicação, migra para a banda de reacção e/ou banda reguladora (passos 19 (ii) e (iii) nas respectivas acumulações), transformando assim o primeiro e o segundo ambiente em estados humedecidos. No presente contexto, o termo "estado humedecido" refere-se ao contacto entre o(s) reagente(s) na banda de reacção e/ou entre o agente na banda reguladora e a amostra através do qual a banda de reacção e/ou reguladora fica húmida ou ligeiramente húmida. 0 efeito do estado humedecido é que os reagentes secos, os agentes químicos secos e/ou os componentes secos são libertados e dissolvidos (mobilizados) e a reacção no dispositivo de vareta de teste tem início e é produzido um sinal detectável, dependente da quantidade de analito presente na amostra. Numa modalidade da presente invenção, a banda de aplicação faz parte da banda de reacção e/ou da banda reguladora. O material poroso [0048] Os materiais seleccionados para serem utilizados na banda de reacção e/ou na banda reguladora podem ser seleccionados de um material poroso. No presente contexto, o termo "material poroso" refere-se a um material que absorve a amostra e permite assim que esta migre. 0 material poroso seleccionado pode ter um tamanho de poro com uma capacidade que possibilita uma taxa de fluxo elevada que dissolve rapidamente o reagente ou combinação de reagentes e permite uma distribuição substancialmente equilibrada das amostras. De preferência, o material poroso pode ser seleccionado por não permitir substancialmente qualquer retenção de amostras ricas em triglicéridos. Numa modalidade da presente invenção, a retenção de triglicéridos é de 0%, por exemplo 1%, e.g. no máximo 2,5%, 5%, 10%, 15%, 25%, 50%, ou da maior parte ou de todos os triglicéridos, e.g. no máximo 75% ou, por exemplo, no máximo 100%. 20 [0049] O material poroso pode ser seleccionado do grupo composto por uma membrana de nitrocelulose, uma celulose, um polímero como nylon, fluoreto de polivinilideno ou látex, fibras de vidro, fibras têxteis, fibras não têxteis, membranas de um gel cromatográfico, diatomite, silica-gel, óxido de silício e kieselguhr.

[0050] Numa modalidade da presente invenção, o material poroso na pelo menos uma banda de reacção e/ou banda reguladora pode ser seleccionado de um grupo de materiais com um tamanho de poro preferencialmente entre 10-30.000 pm, 10-20.000 pm,10-10.000 pm, 10-1000 pm, 10-500 pm, 10-100 pm, 10-75 pm, 10-50 pm, 50-200 pm, 50-100 pm, 100-500 pm, 50-300 pm, 75-300 pm, 75-200 pm, 75-150 pm, 75-120 pm.

[0051] Ainda noutra modalidade da presente invenção, o material poroso na pelo menos uma banda de reacção e/ou banda reguladora pode ser seleccionado de um grupo de materiais com um tamanho de poro adequado, por exemplo no máximo 500 pm, 200 pm, 150 pm, 100 pm ou 75 pm.

[0052] Noutra modalidade da presente invenção, o material poroso na pelo menos uma banda de reacção e/ou banda reguladora pode ser caracterizado por possuir uma grande capacidade de ligação a proteínas, por exemplo no intervalos de 1-400 pg/cm2, 1-250 pg/cm2, 1-200 pg/cm2, 1-140 pg/cm2, 1-120 pg/cm2, 1-100 pg/cm2, 1-80 pg/cm2, 1-60 pg/cm2, 1-40 pg/cm2, 50-200 pg/cm2, 50-100 pg/cm2, 50-150 pg/cm2, 50-120 pg/cm2, 75-120 pg/cm2, 75-110 pg/cm2. [0053] Ainda noutra modalidade da presente invenção, o material poroso na pelo menos uma banda de reacção e/ou banda reguladora pode caracterizar-se por possuir uma 21 grande capacidade de ligação a proteínas, por exemplo no máximo 400 pg/cm2, 250 pg/cm2, 200 pg/cm2, 140 pg/cm2, 120 pg/cm2, 100 pg/cm2, 80 pg/cm2, 60 pg/cm2 ou 40 pg/cm2.

[0054] Assim, numa modalidade da presente invenção, o material poroso na pelo menos uma banda de reacção e/ou na banda reguladora pode caracterizar-se por permitir a migração da amostra numa taxa de fluxo capilar elevada, por exemplo nos intervalos de 50-500 seg/4 cm, 50-250 seg/4 cm, 50-200 seg/4 cm, 50-100 seg/4 cm, 50-75 seg/4, 100-250 seg/4 cm, 150-250 seg/4cm, 200-250 seg/4cm, 250-500 seg/4 cm, 75-150 seg/4cm, 80-130 seg/4 cm ou 80-110 seg/4 cm.

[0055] Noutra modalidade da presente invenção, o material poroso da pelo menos uma banda de reacção e/ou da banda reguladora pode ser caracterizado por permitir a migração da amostra numa taxa de fluxo capilar elevada, por exemplo, no máximo 300 seg/4 cm, 200 seg/4 cm, 100 seg/4 cm ou 75 seg/4 cm.

[0056] De preferência, os materiais porosos utilizados na pelo menos uma banda de reacção e/ou na banda reguladora podem ser os mesmos em pelo menos 2 das bandas, por exemplo 3, 4 ou 5 das bandas.

[0057] De acordo como o material poroso acima descrito, pode ser desejável fornecer um dispositivo para detectar um analito numa análise rápida. Numa modalidade da presente invenção, o tempo de análise é inferior a 15 minutos, por exemplo, inferior a 10 minutos, 8 minutos, 7 minutos, 6 minutos, 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos, 1 minuto ou 30 segundos.

Banda de reacção 22 [0058] No presente contexto, o termo "banda de reacção" refere-se a uma ou mais bandas que compreendem um reagente ou uma combinação de reagentes. 0 reagente ou combinação de reagentes podem preferencialmente ser impregnados na banda de reacção de uma forma tal que o reagente ou combinação de reagentes estejam imobilizados quando num estado seco e móveis quando num estado humedecido.

[0059] No contexto da presente invenção, o termo "reagente" refere-se à substância química ou enzima que reage, participa ou é necessária para a determinação de um analito, de um derivado do mesmo ou de um composto indicador para que o dito analito forneça um sinal detectável. Podem ser fornecidas definições semelhantes da combinação de reagentes que se referem mais especificamente a 2 ou mais reagentes, por exemplo a 3 ou mais reagentes, 4 ou mais reagentes, 5 ou mais reagentes ou 6 ou mais reagentes.

[0060] Numa modalidade da presente invenção, o dispositivo de vareta de teste inclui pelo menos 2 bandas de reacção, por exemplo pelo menos 3, 4, 5 ou 6 bandas de reacção. Nesta modalidade, os reagentes que reagem, participam ou são necessários para a determinação de um analito, de um derivado do referido analito ou de um composto indicador para o referido analito para fornecer um sinal detectável, poderão ser introduzidos em bandas de reacção diferentes. Isto pode melhorar a estabilidade, propriedades e aplicabilidade do dispositivo de vareta de teste porque podem ser incluídos compostos incompatíveis em bandas de reacção diferentes e consequentemente em diferentes ambientes do dispositivo de vareta de teste.

Banda reguladora 23 [0061] No presente contexto, o termo "banda reguladora" refere-se a uma banda capaz de regular o ambiente da amostra que compreende o analito para um segundo ambiente para a amostra de forma a facilitar a determinação do analito, derivado do referido analito ou composto indicador para o referido analito.

[0062] Numa modalidade da presente invenção, a banda reguladora pode incluir um ou mais agentes capazes de aumentar a taxa de reacção. Estes agentes proporcionam uma alteração no pH através da adição de um ácido, de uma base ou da combinação de ambos.

[0063] Ainda noutra modalidade da presente invenção, a banda reguladora está em contacto com pelo menos uma banda de reacção por sobreposição substancialmente completa ou parcial ou por estar adjacente à mesma. Numa modalidade da presente invenção a banda reguladora sobrepõe a pelo menos uma banda de reacção em pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90% ou 95%. No presente contexto, o termo "sobreposição substancialmente completa" refere-se a duas bandas distintas (a banda reguladora e a pelo menos uma banda de reacção) estarem dispostas uma sobre a outra. No presente contexto, o termo "parcialmente sobreposta" refere-se a duas bandas distintas (a banda reguladora e a pelo menos uma banda de reacção) que estão sobrepostas apenas em parte da(s) mesma(s). Uma sobreposição parcial de 100% refere-se a uma sobreposição completa e um desvio de 5% dos 100% de sobreposição completa refere-se a uma sobreposição substancialmente completa.

[0064] Numa modalidade da presente invenção, a banda reguladora e a pelo menos uma banda de reacção estão 24 dispostas adjacentes uma à outra. Isto significa que as bandas são colocadas em contacto uma com a outra (tocando-se) . Uma sobreposição de 0% (mas em contacto) refere-se ao termo "disposição adjacente", além disso, uma sobreposição inferior a 5% pode ser considerada como estando incluída no termo "disposição adjacente", como por exemplo uma sobreposição de, no máximo, 4%, 3%, 2% ou 1%.

[0065] Ainda noutra modalidade da presente invenção, a banda reguladora e a pelo menos uma banda de reacção podem ser combinadas numa banda em que o(s) reagente (s) e o(s) agente(s) capazes de aumentar a taxa de reacção podem ser impregnados individualmente e podem opcionalmente ser separados por um revestimento. Um sistema, um método e vários químicos úteis para preparar uma banda que inclua todas as substâncias (reagente(s) e agente(s) capazes de aumentar a taxa de reacção) numa banda foram descritos na patente US 4.215.995.

