PT2056882E - Identificação de um micro-rna que ativa a expressão da cadeia pesada de beta-miosina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "IDENTIFICAÇÃO DE UM MICRO-RNA QUE ATIVA A EXPRESSÃO DA CADEIA PESADA DE BETA-MIOSINA" 1. Dominio da Invenção A presente invenção refere-se genericamente aos dominios da biologia do desenvolvimento e biologia molecular. Mais particularmente, diz respeito à regulação genética e fisiologia celular em cardiomiócitos e células do músculo esquelético. Especificamente, a invenção refere-se à inibição de um miRNA que resulta em expressão reduzida da cadeia pesada de β-miosina (β-MHC), desse modo tratando hipertrofia cardiaca e falha cardiaca. 2. Descrição da Área Relacionada A hipertrofia cardiaca em resposta a uma carga aumentada imposta ao coração é um mecanismo adaptativo fundamental. É um processo especializado que reflete um aumento quantitativo da dimensão e massa celulares (em vez do número de células) em resultado de quaisquer, ou de uma combinação de estimulos neurais, endócrinos ou mecânicos. A hipertensão, outro fator envolvido em hipertrofia cardiaca, é um precursor frequente de falha cardiaca congestiva. Quando ocorre falha cardiaca, habitualmente o ventrículo esquerdo sofre hipertrofia e dilata-se, e os índices da função sistólica, como fração de ejeção, são reduzidos. Claramente, a resposta de hipertrofia cardíaca é uma síndroma complexa, e a elucidação das vias conducentes a hipertrofia cardíaca será benéfica no tratamento de doença cardíaca resultante de vários estímulos. 2 A hipertrofia miocárdica patológica é caracterizada por um aumento de proteínas de cardiomiócitos e a expressão de um perfil genético reminiscente do desenvolvimento embrionário inicial. Especificamente, aumenta a expressão da cadeia pesada de β-miosina (β-MHC), α-actina esquelética (sACT), e péptidos natriuréticos atriais e cerebrais (ANP e BNP, respetivamente), ao passo que diminui a dos genes específicos do músculo cardiaco adulto, cadeia pesada de a-miosina (α-MHC) e Ca2+-ATPase do reticulo sarcoplasmático (SERCA). Em particular, há evidências fortes indicando um papel de alterações na expressão de isoformas da MHC na patogénese de falha cardiaca em humanos. De fato, os niveis de mRNA e proteínas de α-MHC estão acentuadamente reduzidos em corações humanos em falha, e a melhoria da fração de ejeção do ventrículo esquerdo através de terapia com bloqueadores beta está associada à normalização da expressão de α-MHC. Adicionalmente, foi identificada uma mutação no gene α-MHC humano em associação com cardiomiopatia hipertrófica, o que demonstra que, apesar da sua baixa abundância, o nivel de expressão de α-MHC é critico para uma função cardiaca normal. Assim, é claro que a- e β-MHC desempenham um papel no desenvolvimento de hipertrofia cardiaca, mas as caracteristicas precisas da atuação destes produtos na criação e/ou manutenção do estado patológico permanecem desconhecidas.

De acordo com a presente invenção, é proporcionado o seguinte: 1. Um inibidor do miR-208 para utilização num método de prevenção ou tratamento de hipertrofia cardiaca patológica, falha cardiaca, ou enfarte do miocárdio, em que o inibidor do miR-208 é um oligonucleótido 3 antissentido possuindo uma sequência que é complementar a uma sequência do miR-208. 2. 0 inibidor para utilização de acordo com o item 1, em que o inibidor é um oliqonucleótido curto de filamentação simples quimicamente manipulado complementar ao miR-208 que bloqueia a função do miR-208. 3. 0 inibidor para utilização de acordo com o item 1, em que o oligonucleótido antissentido tem uma sequência complementar à SEQ ID NO: 5. 4. 0 inibidor para utilização de acordo com o item 1, em que o oligonucleótido antissentido contém pelo menos um nucleótido 2'-O-metil-modifiçado . 5. 0 inibidor para utilização de acordo com o item 1, em que o inibidor é administrado a um sujeito necessitado por administração intravenosa, oral, transdérmica, de libertação prolongada, de libertação controlada, de libertação retardada, por supositório, subcutânea, intraperitoneal, ou sublingual ou injeção direta no tecido cardiaco. 6. 0 inibidor para utilização de acordo com o item 1, em que o inibidor é administrado a um sujeito necessitado em combinação com uma segunda terapia cardíaca. 7. 0 inibidor para utilização de acordo com o item 6, em que a referida segunda terapia é selecionada do grupo que consiste num bloqueador beta, um ionotropo, um diurético, ACE-I, antagonista de AII, BNP, um 4 bloqueador de Ca++, um antagonista de recetores da endotelina, e um inibidor de HDAC. 8. 0 inibidor para utilização de acordo com o item 1, em que a administração do inibidor melhora um ou mais sintomas de hipertrofia cardíaca patológica, falha cardíaca, ou enfarte do miocárdio num sujeito, em que os referidos um ou mais sintomas melhorados são selecionados do grupo que consiste em capacidade de exercício aumentada, volume de ejeção cardíaca aumentado, pressão diastólica final ventricular esquerda diminuída, pressão de oclusão capilar pulmonar diminuída, débito cardíaco, ou índice cardíaco, aumentado, pressões arteriais pulmonares diminuídas, dimensões sistólica e diastólica finais do ventrículo esquerdo diminuídas, esforço diminuído das paredes ventriculares esquerda e direita, tensão diminuída das paredes, melhor qualidade de vida, e menor morbidez ou mortalidade relacionada com a doença. 9. A utilização de um inibidor do miR-208 para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a utilização num método de prevenção ou tratamento de hipertrofia cardíaca patológica, falha cardíaca, ou enfarte do miocárdio, em que o inibidor do miR-208 é um oligonucleótido antissentido possuindo uma sequência que é complementar a uma sequência do miR-208.

RESUMO É divulgado um método de regulação da contratilidade e remodelação cardíacas, que compreende administrar um modulador da expressão ou atividade do miR-208 em células cardíacas. É divulgado um método de regulação da expressão 5 de genes de proteínas contráteis cardíacas, que compreende administrar um modulador da expressão ou atividade do miR-208 em células cardíacas. O modulador pode ser um agonista ou um antagonista da expressão ou atividade do miR-208. É divulgado um método de redução da expressão de β-MHC em células cardíacas, que compreende administrar um inibidor da expressão ou atividade do miR-208 nas células cardíacas. É divulgado um método para aumentar a expressão de β-MHC em células cardíacas, que compreende aumentar a expressão ou atividade do miR-208 endógeno ou administrar miR-208 exógeno nas células cardíacas. É divulgado um método para aumentar a expressão de um gene de proteínas contráteis rápidas do músculo esquelético em células cardíacas, que compreende administrar nas células cardíacas um inibidor da expressão ou atividade do miR-208. É divulgado um método para diminuir a expressão de um gene de proteínas contráteis rápidas do músculo esquelético em células cardíacas, que compreende aumentar a expressão ou atividade do miR-208 endógeno ou administrar miR-208 exógeno nas células cardíacas. Exemplos de genes de proteínas contráteis rápidas do músculo esquelético que podem ser aumentados ou diminuídos de acordo com os métodos divulgados incluem: troponina I esquelética; troponina T3, cadeia leve de miosina, ou oí-actina esquelética. É divulgado um método de tratamento de hipertrofia cardíaca patológica ou falha cardíaca, que compreende: identificar um paciente que sofre de hipertrofia cardíaca, falha cardíaca, ou remodelação pós-enfarte do miocárdio; e inibir a expressão ou atividade do miR-208 em células cardíacas do paciente. É divulgado um método de prevenção de hipertrofia patológica ou falha cardíaca, que compreende: identificar um paciente em risco de desenvolver hipertrofia cardíaca 6 patológica ou falha cardíaca; e inibir a expressão ou atividade do miR-208 em células cardíacas do paciente. É divulgado um método de tratamento de enfarte do miocárdio, que compreende inibir a expressão ou atividade do miR-208 em células cardíacas do referido sujeito. É divulgado um método de prevenção de hipertrofia cardíaca e cardiomiopatia dilatada, que compreende inibir a expressão ou atividade do miR-208 em células cardíacas de um sujeito. É divulgado um método para inibir a progressão de hipertrofia cardíaca, que compreende inibir a expressão ou atividade do miR-208 em células cardíacas de um sujeito. É divulgado um método para aumentar a tolerância ao exercício, reduzir a hospitalização, melhorar a qualidade de vida, diminuir a morbidez, e/ou diminuir a mortalidade num sujeito que sofre de falha cardíaca ou hipertrofia cardíaca, que compreende inibir a expressão ou atividade do miR-208 em células cardíacas do sujeito. É divulgado um método para aumentar a expressão de α-MHC em células cardíacas por administração de um inibidor do miR-208 em condições patológicas.

Em certos aspetos da invenção, é proporcionado um antagomir do miR-208 para utilização num método destinado a inibir a expressão ou atividade do miR-208, em que o antagomir é administrado. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um antagomir do miR-208. A administração do antagomir ou outro modulador da expressão ou atividade do miR-208 pode ser efetuada por qualquer método, conhecido dos profissionais, adequado para distribuição no órgão, tecido, ou tipo de célula alvo. Por exemplo, o modulador do miR-208 pode ser administrado por injeção intravenosa, injeção intra-arterial, injeção intrapericárdica, ou 7 injeção direta no tecido (por exemplo, tecido cardiaco, tecido do músculo esquelético). Nalguns aspetos, a administração compreende administração oral, transdérmica, intraperitoneal, subcutânea, de libertação prolongada, de libertação controlada, de libertação retardada, por supositório, ou sublingual do miR-208.

Em certos aspetos da invenção, é proporcionado um inibidor do miR-208 para utilização num método de tratamento ou prevenção de hipertrofia cardiaca patológica ou falha cardíaca num paciente, que também compreende administrar ao paciente uma segunda terapia para hipertrofia cardíaca. A segunda terapia pode ser, por exemplo, um bloqueador beta, um ionotropo, um diurético, ACE-I, antagonista de AII, BNP, um bloqueador de Ca++, e ERA, ou um inibidor de HDAC. A referida segunda terapia pode ser administrada antes, ao mesmo tempo, ou após a inibição do miR-208. 0 tratamento de hipertrofia cardíaca patológica ou falha cardíaca pode ser definido como uma melhoria de um ou mais sintomas de hipertrofia cardíaca patológica ou falha cardíaca. Os sintomas melhorados podem ser, por exemplo, capacidade de exercício aumentada, volume de ejeção cardíaca aumentado, pressão diastólica final ventricular esquerda diminuída, pressão de oclusão capilar pulmonar diminuída, débito cardíaco, ou índice cardíaco, aumentado, pressões arteriais pulmonares diminuídas, dimensões sistólica e diastólica finais do ventrículo esquerdo diminuídas, esforço diminuído das paredes ventriculares esquerda e direita, tensão diminuída das paredes, melhor qualidade de vida, e menor morbidez ou mortalidade relacionada com a doença. 0 tratamento de hipertrofia cardíaca patológica também pode ser definido como um 8 retardamento da transição de hipertrofia cardíaca para falha cardíaca. São divulgados métodos de prevenção de hipertrofia patológica ou falha cardíaca num paciente em risco de desenvolver hipertrofia cardíaca patológica ou falha cardíaca. 0 paciente em risco de desenvolver hipertrofia cardíaca patológica ou falha cardíaca pode exibir um ou mais fatores de risco, incluindo, por exemplo, hipertensão descontrolada de longa duração, doença valvular não corrigida, angina crónica, enfarte do miocárdio recente, predisposição congénita para doença cardíaca ou hipertrofia patológica. Em certos aspetos, o paciente em risco pode ser diagnosticado como tendo uma predisposição genética para hipertrofia cardíaca. Nalguns aspetos, o paciente em risco pode ter um historial familiar de hipertrofia cardíaca. É divulgado um método para diminuir a expressão ou atividade de um gene de proteínas contráteis rápidas do músculo esquelético em células do músculo esquelético, que compreende administrar miR-208 nas células do músculo esquelético. É divulgado um método de tratamento ou prevenção de uma perturbação musculoesquelética num sujeito, que compreende: identificar um paciente que sofre ou em risco de sofrer de uma perturbação musculoesquelética; e aumentar a expressão e/ou atividade do miR-208 em células do músculo esquelético do referido paciente. A perturbação musculoesquelética pode ser, por exemplo, atrofia por desuso, perda muscular em resposta a microgravidade, ou denervação. Em certos aspetos, o método de tratamento ou prevenção da perturbação musculoesquelética também compreende administrar uma segunda terapia diferente de miR-208. 9

Aumentar a expressão e/ou atividade do miR-208 pode compreender administrar miR-208 ao sujeito ou administrar ao sujeito um vetor de expressão que expressa o miR-208. 0 vetor de expressão é um vetor de expressão virai. 0 vetor de expressão virai pode ser, por exemplo, um vetor de expressão adenoviral ou retroviral. Em certos aspetos, o vetor de expressão é um vetor de expressão não virai. Em certos aspetos da invenção, miR-208 ou um vetor de expressão que codifica o miR-208 está associado a um veiculo lipidico. Alternativamente, é possível simplesmente proporcionar miR-208 por si próprio, opcionalmente incluído num veículo de distribuição, tal como um lipossoma ou nanopartícula. 0 fato de o miR 208 ser específico do coração irá prevenir a ocorrência de efeitos secundários indesejados noutros órgãos. É divulgado um método para identificar um modulador do miR-208, que compreende: (a) contactar uma célula com um composto candidato; avaliar a atividade ou expressão do miR-208; e (b) comparar a atividade ou expressão do passo (b) com a atividade ou expressão na ausência do composto candidato, em que uma diferença entre as atividades ou expressão medidas indica que o composto candidato é um modulador do miR-208. Em certos aspetos, a célula é contactada com o composto candidato in vitro. Noutros aspetos, a célula é contactada com o composto candidato in vivo. 0 modulador do miR-208 pode ser um agonista ou antagonista do miR-208. Exemplos de compostos candidatos que podem ser rastreados de acordo com os métodos descritos são péptidos, polipéptidos, polinucleótidos, ou moléculas pequenas. 10

Avaliar a atividade ou expressão do miR-208 pode compreender avaliar o nível de expressão do miR-208. Os profissionais estarão familiarizados com uma variedade de métodos para avaliar níveis de expressão de RNA, incluindo, por exemplo, coloração "Northern" ou RT-PCR. Avaliar a atividade ou expressão do miR-208 pode compreender avaliar a atividade do miR-208. Nalguns aspetos, avaliar a atividade do miR-208 compreende avaliar a expressão ou atividade de genes regulados pelo miR-208. Genes regulados pelo miR-208 incluem, por exemplo, a cadeia pesada de α e β-miosina e genes de proteínas rápidas do músculo esquelético, tais como troponina I esquelética rápida, troponina T3, cadeia leve de miosina, e alfa actina esquelética. Em certos aspetos, avaliar a atividade do miR-208 compreende avaliar a razão entre o nível de expressão da cadeia pesada de α-miosina e o nível de expressão da cadeia pesada de β-miosina. Os profissionais estarão familiarizados com uma variedade de métodos para avaliar a atividade ou expressão de genes regulados pelo miR-208. Esses métodos incluem, por exemplo, coloração "Northern", RT-PCR, ELISA, ou coloração "Western". e/ou cardíacas É divulgado um modulador do miR-208 identificado por um método que compreende: (a) contactar uma célula com um composto candidato; avaliar a atividade ou expressão do miR-208; e (b) comparar a atividade ou expressão do passo (b) com a atividade ou expressão na ausência do composto candidato, em que uma diferença entre as atividades ou expressão medidas indica que o composto candidato é um modulador do miR-208. Moduladores do miR-208 podem ser incluídos em composições farmacêuticas para o tratamento de perturbações cardíacas e/ou perturbações 11 musculoesqueléticas de acordo com os métodos da presente invenção. É divulgado um inibidor do miR-208 identificado por um método que compreende: (a) contactar uma célula com um composto candidato; (b) avaliar a atividade ou expressão do miR-208; e (c) comparar a atividade ou expressão do passo (b) com a atividade ou expressão na ausência do composto candidato, em que uma redução da atividade ou expressão na célula contactada com o composto candidato, em comparação com a atividade ou expressão na célula na ausência do composto candidato, indica que o composto candidato é um inibidor do miR-208. É divulgado um método de tratamento de hipertrofia cardíaca patológica ou falha cardíaca, que compreende: identificar um paciente que sofre de hipertrofia cardíaca ou falha cardíaca; e administrar ao paciente um inibidor do miR-208. Em certos aspetos, o inibidor do miR-208 pode ser identificado por um método que compreende: (a) contactar uma célula com um composto candidato; (b) avaliar a atividade ou expressão do miR-208; e (c) comparar a atividade ou expressão do passo (b) com a atividade ou expressão na ausência do composto candidato, em que uma redução da atividade ou expressão do miR-208 na célula contactada com o composto candidato, em comparação com a atividade ou expressão na célula na ausência do composto candidato, indica que o composto candidato é um inibidor do miR-208. É divulgado um método de tratamento de uma perturbação musculoesquelética, que compreende: identificar um paciente que sofre de uma perturbação musculoesquelética ou em risco 12 de desenvolver uma perturbação musculoesquelética; e administrar ao paciente um agonista do miR-208. Em certos aspetos, o agonista do miR-208 pode ser identificado por um método que compreende: (a) contactar uma célula com um composto candidato; (b) avaliar a atividade ou expressão do miR-208; e (c) comparar a atividade ou expressão do passo (b) com a atividade ou expressão na ausência do composto candidato, em que um aumento da atividade ou expressão do miR-208 na célula contactada com o composto candidato, em comparação com a atividade ou expressão na célula na ausência do composto candidato, indica que o composto candidato é um agonista do miR-208. É divulgado um mamífero não humano transgénico, cujas células não conseguem expressar um miR-208 funcional. É divulgado um mamífero não humano transgénico, cujas células compreendem uma região codificadora do miR-208 sob o controlo de um promotor heterólogo ativo nas células do referido mamífero não humano. 0 mamífero transgénico pode ser, por exemplo, um ratinho ou um rato. 0 promotor pode ser um promotor específico para tecidos, tal como, por exemplo, um promotor específico para o músculo esquelético ou um promotor específico para o coração. É divulgada uma célula de mamífero não humano transgénico desprovida de um ou ambos os alelos nativos do miR-208. A utilização da palavra "um" ou "uma", quando usada em conjunção com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou na especificação, pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um", e "um ou mais do que um". 13 É contemplado que qualquer forma de realização discutida aqui possa ser implementada relativamente a qualquer composição da invenção, e vice-versa. Além disso, composições da invenção podem ser utilizadas para implementar os métodos divulgados.

Ao longo deste requerimento, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui o desvio padrão do erro para o dispositivo ou método empregue para determinar o valor. A utilização do termo "ou" nas reivindicações é usada para significar "e/ou", a menos que seja explicitamente indicado que se refere apenas a alternativas ou que as alternativas são mutuamente exclusivas, apesar de a divulgação suportar uma definição que se refere apenas a alternativas e "e/ou".

Como usadas nesta especificação e reivindicação (reivindicações), as palavras "compreendendo" (e qualquer forma de compreendendo, tal como "compreendem" e "compreende"), "possuindo" (e qualquer forma de possuindo, tal como "possuem" e "possui"), "incluindo" (e qualquer forma de incluindo, tal como "inclui" e "incluem") ou "contendo" (e qualquer forma de contendo, tal como "contém" e "contêm") são inclusivas ou abertas e não excluem elementos ou passos de métodos adicionais não relatados.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS

As seguintes figuras fazem parte da presente especificação e são incluidas para demonstrar adicionalmente certos aspetos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a uma ou mais destas figuras em 14 combinação com a descrição pormenorizada de formas de realização especificas apresentadas aqui. FIG. 1 - 0 miR-208 está contido no gene α-MHC cardíaco. 0 miR-208 é codificado pelo intrão 27 do gene aMHC. Os asteriscos indicam conservação de sequências. FIG. 2 - 0 miR-2 0 8 tem o mesmo padrão de expressão do ot-MHC. Deteção de transcritos de miR-208 por análise "Northern" de tecidos de ratinho adulto. 0 mRNA U6 serve de controlo de carga. FIGS. 3A-C - Regulação da expressão do miR-208 por hormona da tiroide. (FIG. 3A) Diagrama da regulação por PTU/T3 de a- e β MHC. (FIG. 3B) Os ratos foram tratados com PTU durante uma semana na presença e na ausência de T3, e mRNAs de aMHC e β MHC foram detetados por PCR em tempo real. (FIG 3C) Os ratos foram tratados com PTU ou PTU + T3, consoante o indicado, durante uma semana, e a expressão do miR-208 foi detetada por coloração "Northern". Foram analisados corações de quatro animais sob cada condição. FIGS. 4A-C - A inibição da expressão de α-MHC conduz a niveis decrescidos de miR-208. (FIGS. 4A-B) Niveis de expressão relativos para transcritos de a- e βMHC aos 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 dias. (FIG. 4C) Análise de coloração "Northern" do miR-208 em tecido cardíaco de rato, nos instantes indicados, durante o tratamento com PTU. FIGS. 5A-B - Eliminação de um gene do miR-208. (FIG. 5A) Estratégia para gerar ratinhos mutantes no miR-208 por recombinação homóloga. A sequência pré-miRNA foi substituída por uma cassete de resistência a neomicina 15 (Neo) flanqueada por sítios ΙοχΡ. A cassete de neomicina foi removida na linha germinativa de ratinho por criação de ratinhos heterozigóticos em ratinhos transgénicos albergando o transgene CAG-Cre. DTA, toxina da difteria A. (FIG. 5B) Deteção de transcritos do miR-208 por análise "Northern" de corações de ratinhos de tipo selvagem (TS) e mutantes no miR-208 (KO). FIGS. 6A-B - A deleção de miR-208 não altera a expressão de g-MHC. (FIG. 6A) Análise de transcritos de aMHC por RT-PCR de RN A de corações de ratinhos dos genótipos indicados. Estão mostradas as posições de "primers" relativamente a exões de aMHC e os pares de "primers" estão por cima de cada conjunto de amostras. (FIG. 6B) Análise "Western" de níveis proteicos de aMHC e bMHC em corações de ratinhos neonatais dos genótipos indicados. Foram analisados dois ratinhos de cada genótipo. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi detetada como controlo de carga. FIG. 7 - Regulação positiva de genes esqueléticos rápidos em "knock-out" no miR-208. FIG. 8 - Desregulação de genes de resposta a "stress cardíaco em ratinhos "knock-out" no miR-208. FIG. 9 - Um modelo do papel do miR-208 na regulação de genes cardíacos. 0 gene aMHC codifica miR-208, que regula negativamente a expressão de THRAP1 e genes musculoesqueléticos (e provavelmente alvos adicionais) . Os genes a- e βMHC estão ligados, e o miR-208 é requerido para a regulação positiva de β MHC em resposta a sinalização de "stress" e bloqueio da sinalização de T3 por PTU. a- e PMHC promovem a contratilidade rápida e lenta, respetivamente. 16 FIG. 10 - Amostras de corações humanos: sem falha versus em falha. FIG. 11 - THRAP1 como alvo previsto do miR-208. 0 alinhamento de sequências do sitio de ligação do miR-208 putativo na 3' UTR de THRAP1 mostra um nivel elevado de complementaridade e conservação de sequências. FIG. 12 - Ensaio de luciferase da 3' UTR de THRAP1. FIG. 13 - Regulação positiva de genes rápidos do músculo esquelético em corações de ratinhos mutantes no miR-208. FIGS. 14A-E - Anál ise de animais de tipo selvagem e miR- 208-/~ após TAB. (FIG. 14A) Foi detetada expressão de mRNA de aMHC por PCR em tempo real em ratinhos de tipo selvagem e miR-208_/” após operação ficticia ou TAB durante 21 dias. (FIG. 14B) Foi detetado miR-208 por coloração "Northern" de tecido cardiaco de ratinhos de tipo selvagem e miR-208_/~. (FIG. 14C) A análise ecocardiográfica indicou um decréscimo em FS devido a um aumento do LV em dilatação sistólica (LVIDs) em companheiros de ninhada miR-208_/“ e de tipo selvagem em resposta a TAB. A espessura da parede anterior e posterior (AW e PW) na sistole (s) ou diástole (d) após TAB indica uma resposta hipertrófica atenuada em animais miR-208 /_ em comparação com animais de tipo selvagem (n = 5-7 por grupo). * p < 0,05 em comparação com o grupo correspondente de tipo selvagem. (FIG. 14D) Deteção de transcritos de miR-208 por análise "Northern" de corações de ratinhos de tipo selvagem e transgénicos no miR-208. (FIG. 14E) Os transcritos para aMHC, βΜΗΟ, ANF e BNP foram detetados por PCR em tempo real em corações do genótipo 17 indicado. Os valores estão expressos em aumento, em número de vezes, da expressão (± MEP) em comparação com ratinhos de tipo selvagem (n = 3). FIGS. 15A-G - Ratinhos miR-208~/~ exibem hipertrofia cardíaca reduzida em resposta a sobrecarga de pressão. (FIG. 15A) Secções histológicas de corações de ratinhos de tipo selvagem e miR-208“/_ coradas para tricrómico de Masson. A ausência de miR-208 diminui a hipertrofia e fibrose observadas em ratinhos de tipo selvagem sujeitos a TAB durante 21 dias. A barra de escala iguala 2 mm no painel de cima e 20 pm no painel de baixo. (FIG. 15B) Os transcritos para βΜΗ<2, ANF e BNP foram detetados por PCR em tempo real em corações de ratinhos de tipo selvagem e miR-208_/~ após cirurgia fictícia ou TAB. Os valores estão expressos em aumento, em número de vezes, da expressão (± MEP) em comparação com os ratinhos de tipo selvagem sujeitos a operação fictícia (n = 3) . (FIG. 15C) Análise "Western" de níveis proteicos de aMHC e βΜΗΟ em ratinhos adultos de tipo selvagem e mutantes no miR-208 21 dias após cirurgia ficticia e TAB. (FIG. 15D) Secções histológicas de corações de ratinhos com 6 semanas de idade gue expressam um transgene de calcineurina (CnA-Tg) e corações de miR-208“/_; CnA-Tg corado para tricrómico de Masson. A ausência de miR-208 diminui a hipertrofia e fibrose observadas em ratinhos CnA-Tg. A barra de escala iguala 2 mm no painel de cima e 20 pm no painel de baixo. (FIG. 15E) Os transcritos para βΜΗ^ ANF e BNP foram detetados por PCR em tempo real em corações do genótipo indicado. Os valores estão expressos em aumento, em número de vezes, da expressão (± MEP) em comparação com ratinhos de tipo selvagem (n = 3) . (FIG. 15F) Análise "Western" de níveis proteicos de aMHC e βMHC em ratinhos adultos de tipo selvagem e mutantes no 18 miR-208 com e sem a presença do transgene CnA. (FIG. 15G) Análise "Western" de níveis proteicos de aMHC e βΜΒΚ em animais adultos tipo selvagem e transgénicos no miR-208. FIGS. 16A-C - Análise de animais de tipo selvagem e miR- 208-/~ após tratamento com PTU. (FIG. 16A) Foi detetado miR-208 por coloração "Northern" de tecido cardíaco de ratinhos de tipo selvagem e miR-208_/“ após tratamento com PTU. (FIG. 16B) A ecocardiografia mostrou um decréscimo comparável no batimento cardíaco (HR) e fração de encurtamento (FS) em ratinhos de tipo selvagem e miR-208_/“ em resposta ao PTU, devido a aumento da dilatação do LV (LVID) na diástole (d) e na sístole (s) , e adelgaçamento da parede anterior e posterior do LV (AW, PW) (n = 6). * p < 0,05 em comparação com o grupo correspondente de tipo selvagem. (FIG. 16C) Foram detetados transcritos para ANF e BNP por PCR em tempo real em corações de ratinhos de tipo selvagem e miR-208_/_ após tratamento com PTU. Os valores estão expressos em aumento, em número de vezes, da expressão (± MEP) em comparação com os ratinhos de tipo selvagem que receberam ração normal (n = 3) . FIGS. 17A-B - Regulação da capacidade de resposta a hormonas da tiroide do gene βMHC pelo miR-208. (FIG. 17A) Análise "Western" da expressão de aMHC e PMHC em ratinhos de tipo selvagem e mutantes no miR-208 na referência e 2 semanas após o tratamento com PTU. (FIG. 17B) Foram detetados transcritos para aMHC e β MHC por PCR em tempo real em corações de ratinhos de tipo selvagem e miR-208_/“ após tratamento com PTU. Os valores estão expressos em aumento, em número de vezes, da expressão (± MEP) em comparação com ratinhos de tipo selvagem que receberam ração normal (n = 3). 19 FIGS. 18A-D - 0 miR-208 aborda seletivamente THRAP1. (FIG. 18A) 0 alinhamento de sequências do sítio de ligação putativo do miR-208 na 3' UTR de THRAP1 mostra um nível elevado de complementaridade e conservação de sequências. (FIG. 18B) Células COSI foram transfetadas com uma construção de 3' UTR de THRAP1 luciferase, juntamente com plasmídeos de expressão para miR-126 e miR-208. Os valores estão apresentados em alteração, em número de vezes, da expressão de luciferase (± DP) em comparação com o repórter isoladamente. (FIG. 18C) COSI foram transfetadas com HA-MCD-UTR TS ou HA-MCD-UTR mutada juntamente com dosagens crescentes de pCMV-miR-208, variando entre 0,1-2 pg. Os níveis de HA foram detetados utilizando imunocoloração. (FIG. 18D) Coloração "Western" de THRAP1 utilizando um anticorpo específico para THRAP1 em lisados de células cardíacas imunoprecipitados com THRAPl utilizando 400 pg de proteína de animais de tipo selvagem ou miR-208~7~. FIG. 19 - Análise por RT-PCR de transcritos de THRAPl.

Análise de transcritos de THRAPl por RT-PCR de RNA de corações de ratinhos de tipo selvagem e ratinhos miR-208~7~. Estão indicadas as posições dos "primers" no transcrito de mRNA. FIG. 20 - Anál ise por PCR em tempo real de alvos de sinalização de recetores de hormonas da tiroide. Foram detetados transcritos para SERCA2a e PLB, e GLUT4 por PCR em tempo real em corações de ratinhos de tipo selvagem e miR-208-7-. Os valores estão expressos em alteração, em número de vezes, da expressão (± MEP) em comparação com ratinhos de tipo selvagem. 20 FIG. 21 - Coloração "Northern" que mostra a expressão do miR-499 em corações de ratinhos de tipo selvagem, miR-208+/~ e miR-208~/~. Há uma correlação direta entre a expressão do miR-208 e miR-499, bem como Myh7b, em ratinhos de tipo selvagem e mutantes. FIG. 22 - Estrutura do locus de Myh7b e a posição da região codificadora de miR-499 dentro daguele. FIG. 23 - Coloração de RNA mostrando expressão do miR-499 no coração e soleus. O miR-499 não é expresso em fibras rápidas musculoesqueléticas, tais como gastrocnemius/ plantaris (GP), tibialis anterior (TA) ou digitorum longus extensor (EDL). FIG. 24 - Coloração "Northern" mostrando expressão do miR-499 em ratinhos de tipo selvagem com doença cardíaca. MI, enfarte do miocárdio. CnA Tg, ratinhos transgénicos em calcineurina. FIG. 25 - Diagrama esquemático da regulação do miR-499 pelo miR-208 em músculo cardíaco. FIGS. 26A-C - Expressão de miRNA durante hipertrofia cardíaca. (FIG. 26A) Secções coradas com H&E de corações representativos de ratinhos após cirurgia fictícia e TAB durante 21 dias e de ratinhos CnA Tg. A barra de escala iguala 2 mm. (FIG. 2 6B) Os diagramas de Venn que mostram números de microRNAs cuja expressão foi alterada em cada tipo de coração estão mostrados em baixo. (FIG. 26C) Colorações "Northern" de microRNAs cuja expressão foi 21 alterada durante hipertrofia. 0 RNA de U6 foi detetado como controlo da carga. FIG. 27 - A expressão do miR-29 é regulada negativamente em resposta a "stress" cardiaco. Estão mostrados à esquerda corações de ratinhos de tipo selvagem (TS) e ratinhos com hipertrofia e fibrose induzidas por um transgene de calcineurina (CnA) ou TAB. 0 nivel relativo de expressão do miR-29 em cada tipo de coração está mostrado à direita. FIG. 28 - Análise de microsséries de corações de ratinhos "knockout" no miR-208 em comparação com o tipo selvagem. Foi efetuada análise de microsséries em mRNA isolado de corações de tipo selvagem e nulos para miR-208 às 6 semanas de idade. 0 miRNA com maior regulação negativa, a seguir ao miR-208, é o miR-499. FIG. 29 - A família miR-29 é regulada positivamente de modo dramático em corações nulos para miR-208. FIG. 30 - A família miR-29 aborda seletivamente mRNAs que codificam colagénios e outros componentes da matriz extracelular envolvidos em fibrose. FIG. 31 - Modelo do controlo de fibrose cardíaca pela família miR-208 e miR-29. No coração normal, o miR-208 inibe a expressão do miR-29. Na ausência do miR-208, a expressão do miR-29 é regulada positivamente, prevenindo a expressão da matriz extracelular e fibrose em resposta a "stress". As funções do miR-208, -499 e -29 estão interligadas. A perda do miR-208 pode ser cardioprotetora, ao prevenir a expressão do miR-499 e regulação positiva da expressão do miR-29, com bloqueio consequente de fibrose. 22

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO

ILUSTRATIVAS A falha cardíaca é uma das principais causas de morbidez e mortalidade no mundo. Só nos Estados Unidos, estimativas indicam que 3 milhões de pessoas estão presentemente a viver com cardiomiopatia e mais 400 000 são diagnosticadas numa base anual. A cardiomiopatia dilatada (DCM), também chamada de "cardiomiopatia congestiva", é a forma mais comum das cardiomiopatias e tem uma predominância estimada de quase 40 por 100 000 indivíduos (Durand et al., 1995) . Apesar de haver outras causas de DCM, a cardiomiopatia dilatada familiar tem sido indicada como representando aproximadamente 20% de DCM "idiopática". Aproximadamente metade dos casos de DCM são idiopáticos, e o restante está associado a processos de doenças conhecidos. Por exemplo, danos miocárdicos graves podem resultar de certos fármacos utilizados em quimioterapia de cancro (por exemplo, doxorrubicina e daunorrubicina). Além disso, muitos pacientes com DCM são alcoólicos crónicos. Felizmente, para estes pacientes, a progressão da disfunção miocárdica pode ser interrompida ou revertida se o consumo de álcool for reduzido ou terminado precocemente no decurso da doença. A cardiomiopatia periparto é outra forma idiopática de DCM, tal como doença associada a sequelas infeciosas. Em resumo, as cardiomiopatias, incluindo DCM, são problemas importantes de saúde pública. A doença cardíaca e suas manifestações, incluindo doença da artéria coronária, enfarte do miocárdio, falha cardíaca congestiva e hipertrofia cardíaca, apresentam claramente um grande risco de saúde nos Estados Unidos hoje em dia. 0 custo do diagnóstico, tratamento e suporte de pacientes que 23 sofrem destas doenças está bem dentro dos milhares de milhões de dólares. Duas manifestações particularmente graves de doença cardiaca são enfarte do miocárdio e hipertrofia cardiaca. Relativamente ao enfarte do miocárdio, ocorre tipicamente uma oclusão coronária trombocitica aguda numa artéria coronária devido a aterosclerose, e causa morte de células do miocárdio. Uma vez que os cardiomiócitos, as células do músculo cardíaco, são diferenciados de modo terminal e geralmente incapazes de sofrer divisão celular, geralmente são substituídos por tecido cicatricial quando morrem durante um enfarte agudo do miocárdio. 0 tecido cicatricial não é contrátil, não consegue contribuir para a função cardíaca, e muitas vezes desempenha um papel prejudicial na função cardíaca ao expandir durante a contração cardíaca, ou aumentando a dimensão e raio efetivo do ventrículo, por exemplo, tornando-se hipertrófico. Relativamente a hipertrofia cardíaca, uma teoria considera-a uma doença que se assemelha a um desenvolvimento aberrante e, como tal, levanta a questão de se sinais de desenvolvimento no coração podem contribuir para doença hipertrófica. A hipertrofia cardíaca é uma resposta adaptativa do coração a virtualmente todas as formas de doença cardíaca, incluindo as provenientes de hipertensão, carga mecânica, enfarte do miocárdio, arritmias cardíacas, perturbações endócrinas, e mutações genéticas em genes de proteínas contráteis do coração. Não obstante a resposta hipertrófica ser inicialmente um mecanismo compensador que aumenta o débito cardíaco, hipertrofia prolongada pode conduzir a DCM, falha cardíaca, e morte súbita. Nos Estados Unidos, aproximadamente meio milhão de indivíduos são diagnosticados com falha cardíaca anualmente, com uma taxa de mortalidade que se aproxima dos 50%. 24

As causas e efeitos de hipertrofia cardíaca têm sido extensamente documentados, mas os mecanismos moleculares subjacentes não foram elucidados. A compreensão destes mecanismos é uma preocupação importante na prevenção e tratamento de doença cardíaca, e será crucial como modalidade terapêutica na conceção de novos fármacos que abordem especificamente hipertrofia cardíaca e falha cardíaca. Uma vez que a hipertrofia cardíaca patológica tipicamente não produz quaisquer sintomas até os danos cardíacos serem suficientemente graves para produzirem falha cardíaca, os sintomas de cardiomiopatia são os associados a falha cardíaca. Estes sintomas incluem respiração ofegante, fadiga com esforço, a incapacidade para permanecer deitado sem ficar com dificuldade em respirar (ortopneia), dispneia paroxística noturna, dimensões cardíacas aumentadas, e/ou inchaço na parte inferior das pernas. Também é frequente os pacientes apresentarem pressão sanguínea aumentada, sons cardíacos extra, murmúrios cardíacos, embolias pulmonar e sistémica, dor no peito, congestão pulmonar, e palpitações. Adicionalmente, a DCM causa frações de ejeção diminuídas (isto é, uma medida da função e remodelação sistólica intrínsecas). A doença é adicionalmente caracterizada por dilatação ventricular e função sistólica muito enfraquecida devido a contratilidade miocárdica diminuída, conducente a falha cardíaca dilatada em muitos pacientes. Os corações afetados também sofrem remodelação de células/câmaras devido à disfunção miocítica/miocárdica, que contribui para o "fenótipo de DCM". À medida que a doença progride, o mesmo acontece com os sintomas. Os pacientes com DCM também têm uma incidência muito aumentada de arritmias com risco de vida, incluindo taquicardia ventricular e fibrilação 25 ventricular. Nestes pacientes, um episódio de sincope (tonturas) é considerado um prenúncio de morte súbita. 0 diagnóstico de cardiomiopatia dilatada depende tipicamente da demonstração de câmaras cardíacas dilatadas, particularmente ventrículos dilatados. A dilatação é habitualmente observável em raios X ao peito, mas é avaliada de modo mais rigoroso utilizando ecocardiogramas. É muitas vezes dificil de distinguir a DCM de miocardite aguda, doença cardiaca valvular, doença da artéria coronária, e doença cardiaca hipertensiva. Depois de feito o diagnóstico de cardiomiopatia dilatada, são feitos todos os esforços para identificar e tratar causas potencialmente reversíveis e prevenir outros danos cardíacos. Por exemplo, devem ser excluídas doença da artéria coronária e doença cardíaca valvular. É necessário abordar e controlar anemia, taquicardias anormais, deficiências nutricionais, alcoolismo, doença da tiroide e/ou outros problemas.

Como mencionado acima, o tratamento com agentes farmacológicos ainda representa o mecanismo principal de redução ou eliminação das manifestações de falha cardíaca. Os diuréticos constituem a primeira linha de tratamento de falha cardíaca ligeira até moderada. Infelizmente, muitos dos diuréticos habitualmente utilizados (por exemplo, as tiazidas) têm numerosos efeitos adversos. Por exemplo, certos diuréticos podem aumentar o colesterol e triglicéridos no soro. Além disso, os diuréticos são geralmente ineficazes para pacientes que sofrem de falha cardíaca grave.

Quando os diuréticos são ineficazes podem ser utilizados agentes vasodilatadores; os inibidores da enzima conversora 26 de angiotensina (ACE) (por exemplo, enalopril e lisinopril) não só proporcionam alívio sintomático, tendo também sido relatado que diminuem a mortalidade (Young et al., 1989). No entanto e mais uma vez, os inibidores da ACE estão associados a efeitos adversos que levam à sua contraindicação em pacientes com certos estados de doença (por exemplo, estenose da artéria renal). De modo semelhante, a terapia com agentes inotrópicos (isto é, um fármaco que melhora o débito cardíaco por aumento da força de contração do músculo miocárdico) está associada a uma panóplia de reações adversas, incluindo problemas gastrointestinais e disfunção do sistema nervoso central.

Assim, os agentes farmacológicos correntemente utilizados têm desvantagens graves em populações de pacientes particulares. A disponibilidade de agentes novos, seguros e eficazes iria indubitavelmente beneficiar pacientes que não podem utilizar as modalidades farmacológicas presentemente disponíveis, ou que não recebem um alívio adequado dessas modalidades. 0 prognóstico para pacientes com DCM é variável, e depende do grau de disfunção ventricular, com a maior parte das mortes ocorrendo num período de cinco anos após o diagnóstico. I. A Presente Invenção A razão entre as isoformas a- e β-MHC no coração adulto é um determinante principal da contratilidade cardíaca. A β-MHC, a principal isoforma de miosina no coração adulto, exibe atividade de ATPase relativamente baixa, ao passo que a α-MHC tem atividade de ATPase elevada. Em resposta a uma variedade de estímulos patológicos, tais como enfarte do miocárdio, hipertensão, e outras perturbações, a expressão de β-MHC aumenta e a expressão de α-MHC diminui, com 27 redução consequente da atividade de ATPase miofibrilar e velocidade de encurtamento reduzida de miofibras cardíacas, acabando por conduzir a disfunção contrátil. De modo notável, alterações muito pequenas no teor de α-MHC do coração podem ter uma influência profunda no desempenho cardiaco.

Os microRNAs (miRs) são pequenos RNAs de ~22 nucleótidos que são derivados de pré-miRs maiores. Os miRs atuam como repressores de mRNAs alvo ao promover a sua degradação, quando as suas sequências são perfeitamente complementares, ou inibindo a tradução quando as suas sequências contêm emparelhamentos defeituosos. 0 microRNA-208 (miR-208) é codificado por um intrão do gene α-MHC e é especificamente expresso no coração. Os inventores criaram ratinhos "knockout" no miR-208 e descobriram que o miR-208 é requerido para a ativação da expressão do gene β-MHC no coração adulto, bem como para a expressão de vários genes de proteínas contráteis diferentes. Adicionalmente, a inibição do miR-208 conduz a uma redução acentuada de fibrose cardiaca. Estas descobertas sugerem que estratégias para modular a expressão do miR-208 terão efeitos profundos na contratilidade cardiaca em humanos, por exemplo, inibição do miR-208 para prevenir a expressão de β-MHC e manter a expressão de α-MHC no coração após lesão cardíaca.

É divulgado agonismo da expressão ou atividade do miR-208, por ativação terapêutica do gene miR-208 endógeno ou introdução de miR-208 exógeno no coração utilizando vetores adenovirais ou outros - mais uma vez, não há necessidade de utilizar um meio de expressão ectópica de um sistema adenoviral para aumentar a expressão de β-MHC, para o tratamento de indivíduos com uma mutação no gene α-MHC. A 28 regulação positiva de vários genes de proteínas contráteis rápidas do músculo esquelético nos corações de ratinhos mutantes no miR-208 também sugere que o miR-208 tipicamente reprime o programa dos genes rápidos do músculo esquelético. A ativação destes genes no coração representa uma abordagem potencial à regulação da contratilidade cardíaca. É divulgada a utilização do miR-208 para reprimir genes de fibras rápidas no músculo esquelético e desse modo ativar a expressão recíproca de genes de fibras lentas, que estão acoplados para aumentar a sensibilidade à insulina e capacidade de resistência do músculo esquelético. A repressão de genes de fibras lentas e a ativação de genes de fibras rápidas no músculo esquelético estão associadas a numerosas perturbações musculoesqueléticas, incluindo atrofia por desuso, perda muscular em resposta a antigravidade, e denervação.

Assim, os presentes inventores descobriram que o miR-208 é um regulador muscular específico e essencial da expressão do gene β-MHC no coração que, adicionalmente, regula fibrose cardíaca. A descoberta de que o miR-208 regula a expressão de β-MHC e a expressão de genes rápidos do músculo esquelético é completamente nova, tal como o é a utilização deste microRNA para controlar a contratilidade cardíaca e a função musculoesquelética. II. miRNAs A. Contexto

Em 2001, vários grupos utilizaram um novo método de clonagem para isolar e identificar um grande grupo de "microRNAs" (miRNAs) de C. elegans, Drosophila, e humanos 29 (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee e Ambros, 2001) . Foram identificadas várias centenas de miRNAs em plantas e animais — incluindo humanos — que não aparentam ter siRNAs endógenos. Logo, não obstante serem semelhantes a siRNAs, os miRNAs são ainda assim distintos.

Os miRNAs observados até agora têm tido aproximadamente 21-22 nucleótidos de comprimento e provêm de precursores maiores, que são transcritos de genes não codificadores de proteínas. Ver o artigo de revisão de Carrington et al. (2003) . Os precursores formam estruturas que se dobram umas sobre as outras em regiões de autocomplementaridade; depois são processados pela nuclease Dicer em animais ou DCL1 em plantas. As moléculas de miRNA interrompem a tradução através de emparelhamento de bases preciso ou impreciso com os seus alvos.

Os miRNAs estão envolvidos na regulação de genes. Alguns miRNAs, incluindo lin-4 e let-7, inibem a síntese de proteínas por ligação a regiões 3' não traduzidas (3' UTRs) parcialmente complementares de mRNAs alvo. Outros, incluindo o miRNA Scarecrow presente em plantas, funcionam tal como o siRNA e ligam-se a sequências de mRNA perfeitamente complementares para destruir o transcrito alvo (Grishok et al., 2001). A investigação de microRNAs está a aumentar à medida que os cientistas começam a apreciar o amplo papel que estas moléculas desempenham na regulação da expressão genética eucariótica. Os dois miRNAs melhor compreendidos, lin-4 e let-7, regulam a calendarização do desenvolvimento em C. elegans por regulação da tradução de uma família de mRNAs chave (revisto em Pasquinelli, 2002). Foram identificadas 30 várias centenas de miRNAs em C. elegans, Drosophila, ratinho, e humanos. Como seria de esperar para moléculas que regulam a expressão genética, foi mostrado que os niveis de miRNA variam entre tecidos e etapas do desenvolvimento. Adicionalmente, um estudo mostra uma correlação forte entre expressão reduzida de dois miRNAs e leucemia linfocitica crónica, proporcionando uma possível ligação entre miRNAs e cancro (Calin, 2002) . Apesar de a área ainda ser jovem, especula-se que miRNAs podem ser igualmente importantes como fatores de transcrição na regulação da expressão genética em eucariotas superiores. Há alguns exemplos de miRNAs que desempenham papéis críticos na diferenciação celular, desenvolvimento inicial, e processos celulares, como apoptose e metabolismo de gorduras. Ambos os lin-4 e let-7 regulam a passagem de um estado larvar para outro durante o desenvolvimento de C. elegans (Ambros, 2003). O mir-14 e bantam são miRNAs de Drosophila que regulam a morte celular, aparentemente por regulação da expressão de genes envolvidos na apoptose (Brennecke et al., 2003, Xu et al., 2003). O miR14 também foi implicado no metabolismo de gorduras (Xu et al., 2003). Lsy-6 e miR-2 73 são miRNAs de C. elegans que regulam a assimetria em neurónios quimiossensoriais (Chang et al., 2004). Outro miRNA de animal que regula a diferenciação celular é o miR-181, que guia a diferenciação de células hematopoiéticas (Chen et al., 2004). Estas moléculas representam a gama completa de miRNAs de animais com funções conhecidas. Uma maior compreensão das funções de miRNAs irá indubitavelmente revelar redes reguladoras que contribuem para os processos normais de desenvolvimento, diferenciação, comunicação inter- e intracelular, ciclo celular, angiogénese, apoptose, e muitos outros processos 31 celulares. Dado os seus importantes papéis em muitas funções biológicas, é provável que os miRNAs venham a oferecer pontos importantes para intervenção terapêutica ou análise de diagnóstico. A caracterização das funções de biomoléculas, como miRNAs, envolve muitas vezes a introdução das moléculas em células ou remoção das moléculas de células e medição do resultado. Se a introdução de um miRNA em células originar apoptose, então indubitavelmente o miRNA participa numa via apoptótica. Foram descritos métodos de introdução e remoção de miRNAs em/de células. Duas publicações recentes descrevem moléculas antissentido que podem ser utilizadas para inibir a atividade de miRNAs específicos (Meister et ai., 2004; Hutvagner et al., 2004). Outra publicação descreve a utilização de plasmídeos que são transcritos por RNA polimerases endógenas e originam miRNAs específicos quando transfetados em células (Zeng et ai., 2002). Estes dois conjuntos de reagentes têm sido utilizados para avaliar miRNAs isolados. B. miR-208 O miR-208 é um miRNA intrónico que está localizado no 27° intrão do gene α-MHC. FIG. 1. As sequências codificadoras de pré-miRNA para o miR-208 de humano, ratinho, rato, e canino estão apresentadas nas SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, respetivamente. A sequência madura do miR-208 está apresentada na SEQ ID NO: 5. Tal como α-MHC, o miR-208 é expresso apenas no coração. FIG. 2.

