PT1987357E - Polipéptidos reconhecidos pelos anticorpos antitrichinella e respectivas utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

POLIPEPTIDOS RECONHECIDOS PELOS ANTICORPOS ANTI-TRICHINELLA E RESPECTIVAS UTILIZAÇÕES A presente invenção tem por objecto a utilização de novos antigénios identificados no parasita Trichinella, no quadro do diagnóstico e da prevenção da triquinelose. A triquinelose é uma zoonose associada ao consumo de carne infestada com o parasita Trichinella (MURRELL et al., 2000) .

Este nemátodo da classe dos Adenophorea pertence à familia das Trichinellidae que inclui 8 espécies e três genótipos afins em 2 grupos filogeneticamente distintos: por um lado as triquinas encapsuladas (T. spiralis; T. nativa; T. britovi; T. murrelli; T. nelsoni) que infestam os mamíferos e, por outro lado, as triquinas não encapsuladas (τ. pseudospiralis; T. papuae; T. zimbabwensis) que infestam mamíferos, aves e répteis (GASSER et al, 2004 ) . Todas estas espécies podem infectar os seres humanos. O ciclo biológico do parasita é auto-heteróico: ocorre inteiramente num único hospedeiro que é sucessivamente o hospedeiro definitivo (portador de parasitas adultos) e o hospedeiro intermédio (portador de larvas infestantes) (BOIREAU et al, 2002). A passagem de larvas infestantes de um hospedeiro para outro é necessária para a realização de um ciclo novo. Essa passagem faz-se através da ingestão de carne crua ou mal cozida contaminada com larvas. Durante a digestão, elas são libertadas e penetram no epitélio intestinal onde se irão transformar em vermes adultos (Ad) 1 sexuados. As fêmeas fecundadas expulsam em seguida as larvas LI recém-nascidas (LlRN) que atingem os músculos estriados através da circulação sanguínea e linfática. Estas larvas LlRN penetram nas células musculares (fase de crescimento infestante LlM: larva Ll muscular) onde provocam a desdiferenciação em células viveiros cercadas por uma espessa cápsula protectora do colagénio no caso das triquinas encapsuladas e muito fina no caso das triquinas ditas não encapsuladas.

Enquanto a triquinelose é assintomática nos animais, a infestação humana traduz-se, na fase intestinal inicial, por diarreias associada a náuseas, vómitos e dores abdominais violentas, enquanto os sintomas ligados à fase de invasão muscular caracterizam-se pela combinação de febre, edema facial e mialgias (CAPO & DESPOMMIER, 1996) . Doenças oculares, pulmonares, gastrointestinais, cardíacas e neurológicas podem vir completar este quadro clínico da triquinelose, cuja evolução pode ser mortal. 0 carácter crónico da infestação, caracterizado pela persistência das dores musculares nos pacientes, está associado à sobrevivência do parasita na célula viveiro. 0 tratamento específico da triquinelose em seres humanos por meio de anti-helmínticos é tanto mais eficaz quanto mais precoce for o diagnóstico da infestação, para permitir uma acção contra todas as fases parasitárias e especialmente antes da formação da cápsula protectora de colagénio ao redor das larvas LlM (FOURESTIE et al., 1988).

Os dados epidemiológicos têm mostrado uma distribuição geográfica do parasita em todas as latitudes, associada a um modo de transmissão envolvendo muitas espécies de animais selvagens que também mantêm um ciclo de infestação 2 doméstico, representado principalmente pelo porco (DUPOUY-CAMET, 2000).

As epidemias de triquinelose humana, zoonoses emergentes ou re-emergentes, são um verdadeiro problema de saúde pública em todo o mundo por causa dos hábitos alimentares e dos controlos sanitários nem sempre eficazes (MURRELL & POZIO, 2000) . Estas epidemias envolvem principalmente a carne de porco e de javali, assim como a de cavalo (BOIREAU et al., 2000). A prevenção da contaminação humana exige, portanto, que a carne seja bem passada e uma melhoria das condições de criação de animais e/ou de controlo da triquinelose animal (suinos, cavalos, javalis e outras espécies animais susceptiveis à Trichinella) (BOIREAU et al., 2002).

As técnicas de despistagem da triquinelose dividem-se em duas categorias: 1) detecção directa de larvas L1M, por triquinoscopia (observação microscópica de um fragmento de carne) ou após a digestão artificial de amostras de músculos e 2) detecção indirecta por diferentes EGPA-SDSs imunológicos que permitem a detecção de anticorpos dirigidos contra os antigénios de Trichinella. A cada uma das fases de desenvolvimento do parasita: adulto (Ad), larvas recém-nascidas (LlRN) e larvas musculares (L1M), corresponde um determinado perfil antigénico.

Actualmente utilizam-se preparações antigénicas de larvas no estádio LlM para o imuno-diagnóstico. Com efeito, as fracções antigénicas das duas fases precoces Ad e LlRN são dificeis de purificar e, até hoje, não foram 3 identificados antigénios imuno-dominantes associados com uma ou com a outra dessas duas etapas.

Utiliza-se principalmente quer preparações de antigénios totalmente solúveis, obtido por lise das larvas, centrifugação do lisado e recuperação do sobrenadante, quer então, mais frequentemente, antigénios de excreção/secreção (antigénios E/S).

Os antigénios de excreção - secreção são produzidos durante a sobrevivência das larvas LlM em meio de cultura; provêm de um determinado órgão, denominado sticosoma, que consiste em cinquenta células discóides, os sticocitos. Os sticocitos contêm grânulos, cujos conteúdos são descarregados através de um canaliculo na luz do esófago do parasita. Este conteúdo, que é altamente antigénico, constitui uma parte dos antigénios de excreção - secreção. Estes antigénios formam uma mistura complexa de proteínas, contendo, nomeadamente, um grupo de glicoproteínas (chamados antigénios TSL1), tendo uma molécula glicidílica particular, conhecida apenas na Trichinella e presente em todas as espécies deste parasita, a beta-tivelose.

As preparações de antigénios de excreção - secreção que actualmente são utilizadas como referência para o imuno-diagnóstico da triquinelose obtêm-se a partir do meio de cultura de larvas LlM de Trichinella spiralis. Após 18 a 20 horas de cultura, o meio é recuperada por filtração e depois concentrado (Gamble et al, 1983; Gamble et al, 1988) .

As preparações de antigénio totalmente solúveis têm como principal desvantagem a sua falta de especificidade. Observam-se frequentemente reacções antigénicas cruzadas 4 com outras parasitoses. Os antigénios de excreção secreção permitem obter uma melhor especificidade. No entanto, em ambos os casos, é difícil de produzir em grandes quantidades lotes padronizados de antigénio.

As sequências de ADN que codificam o antigénio E/S e as suas utilizações para a produção de antigénios úteis para o diagnóstico ou a vacinação contra a infecção por T. spiralis, estão divulgadas na patente US5422263.

Os antigénios de Trichinella e os seus epitopos imuno-dominates foram revistos por Boireau et al., MULTIDISCIPLINARITY FOR PARASITES, VECTORS AND PARASITIC DISEASES, VOL 1 MEDIMOND PUBLISHING CO, VIA RUBBIANI 6/2, 40124 BOLOGNA, ITÁLIA, páginas 181-188; 2004. A estrutura sacaridica contendo beta-tivelose, representando um epitopo imuno-dominante das preparações de antigénio E/S (REASON et al 1994; patentes U.S. 5.541.075 e 5.707.817) foi sintetizada quimicamente e foi proposta a sua utilização para o imuno-diagnóstico da Trichinella.

Este reagente tem boa especificidade, mas a sua sensibilidade parece menor do que a das preparações de antigénios E/S. Além disso, a sintese desta estrutura, por via quimica, é ainda cara e pesada de implementar.

Um outro problema encontrado no quadro do diagnóstico serológico de Trichinella é a existência de uma "janela cega" de detecção correspondente aos estádios precoces da infestação, que se traduz por resultados falsamente negativos. Além disso, no cavalo, observou-se o desaparecimento progressivo dos anticorpos 25 semanas após a infestação. 5

Os requerentes identificaram antigénios imuno-dominantes associados aos estádios precoces da infestação com Trichinella e que se podem utilizar no diagnóstico serológico da triquinelose, a fim de fornecer os meios para se conseguir uma detecção precoce, especifica e sensível das infestações com Trichinella tanto em seres humanos como em animais. Para este fim, pesquisaram a existência, entre os produtos dos genes expressos por Trichinella no estádio LlRN e/ou no estádio Ad, de proteínas que possuíssem as propriedades antigénicas desejadas.

Neste contexto, descobriram que uma proteína de Trichinella spiralis, que faz parte das proteínas expressas especificamente no estádio LlRN neste organismo, constituía um antigénio imuno-dominante, que permitia uma detecção precoce da resposta humoral contra Trichinella e que, além disso, estava conservada entre as diferentes espécies de Trichinella.

Esta proteína será denominada, daqui para a frente, por NBLl. A sequência completa de ADNc que codifica para esta proteína assim como a sequência polipeptídica dela deduzida estão disponíveis no GenBank, respectivamente, com os números AF331160 e AAK16520 (aliás Swissprot Q9BJL7); estas sequências estão anotadas como "serina protease SS2, especifica das larvas recém-nascidas". Estas sequências estão igualmente reproduzidas, respectivamente, na lista de sequências em anexo com os números SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Uma sequência parcial de ADNc que codifica para esta proteína, assim como a sequência polipeptídica dela deduzida estão acessíveis no GenBank, respectivamente, com os números AY491941 e AAR36900 (aliás Swissprot Q6RUJ3). 6

Os requerentes também demonstraram que a imuno-reactividade associada com a resposta humoral dirigida contra NBLl está localizada na parte do terminal C desta proteína e identificaram um epítopo imuno-dominante responsável por esta reactividade.