[0066] Numa modalidade da presente invenção, podem ser incorporados um ou mais reagentes na banda reguladora, ao passo que o(s) reagente(s) sensíveis ao segundo ambiente, à composição química ou aos reagentes do ensaio podem ser removidos para uma banda distinta, e.g. a banda de reacção.

Suporte sólido [0067] 0 dispositivo, de acordo com a presente invenção, pode ser suportado por um suporte sólido. No presente contexto, o termo "suporte sólido" refere-se a um material que não influencia a migração ou a reacção da amostra líquida, ou no(s) reagente(s) ou agentes capazes de aumentar a taxa de reacção. 0 suporte sólido fornece uma base estabilizadora para o dispositivo de ensaio e confere uma resistência suficiente para manter o formato fisico 25 pretendido e nao interfere substancialmente com a produção de um sinal detectável.

[0068] Numa modalidade da presente invenção, o material para o suporte sólido é seleccionado do grupo composto por tubos, esferas de polímeros, tiras de nitrocelulose, membranas, filtros, folhas plásticas e similares.

[0069] Naturalmente, podem ser utilizados materiais sintéticos e de ocorrência natural que sejam sinteticamente modificados como material da fase sólida. Tais materiais incluem polissacáridos como, por exemplo, materiais celulósicos, tais como papel e derivados de celulose, como acetato de celulose e nitrocelulose, sílica, materiais inorgânicos, como por exemplo, alumina desactivada, diatomite, MgSC>4 ou outros materiais inorgânicos finamente divididos, dispersos uniformemente numa matriz polimérica porosa, a qual pode incluir um ou mais polímeros tais como homopolímeros e copolímeros de cloreto de vinilo, por exemplo, cloreto de polivinilo, copolímero de cloreto de vinilo e propileno, e copolímero de cloreto de vinilo e acetato de vinilo, tecido, de ocorrência natural (por exemplo, algodão) ou sintética (por exemplo, nylon), géis porosos, como sílica-gel, agarose, dextrano e gelatina, películas poliméricas, tais como poliacrilamida, e similares.

[0070] Numa modalidade da presente invenção, o suporte sólido pode ser omitido do dispositivo de vareta de teste. Neste caso, o dispositivo de vareta de teste compreende pelo menos uma banda de reacção e uma banda reguladora. Ao efectuar a determinação de um analito numa amostra utilizando um dispositivo de vareta de teste sem um suporte sólido, a amostra pode ser aplicada numa superfície do 26 dispositivo de vareta de teste e o sinal detectável pode ser detectado na mesma ou noutra superfície do dispositivo.

Analitos para determinação [0071] Pode ser utilizado um dispositivo ou um método com base nos princípios acima referidos para determinar uma ampla variedade de analitos pela escolha de compostos de coloração apropriados conhecidos dos especialistas na área, e a invenção não se limita aos exemplos aqui mencionados.

[0072] Numa modalidade da presente invenção, os analitos para análise podem ser seleccionados do grupo composto por uma proteína, uma enzima, uma gordura, um hidrato de carbono, um antibiótico, um esteróide, como hormonas, uma vitamina, um composto químico, um hapteno, uma célula, como uma bactéria ou leucócitos, um anticorpo, uma droga de abuso e sangue.

[0073] Numa modalidade da presente invenção, o analito é uma enzima e a enzima é preferencialmente seleccionada do grupo formado por catalase, lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina, fosfatase ácida, carboxilesterase, arilo-esterase, β-glicuronidase, lactoperoxidase, lipase, lisozima, xantina oxidase, plasmina e beta-N-acetil-hexosaminidase (NAGase), sintase da prostaglandina D (PGDS) .

[0074] Ainda noutra modalidade da presente invenção, o analito é um composto químico e pode ser seleccionado do grupo formado por ureia, triglicéridos e corpos cetónicos, tais como o acetoacetato, beta-hidroxibutirato (BOHB), acetona, ácido ascórbico, nitratos, urobilinogénio, colesterol, e esteróides como pregnenolona, progesterona, testosterona, di-hidrotestosterona, estrona, estradiol, 27 cortisol, cortisona, aldosterona, corticosterona, androstenediona, 17a-0H-pregnenolona, 17a-0H-progesterona, 11-desoxicorticosterona, 11-desoxicortisol e dehidroepiandrosterona, hormona luteínizante ou gonadotrofina coriónica humana.

[0075] Ainda noutra modalidade da presente invenção, o analito é um hidrato de carbono e este pode ser seleccionado do grupo formado por um monossacárido, como a glicose ou a galactose, e um dissacárido, como a lactose.

Amostras para análise [0076] No presente contexto, o termo "amostra" refere-se a gualquer amostra no estado liquido, sólido ou gasoso e que pode ser liquidificada no momento do teste. De modo a humedecer o material poroso utilizado na banda reguladora e/ou na pelo menos uma banda de reacção, pode ser aplicada uma amostra liquida para permitir a migração. Além disso, é preferível que seja necessário apenas um número mínimo de passos de manuseamento da amostra líquida antes da sua aplicação no dispositivo de vareta de teste. No presente contexto, o termo "passos de manuseamento" refere-se a qualquer tipo de tratamento prévio da amostra líquida antes ou depois da sua aplicação ao dispositivo de teste. Este tratamento prévio inclui separação, filtração, diluição, destilação, concentração, inactivação de compostos interferentes, centrifugação, aquecimento, fixação, adição de reagentes ou tratamento químico.

[0077] Numa modalidade da presente invenção, a amostra pode ser recolhida de um mamífero, preferencialmente seleccionado de um grupo constituído por animais de rebanho, vacas, camelos, búfalos, porcos, cavalos, veados, 28 ovelhas, cabras, animais de estimaçao, caes, gatos e humanos.

[0078] Numa modalidade preferida da presente invenção, a amostra pode ser derivada de qualquer fonte desejável, contudo, é preferível que a amostra seja seleccionada do grupo constituído por leite, sangue, soro, plasma, saliva, urina, suor, fluido ocular, fluido cefalorraquidiano, fluido ascítico, fluido mucoso, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico ou similares.

[0079] Para além de fluidos fisiológicos, podem ser utilizadas outras amostras líquidas, como amostras aquosas variadas, produtos alimentares, águas residuais e similares. Adicionalmente, pode ser utilizada uma amostra de teste sólida, desde que seja modificada para constituir uma amostra líquida, por exemplo, na forma de uma solução, suspensão ou emulsão.

Composto corante [0080] No presente contexto, o termo "composto corante" refere-se a um composto químico capaz de desenvolver e emitir um sinal detectável, por exemplo, produzir uma cor. A intensidade dessa cor varia, dependendo da concentração do analito presente na amostra.

[0081] Os exemplos de compostos corantes adequados para cada teste específico podem ser facilmente identificados pelo especialista na área e podem ser introduzidos num dispositivo de vareta de teste de acordo com a presente invenção.

[0082] Numa modalidade da presente invenção, o composto corante é seleccionado do grupo composto por sal de 29 tetrazólio; sal sódico de 4-aminoantipirina/3,5-dimetoxi-N-etilo-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-anilina; 4- aminoantipirina/sal sódico de ácido l-naftol-3,6-dissulfónico; sal sódico de 4-aminoantipirin-N-etilo-N-(2-hidroxi-3-sulfopropilo)-m-toluidina; 4-aminoantipirin-1,7-dihidroxinaftaleno; sulfonato de 4-aminoantipirin-3, 5-dicloro-2-hidroxibenzeno; Violeta Tetrazolium; ácido 3,5-dinitrobenzóico; sulfato de cobre; ácido N-l-naftil-N'-dietilenodiamina-oxálico; sal Fast Red TR; verde de bromocresol; azul de bromofenol; Arsenazo III; 2-(3,5-dimetoxi-4-hidroxifenol)-4,5-bis(4-dimetilaminofenil)-imidazol; corante piridilazo; acoplador de cor magenta; formazano de 1,5-bis(2-hidroxi-3,5-diclorofenil)-3-ciano; tartarato de cobre; hidrazona de 3-metil-2-benzotiazolina; sulfonato de N-propil-4-(2,6-dinitro-4- clorobenzil)quinolinio de etano; hidroxidiaril-imidazol; tetraclorozincato de 2-metoxi-4-morfolinofenil-diazónio; 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; 4-aminofenazona/sulfonato de 3,5-dicloro-2-hidroxibenzeno; difosfato de primaquina/3-metil-2-benzotiazolina-hidrazona; ácido 2,5- dinitrobenzóico; cloreto de 2-(p-indofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-feniltetrazólio; 3-hidroxi-l,2,3,4- tetrahidrobenzo-(h)-quinolina; ou qualquer derivado destes.

Aumento da taxa de reacção [0083] Como acima referido, a banda reguladora fornece um segundo ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), quando num estado humedecido, permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o reagente.

[0084] Numa modalidade da presente invenção, a taxa aumentada da reacção é fornecida por uma alteração no pH devido à adição de um ácido, de uma base, ou de uma combinação de ambos. 30

Composto auxiliar [0085] Dada a complexidade das amostras líquidas a serem analisadas na presente invenção, pode ser ocasionalmente vantajosa a utilização de um composto auxiliar de modo a melhorar o fluxo e a absorção da amostra líquida pela banda reguladora e/ou na(s) banda(s) de reacção e a fornecer uma libertação rápida, consistente e equilibrada do(s) reagente (s) e dos agentes capazes de aumentar a taxa de reacção. 0 composto auxiliar pode ser fornecido ao dispositivo através a) da sua adição à(s) banda(s) de reacção e/ou à banda reguladora, isoladamente ou em conjunto com a amostra líquida, b) da incorporação do composto auxiliar em pelo menos uma das bandas de reacção e/ou na banda reguladora, ou c) de uma combinação destas.