Utilizando o algoritmo PicTar para a identificação de alvos do miRNA (Krek et ai., 2005), os inventores identificaram a proteina 1 associada a recetores de hormonas da tiroide 32 (THRAP1) como um alvo previsto para o miR-208. As sequências 3' UTR de THRAP1 de humano, chimpanzé, ratinho, rato, canino, galinha, peixe fugu, e peixe-zebra estão apresentadas nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 13, respetivamente. C. Inibidores do miR-208

Em geral, os inibidores de miRNAs tomam a forma de "antagomir", oligonucleótidos curtos de filamentação simples e quimicamente manipulados complementares a miRNAs que bloqueiam a função de miRNAs (Krutzfeldt et al., 2005). Outras abordagens incluem a inibição de miRNAs com 2' -0-metil (2'-0Me) oligorribonucleótidos antissentido e pequenos RNAs de interferência (siRNAs) de filamentação dupla manipulados com certas propriedades de "tipo fármaco" (modificações químicas para estabilidade; conjugação a colesterol para distribuição) (Krutzfeldt et al., 2005). III. Métodos de Tratamento de Hipertrofia Cardiaca A. Regimes Terapêuticos A corrente gestão clínica de hipertrofia cardíaca no cenário de uma perturbação cardiovascular inclui a utilização de pelo menos dois tipos de fármacos: inibidores do sistema renina-angiotensina, e agentes bloqueadores β-adrenérgicos (Bristow, 1999). Os agentes terapêuticos para tratar hipertrofia patológica no cenário de falha cardíaca incluem inibidores da enzima conversora da angiotensina (ACE) II e agentes bloqueadores de recetores β-adrenérgicos (Eichhorn e Bristow, 1996). Outros agentes farmacêuticos que têm sido divulgados para o tratamento de hipertrofia cardíaca incluem antagonistas de recetores da angiotensina II (Patente U.S. 5,604,251) e antagonistas do neuropéptido 33 Y (WO 98/33791). Apesar dos compostos farmacêuticos presentemente disponíveis, a prevenção e tratamento de hipertrofia cardíaca, e subsequente falha cardíaca, continuam a ser um desafio terapêutico. 0 tratamento não farmacológico é principalmente utilizado como adjunto do tratamento farmacológico. Um meio de tratamento não farmacológico envolve a redução de sódio na dieta. Adicionalmente, um tratamento não farmacológico também implica a eliminação de certos fármacos desencadeadores, incluindo agentes inotrópicos negativos (por exemplo, certos bloqueadores de canais de cálcio e fármacos antiarrítmicos, como disopiramida), cardiotoxinas (por exemplo, anfetaminas), e expansores do volume plasmático (por exemplo, agentes anti-inflamatórios não esteroides e glucocorticoides).

Numa forma de realização da presente invenção, são proporcionados inibidores do miR-208 para utilização em métodos destinados ao tratamento de hipertrofia cardíaca ou falha cardíaca. Para as finalidades da presente aplicação, o tratamento compreende reduzir um ou mais dos sintomas de hipertrofia cardíaca, tal como capacidade de exercício reduzida, volume de ejeção de sangue reduzido, pressão diastólica final ventricular esquerda aumentada, pressão de oclusão capilar pulmonar aumentada, débito cardíaco, índice cardíaco, reduzido, pressões arteriais pulmonares aumentadas, dimensões sistólica e diastólica finais do ventrículo esquerdo aumentadas, e esforço da parede, tensão da parede e espessura da parede ventricular esquerda aumentados - e o mesmo para o ventrículo direito. Adicionalmente, a utilização de inibidores do miR-208 pode 34 prevenir o surgimento de hipertrofia cardíaca e dos seus sintomas associados.

Os regimes de tratamento variam, dependendo da situação clínica. No entanto, uma manutenção de longa duração aparenta ser apropriada na maior parte das circunstâncias. Também pode ser desejável tratar hipertrofia com inibidores do miR-208 de modo intermitente, tal como numa janela breve durante a progressão da doença. B. Terapia Combinada

Noutra forma de realização, é contemplada a utilização de um inibidor do miR-208 da invenção em combinação com outras modalidades terapêuticas. Assim, para além das terapias descritas acima, também é possível proporcionar ao paciente terapias cardíacas farmacêuticas mais "comuns". Exemplos de outras terapias incluem, sem limitação, os denominados "bloqueadores beta", anti-hipertensores, cardiotónicos, antitrombóticos, vasodilatadores, antagonistas de hormonas, ionotropos, diuréticos, antagonistas de recetores da endotelina, bloqueadores de canais de cálcio, inibidores da fosfodiesterase, inibidores da ACE, antagonistas da angiotensina do tipo 2 e bloqueadores/inibidores de citoquinas, e inibidores de HDAC.

Podem ser obtidas combinações por contacto de células cardíacas com uma única composição ou formulação farmacológica que inclui ambos os agentes, ou por contacto da célula com duas composições ou formulações distintas, ao mesmo tempo, em que uma composição inclui a construção de expressão e a outra inclui o agente. Alternativamente, a terapia utilizando um inibidor do miR-208 pode preceder ou seguir-se à administração do(s) outro(s) agente(s) em 35 intervalos que variam desde minutos até semanas. Em formas de realização em que o outro agente e construção de expressão são aplicados separadamente na célula, em geral será de assegurar que não expirou um período de tempo significativo entre o instante de cada distribuição, de modo que o agente e a construção de expressão ainda sejam capazes de exercer um efeito vantajosamente combinado na célula. Nesses casos, é contemplado que tipicamente a célula será contactada com ambas as modalidades num período de cerca de 12-24 horas uma da outra e, mais preferivelmente, num período de cerca de 6-12 horas uma da outra, sendo muito preferido um tempo de retardamento de apenas cerca de 12 horas. No entanto, nalgumas situações pode ser desejável prolongar significativamente o período de tempo do tratamento, com vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) até várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) de intervalo entre as administrações respetivas.

Também é concebível que seja desejada mais do que uma administração de um inibidor do miR-208, ou do outro agente. A este respeito, podem ser empregues várias combinações. A título ilustrativo, quando o inibidor do miR-208 é "A" e o outro agente é "B", são exemplificativas as seguintes permutações com base em 3 e 4 administrações totais:

A/B/A WAJB WBfA A/AfB WÂJA A/B/B B/&4B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A BÍWAJA 8M/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/3 9/AM/A A/S/AM à/ÂJ&Já àMWB B/A/B/B B/S1V0 São igualmente contempladas outras combinações. 36 C. Agentes Terapêuticos Farmacológicos

Agentes terapêuticos farmacológicos e métodos de administração, dosagens, etc., são bem conhecidos dos profissionais (ver, por exemplo, o "Physicians' Desk Reference", Klaassen "The Pharmacological Basis of Therapeutics", "Remington's Pharmaceutical Sciences", e "The Merck índex", Décima Primeira Edição), e podem ser combinados com a invenção à luz das divulgações feitas aqui. Será necessário que ocorra alguma variação na dosagem, dependendo do estado do sujeito a ser tratado. Em qualquer caso, o responsável pela administração irá determinar a dose apropriada para o sujeito individual, e essas determinações individuais pertencem ao âmbito dos profissionais.

Exemplos de um agente terapêutico farmacológico que podem ser utilizados na presente invenção incluem um agente anti-hiperlipoproteinémico, um agente antiarteriosclerótico, um agente antitrombótico/fibrinolitico, um coagulante sanguíneo, um agente antiarrítmico, um agente anti-hipertensor, um vasoconstritor, um agente de tratamento para falha cardíaca congestiva, um agente antianginoso, um agente antibacteriano ou uma combinação desses.

Adicionalmente, deve ser notado que qualquer um dos seguintes pode ser utilizado para desenvolver novos conjuntos de genes alvo para terapia cardíaca, uma vez que bloqueadores β foram utilizados nos presentes exemplos (ver em baixo). É esperado que muitos destes genes possam sobrepor-se, e é provável que possam ser desenvolvidos novos alvos genéticos. i. Antihiperlipoproteinémicos 37

Em certos casos, a administração de um agente que diminui a concentração de um ou mais lipidos e/ou lipoproteinas do sangue, conhecido aqui como "anti-hiperlipoproteinémico", pode ser combinada com uma terapia cardiovascular aqui divulgada, particularmente no tratamento de aterosclerose e espessamentos ou bloqueios de tecidos vasculares. Em certos aspetos, um agente anti-hiperlipoproteinémico pode compreender um derivado de ácidos ariloxialcanoico/fibrico, um sequestrante de resina/ácido biliar, um inibidor da HMG CoA redutase, um derivado do ácido nicotinico, uma hormona da tiroide ou análogo de hormona da tiroide, um agente variado ou uma combinação desses. a. Derivados de Ácido Ariloxialcanoico/Ácido Fibrico

Exemplos não limitadores de derivados de ácidos ariloxialcanoico/fibrico incluem beclobrato, enzafibrato, binifibrato, ciprofibrato, clinofibrato, clofibrato (atromida-S) , ácido clofibrico, etofibrato, fenofibrato, gemfibrozil (lobid), nicofibrato, pirifibrato, ronifibrato, simfibrato e teofibrato. b. Sequestrantes de Resinas/Ácido Biliar

Exemplos não limitadores de sequestrantes de resinas/ácido biliar incluem colestiramina (cholybar, questran), colestipol (colestid) e polidexida. c. Inibidores da HMG CoA Redutase

Exemplos não limitadores de inibidores da HMG CoA redutase incluem lovastatina (mevacor) , pravastatina (pravochol) ou simvastatina (zocor). d. Derivados do Ácido Nicotinico 38

Exemplos de derivados do ácido nicotínico incluem nicotinato, acepimox, niceritrol, nicoclonato, nicomol e ácido oxiniácico. e. Hormonas da Tiroide e Análogos

Exemplos de hormonas da tiroide e seus análogos incluem etoroxato, ácido tiroprópico e tiroxina. f. Anti-hiperlipoproteinémicos Variados

Exemplos de anti-hiperlipoproteinémicos variados incluem acifran, azacosterol, benfluorex, β-benzalbutiramida, carnitina, sulfato de condroitina, clomestrona, dextrano, sulfato de dextrano sódico, ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico, eritadenina, furazabol, meglutol, melinamida, mitatrienodiol, ornitina, γ-orizanol, pantetina, tetra-acetato de pentaeritritol, a-fenilbutiramida, pirozadil, probucol (lorelco), β-sitosterol, sal de piperazina do ácido sultosilico, tiadenol, triparanol e xenbucina. ii. Antiarterioscleróticos

Exemplos de um antiarteriosclerótico incluem carbamato de piridinol. iii. Agentes Antitrombóticos/Fibrinolíticos

Em certas formas de realização, a administração de um agente que auxilia a remoção ou prevenção de coágulos sanguíneos pode ser combinada com a administração de um modulador, particularmente no tratamento de aterosclerose e bloqueios da rede vascular (por exemplo, arteriais). Exemplos não limitadores de agentes antitrombóticos e/ou fibrinolíticos incluem anticoagulantes, antagonistas de anticoagulantes, agentes antiplaquetários, agentes 39 trombolíticos, antagonistas de agentes trombolíticos ou combinações desses.

Em certos aspetos, são preferidos agentes antitrombóticos que possam ser administrados oralmente, tais como, por exemplo, aspirina e varfarina (coumadina). a. Anticoagulantes

Um exemplo de um anticoagulante inclui acenocoumarol, ancrode, anisindiona, bromindiona, clorindiona, coumetarol, ciclocumarol, sulfato de dextrano sódico, dicumarol, difenadiona, biscoumacetato de etilo, etilidenodicoumarol, fluindiona, heparina, hirudina, liapolato sódico, oxazidiona, polissulfato de pentosano, fenindiona, fenprocoumona, fosvitina, picotamida, tioclomarol e varfarina. b. Agentes Antiplaquetários

Exemplos de agentes antiplaquetários incluem aspirina, um dextrano, dipiridamole (persantin), heparina, sulfinpirazona (anturane) e ticlopidina (ticlid). c. Agentes Trombolíticos

Exemplos de agentes trombolíticos incluem ativador do plasminogénio em tecidos (activase), plasmina, pró-uroquinase, uroquinase (abbokinase) , estreptoquinase (streptase), anistreplase/APSAC (eminase).

Iv. Coagulantes sanguíneos

Em certas formas de realização em que um paciente sofre de uma hemorragia ou de uma probabilidade aumentada de hemorragia, pode ser usado um agente que pode aumentar a coagulação do sangue. Exemplos não limitadores de um agente 40 promotor da coagulação sanguínea incluem antagonistas de agentes trombolíticos e antagonistas de anticoagulantes. a. Antagonistas de Anticoagulantes

Exemplos de antagonistas de anticoagulantes incluem protamina e vitamina Kl. b. Antagonistas de Agentes Trombolíticos e Antitrombóticos

Exemplos de antagonistas de agentes trombolíticos incluem ácido aminocaproico (amicar) e ácido tranexâmico (amstat). Exemplos não limitadores de antitrombóticos incluem anagrelida, argatrobano, cilstazol, daltrobano, defibrotida, enoxaparina, fraxiparina, indobufeno, lamoparano, ozagrel, picotamida, plafibrida, tedelparina, ticlopidina e triflusal. v. Agentes Antiarrítmicos

Exemplos de agentes antiarrítmicos incluem agentes antiarrítmicos da Classe I (bloqueadores de canais de sódio), agentes antiarrítmicos da Classe II (bloqueadores beta-adrenérgicos), agentes antiarrítmicos da Classe III (fármacos que prolongam a repolarização), agentes antiarrítmicos da Classe IV (bloqueadores de canais de cálcio) e agentes antiarrítmicos variados. a. Bloqueadores de Canais de Sódio

Exemplos de bloqueadores de canais de sódio incluem agentes antiarrítmicos da Classe IA, Classe IB e Classe IC. Exemplos de agentes antiarrítmicos da Classe IA incluem disopiramida (norpace), procainamida (pronestyl) e quinidina (quinidax). Exemplos não limitadores de agentes antiarrítmicos da Classe IB incluem lidocaína (xylocaine), tocainida (tonocard) e mexiletina (mexitil). Exemplos não 41 limitadores de agentes antiarrítmicos da Classe IC incluem encainida (enkaid) e flecainida (tambocor). b. Bloqueadores beta

Exemplos de um bloqueador beta, também conhecido como bloqueador β-adrenérgico, antagonista β-adrenérgico ou agente antiarrítmico da Classe II, incluem acebutolol (sectral), alprenolol, amosulalol, arotinolol, atenolol, befunolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bucumolol, bufetolol, bufuralol, bunitrolol, bupranolol, cloridrato de butidrina, butofilolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, cetamolol, cloranolol, dilevalol, epanolol, esmolol (brevibloc), indenolol, labetalol, levobunolol, mepindolol, metipranolol, metoprolol, moprolol, nadolol, nadoxolol, nifenalol, nipradilol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, practolol, pronetalol, propanolol (inderal), sotalol (betapace), sulfinalol, talinolol, tertatolol, timolol, toliprolol e xibinolol. Em certos aspetos, o bloqueador beta compreende um derivado ariloxipropanolamina. Exemplos de derivados ariloxipropanolamina incluem acebutolol, alprenolol, arotinolol, atenolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bunitrolol, butofilolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, cetamolol, epanolol, indenolol, mepindolol, metipranolol, metoprolol, moprolol, nadolol, nipradilol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propanolol, talinolol, tertatolol, timolol e toliprolol. c. Agentes que Prolongam a Repolarização

Exemplos de um agente que prolonga a repolarização, também conhecido como agente antiarrítmico da Classe III, incluem amiodarona (cordarone) e sotalol (betapace). 42 d. Bloqueadores/Antagonistas de Canais de Cálcio

Exemplos de um bloqueador de canais de cálcio, também conhecido como agente antiarritmico da Classe IV, incluem uma arilalquilamina (por exemplo, bepridil, diltiazem, fendilina, galopamil, prenilamina, terodilina, verapamil), um derivado di-hidropiridina (felodipina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina, nisoldipina, nitrendipina), um derivado piperazida (por exemplo, cinarizina, flunarizina, lidoflazina) , ou um bloqueador de canais de cálcio variado, tal como benciclano, etafenona, magnésio, mibefradil ou per-hexilina. Em certas formas de realização, um bloqueador de canais de cálcio compreende um antagonista de cálcio de di-hidropiridina (do tipo nifedipina) de atuação prolongada. e. Agentes Antiarritmicos Variados

Exemplos de agentes antiarritmicos variados incluem adenosina (adenocard) , digoxina (lanoxin), acecainida, ajmalina, amoproxano, aprindina, tosilato de bretilio, bunaftina, butobendina, ácido capobénico, cifenlina, disopiranida, hidroquinidina, indecainida, brometo de ipatrópio, lidocaina, lorajmina, lorcainida, meobentina, moricizina, pirmenol, prajmalina, propafenona, pirinolina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina e viquidil. vi. Agentes Antihipertensores

Exemplos de agentes anti-hipertensores incluem simpatolíticos, bloqueadores alfa/beta, bloqueadores alfa, agentes anti-angiotensina II, bloqueadores beta, bloqueadores de canais de cálcio, vasodilatadores e antihipertensores variados. 43 a. Bloqueadores Alfa

Exemplos de um bloqueador alfa, também conhecido como bloqueador α-adrenérgico ou antagonista a-adrenérgico, incluem amosulalol, arotinolol, dapiprazol, doxazosina, mesilatos ergoloides, fenspirida, indoramina, labetalol, nicergolina, prazosina, terazosina, tolazolina, trimazosina e ioimbina. Em certas formas de realização, um bloqueador alfa pode compreender um derivado quinazolina. Exemplos de derivados quinazolina incluem alfuzosina, bunazosina, doxazosina, prazosina, terazosina e trimazosina. b. Bloqueadores Alfa/Beta

Em certas formas de realização, um agente anti-hipertensor é um antagonista alfa e beta adrenérgico. Exemplos de um bloqueador alfa/beta compreendem labetalol (normodyne, trandate) .

c. Agentes Anti-Angiotensina II

Exemplos de agentes anti-angiotensina II incluem inibidores da enzima conversora da angiotensina e antagonistas de recetores da angiotensina II. Exemplos de inibidores da enzima conversora da angiotensina (inibidores da ACE) incluem alacepril, enalapril (vasotec), captopril, cilazapril, delapril, enalaprilat, fosinopril, lisinopril, moveltopril, perindopril, quinapril e ramipril. Exemplos de um bloqueador de recetores da angiotensina II, também conhecido como antagonista de recetores da angiotensina II, bloqueador de recetores da ANG ou bloqueador de recetores da ANG-II de tipo 1 (ARBS), incluem angiocandesartan, eprosartan, irbesartan, losartan e valsartan. d. Simpatoliticos 44

Exemplos de um simpatolítico incluem um simpatolitico de atuação central ou um simpatolitico de atuação periférica. Exemplos de um simpatolitico de atuação central, também conhecido como simpatolitico do sistema nervoso central (SNC), incluem clonidina (catapres), guanabenz (wytensin) guanfacina (tenex) e metildopa (aldomet). Exemplos de um simpatolitico de atuação periférica incluem um agente bloqueador ganglionário, um agente bloqueador de neurónios adrenérgicos, um agente bloqueador β-adrenérgico ou um agente bloqueador alfa 1-adrenérgico. Exemplos de um agente bloqueador ganglionário incluem mecamilamina (inversine) e trimetafano (arfonad). Exemplos de um agente bloqueador de neurónios adrenérgicos incluem guanetidina (ismelin) e reserpina (serpasil). Exemplos de um bloqueador β-adrenérgico incluem acenitolol (sectral), atenolol (tenormin), betaxolol (kerlone), carteolol (cartrol), labetalol (normodyne, trandate), metoprolol (lopressor), nadanol (corgard), penbutolol (levatol), pindolol (visken), propranolol (inderal) e timolol (blocadren). Exemplos de um bloqueador alfa 1-adrenérgico incluem prazosina (minipress), doxazocina (cardura) e terazosina (hytrin). e. Vasodilatadores

Em certas formas de realização, um agente terapêutico cardiovascular pode compreender um vasodilatador (por exemplo, um vasodilatador cerebral, um vasodilatador coronário ou um vasodilatador periférico). Em certas formas de realização preferidas, um vasodilatador compreende um vasodilatador coronário. Exemplos de um vasodilatador coronário incluem amotrifeno, bendazol, hemissuccinato de benfurodil, benziodarona, cloracizina, cromonar, clobenfurol, clonitrato, dilazep, dipiridamol, droprenilamina, efloxato, tetranitrato de eritritilo, 45 etafenona, fendilina, floredil, ganglefeno, bis(éter de β-dietilaminoetilo) de herestrol, hexobendina, tosilato de itramina, quelina, lidoflanina, hexanitrato de manitol, medibazina, nicorglicerina, tetranitrato de pentaeritritol, pentrinitrol, per-hexilina, pimefilina, trapidil, tricromil, trimetazidina, fosfato de trolnitrato e visnadina.

Em certos aspetos, um vasodilatador pode compreender um vasodilatador de terapia crónica ou um vasodilatador para emergência hipertensiva. Exemplos de um vasodilatador de terapia crónica incluem hidralazina (apresoline) e minoxidil (loniten). Exemplos de um vasodilatador para emergência hipertensiva incluem nitroprussiato (nipride), diazóxido (hiperstat IV), hidralazina (apresoline), minoxidil (loniten) e verapamil. f. Anti-hipertensores Variados

Exemplos de anti-hipertensores variados incluem ajmalina, ácido γ-aminobutírico, bufeniodo, cicletainina, ciclosidomina, um tanato de criptenamina, fenoldopam, flosequinano, cetanserina, mebutamato, mecamilamina, metildopa, metil-4-piridilcetona tiossemicarbazona, muzolimina, pargilina, pempidina, pinacidil, piperoxano, primaperona, uma protoveratrina, raubasina, rescimetol, rilmenideno, saralasina, nitroprussiato de sódio, ticrinafeno, camsilato de trimetafano, tirosinase e urapidil.

Em certos aspetos, um anti-hipertensor pode compreender um derivado ariletanolamina, um derivado benzotiadiazina, um derivado N-carboxialquil(péptido/lactama), um derivado dihidropiridina, um 1,1 derivado guanidina, uma 46 hidrazina/ftalazina, um derivado imidazolo, um composto de amónio quaternário, um derivado reserpina ou um derivado sulfonamida.

Derivados Ariletanolamina. Exemplos de derivados ariletanolamina incluem amosulalol, bufuralol, dilevalol, labetalol, pronetalol, sotalol e sulfinalol.

Derivados Benzotiadiazina. Exemplos de derivados benzotiadiazina incluem altizida, bendroflumetiazida, benztiazida, benzil-hidroclorotiazida, butiazida, clorotiazida, clortalidona, ciclopentiazida, ciclotiazida, diazóxido, epitiazida, etiazida, fenquizona, hidroclorotizida, hidroflumetizida, meticlotiazida, meticrano, metolazona, paraflutizida, politizida, tetraclormetiazida e triclormetiazida.

Derivados W-carboxialquil(péptido/lactama). Exemplos de derivados N-carboxialquil(péptido/lactama) incluem alacepril, captopril, cilazapril, delapril, enalapril, enalaprilato, fosinopril, lisinopril, moveltipril, perindopril, quinapril e ramipril.

Derivados Di-hidropiridina. Exemplos de derivados di-hidropiridina incluem amlodipina, felodipina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nilvadipina, nisoldipina e nitrendipina.

Derivados Guanidina. Exemplos de derivados guanidina incluem betanidina, debrisoquina, guanabenz, guanaclina, guanadrel, guanazodina, guanetidina, guanfacina, guanoclor, guanoxabenz e guanoxano. 47

Hidrazinas/Ftalazinas. Exemplos de hidrazinas/ftalazinas incluem budralazina, cadralazina, di-hidralazina, endralazina, hidracarbazina, hidralazina, feniprazina, pildralazina e todralazina.