Por outro lado, os requerentes identificaram, a partir de um banco de dados de ADNc as fases precoces mistas Ad+LlRN de Γ. spiralis, um novo gene, designado a seguir por 411. A sequência deste gene está representada na lista de sequências em anexo com o número SEQ ID NO: 3 e a do se produto de tradução com o número SEQ ID NO: 4. 0 produto de tradução deste gene é um produto homólogo (78,7 % de identidade) de um antigénio E/S, designado por proteína Tp21-3, identificada na Γ. pseudospiralis (AAF79206; NAGANO et al, 2001.), assim como o produto de tradução do hipotético ORF 17.20 de T. spiralis (AAB48489), com o qual apresenta uma identidade de 86,6 %. O produto de tradução do gene 411 também permite detectar, numa fase precoce, a resposta humoral dirigida contra diferentes espécies de Trichinella.

Além disso, cada antigénio NBLl e 411 permitiu, durante os ensaios efectuados, detectar animais infestados com Trichinella que não tinha sido detectada nem pelo outro antigénio, nem pelo antigénio E/S, pelo menos durante o período de pós-infecção (pi) D15-D30. A associação do antigénio NBLl (ou de um seu epítopo imuno-dominante) com o antigénio 411 permite assim melhorar 7 a sensibilidade do diagnóstico, nomeadamente nas fases iniciais da infestação (15 a 20 dias após a infestação). A presente invenção, tem assim por objecto a utilização de um polipéptido antigénico reconhecido pelos anticorpos anti-Trichinella como reagente para a detecção de anticorpos anti-Trichinella numa amostra biológica, caracterizada pelo facto de o referido polipéptido ser seleccionado a partir de: a) um polipéptido compreendendo um epítopo imuno-dominante do antigénio NBL1, epítopo esse que é definido pela sequência PSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 5), b) um polipéptido, também designado a seguir por antigénio 411, que compreende os aminoácidos 25-175 da sequência SEQ ID NO: 4 (que representa a forma madura da proteína 411) ou que compreende uma sequência que apresenta uma identidade de pelo menos 80 % e, por ordem crescente de preferência, pelo menos, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade com a sequência dos aminoácidos 25-175 da SEQ ID NO: 4. A presente invenção tem por objecto, mais particularmente, um processo para detectar a presença de anticorpos anti-Trichinella, numa amostra biológica, processo que é caracterizado pelo facto de incluir: o contacto da referida amostra biológica com um ou mais polipéptidos a) e/ou um ou mais polipéptidos b), tal como definidos anteriormente, em condições que permitem a formação de um complexo de antigénio/anticorpo com os anticorpos anti-Trichinella que eventualmente estão presentes na referida amostra; a detecção, por todos os meios apropriados, do complexo de antigénio/anticorpo eventualmente formado.

Geralmente, a referida amostra biológica é uma amostra de soro. Pode ser obtida a partir de qualquer indivíduo (mamíferos, aves ou répteis) pertencendo a uma espécie que pode estar infestada pela Trichinella e no qual se deseja detectar a presença deste parasita. De preferência, trata-se de uma amostra obtida a partir de um mamífero, por exemplo, de um animal de criação ou de um paciente humano.

Com vantagem, utiliza-se uma mistura de um ou mais polipéptidos a) e/ou um ou mais polipéptidos b) tal como definidos antes.

Esta combinação permite, nomeadamente, alargar o espectro de reactividade, em comparação com cada um dos polipéptidos usados individualmente.

Os polipéptidos a) definidos antes, excluindo o antigénio NBLl completo, identificado pelo número de acesso do GenBank AAK16520 e do seu fragmento identificado pelo número de acesso do GenBank AAR36900, também estão incluídos, como tal, no objecto da presente invenção.

Entre os polipéptidos, de acordo com a presente invenção, incluem-se, nomeadamente, os polipéptidos contendo uma ou mais das seguintes sequências: a sequência: PSSGSRPTYPSSGSR (SEQ ID NO: 6); a sequência PSSGSRPTYPYTGSR (SEQ ID NO: 7); a sequência RPTSPSSGSRPTYPS (SEQ ID NO: 8). Isto engloba, por exemplo, fragmentos da região do terminal C do antigénio NBLl: incluem, nomeadamente, os fragmentos contendo a seguinte sequência: 9

ENSPBGTVKWASKEDSPVDLSTASRPTNPYTGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTSPS5GSR PTYPSSGSRPITESSGSRPTYPYTGSRPTPQKRWPSYQKYFP&VQKYIDSLPSGTQGTLÊ YTVTQNGVTTTT (SEQ ID NO:li) correspondente aos aminoácidos 326-459 da SEQ ID NO: 2 e sub-fragmentos desta sequência SEQ ID NO: 11, nomeadamente os que compreendem a seguinte sequência: PSSGSRPTYPSSGSRPTSPSSGSRPTYPSSGSRPTYPSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 9) correspondente aos aminoácidos 363-409 da SEQ ID NO: 2 e, em particular, os que compreendem a seguinte sequência: srptnpytgsrptspssgsrftypssgsrptspssgsrftypssgsrptypssgsrptypy ; TGSRPT (SEQ ID NO: 10) que corresponde aos aminoácidos 349-415 da SEQ ID NO: 2.

Os polipéptidos b) definidos antes, excepto os identificados pelos números de acesso do GenBank AAF79206 e aab48489 fazem parte, como tal, do objecto da presente invenção. Os polipéptidos preferidos incluem, nomeadamente, o polipéptido da SEQ ID NO: 4 ou o polipéptido correspondente aos aminoácidos 25-175 da SEQ ID NO: 4, assim como os polipéptidos que apresentam pelo menos 90 % ou, de preferência, pelo menos 95 % de identidade com a SEQ ID NO: 4 ou com a sequência de aminoácidos 25-175 da sequência SEQ ID NO: 4. A presente invenção inclui, nomeadamente, polipéptidos quiméricos compreendendo uma ou várias cópias da sequência PSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 5) ou um fragmento do antigénio NBLl contendo esta sequência e/ou uma ou mais cópias de um polipéptido b) tal como definidos anteriormente, 10 eventualmente fundidos com uma ou mais de outras sequências heterólogas. A presente invenção também tem por objecto polinucleótidos codificando para polipéptidos de acordo com a presente invenção, assim como vectores recombinantes compreendendo os referidos polinucleótidos e células hospedeiras transformadas pelos referidos vectores. A presente invenção também tem por objecto uma composição compreendendo um ou mais polipéptidos a) e um ou mais polipéptidos b), tal como definido anteriormente, assim como uma composição que compreende um ou mais polinucleótidos codificando para os referidos polipéptidos.

Os polipéptidos a) e b), definidos antes, podem ser utilizados no quadro de diferentes processos de detecção de anticorpos, que são conhecidos por si próprios. A titulo de exemplo, podemos citar, nomeadamente, os processos do tipo ELISA (directo, indirecto ou em sanduíche), os processos de microaglutinação em esferas, assim como os processos de transferência electroforética associada à imuno-coloração. A presente invenção também tem por objecto um estojo para detectar a presença de anticorpos anti-Trichinella numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de compreender ou mais um polipéptidos a) e/ou um ou mais polipéptidos b), como definidos anteriormente e, se for caso disso, tampões e reagentes apropriados para a constituição de um meio de reaccional permitindo a formação de um complexo de antigénio-anticorpo e, eventualmente, meios para a detecção do referido complexo de antigénio/anticorpo. 11

Vantajosamente, o referido estojo é composto por um polipéptido a) e/ou um polipéptido b), tal como definidos anteriormente, imobilizados num suporte sólido. A titulo de exemplos não limitativos de suportes sólidos que se podem utilizar citam-se placas de microtitulação, esferas, micro-esferas ou micro-partículas, tiras estreitas, etc. 0 referido estojo também pode incluir amostras de referência, tal como um ou mais soros negativos e um ou mais soros positivos. A presente invenção também tem por objecto a utilização de um polipéptido a) ou de um polipéptido b), tal como definidos anteriormente, para a preparação de anticorpos dirigidos especificamente contra o referido polipéptido.

Estes polipéptidos podem ser usados no quadro de diferentes processos, conhecidos por si sós, de preparação de anticorpos. Podem, por exemplo (eventualmente após a adição de um adjuvante apropriado) ser utilizados para a imunização de um animal. Também podem ser enxertados num suporte de cromatografia de afinidade, para permitir purificar, a partir de um fluido biológico, os anticorpos especificamente dirigidos contra o polipéptido em causa. 0 fluido biológico pode ser, por exemplo, o soro de um animal previamente imunizado com o polipéptido de interesse ou um sobrenadante de hibridoma; também pode ser soro de um animal infestado com Trichinella, a partir do qual se pode isolar uma sub-população de anticorpos especificamente dirigidos contra o polipéptido em causa. A presente invenção também engloba qualquer anticorpo especificamente dirigido contra um polipéptido a) ou um 12 polipéptido b) tal como definidos antes. Pode tratar-se de anticorpos monoclonais ou policlonais. Os anticorpos preferidos são os que reconhecem o epitopo PSSGSRPTYP (SEQ ID NO: 5).

Os anticorpos especificamente dirigidos contra um polipéptido podem ser obtidos por várias técnicas conhecidas por si mesmas e, especialmente, pelos processos convencionais, que compreende a imunização de um animal com o polipéptido em causa (eventualmente complementado com um adjuvante apropriado) e a recuperação do seu soro (para a produção de anticorpos policlonais) ou das suas células de linfócitos (para produzir anticorpos monoclonais).

Os polipéptidos a) e b) definidos antes, assim como os polinucleótidos codificando para esses polipéptidos podem ser usados para a preparação de composições imunogénicas e, nomeadamente, de vacinas anti-Trichinella. A presente invenção também tem por objecto uma composição imunogénica compreendendo um ou mais polipéptidos a) e/ou um ou mais polipéptidos b), tal como definidos anteriormente ou um ou mais polinucleótidos codificando para os referidos polipéptidos associados a um ou mais adjuvantes para permitir melhorar a resposta imunitária.

De acordo com uma modalidade preferida de realização de uma composição imunogénica, de acordo com a presente invenção, trata-se de uma vacina.