[0086] Numa modalidade da presente invenção, o composto auxiliar é adicionado ao dispositivo de vareta de teste antes que a amostra liquida seja adicionada. O composto auxiliar é, preferencialmente, um líquido.

[0087] Noutra modalidade preferida da presente invenção, o composto auxiliar e a amostra líquida são adicionados ao dispositivo de vareta de teste em camadas. No presente contexto, o termo "camadas" refere-se à divisão do volume do composto auxiliar e do volume da amostra líquida e , de seguida, o composto auxiliar e a amostra líquida são adicionados ao primeiro ambiente, um após o outro. Neste caso, o composto auxiliar adicionado pode ser líquido ou sólido. Numa modalidade da presente invenção, o composto auxiliar e a amostra líquida são divididos em pelo menos 2 volumes, cada um fornecendo 4 camadas alternadas de composto auxiliar e amostra líquida, e.g. o composto auxiliar e a amostra líquida são divididos em pelo menos 3 31 volumes, cada um fornecendo 6 camadas alternadas de composto auxiliar e amostra líquida, por exemplo o composto auxiliar e a amostra líquida são divididos em pelo menos 4 volumes, cada um fornecendo 8 camadas alternadas de composto auxiliar e amostra líquida, e.g. o composto auxiliar e a amostra líquida são divididos em pelo menos 6 volumes, cada um fornecendo 12 camadas alternadas de composto auxiliar e amostra líquida, tal como o composto auxiliar e a amostra líquida serem divididos em pelo menos 8 volumes, cada um fornecendo 16 camadas alternadas de composto auxiliar e amostra líquida, e.g. o composto auxiliar e a amostra líquida são divididos em pelo menos 10 volumes, cada um fornecendo 20 camadas alternadas de composto auxiliar e amostra líquida, tal como o composto auxiliar e a amostra líquida serem divididos em pelo menos 20 volumes, cada um fornecendo 40 camadas alternadas de composto auxiliar e amostra líquida.

[0088] Ainda noutra modalidade da presente invenção, o composto auxiliar pode ser impregnado numa ou mais bandas de reacção e/ou na banda reguladora.

[0089] Noutra modalidade da presente invenção, pelo menos uma banda de reacção e/ou a banda reguladora incorporam pelo menos um composto auxiliar capaz de melhorar o fluxo da amostra líquida.

[0090] Ainda noutra modalidade da presente invenção, o composto auxiliar fornece uma libertação rápida, consistente e homogénea do(s) reagente(s) na pelo menos uma banda de reacção e/ou do agente capaz de aumentar a taxa de reacção na banda reguladora. Adicionalmente, o composto auxiliar fornece uma afinidade reduzida para a ligação de proteínas. 32 [0091] Para além disso, o composto auxiliar pode fornecer uma baixa retenção de amostras ricas em triglicéridos e/ou pode diminuir a viscosidade da amostra.

[0092] Numa modalidade da presente invenção, o composto auxiliar contém constituintes químicos seleccionados do grupo composto por água, um surfactante, um sal, um metal, um açúcar, uma proteína e um lípido.

Preparação do dispositivo de vareta de teste [0093] 0 dispositivo de vareta de teste, de acordo com a presente invenção, pode ser preparado através de qualquer método convencional destinado à preparação de dispositivos de vareta de teste. Numa modalidade preferida, o método para fornecer um dispositivo de vareta de teste de acordo com a presente invenção compreende os passos de: (i) fornecer uma banda de reacção através da impregnação de um primeiro material poroso com uma solução aquosa que inclui um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir com o analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça um sinal detectável quando num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), o referido primeiro ambiente permitindo uma estabilidade melhorada de armazenamento do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta, (ii) seguidamente, secar a banda de reacção, (iii) fornecer uma banda reguladora impregnando um segundo material poroso com uma solução aquosa, compreendendo um segundo ambiente para o(s) referido(s) 33 reagente (s) quando num estado humedecido, o referido segundo ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o reagente, (iv) seguidamente, secar o segundo material poroso impregnado, (v) colocar a banda de reacção em contacto com a banda reguladora, opcionalmente num suporte sólido, para obter o dispositivo de vareta de teste, e em que o dispositivo de vareta se baseia numa determinação baseada em enzimas e em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima(s) e em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que se aproxima do pH da(s) enzima(s) e em que os diferentes ambientes têm diferentes valores de pH.

[0094] A pelo menos uma banda de reacçao e a banda reguladora podem entrar em contacto através de sobreposição substancialmente completa das bandas, sobreposição parcial das bandas ou através da disposição adjacente da banda reguladora em relação à pelo menos uma banda de reacção. Numa modalidade da presente invenção, a disposição das bandas pode ser seleccionada de maneira a evitar a precipitação de um componente da amostra na face superior do dispositivo. Os componentes da amostra que se podem precipitar podem ser seleccionados de um grupo constituído por proteínas, hidratos de carbono, gordura, células ou outros componentes presentes na amostra.

[0095] Numa modalidade preferida da presente invenção, o primeiro ambiente pode ser criado de forma a favorecer o 34 armazenamento do(s) reagente(s) capazes de reagir com o analito e de fornecer um sinal detectável - conforme descrito anteriormente. Para além disso, o segundo ambiente pode ser criado de forma a favorecer o desempenho do(s) reagente(s) capaz (es) de reagir com o analito e fornecer um sinal detectável - também conforme descrito anteriormente. Em alternativa ou adicionalmente, o segundo ambiente pode ser criado de forma a favorecer a taxa de reacção entre o analito e o(s) reagente(s) capaz (es) de reagir com o analito fornecendo um sinal detectável - conforme o acima descrito.

[0096] Ainda noutra modalidade da presente invenção, o primeiro ambiente pode ser criado de forma a favorecer a composição da amostra que se suspeite conter um analito. No caso em que o analito pode ser encontrado no leite, deve-se verificar se a banda reguladora ou a pelo menos uma banda de reacção tem um pH de 6 ou inferior. Se essa banda com um pH de 6 ou menos, estiver colocada no topo das outras bandas e estiver ligada à banda de aplicação, as proteínas lácteas podem coagular e formar um precipitado na face superior do dispositivo de vareta de teste. Este precipitado pode causar uma diminuição na intensidade do sinal detectável. Assim, pode ser preferível que tal banda esteja localizada a jusante da banda de aplicação de modo a evitar a diminuição do sinal detectável.

Modalidades Adicionais [0097] Numa modalidade da presente invenção, pelo menos uma banda de reacção está localizada em relação à banda reguladora de modo a evitar precipitação de um componente da amostra na face superior do dispositivo. 0(s) componente(s) da amostra que podem precipitar, podem ser 35 seleccionados do grupo que consiste em proteínas, hidratos de carbono, gorduras, células ou outro componente presente na amostra.

[0098] Em casos onde o analito pode ser encontrado no leite e onde a actividade está a ser controlada através de uma mudança no pH, deverá verificar-se se a banda reguladora ou a pelo menos uma banda de reacção têm um valor de pH de cerca de 5 ou menos. Se essa banda, com um valor de pH de cerca de 5 ou menos, for colocada no cimo das outras bandas, as proteínas do leite podem coagular e formar uma precipitação na face superior do dispositivo de vareta de teste. Esta precipitação pode causar uma diminuição na intensidade do sinal detectável. Deste modo, pode ser preferido que tal banda esteja localizada a jusante do local de aplicação da amostra, para evitar a diminuição indesejável no sinal detectável.

[0099] Numa modalidade alternativa da presente invenção, o termo "face superior" está relacionado com a superfície do dispositivo de vareta de teste da presente invenção de onde o sinal detectável pode ser obtido através de instrumentos e aparelhos adequados ou por inspecção visual. Esta superfície pode ser a mesma onde a amostra foi aplicada ou pode ser uma superfície diferente.

Determinação de LDH

[0100] Como acima mencionado, os inventores da presente invenção desenvolveram agora uma nova estrutura de um dispositivo de vareta de teste para determinação da concentração de um analito numa amostra; tal analito pode ser lactato desidrogenase (LDH) em fluídos corporais. 0 dispositivo de vareta de teste, de acordo com a presente invenção, pode ser útil na detecção qualitativa e na 36 determinação quantitativa da LDH, numa amostra onde o meio de teste compreende uma composição de reagente incorporada num material poroso.

[0101] A determinação quantitativa da LDH pode ser importante para a determinação de inflamação mamária que afecta a integridade da estrutura da glândula mamária e danifica, simultaneamente, o epitélio secretor e as barreiras entre o leite e o sangue. Consequentemente, muitos componentes do leite são influenciados pela mastite. Os componentes principais, como gorduras, proteínas e lactose são reduzidos e várias enzimas são alteradas. A LDH e/ou a N-acetilglicosaminidase podem ser usadas como indicadores adequados da inflamação causada por mastite. A N-acetil-B-D-glicosaminidase, também denominada por N-acetil-glicosaminidase (NAGase), tem sido considerada como um dos melhores marcadores para a inflamação mamária. Adicionalmente, foi demonstrado que outras enzimas no leite, como a LDH, podem ser igualmente valiosas e agir como um indicador adequado de mastite, tal como a NAGase.

[0102] Por outro lado, a determinação quantitativa de LDH pode ser extremamente importante na detecção de doenças cardíacas, especialmente em caso de ataque cardíaco, na medida em que, após o ataque cardíaco, a concentração de LDH, por exemplo, no sangue aumenta visivelmente acima da sua concentração normal. A detecção precoce desse aumento anormal na concentração de LDH pode, assim, permitir a um diagnóstico mais rápido e exacto de doenças cardíacas.