Derivados Imidazolo. Exemplos de derivados imidazolo incluem clonidina, lofexidina, fentolamina, tiamenidina e tolonidina.

Compostos de Amónio Quaternário. Exemplos de compostos de amónio quaternário incluem brometo de azametónio, cloreto de clorisondamina, hexametónio, bis(metilsulfato) de pentacinio, brometo de pentametónio, tartarato de pentolinio, cloreto de fenactropinio e metossulfato de trimetidinio.

Derivados de Reserpina. Exemplos de derivados de reserpina incluem bietaserpina, deserpidina, rescinamina, reserpina e sirosingopina.

Derivados Sulfonamida. Exemplos de derivados sulfonamida incluem ambusida, clopamida, furosemida, indapamida, quinetazona, tripamida e xipamida. g. Vasoconstritores

Vasoconstritores são geralmente utilizados para aumentar a pressão sanguínea durante choque, que pode ocorrer durante um procedimento cirúrgico. Exemplos de um vasoconstritor, também conhecido como anti-hipotensor, incluem metilsulfato de amezínio, angiotensina amida, dimetofrina, dopamina, etifelmina, etilefrina, gepefrina, metaraminol, midodrina, norepinefrina, foledrina e sinefrina. 48 vii. Agentes de Tratamento para Falha Cardíaca Congestiva

Exemplos de agentes para o tratamento de falha cardíaca congestiva incluem agentes anti-angiotensina II, tratamento de redução da pós-carga - pré-carga, diuréticos e agentes inotrópicos. a. Redução da Pós-carga - Pré-carga

Em certas formas de realização, um paciente animal que não consegue tolerar um antagonista da angiotensina pode ser tratado com uma terapia de combinação. Essa terapia pode combinar a administração de hidralazina (apresoline) e dinitrato de isossorbido (isordil, sorbitrate). b. Diuréticos

Exemplos de um diurético incluem um derivado tiazida ou benzotiadiazina (por exemplo, altiazida, bendroflumetazida, benztiazida, benzil-hidroclorotiazida, butiazida, clorotiazida, clorotiazida, clortalidona, ciclopentiazida, epitiazida, etiazida, etiazida, fenquizona, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, meticlotiazida, meticrane, metolazona, paraflutizida, politizida, tetraclorometiazida, triclormetiazida) , um composto organomercúrio (por exemplo, clormerodrina, meralurida, mercamfamida, mercaptomerina sódio, ácido mercumalílico, mercumatilina sódio, cloreto mercuroso, mersalil), uma pteridina (por exemplo, furtereno, triamtereno) , purinas (por exemplo, acefilina, 7-morfolinometilteofilina, pamobrom, proteobromina, teobromina), esteroides incluindo antagonistas da aldosterona (por exemplo, canrenona, oleandrina, espironolactona), um derivado sulfonamida (por exemplo, acetazolamida, ambusida, azosemida, bumetanida, butazolamida, cloraminofenamida, clofenamida, clopamida, 49 clorexolona, difenilmetano-4,4'-dissulfonamida, dissulfamida, etoxzolamida, furosemida, indapamida, mefrusida, metazolamida, piretanida, quinetazona, torasemida, tripamida, xipamida) , um uracilo (por exemplo, aminometradina, amisometradina) , um antagonista poupador de potássio (por exemplo, amilorida, triamtereno) ou um diurético variado, tal como aminozina, arbutina, clorazanil, ácido etacrinico, etozolina, hidracarbazina, isossorbido, manitol, metochalcona, muzolimina, per-hexilina, ticrinafeno e ureia. c. Agentes Inotrópicos

Exemplos de um agente inotrópico positivo, também conhecido como cardiotónico, incluem acefilina, uma acetildigitoxina, 2-amino-4-picolina, amrinona, hemissuccinato de benfurodil, bucladesina, cerberosina, camfotamida, convalatoxina, cimarina, denopamina, deslanosida, digitalina, digitalis, digitoxina, digoxina, dobutamina, dopamina, dopexamina, enoximona, eritrofleina, fenalcomina, gitalina, gitoxina, glicociamina, heptaminol, hidrastinina, ibopamina, uma lanatosida, metamivam, milrinona, nerifolina, oleandrina, ouabaina, oxifedrina, prenalterol, proscilaridina, resibufogenina, escilareno, escilarenina, estrofantina, sulmazole, teobromina e xamoterol.

Em aspetos particulares, um agente inotrópico é um glicósido cardíaco, um agonista beta-adrenérgico ou um inibidor de fosfodiesterases. Exemplos de um glicósido cardíaco incluem digoxina (lanoxin) e digitoxina (cristodigin). Exemplos de um agonista β-adrenérgico incluem albuterol, bambuterol, bitolterol, carbuterol, clenbuterol, clorprenalina, denopamina, dioxetedrina, dobutamina (dobutrex), dopamina (intropin), dopexamina, 50 efedrina, etafedrina, etilnorepinefrina, fenoterol, formoterol, hexoprenalina, ibopamina, isoetarina, isoproterenol, mabuterol, metaproterenol, metoxifenamina, oxifedrina, pirbuterol, procaterol, protoquilol, reproterol, rimiterol, ritodrina, soterenol, terbutalina, tretoquinol, tulobuterol e xamoterol. Exemplos de um inibidor de fosfodiesterases incluem amrinona (inocor). d. Agentes Antianginosos

Agentes antianginosos podem compreender organonitratos, bloqueadores de canais de cálcio, bloqueadores beta e combinações desses.

Exemplos de organonitratos, também conhecidos como nitrovasodilatadores, incluem nitroglicerina (nitro-bid, nitrostat), dinitrato de isossorbido (isordil, sorbitrate) e nitrato de amilo (aspirol, vaporole). viii. Antagonistas de Recetores da Endotelina A endotelina (ET) é um péptido de 21 aminoácidos que tem efeitos fisiológicos e patofisiológicos potentes que aparentam estar envolvidos no desenvolvimento de falha cardiaca. Os efeitos da ET são mediados por interação com duas classes de recetores da superfície celular. O recetor do tipo A (ET-A) está associado a vasoconstrição e crescimento celular, ao passo que o recetor do tipo B (ET-B) está associado a vasodilatação mediada por células endoteliais e à libertação de outras neuro-hormonas, como aldosterona. Agentes farmacológicos que podem inibir a produção de ET ou a sua capacidade para estimular células relevantes são conhecidos na área. A inibição da produção de ET envolve a utilização de agentes que bloqueiam uma enzima denominada enzima conversora da endotelina, que está 51 envolvida no processamento do péptido ativo a partir do seu precursor. A inibição da capacidade da ET para estimular células envolve a utilização de agentes que bloqueiam a interação da ET com os seus recetores. Exemplos não limitadores de antagonistas de recetores da endotelina (ERA) incluem Bosentan, Enrasentan, Ambrisentan, Darusentan, Tezosentan, Atrasentan, Avosentan, Clazosentan, Edonentan, sitaxsentan, TBC 3711, BQ 123, e BQ 788. D. Agentes Terapêuticos Cirúrgicos

Em certos aspetos, o agente terapêutico secundário pode compreender uma cirurgia de algum tipo, que inclui, por exemplo, cirurgia preventiva, de diagnóstico ou determinação do estado, curativa e paliativa. Cirurgia, e em particular cirurgia curativa, pode ser utilizada em conjunção com outras terapias, como divulgadas aqui, e um ou mais agentes diferentes.

Esses agentes terapêuticos cirúrgicos para doenças e perturbações vasculares e cardiovasculares são bem conhecidos dos profissionais, e podem compreender, mas não estão limitados à realização de cirurgia num organismo, proporcionar uma prótese mecânica cardiovascular, angioplastia, reperfusão da artéria coronária, ablação por cateter, proporcionar ao sujeito um desfibrilhador cardioversor implantável, suporte circulatório mecânico ou uma combinação desses. Exemplos não limitadores de um suporte circulatório mecânico que podem ser utilizados na presente invenção compreendem contrapulsação com balão intra-aórtico, dispositivo de assistência ventricular esquerda ou uma combinação desses. 52 E. Formulações de Fármacos e Vias para Administração a Pacientes

Quando forem contempladas aplicações clínicas, serão preparadas composições farmacêuticas numa forma apropriada para a aplicação pretendida. Em geral, isto irá implicar preparar composições essencialmente desprovidas de pirogénios, bem como de outras impurezas que podem ser nocivas para humanos ou animais.

Geralmente será desejável empregar sais e tampões apropriados, para tornar os vetores de distribuição estáveis e permitir a captação pelas células alvo. Também serão empregues tampões quando células recombinantes forem introduzidas num paciente. As composições aquosas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz do vetor ou células, dissolvida ou dispersa num transportador ou meio aquoso farmaceuticamente aceitável. A frase "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas ou outras indesejadas quando administradas a um animal ou um humano. Como usado aqui, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui solventes, tampões, soluções, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e afins, aceitáveis para utilização na formulação de agentes farmacêuticos, como agentes farmacêuticos adequados para administração a humanos. A utilização desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na área. Excetuando o caso de qualquer meio ou agente convencional ser incompatível com os ingredientes ativos da presente invenção, é contemplada a sua utilização em composições terapêuticas. Ingredientes ativos 53 suplementares também podem ser incorporados nas composições, desde que não inativem os vetores ou células das composições.

As composições ativas da presente invenção podem incluir preparações farmacêuticas clássicas. A administração destas composições de acordo com a presente invenção pode ser realizada por qualquer via comum, desde que o tecido alvo esteja disponível por essa via. Isto inclui oral, nasal, ou bucal. Alternativamente, a administração pode ser realizada por injeção intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa, ou por injeção direta em tecido cardíaco. Essas composições serão normalmente administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis, como descrito supra.

Os compostos ativos também podem ser administrados pela via parentérica ou intraperitoneal. A título ilustrativo, podem ser preparadas soluções dos compostos ativos, na forma de base livre ou de sais farmaceuticamente aceitáveis, em água adequadamente misturada com um surfactante, como hidroxipropilcelulose. Também podem ser preparadas dispersões em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, e suas misturas, e em óleos. Em condições normais de armazenamento e utilização, estas preparações contêm geralmente um conservante, para prevenir o crescimento de microrganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem, por exemplo, soluções ou dispersões aquosas esterilizadas, e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. Em geral, estas preparações são esterilizadas e fluidas de modo que exista fácil aptidão 54 para injeção. As preparações devem ser estáveis nas condições de preparação e armazenamento e devem ser conservadas contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos. Solventes ou meios de dispersão apropriados podem conter, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e afins), suas misturas adequadas, e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, utilizando um revestimento, como lecitina, mantendo a dimensão requerida das partículas no caso de dispersão e utilizando surfactantes. A prevenção da ação de microrganismos pode ser efetivada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e afins. Em muitos casos será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser efetivada utilizando nas composições agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Podem ser preparadas soluções injetáveis esterilizadas incorporando os compostos ativos, numa quantidade apropriada, num solvente juntamente com quaisquer outros ingredientes (por exemplo, como os enumerados acima) consoante o desejado, seguido de esterilização com filtração. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados num veículo esterilizado que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes desejados, por exemplo, como enumerados acima. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos de preparação preferidos incluem técnicas de secagem com 55 vácuo e liofilização, que dão origem a um pó do(s) ingrediente(s) ativo(s) mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução respetiva previamente filtrada de modo esterilizado.

Para administração oral, os polipéptidos da presente invenção podem ser geralmente incorporados com excipientes e utilizados na forma de colutórios não ingeriveis e dentifricos. Um colutório pode ser preparado incorporando o ingrediente ativo, na quantidade requerida, num solvente apropriado, como uma solução de borato de sódio (Solução de Dobell). Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser incorporado numa lavagem antissética contendo borato de sódio, glicerina e bicarbonato de potássio. 0 ingrediente ativo também pode ser disperso em dentifricos, incluindo: géis, pastas, pós e fases espessas. 0 ingrediente ativo pode ser adicionado, numa quantidade terapeuticamente eficaz, a uma pasta dentifrica que pode incluir água, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes, e agentes humedecedores.

As composições da presente invenção podem ser geralmente formuladas numa forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, sais de adição de ácidos (formados com grupos amino livres da proteína) derivados de ácidos inorgânicos (por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico), ou de ácidos orgânicos (por exemplo, acético, oxálico, tartárico, mandélico, e afins). Sais formados com os grupos carboxilo livres da proteína também podem ser derivados de bases inorgânicas (por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio, ou férrico) ou de bases orgânicas (por exemplo, 56 isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e afins).

Por formulação, as soluções são preferivelmente administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal que é terapeuticamente eficaz. As formulações podem ser facilmente administradas numa variedade de formas de dosagem, como soluções injetáveis, cápsulas de libertação de fármacos e afins. Para administração parentérica numa solução aquosa, por exemplo, a solução é geralmente tamponada de modo adequado e o diluente líquido é primeiramente tornado isotónico, por exemplo, com uma quantidade suficiente de solução salina ou glucose. Essas soluções aquosas podem ser utilizadas, por exemplo, para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Preferivelmente são empregues meios aquosos esterilizados, como é conhecido dos profissionais, particularmente à luz da presente divulgação. A título ilustrativo, uma única dose pode ser dissolvida em 1 mL de solução isotónica de NaCl e adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no sítio proposto da infusão (ver, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Irá necessariamente ocorrer alguma variação da dosagem, dependendo do estado do sujeito a ser tratado. O responsável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a dose apropriada para o sujeito individual. Além disso, para administração humana, as preparações devem cumprir padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, como requerido pelo Gabinete da FDA de Padrões biológicos. 57 IV. Métodos de Tratamento de Doenças Musculoesqueléticas e Doença Fibrótica A regulação positiva de vários genes de proteínas contráteis musculoesqueléticas rápidas foi observada nos corações de ratinhos mutantes no miR-208. Esta regulação positiva de vários genes de proteínas contráteis musculoesqueléticas rápidas nos corações de ratinhos mutantes no miR-208 indica que o miR-208 reprime o programa genético musculoesquelético rápido. No músculo esquelético, a repressão de genes de fibras lentas e ativação de genes de fibras rápidas estão associadas a numerosas perturbações musculoesqueléticas, incluindo atrofia por desuso, perda muscular em resposta a antigravidade, e denervação. Assim, a expressão do miR-208 em células musculoesqueléticas pode ser útil na repressão de genes de fibras rápidas e, desse modo, na ativação da expressão recíproca de genes de fibras lentas. Em conformidade, são divulgados métodos de tratamento de perturbações musculoesqueléticas por administração do miR-208 no músculo esquelético de um sujeito que tem, ou está em risco de desenvolver uma perturbação musculoesquelética.

As fibras musculoesqueléticas adultas podem ser classificadas em subtipos de contração rápida e lenta com base em propriedades contráteis e metabólicas especializadas. Estas propriedades refletem a expressão de conjuntos específicos de isoformas de proteínas contráteis rápidas e lentas de cadeias pesadas e leves de miosina, tropomiosina, e troponinas, bem como mioglobina (Naya et al., 2000). Os músculos de contração lenta são principalmente utilizados em atividades crónicas, como manutenção da postura e atividade de locomoção sustentada. As fibras de contração rápida são principalmente utilizadas 58 para atividades de impulsos de força elevada. 0 fenótipo do músculo esquelético adulto não é estático; ao invés, retém a capacidade para se ajustar a variações em padrões de suporte de carga e utilização contrátil, resultando em adaptações da morfologia, fenótipo, e propriedades contráteis. Por exemplo, a remoção da carga corporal no ambiente de microgravidade de voos espaciais resulta num grau acentuado de atrofia muscular e num fenótipo proteico alterado que estão correlacionados com uma alteração lento-para-rápido de propriedades contráteis e metabólicas para roedores e humanos (Tsika et al., 2002; Baldwin e Haddad, 2001; Edgerton e Roy, (2000); Fitts et al., 2000). Assim, são divulgados métodos de tratamento ou prevenção de perda muscular em resposta a um ambiente de gravidade reduzida por administração de miR-208 no músculo esquelético. A atrofia por desuso é uma atrofia muscular resultante de falta de uso muscular. A atrofia por desuso é tipicamente observada em pessoas acamadas, pessoas com membros engessados, ou aquelas que estão inativas por outros motivos. Adicionalmente, desmantelamentos da atividade elétrica de miofibras, incluindo denervação, conduzem a atrofia muscular. Após períodos curtos de desuso, a atrofia muscular é reversível. No entanto, o desuso extremo de um músculo pode resultar numa perda permanente de fibras musculoesqueléticas e na substituição dessas fibras por tecido conjuntivo. É contemplado que, por repressão de genes de fibras rápidas no músculo esquelético e, desse modo, ativação da expressão recíproca de genes de fibras lentas, os sintomas de atrofia muscular podem ser reduzidos ou prevenidos. Assim, são divulgados métodos de tratamento ou prevenção de atrofia muscular por administração de miR-208 no músculo esquelético. 59

Para além de desempenhar um papel importante no controlo de fibrose no coração, a expressão ubíqua da família de moléculas miR-29 significa que também pode desempenhar um papel noutras indicações fibróticas, como as que envolvem o rim, fígado e pulmões. Também se observa fibrose secundária a diabetes. Os pacientes diabéticos do tipo 1 e tipo 2 têm um risco acrescido de sofrer de cardiomiopatia. A cardiomiopatia em diabetes está associada a um agregado de características, incluindo elasticidade diastólica diminuída, fibrose intersticial e hipertrofia miocítica. Uma vez que o miR-208 inibe o miR-29, a inibição do miR-208 pode ser utilizada para bloquear fibrose cardíaca, bem como fibrose não cardíaca. A Fibrose Hepática Congénita (CHF) é uma doença rara que afeta o fígado e os rins. É herdada pelo paciente como uma característica recessiva autossómica. As anormalidades do fígado são hepatomegalia, pressão aumentada no sistema venoso que transporta sangue de diferentes órgãos para o fígado (hipertensão portal), e tecido conjuntivo do tipo fibroso que se dissemina sobre e no fígado (fibrose hepática), muitas vezes denominado de lesões hepáticas. Os indivíduos afetados também têm função renal enfraquecida, habitualmente causada por uma doença renal policística recessiva autossómica (ARPKD). A função renal enfraquecida associada a CHF em adultos é causada por uma doença renal policística dominante autossómica (ADPKD). A perda progressiva da função renal está associada não só a desenvolvimento de glomerulosclerose, mas também ao de fibrose intersticial. A fibrose intersticial é caracterizada pela destruição de túbulos renais e capilares 60 intersticiais, bem como pela acumulação de proteínas da matriz extracelular. A gravidade da fibrose tubulointersticial tem sido considerada, desde há muito tempo, um determinante crucial de lesão renal progressiva em glomerulonefrite humana e experimental. A fibrose pulmonar, ou formação de escaras no pulmão, resulta da substituição gradual de sacos aéreos pulmonares normais por tecido fibrótico. Quando se forma a escara, o tecido torna-se mais espesso, causando uma perda irreversível da capacidade do tecido para transferir oxigénio para a corrente sanguínea. Os sintomas incluem respiração ofegante (particularmente com esforço), tosse entrecortada, seca e crónica, fadiga e fraqueza, desconforto no peito, perda de apetite e rápida perda de peso.

Alguns postularam que a fibrose pulmonar poderá ser uma perturbação autoimune, ou os efeitos posteriores de uma infeção virai. No entanto, há uma crença crescente de que a predisposição genética é um fator chave. Verificou-se existir uma mutação na proteína SP-C em famílias com um historial de fibrose pulmonar. O pensamento mais corrente é que o processo fibrótico é uma reação (com predisposição genética) a lesões microscópicas no pulmão. Apesar de a causa exata permanecer desconhecida, têm sido estabelecidas associações com poluentes ambientais e ocupacionais inalados, fumo de cigarros, doenças como escleroderma, artrite reumatoide, lúpus e sarcoidose, certas medicações e radiação terapêutica. A cardiomiopatia diabética em pacientes é caracterizada por hipertrofia miocárdica, fibrose intersticial, alterações 61 endoteliais capilares, e espessamento de lâminas basais capilares, e é secundária a alterações na estrutura do colagénio. A acumulação aumentada de colagénio encontra-se principalmente nas regiões epicárdica e perivascular, onde induz um enfraquecimento da função diastólica do LV, muitas vezes conduzindo a falha cardíaca. V. Estojos

Um estojo pode compreender qualquer uma das composições descritas aqui. Num exemplo, um estojo inclui um miRNA individual. 0 estojo também pode incluir água e tampão de hibridização, para facilitar a hibridização dos dois filamentos dos miRNAs. 0 estojo também pode incluir um ou mais reagente(s) de transfeção, para facilitar a distribuição do miRNA em células.

Os componentes dos estojos podem ser embalados em meios aquosos ou em forma liofilizada. Os recipientes dos estojos incluirão geralmente pelo menos um frasco, tubo de teste, balão, garrafa, seringa ou outro meio contentor, onde um componente pode ser colocado e, preferivelmente, adequadamente calibrado em alíquotas. Quando houver mais do que um componente no estojo (o reagente de etiquetagem e a etiqueta podem ser embalados em conjunto), em geral o estojo também conterá um segundo, terceiro ou outro recipiente adicional onde podem ser separadamente colocados os componentes adicionais. No entanto, um frasco pode compreender várias combinações de componentes. Os estojos também incluirão tipicamente um meio para conter os ácidos nucleicos, e quaisquer outros recipientes de reagentes proximamente confinados para venda comercial. Esses recipientes podem incluir recipientes para injeção ou de 62 plástico moldado por sopragem onde ficam retidos os frascos desejados.

Quando os componentes do estojo forem proporcionados numa e/ou mais soluções liquidas, a solução liquida é uma solução aquosa, sendo particularmente preferida uma solução aquosa esterilizada.

No entanto, os componentes do estojo podem ser proporcionados na forma de pó(s) seco(s). Quando reagentes e/ou componentes forem proporcionados na forma de um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. É concebido que o solvente também possa ser proporcionado noutro recipiente. 0 recipiente incluirá geralmente pelo menos um frasco, tubo de teste, balão, garrafa, seringa ou outro meio contentor, onde as formulações de ácidos nucleicos são colocadas, preferivelmente colocadas de modo adequado. Os estojos também podem compreender um segundo recipiente para conter um tampão e/ou outro diluente esterilizado farmaceuticamente aceitável.

Os estojos também incluirão tipicamente um meio para conter os frascos em confinamento próximo para venda comercial, tais como, por exemplo, recipientes para injeção e/ou de plástico moldado por sopragem, onde ficam retidos os frascos desejados.

Esses estojos também podem incluir componentes que conservam ou mantêm o miRNA, ou que o protegem contra a sua degradação. Esses componentes podem estar desprovidos de RNAse ou podem proteger contra RNAses. Esses estojos 63 compreenderão, em geral, em meios adequados, recipientes distintos para cada reagente ou solução individual.

Um estojo também incluirá instruções de utilização dos componentes do estojo, bem como a utilização de qualquer outro reagente não incluido no estojo. As instruções podem incluir variações que podem ser implementadas. É contemplado que esses reagentes são componentes de estojos. No entanto, esses estojos não estão limitados aos itens particulares identificados acima, e podem incluir qualquer reagente utilizado para a manipulação ou caracterização de miRNA. VI. Métodos de Rastreio São divulgados métodos para identificar inibidores do miR-208 que são úteis na prevenção ou tratamento ou reversão de hipertrofia cardíaca ou falha cardíaca. Estes ensaios podem compreender o rastreio aleatório de grandes bibliotecas de substâncias candidatas; alternativamente, os ensaios podem ser utilizados para concentração em classes particulares de compostos selecionados tendo em vista atributos estruturais que se crê torná-los mais prováveis para inibir a expressão e/ou função do miR-208.

Para identificar um modulador do miR-208, geralmente será determinada a função de um miR-208 na presença e ausência da substância candidata. Por exemplo, um método compreende geralmente: (a) proporcionar um modulador candidato; (b) misturar o modulador candidato com um miR-208; (c) medir a atividade do miR-208; e 64 (d) comparar a atividade do passo (c) com a atividade na ausência do modulador candidato, em que uma diferença entre as atividades medidas indica que o modulador candidato é, de fato, um modulador do miR-2 0 8.

Os ensaios também podem ser conduzidos em células isoladas, órgãos, ou em organismos vivos.