Uma grande variedade de adjuvantes que permitem aumentar a imunogenicidade dos péptidos são conhecidos dos especialistas na matéria: podem ser citados, a titulo de 13 exemplos de adjuvantes, alume (hidróxido de alumínio), adjuvante completo ou incompleto de Freund (ifa), lipossomas e virossomas (envelope virai reconstituído), derivados peptidicos de ácido murâmico, etc. No caso de uma vacina, obviamente escolher-se-á um adjuvante aceitável sob o ponto de vista farmacológico; a título de exemplo de adjuvantes preferidos, incluem-se adjuvantes do tipo emulsão de "água em óleo", por exemplo, os adjuvantes comercializados pela SEPPIC sob os nomes MONTANIDE ISA 70 e MONTANIDE ISA 775, que também estão descritos nas patentes EP 480 982, EP 825 875, US 5.422.109, US 6.251.407, US 6.610.309.

Quando adequado, nomeadamente no caso de péptidos curtos {< 30 aminoácidos), os referidos polipéptidos podem ser acoplados a uma proteína transportadora. A título de exemplo de proteínas transportadoras, podem citar-se, nomeadamente, a KLH (Keyhole Limpet hemocianina [hemocianina da lapa californiana]), a albumina de soro bovino (ASB), albumina do ovo, anatoxina tetânica ou diftérica. Pode-se igualmente formar uma composição multiepitópica, combinando entre si múltiplas cópias de um mesmo péptido e, eventualmente, com outros epítopos peptidicos, sob a forma de polipéptidos quiméricos ou através de uma cadeia de polímeros, por exemplo, uma polilisina.

Se se utiliza como imunogénio um polinucleótido, a composição imunogéncia pode apresentar-se sob a forma de um vector recombinante no qual se inserem os polinucleótidos a administrar. Pode-se utilizar, por exemplo, vectores virais, como poxvírus, adenovírus, retrovírus, lentivírus, vírus do herpes e VAA (vírus adeno-associados), etc. Também 14 pode igualmente apresentar-se sob a forma de uma bactéria não patogéncia, transformado por um ou mais vectores de expressão contendo os referidos polinucleótidos. Também se podem igualmente administrar directamente os polinucleótidos sob a forma de ADN nu ou incorporar em lipossomas. No caso de uma vacina, é preferível usar uma bactéria não patogéncia (por exemplo, um lactobacilo ou uma estripe não patogéncia de Escherichia coli ou de Salmonella suis) ou um vector derivado de uma estripe de vacina virai; por exemplo, um vector derivado de uma estripe de vacina do virus da pseudo-raiva (doença de Aujeszky). A presente invenção vai ser melhor entendida a partir da descrição mais detalhada que se segue, que se refere a exemplos que ilustram a utilização dos antigénios NBLl e 411, para o imuno-diagnóstico precoce da triquinelose.

Legenda das figuras

Figura 1: Sequência da proteína THX-NBLl (Cterm). A sequência proveniente de NBLl está indicada em caracteres a negrito e as sequências provenientes do plasmido pETl02 estão indicadas em itálico.

Figura 2: Imuno-reactividade da proteína THX NBLl (Cterm). M: marcador de peso molecular; 1: soro de suíno negativo; 2: soro de suínos infectados experimentalmente com 20.000 LlM de T. spiralis. Figura 3: Comparação das cinéticas do aparecimento de anticorpos anti-Trichinella detectados por elisa de THX-NBLl (Cterm) ou por ELISA de Ag E/S em soros de suínos infectados com T. spiralis. A: Detecção, por ELISA, de THX-NBLl (Cterm); B:

Detecção, por ELISA, de Ag E/S 15

Em abcissa: número de dias após a infestação; em ordenadas: percentagem de reactividade. 0 limite de detecção do ensaio ELISA está marcado com um traço a negro (44 % para o ELISA de THX-NBLl (Cterm) e 14 % para o ELISA de Ag E/S). As médias e os desvios-padrão da amostra/controlo positivo estão indicados para cada grupo de suínos infectados.

Figura 4: Especificidade do ensaio ELISA para NBLl (Cterm).

Em abcissa: grupo de 230 amostras negativas provenientes de suínos industriais ou suínos criados à solta. As 5 amostras positivas são provenientes de soros de suínos infectados experimentalmente. O limite é igual a 2 vezes o valor médio das amostras negativas. Em ordenada: percentagem de reactividade.

Figura 5: Sequência da proteína THX-411. A sequência proveniente de 411 está indicada a negrito. As sequências provenientes do plasmido estão indicadas em itálico.

Figura 6: Imuno-reactividade da proteína THX-411. 1: soro positivo 50d pi; 2: soro positivo 30d pi; 3: soro negativo -5d; 4: controlo conjugado. M: marcador de pesos moleculares.

Figura 7: Comparação das cinéticas de aparecimento de anticorpos anti-Trichinella detectadas por ELISA para THX-411 ou por ELISA para Ag E/S em soros de suínos infestados com Γ. spiralis.

A: Detecção de THX-411 por ELISA; B: detecção de Ag E/S por ELISA

Em abcissas: número de dias após a infestação; em ordenadas: percentagem de reactividade. O limite de detecção por ELISA está marcado com um traço negro (52 % para THX-411 por ELISA e 14 % para Ag E/S por ELISA).

As médias e os desvios-padrão da relação 16 amostra/controlo positivo, estão indicados para cada grupo de suinos infestados. EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE THX-NBL1 (CTERM), COMPREENDENDO UMA PORÇÃO DO TERMINAL C DE NBL1.

Fez-se um imuno-rastreio de um banco de dados de ADNc de LIRN de Trichinella spiralis com um soro de suino obtido 35 dias após a infestação experimental com 10.000 LlM de Γ. spiralis. A sequenciação dos clones reconhecidos por este soro permitiu determinar que a maioria deles codificava para uma mesma proteína.

Esta proteína é uma protease com uma putativa serina, cuja sequência de ADNc e a sequência de aminoácidos dela deduzida, estão disponíveis no GenBank respectivamente com os números AF331160 e AAK16520 e estão igualmente reproduzidas aqui com os números de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. É denominada aqui por NBL1.

Uma porção da parte do terminal C da proteína foi amplificada com a ajuda dos oligonucleótidos NBLICtermF (5'-CACCGAAAATTCTCCTGAAGGA-3') (SEQ ID NO: 12) e NBLICtermR (5'-TGTTGTTGTAGTAACTCC-3' ) (SEQ ID NO: 13) e a ADN polimerase AccuPrime Pfx ADN polimerase (Invitrogen) e foi clonada no plasmido pET102D/TOPO usando o estojo de expressão «Champion pEH02 Directional TOPO», de acordo com as recomendações do fabricante (Invitrogen). O plasmido recombinante resultante, denominado pET102-NBL1 (Cterm) codifica para uma proteína de fusão tiorredoxina-NBLl (Cterm) (THX-NBLl (Cterm), de 291 AA, comportando, na posição do terminal C, um marcador de poli- 17 histidina. A sequência desta proteína de fusão está representada na figura 1. A proteína de fusão THX-NBLl (Cterm) foi expressa nas bactérias BL21 Star (DE3), BL21 (DE3) pLis de E. coli (Invitrogen) transformadas pelo plasmido pETl02-NBLl (Cterm) e purificadas por cromatografia de afinidade em condições desnaturantes numa coluna Ni-NTA (estojo de colunas de rotação Ni-NTA; pérolas Ni-NTA), utilizando o protocolo recomendado pelo fornecedor (Qiagen). A proteína de fusão THX-NBLl (Cterm) purificada aparece, após a electroforese, em condições desnaturantes (EGPA-SDS) sob a forma de uma banda com o tamanho esperado de 31,1 kDa. A imuno-reactividade da proteína THX-NBLl (Cterm) foi analisada por transferência de Western, em função de um soro de suíno indemne de triquinelose e de um soro de porco infestado com 20.000 larvas L1M de T. spiralis recolhidas 60 dias após a infestação.

Após a electroforese, em condições desnaturantes (EGPA-SDS), a proteína foi electro-transferida para uma membrana P Hybond (PVDF), seguindo as instruções do fabricante (Amersham). As membranas foram pré-hibridadas durante 1 h em TBS-T (Tris-HCl 20 mM, a pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 a 0,1 %) e 5% de leite desnatado. Após 2 lavagens em TBS-T durante 1 min e mais 3 lavagens em TBS-T durante 5 min, as membranas foram incubadas durante 1 h com o soro de suíno diluído a 1/200 em TBS. Após a lavagem, as membranas foram incubadas durante 20 min com o anticorpo secundário de coelho anti-lgG marcado com fosfatase alcalina (A1192, Sigma) diluído a 1/30000 e, em seguida, 18 com o substrato NBT/BCIP (E116, Interchim) durante 30 min para a revelação da marcação.

Os resultados estão ilustrados na figura 2.

Observa-se uma imuno-reactividade muito forte de thx-NBLl (Cterm) com o soro de suinos infestados com T. spiralis. EXEMPLO 2: USO DE THX-NBLl (CTERM) PARA DETECTAR A RESPOSTA HUMORAL DIRIGIDA CONTRA TRICHINELLA. A proteina-THX NBLl (Cterm), preparada como descrito no exemplo 1 anterior, foi avaliada por ELISA indirectamente em função de soros de suinos infestados com Trichinella, em comparação com o antigénio de excreção/ secreção (E/S) de Γ. spiralis. O antigénio E/S de referência prepara-se de acordo com o protocolo descrito por GAMBLE et al. (1988). Obtém-se a partir do sobrenadante da cultura de larvas LlM mantidas vivas durante 24 horas em RPMI 1640 contendo 1 % de piruvato, 15 % de soro bovino (SBF), 1 % de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina.