[0103] Devido à importância do diagnóstico precoce de condições cardíacas anormais, um teste para a detecção de variáveis na concentração de LDH no sangue deve ser suficientemente rápido e simples para o clínico, mas exacto 37 o suficiente para permitir que o diagnóstico seja feito sem margens de erro ou falsas leituras. Esse mecanismo é representado pelo dispositivo inovador de vareta de teste da presente invenção. Utilizando este dispositivo inovador de vareta de teste, não é necessária qualquer instrumentação, nem qualquer mistura ou reconstituição de reagentes. 0 teste pode, por conseguinte, ser conduzido no domicilio do doente ou num gabinete médico sem qualquer equipamento especial.

[0104] Numa modalidade da presente invenção, um método para analisar a LDH numa amostra pode compreender os passos de: (i) aplicar numa banda de reacção a amostra suspeita de conter LDH. (ii) permitir que a amostra migre para a banda de reacção que inclui um reagente ou combinação de reagentes capazes de reagir com LDH, um derivado de LDH ou um composto indicador para que a LDH forneça um sinal detectável quando num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), o referido primeiro ambiente permitindo uma melhor estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta de teste quando num estado não húmido, (iii) permitir que a amostra migre da banda de reacção para uma banda reguladora, a referida banda reguladora estando em contacto com a banda de reacção, a banda reguladora criando um segundo ambiente para o referido reagente, quando num estado humedecido, o referido ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre a LDH e o(s) reagente(s), e 38 (iv) permitir que o reagente e a LDH, o derivado de LDH ou o composto indicador de LDH forneçam um sinal detectável.

[0105] Numa modalidade adicional da presente invenção, a determinação de LDH baseia-se numa determinação baseada em enzimas.

[0106] Ainda noutra modalidade da presente invenção, a taxa de reacção aumentada é fornecida através de uma mudança no pH. Tal mudança no pH foi anteriormente descrita.

[0107] 0 dispositivo inovador de vareta de teste para determinação da concentração de LDH numa amostra pode compreender, pelo menos, uma banda de reacção que inclui um material poroso, como papel de celulose, que contém em si o resíduo seco resultante da impregnação do mesmo com um reagente, uma combinação de reagentes ou uma série de materiais reagentes.

[0108] 0 primeiro reagente pode ser um sal de tetrazólio. Este reagente é capaz de conferir à área do dispositivo de vareta de teste em contacto com a amostra, uma cor de intensidade variável de forma a ser representativa da concentração de LDH no soro que é adicionado ao indicador. Estes corantes são bem conhecidos no meio e, geralmente, têm a seguinte fórmula: R1 \—(l® „θ / \x R3 R2 em que R1, R2 e R3, individualmente, são os mesmos arilos, 39 ou diferentes, ou radicais de arilo substituídos, e X é um anião, como halogenetos, etc.

[0109] Exemplos úteis de sais desta configuração incluem cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio; cloreto de 2-(p-iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazólio (INT); nitroazul de tetrazólio; azul de tetrazólio; e semelhantes. Estes sais podem ser incorporados no dispositivo inovador de vareta, em concentrações que variam de cerca de 0,05 partes, preferivelmente de cerca de 0,1 partes a cerca de 0,2 partes, para 100 partes de solução usada da forma apresentada abaixo.

[0110] Um segundo reagente que pode ser incorporado na pelo menos uma banda de reacção do dispositivo inovador de vareta de teste compreende um preventor de efeito cromático que é empregue para prevenir o movimento cromático do sal de tetrazólio sobre a superfície do material poroso. Exemplos de materiais que podem ser usados para este propósito incluem ácido polimetacrílico, ácido poliacrílico, carboximetilcelulose, copolímeros de ácido maleico e éter metilvinílico e semelhantes. Estes materiais são usados em quantidades que variam de cerca de 0,1 partes a 3,0 partes, preferivelmente, de cerca de 0,5 partes a cerca de 2,5 partes, para 10 partes da solução usada.

[0111] Um terceiro componente a ser impregnado na pelo menos uma banda de reacção, pode ser um anti-oxidante que é empregue para prevenir a coloração prematura do sal de tetrazólio. Exemplos de anti-oxidantes adequados incluem os fenóis alquilados tais como 2,6-di-terc-butil-p-cresol; hidroxitolueno butilado; 4-t-butil-catecol; hidrocinamato de octadecil-3,5-di-t-butil-4-hidroxi; bisfenóis alquilidenos tais como 2,2'-metilenobis (6-t-butil-4-metil- 40 (6-t-butil-3-metil-fenol); fenol), 4,4'-butilidenobis tiobisfenóis tais como 4,4'-tiobis (6-t-butil-3-metilfenol), 2,2'-tiobis (6-t-butil-4-metilfenol); polifenóis tais como metano de tetraquis (metileno(3,5-di-t-butil-4-hidroxihidrocinamato)], benzeno de 1,3,5-trimetil-2,4,6-tris (3,5-di-t-butil-4-hidroxibenzil); ésteres tais como tiodipropionato de ditridecilo, tiodipropionato de distearilo, dilauriltiodipropionato; aminas tais como diaminas de p-fenileno substituídas por diarilo ou dialquilo, difenilamina, N-fenil-alfa-naftilamina; fosfitos orgânicos tais como fosfito de dibutilo, fosfito de didecilo, fosfito de dioctilo, fosfito de difenildecilo, fosfito de ditetradecilo, fosfito de fenildidecilo, fosfito de fenilneopentilo, fosfito tridecilo, tritiofosfito de trilaurilo, fosfito de trifenilo, fosfito trisnonilo e vários outros anti-oxidantes bem conhecidos tais como as quinonas, que incluem hidroquinona, éter monometílico de hidroquinona, mono-t-butilhidroquinona, 2,5-di-t-butilhidroquinona, toluhidroquinona, 2,5-di-t-amilohidroquinona e semelhantes. Pode-se também usar fenotiazina, hidroxibenzofenona, p-dimetilamino-nitrosobenzeno, ácido tiodipropiónico, etc..

[0112] Estes materiais anti-oxidantes podem ser usados em quantidades que variam de cerca de 0, 01 partes a 2,0 partes, preferivelmente de cerca de 0, 02 partes a 1,0 parte, para 100 partes de solução e podem ser usados em conjunção com o sal de tetrazólio, antes ou depois da deposição dos mesmos.

[0113] Um quarto componente que pode ser impregnado na pelo menos uma banda de reacção pode ser diaforase, que é usado para catalisar a redução do sal de tetrazólio com NADH. Esta enzima é bem conhecida no meio e deve ser empregue em 41 concentrações que variam de cerca de 0,02 partes a 0,2 partes em massa e é, preferivelmente, usada de 0,03 partes a 0,10 partes para 100 partes de solução usada.

[0114] 0 dinucleótido de nicotinamida e adenina, daqui por diante também designado por da NAD, numa mistura com um sal alcalino de lactato, por exemplo um lactato de litio, lactato de sódio, lactato de potássio e semelhantes, inclui um constituinte adicional, que pode ser impregnado na pelo menos uma banda de reacção. O uso do NAD é bem conhecido no meio e deve ser empregue em concentrações que variam de cerca de 0,01 partes a cerca de 0,2 partes e é, preferivelmente, usado de cerca de 0,015 partes a 0, 08 partes para 100 partes de solução. 0 sal lactato é usado em quantidades que variam de cerca de 0,03 partes a cerca de 1,5 partes, e é preferivelmente usado de cerca de 0,02 partes a cerca de 0,09 partes para 100 partes de solução usada.

[0115] Considera-se útil a utilização da seguinte reacção dos reagentes presentes na determinação de LDH numa amostra usando o mecanismo acima descrito:

LDH L-lactacto + NAD+ -------------------> Piruvato + NADH + H+

Diaforase NADH + NTB ---------------------> NAD+ + corante formazano [0116] 0 esquema de reacção acima demonstra que, quando a amostra é adicionada ao dispositivo de vareta de teste, a LDH nela contida pode causar uma reacção que resulta na redução do sal de tetrazólio e na formação de um indicador colorido, cuja intensidade é directamente proporcional à 42 concentração de LDH. Basta, então, ao clínico comparar a cor que resulta de uma tabela de cores Standard para avaliar a concentração de LDH do soro que está a ser testado.

[0117] Para alcançar resultados óptimos utilizando o dispositivo de vareta de teste da presente invenção, é também vantajoso, embora não seja necessário, incorporar na pelo menos uma banda de reacção, um agente humidificante não-iónico adequado que seja do conhecimento do especialista na área. Por exemplo, podem ser usadas alcanolamidas de ácidos gordos, por exemplo, os produtos de reacção de alcanolamida com ácidos gordos como o ácido láurico ou ácido gordo de coco, alcanolaminas adequadas sendo a dietanolamina, monoetanolamina, monoisopropanolamina e semelhantes; materiais derivados de óxido de etileno, por exemplo, aqueles que derivam da reacção de óxido de etileno com alquilfenóis em que o grupo alquilo é octil ou nonil ou mais elevado, alcoóis gordos de cadeia longa como álcool tridecílico, lanolina, álcool de lecitina, etc., ácidos gordos de cadeia longa, tais como resina líquida, ácido oleico, ácido abiético, etc., mercaptanos gordos de cadeia longa, aminas gordas de cadeia longa, polioxipropilenoglicol, éster de ácidos gordos de sorbitol; ésteres de açúcar, por exemplo, os produtos da reacção de alcoólise do éster metílico de um ácido gordo e sacarose ou rafinose; polissorbitol; álcool polivinílico; metilcelulose; fenol etoxilado/resinas de formaldeído e semelhantes. São empregues concentrações de cerca de 0,01 partes a cerca de 1,0 partes de agente humidificador por 100 partes de solução, sendo os agentes humidificadores adicionados, preferivelmente, com cada componente, se os componentes forem adicionados singularmente ou numa mistura 43 com os componentes, se forem adicionados como um sistema de mistura completo.