Será obviamente compreendido que todos os métodos de rastreio são úteis por si próprios, apesar do fato de poderem não ser encontrados candidatos efetivos. A. Moduladores

Como usado aqui, o termo "substância candidata" refere-se a qualquer molécula que potencialmente pode modular a função indutora de β-MHC do miR-208. Tipicamente serão adquiridas, de várias fontes comerciais, bibliotecas moleculares que se crê cumprirem os critérios básicos de fármacos úteis, num esforço para a identificação em "força bruta" de compostos úteis. 0 rastreio dessas bibliotecas, incluindo bibliotecas geradas de modo combinatorial (por exemplo, bibliotecas de antagomir), é um modo rápido e eficiente de rastrear grandes números de compostos relacionados (e não relacionados) quanto à atividade. As abordagens combinatoriais também são propensas à evolução rápida de fármacos potenciais pela criação de compostos de segunda, terceira, e quarta geração modelados em compostos ativos mas indesejáveis. B. Ensaios In vitro

Um ensaio rápido, económico e fácil de conduzir é um ensaio in vitro. Em geral, esses ensaios empregam moléculas 65 isoladas, podem ser conduzidos rapidamente e em grandes números, desse modo aumentando a quantidade de informação que pode ser obtida num curto período de tempo. Pode ser utilizada uma variedade de recipientes para conduzir os ensaios, incluindo tubos de teste, placas, pratos e outras superfícies, como tiras reagentes ou esférulas.

Uma técnica de rastreio de alto rendimento de compostos é descrita em WO 84/03564. Grandes números de pequenos compostos antagomir podem ser sintetizados num substrato sólido, como pinos de plástico ou qualquer outra superfície. Essas moléculas podem ser rapidamente rastreadas quanto à sua capacidade para hibridizar com o miR-208. C. Ensaios In cyto É divulgado o rastreio de compostos quanto à sua capacidade para modular a expressão e função do miR-208 em células. Várias linhas de células, incluindo as derivadas de células do músculo esquelético, podem ser utilizadas para esses ensaios de rastreio, incluindo células especificamente manipuladas para esta finalidade. Também podem ser utilizadas células cardíacas primárias, tal como pode a linha de células H9C2. D. Ensaios In vivo

Os ensaios in vivo envolvem a utilização de vários modelos animais de doença cardíaca ou doença musculoesquelética, incluindo animais transgénicos, que foram manipulados para terem defeitos específicos, ou conterem marcadores que podem ser utilizados para medir a capacidade de uma substância candidata para atingir e atuar sobre diferentes células no organismo. Devido à sua dimensão, facilidade de 66 manipulação, e informações quanto à sua fisiologia e constituição genética, os ratinhos são uma forma de realização preferida, especialmente para transgénicos. No entanto, outros animais também são adequados, incluindo ratos, coelhos, hamsters, porquinhos-da-índia, gerbilos, marmotas, gatos, cães, ovelhas, cabras, porcos, vacas, cavalos e macacos (incluindo chimpanzés, gibões e babuínos). Ensaios quanto a inibidores podem ser conduzidos utilizando um modelo animal derivado de qualquer uma destas espécies. 0 tratamento de animais com compostos de teste envolverá a administração do composto, numa forma apropriada, ao animal. A administração será feita por qualquer via que possa ser utilizada para fins clínicos. A determinação da eficácia de um composto in vivo pode envolver uma variedade de critérios diferentes, incluindo mas não se limitando a alteração de vias de sinalização hipertrófica e sintomas físicos de hipertrofia. A medição da toxicidade e resposta à dose também pode ser realizada em animais de um modo mais significativo do que em ensaios in vitro ou in cyto. VII. Vetores para Clonagem, Transferência e Expressão Genéticas

Em certas formas de realização são empregues vetores de expressão para expressar o miR-208 ou um seu inibidor. A expressão requer que sinais apropriados sejam proporcionados nos vetores, e que incluam vários elementos reguladores, como intensificadores/promotores de fontes virais e de mamífero que conduzem a expressão dos genes de interesse em células hospedeiras. Também são definidos elementos concebidos para otimizar a estabilidade e aptidão para tradução de RNA mensageiro em células hospedeiras. 67

Também são proporcionadas as condições de utilização de alguns marcadores de seleção de fármacos dominantes para o estabelecimento de clones de células permanentes e estáveis que expressam os produtos, tal como um elemento que liga a expressão dos marcadores de seleção de fármacos à expressão do polipéptido. A. Elementos Reguladores

Ao longo deste requerimento, é pretendido que o termo "construção de expressão" inclua qualquer tipo de construção genética contendo um ácido nucleico que codifica um produto genético em que parte ou a totalidade da sequência codificadora do ácido nucleico está apta a ser transcrita. 0 transcrito pode ser traduzido numa proteína, mas tal não é necessário. Em certos aspetos, a expressão inclui transcrição de um gene e tradução de mRNA num produto genético. Noutras formas de realização, a expressão inclui apenas a transcrição do ácido nucleico que codifica um gene de interesse.

Em certos aspetos, o ácido nucleico que codifica um produto genético está sob o controlo da transcrição de um promotor. Um "promotor" refere-se a uma sequência de DNA reconhecida pela maquinaria sintética da célula, ou maquinaria sintética introduzida, necessária para iniciar a transcrição específica de um gene. A frase "sob o controlo de transcrição" significa que o promotor está na localização e orientação corretas relativamente ao ácido nucleico para controlar a iniciação da RNA polimerase e expressão do gene. 0 termo promotor será usado aqui para referir um grupo de módulos de controlo da transcrição que estão aglomerados em 68 redor do sítio de iniciação para a RNA polimerase II. Muito do pensamento sobre a organização de promotores deriva de análises de vários promotores virais, incluindo os da timidina quinase (tk) do HSV e unidades de transcrição inicial do SV40. Estes estudos, aumentados por trabalhos mais recentes, mostraram que os promotores são compostos por módulos funcionais discretos, cada um consistindo aproximadamente em 7 - 20 pb de DNA, e contendo um ou mais sítios de reconhecimento para proteínas ativadoras ou repressoras da transcrição. A função de pelo menos um módulo de cada promotor consiste em posicionar o sítio de início para a síntese de RNA. O melhor exemplo conhecido disto é a caixa TATA, mas nalguns promotores sem uma caixa TATA, como o promotor do gene da desoxinucleotidil-transferase terminal de mamífero e o promotor dos genes tardios do SV40, um elemento discreto sobreposto ao próprio sitio de início ajuda a fixar o local da iniciação.

Elementos promotores adicionais regulam a frequência da iniciação da transcrição. Tipicamente, estes estão localizados na região de 30 - 110 pb a montante do sítio de início, apesar de ter sido recentemente mostrado que alguns promotores também contêm elementos funcionais a jusante do sítio de início. É frequente o espaçamento entre elementos promotores ser flexível, de modo que a função promotora é conservada quando elementos são invertidos ou movidos entre si. No promotor de tk, o espaçamento entre elementos promotores pode ser aumentado para 50 pb antes de a atividade começar a diminuir. Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar de modo cooperativo ou independente para ativar a transcrição. 69

Noutros aspetos, o promotor do gene inicial imediato do citomegalovirus (CMV) humano, o promotor inicial do SV40, a repetição terminal longa do virus do sarcoma de Rous, o promotor da insulina de rato e a gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase podem ser utilizados para se obter expressão de nivel elevado da sequência codificadora de interesse. Também é contemplada a utilização de outros promotores fágicos virais ou celulares de mamifero ou bacterianos bem conhecidos na área para se obter expressão de uma sequência codificadora de interesse, desde que os niveis de expressão sejam suficientes para uma dada finalidade.

Ao empregar um promotor com propriedades bem conhecidas, o nivel e padrão de expressão da proteina de interesse após transfeção ou transformação podem ser otimizados. Além disso, a seleção de um promotor que é regulado em resposta a sinais fisiológicos específicos pode permitir a expressão indutivel do produto genético. As Tabelas 1 e 2 listam vários elementos reguladores que podem ser empregues, no contexto da presente invenção, para regular a expressão do gene de interesse. Não é pretendido que esta lista seja exaustiva de todos os possíveis elementos envolvidos na promoção da expressão genética, mas sim que seja meramente exemplificativa daqueles.

Os intensificadores são elementos genéticos que aumentam a transcrição a partir de um promotor localizado numa posição distante na mesma molécula de DNA. Os intensificadores estão organizados de modo muito semelhante aos promotores. Isto é, são compostos por muitos elementos individuais, cada um dos quais se liga a uma ou mais proteínas de transcrição. 70 A distinção básica entre intensificadores e promotores é operacional. Uma região intensificadora como um todo deve ser capaz de estimular a transcrição à distância; isto não é necessário para uma região promotora ou seus elementos componentes. Por outro lado, um promotor deve ter um ou mais elementos que dirigem a iniciação da sintese de RNA num sitio particular e numa orientação particular, ao passo que os intensificadores não têm estas especificidades. Frequentemente, os promotores e intensificadores estão sobrepostos e são contíguos, parecendo muitas vezes que têm uma organização modular muito semelhante.

Em baixo apresenta-se uma lista de promotores virais, promotores/intensificadores celulares e promotores/ intensificadores indutíveis que podem ser utilizados em combinação com o ácido nucleico que codifica um gene de interesse numa construção de expressão (Tabela 1 e Tabela 2). Adicionalmente, qualquer combinação de promotor/ intensificador (tal como para a Base de Dados de Promotores Eucarióticos EPDB) também pode ser utilizada para conduzir a expressão do gene. As células eucarióticas podem suportar a transcrição citoplasmática a partir de certos promotores bacterianos se for proporcionada a polimerase bacteriana apropriada, como parte do complexo de distribuição ou como uma construção de expressão genética adicional. TABELA 1 Promotor e/ou Intensificador Promotor/Intensificador Referências Cadeia Pesada de Imunoglobulina Banerji et al., 1983; Gilles et al. , 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; 71 TABELA 1 Promotor e/ou Intensificador Promotor/Intensificador Referências Porton et al., 1990 Cadeia Leve de Imunoglobulina Queen et al., 1983; Picard et al., 1984 Recetor de Células T Luria et al., 1987; Winoto et al. , 1989; Redondo et al., 1990 HLA DQ a e/ou DQ β Sullivan et al., 1987 Interferão β Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988 Interleuquina 2 Greene et al., 1989 Recetor da Interleuquina 2 Greene et al., 1989; Lin et al., 1990 MHC Classe II 5 Koch et al., 1989 HLA-DRa de MHC Classe II Sherman et al., 1989 β-Actina Kawamoto et al., 1988; Ng et al. , 1989 Creatina Quinase Muscular (MCK) Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989 Pré-albumina (Transtiretina) Costa et al., 1988 Elastase I Ornitz et al., 1987 Metalotioneína (MTII) Karin et al., 1987; Culotta et al. , 1989 Colagenase Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987a Albumina Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990 a-Fetoproteína Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989 t-Globina Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990 β-Globina Trudel et al., 1987 c-f os Cohen et al., 1987 c-HA-ras Triesman, 1986; Deschamps et ai., 1985 Insulina Edlund et ai., 1985 Molécula de Adesão Celular Neuronal (NCAM) Hirsh et al., 1990 cq-Antitripaína Latimer et ai., 1990 Histona H2B (TH2B) Hwang et al., 1990 Colagénio de Ratinho e/ou Tipo I Ripe et al., 1989 72 TABELA 1 Promotor e/ou Intensificador Promotor/Intensificador Referências Proteínas Reguladas por Chang et al., 1989 Glucose (GRP94 e GRP78) Hormona de Crescimento do Larsen et al., 1986 Rato Amiloide do Soro Humano Edbrooke et al., 1989 (SAA) Troponina I (TN I) Yutzey et al., 1989 Fator de Crescimento Pech et al., 1989 Derivado de Plaquetas (PDGF) Distrofia Muscular de Klamut et al., 1990 Duchenne SV40 Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al-, 1987; Schaffner et al., 1988 Polioma Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al. , 1986; Satake et al., 1988; Campbell e/ou Villarreal, 1988 Retrovírus Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Choi et al., 1988; Reisman et al., 1989 Vírus Papiloma Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos e/ou Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987 Vírus da Hepatite B Bulia et al., 1986; Jameel et al., 1986; 73 TABELA 1 Promotor e/ou Intensificador Promotor/Intensificador Referências Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988 Vírus da Imunodeficiência Humana Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989 Citomegalovírus (CMV) Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986 Vírus da Leucemia do Macaco Gibão Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989 TABELA 2 Elementos Indutiveis Elemento Indutor Referências MT II Éster de Forbol (TFA) Metais Pesados Palmiter et al., 1982; Haslinger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Imagawa et al., 1987; Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeall et al., 1989 MMTV (vírus do tumor mamário do ratinho) Glucocorticoides Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988 Interferão β poli (Π) X poli(rc) Tavernier et al., 1983 Adenovírus 5 E2 EIA Imperiale et al., 1984 Colagenase Éster de Forbol (TPA) Angel et al., 1987a Estromelisina Éster de Forbol (TPA) Angel et al., 1987b SV40 Éster de Forbol Angel et al., 1987b 74 TABELA 2 Elementos Indutiveis Elemento Indutor Referências (TPA) Gene MX Murino Interferão, Vírus da Doença de Newcastle Hug et al., 1988 Gene GRP78 A23187 Resendez et al., 1988 oc—2 — Macroglobulina IL-6 Kunz et al., 1989 Vimentina Soro Rittling et al. , 1989 Gene H-2Kb de MHC Classe I Interferão Blanar et al., 1989 HSP70 EIA, Antigénio T Grande do SV40 Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b Proliferina Éster de Forbol-TPA Mordacq et al. , 1989 Fator de Necrose Tumoral PMA Hensel et al., 1989 Gene da Hormona Estimulante da Tiroide α Hormona da Tiroide Chatterjee et al., 1989 São particularmente interessantes promotores específicos de músculos, e mais particularmente promotores específicos do coração. Estes incluem o promotor da cadeia leve 2 de miosina (Franz et al., 1994; Kelly et al., 1995), o promotor da alfa actina (Moss et al. , 1996), o promotor da troponina 1 (Bhavsar et al., 1996); o promotor do permutador Na+/Ca2+ (Barnes et al., 1997), o promotor da distrofina (Kimura et al., 1997), o promotor da integrina alfa7 (Ziober e Kramer, 1996), o promotor do péptido natriurético cerebral (LaPointe et al., 1996) e o promotor da alfa B-cristalina/pequena proteína de choque térmico (Gopal-Srivastava, 1995), promotor da cadeia pesada de alfa 75 miosina (Yamauchi-Takihara et al., 1989) e o promotor do ANF (LaPointe et al., 1988).

Quando for empregue uma inserção de cDNA, será tipicamente desejado incluir um sinal de poliadenilação para efetuar a poliadenilação apropriada do transcrito genético. Não se crê que a natureza do sinal de poliadenilação seja crucial para a prática bem-sucedida da invenção, e pode ser empregue qualquer uma dessas sequências, como os sinais de poliadenilação da hormona de crescimento humano e do SV40. Como elemento da cassete de expressão também é contemplado um terminador. Estes elementos podem servir para aumentar os niveis de mensagens e para minimizar a continuação da leitura da cassete para outras sequências. B. Marcadores Selecionáveis

Em certos aspetos, as células contêm construções de ácidos nucleicos, uma célula pode ser identificada in vitro ou in vivo incluindo um marcador na construção de expressão. Esses marcadores conferem à célula uma alteração identificável, permitindo uma identificação fácil de células contendo a construção de expressão. Habitualmente, a inclusão de um marcador de seleção de fármacos auxilia a clonagem e a seleção de transformantes, por exemplo, genes que conferem resistência a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol são marcadores selecionáveis úteis. Alternativamente podem ser empregues enzimas, como a timidina quinase (tk) do virus herpes simplex ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT). Também podem ser empregues marcadores imunológicos. Não se crê que seja importante qual o marcador selecionável empregue, desde que esteja apto a ser expresso simultaneamente com o ácido nucleico que codifica um produto genético. Outros 76 exemplos de marcadores selecionáveis são bem conhecidos do profissional.

C. Construções Multigenes e IRES

Em certos aspetos, a utilização de elementos de sitios internos de ligação de ribossomas (IRES) é empregue para criar mensagens multigenes, ou policistrónicas. Os elementos IRES conseguem iludir o modelo de rastreio de ribossomas da tradução dependente de Cap 5' metilada e começam a tradução em sitios internos (Pelletier e Sonenberg, 1988). Foram descritos os elementos IRES de dois membros da familia dos picanovirus (polio e encefalomiocardite) (Pelletier e Sonenberg, 1988), bem como um IRES de uma mensagem de mamífero (Macejak e Sarnow, 1991) . Os elementos IRES podem ser ligados a fases de leitura aberta heterólogas. Múltiplas fases de leitura aberta podem ser transcritas em conjunto, cada uma separada por um IRES, criando mensagens policistrónicas. Em virtude do elemento IRES, cada fase de leitura aberta está acessível a ribossomas para uma tradução eficiente. Múltiplos genes podem ser eficientemente expressos utilizando um único promotor/intensificador para transcrever uma única mensagem.

Qualquer fase de leitura aberta heteróloga pode ser ligada a elementos IRES. Isto inclui genes para proteínas segregadas, proteínas com múltiplas subunidades, codificadas por genes independentes, proteínas intracelulares ou ligadas a membranas e marcadores selecionáveis. Deste modo, a expressão de várias proteínas pode ser simultaneamente manipulada numa célula com uma única construção e um único marcador selecionável. 77 D. Distribuição de Vetores de Expressão Há alguns modos para introduzir vetores de expressão em células. Em certos aspetos, a construção de expressão compreende um virus ou construção manipulada derivada de um genoma virai. A capacidade de certos virus para entrarem em células via endocitose mediada por recetores, para se integrarem no genoma de células hospedeiras e expressarem genes virais de modo estável e eficiente, tornou-os candidatos atrativos para a transferência de genes estranhos para células de mamifero (Ridgeway, 1988; Nicolas e Rubenstein, 1988; Baichwal e Sugden, 1986; Temin, 1986). Os primeiros virus utilizados como vetores genéticos foram virus de DNA, incluindo os papovavirus (virus simio 40, virus do papiloma bovino, e polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal e Sugden, 1986) e adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal e Sugden, 1986). Estes têm uma capacidade relativamente baixa para sequências de DNA estranho e têm um espetro restrito de hospedeiros. Além disso, o seu potencial oncogénico e efeitos citopáticos em células permissivas levantam preocupações de segurança. Podem acomodar apenas até 8 kB de material genético estranho, mas podem ser facilmente introduzidos numa variedade de linhas de células e animais laboratoriais (Nicolas e Rubenstein, 1988; Temin, 1986).

Um dos métodos preferidos para distribuição in vivo envolve a utilização de um vetor de expressão de adenovirus. Pretende-se que "vetor de expressão de adenovirus" inclua aquelas construções contendo sequências de adenovirus suficientes para (a) suportar o empacotamento da construção a (b) expressar um polinucleótido antissentido que foi clonado ai. Neste contexto, expressão não requer que o produto genético seja sintetizado. 78 0 vetor de expressão compreende uma forma geneticamente manipulada de adenovirus. 0 conhecimento da organização genética do adenovirus, um virus de DNA de filamentação dupla, linear, de 36 kB, permite a substituição de grandes porções de DNA adenoviral por sequências estranhas até 7 kB (Grunhaus e Horwitz, 1992) . Em contraste com retrovirus, a infeção adenoviral de células hospedeiras não resulta em integração cromossómica, pois o DNA adenoviral pode replicar-se de um modo epissomal sem genotoxicidade potencial. Além disso, os adenovirus são estruturalmente estáveis, e não foi detetado rearranjo do genoma após amplificação extensa. Os adenovirus podem infetar virtualmente todas as células epiteliais independentemente da sua fase do ciclo celular. Até à data, a infeção adenoviral parece estar ligada apenas a doença ligeira, como doença respiratória aguda em humanos. 0 adenovirus é particularmente adequado para utilização como vetor de transferência de genes devido ao seu genoma de tamanho intermédio, facilidade de manipulação, titulo elevado, gama larga de células alvo e elevada infetividade. Ambas as extremidades do genoma virai contêm repetições invertidas (ITRs) de 100 - 200 pares de bases, que são elementos cis necessários para a replicação e empacotamento de DNA virai. As regiões inicial (E) e tardia (L) do genoma contêm diferentes unidades de transcrição que são divididas pelo surgimento da replicação do DNA virai. A região EI (EIA e E1B) codifica proteínas responsáveis pela regulação da transcrição do genoma virai e alguns genes celulares. A expressão da região E2 (E2A e E2B) resulta na síntese das proteínas para a replicação do DNA virai. Estas proteínas estão envolvidas na replicação do DNA, expressão genética 79 tardia e bloqueio metabólico de células hospedeiras (Renan, 1990) . Os produtos dos genes tardios, incluindo a maior parte das proteínas da cápside virai, só são expressos após processamento significativo de um único transcrito primário devido ao promotor tardio principal (MLP). O MLP (localizado a 16,8 u.m.) é particularmente eficiente durante a fase tardia da infeção, e todos os mRNAs devidos a este promotor possuem uma sequência lider 5'-tripartida (TPL) que os tornam em mRNAs preferidos para tradução.

Num sistema corrente, um adenovirus recombinante é gerado a partir da recombinação homóloga entre um vetor vaivém e um vetor de pró-vírus. Devido à possível recombinação entre dois vetores pró-virais, um adenovirus de tipo selvagem pode ser gerado a partir deste processo. Em consequência, é crítico isolar um único clone de vírus a partir de uma placa individual e examinar a sua estrutura genómica. A geração e propagação dos correntes vetores de adenovirus, que são deficientes para replicação, dependem de uma linha celular auxiliadora única, designada 293, que foi transformada a partir de células renais embrionárias humanas por fragmentos de DNA Ad5 e que expressa de modo constitutivo proteínas EI (Graham et ah, 1977). Uma vez que a região E3 é dispensável do genoma do adenovirus (Jones e Shenk, 1978), os correntes vetores de adenovirus, com o auxílio de células 293, contêm DNA estranho na região El, D3 ou ambas (Graham e Prevec, 1991) . Na natureza, os adenovirus podem empacotar aproximadamente 105% do genoma de tipo selvagem (Ghosh-Choudhury et al., 1987), proporcionando capacidade para cerca de 2 kb extra de DNA. Combinados com os aproximadamente 5,5 kb de DNA que são substituíveis nas regiões El e E3, a capacidade máxima do 80 corrente vetor de adenovírus é menor do que 7,5 kb, ou cerca de 15% do comprimento total do vetor. Mais de 80% do genoma virai do adenovirus permanece na cadeia principal do vetor e é a fonte de citotoxicidade transmitida pelo vetor. Além disso, a deficiência para replicação do virus deletado em EI é incompleta.

Linhas de células auxiliadoras podem ser derivadas de células humanas, como células renais embrionárias humanas, células musculares, células hematopoiéticas ou outras células mesenquimais ou epiteliais embrionárias humanas. Alternativamente, as células auxiliadoras podem ser derivadas das células de outras espécies de mamíferos que são permissivas para adenovirus humanos. Essas células incluem, por exemplo, células Vero ou outras células mesenquimais ou epiteliais embrionárias de macaco. Como afirmado acima, a linha celular auxiliadora preferida é 293.

Racher et al. (1995) divulgaram métodos aperfeiçoados de cultura de células 293 e propagação de adenovirus. Num formato, agregados celulares naturais crescem por inoculação de células individuais em balões com agitação tratados com silicone de 1 litro (Techne, Cambridge, RU) contendo 100 - 200 mL de meio. Após agitação a 4 0 rpm, a viabilidade celular é estimada com azul de tripano. Noutro formato são empregues microtransportadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, RU) (5 g/L) do modo seguinte. Uma inoculação de células, ressuspensa em 5 mL de meio, é adicionada ao transportador (50 mL) num balão Erlenmeyer de 250 mL e permanece estacionária, com agitação ocasional, durante 1 até 4 horas. O meio é então substituído por 50 mL de meio fresco e é iniciada a agitação. Para a produção de 81 vírus, deixam-se as células crescer até cerca de 80% de confluência; após esse período de tempo, o meio é substituído (para 25% do volume final) e adiciona-se adenovírus a uma MOI de 0,05. As culturas permanecem estacionárias durante a noite; seguidamente o volume é aumentado para 100%, e inicia-se a agitação durante mais 72 horas.

Para além do requisito de o vetor de adenovírus ser deficiente para replicação, ou pelo menos condicionalmente deficiente, não se crê que a natureza do vetor de adenovírus seja crucial para a prática bem-sucedida da invenção. 0 adenovírus pode ter qualquer um dos 42 diferentes serotipos conhecidos ou subgrupos A-F. 0 adenovírus do tipo 5 do subgrupo C é o material de partida preferido para se obter o vetor de adenovírus com deficiência condicional para replicação. Isto deve-se ao fato de o Adenovírus do tipo 5 ser um adenovírus humano, do qual se conhecem muitas informações bioquímicas e genéticas, e historicamente tem sido utilizado para a maior parte das construções que empregam adenovírus como vetor.