Para os ensaios por ELISA, o antigénio, diluído em SBF IX, à razão de 1,25 pg/ml para o antigénio E/S e 2 pg/ml para THX-NBLl (Cterm), foi incubado durante 1 noite, a 4 °C, em placas de 96 poços (placas MediSorp, NUNC). Após 3 lavagens (SBF IX, Tween 20 a 0,05 %), as placas foram saturadas, à temperatura ambiente, durante 1 h, com uma solução de leite desnatado diluída a 2 % na solução de lavagem. 19

Adiciona-se a cada poço 100 μΐ de soro de porco diluído a 1/20 em tampão de SBF lx, adicionado de Tween 20 a 0,05 %. Após incubação, durante 30 min, a 37 °C, seguido de 3 lavagens (SBF IX, Tween 20 a 0,05 %) adiciona-se a cada poço 100 μΐ da solução de conjugado (proteína G-peroxidase (P-8170, Sigma) diluída a 1/32000 em lx tampão de SBF, complementado com Tween 20 a 0,05 %. Depois de uma incubação adicional de 30 min, a 37 0 C, seguida de 3 lavagens (SBF IX, Tween 20 a 0,05 %) adiciona-se a cada poço 100 μΐ de solução de substrato (3,3', 5,5'-tetra-metilbenzidina-peróxido de hidrogénio: TMB3). Após 20 minutos de incubação, à temperatura ambiente, no escuro, a reacção foi interrompida pela adição de 100 μΐ/poço de H2SO4 0,5 Μ. A leitura das placas efectua-se através da medição da densidade óptica a 450 nm. O resultado da leitura das placas de ELISA é apresentado como a percentagem de reactividade de uma amostra de soro em relação a um soro de controlo positivo.

% E = (DO da amostrã-DO do controlo negativo/DO do controlo positivo-DO do controlo negativo)xlOO

P O limiar de positividade (igual a 2 vezes o valor médio das amostras negativas de referência) é de 14 % para ELISA de Ag E/S e de 44 % para o ensaio ELISA de THX NBL1 (Cterm).

Comparou-se a cinética de aparecimento dos anticorpos anti-Trichinella detectados por ELISA de THX-NBLl (Cterm) ou por ELISA de Ag E/S em soros de suínos convencionais infestados experimentalmente com 200, 1.000 ou 20.000 larvas L1M de T. spiralis.

Os resultados estão ilustrados na figura 3. 20 0 antigénio-THX NBLl (Cterm) permite detectar as respostas humorais, dependentes da dose, dirigidas contra T. spiralis. A detecção de epitopos conformacionais por este ensaio de ELISA relacionado com a detecção de epitopos lineares por transferência de Western também demonstrou a natureza imuno-dominante da proteína NBLl de Trichinella. 0 ensaio ELISA de THX-NBLl (Cterm) detecta a conversão do soro desde o 25° dia pi, enquanto o ensaio ELISA de Ag E/S não detecta a conversão do soro senão 10 dias mais tarde. A detecção por ELISA de Ag E/S e ELISA de THX-NBLl (Cterm) das respostas humorais induzidas por r. spiralis e as três outras espécies de Trichinella identificadas na Europa, T. nativa, T. britovi e T. pseudospiralis, também foram comparadas.

Os resultados estão resumidos no quadro I a seguir. 21

QUADRO I

Espécie Tríchínella Inoculo (a) Infectividade (b.) laxa de despistagem por ELISA de Ag E/S laxa de despistagem total por ELISA de Ag E/S laxa de despistagem por ELISA de THX-NBL1(Cterm) laxa de despistagem total por ELISA de THX-NBL1(Cterm) Número de animais co-detectados mais tardiamente por 1'ELISA de IHX-NBL1(Cterm) Número de animais detectados no mesmo momento pelos 2 ensaios de ELISA Número de animais detectados mais precocemente por ELISA de IHX-NBL1 (Cterm) Número de animais detectados no mesmo momento pelos 2 ensaios de ELISA ou mais precocemente por ELISA de IHX-NBL1 (Cterm) Ganho de precocidade induzida por ELISA de THX-NBL1(Cterm) (c) T. spíialís 200 3 3/3 9/9 1/3 7/9 - - 7/7 7/7 5 - 28 1000 43,1 3/3 3/3 20 000 538,9 3/3 3/3 T. britovi 200 1,8 1/3 7/9 1/3 6/9 - - 6/6 6/6 5 - 45 1000 1 3/3 2/3 20 000 123,1 3/3 3/3 T, nativa 200 0,0007 1/3 5/9 1/3 6/9 - - 6/6 6/6 15 - 38 1000 0,0015 1/3 2/3 20 000 0,1022 3/3 3/3 1. pseudospiiatis 200 0,058 0/3 6/9 0/3 5/9 - -- 5/5 5/5 5 - 45 1000 2,1 3/3 2/3 20 000 98,9 3/3 3/3 (a) inoculo infeccioso em número de L1M de Iiichmella por porco (b) carga parasitária muscular média por animal (em larvas por grama de músculo) (c) ganho de precocidade expresso em dias obtidos pelo ensaio ELISA de NBL1(Cterm) comparado com o ensaio ELISA de Ag E/S nos animais co-detectados por estes 2 ensaios 22

Todos estes resultados mostram que o ensaio ELISA de THX-NBLl (Cterm) permite uma detecção particularmente precoce das respostas humorais, desde o 15° d pi, para os animais altamente infestados e uma detecção ligeiramente atrasada para a detecção de animais infestados com uma carga média de 1000 LlM (25° d pi). Resultados semelhantes foram obtidos com porcos holoxénicos infestados, seguindo o mesmo protocolo. A sero-conversão mais precoce detectada por ELISA de Ag E/S foi no 25° dia pi. A comparação dos resultados obtidos, com os 2 ensaios por ELISA, mostrou um ganho de 5 a 20 dias em termos de precocidade do diagnóstico de T. spíralís pela utilização ELISA usando o THX-NBLl (Cterm) (quadro I) . Além disso, os animais infestados com T. spíralís que foram diagnosticados ao mesmo tempo por ELISA de Ag E/S e ELISA de THX-NBLl (Cterm) demonstraram, a todos, a redução das suas janelas de detecção serológica com o ensaio ELISA de THX-NBLl (Cterm). A sensibilidade do ensaio ELISA de thx-nblI (Cterm) foi demonstrada com a despistagem eficaz de 7/9 suínos convencionais, durante esta experiência com animais ou seja, 3/3 suínos infestados com 20000 LlM, 3/3 suínos infestados com 1000 LlM e 1/3 porcos infestados apenas com 200 LlM de Γ. spíralís. As detecções foram associadas à carga parasitária muscular de T. spíralís nestes animais que variou, em média, de 3 larvas por grama (LpG) em suínos infestados experimentalmente com 200 LlM, 43 LpG para suínos infestados experimentalmente com 1000 LlM, e 538 LpG para os suínos infestados experimentalmente com 20.000 LlM.

As respostas humorais induzidas pelas outras três espécies de Trichinella identificadas na Europa, T. nativa, T. britovi e Γ. pseudospiralis, também foram detectadas, de uma maneira dependente da dose, pelo ensaio ELISA de THX-NBLl (Cterm), demonstrando a conservação genética e 23 antigénica de NBLl do género Trichinella (imuno-dominância) e, portanto, todo o seu interesse para um diagnóstico de largo espectro de triquineloses. A sensibilidade e a precocidade do diagnóstico (15° d pi) foram confirmadas. A janela de sero-conversão foi reduzida de 5 a 45 dias com o ELISA de THX-NBLl (Cterm) e, como a infestação por T. spíralís, todos os animais que foram diagnosticados por ambos os ELISA de Ag E/S e ELISA de THX-NBLl (Cterm), viram a sua janela de detecção serológica diminuir com o ensaio ELISA de THX-NBLl (Cterm). Além disso, as análises de infestação pela espécie T. nativa demonstraram a alta sensibilidade de ELISA de THX-NBLl (Cterm), que diagnosticou 6/9 animais (contra 5/9 animais por ELISA de Ag E/S) com 2 porcos sem serem detectados pelo ELISA de Ag E/S enquanto a carga parasitária do músculo, em média, não ultrapassou 7xlCT4 a 0,1 LpG. A especificidade do ensaio ELISA de THX-NBLl (Cterm) foi demonstrada por meio de soros retirados do conjunto dos animais antes de cada infestação experimental e até 10 dias pi. Mais de 200 soros de suinos criados ao ar livre foram utilizados para mostrar a especificidade da molécula. Nenhum porco negativo, face à Trichinella, reagiu com o ensaio ELISA de THX-NBLl (Cterm).

Estes resultados estão ilustrados na figura 4. EXEMPLO 3: IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPOS IMUNO-DOMINANTES DE NBLl.

Uma análise in silico da sequência de aminoácidos deduzida da parte do terminal C de NBLl foi realizada para prever as regiões mais antigénicas. 24

Os resultados da análise in silico levaram à selecção de 11 péptidos sobrepostos, abrangendo 113 AA da parte do terminal C de NBLl (do AA 327 ao AA 440) . As sequências destes péptidos estão indicadas a seguir N5EM1: NH2-NSPEGTVKWASKEDS-CONH2 (SEQ ID NO: 14) N5EM2: NH2-ASKEDSPVDLSTASR-CONH2 (SEQ ID NO: 15) N5EM3: NH2-LSTASRPTNPYTGSR-CONH2 (SEQ ID NO: 16) N5EM4: NH2-PYTGSRPTSPSSGSR-CONH2 (SEQ ID NO: 17) N5EM5: NH2-PSSGSRPTYPSSGSR-CONH2 (SEQ ID NO: 6) N5EM6: NH2-PSSGSRPTSPSSGSR-CONH2 (SEQ ID NO: 18) N5EM7: NH2PSSGSRPTYPYTGSR-CONH2 (SEQ ID NO: 7) N5EM8: NH2-PYTGSRPTPQKPVFP-CONH2 (SEQ ID NO: 19) N5EM9: NH2-QKPVFPSYQKYPPAV-CONH2 (SEQ ID NC, 20) N5EM10: NH2-KYPPAVQKYIDSLPS-CONH2 (SEQ ID NO: 21) N5EM11: NH2-RPTSPSSGSRPTYPS-CONH2 (SEQ ID NO: 8) A antigenicidade dos péptidos N5EM, face a um soro de porco infestado com 20.000 larvas LlM de T. spiralis e recolhidos 60 dias após a infestação, foi avaliada pelo teste ELISA indirecto utilizando um protocolo idêntico ao descrito no exemplo 2, excepto no facto de os péptidos, previamente biotinilados, serem incubados (2 pg/ml em IX SBF, 100 μΐ/poço) em placas pré-tratados com estreptavidina.