[0118] Na produção do dispositivo inovador de vareta de teste, o método empregue depende principalmente do reagente que está a ser empregue, assim como do anti-oxidante para o sal de tetrazólio. Se o anti-oxidante for apenas solúvel num solvente orgânico, o material poroso seco, normalmente papel, pode ser impregnado com os reagentes numa série de imersões. Alternativamente, os reagentes são impregnados em duas ou mais bandas de reacção diferentes.

[0119] Numa modalidade da presente invenção, pode ser preparada uma solução aquosa do sal de tetrazólio e, opcionalmente, em combinação com o preventor do efeito cromático, e a pelo menos uma banda de reacção pode ser posta em contacto com esta e depois seca num túnel de secagem ou num forno de ar forçado. A banda de reacção impregnada ou uma segunda banda de reacção, pode depois ser posta em contacto com uma solução orgânica solvente do anti-oxidante. 0 veiculo é seco novamente. Uma solução tampão de diaforase e, opcionalmente, um estabilizador de hidratos de carbono podem, então, ser preparados e uma das bandas de reacção impregnada uma vez, duas ou três vezes, pode ser impregnada e seca. Pode ser preparada uma solução tampão de NAD e lactato alcalino, e um dos papéis tratados ou outra banda de reacção, ou seja, uma quarta banda de reacção pode ser impregnada e uma quarta secagem conclui a preparação do indicador de teste.

[0120] Numa modalidade da presente invenção, o método para determinar a LDH numa amostra pode ser realizado usando um dispositivo de vareta de teste com pelo menos uma banda de reacção que compreende: 44 (a) um composto corante, (b) diaforase, e (c) um dinucleótido de nicotinamida, e (d) um sal lactato.

[0121] Os reagentes (a) , (b) , (c) e (d) podem estar numa única banda de reacção ou em bandas de reacção individuais, por exemplo em 2, 3 ou 4 bandas de reacção diferentes.

[0122] Noutra modalidade da presente invenção, o dispositivo de vareta de teste pode compreender, adicionalmente, pelo menos, uma banda de reacção que tem: (e) um preventor de efeito cromático, e/ou (f) um anti-oxidante.

[0123] Os reagentes (e) e (f) podem estar numa única banda de reacção em conjunto com os reagentes (a) , (b) , (c) e (d) , ou em bandas de reacção individuais, por exemplo em 2 bandas de reagente diferentes.

[0124] Os reagentes podem ser separados em, pelo menos, 2 bandas de reacção, por exemplo em pelo menos 3, 4, 5, 6 bandas de reacção.

[0125] Numa modalidade da presente invenção, o composto corante é seleccionado do grupo que consiste em sal de tetrazólio ou qualquer derivado deste.

[0126] Se os agentes humidificadores, etc., se destinam a ser incorporados, eles são adicionados durante qualquer uma ou em todas as impregnações para obter depósitos de reacção 45 uniformes. Materiais adequados como estabilizadores de hidratos de carbono incluem maltose e sorbitol, assim como óxidos de etileno poliméricos hidrossolúveis tanto com pesos moleculares elevados como reduzidos, dietilenoglicol e semelhantes, em concentrações que variam de cerca de 10,0 partes a cerca de 0,25 partes, de preferência de cerca de 15,0 partes a cerca de 20,0 partes para 100 partes de solução.

[0127] Numa modalidade da presente invenção, pode ser empregue um anti-oxidante hidrossolúvel e, assim, todos os reagentes podem ser misturados em conjunto na solução tampão, estando as concentrações de cada ingrediente acima estabelecidas, excepto que cada uma se baseia nas mesmas 100 partes de água, e pode ser empregue um ciclo de imersão único para produzir o indicador de teste.

[0128] Exemplos de tampões úteis em ambos os procedimentos incluem tampão fosfato, tampão ftalato, tampão tris, tampão citrato-fosfato, tampão borato-succinato, etc.. O tampão preferido é o tampão tris, por exemplo, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol, numa concentração de 0,05 a 0,2M.

[0129] A mudança de cor dos indicadores de teste preparados de acordo com o processo de imersão múltiplo pode ser de rosa a vermelho, enquanto que a mudança de cor do método de imersão único pode ser passar de amarelo a castanho.

[0130] As concentrações acima expressas em conexão com os componentes que podem ser incorporados no dispositivo inovador de vareta de teste estão definidas para as soluções desses componentes que são saturados apenas sobre a pelo menos uma banda de reacção e não se destinam a 46 especificar a quantidade de cada componente que está eventualmente presente na pelo menos uma banda de reacção. Isto que dizer que a saturação do veiculo absorvente com concentração especifica de um componente especifico em solução, não incorporará inequivocamente no material poroso a mesma quantidade ou percentagem de componente presente na solução. Descobriu-se, contudo, que as concentrações de solução acima referidas podem, qeralmente, ser suficientes para incorporar componente suficiente na pelo menos uma banda de reacção, após a saturação com a mesma, para produzir um dispositivo de vareta funcional, as capacidades absorventes da pelo menos uma banda de reacção sendo características dos materiais normalmente usados para este propósito.

[0131] Embora a discussão acima relativamente à preparação deste dispositivo de vareta de teste descreva a saturação da pelo menos uma banda de reacção através de imersão, por vezes, especialmente quando se pretende realizar uma série de saturações, é necessário aplicar a solução componente à pelo menos uma banda de reacção em vez de mergulhar o veiculo, porque a sucessão de imersões tende a lavar os componentes previamente depositados.

[0132] É óbvio para o especialista na área que o primeiro e o segundo ambientes podem ser alterados se estiver a ser fornecido um ensaio diferente para a determinação de LDH. Adicionalmente, é também óbvia para o especialista a forma de optimizar o primeiro e o segundo ambientes, com base no conhecimento fornecido pelo conceito da presente invenção, nomeadamente, tendo um primeiro ambiente que pode ser seleccionado de forma a favorecer o armazenamento do(s) reagente(s) capaz(es) de reagir com o analito e fornecer um sinal detectável, e tendo um segundo ambiente que pode ser 47 criado de forma a favorecer o desempenho do(s) reagente(s) capaz (es) de reagir com o analito e de fornecer um sinal detectável ou de modo a favorecer a taxa de reacção entre o analito e o(s) reagente(s) capaz (es) de reagir com o analito fornecendo um sinal detectável.

[0133] Numa modalidade preferida da presente invenção, o dispositivo de vareta de teste é desenvolvido para medir a LDH de acordo com o esquema de reacção acima referido para detectar a LDH. Nesta construção, pode ser preferido que a pelo menos uma banda de reacção seja fornecida com um valor de pH de aproximadamente 6,8 pH e que a banda de regulação seja fornecida com um agente regulador de pH capaz de fornecer um segundo ambiente para o reagente ou combinação de reagentes de aproximadamente 8,3 pH .

Determinação de β-hidroxibutirato (BHB) [0134] 0 BHB é formado quando a gordura é mobilizada para energia. O nível de BHB, com outros corpos cetónicos, aumenta em situação de fome ou de sub-alimentação, por exemplo, em animais. O seu nível está estreitamente relacionado com o estado de energia quando há uma elevada exigência de glicose, por exemplo, no final da gravidez ou no período de lactação em animais de rebanho, como vacas.

[0135] Numa modalidade da presente invenção, a determinação de BHB pode ser realizada usando o mesmo esquema de reacção que foi fornecido para a determinação de LDH, como explicado acima.

[0136] Numa modalidade preferida da presente invenção, o dispositivo de vareta é desenvolvido para medir o BHB, de acordo com o esquema de reacção acima referido para detectar o BHB. Nesta construção, pode ser preferido que a 48 pelo menos uma banda de reacção seja fornecida com um valor de pH de aproximadamente 6,8 pH e que a banda de regulação seja fornecida com um agente regulador de pH capaz de fornecer um segundo ambiente para o reagente ou combinação de reagentes de aproximadamente 8,3 pH.

Determinação de ureia [0137] A determinação da utilização de proteína pode ser um parâmetro importante. Na pecuária, é muito importante que os animais (e.g., vacas) utilizem de forma óptima as proteínas contidas na ração, já que as proteínas são um dos componentes mais caros da alimentação. A utilização depende, inter alia, da quantidade de energia e proteína simultaneamente presente no animal.

[0138] Numa modalidade da presente invenção, a determinação da ureia pode ser realizada usando o seguinte esquema de reacção:

Urease

Ureia + 2H20 --------------> 2NH4+ + C032' NH4+ + Base - NH3 NH3 + Indicador -► Corante [0139] Numa modalidade preferida da presente invenção, o dispositivo de vareta é desenvolvido para medir o BHB, de acordo com o esquema de reacção acima referido para detectar o BHB. Nesta construção, e quando se usa urease obtida a partir de feijões brancos, pode ser preferido que a pelo menos uma banda de reacção seja fornecida com um valor de pH de aproximadamente 8,0 e que a banda de regulação seja fornecida com um agente regulador de pH capaz de fornecer um segundo ambiente para o reagente ou 49 combinação de reagentes com um valor de pH de aproximadamente 6,0.

Determinação de N-acetil-glicosaminidase (NAGase) [0140] A determinação quantitativa de NAGase pode, tal como a de LDH, ser importante para a determinação de inflamação mamária que afecta a integridade da estrutura da glândula mamária e danifica simultaneamente o epitélio secretor e as barreiras entre o leite e o sangue.