Como afirmado acima, o vetor típico é deficiente para replicação e não terá uma região EI de adenovírus. Assim, será muito conveniente introduzir o polinucleótido que codifica o gene de interesse na posição de onde foram removidas as sequências codificadoras El. No entanto, a posição da inserção da construção nas sequências do adenovírus não é crítica para a invenção. O polinucleótido que codifica o gene de interesse também pode ser inserido no lugar da região E3 deletada em vetores com substituição de E3, como descrito por Karlsson et al. (1986), ou na 82 região E4 onde uma linha celular auxiliadora ou virus auxiliador complementa o defeito de E4. É fácil fazer crescer e manipular adenovirus, e este exibe gamas largas de hospedeiros in vitro e in vivo. Este grupo de virus pode ser obtido com titulos elevados, por exemplo, 109-1012 unidades formadoras de placas por mL, e são altamente infeciosos. 0 ciclo de vida do adenovirus não requer integração no genoma da célula hospedeira. Os genes estranhos distribuídos por vetores de adenovirus são epissomais e, em consequência, têm baixa genotoxicidade para células hospedeiras. Não foram relatados efeitos secundários em estudos de vacinação com adenovirus de tipo selvagem (Couch et ai., 1963; Top et ai., 1971), demonstrando a sua segurança e potencial terapêutico como vetores de transferência de genes in vivo.

Os vetores de adenovirus têm sido utilizados em expressão genética eucariótica (Levrero et ai., 1991; Gomez-Foix et ai., 1992) e desenvolvimento de vacinas (Grunhaus e Horwitz, 1992; Graham e Prevec, 1991). Recentemente, estudos com animais sugeriram que adenovirus recombinantes podem ser utilizados para terapia genética (Stratford-Perricaudet e Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et ai., 1990; Rich et ai., 1993). Estudos de administração de adenovirus recombinantes em diferentes tecidos incluem instilação traqueal (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), injeção muscular (Ragot et al., 1993), injeções intravenosas periféricas (Herz e Gerard, 1993) e inoculação estereotáctica no cérebro (Le Gal La Salle et al., 1993).

Os retrovirus são um grupo de virus de RNA de filamentação simples caracterizados por capacidade de converterem o seu 83 RNA em DNA de filamentação dupla em células infetadas por um processo de transcrição reversa (Coffin, 1990). O DNA resultante é então integrado de modo estável em cromossomas celulares na forma de um pró-vírus e dirige a síntese de proteínas virais. A integração leva à retenção das sequências genéticas virais na célula recetora e seus descendentes. O genoma retroviral contém três genes, gag, pol e env, que codificam proteínas capsídicas, enzima polimerase, e componentes do envelope, respetivamente. Uma sequência presente a montante do gene gag contém um sinal para empacotamento do genoma em viriões. Duas sequências de repetições terminais longas (LTR) estão presentes nas extremidades 5' e 3' do genoma virai. Estas contêm sequências promotoras e intensificadoras fortes e também são requeridas para integração no genoma da célula hospedeira (Coffin, 1990).

Para construir um vetor retroviral, um ácido nucleico que codifica um gene de interesse é inserido no genoma virai no lugar de certas sequências virais, para produzir um vírus que é deficiente para replicação. Para produzir viriões é construída uma linha de células empacotadoras contendo os genes gag, pol e env mas sem as LTR e componentes de empacotamento (Mann et al., 1983). Quando um plasmídeo recombinante contendo um cDNA, juntamente com as LTR e sequências de empacotamento retrovirais, é introduzido nesta linha de células (por precipitação com fosfato de cálcio, por exemplo), a sequência empacotadora permite que o transcrito de RNA do plasmídeo recombinante seja empacotado em partículas virais, que então são segregadas para o meio de cultura (Nicolas e Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 0 meio contendo os retrovírus recombinantes é então recolhido, opcionalmente concentrado, 84 e utilizado para transferência genética. Os vetores retrovirais conseguem infetar uma grande variedade de tipos de células. No entanto, a integração e expressão estável requerem a divisão de células hospedeiras (Paskind et al., 1975).

Foi recentemente desenvolvida uma nova abordagem concebida para permitir o direcionamento especifico de vetores de retrovirus com base na modificação química de um retrovírus pela adição química de resíduos de lactose ao envelope virai. Esta modificação pode permitir a infeção específica de hepatócitos via recetores de sialoglicoproteínas.

Foi concebida uma abordagem diferente de direcionamento de retrovírus recombinantes, na qual foram utilizados anticorpos biotinilados contra uma proteína de envelope retroviral e contra um recetor celular específico. Os anticorpos foram acoplados via os componentes de biotina utilizando estreptavidina (Roux et al., 1989). Ao utilizar anticorpos contra antigénios do complexo principal de histocompatibilidade da classe I e classe II, demonstraram a infeção de uma variedade de células humanas que continham esses antigénios de superfície com um vírus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989). Há algumas limitações à utilização de vetores de retrovírus. Por exemplo, os vetores de retrovírus são habitualmente integrados em sítios aleatórios do genoma celular. Isto pode conduzir a mutagénese por inserção através da interrupção de genes do hospedeiro ou através da inserção de sequências reguladoras virais que podem interferir na função de genes flanqueadores (Varmus et al., 1981) . Outra preocupação com a utilização de vetores de 85 retrovírus deficientes é o potencial aparecimento de virus de tipo selvagem competente para replicação nas células empacotadoras. Isto pode dever-se a eventos de recombinação nos quais a sequência intacta do virus recombinante é inserida a montante da sequência de gag, pol, env integrada no genoma da célula hospedeira. No entanto, estão agora disponíveis novas linhas de células empacotadoras que devem diminuir muito a probabilidade de recombinação (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).

Na presente invenção podem ser empregues outros vetores virais como construções de expressão. Podem ser empregues vetores derivados de vírus, tais como vírus vacínia (Ridgeway, 1988; Baichwal e Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), vírus adeno-associados (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal e Sugden, 1986; Hermonat e Muzycska, 1984) e vírus herpes. Oferecem várias características atrativas para várias células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal e Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).

Com o reconhecimento de vírus da hepatite B deficientes ganhou-se uma nova compreensão da relação estrutura-função de diferentes sequências virais. Estudos in vitro mostraram que o vírus pode reter a capacidade de empacotamento dependente de auxiliadores e transcrição reversa apesar da deleção de até 80% do seu genoma (Horwich et al. , 1990) . Isto sugeriu que grandes porções do genoma podem ser substituídas por material genético estranho. O hepatotropismo e persistência (integração) foram propriedades particularmente atrativas para transferência genética dirigida para o fígado. Chang et al. introduziram o gene da cloranfenicol acetiltransferase (CAT) no genoma 86 do vírus da hepatite B de pato em vez das sequências codificadoras de polimerase, superfície e pré-superfície. Foi cotransfetado com um vírus de tipo selvagem numa linha de células de hepatoma aviário. 0 meio de cultura contendo títulos elevados do vírus recombinante foi utilizado para infetar hepatócitos primários de patinhos. Foi detetada expressão estável do gene CAT durante pelo menos 24 dias após a transfeção (Chang et al., 1991).

Para realizar a expressão das construções de genes sentido ou antissentido, a construção de expressão deve ser distribuída numa célula. Esta distribuição pode ser efetuada in vitro, como em procedimentos laboratoriais de transformação de linhas de células, ou in vivo ou ex vivo, como no tratamento de certos estados de doença. Um mecanismo de distribuição é via infeção virai, em que a construção de expressão é encapsidada numa partícula virai infeciosa. A presente invenção também contempla vários métodos não virais para a transferência de construções de expressão em células de mamífero cultivadas. Estes incluem precipitação com fosfato de cálcio (Graham e Van Der Eb, 1973; Chen e Okayama, 1987; Rippe et al. , 1990) DEAE-dextrano (Gopal, 1985), eletroporação (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al. , 1984), microinjeção direta (Harland e Weintraub, 1985), lipossomas carregados com DNA (Nicolau e Sene, 1982; Fraley et al., 1979) e complexos lipofectamina-DNA, sonicação de células (Fechheimer et al., 1987), bombardeamento de genes utilizando microprojéteis de alta velocidade (Yang et al., 1990), e transfeção mediada por recetores (Wu e Wu, 1987; Wu e Wu, 1988) . Algumas destas 87 técnicas podem ser adaptadas com êxito para utilização in vivo ou ex vivo.

Depois de a construção de expressão ter sido distribuída na célula, o ácido nucleico que codifica o gene de interesse pode ser posicionado e expresso em diferentes sitios. Em certas formas de realização, o ácido nucleico que codifica o gene pode ser integrado de modo estável no genoma da célula. Esta integração pode ser feita na localização e orientação cognatas via recombinação homóloga (substituição de genes) ou pode ser integrado numa localização inespecifica aleatória (adição de genes) . Ainda noutras formas de realização, o ácido nucleico pode ser mantido de modo estável na célula como um segmento separado e epissomal de DNA. Esses segmentos ou "epissomas" de ácidos nucleicos codificam sequências suficientes para permitir a manutenção e replicação independentemente ou em sincronia com o ciclo da célula hospedeira. 0 modo como a construção de expressão é distribuída numa célula e em que local da célula permanece o ácido nucleico dependem do tipo de construção de expressão empregue.

Ainda noutro aspeto, a construção de expressão pode simplesmente consistir em DNA recombinante ou plasmídeos nus. A transferência da construção pode ser efetuada por qualquer um dos métodos mencionados acima que, física ou quimicamente, permeabilizam a membrana celular. Isto é particularmente aplicável à transferência in vitro, mas também pode ser aplicado à utilização in vivo. Dubensky et al. (1984) injetaram com êxito DNA de vírus de polioma, na forma de precipitados com fosfato de cálcio, em fígado e baço de ratinhos adultos e recém-nascidos, demonstrando replicação virai ativa e infeção aguda. Benvenisty e Neshif (1986) também demonstraram que a injeção intraperitoneal direta de plasmideos precipitados com fosfato de cálcio resulta em expressão dos genes transfetados. É considerado que DNA que codifica um gene de interesse também possa ser transferido de um modo semelhante in vivo e expresse o produto genético.

Ainda noutro aspeto, a transferência de uma construção de expressão de DNA nu para células pode envolver bombardeamento de partículas. Este método depende da capacidade de acelerar microprojéteis revestidos com DNA para uma velocidade elevada, permitindo que perfurem membranas celulares e entrem em células sem as matar (Klein et al., 1987). Têm sido desenvolvidos vários dispositivos para acelerar partículas pequenas. Um desses dispositivos baseia-se numa descarga de alta voltagem para gerar uma corrente elétrica, que por sua vez proporciona a força motriz (Yang et al. , 1990). Os microprojéteis utilizados têm consistido em substâncias biologicamente inertes, como esférulas de tungsténio ou ouro. Órgãos selecionados, incluindo o fígado, pele e tecido muscular de ratos e ratinhos, foram bombardeados in vivo (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Isto pode requerer exposição cirúrgica do tecido ou células, para eliminar qualquer tecido interveniente entre o canhão e o órgão alvo, isto é, tratamento ex vivo. Mais uma vez, DNA que codifica um gene particular pode ser distribuído via este método e ainda estar incorporado na presente invenção.

Noutro aspeto, a construção de expressão pode ser encerrada num lipossoma. Os lipossomas são estruturas vesiculares caracterizadas por uma membrana de bicamada fosfolipídica e 89 um meio aquoso interno. Lipossomas multilamelares têm múltiplas camadas lipidicas separadas por meio aquoso. Formam-se espontaneamente quando fosfolipidos são suspensos num excesso de solução aquosa. Os componentes lipidicos sofrem autorrearranjo antes da formação de estruturas fechadas e encerram água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipidicas (Ghosh e Bachhawat, 1991). Também são contemplados complexos lipofectamina-DNA. A distribuição de ácidos nucleicos mediada por lipossomas e a expressão de DNA estranho in vitro têm tido muito êxito. Wong et al. (1980) demonstraram a exequibilidade da distribuição mediada por lipossomas e expressão de DNA estranho em embriões de galinha cultivados, células HeLa e de hepatoma. Nicolau et al. (1987) efetuaram com êxito transferência genética mediada por lipossomas em ratos após injeção intravenosa.

Em certos aspetos, o lipossoma pode ser complexado com um virus de hemaglutinação (HVJ). Foi mostrado que isto facilita a fusão com a membrana celular e promove a entrada na célula de DNA encapsulado em lipossomas (Kaneda et al., 1989) . Noutras formas de realização, o lipossoma pode ser complexado ou empregue em conjunção com proteínas cromossómicas nucleares diferentes de histona (HMG-1) (Kato et al., 1991). Ainda noutras formas de realização, o lipossoma pode ser complexado ou empregue em conjunção com HVJ e HMG-1. Uma vez que essas construções de expressão têm sido empregues com êxito na transferência e expressão de ácidos nucleicos in vitro e in vivo, então são aplicáveis para a presente invenção. Quando um promotor bacteriano for empregue na construção de DNA, também será desejável incluir no lipossoma uma polimerase bacteriana apropriada. 90

Outras construções de expressão que podem ser empregues para distribuir um ácido nucleico que codifica um gene particular em células são veiculos de distribuição mediados por recetores. Estes tiram partido da captação seletiva de macromoléculas por endocitose mediada por recetores em quase todas as células eucarióticas. Devido à distribuição de vários recetores especifica para tipos de células, a distribuição pode ser altamente especifica (Wu e Wu, 1993).

Veiculos de direcionamento de genes mediados por recetores consistem geralmente em dois componentes: um ligando especifico para recetores celulares e um agente de ligação de DNA. Têm sido utilizados vários ligandos para transferência de genes mediada por recetores. Os ligandos mais extensamente caracterizados são asialo-orosomucoide (ASOR) (Wu e Wu, 1987) e transferrina (Wagner et al. , 1990). Recentemente, uma neoglicoproteína sintética, que reconhece o mesmo recetor do ASOR, foi utilizada como veiculo de distribuição de genes (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994), e o fator do crescimento epidérmico (EGF) também foi utilizado para distribuir genes para células de carcinoma escamoso (Myers, EPO 0273085) .

Noutros aspetos, o veiculo de distribuição pode compreender um ligando e um lipossoma. Por exemplo, Nicolau et al. (1987) empregaram lactosil-ceramida, um asialogangliósido com galactose terminal, incorporada em lipossomas e observaram um aumento da captação do gene da insulina por hepatócitos. Assim, é exequível que um ácido nucleico que codifica um gene particular também possa ser especificamente distribuído num tipo de células por qualquer número de sistemas ligando-recetor com ou sem 91 lipossomas. Por exemplo, o fator de crescimento epidérmico (EGF) pode ser utilizado como recetor para a distribuição mediada de um ácido nucleico em células que exibem regulação positiva do recetor do EGF. Pode ser utilizada manose para abordar seletivamente o recetor da manose em células do figado. Além disso, anticorpos para CD5 (CLL), CD22 (linfoma) , CD25 (leucemia de células T) e MAA (melanoma) podem ser utilizados de modo semelhante como frações de direcionamento.

Num exemplo particular, o oligonucleótido pode ser administrado em combinação com um lipido catiónico. Exemplos de lipidos catiónicos incluem, mas não estão limitados a lipofectina, DOTMA, DOPE, e DOTAP. A publicação de W00071096 descreve diferentes formulações, como uma formilação de DOTAP: colesterol ou derivado do colesterol, que podem ser eficazmente utilizadas para terapia genética. Outras divulgações também discutem diferentes formulações lipídicas ou lipossómicas incluindo nanopartículas e métodos de administração; estas incluem mas não estão limitadas às Publicações de Patentes U.S. 20030203865, 20020150626, 20030032615, e 20040048787. Métodos utilizados para a formação de partículas também são divulgados nas patentes U.S. 5,844,107, 5,877,302, 6,008,336, 6,077,835, 5,972,901, 6,200,801, e 5,972,900.

Em certos aspetos, a transferência de genes pode ser mais facilmente realizada em condições ex vivo. Terapia genética ex vivo refere-se ao isolamento de células de um animal, distribuição de um ácido nucleico nas células in vitro, e depois incorporação de novo das células modificadas num animal. Isto pode envolver a remoção cirúrgica de 92 tecidos/órgãos de um animal ou a cultura primária de células e tecidos. VIII. Métodos de Geração de Ratinhos Transgénicos São divulgados animais transgénicos desprovidos de um ou de ambos os alelos funcionais do miR-208. Também animais transgénicos que expressam o miR-208 sob o controlo de um promotor indutivel, seletivo para tecidos ou constitutivo, linhas de células recombinantes derivadas desses animais, e embriões transgénicos podem ser úteis na determinação do papel exato que o miR-208 desempenha no desenvolvimento e diferenciação de cardiomiócitos e no desenvolvimento de hipertrofia cardiaca patológica e falha cardiaca. Além disso, esses animais transgénicos podem permitir compreender o desenvolvimento cardiaco. A utilização de um ácido nucleico que codifica o miR-208 expresso de modo constitutivo proporciona um modelo de expressão super- ou desregulada. Também são contemplados animais transgénicos "knockout" para o miR-208, num ou ambos os alelos.

Num aspeto geral, um animal transgénico é produzido pela integração de um dado transgene no genoma de um modo que permite a expressão do transgene. Métodos de produção de animais transgénicos são genericamente descritos por Wagner e Hoppe (Patente U.S. 4,873,191), e Brinster et al., (1985).

Tipicamente, um gene flanqueado por sequências genómicas é transferido por microinjeção para um ovo fertilizado. Os ovos microinjetados são implantados numa fêmea hospedeira, e a progenitura é rastreada quanto à expressão do transgene. Animais transgénicos podem ser produzidos a partir dos ovos fertilizados de alguns animais, incluindo 93 mas não se limitando a répteis, anfibios, pássaros, mamíferos, e peixes.

Clones de DNA para microinjeção podem ser preparados por quaisquer meios conhecidos na área. Por exemplo, clones de DNA para microinjeção podem ser clivados com enzimas apropriadas para removerem as sequências plasmídicas bacterianas, e os fragmentos de DNA podem ser submetidos a eletroforese em géis de agarose 1% em tampão TBE, utilizando técnicas comuns. As bandas de DNA são visualizadas por coloração com brometo de etídio, e a banda contendo as sequências de expressão é excisada. A banda excisada é então colocada em sacos de diálise contendo 0,3 M acetato de sódio, pH 7,0. O DNA é eletroeluído para os sacos de diálise, é extraído com uma solução 1: 1 de fenol: clorofórmio e precipitado por dois volumes de etanol. O DNA é redissolvido em 1 mL de tampão com baixo teor de sal (0,2 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4, e 1 mM EDTA) e é purificado numa coluna Elutip-D™. A coluna é primeiramente preparada com 3 mL de tampão com alto teor de sal (1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4, e 1 mM EDTA) seguido de lavagem com 5 mL de tampão com baixo teor de sal. As soluções de DNA são passadas na coluna três vezes, para ligar o DNA à matriz da coluna. Após uma lavagem com 3 mL de tampão com baixo teor de sal, o DNA elui com 0,4 mL de tampão com alto teor de sal e é precipitado por dois volumes de etanol. As concentrações do DNA são medidas por absorção a 260 nm num espetrofotómetro de UV. Para a microinjeção, as concentrações de DNA são ajustadas para 3 yg/mL em 5 mM Tris, pH 7,4 e 0,1 mM EDTA. Outros métodos de purificação de DNA para microinjeção são descritos em Palmiter et al. (1982); e em Sambrook et al. (2001). 94

Num procedimento exemplificativo de microinjeção, a superovulação de ratinhos fêmeas com seis semanas de idade é induzida com uma injeção de 5 IU (0,1 cc, i.p.) de gonadotropina do soro de égua prenha (PMSG; Sigma) seguido, 48 horas depois, de uma injeção de 5 IU (0,1 cc, i.p.) de gonadotropina coriónica humana (hCG; Sigma). As fêmeas são reunidas a machos imediatamente após a injeção de hCG. Vinte e uma horas após a injeção de hCG, as fêmeas que acasalaram são sacrificadas por asfixia com CO2 ou deslocamento cervical, os embriões são recuperados de oviductos excisados e colocados em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com 0,5% albumina de soro bovino (BSA; Sigma). As células do cumulus envolventes são removidas com hialuronidase (1 mg/mL). Os embriões pró-nucleares são depois lavados e colocados em solução salina equilibrada de Earle contendo 0,5 % BSA (EBSS), numa incubadora a 37,5°C com uma atmosfera humidificada a 5% CO2, 95% ar, até à altura da injeção. Os embriões podem ser implantados na fase de duas células.

Ratinhos fêmeas adultos com ciclos aleatórios são emparelhados com machos que foram submetidos a vasectomia. Para esta finalidade podem ser utilizados ratinhos C57BL/6 ou Suíços ou outras estirpes comparáveis. As fêmeas recetoras são emparelhadas ao mesmo tempo das fêmeas dadoras. Na altura da transferência dos embriões, as fêmeas recetoras são anestesiadas com uma injeção intraperitoneal de 0,015 mL de 2,5 % avertina por grama de peso do corpo. Os oviductos são expostos por uma única incisão dorsal na linha média. Depois é feita uma incisão ao longo da parede do corpo diretamente sobre o oviducto. A bursa ovárica é então rompida com pinças de relojoeiro. Os embriões a serem 95 transferidos são colocados em DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco) e na ponta de uma pipeta de transferência (cerca de 10 até 12 embriões) . A ponta da pipeta é inserida no infundibulo e os embriões são transferidos. Depois da transferência, a incisão é fechada com duas suturas. IX. Definições

Como usado aqui, o termo "falha cardíaca" é utilizado de modo lato para designar qualquer estado que reduz a capacidade do coração para bombear sangue. Como resultado, congestão e edema desenvolvem-se nos tecidos. Muito frequentemente, a falha cardíaca é causada por contratilidade diminuída do miocárdio, devido a fluxo sanguíneo coronário reduzido; no entanto, muitos outros fatores podem conduzir a falha cardíaca, incluindo danos nas válvulas cardíacas, deficiência de vitaminas, e doença primária do músculo cardíaco. Não obstante os mecanismos fisiológicos precisos de falha cardíaca não estarem totalmente compreendidos, crê-se, em geral, que a falha cardíaca envolve perturbações em várias propriedades autonômicas cardíacas, incluindo respostas simpáticas, parassimpáticas e de barorrecetores. A frase "manifestações de falha cardíaca" é usada de modo lato para abranger todas as sequelas associadas a falha cardíaca, como respiração ofegante, edema com sinal de godet, um fígado mole dilatado, veias do pescoço congestionadas, estertores pulmonares e afins, incluindo descobertas laboratoriais associadas a falha cardíaca.

O termo "tratamento" ou equivalentes gramaticais abrangem a melhoria e/ou reversão dos sintomas de falha cardíaca (isto é, a capacidade do coração para bombear sangue). A 96 "melhoria da função fisiológica" do coração pode ser avaliada utilizando qualquer uma das medições descritas aqui (por exemplo, medição da fração de ejeção, fração de encurtamento, dimensão interna do ventrículo esquerdo, batimento cardíaco, etc.), bem como qualquer efeito na sobrevivência do animal. Quando se utilizam modelos animais, a resposta de animais transgénicos tratados e de animais transgénicos não tratados é comparada utilizando qualquer um dos ensaios descritos aqui (adicionalmente, animais não transgénicos tratados e não tratados podem ser incluídos como controlos) . Desse modo, um composto que causa uma melhoria em qualquer parâmetro associado a falha cardíaca utilizado nos métodos de rastreio divulgados aqui pode ser identificado como um composto terapêutico. 0 termo "cardiomiopatia dilatada" refere-se a um tipo de falha cardíaca caracterizado pela presença de um ventrículo esquerdo simetricamente dilatado com função contrátil sistólica fraca e, adicionalmente, é frequente envolver o ventrículo direito. 0 termo "composto" refere-se a qualquer entidade química, agente farmacêutico, fármaco, e afins que pode ser utilizado para tratar ou prevenir uma doença, moléstia, enfermidade, ou perturbação da função corporal. Compostos compreendem compostos terapêuticos conhecidos e potenciais. Pode determinar-se que um composto é terapêutico por rastreio, utilizando os métodos de rastreio divulgados aqui. Um "composto terapêutico conhecido" refere-se a um composto terapêutico que se verificou (por exemplo, por ensaios com animais ou experiência prévia com administração a humanos) ser eficaz nesse tratamento. Por outras 97 palavras, um composto terapêutico conhecido não se limita a um composto eficaz no tratamento de falha cardíaca.