Detectaram-se três péptidos imuno-reactivos (N5EM5, 7 e 11). A análise da sequência primária dos péptidos imuno-reactivos revelou a presença de um elemento comum de 10 aminoácidos (PSSGSRPTYP) (SEQ ID NO: 5). Este elemento, por sua vez, também está presente 4 vezes em toda a sequência da proteína NBLl. Além disso, o mapeamento de epítopos, usando os péptidos que se sobrepõem aos 6 AA permitiu por 25 em evidência a importância de um único AA, uma tirosina, para a imuno-reactividade do epítopo linear nos péptidos.

Outras experiências demonstraram, finalmente, que o péptido N5EM11 era o péptido mais reactivo comparado com N5EM5 e N5EM7, em termos de sensibilidade e de precocidade.

Este péptido foi comparado com o antigénio de E/S de T. spiralis, conforme descrito no exemplo 2 para THX-NBLl (Cterm).

Os resultados estão resumidos no quadro II a seguir: 26

QUADRO II

Espécie Iríchinellã Inoculo (a). Infectividade (b). laxa de despistagem por ELISA de Ag E/S laxa de despistagem total por ELISA de Ag E/S laxa de despistagem por ELISA de N5EM11 laxa de despistagem total por ELISA de N5EM11 Número de animais co-detectados mais tardiamente por ELISA de N5EM11 Número de animais detectados no mesmo momento pelos 2 ensaios ELISA de N5EM11 Número de animais detectados mais precocemente por ELISA de N5EM11 Número de animais detectados no mesmo momento pelos 2 ensaios ELISA ou mais precocemente por ELISA de N5EM11 Ganho de precocidade induzido por ELISA de N5EM11 (c) I. spiralis 200 3 3/3 9/9 0/3 5/9 - 2/5 3/5 5/5 5-10 1000 43,1 3/3 2/3 20000 538,9 3/3 3/3 T. britovi 200 1,8 1/3 7/9 1/3 5/9 - 1/5 4/5 5/5 5-30 1000 1 3/3 1/3 20000 123,1 3/3 3/3 I. Nativa 200 0,0007 1/3 5/9 0/3 4/9 - - 4/4 4/4 15-25 1000 0,0015 1/3 1/3 20000 0,1022 3/3 3/3 T. pseudospiralis 200 0,058 0/3 6/9 0/3 4/9 2/4 - 2/4 2/4 30 1000 2,1 3/3 2/3 20000 98,9 3/3 2/3 (a) inoculo infeccioso em número de L1M de Iríchinellã por porco (b) alteração parasitária muscular média por animal (em larvas por grama de músculos) (c) ganho de precocidade expresso em dias obtidos pelo ensaio ELISA de N5EM11 comparado com o ensaio ELISA de Ag E/S em animais co-detectados por estes dois ensaios 27

Estes resultados mostram que o ensaio ELISA de N5EM11 permite a detecção de infestações moderadas provocadas por Γ. spiralis. Além disso, conseguiu-se uma detecção precoce a partir do 20° dia após a infestação ou seja, 5 a 10 dias mais cedo do que permitiu o ELISA de Ag E/S

Observa-se também uma diminuição da taxa de anticorpos anti-N5EMll após o pico de detecção, o que confirma este carácter precoce, que é útil para datar uma infestação recente. Todos os porcos infestados com T. spiralis e diagnosticados por ELISA do péptido N5EM11 apresentam uma janela de seroconversão em parte semelhante, mas na maioria dos casos maior, do que a observada com o ensaio ELISA de Ag E/S.

Além disso, este N5EM11 apresenta reacções antigénicas cruzadas com o soro de suínos infestados com T. nativa, T. britovi e T. pseudospiralis demonstrando a imuno-dominância deste péptido no estádio LlRN de Trichinella. Estas reacções antigénicas cruzadas levam a uma detecção que se pode obter 5 a 30 dias mais cedo do que com ELISA de Ag E/S.

Notou-se contudo uma erosão da sensibilidade na comparação com o ensaio ELISA de Ag E/S, em termos de detecção tardia para animais infestados com T. pseudospiralis e co-detectados pelos dois testes. A contrario, o ensaio ELISA de N5EM11 também permitiu diagnosticar um animal infestado com r. nativa e não despistado pelo ELISA de Ag E/S, enquanto a carga parasitária do músculo foi residual. A especificidade do ensaio ELISA de N5EM11 foi avaliada com a ajuda de soros colhidos de 300 animais antes 28 da infestação experimental e até 10 dias pi. Esta especificidade é superior a 99 % (resultados não mostrados). EXEMPLO 4: IDENTIFICAÇÃO E ISOLAMENTO DO ANTIGÉNIO 411

Seleccionou-se o clone de ADNc 411 a partir de um banco de dados de ADNc dos estádios invasivos precoces Ad + LlRN de T spiralis.

Determinou-se a sequência de ácidos nucleicos deste clone de ADNc, assim como a sequência polipeptidica deduzida que estão representadas, respectivamente, na lista de sequências com os números de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. O quadro aberto de leitura de 411 codifica para uma possível proteína de 20 kDa. Com excepção de um péptido de sinal, não se identificou nenhum domínio de proteína. A comparação entre o quadro aberto de leitura completo de 411 com as sequências disponíveis no GenBank mostra que há 78,7 % de identidade com a proteína de excreção/secreção TP21-3 identificada em Γ. pseudospiralis (AAF79206; NAGANO et ai, 2001) e 86,6 % de identidade com a sequência do hipotético QAL (quadro aberto de leitura) 17.20 de T. spiralis submetido por Polvere e Despommier (AAB48489) . Estas comparações de sequências identificaram 411 como novo membro desta família de genes comuns do género Trichinella. O quadro aberto de leitura completo de 411 foi amplificado com a ajuda dos oligonucleótidos 411F (5'-CACCCGAGAAAACATGCAT-3' ) (SEQ ID NO: 22) e 411R (5'-TCCATTCAATTTTGCGTCAC-3' ) (SEQ ID NO: 23) e a polimerase de ADN AccuPrime pfx (Invitrogen) e foi clonado no plasmido pETl02D/topo, utilizando o estojo de expressão «Champion 29 pETl02 Directional TOPO» de acordo com as recomendações do fabricante (Invitrogen). 0 plasmido recombinante obtido, designado por pETl02-411 codifica para uma proteína de fusão tioredoxina-411 (THX-411) de 330 aa, previsto para uma massa molecular de 36,7 kDa e comportando, numa posição do terminal C, um marcador de poli-histidina. A sequência desta proteína de fusão está representada na figura 5. A proteína de fusão THX-411 foi expressa em bactérias BL21 Star (DE3), BL21 (DE3) pLis de E. colí (Invitrogen) transformadas com o plasmido pETl02-411 e purificadas por cromatografia de afinidade em condições desnaturantes numa coluna Ni-NTA (estojo de colunas rotativas Ni-NTA, pérolas de Ni-NTA), usando o protocolo recomendado pelo fornecedor (Qiagen) . A proteína de fusão THX-411 purificada aparece, após electroforese, em condições desnaturantes (EGPA-SDS) sob a forma de uma banda com a dimensão esperada de 36,7 kDa. A imuno-reactividade da proteína THX-411 face a um soro de porco indemne de triquinelose e do soro do mesmo porco, 30 dias e 50 dias após a infestação com 20.000 larvas de LlM de T. spiralis foi comparada com a do antigénio de referência E/S (preparado como descrito antes no exemplo 2). A análise foi realizada por transferência de Western, usando o mesmo protocolo, que o descrito no exemplo 1 anterior.

Os resultados estão ilustrados na figura 6.

Observa-se uma forte imuno-reactividade de THX-411 com 30 os soros de suínos infestados com T. spiralis e a detecção precoce de anticorpos anti-411 (30 dias pi). Observa-se um ligeiro ruído de fundo devido às reacções cruzadas entre as proteínas bacterianas residuais de alto peso molecular que subsistem na preparação de THX-411 e os anticorpos anti-£. coli presentes nos soros. EXEMPLO 5: UTIULIZAÇÃO DE THX-411 PARA A DETECÇÃO DA RESPOSTA HDMORAL DIRIGIDA CONTRA TRICHINELLA. A proteína, preparada como descrito no exemplo 4 anterior, foi avaliada por ensaio ELISA indirecto contra soros de suínos infestados com Trichinella, em comparação com o antigénio de excreção/secreção (E/S) de T. spiralis.

Comparou-se a cinética de aparecimento dos anticorpos anti-Trichinella detectados por ELISA de THX-411 ou por ELISA de Ag E/S em soros de suínos convencionais infestados experimentalmente com 200, 1.000 ou 20.000 larvas LlM de T. spiralis. Foi igualmente comparada a detecção por ELISA de Ag E/S e por ELISA de THX-411 das respostas humorais induzidas por T. spiralis e as três outras espécies de Trichinella identificadas na Europa, T. nativa, T. britovi e T. pseudospiralis. O protocolo utilizado é idêntico ao descrito no exemplo 2. O antigénio THX-411 foi utilizado à razão de 2 pg/ml e o antigénio E/S a 1,25 pg/ml. O limiar de positividade é de 14 % para o ensaio ELISA de Ag E/S e de 52 % para o ensaio ELISA de THX-411.