[0141] Numa modalidade da presente invenção, a determinação da ureia pode ser realizada usando o seguinte esquema de reacção: NAGase

4-MU-NAG ----------------> ácido 4-MU ácido 4-MU + Base -► corante 4-MU-fenolato [0142] Aqui, 4-MU-NAG refere-se a 4-metilumbeliferil-N-acetil-beta-D-glicosaminida, ácido 4-MU refere-se a 4-metilumbeliferona e corante 4-MU-fenolato refere-se a um sal de 4-metilumbeliferona.

[0143] Numa modalidade preferida da presente invenção, o dispositivo de vareta de teste é desenvolvido para medir a NSGase de acordo com o esquema de reacção acima referido para detectar a NAGase. Nesta construção, pode ser preferido que a pelo menos uma banda de reacção seja fornecida com um valor de pH de aproximadamente 7,0 e que a banda de regulação seja fornecida com um agente regulador de pH capaz de fornecer um segundo ambiente para o reagente ou combinação de reagentes com pH de aproximadamente 4,6.

[0144] É óbvio para o especialista na área que o primeiro e 50 o segundo ambientes possam ser alterados se estiver a ser realizado um ensaio diferente para a determinação de LDH, BHB, ureia, NAGase ou qualquer outro analito. Adicionalmente, é também óbvia para o especialista a forma de optimizar o primeiro e o segundo ambientes, baseando-se no conhecimento fornecido pelo conceito da presente invenção, nomeadamente, tendo um primeiro ambiente que pode ser criado de forma a favorecer o armazenamento do(s) reagente(s) capaz (es) de reagir com o analito e fornecendo um sinal detectável, e tendo um segundo ambiente que pode ser criado de forma a favorecer o desempenho do(s) reagente (s) capazes de reagir com o analito e que providencia um sinal detectável ou para favorecer a taxa de reacção entre o analito e o(s) reagente (s) capaz (es) de reagir com o analito fornecendo um sinal detectável.

[0145] 0 conceito da presente invenção será posteriormente ilustrado nos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

[0146] Exemplo 1. Preparação e teste de varetas de teste para a LDH.

[0147] Tipo la, construção de camada única, pH 6,8 Preparação da solução de impregnação: [0148] 1,5 g de L-lactato de litio, 3,0 g de β-ΝΑϋ+, 150 mg de polietilenoglicol 20.000, e 1,5 g de sacarose são dissolvidos em 120 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 8,0. Então, são adicionados 1,5 mL de solução de Triton X-100 a 5%, seguidos de 1,5 g de albumina de soro bovino (BSA) , 30 KU de diaforase e 150 mg de nitroazul de tetrazólio (NTB) . 51 É adicionado tampão fosfato 0,1 M, pH 8,0, para perfazer 150 mL no total e a solução é agitada. O pH final desta solução é 6,8.

Impregnação de papel: [0149] A solução de impregnação é transferida para uma cuba de aço inoxidável. Uma folha de papel de filtro 20x20 cm (e.g. Whatman 3MMChr) é impregnada na solução de impregnação, pH 6,8, durante cerca de 10 segundos. Então, o papel de filtro é removido da solução de impregnação e deixado a escorrer na vertical durante cerca de 30 segundos preso com um clipe limpo. Podem ser impregnadas 10 ou 11 folhas no total.

Secagem: [0150] As folhas de papel de filtro impregnadas são secas num forno bem ventilado a 38-42 °C até estarem secas (aprox. 45 minutos). Os papéis de filtro secos podem ser mantidos em sacos selados de folha de alumínio com um agente de secagem a cerca de 4-6 °C até à utilização.

Corte: [0151] A folha impregnada é cortada em tiras de 5 mm de largura e.g. numa cortadora rotativa e, depois, as tiras são cortadas em quadrados de 5 mm x 5 mm cortando as tiras ortogonalmente, e.g. numa cortadora rotativa.

[0152] Tipo lb, construção de camada única, pH 8,3 Preparação da solução de impregnação: [0153] 1,5 g de L-lactato de lítio, 3,0 g de β-ΝΑϋ+, 150 mg de polietilenoglicol 20.000, e 1,5 g de sacarose são dissolvidos em 120 mL de tampão Tris-HCl 0,1 M pH 9,0. 52

Então, são adicionados 1,5 mL de solução de Triton X-100 a 5%, seguidos de 1,5 g de albumina de soro bovino (BSA), 30 KU de diaforase e 150 mg de nitroazul de tetrazólio (NTB) . É adicionado tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 9,0, para perfazer 150 mL no total e a solução é agitada. 0 pH final desta solução é 8,3.

Impregnação de papel: [0154] A solução de impregnação é transferida para uma cuba de aço inoxidável. Uma folha de papel de filtro 20x20 cm (e.g. Whatman 3MMChr) é impregnada na solução de impregnação, pH 8,3, durante cerca de 10 segundos. Então, o papel de filtro é removido da solução de impregnação e deixado a escorrer na vertical durante cerca de 30 segundos preso com um clipe limpo. Podem ser impregnadas 10 ou 11 folhas no total.

Secagem: [0155] As folhas de papel de filtro impregnadas sao secas num forno bem ventilado a 38-42 °C até estarem secas (aprox. 45 minutos). Os papéis de filtro secos podem ser mantidos em sacos selados de folha de alumínio com um agente de secagem a cerca de 4-6 °C até à utilização.

Corte: [0156] A folha impregnada é cortada em tiras de 5 mm de largura e.g. numa cortadora rotativa e, depois, as tiras são cortadas em quadrados de 5 mm x 5 mm, cortando as tiras ortogonalmente, e.g. numa cortadora rotativa.

[0157] Tipo 2, construção de camada dupla, pH 6,8 na banda de reacção, pH ~12 na banda de regulação 53 [0158] Preparaçao da solução de impregnação para a banda de reacção (pH 6,8): [0159] 1,5 g de L-lactato de lítio, 3,0 g de β-ΝΑϋ+, 150 mg de polietilenoglicol 20.000, e 1,5 g de sacarose são dissolvidos em 120 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 8,0. Então, são adicionados 1,5 mL de solução de Triton X-100 a 5%, seguidos de 1,5 g de albumina de soro bovino (BSA), 30 KU de diaforase e 150 mg de nitroazul de tetrazólio (NTB). É adicionado tampão fosfato 0,1 M, pH 8,0, para perfazer 150 mL no total e a solução é agitada. O pH final desta solução é 6,8.

Impregnação da banda de reacção: [0160] A solução de impregnação é transferida para uma cuba de aço inoxidável. Uma folha de papel de filtro 20x20 cm (e.g. Whatman 3MMChr) é impregnada na solução de impregnação, pH 6,8, durante cerca de 10 segundos. Então, a banda de reacção é removida da solução de impregnação e deixada a escorrer na vertical durante cerca de 30 segundos presa com um clipe limpo. Podem ser impregnadas 10 ou 11 folhas no total.

Secagem da banda de reacção: [0161] As folhas de banda de reacção impregnadas são secas num forno bem ventilado a 38-42 °C até estarem secas (aprox. 45 minutos). As bandas de reacção secas podem ser mantidas em sacos selados de folha de alumínio com um agente de secagem a cerca de 4-6 °C até à utilização.

Preparação da solução de impregnação para a banda de regulação (pH 12): 54 [0162] 50 g de TRIS (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol) são dissolvido em 200 mL de água desionizada para obter uma solução com pH~12.

Impregnação da banda de regulação: [0163] A solução de impregnação é transferida para uma cuba de plástico. Uma folha de limpeza com 10x20 cm (e.g. Asahi Berncot PS-2) é impregnada na solução de impregnação pH ~12 durante cerca de 30 segundos. Então a banda de regulação é removida da solução de impregnação e colocada na horizontal num tabuleiro de rede de aço inoxidável. Aproximadamente 25 folhas de bandas de regulação podem ser impregnadas no total.

Secagem da banda de regulação: [0164] As bandas de regulação são secas num forno bem ventilado a 38-42 °C até estarem secas (aprox. 10 minutos). As folhas de limpeza podem ser guardadas em sacos selados de folha de aluminio com um agente de secagem a cerca de 4-6 °C até à utilização.

Laminação da banda de reacção impregnada com pH 6,8 e banda de regulação impregnada pH ~12: [0165] Uma película fina de cola em spray (e.g. 3M #75) é aplicada a um lado da banda de regulação impregnada. Uma folha da banda de reacção impregnada, cortada 10x20 cm, é colocada numa superfície horizontal limpa, a folha de banda de regulação com cola pulverizada é colocada em cima da banda de reacção e as duas camadas são laminadas uma à outra aplicando pressão com um rolo de borracha. As arestas da folha laminada são cortadas para eliminar qualquer material não laminado. As folhas laminadas podem ser 55 guardadas em sacos selados de folha de alumínio com um agente de secagem a cerca de 4-6 °C até à utilização.

Corte: [0166] A folha laminada é cortada em tiras de 5 mm de largura e.g. numa cortadora rotativa e, depois, as tiras são cortadas em quadrados de 5 mm x 5 mm, cortando as tiras ortogonalmente, e.g. numa cortadora rotativa. Os quadrados são organizados de forma a que o lado do papel de filtro fique virado para cima.