Como usado aqui, o termo "agonista" refere-se a moléculas ou compostos que imitam a ação de um composto "nativo" ou "natural". Os agonistas podem ser homólogos destes compostos naturais relativamente à conformação, carga ou outras características. Assim, os agonistas podem ser reconhecidos por recetores expressos em superfícies celulares. Este reconhecimento pode dar origem a alterações fisiológicas e/ou bioquímicas na célula, de modo que a célula reage à presença do agonista tal como se estivesse presente o composto natural. Os agonistas podem incluir proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, ou quaisquer outras moléculas que interagem com uma molécula, recetor, e/ou via de interesse.

Como usado aqui, o termo "hipertrofia cardíaca" refere-se ao processo no qual miócitos cardíacos adultos respondem a "stress" por crescimento hipertrófico. Esse crescimento é caracterizado por aumentos da dimensão celular sem divisão celular, reunião de sarcómeros adicionais na célula para maximizar a geração de força, e uma ativação de um programa genético cardíaco fetal. A hipertrofia cardíaca está muitas vezes associada a risco aumentado de morbidez e mortalidade; assim, estudos dirigidos à compreensão dos mecanismos moleculares de hipertrofia cardíaca podem ter um impacto significativo na saúde humana.

Como usados aqui, os termos "antagonista" e "inibidor" referem-se a moléculas, compostos, ou ácidos nucleicos que inibem a ação de um fator celular que pode estar envolvido em hipertrofia cardíaca. Os antagonistas podem ou não ser 98 homólogos destes compostos naturais no que se refere à conformação, carga ou outras características. Assim, os antagonistas podem ser reconhecidos pelos mesmos recetores ou recetores diferentes que são reconhecidos por um agonista. Os antagonistas podem ter efeitos alostéricos que previnem a ação de um agonista. Alternativamente, os antagonistas podem prevenir a função do agonista. Em contraste com os agonistas, os compostos antagonistas não conduzem a alterações patológicas e/ou bioquímicas na célula, de modo que a célula reage à presença do antagonista tal como se estivesse presente o fator celular. Antagonistas e inibidores podem incluir proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, ou quaisquer outras moléculas que se ligam ou interagem com um recetor, molécula, e/ou via de interesse.

Como usado aqui, o termo "modular" refere-se a uma modificação ou a uma alteração de uma atividade biológica. A modulação pode consistir num aumento ou diminuição da atividade proteica, uma modificação da atividade de quinase, uma modificação de características de ligação, ou qualquer outra modificação das propriedades biológicas, funcionais, ou imunológicas associadas à atividade de uma proteína ou outra estrutura de interesse. 0 termo "modulador" refere-se a qualquer molécula ou composto que é capaz de modificar ou alterar a atividade biológica como descrito acima. norepinefrina).

Alguns 0 termo "antagonista de recetores β-adrenérgicos" refere-se a um composto ou entidade química que é capaz de bloquear, parcial ou totalmente, o tipo beta (β) de adrenorrecetores (isto é, recetores do sistema adrenérgico que respondem a catecolaminas, especialmente 99 antagonistas de recetores β-adrenérgicos exibem um grau de especificidade para um subtipo de recetores (geralmente βι) ; esses antagonistas são denominados "antagonistas de recetores adrenérgicos específicos para βι" e "antagonistas de recetores adrenérgicos específicos para β2". 0 termo "antagonista de recetores β-adrenérgicos" refere-se a compostos químicos que são antagonistas seletivos e não seletivos. Exemplos de antagonistas de recetores β-adrenérgicos incluem mas não estão limitados a acebutolol, atenolol, butoxamina, carteolol, esmolol, labetolol, metoprolol, nadolol, penbutolol, propanolol, e timolol. A utilização de derivados de antagonistas de recetores β-adrenérgicos conhecidos está abrangida pelos métodos aqui divulgados. De fato, qualquer composto que se comporte funcionalmente como um antagonista de recetores β-adrenérgicos está abrangido pelos métodos da presente invenção.

Os termos "inibidor da enzima conversora da angiotensina" ou "inibidor da ACE" referem-se a um composto ou entidade química que é capaz de inibir, parcial ou totalmente, a enzima envolvida na conversão da angiotensina I relativamente inativa na angiotensina II ativa no sistema renina-angiotensina. Adicionalmente, os inibidores da ACE inibem de modo concomitante a degradação da bradiquinina, que provavelmente aumenta de modo significativo o efeito anti-hipertensor dos inibidores da ACE. Exemplos de inibidores da ACE incluem mas não estão limitados a benazepril, captopril, enalopril, fosinopril, lisinopril, quiapril e ramipril. A utilização de derivados de inibidores conhecidos da ACE está abrangida pelos métodos aqui divulgados. De fato, qualquer composto que se comporte 100 funcionalmente como um inibidor da ACE está abrangido pelos métodos aqui divulgados.

Como usado aqui, o termo "genótipos" refere-se à constituição genética real de um organismo, ao passo que "fenótipo" se refere a caracteristicas fisicas exibidas por um indivíduo. Adicionalmente, o "fenótipo" é o resultado da expressão seletiva do genoma (isto é, é uma expressão do historial celular e da sua resposta ao ambiente extracelular). De fato, o genoma humano contém 30 000 - 35 000 genes estimados. Em cada tipo de célula, apenas é expressa uma pequena fração (isto é, 10-15%) destes genes. X. Exemplos

Os exemplos seguintes são incluídos para ilustrar adicionalmente vários aspetos da invenção. Os profissionais devem apreciar que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas e/ou composições descobertas pelo inventor para funcionarem bem na prática da invenção e, assim, pode considerar-se que constituem modos preferidos para a sua prática. 18), U6 reverso:

Exemplo 1 - Materiais & Métodos Análise de coloração "Northern". Amostras de tecido cardíaco de ventrículos esquerdos de humanos anónimos diagnosticados como tendo corações sem falha ou com falha Cardiac foram obtidas da Gilead Colorado (Westminster, CO). Isolou-se RNA total de amostras de tecido cardíaco de ratinho, rato e humano utilizando o reagente Trizol (Gibco/BRL). As colorações "Northern" para detetar microRNAs foram realizadas como previamente descrito (1). Uma sonda U6 serviu de controlo de carga (U6 direto: 5-GTOCTCaCTTOOOCAGC-3 (SEQ ID NO: 18), U6 reverso: 5- 101 AAAATATOC AACGCTTCo\CGAATTTGC<3 - 3 (SEQ ID NO: 19)). Para detetar a expressão de aMHC, uma coloração "Northern" contendo 10 pg de RNA de tecido cardíaco de animais adultos de tipo selvagem e mutantes no miR-208 foi sondada com um fragmento de cDNA de aMHC abrangendo uma parte da região 5'UTR e primeiro exão.

Tratamento com PTU. A deficiência de hormonas da tiroide foi induzida nutrindo animais, durante os períodos indicados, com uma ração sem iodo suplementada com 0,15% PTU, adquirido à Harlan Teklad Co. (TD 97061) (Madison, WI) .

Análise de microsséries e PCR em tempo real. RNA total de tecido cardíaco foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen). A análise de microsséries foi realizada utilizando a série do Genoma de Ratinho 430 2.0 (Affymetrix) . Realizou-se RT-PCR com "primers" hexaméricos aleatórios (Invitrogen) em amostras de RNA, após o que a expressão de um subconjunto de genes foi analisada por PCR quantitativo em tempo real utilizando sondas Taqman, adquiridas à ABI.

Geração de ratinhos mutantes no miR-208. Para gerar o vetor de abordagem do miR-208, um fragmento de 0,4 kb (braço 5') estendendo-se a montante da região codificadora do miR-208 foi digerido com SacII e Notl e ligado no plasmídeo de abordagem pGKneoF2L2dta a montante dos sítios loxP e da cassete de neomicina flanqueada por Frt. Um fragmento de 3,3 kb (braço 3') foi digerido com Sall e HindIII e ligado no vetor entre as cassetes de resistência à neomicina e seleção negativa de Dta. As células ES alvo contendo o alelo desmantelado foram identificadas por análise de coloração "Southern" com sondas 5' e 3'. Três clones de ES 102 alvo de miR-208 foram identificados e utilizados para a injeção de blastócitos. Os ratinhos quiméricos resultantes foram criados para C57BL/6 para se obter a transmissão da linha germinativa do alelo mutante. As sequências de "primers" de PCR estão disponiveis a pedido.

Coloração "Western". Extraiu-se miosina de tecido cardíaco como descrito (Morkin, 2000) . As isoformas de MHC foram separadas por SDS PAGE e realizou-se coloração "Western" com aMHC monoclonal de ratinho (BA-G5) (ATCC, Rockville, MD) e antimiosina monoclonal de ratinho (M8421 lenta, esquelética) (Sigma, MO) , que é altamente específico para βΜΗ<2. Para detetar toda a miosina estriada utilizou-se um anticorpo pan-específico (monoclonal de ratinho 3-48; Accurate Chemical & Scientific Corporation, NY). Detetou-se a THRAP1 por imunoprecipitação a partir de 400 pg de lisado de proteínas cardíacas. Após pré-clarificação das amostras durante 1 hora a 4°C, o sobrenadante foi incubado durante a noite a 4°C com 1 pL de anti-THRAPl policlonal de coelho (uma oferta generosa de R. Roeder, Rockefeller University) e 15 pL de esférulas de proteína A. As esférulas foram lavadas três vezes com tampão de lise e ferveram em tampão de amostras de SDS. A proteína THRAP1 imunoprecipitada foi resolvida por SDS-PAGE e analisada utilizando anti-THRAPl policlonal de coelho a uma diluição de 1: 3000 e IgG anti-coelho conjugado a peroxidase de rábano bravo a uma diluição de 1: 5000, com deteção com Reagente Luminol (Santa Cruz).

Análise histológica e hibridização de RNA in situ. Os tecidos utilizados para histologia foram incubados em solução de Krebs-Henselheit, foram fixados em 4% paraformaldeído, seccionados, e processados quanto a 103 coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e Tricrómico de Masson ou hibridização in situ por técnicas comuns (Krenz e Robbins, 2004). Geraram-se sondas de RNA etiquetadas com 35S utilizando o estojo Maxiscript (Amersham). Os sinais foram pseudocorados a vermelho utilizando Adobe Photoshop.

Ecocardiografia transtorácica. A função cardíaca e dimensões do coração foram avaliadas por ecocardiografia bidimensional em ratinhos conscientes utilizando um Sistema Vingmed (GE Vingmed Ultrasound, Horten, Noruega) e um transdutor linear em série de 11,5 MHz. Utilizaram-se registos de modo M para medir as espessuras das paredes anterior e posterior do final da diástole e no final da sístole. O diâmetro interno ventricular esquerdo (LV) (LVID) foi medido como o maior diâmetro anteroposterior na diástole (LVIDd) ou sístole (LVIDs). Os dados foram analisados por um único observador cego para o genótipo dos ratinhos. A fração de encurtamento (FS) do LV foi calculada de acordo com a fórmula seguinte: FS (%) = [(LVIDd LVIDs)/LVIDd] x 100 .

Geração de ratinhos transgénicos. Um fragmento genómico de ratinho que flanqueia o miRNA de interesse foi subclonado num plasmídeo de expressão específico para o coração contendo a α-MHC e sinal poli(A)+ de GH humana (Kiriazis e Kranias, 2000) . Isolou-se DNA genómico de biopsias da cauda de ratinho, tendo sido analisado por PCR utilizando "primers" específicos para o sinal poli(A)+ de GH humana.

Plasmideos e ensaios de transfeção. Um fragmento genómico de 305 pb abrangendo a região codificadora do miR-208 foi amplificado por PCR e ligado em pCMV6. Um fragmento de 1 kb abrangendo a totalidade da UTR da THRAP1 murina foi 104 amplificado por PCR e ligado numa construção de expressão de pCMV6 com cauda HA e a construção de repórter de luciferase do pirilampo (f-luc) (pMIR-REPORT™, Ambion). Foi construída uma mutação da sequência de ligação de semente do miR-2 0 8 UCGUCUUA por mutagénese à base de PCR.

Exemplo 2 - Resultados O miR-208 é um regulador central da função contrátil cardíaca. MicroRNAs intrónicos são transcritos como parte do transcrito do gene hospedeiro, são removidos no processamento e processados no miRNA maduro. O miR-208 é um miRNA intrónico que está localizado no 21° intrão do gene α-MHC. FIG. 1. Tal como a α-MHC, o miR-208 é expresso somente no coração. FIG. 2. A hormona da tiroide pós-natal regula a expressão de isoenzimas de miosina ventricular por estimulação da síntese de α-MHC e inibição da expressão de β-MHC. Para examinar se o bloqueio da sinalização da hormona da tiroide também influencia a expressão do miRNA 208, os inventores utilizaram amostras cardíacas de rato, que foram expostas a propiltiouracilo (PTU) durante um período de tempo determinado. O PTU bloqueia a biossíntese de hormonas da tiroide por inibição da "organificação" de iodo - a sua incorporação em T3 e T4, e desse modo reprime a expressão de α-MHC e aumenta β-MHC. A análise de coloração "Northern" indicou uma correlação perfeita entre o nível de expressão de α-MHC e o nível de pré-miRNA, o denominado "stemloop", ao passo que o miRNA maduro permaneceu presente durante as semanas seguintes. FIGS. 3A-C e FIGS. 4A-C.

Para estudar o papel do miR-208, os inventores geraram ratinhos nulos para o miR-208. FIG. 5. Apesar disto não ter interferido na transcrição ou tradução de α-MHC, a análise 105 de microsséries em tecido cardíaco de ratinhos de tipo selvagem e KO no miR-208 de 2 meses de idade indicou que a remoção do miR-208 conduziu a indução forte de genes rápidos do músculo esquelético. FIGS. 6A-B, e FIG. 7.

Para examinar o efeito da remoção do miR-208 durante "stress" cardíaco, os inventores expuseram animais de tipo selvagem e KO no miR-208 a constrição transversal da banda aórtica (TAB). TAB é um indutor potente de hipertrofia cardíaca, e concomitante expressão genética hipertrófica. Enquanto os animais de tipo selvagem exibiram um aumento grave da expressão da β-MHC, os animais KO não exibiram esta indução. FIG. 8.

Tabela 3 - KO versus TS 3 semanas após TAB

Gene

Troponina cardíaca I, esquelética rápida Troponina cardíaca T3, esquelética rápida MLC, esquelética rápida α actina esquelética β MHC

Alteração, em número de vezes, comparado com tipo selvagem após TAB 194,OX regulado positivamente 194,0X regulado positivamente 3,7X regulado positivamente 2,8X regulado positivamente 29,8S regulado negativamente

Em conjunto, estes dados indicam que a expressão do gene a-MHC induz adicionalmente a expressão de um miRNA que regula negativamente a expressão do programa genético musculoesquelético rápido. O miR-208 está embutido no gene α-MHC, que é regulado por sinais de desenvolvimento, fisiológicos, e de desenvolvimento. O α-MHC é um determinante primário da contratilidade rápida. 0 miR-208 reprime genes musculoesqueléticos rápidos no coração, de modo que a sua deleção origina um aumento dramático da 106 expressão de genes musculoesqueléticos rápidos (FIG. 13). O miR-208 também é requerido para regular positivamente β-MHC no coração. Uma vez que microRNAs atuam como repressores, é postulado que o miR-208 reprime um repressor da expressão de β-MHC, como ilustrado na FIG. 9. Durante "stress" cardiaco, este miRNA é responsável pela indução de β-MHC, ao nivel do RNA e proteico, ao passo que esta indução está totalmente ausente na ausência do miR-208 e a a-MHC permanece como a única isoforma da cadeia pesada de miosina. A análise da expressão de α-MHC em amostras de corações humanos com falha e sem falha mostrou que a expressão de α-MHC em coração com falha estava reduzida em comparação com a expressão de α-MHC em coração sem falha (FIG. 10). Estes dados demonstram que o miR-208 é um regulador central da função contrátil cardíaca e aparenta estar envolvido na troca de miosina mal-adaptativa durante doença cardíaca.

Utilizando o "software" miRanda (disponibilizado pelo Computational Biology Center do Memorial Sloan-Kettering Câncer Center) e o algoritmo PicTar para a identificação de alvos do miRNA (Krek et al., 2005), proteína 1 associada a recetores de hormonas da tiroide (THRAP1) foi identificada como um alvo previsto para o miR-208. A FIG. 12 mostra o alinhamento do miR-208 com sequências 3' UTR da THRAP1 de humano, chimpanzé, ratinho, rato, canino, galinha, peixe fugu, e peixe-zebra. O miR-208 regula a remodelação cardíaca patológica.

Ratinhos homozigóticos para a deleção do miR-208 eram viáveis e não exibiram anormalidades óbvias na dimensão, forma ou estrutura do coração até às 20 semanas de idade. Para investigar adicionalmente as funções potenciais do 107 miR-208, os inventores compararam a resposta de ratinhos de tipo selvagem e mutantes no miR-208 a coartação aórtica torácica (TAB), que induz hipertrofia cardíaca por pós-carga aumentada no coração e é acompanhada de regulação negativa de aMHC e regulação positiva de βMHC (Hill et ai., 2000) . A expressão de mRNA de aMHC diminuiu como esperado após TAB (FIG. 14A), mas o miR-208 ainda era abundantemente expresso 21 dias após a TAB (FIG. 14B), o que é consistente com a sua semivida relativamente longa.

Em resposta à TAB, os ratinhos de tipo selvagem exibiram um aumento pronunciado da massa cardíaca acompanhado de crescimento hipertrófico de cardiomiócitos e fibrose ventricular (FIG. 15A). Em contraste, os animais mutantes no miR-208 exibiram virtualmente nenhuma hipertrofia de cardiomiócitos ou fibrose em resposta à TAB (FIG. 15A) . A ecocardiografia confirmou que os animais miR-208”/_ exibiram uma resposta hipertrófica atenuada e uma redução da contratilidade (FIG. 14C) . O mais notável foi a incapacidade dos animais mutantes para regular positivamente a βΜΗΟ. Ao invés, a expressão da proteína aMHC aumentou em corações mutantes no miR-208 em resposta à TAB, o que pode refletir um mecanismo compensador para manter a expressão da MHC na ausência da regulação positiva de PMHC. Outros genes de resposta a "stress", como os que codificam os péptidos natriuréticos ANF e BNP, foram fortemente induzidos em animais mutantes no miR-208 (FIGS. 15B-C). A análise de microsséries em corações de animais de tipo selvagem e miR-208‘/_ confirmou que a ausência do miR-208 originou um bloqueio altamente específico da expressão de βΜΗΰ (Tabelas 4-5). 108

Tabela 4 - Análise de microsséries de tecido cardíaco de animais de tipo selvagem e miR-208_/~. Em cada categoria apresentam-se os principais 20 genes que são expressos de modo diferencial em miR208_/_ em comparação com animais de tipo selvagem.

Genes com expressão elevada em animais animais KO no miR-208 relativamente a de tipo selvagem KO miR -208 Tipo sel vagem Log Vezes de alte ração Gene 349,1 8,3 6, 3 78,8 Resposta precoce ao crescimento 2 (Egr2) 7920,4 128 6,2 73, 5 Proponina de Mus musculus I, esquelético, rápido 2 (Tnni2), mRNA 731,3 9,1 5, 6 48,5 Resposta precoce ao crescimento 2 (Egr2) 6298,8 135,1 5, 5 45,3 Proteína de choque térmico, 70 kDa 1 (Hsp 70-1) 4546,4 91,9 5,3 39, 4 Proteína de choque térmico, 70 kDa 3 (Hsp 70-3) 695,3 17,6 5,2 36, 8 Troponina de Mus musculus T3, esquelético, rápido (Tnnt3), mRNA 6580,9 170,5 5,1 34,3 Proteína de choque térmico, 70 kDa 1 (Hsp 70-1) 7772,6 360,6 4,5 22,6 Proteína de choque térmico, 70 kDa 1 (Hsp 70-1) 4665,2 341,7 3,9 14,9 Resposta precoce ao crescimento de Mus musculus 1 (Egrl), mRNA 7909,7 119, 1 3, 6 12,1 Troponina I, esquelético, rápido 2 (Tnni2) 3490,1 339, 8 3,5 11,3 Subfamília de recetores nucleares de Mus musculus 4, grupo A, membro 1 (Nr4al), mRNA 9451 486,7 3,5 11,3 Cadeia leve de miosina de Mus musculus, alcali, músculo esquelético rápido (Mylf) 1206,8 171,1 3 8,0 Oncogene de osteossarcoma FBJ (Fos) 109 1277,2 219, 9 2,8 7,0 Família de transportadores de soluto 11 membro 1 (proteína de macrófagos associada a resistência natural 1) 586,2 103,4 2,7 6,5 Fator ativador da transcrição 3 695,4 110,1 CM 6,1 Parvalbumina (Pva) de Mus musculus, mRNA 2313,5 500,9 2,4 5,3 Homólogo de DnaJ (Hsp40), subfamília B, membro 1 1291,9 287,4 2,4 5,3 mRNA da proteína do gene transformador de tumor da pituitária (PTTG) de Mus musculus, cds completa 174,7 30 2,3 4, 9 Hidrolase carboxi-terminal de ubiquitina Ll, (Uchll) 170,4 32 2,2 4, 6 Osteomodulina (Omd) de Mus musculus,

mRNA

Genes com expressão diminuída em animais KO no miR-208 relativamente a animais de tipo selvagem 3 semanas após a TAB KO miR- 208 Tipo sel vagem Log Vezes de alte ração Gene CM CM 142,9 6,3 -78,8 mRNA de transcrito X-específico (Xist) inativo de localização nuclear de ratinho 82,7 4674,2 5,1 -34,3 Transcrito X (inativo)-específico, antissentido 47,4 517,5 3,5 -11,3 Citocromo P450 de Mus musculus, 2a5 (Cyp2a5), mRNA 315, 6 2607,7 3,4 o \—1 1 Gene associado a deficiência em carnitina de Mus musculus expresso no ventrículo 1 (Cdvl), mRNA 486, 9 4827,9 3,3 -9,8 Gene associado a deficiência em carnitina de Mus musculus expresso no ventrículo 1 (Cdvl), mRNA 34,9 205,2 3,3 -9,8 betaGlcNAc beta 1,3- galactosiltransferase, polipéptido 2 (b3Galt2) 8 70,5 - -9,2 Caderina 1 (cdHl) de Mus musculus, 110

3,2 mRNA 23, 8 129,3 2,9 -7,5 mRNA de beta globina de Mus musculus, cds parcial 32,4 196,2 2,8 -7,0 Cristalina de Mus musculus, beta A4 (Cryba4), mRNA 8,3 49,3 2,7 -6,5 mRNA da proteína box do grupo de alta mobilidade (sox2) de Mus musculus, cds completa 2,1 21,5 2,7 -6,5 betaGlcNAc beta 1,3-galactosiltransferase, polipéptido 2 (b3Galt2) 225, 8 1498,4 2,7 -6,5 Citocromo P450 de Mus musculus, 2f2 (Cyp2f2), mRNA 1294,9 8588,1 2,7 -6,5 mRNA de Mus musculus para a proteína de células clara de 10 kD (CC10), (Scgblal) 421,7 4127,3 2,6 -6,1 mRNA de UGRP1A de Mus musculus, cds completa, (Scgb3a2) /PR0D=UGRP1A 90,5 434,8 2,4 -5, 3 Canal ativado por voltagem de potássio, família relacionada com Shal, membro 2 (Kcnd2) 7,8 48,2 2,4 -5, 3 mRNA da proteína de ligação ao elemento de resposta ao TNF de Mus musculus, cds completa, (Smarca3) 269,3 1118,5 2,3 -4,9 Canal ativado por voltagem de potássio, família relacionada com Shal, membro 2 (Kcnd2) 22,4 61,2 2,2 -4,6 Rico em leucina, inativado em glioma I, (Lgil) 85 469, 8 2,2 -4,6 Proteína de ligação a guanina nucleótido, alfa 12, (Gnal2) 954,7 2196,7 2,1 -4,3 Proteína de choque térmico de Mus musculus de 25 kDa 2 (cardiovascular) (Hsp25-2), mRNA

Tabela 5 - Análise de mlcrossérles de tecido cardíaco de animais de tipo selvagem e miR-208_/” 3 semanas pós-TAB. Em cada categoria apresentam-se os principais 20 genes que são 111 expressos de modo diferencial em miR-208 em comparação com animais de tipo selvagem 3 semanas após cirurgia TAB.