Os resultados estão ilustrados na figura 7 e no quadro III a seguir. 31

QUADRO III

Espécie de Iríchínellã Inoculo (a). Infectividade (b). laxa de despistagem por ELISA de Ag E/S laxa de despistagem total por ELISA de Ag E/S laxa de despistagem por ELISA de THX-411 laxa de despistagem total por ELISA de 1HX-411 Número de animais co-detectados mais tardiamente por ELISA de 1HX-411 Número de animais detectados no mesmo momento pelos 2 ensaios ELISA de 1HX-411 Número de animais detectados mais precocemente por ELISA de THX-411 Número de animais detectados no mesmo momento pelos 2 ensaios ELISA ou mais precocemente por ELISA de 1HX-411 Ganho de precocidade induzido por ELISA de THX-411 (c) I. spírãlís 200 3 3/3 9/9 1/3 5/9 2/5 1/5 2/5 3/5 5-10 1000 43,1 3/3 1/3 20000 538,9 3/3 3/3 I. hrítoví 200 1,8 1/3 7/9 0/3 4/9 - - 4/4 4/4 5-20 1000 1 3/3 2/3 20000 123,1 3/3 2/3 I. Nativa 200 0,0007 1/3 5/9 1/3 6/9 - 1/6 5/6 6/6 10-20 1000 0,0015 1/3 2/3 20000 0,1022 3/3 3/3 I. pseudospiralis 200 0,058 0/3 6/9 0/3 2/9 1/2 - 1/2 1/2 20 1000 2,1 3/3 0/3 20000 98,9 3/3 2/3 (a) inoculo infeccioso em número de LlM de Trichínella por porco. (b) alteração parasitária muscular média por animal (em larvas por grama de músculos). (c) ganho de precocidade (expresso em dias) obtido pelo ensaio ELISA de 411 comparado com o ensaio ELISA de Ag E/S em animais co-detectados por estes dois ensaios 32 0 conjunto destes resultados mostra que o antigénio 411 permite a detecção das respostas humorais dependentes da dose dirigida contra T. spiralis. A detecção de epitopos conformacionais por meio deste ensaio de ELISA associado à detecção de epitopos lineares por transferência de Western também demonstra a natureza imuno-dominante da proteína 411 de Trichinella. A proteína recombinante THX-411 permite uma detecção particularmente precoce de anticorpos dirigidos contra Γ. spiralis (desde o 20° d pi para animais fortemente infestados com 20000 LlM). A seroconversão é acompanhada de um perfil de respostas humorais com títulos elevados e que se mantêm até ao 60 d pi. A seroconversão dos animais infestados com uma carga parasitária moderada e baixa foi detectada mais tardiamente, no 30° d pi e no 60° d pi, respectivamente. A seroconversão detectada mais precocemente por ELISA de Ag E/S foi no 25° dia pi.

Os animais infestados com T. spiralis que foram diagnosticados tanto por ELISA de Ag E/S como por ELISA de THX-411 viram, para 2/5 deles, a sua janela de detecção serológica reduzir-se com o ensaio ELISA de THX-411, com um ganho de 5 a 10 dias em termos de precocidade. A sensibilidade do ensaio ELISA de THX-411 foi demonstrada com a despistagem eficaz de 5/9 suínos convencionais durante esta experiência com animais ou seja, 3/3 porcos infestados com 20000 de LlM, 1/3 suínos infestados com 1000 LlM e 1/3 porcos infestados com apenas 200 LlM de T. spiralis. As detecções estavam associadas à carga parasitária muscular de T. spiralis nestes animais, que variava, em média, de 3 larvas por grama (LpG) para os suínos experimentalmente infestados com 200 LlM, 43 LpG 33 para os suínos infestados com 1000 LlM e 538 LpG para os suínos infestados com 20.000 LlM.

As respostas humorais induzidas por T. nativa, T. britovi e Γ. pseudospiralis também foram detectados por ELISA de THX-411 (10/12 animais infestados com 20.000 LlM), demonstrando a conservação genética e antigénica de 411 no género Trichinella e, por consequência, o seu enorme interesse no diagnóstico de largo espectro de triquineloses. O diagnóstico precoce foi confirmado desde o 20° d pi. A janela de seroconversão foi reduzida de 5 para 20 dias, com o ensaio ELISA de 411 e, na fase larvar de infestação por Γ. spiralis, 50 % a 100 % dos animais que foram diagnosticados por ambos os ELISA de Ag E/S e ELISA de THX-411 viram a sua janela de detecção serológica reduzir-se com o ensaio ELISA de THX-411. A análise da infestação pela espécie T. nativa tem demonstrado uma maior sensibilidade do ELISA de THX-411 que diagnosticou 6/9 animais (contra 5/9 animais por o ELISA de Ag E/S), enquanto a carga parasitária muscular foi em média apenas de 7xl0~4 a 0,1 LpG. Além disso, obtiveram-se perfis de respostas humorais semelhantes para os animais infestados com T. spiralis e T. nativa, enquanto a intensidade da infestação gerada por esta última espécie foi significativamente menor, sugerindo um carácter imunogénico muito importante da proteína 411 de T. nativa e a sua utilização para a detecção desta espécie resistente à congelação. A especificidade do ensaio ELISA de THX-411 foi avaliada por meio de soros recolhidos de 150 animais antes da infestação experimental e até 10 dias pi. Esta especificidade é superior a 99 % (resultados não mostrados). 34

Conclusão

Os antigénios NBLl e 411 são antigénios imuno-dominantes e conservados dentro do género Trichinella. Os ensaios de ELISA com estes antigénios (NBLl parte do terminal C; epítopo peptídico N5EM11 de NBLl; antigénio 411) apresentam uma especificidade face à Trichinella superior a 99 % e permitem o diagnóstico precoce (15-60 dias após a infestação) das triquineloses suinas produzidas pelas quatro espécies de Trichinella identificadas na

Europa. O ensaio de ELISA utilizando proteína recombinante purificada THX-NBLl (Cterm), contendo o epítopo imuno-dominante NBLl localizado na parte do terminal C da proteína, é específico para a detecção de Trichinella, sensível e permite o diagnóstico de triquineloses suínas com uma precocidade acrescida de 5 a 45 dias em comparação com o ELISA de Ag E/S. Além disso, este teste permitiu obter uma janela de detecção serológica reduzida em comparação com ELISA de Ag E/S em 100 % dos animais que foram diagnosticados tanto por ELISA de Ag E/S como por ELISA de THX-NBLl (Cterm). O ensaio de elisa utilizando a proteína recombinante purificada THX-411 reproduziu, com uma sensibilidade ligeiramente menor (17/36 animais diagnosticados), as cinéticas de respostas humorais detectadas por ELISA Ag E/S. No entanto, a sensibilidade deste novo ELISA permitiu diagnosticar um porco não despistado pelo ELISA de Ag E/S. O teste de ELISA de THX-411 pode permitir o diagnóstico das triquineloses suínas com uma precocidade acrescida de 5 a 20 dias, em comparação com o ELISA de Ag E/S. Além disso, 50 % a 100 % dos animais que foram diagnosticados tanto por 35 ELISA de Ag E/S como por ELISA de THX-411, viram a sua janela de detecção serológica reduzir-se com o ELISA de THX-411.

Todos estes resultados mostram que os antigénios NBLl e 411 podem ser utilizados como alternativa ao antigénio E/S ou complementando-o, para o diagnóstico serológico precoce de triquineloses. Além disso, a combinação destes dois novos antigénios de Trichinella permite melhorar a sensibilidade do diagnóstico por ELISA de um animal adicional. A combinação de NBLl (Cterm) com um péptido imuno-dominante do tipo N5EM11 e 411 permite melhorar a sensibilidade do diagnóstico de Trichinella (24/36 animais detectados) . 0 efeito aditivo de NBLl com 411 traduz-se por um ganho de detecção de um animal induzido por 411, assim como a detecção mais precoce de um animal induzida por 411. O triptico (NBlL, 411, N5EM11) estabiliza ao longo do tempo o ensaio ELISA por meio da co-detecção simultânea de anticorpos por via de 2 ou 3 antigénios, contudo sem nenhum ganho adicional em termos do número de animais.

Em contrapartida, obtém-se um diagnóstico precoce < 30 d pi graças aos dois antigénios NBLl e 411.

REFERÊNCIAS

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SEQUÊNCIAS

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FRANÇAISE DE SECURITE SANITAIRE DES ALIMENTS - JILIN

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< 210 > 1 <211> 1609 <212> ADN <213> Trichinella spiralis <220>