Teste de desempenho das varetas de LDH tipos la, lb e 2 [0167] 0 teste de desempenho foi realizado do seguinte

modo: Uma série de calibração de LDH em leite foi preparada fresca adicionando 0, 100, 500 e 1000 U/L de enzima LDH (Sigma #L1378 de músculo bovino) a leite UHT. 10 pL de leite da série de calibração foram adicionados a uma vareta a 25°C, que foi então incubada a 25 °C durante 5 minutos. O desenvolvimento da cor na vareta foi avaliado por espectrofotometria num comprimento de onda de 520 nm.

[0168] Os resultados experimentais das medições com varetas de tipos la, lb e 2 estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Curvas de calibração com varetas de tipos la, lb e 2. LDH 1 (U/L) | Tipo la (Tipo | lb Tipo 2 jpH 6, 8 18,3 "6,8 comb. 12 -> 8,3" (Ver i: exemplo 3 abaixo) 0 | 0,78 lo, 76 0,77 íoo | 0,72 |0,57 0,58 56 LDH 1 iÍTipo | Tipo Tipo 2 (U/L) 1 il 1 a | lb 500 | 0, 67 1 0,42 i—1 o 1000 | ! 0,60 10,34 0,33 [0169] A vareta tipo la, que foi impregnada a pH 6,8, origina uma curva de calibração relativamente rasa, onde o intervalo dinâmico é de 0,18. A vareta tipo lb, que foi impregnada a pH 8,3, origina uma curva de calibração relativamente abrupta, onde o intervalo dinâmico é de 0,42. A vareta de tipo 2, que é constituída por uma banda de reacção impregnada a pH 6,8 combinada com uma banda de regulação impregnada a pH 12, origina uma curva de calibração relativamente abrupta bastante similar à do tipo lb, com um intervalo dinâmico de 0,44.

[0170] Teste de estabilidade acelerada das varetas de LDH tipos la, lb e 2 [0171] Foi conduzido um teste de estabilidade acelerada armazenando varetas dos três tipos la, lb e 2, respectivamente, em sacos de folha de alumínio selados com um agente de secagem a 37 °C durante 1 semana. Após este período, foi conduzido um teste de desempenho como descrito acima. É geralmente aceite que se o desempenho não se alterar após uma semana a 37 °C em sacos de folha de alumínio fechados, as varetas podem ter um tempo de armazenamento de pelo menos 12 meses a 4 °C em sacos de folha de alumínio fechados. Deste modo, um teste de estabilidade acelerada fornece uma boa indicação da estabilidade real a longo prazo do material testado. 57 [0172] Os resultados experimentais obtidos com varetas de tipos la, lb e 2, respectivamente, estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Estabilidade acelerada de varetas de tipos la, lb e 2. LDH I Tipo |Tipo Tipo 2 (U/L) | la 1 lb jpH 6, 8 ! 8,3 "6,8 comb. 12 exemplo 3 abaixo) 0 1 0,77 |θ, 63 0,77 100 | 0,72 10,54 0,57 500 | 0, 68 !0,42 0,41 1000 | 0, 60 jo, 35 0,33 [0173] A vareta de tipo la, que foi impregnada a pH 6,8, produz praticamente a mesma curva de desempenho após 1 semana de envelhecimento acelerado, tal como atrás. A vareta de tipo lb, que foi impregnada a pH 8,3, apresenta uma curva de calibração muito mais rasa após 1 semana de envelhecimento acelerado, quando comparada com o mesmo tipo de varetas sem envelhecimento acelerado. A vareta de tipo 2, que é constituída por uma banda de reacção impregnada a pH 6,8 combinada com uma banda de regulação impregnada a pH 12, origina uma curva de desempenho praticamente idêntica após 1 semana de envelhecimento acelerado, tal como atrás.

[0174] A vareta de tipo 2 revela, assim, um desempenho tão bom quanto o da vareta de tipo lb e a mesma estabilidade de armazenamento do que a vareta de tipo la. 58

Exemplo 2. Selecção do pH óptimo em relação ao desempenho e à estabilidade, respectivamente a. Construção de vareta com uma camada para medição de LDH; variação de pH do liquido de impregnação.

[0175] Teste 1 (tampão de fosfato, pH final 6,81) : 0 líquido de impregnação foi preparado a partir de tampão fosfato 100 mM (pH 8,0), lactato (10 mg/mL), NAD+ (20 mg/mL), diaforase (200 U/mL) e NTB (2 mg/mL) para produzir um pH final de 6,81. Papel Whatman 3MMChr foi impregnado e seco num forno a 40 °C durante 1 hora. Foram cortados quadrados de 5x5 mm do papel impregnado e foram fixados em compartimentos de plástico.

[0176] Teste 2 (tampão Tris, pH final 8,18) : O líquido de impregnação foi preparado a partir de tampão Tris 100 mM (pH 9,0), lactato (10 mg/mL), NAD+ (20 mg/mL) , diaforase (200 U/mL) e NTB (2 mg/mL) para produzir um pH final de 8,18. Papel Whatman 3MMChr foi impregnado e seco num forno a 40 °C durante 1 hora. Foram cortados quadrados de 5x5 mm do papel impregnado e foram fixados em compartimentos de plástico.

[0177] Série LDH Standard: Painéis de LDH foram preparados a partir de LDH da Sigma (L-2525) em leite UHT com as seguintes actividades: 0 U/L, 100 U/L, 500 U/L e 1000 U/L.

[0178] As varetas foram testadas adicionando 8 pL de LDH

Standard a 25 °C. Tempo de incubação: 5 minutos.

Resultados de desempenho da vareta: 59 [0179] Os resultados de desempenho estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: Estudo do desempenho dos testes 1 e 2.

Teste Reflectância em Q, O ;Δ0-ιοοο 0 U/L 1100 U/L Ϊ 5 0 0 U/L 1000 U/L j N.° 1, pH 6, 81 80 ] 7 6 167 160 ] 2 0 N.° 2, pH 8, 18 65 ] 57 14 2 35 130

Os resultados mostram que a diferença na reflectância na gama 0-1000 U/L é significativamente maior com varetas preparadas a pH 8,18 em tampão TRIS do que com varetas preparadas a pH 6,81 em tampão fosfato. Isto significa que a sensibilidade é superior com varetas preparadas a pH 8,18 em tampão TRIS do que com varetas preparadas a pH 6,81 em tampão fosfato.

Resultados de estabilidade da vareta: [0180] As varetas foram mantidas em sacos selados de folha de alumínio com um agente de secagem a 4, 30 e 37 °C, respectivamente, durante 1 semana. As varetas foram então testadas como descrito acima e os resultados estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2: Teste de varetas a partir do estudo estabilidade dos testes 1 e 2. Experiênci | Temp. de jReflectância em % a | armazenamento °C ]o h 00 500 1000 ju/L ju/l. U/L ju/L N.° 1, pH 4 i78,8 j 77,3 69,5 | 63, 1 i—1 oo K£> 30 177,7 (76, 3 69,0 | 62, 8 60

Experiênci | Temp. de Reflectância em % a s armazenamento °C | 37 0 U/L 77,1 100 U/L 73, 8 500 U/L 67,4 1000 U/L 59, 9 N.° 2, pH ! 4 64,4 58,0 43, 1 36, 1 8, 18 _...._______...... ....._________..... ....------------....... ............-----....... -------------.......—.... I 30 59, 6 54,8 41,5 34,7 | 37 53, 1 48,8 38, 8 33, 9

Varetas preparadas a pH 6, 81 em tampão fosfato apresentam apenas um desvio mínimo ao passar de 4 para 30°C e daí para 37°C. Pelo contrário, varetas preparadas a pH 8,18 em tampão TRIS revelam uma redução significativa dos valores da reflectância na extremidade final da gama de actividade reduzida de LDH. Os resultados mostram gue a estabilidade de varetas preparadas a pH 6,81 em fosfato tampão é significativamente maior do que a de varetas preparadas a pH 8,18 em tampão TRIS.

b. Construção de vareta com uma camada para medição de LDH; variação de pH da amostra de LDH

[0181] Teste 3 (ajuste de pH efectuado usando tampao TRIS):

As varetas foram preparadas de acordo com o método do Teste 1 acima. Série LDH Standard em leite:

Série 0 U/L: Uma série Standard de leite UHT sem gualquer LDH adicionado, mas com pH ajustado em valores discretos no intervalo de 6,55 a 8,84, foi preparada misturando leite UHT com leite UHT adulterado com tampão TRIS (100 mM). Os valores 61 discretos de pH são: 6,55, 7,20, 7,83, 8,13, 8,33, 8,44, 8,57, 8,64, 8,72, 8,77 e 8,84. Série 175 U/L: Uma série Standard de leite UHT com 175 U/L LDH adicionado, e com o pH ajustado em valores discretos no intervalo de 6,55 a 8,84, foi preparada misturando leite UHT contendo LDH 175 mM com leite UHT contendo LDH 175 mM e adulterado com tampão TRIS (100 mM) . Os valores discretos de pH são os fornecidos acima. Série 350 U/L: Uma série Standard de leite UHT com 350 U/L LDH adicionado, e com o pH ajustado em valores discretos no intervalo de 6,55 a 8,84, foi preparada misturando leite UHT contendo LDH 350 mM com leite UHT contendo LDH 350 mM e adulterado com tampão TRIS (100 mM) . Os valores discretos de pH são os fornecidos acima.

As varetas foram testadas adicionando 10 pL de LDH Standard a 25°C. Tempo de incubação: 5 minutos.

Resultados de desempenho da vareta: [0182] Os resultados de desempenho estão apresentados na Tabela 3.

Tabela 3: Teste de varetas com LDH em amostras de leite ajustadas para vários valores de pH usando tampão TRIS.

Teste

Reflectância em %

0-350

0 U/L 1175 U/L

350 U/L 3A, PH 6,55 73, 7 158,0 149,4 |24,3 3B, PH 7,20 73, 3 )55,0 :! 4 6, 5 j 2 6, 8 3C, PH 7, 83 74,0 150,1 14 4,6 j 2 9, 4 62

Teste Reflectância em % \ Δο-350 0 U/L 1175 U/L 350 U/L 3D, pH 8, 13 71,7 ! 4 6, 8 38,8 132, 9 3E, pH 8, 33 71, 6 I 41,7 33, 8 ]37,8 3F, pH 8, 44 71, 1 135, 4 29, 8 141,3 3G, pH 8, 57 68, 9 134,1 27,4 141,5 3H, pH 8, 64 68,2 32,5 27,1 141, 1 31, pH 8, 72 68,7 ] 31, 9 26, 0 142,7 3 J, pH 8, 77 66, 0 131,7 24, 6 141,4 3K, pH 8, 84 68,0 131,4 24, 6 )43,4

Os resultados mostram que o desempenho melhora com valores de pH crescentes do LDH em amostras de leite. A melhoria no desempenho tende a estabilizar num valor de pH em torno de 8,4.

Conclusão: [0183] Estes testes demonstram que as melhores condições de pH para o desempenho óptimo para determinação de LDH nas presentes condições são usar o tampão TRIS num pH de cerca de 8,18, condição na qual a estabilidade de armazenamento revelou ser fraca. Por outro lado, para melhorar a estabilidade de armazenamento, o valor do pH deverá ser reduzido e foi demonstrado que um pH de cerca de 6, 81 é significativamente melhor a nivel da estabilidade de armazenamento do que um pH de 8,18.

[0184] Assim, o valor de pH inicial da banda de regulação pode ser determinado por ensaios de tentativa e erro e quando combinado com o valor de pH (pH 6,81) que fornece 63 uma maior estabilidade de armazenamento, irá fornecer um desempenho óptimo (ou quase óptimo) à vareta.

[0185] Além disso, também ficou demonstrado que a presente invenção fornece um sistema estável ou dispositivo de vareta de teste em que desvios menores do valor de pH óptimo da banda de requlação têm um efeito limitado ou não têm qualquer efeito no desempenho do dispositivo de vareta, o que ressalta do teste 3F ao 3K. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [0186] • US 3.867.259 (por Forgione) • Lippenheide et al. (1995) • US 4.215.995 • Trevor Palmer, 2a edição, "Understanding Enzymes publicado em 1985 US 3 . 901 . 657 US 4 .732 .736 US 4 . 959 .305 US 2 004/219694 US 2 005/260695 US 4 .438 .067 US 4 .454 .094 FR 2 .191 .734 US 2 003/ 073073 64

Claims (12)

1. Re ivindi caçõe s 1. Um dispositivo de vareta de teste para a determinação de um analito numa amostra, o referido dispositivo caracterizado por compreender: (i) um suporte sólido opcional, (ii) pelo menos uma banda de reacção que compreende um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir ao analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça um sinal detectável quando num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), o referido primeiro ambiente permitindo uma melhor estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta de teste quando num estado não humedecido, (iii) uma banda reguladora que está em contacto com a pelo menos uma banda de reacção, criando um segundo ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), quando num estado húmido, o referido segundo ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o(s) reagente(s), e em que a amostra é aplicada a uma superfície do dispositivo de vareta de teste e o sinal detectável é detectado na mesma; em que a determinação do analito é baseada em enzimas; em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima (s); em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que se aproxima do valor de pH óptimo da(s) 1 enzima(s); e em que os diferentes ambientes têm diferentes valores de pH.
2. 2. Um dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o analito ser seleccionado do qrupo que consiste numa proteína, uma enzima como a catalase, a lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina, fosfatase ácida, carboxilesterase, arilo-esterase, β-glicuronidase, lactoperoxidase, lipase, lisozima, xantina oxidase, plasmina e beta-N-acetil-hexosaminidase (NAGase), prostaglandina-sintase D (PGDS), uma gordura, um hidrato de carbono, um antibiótico, um esteróide, uma vitamina, uma composição química como a ureia, triglicéridos e corpos cetónicos, tais como o acetoacetato, beta-hidroxibutirato (BOHB), acetona, ácido ascórbico, nitratos, urobilinogénio, colesterol, e esteróides como pregnenolona, progesterona, testosterona, di-hidrotestosterona, estrona, estradiol, cortisol, cortisona, aldosterona, corticosterona, androstenediona, 17a-0H-pregnenolona, 17a-0H-progesterona, 11-desoxicorticosterona, 11-desoxicortisol e dehidroepiandrosterona, hormona luteinizante ou gonadotrofina coriónica humana, uma célula, como um leucócito e uma substância de abuso e sangue.
3. 3. Um dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por pelo menos uma banda de reacção estar localizada em relação à banda reguladora de modo a evitar a precipitação de um componente da amostra, na face superior do dispositivo.
4. 4. Um dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o primeiro ambiente ser criado de forma a favorecer a estabilidade de 2 armazenamento do(s) reagente(s) capaz (es) de reagir com o analito e fornecer um sinal detectável.
5. 5. Um método para ensaiar um analito numa amostra de leite, caracterizado por compreender os passos de: (i) aplicar a amostra de leite suspeita de conter o analito a uma banda de reacção, (ii) permitir que a amostra migre para a banda de reacção que compreende um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir com o analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça um sinal detectável quando estiver num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), o referido primeiro ambiente permitindo uma elevada estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta de teste quando num estado não humedecido, (iii) permitir que a amostra, sozinha ou com o reagente, migre da banda de reacção para uma banda reguladora, estando a referida banda reguladora em contacto com a banda de reacção, a banda reguladora criando um segundo ambiente para o referido reagente quando num estado humedecido, o referido segundo ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o(s) reagente(s), (iv) permitir que o regente e o analito, o derivado do referido analito ou o composto indicador para o referido analito forneçam um sinal detectável, e (v) detectar o sinal detectável na mesma superfície onde a amostra foi aplicada e 3 em que a determinação do analito é baseada em enzimas; em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima(s); em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que se aproxima do valor de pH óptimo da(s) enzima(s) e em que os diferentes ambientes têm diferentes valores de pH.
6. 6. Um método de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o analito ser seleccionado do grupo composto por uma proteína, uma enzima como catalase, lactato desidrogenase (LDH), fosfatase alcalina, fosfatase ácida, carboxilesterase, arilo-esterase, β-glucuronidase, lactoperoxidase, lipase, lisozima, xantina oxidase, plasmina e beta-N-acetil-hexosaminidase (NAGase), prostaglandina D sintase (PGDS), uma gordura, um hidrato de carbono, um antibiótico, um esteróide, uma vitamina, um composto químico como a ureia, triglicéridos e corpos cetónicos, tais como acetoacetato, beta-hidroxibutirato (BOHB), acetona, ácido ascórbico, nitratos, urobilinogénio, colesterol, e esteróides como pregnenolona, progesterona, testosterona, di-hidrotestosterona, estrona, estradiol, cortisol, cortisona, aldosterona, corticosterona, androstenediona, 17a-0H-pregnenolona, 17a-0H-progesterona, 11-desoxicorticosterona, 11-desoxicortisol e dehidroepiandrosterona, hormona luteinizante ou gonadotrofina coriónica humana, uma célula, como um leucócito e sangue.
7. 7. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-6, caracterizado por o primeiro ambiente ser criado de forma a favorecer a estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) capaz (es) de reagir com o analito e fornecer um sinal detectável. 4
8. 8. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, caracterizado por o segundo ambiente ser criado de forma a favorecer a taxa de reacção entre o analito e o(s) reagente(s) capaz (es) de reagir com o analito fornecendo um sinal detectável.
9. 9. Um método para a preparação do dispositivo de vareta de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por o dito método compreender os passos de: (i) fornecer uma banda de reacção através da impregnação de um primeiro material poroso com uma solução aquosa que inclui um reagente ou uma combinação de reagentes capazes de reagir com o analito, um derivado do referido analito ou um composto indicador para que o referido analito forneça um sinal detectável quando num estado humedecido, a pelo menos uma banda de reacção fornecendo um primeiro ambiente para o(s) referido(s) reagente(s), o referido primeiro ambiente permitindo uma estabilidade de armazenamento do(s) reagente(s) e do dispositivo de vareta, (ii) seguidamente, secar a banda de reacção, (iii) fornecer uma banda reguladora impregnando um segundo material poroso com uma solução aquosa, criando um segundo ambiente para o(s) referido (s) reagente (s) quando num estado húmido, o referido segundo ambiente permitindo uma taxa de reacção aumentada entre o analito e o reagente, (iv) seguidamente, secar o segundo material poroso impregnado, e 5 (v) colocar a banda de reacção em contacto com a banda reguladora, opcionalmente num suporte sólido, para obter o dispositivo de vareta de teste e em que o dispositivo de vareta de teste é baseado numa determinação baseada em enzimas e em que a condição no primeiro ambiente é fornecida ajustando o valor do pH para um valor que se desvia do valor de pH óptimo da(s) enzima(s); em que a condição no segundo ambiente é fornecida regulando o valor do pH para um valor que aproxima o valor de pH óptimo da ( s) enzima(s) e em que os diferentes ambientes têm diferentes valores de pH.
10. 10. Um método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por pelo menos uma banda de reacção estar localizada em relação à banda reguladora de modo a evitar a precipitação de um componente da amostra, na face superior do dispositivo.
11. 11. Um método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o componente da amostra ser seleccionado do grupo composto por proteínas, hidratos de carbono, gorduras, células ou outros componentes presentes na amostra.
12. 12. Uso de um dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 caracterizado por ser usado para a determinação de um analito numa amostra. 6