<221> CDS <222> (90)..(1487) < 4 0 0 > 1 gaaaagtgcc gctttgttfcc aaagacaaat agaaatgaaa caaaggatat tccâtâcgaa 6 cagfcagccat taaaaggtgt gc :tgcatge atg cat aaa att aca e&c ãââ agt 11 Met 1 His Lys Ile Thr 5 His Lys Ser att gta tca cgt cat aca ttt gct gtt tat ttg tta gtt agt ggt cag 16 He Vai Ser Arg Bis Thr Phe Ala vai Tyr Leu Leu Val Ser Gly Gin 10 15 20 aaa ctg caa tat ata tat ata ttt att tgc aaa atg att aga cgt ctt 20 Lys Leu Gin Tyr Ile Tyr Ile Phe Ile Cys Lys Met Ile Arg Arg Leu 25 30 35 40 ttt caa tat acc tca atg act ttt gct tgg att ctt o lC ttc tta tcc 25 Phe 61n Tyr Thr Ser Met Thr Phe Ma Trp Ile Leu Leu Phe Leu Ser 45 50 55 gca gct tct cca tca cta soo geg ttt gaa tgc ggt gtg cca cat ttt 30 Ala Ala Ser Pro Ser Leu Gly Ala Phe Glu Cys Gly Val Pro His Phe 60 65 70 aaa cec tat ata tgo aaa tct ggt cg& att gtt ggt gga act gac gta 35 Lys Pro Tyr Ile Trp Lys Ser Gly Arg Ile Vai Gly Gly Thr Asp Val 39 75 80 85 cga cca cac tca cat cca tgg cag att caa ttg tta aag tca gaa acg 401 Arg Pro His Ser His Pro Trp Gin Ile Gin Leu Leu Lys Ser Glu Thr 90 95 100 gga gge tac age age ttg tgc ggt ggt agt Gtt gtt cat ttc ggt aaa 449 «y Gly Tyr Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Leu Val His Phe Gly Lys 105 110 115 120 ccc tca aat ggt act cga ttt gta ctt acc gcc g cg cac tgt ata act 497 Pro Ser Asn Gly Thr Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cya Ile Thr 125 130 135 act age aat atg tat cca aga a cg tca aga ttt a ca gtt gtg acc ggt 545 Thr Ser Asn Met Tyr Pro Arg Thr Ser Arg Phe Thr Val Val Thr Gly 140 145 150 gcc cac aac ate aaa atg cat gaa aaa gaa aaa aag ege ata cca att 593 Ala His Asn Ile Lys Met His Glu Lys Glu Lys Lys Arg Ile Pro He 155 160 165 act tcc tat tat gtt cag cac tgg aac cct gtg atg aca aca aac gac 641 Thr Ser Tyr Tyr Vai Gin His Trp Asn Pro Val Met Thr Thr Asn Asp 170 175 180 att gcg ttg ctt ege etg gea gaa act gtt tat tat aat gaa tat acc 689 Ile Ala Leu Leu Arg Leu Ala Glu Thr Val Tyr Tyr Asn Glu Tyr Thr 185 190 155 200 agg cct gtc tgt ttg cca gaa cea aat gaa gaa ttg act cct gga gat 737 Arg Pro Vai Cys Leu Pro Glu Pro Asn Glu Glu Leu Thr Pro Gly Asp 205 210 215 att tgc gtt gtc âCC gga tgg ggt gat ácg act gaa aat gga act act 785 Ile Cys Vai Vai Thr Gly Trp Gly Asp Thr Thr Glu Asn Gly Thr Thr 220 225 230 tct aat act ttg aag caa gtt ggt gtc aaa att atg aag aaa gga act S33 Ser Asn Thr Leu Lys Gin Val Gly vai Lys Ile Met Lys Lys Gly Thr 235 240 245 tgt gea aat gtg aga agt gaa gtt att act ttt tgc gct gga gct atg 881 Cys Ala Asn Vai Arg Ser Glu Val Ile Thr Phe Cys Al s Gly Ala Met 250 255 260 gag ggt ggt aaa gac agt tgt caa ggt gat tct sgt ggc cca ctg ata 929 Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu ile 265 270 275 280 tgc aag aaa aat ggg asa agt gtt caa ttc ggt gtc gtt agt tat ggt 977 Cys Lys Lys Asn Gly Lys Ser Vai Gin Phe Gly Val Val Ser Tyr Gly 285 230 295 act gga tgc gcc aga aaa ggt tat ccc gga gtg tat gcc aaa gtt cca 1025 Thr Gly Cys Ala Arg Lys Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val Pro 300 305 310 tca tat gtc a ca tgg tta aat aaa get gea aaa gaa ctt gaa aat tct 1073 Ser Tyr Vai Thr Trp Leu Asn Lys Ala Ala Lys Glu Leu Glu Asn Ser 315 320 325 40 1121 1121 cet gaa gga act gta aaa tgg gct tca aaa gaa gat tcg cca gtc gat Pro Glv Gly Thr Vâl Lys Trp Ala Ser Lys Glu Aâp Ser Pro Vai Asp 330 335 340 tta tct act gca tca aga cca act aac cca tat act ggg tca aga ccg Leu Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro 345 350 355 360 aca tct cca tct agt gga tca aga ccc aca tat cca tct agt gga tca Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Qly Ser 365 370 375 aga cca aca tct cca tct agt gga tca aga ccc aca tat coa tct agt Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser eiy Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser 380 385 390 39a tca aga ccc aca tat cca tct agt gga tca aga cca aca tat cca Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro 395 400 405 tat act gga tca aga GCt act cct caa aag cca gta ttt cca tca tac Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro Gin Lys Pro Vai Phe Pro Ser Tyr 410 415 420 caa a&a tat ccg cca gca gtt caa tac att gat agt tta cca age Gin Lys Tyr Pro Pro Ala Vai Gin Lya Tyr Tle Asp Ser Leu Pro Sar 425 430 435 440 gga a cg caa gga a cg ctc gaa tac aca gtc aca csg aat gga gtt act Gly Thr Gin Gly Thr Leu Glu Tyr Thr Vai Thr Glíi Asn Gly Vai Thr 445 450 455 aca aca aca tat tat cac ttt tct aag taa aaafcatfcatg attaattcac Thr Thr Thr Tyr Tyr His Phe Ser Lys 460 465 tactgctctg aacgtaatta aaaaaggaat atttattaag cstttfcaata tgacacatta tatatattaa aacagtcaaa tttgaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1169 1217 1255 1313 1361 1409 1457 1507 1567 1609

<210> 2 <211> 465 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 2 41

Met His Lys lie Thr His Lys Ser 1 5

Vai Tyr Leu Leu Vai Ser Gly Gin 20

Ile Cys Lys Met lie Arg Arg Leu 35 40

Ala Trp Ile Leu Leu Phe Leu Ser 50 55

Ile Vai Ser Arg His Thr Phe Ala 10 15 Lys Leu Gin Tyr Ile Tyr Ile Phe 25 30 Phe Gin Tyr Thr Ser Met Thr Phe 45 Ala Ala Ser Pro Ser Leu Giy Ala 60 42

Phe Glu Cys Gly Vai Pro His Phe Lys Pro Tyr Ile Trp Lys Ser Gly 65 70 75 80 Arg Xle Va.1 Gly Gly Thr Asp Val Arg Pro His Ser His Pro Trp Gin 85 90 95 Ile Gin Leu Leu Lys Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Cys Gly 100 105 110 Gly Ser Leu Vai Bis Phe Gly Lys Pro Ser Asn Gly Thr Arg Phe Val 1X5 120 125 Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Thr Thr Ser Asn Met Tyr Pro Arg Thr 130 135 140 Ser Arg Phe Thr val Val Thr Gly Ala His Asn Ile Lys Met His Glu 145 150 155 160 Lys Glu Lys Lys Arg Ile Pro Ile Thr Ser Tyr Tyr Val Gin His Trp 165 170 175 Asn Pro vai Met Thr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu Ala Glu 180 185 190 Thr Vai Tyr Tyr Asn Glu Tyr Thr Arg Pro Val Cys Leu Pro Glu Pro 195 200 205 Asn Glu Glu Leu Thr Pro Gly Asp Xle Cys Val Val Thr Gly Trp Gly 210 215 220 Asp Thr Thr Glu Asn Gly Thr Thr Ser Asn Thr Leu Lys Gin val Gly 225 230 235 240 Vai Lys Xle Met Lys Lys Gly Thr Cys Ala Asn Val Arg Ser Glu Val 245 250 255 Ile Thr Phe Cys Ala Gly Ala Met Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gin 260 265 270 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Lys Lys Asn Gly Lys Ser Val 275 280 285 Gin Phe Gly Vai Val Ser Tyr Gly Thr Gly Cys Ala Arg Lys Gly Tyr 290 295 300 Pro Gly Vai Tyr Ala Lys Val Pro Ser Tyr val Thr Trp Leu Asn Lys 305 310 315 320 Ala Ala Lys Glu Leu Glu Asn Ser Pro Glu Gly Thr Val Lys Trp Ala 325 330 335 Ser Lys Glu Asp Ser Pro Val Asp Leu ,Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr 340 345 350 Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg 355 360 365 Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly 370 375 380 43

Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser 385 390 Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro 405 Gin Lys Pro Vai Phe Pro Ser Tyr 420 Lys Tyr Ilô ASp Ser Leu Pro Ser 435 440 Thr Vai Thr Gin Asn Gly Vai Thr 450 455

Gly Ser Arg H Q Thr Tyr Pro Ser 395 400 Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro 410 415 Gin Lys Tyr Pro Pro Ala Vai Gin 425 430 Gly Thr Gin Gly Thr Leu Gltt Tyr 445 Thr Thr Thr Tyr Tyr His Phe Ser 460

Lys 4 65 <210> 3 <211> 700 <212> ADN <213> Trichinella spiralis <220> <221> CDS <222> (1)..(528) <400> 3 44 cga gaa aac atg cat tgc caa ttc att ctc tet ttg ctc ctt ttc tet 48 Arg Glu Aso Het Hís Cys Gin Phe na Leu Ser Leu Leu Leu Phe Ser 1 5 10 15 ttg aac gtc gta ttc ttc gaa gee geg aaa tea ctg gat gee gta gac 36 Leu Asa Vai Vai Phe Phe Glu Ala Ala Lys Ser Leu Asp Ala Val Asp 20 25 30 gat gaa tta aaa aga tgt act gag aag caa act gaa att tgt gct caa 144 Asp Glu Leu Lys Arg Cys Thr Glu Lys Gin Thr Glu lie Cya Ala Gin 35 40 45 aca gaa tgc aaa gca gaa gat gca att atg aca gat ctg ctt ctc gag 132 Thr Glu Cys Lya Ala Glu Asp Ala Ile Met Thr Asp Leu Leu Leu Glu 50 55 60 gga gaa age gac att act gat cat cct gac ttc ctt tta tac gca act 240 Gly Glu Ser Asp Us Thr Asp Kis Pro Asp Phe Leu Leu Tyr Ala Thr 65 70 75 80 tgc atg caa cgt •tgc tgt gca aga ctg aac ggc gct caa gta gct cca 288 Cys Met Gin Arg Cys Cys Ala Arg Leu Aso Gly Ala Gin Val Ala Pro 85 30 95 ttg aaa gaa gaa gaa aaa cga aga gga cct tea aaa tta ccg ttc caa 336 Léu Lys Glu Glu Glu Lys Arg Arg Gly Pro Ser Lys Leu Pro Phe Gin 100 105 110 • age att ttt gaa gtt gct gat eaa aaa aca gtt gaa aga tgt gat gaa 38 4 Ser lie Phe Glu Vai Ala Asp Gin Lys Thr Val Glu Arg Cys Asp Glu 115 120 125 aca atg tgc aag agt tat aga aag aaa tat gaa aat ttg gta Thr Met Cys Lys Ser Tyr Arg Lys Lys Tyr Glu Asn Leu Val 130 135 140 act tea age tac aaa aag cta cga tea age caa gaa ttg aaa Thr Ser Ser Tyr Lys Lys Leu Arg Ser Ser Gin Glu Leu Lys 145 ISO 155 aaa caa tgc ate gaa aga tgt gac gca aaa ttg aat gga tta Lys Gin Cys lie Glu Arg Cys Asp Ala Lys Leu Asn Gly Leu 165 170 gca ttg 432 Ala leu gac tac 480

Asp Tyr 160 cag taa 528

Gla 175 agccagatafc gaagaatgga gatatgcatt aoaaagaaaa attttaactg tgtfcttataa aafcctataaa fcatcatttet aactgcatta gaattttttt aaaataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa actcgagggg gggçccggtc aaataatttt 538 gaagaaaaat €48 cc 700

<210> 4 <211> 175 <212> PRT <213> Trichinella spiralis 45 < 4 Ο Ο > 4

Arg Glu Asn Met His Cys Gin Phe Ile Leu Ser Lôu Leu Leu Phe Ser 1 5 10 15 Leu Asn vai Vai Phe phe Glu Ala Ala Lys Ser Leu Asp Ala Vai Asp 20 25 30 Asp Glu Leu Lys Arg Cys Thr Glu Lys Gin Thr Glu Ile Cys Ala Gin 35 40 45 Thr Glu Cys Lys Ala Glu Asp Ala Ile Met Thr Asp Leu Leu Leu Glu 50 55 60 Gly Glu Ser Asp Ile Thr Asp His Pro Asp Phe Leu Leu Tyr Ala Thr 65 70 75 SO Cys Môt Gin Arg Cys Cys Ala Arg Leu Asn Gly Ala Gin Vai Ala Pro 85 00 95 Leu Lys Glu Glu Glu Lys Arg Arg Gly Pro Ser Lys Leu Pro Phe Gin 100 .105 110 Ser lie Phe Glu Vai Ala Asp Gin Lys Thr Vai Glu Arg Cys Asp Glu 115 120 125 Thr Met Cys Lys Ser Tyr Arg Lys Lys Tyr Glu Asn Leu Vai Ala Leu 130 135 140 Thr Ser Ser Tyr Lys Lys Leu Arg Ser Ser Gin Glu Leu Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Gin Cys lie Glu Arg Cys Asp Ala Lys Leu Asn Gly Leu Gin 165 170 175 < 210 > 5 < 211> 10

< 212 > PRT <213> Trichinella spiralis < 4 0 0 > 5

Pro Sex Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro l 5 10

<210> 6 <211> 15 <212> PRT 46 <213> Trichinella spiralis <400> 6

Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg 1 5 10 15

<210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 7

Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser Arg 1 5 10 15

<210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 8

Arg Pro Thr Ser Pro Sar Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser 15 10 15

<210> 9 <211> 46 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 9 47

Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro 15 10 IS

Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser 20 25 30

Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr fyr Pro 3S 40 45

<210> 10 <211> 67 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 10

Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser 1 5 10 15 Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser 20 25 30 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro 35 40 45 Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser 50 55 60 Arg Pro Thr 65

<210> 11 <211> 134 <212> PRT <213> Trichinella spiralis < 4 0 0 > 11 48

Glu As ri Ser Pro Glu Gly Thr Vai Lys Trp Ala Ser Lys Glu Asp Ser 1 5 10 15 Pro Vai Asp Leu Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr Àsn Pro Tyr Thr Gly 20 25 30 Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Giy Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser 35 40 45 Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr 50 55 60 Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro 65 70 75 SO Thr Tyr Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro Gin Lys Pro Vai Phe 85 so ss Pro Ser Tyr Gin Lys Tyr Pro Pro Ala Vai Gin Lys Tyr Ile Asp Ser 100 105 110 Leu Pro Ser Gly Thr G1 π Gly Thr Leu Glu Tyr Thr Vai Thr Gin Asn 115 120 125 eiy Vai Thr Thr Thr Thr 130 < 210 > 12 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> NBLICtermF < 4 0 0 > 12 caccgaaaat tctcctgaag ga 22

<210> 13 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> NBLlCtermR 49 < 4 Ο Ο > 13 tgttgttgta gtaactcc 18 < 210 > 14

< 211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis < 4 Ο Ο > 14

Asrt Ser Pro Glu Gly Tftr Vai Lys Trp Ala Ser Lys Glu Asp Ser X 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 15

Ala Ser Lys Glu Asp Ser Pro Vai Asp Leu Ser Thr Ala Ser Arg I 5 10 15

<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 16

Leu Ser Thr Ala Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr Thr Gly Ser Arg 15 10 15 <210> 17 50

< 211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 17

Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg 1 5 10 15

<210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 18

Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 19

Pro Tyr Thr Gly Ser Arg Pro Thr Pro Gin Lvs Pro Vai Phe Pro 15 10 15

<210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 20 51

Gin Lys Pro Vai Phe Pro Ser Tyr Gin Lys Tyr Pro Pro Ala Vai 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Trichinella spiralis <400> 21 Lys Tyr Pro Pro Ala Vai Gin Lys Tyr Ilô Asp Ser Leu Pro Ser 1 5 10 15 <210> 22 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> 411F <400> 22 cacccgagaa aacatgcat 19 <210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220>

<223> 411R 52 < 4 Ο Ο> 23 tccattcaat tttgcgtcac 20

Lisboa, 11 de Janeiro de 2011. 53

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polipéptido antigénico, reconhecido por anticorpos anti-Trichinella, como reagente para a detecção de anticorpos anti-Trichinella numa colheita biológica, caracterizada pelo facto de o referido polipéptido compreender um epitopo imuno-dominante do antigénio NBLl, sendo esse epitopo definido pela sequência PSSGSRPTYP (SEQ ID NO. 5).
2. 2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de se utilizar uma mistura que compreende um ou mais polipéptidos, conforme definidos na reivindicação 1, eventualmente combinados com um ou mais polipéptidos, compreendendo os aminoácidos 25-175 da sequência SEQ ID NO. 4 ou que compreende uma sequência com pelo menos 70 o 0 de identidade com a sequência dos aminoácidos 25- 175 da sequência SEQ ID NO. 4 .
3. 3. Polipéptidos antigénicos, caracterizados pelo facto de serem reconhecidos pelos anticorpos anti-Trichinella, tal como definido na reivindicação 1, com exclusão do polipéptido identificado pelo número de acesso do GenBank AAK16520.1 e o polipéptido identificado pelo número de acesso do GenBank AAR36900.1.
4. 4. Polipéptido antigénico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de conter uma ou mais das sequências seguintes: a sequência: PSSGSRPTYPSSGSR (SEQ ID NO 6); a sequência PSSGSRPTYPYTGSR (SEQ ID NO 7); a sequência RPTSPSSGSRPTYPS (SEQ ID NO 8). 1
5. 5. Polipéptido antigénico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de conter os aminoácidos 363-409 da sequência SEQ ID NO. 2.
6. 6. Polipéptido antigénico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de ser constituído por um polipéptido quimérico compreendendo uma ou mais cópias de um polipéptido, tal como definido na reivindicação 1, eventualmente com uma ou mais cópias de um polipéptido como definido no reivindicação 2, eventualmente fundidos numa ou mais sequência heterólogas.
7. 7. Polinucleótido caracterizado pelo facto de codificar para um polipéptido antigénico de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 6.
8. 8. Vector recombinante caracterizado pelo facto de conter um ou mais polinucleótidos, de acordo com a reivindicação 7.
9. 9. Célula hospedeira caracterizada pelo facto de ser transformada por um vector recombinante de acordo com a reivindicação 8.
10. 10. Utilização de um polipéptido, tal como definido na reivindicação 1, caracterizada pelo facto de se destinar à obtenção de uma composição que pode ser usada para a produção de anticorpos.
11. 11. Anticorpos caracterizados pelo facto de reconhecerem especificamente um polipéptido, tal como definido na reivindicação 1. 2
12. 12. Anticorpos, de acordo com a reivindicação 11, caracterizados pelo facto de reconhecerem o epítopo PSSGSRPTYP (SEQ ID NO. 5).
13. 13. Processo para detectar a presença de anticorpos anti-Trichinella numa amostra biológica, em que o referido processo é caracterizado pelo facto de compreender: - o contacto da referida amostra biológica com um ou mais polipéptidos, conforme definido na reivindicação 1, eventualmente combinados com um ou mais polipéptidos, conforme definidos na reivindicação 2, em condições que permitam a formação de um complexo de antigénio/anticorpo com os anticorpos anti-Trichinella que podem eventualmente estar presentes na referida amostra; a detecção, por qualquer meio adequado, do complexo antigénio/anticorpo que eventualmente se formou.
14. 14. Estojo para detecção da presença de anticorpos anti-Trichinella numa amostra biológica, caracterizado pelo facto de compreender um ou mais polipéptidos, conforme definidos na reivindicação 1, eventualmente combinados com um ou mais polipéptidos, conforme definidos na reivindicação 2 e, se for caso disso, tampões e reagentes que são adequados para formar um meio de reacção que permita a formação de um complexo de anticorpo/antigénio e, eventualmente, meios para detectar o referido complexo de anticorpo/ antigénio.
15. 15. Estojo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de os referidos polipéptidos estarem imobilizados num suporte sólido. 3
16. 16. Composição imunogéncia, caracterizada pelo facto de compreender um ou mais polipéptidos, conforme definido na reivindicação 1, eventualmente combinados com um ou mais polipéptidos, conforme definido na reivindicação 2 ou um ou mais polinucleótidos de codificação para os referidos polipéptidos, tal como definidos na reivindicação 1, eventualmente combinados com um ou mais polinucleótidos de codificação para os referidos polipéptidos, tal como definidos na reivindicação 2, associados a um ou mais adjuvantes que permitam melhorar a resposta imunitária.
17. 17. Composição imunogéncia, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se tratar de uma vacina. Lisboa, 11 de Janeiro de 2011 4