Genes com expressão animais elevada de tipo em animais KO no miR-208 relativamente a selvagem 3 semanas após TAB KO miR -208 Tipo sel vagem Log Vezes de alte ração Gene 7259,6 38,8 7,6 194,0 Troponina de Mus musculus I, esquelético, rápido 2 (Tnni2), mRNA 2455,4 11,8 7,6 194,0 Proponina de Mus musculus T3, esquelético, rápido (Tnnt3), mRNA 249, 6 1,3 7,6 194,0 Tipo 3 de quitinase 3 (Chi313) de Mus musculus, mRNA 5624,4 49, 9 6,1 68,6 Transcrito X (inativo)-específico, antissentido (Tsix) 4267,5 62,9 4,6 24,3 Troponina I, esquelético, rápido 2 (Tnni2) 427,9 31,8 3,7 13,0 Amiloide A 3 do soro (Saa3) de Mus musculus, mRNA 607,4 59, 9 3,2 9,2 Proteína de ligação a cálcio A8 de Mus musculus S100 (calgranulina A) (S100a8), mRNA 631 68,3 3 8,0 Parvalbumina (Pva) de Mus musculus, mRNA 1023,2 195,3 2,9 7,5 Integrina alfa 9 (Itga9) de Mus musculus, mRNA 553,5 51,1 2,9 7,5 Proteína de ligação a cálcio A9 de Mus musculus S100 (calgranulina B) (S100a9), mRNA 1476 205, 1 2,8 7,0 Trombospondina 1 (Thbsl) 2697,7 415,7 2,8 7,0 Calsequestrina 1 (Casql) de Mus musculus, mRNA 1172,3 173, 1 2,7 6,5 Lisil-oxidase (Lox) de Mus musculus, mRNA 327 67,6 2,6 6,1 Cromogranina B (Chgb) de Mus musculus, mRNA 1488,6 241,7 2,5 5,7 Pró-colagénio, tipo III, alfa 1 (Col3al) 112 1729,8 308,2 C\] 5,3 Elastina (Eln) 771,2 128 2,4 5,3 Sinucleína, alfa (Snca) 914,2 185, 1 2,3 4, 9 Proteína beta de ligação do fator de transformação do crescimento latente 2 (Ltbp2) de Mus musculus, mRNA 2753,4 425,7 2,3 4, 9 Inibidor de serina protease 2 -2 (Spi2- 2) de Mus musculus, mRNA 1509,5 256, 9 2,3 4, 9 Pró-colagénio, tipo V, alfa 2 (Col5a2)

Genes com expressão diminuída em animais KO no miR-208 relativamente a animais de tipo selvagem 3 semanas após a TAB KO miR- 208 Tipo sel vagem Log Vezes de alte ração Gene 1,4 146,5 5,9 -59,7 Proteína de motivo tripartido 12 (TRIM12) 2,7 128,1 5,1 -34,3 Região de ligação de RNA (RNP1, RRM) contendo 2 (Rnpc2) 485,2 9966,2 4, 9 -29, 9 Miosina de Mus musculus, polipéptido pesado 7, músculo cardíaco, beta (Myh7), mRNA co 101 3,3 -9,8 Jumonji (jmj) de Mus musculus, mRNA 9,3 144,5 3,2 -9,2 Citoquina indutível pequena All (Scyall) de Mus musculus, mRNA 9, 9 86, 9 - -8,6 Canal ativado por voltagem de potássio 3,1

de Mus musculus, subfamília relacionada com Isk, membro 1 (Kcnel), mRNA 7,5 67,1 -8,6 3,1 Rico em (Lgil) leucina, inativado em glioma 1 128,5 974,2 co 1 1 mRNA da proteína do gene transformador 300,9 2502 252,4 2016,7 3.1 de tumor da pituitária (PTTG) de Mus musculus, cds completa -8,6 Proteína de choque térmico, 70 kDa 1 3.1 (Hsp 70-1) -8,6 Proteína de choque térmico, 70 kDa 3 (Hsp 70-3) 3,1 113 7,9 133, 4 3, 0 O 00 1 Recetor da prostaglandina F (Ptgfr) de Mus musculus, mRNA 423, 9 3375,9 3, 0 o 00 1 Transformador de tumor da pituitária 1 (Pttgl) 29,5 211,8 2,9 -7,5 Glicina C-acetiltransferase (2-amino-3-cetobutirato-coenzima A ligase) (Gcat) de Mus musculus 388 3048,8 2,9 -7,5 Proteína de choque térmico, 70 kDa 1 (Hsp 70-1) 557,2 3734,4 CO 1 C\] o 1 Gene associado a deficiência em carnitina expresso no ventrículo 1 (Cdvl) de Mus musculus, mRNA 302,6 1731,8 2,6 -6,1 Gene associado a deficiência em carnitina expresso no ventrículo 1 (Cdvl) de Mus musculus, mRNA 49,3 211,2 LO 1 C\] -5,7 Proteína regulada por androgénio do rim (Kap) 12,3 5 6,6 LO 1 C\] -5,7 mRNA de serina hidroximetiltransferase de Mus musculus, cds completa 42 224,8 2,5 -5,7 Ativação de macrófagos 2 (Mpa2) 30,3 165,1 - -5, 3 Recetor ativado por proliferadores de 2,4 peroxissoma, gama, coativador 1 (Ppargcl)

Os ratinhos miR-208-/“ também foram resistentes a fibrose e hipertrofia cardiomiocitica em resposta à expressão transgénica de calcineurina ativada (FIG. 15D), um estimulo especialmente poderoso de hipertrofia cardíaca e falha cardíaca. De modo semelhante, mRNA e proteína de βMHC não foram regulados positivamente em corações de miR-208~/_; ratinhos CnA-Tg, às 6 semanas de idade, ao passo que ANF e BNP foram fortemente induzidos (FIGS 15E-F). Assim, o miR-208 é necessário para a regulação positiva de β MHC e remodelação celular, mas não para a expressão de outros marcadores de "stress" cardíaco. 114

Para testar se o miR-208 era suficiente para a regulação positiva da expressão de βMHC, os inventores geraram ratinhos transgénicos que superexpressaram o miR-208 sob o controlo do promotor de aMHC. Os ratinhos transgénicos aMHC-miR-208 foram viáveis e expressaram o miR-208 a um nivel ~ 3 vezes acima dos corações de tipo selvagem (FIG. 14D) . Corações de uma linha transgénica, representando a superexpressão média do transgene, não exibiram sinais claros de remodelação patológica aos 2 meses de idade mas, de modo notável, exibiram uma regulação positiva dramática da expressão de β MHC (FIG. 15G e FIG. 14E) . Esta atividade do miR-208 foi especifica, pois a superexpressão transgénica do miR-214, que é induzido durante hipertrofia cardiaca, não teve nenhum efeito na expressão de βMHC. Uma vez que o nivel endógeno do miR-208 no coração de ratinho adulto é insuficiente para regular positivamente a expressão de βMHC, a descoberta de que um aumento de 3 vezes da expressão do miR-208 nestes ratinhos transgénicos resulta em regulação positiva da expressão de β MHC sugere que há um limite estreito para o controlo da expressão de βMHC por este microRNA.

O miR-208 regula a repressão de β MHC dependente de T3. A sinalização de T3 induz transcrição de aMHC via um elemento de resposta de T3 (TRE) positivo, ao passo que um TRE negativo no promotor do gene β MHC medeia a repressão da transcrição (Ojamaa et al., 2000). Para testar se o miR-208 era requerido para a regulação de β MHC dependente de T3, companheiros de ninhada mutantes e de tipo selvagem foram nutridos com ração contendo PTU durante 2 semanas, para bloquear a sinalização de T3. Pela análise de coloração "Northern" verificou-se que o miR-208 está presente de modo 115 abundante após 2 semanas de tratamento com PTU (FIG. 16A) . 0 PTU, como esperado, induziu um decréscimo do batimento cardíaco e contratilidade e um aumento da dilatação, sem diferenças notáveis entre animais de tipo selvagem e mutantes (FIG. 16B). No entanto, enquanto os animais de tipo selvagem exibiram o decréscimo esperado de a- e aumento de βMHC em resposta ao PTU, mais uma vez os animais miR-208_/“ aparentaram ser resistentes à regulação positiva de β MHC, apesar de ter sido detetável um vestígio de expressão de β MHC (FIGS. 17A-B) . 0 ANF e BNP foram regulados positivamente pelo PTU em animais miR-208‘/_, confirmando o papel específico do miR-208 na expressão de β MHC (FIG. 16C) . Uma vez que o PTU induz a troca da isoforma a- para β MHC apenas por interferência na sinalização de recetores de hormonas da tiroide (TR), estas descobertas sugerem que o miR-208 potência a expressão de β MHC através de um mecanismo que envolve o TR. O miR-208 aborda seletivamente a Proteina 1 Associada ao TR. Entre os relativamente poucos alvos previstos do miR-208, o mRNA que codifica a Proteína 1 Associada a recetores de hormonas da tiroide (THRAP1), também conhecido como TRAP240, foi pontuado como sendo o alvo mais forte previsto com o programa de previsão de alvos PicTar (Krek et al., 2 0 05) . A THRAP1, um componente do complexo TRAP associado ao TR, modula a atividade do TR por recrutamento de RNA polimerase II e fatores de iniciação gerais (Ito e Roeder, 2001). O sítio de ligação putativo do miR-208 na 3'-UTR do mRNA de THRAP1 exibiu complementaridade elevada com o braço 5' do miR-208, o determinante mais crítico da abordagem seletiva do miRNA, bem como conservação evolutiva (FIG. 18A). Com base na complementaridade imperfeita do miR-208 e 116 sequência 3' UTR de THRAPl, seria de esperar que o miR-208 inibisse a tradução de THRAP1.

Para testar se a sequência alvo putativa do miR-208 na 3 ' - UTR de THRAPl podia mediar a repressão da tradução, os inventores inseriram a 3'-UTR completa do transcrito de THRAPl num plasmídeo de expressão de luciferase, que foi transfetado em células COSI. Quantidades crescentes de miR-208 conduzido pelo CMV resultaram numa diminuição, dependente da dose, da atividade de luciferase, ao passo que quantidades comparáveis de miR-126, como controlo, não tiveram nenhum efeito (FIG. 18B) . 0 CMV-miR-208 também anulou a tradução, de modo dependente da dose, de uma cassete de expressão de malonil-CoA-descarboxilase (MCD) com cauda de HA ligada à sequência de ligação de 3'-UTR de THRAPl, mas não uma sequência alvo do miR-208 mutante (FIG. 18C) . Adicionalmente, a expressão da proteína THRAPl foi aumentada em lisatos proteicos cardíacos de ratinhos miR-208_/” em comparação com companheiros de ninhada de tipo selvagem (FIG. 18D) , ao passo que o mRNA de THRAPl foi comparável em corações dos dois genótipos (FIG. 19), o que é consistente com a conclusão de que o miR-208 atua como regulador negativo da tradução de THRAPl in vivo. Em situações de "stress", a influência negativa do miR-208 na expressão da proteína THRAPl pode ser ainda maior, à luz de estudos recentes que mostram que o "stress" aumenta ações repressivas de miRNAs ao promover a sua associação de miRNAs com Argonauta (Leung et ai., 2006). O miR-208 é requerido para a expressão do miR-499. Para explorar adicionalmente o mecanismo de ação do miR-208 no coração, os inventores definiram os padrões de expressão do microRNA em corações de ratinhos de tipo selvagem e nulos 117 para miR-208 por análise de microsséries. Entre vários microRNAs que foram regulados positiva e negativamente em corações mutantes, os inventores descobriram que o miR-499 era muito abundante em corações normais, mas não era expresso em niveis acima do fundo em mutantes no miR-208. Estas descobertas foram confirmadas por coloração "Northern" (FIG. 21). A análise da localização genómica do gene do miR-499 mostrou que estava contido no 20° intrão do gene Myh7b, um homólogo do gene alfa-Mhc (Myh7b) (FIG. 22) . O gene Myh7b está conservado em vertebrados e é expresso somente no coração e músculo esquelético lento (soleus) (FIG. 23). Adicionalmente, o miR-499 é regulado negativamente durante hipertrofia cardiaca (FIG. 24). O MEF2 regula a expressão do mlR-499 em músculo cardíaco e esquelético. Na região flanqueadora 5' do gene Myh7, os inventores identificaram uma sequência de consenso potencial do MEF2 que está conservada entre espécies. Esta sequência ligou-se ao MEF2 avidamente em ensaios de desvio da mobilidade em gel, e a mutação desta sequência aboliu a expressão de um repórter lacZ em ratinhos transgénicos. O sitio do MEF2 estava justaposto a uma sequência de caixa E conservada (CANNTG), que serve de sitio de ligação para membros da familia MyoD de proteinas bHLH que conduzem a expressão de genes no músculo esquelético com o MEF2. De fato, MyoD em conjunto com a proteína bHLH ubíqua E12 ligaram-se à caixa E do promotor. A mutação desta sequência preveniu a expressão do transgene lacZ em músculo esquelético, mas não afetou a expressão no coração. 118 ID dos Alvos. Em conjunto, os dados relatados aqui indicam que a expressão regulada pelo MEF2 do gene Myh7b induz adicionalmente a expressão de um miRNA especifico de músculo lento e coração que regula negativamente a expressão do programa genético do músculo esquelético rápido. Estes dados proporcionam evidências de que o miRNA 499 é um regulador central do tipo de fibras musculoesqueléticas. 0 miR-208 é altamente homólogo ao miR-499, e o fato notável de ambos os microRNAs serem codificados por intrões de genes Mhc sugere que partilham mecanismos reguladores comuns. Uma vez que os miRNAs influenciam negativamente a expressão genética de um modo especifico para sequências, o elevado grau de homologia predispõe o miR-208 e miR-499 a exercerem funções comparáveis, devido a sobreposição em genes alvo. Os inventores identificaram reguladores da transcrição da expressão de Mhc que aparentam servir de alvos do miR-499. Também mostraram que a expressão do miR-499 é controlada pelo miR-208 no coração, de modo que o silenciamento do miR-208 elimina a expressão do miR-499.

Uma vez que dados anteriores dos inventores demonstraram que o desmantelamento genético do miR-208 conduz a indução forte de genes do músculo esquelético especificamente rápidos no coração, é provável que o miR-499 tenha uma função comparável no músculo esquelético e possa atuar como regulador dominante do tipo de fibras. Em linha com esta hipótese, a análise de promotores deste transcrito indica que a expressão do miR-499 e seu transcrito hospedeiro é regulada pelo fator de transcrição miogénico MEF2, um regulador central da expressão de genes do tipo de fibras do músculo esquelético e de fibras lentas. Os inventores 119 mostraram que a atividade do MEF2 promove a capacidade de resistência muscular e evita a fadiga muscular após exercício prolongado. Assim, propõem que estas ações do MEF2 dependem, pelo menos em parte, da ativação direta da expressão do miR-499 (FIG. 25).

Em conjunto, estes dados indicam que a expressão regulada pelo MEF2 do gene Myh7b induz adicionalmente a expressão de um miRNA específico de músculo lento e coração que regula negativamente a expressão do programa genético do músculo esquelético rápido. Os dados proporcionam evidências de que o miRNA 4 99 atua como regulador central do tipo de fibras musculoesqueléticas. 0 fato notável de o miR-208 e -499 serem altamente homólogos e serem ambos codificados por intrões de genes Mhc sugere que partilham mecanismos reguladores comuns. Uma vez que os miRNAs influenciam negativamente a expressão genética de um modo específico para sequências, o elevado grau de homologia predispõe o miR-208 e miR-499 a exercerem funções comparáveis, devido a sobreposição em genes alvo. Os inventores identificaram reguladores da transcrição da expressão de Mhc que aparentam servir de alvos do miR-499, e também mostraram que a expressão do miR-499 é controlada pelo miR-208 no coração, de modo que o silenciamento do miR-208 elimina a expressão do miR-499.

Regulação de hipertrofia cardiaca e falha cardiaca por miRNAs que respondem a "stress". À luz do seu envolvimento na modulação de fenótipos celulares, pusemos a hipótese de que miRNAs poderão desempenhar um papel na regulação da resposta do coração a "stress" cardíaco, que se sabe resultar em alterações da transcrição e tradução na expressão genética. Para investigar o envolvimento 120 potencial de miRNAs em hipertrofia cardíaca, os inventores realizaram uma análise de microsséries de miRNA lado-a-lado em 2 modelos estabelecidos de ratinho de hipertrofia cardíaca, utilizando uma microssérie que representou 186 miRNAs diferentes (Babak et al., 2004). Os ratinhos que foram sujeitos a coartação aórtica torácica (TAB), que induz hipertrofia por pós-carga aumentada no coração (Hill et ai., 2000), foram comparados com animais operados de modo fictício. Num segundo modelo, ratinhos transgénicos que expressam a calcineurina (CnA) ativada no coração, que resulta numa forma grave e bem caracterizada de hipertrofia (Molkentin et al., 1998), foram comparados com companheiros de ninhada de tipo selvagem (FIG. 26A) . O RNA isolado de corações de ratinhos sujeitos a TAB exibiu expressão aumentada de 27 miRNAs em comparação com controlos operados de modo fictício, e ratinhos CnA Tg exibiram expressão aumentada de 33 miRNAs em comparação com controlos de companheiros de ninhada não transgénicos, dos quais 21 foram regulados positivamente em ambos os modelos. De modo semelhante, hipertrofia induzida por TAB e CnA foi acompanhada de expressão reduzida de 15 e 14 miRNAs, respetivamente, dos quais 7 miRNAs foram regulados negativamente em comum (FIG. 2 6B) . A análise "Northern" destes miRNAs (dados nossos não publicados) e análises prévias de microsséries (Barad et al., 2004; Sempere et al., 2004; Shingara et al., 2005; Liu et al., 2004) indicam que são expressos numa gama larga de tecidos. Com base nos seus níveis de expressão relativos, conservação de sequências humanas, de rato e ratinho, e níveis de expressão durante hipertrofia, os inventores centraram-se em 11 miRNAs regulados positivamente e 5 regulados negativamente (FIG. 26C). 121 A análise de coloração "Northern" de RNA cardíaco de animais TS e CnA Tg confirmou uma expressão aumentada de miRs -21, -23, -24, -125b, -195, -199a, e -214, e expressão decrescida de miRs -29c, -93, -150 e -181b (FIG. 26C e FIG. 27) . Coletivamente, estes dados indicam que miRNAs distintos são regulados durante hipertrofia cardíaca, sugerindo a possibilidade de poderem funcionar como moduladores deste processo. A família miR-29 como alvos a jusante de regulação pelo miR-208. Os inventores realizaram uma microssérie de miRNA em corações de ratinhos de tipo selvagem e nulos para miR-208 num esforço para identificar miRNAs a jusante que possam mediar as ações do miR-208 (FIG. 28) . Descobriram que múltiplos membros da família miR-29 foram regulados positivamente em ratinhos nulos para o miR-208 (FIG. 29). A previsão de alvos indicou que membros da família miR-29 abordaram seletivamente mRNAs que codificam múltiplos colagénios e outros componentes da matriz extracelular (FIG. 30) . Assim, é provável que a regulação positiva de membros da família miR-29 em ratinhos nulos para o miR-208 seja responsável pelo bloqueio de fibrose observado nestes animais (FIG. 31).

Resumo. A descoberta de que o miR-2 9 é regulado negativamente no coração doente e aborda seletivamente mRNAs que codificam colagénios e proteínas da matriz extracelular sugere ser provável que estratégias para aumentar a expressão do miR-29 ou a sua associação a mRNAs alvo tenham efeitos benéficos no coração nos cenários de remodelação cardíaca patológica e fibrose. Além disso, é provável que o aumento da expressão ou função do miR-29 122 previna fibrose associada a muitas doenças em tecidos como o figado, pulmão, rim e outros. Adicionalmente, a descoberta de que o miR-208 reprime a expressão do miR-29, e que a perda de miR-208 regula positivamente a expressão do miR-29, indicam que o miR-29 é um mediador a jusante das ações do miR-208 no coração.

Exemplo 3 - Discussão

Estes resultados demonstram que o miR-208, que é codificado por um intrão do gene aMHC, regula o crescimento e expressão genética de cardiomiociticos dependentes de "stress". Na ausência do miR-208, a expressão de βMHC é grandemente atenuada no coração adulto em resposta a sobrecarga de pressão, calcineurina ativada, ou hipotiroidismo, sugerindo que as vias através das quais estes estímulos induzem transcrição de β MHC partilham um componente comum sensível ao miR-208 (FIG. 9) . Em contraste, a expressão de β MHC permaneceu inalterada nos corações de ratinhos recém-nascidos miR-208_/”, demonstrando que o miR-208 participa especificamente no mecanismo de regulação da expressão de β MHC dependente de "stress".

Uma chave para o mecanismo de ação do miR-208 provém da semelhança de corações miR-208_/“ com corações sujeitos a hipertiroidismo, ambos os quais exibem um bloqueio da expressão de βΜΗΟ, regulação positiva de genes de resposta a "stress" (Wei et al. , 2005; Pantos et al. , 2006), e proteção contra hipertrofia patológica e fibrose (Yao e Eghbali, 1992; Chen et al., 2000). A regulação positiva de genes musculoesqueléticos rápidos em corações miR-208_/~ também imita a indução de fibras musculoesqueléticas rápidas no estado de hipertiroidismo (Vadaszova et al., 2004) . A sinalização de T3 reprime a expressão de β MHC no 123 coração pós-natal, e PTU, que causa hipotiroidismo, induz βMHC (Morkin, 2000; Schuyler e Yarbrough, 1990) . A incapacidade do PTU para induzir expressão de β MHC em corações miR-208_/“ implica adicionalmente o miR-208 na via de sinalização de T3.

Estes resultados sugerem que o miR-208 atua, pelo menos em parte, por repressão da expressão do corregulador de TR THRAP1, que pode exercer efeitos positivos e negativos na transcrição (Pavri et al. , 2005; Park et al. , 2005). O TR atua através de um TRE negativo para reprimir a expressão de β MHC no coração adulto (Morkin, 2000) . Assim, seria de prever que o aumento da expressão de THRAP1 na ausência do miR-208 aumentasse a atividade repressiva do TR para a expressão de β MHC, o que é consistente com o bloqueio da expressão de β MHC em corações miR-208_/“. Em contraste, a regulação da expressão de a- e β MHC durante o desenvolvimento é independente da sinalização de T3 (Morkin, 2000) e não é afetada pelo miR-208. É notável que outros genes alvo de TR, como fosfolambano (PLB) e cálcio-ATPase do retículo sarco(endo) plasmático (SERCA) 2a e transportador de glucose (GLUT) 4, foram expressos normalmente em ratinhos miR-208_/~ (FIG. 20) . Foi proposto que o gene β MHC pode responder a isoformas especificas de TR (Kinugawa et al., 2001; Mansen et al., 2001; Kinugawa et al. , 2001). Talvez a THRAP1 atue em isoformas especificas de TR ou seletivamente num subconjunto de genes dependentes de TR via interações com fatores específicos para promotores. Uma vez que os miRNAs atuam geralmente através de múltiplos alvos a jusante para exercerem os seus efeitos, também é provável que alvos adicionais contribuam para os efeitos do miR-208 no crescimento e expressão genética cardíacos. 124

Aumentos relativamente pequenos na composição de βΜΗΟ, como os que ocorrem durante hipertrofia cardíaca e falha cardíaca, podem reduzir a atividade de ATPase miofibrilar e função sistólica (Abraham et ai., 2002). Assim, a manipulação terapêutica da expressão do miR-208 ou interação com os seus alvos de mRNA pode aumentar potencialmente a função cardíaca por supressão da expressão de βΜΗΟ. Com base na profunda influência do miR-208 na resposta a "stress" cardíaco, e a regulação de numerosos miRNAs no coração doente (van Rooij et al., 2006), os inventores antecipam que miRNAs demonstrarão ser reguladores chave das funções e respostas a doença do coração adulto, e possivelmente outros órgãos.

Todas as composições e métodos divulgados e reivindicados aqui podem ser preparados e executados sem experimentação desnecessária à luz da presente divulgação. Mais especificamente, será claro que certos agentes que são química e fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes descritos aqui, sendo obtidos resultados iguais ou semelhantes. XI. Referências São referidos os seguintes documentos.

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Lisboa, 6 de Novembro de 2012

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Inibidor do miR-208 para utilização num método de prevenção ou tratamento de hipertrofia cardíaca patológica, falha cardíaca, ou enfarte do miocárdio, em que o inibidor do miR-208 é um oligonucleótido antissentido possuindo uma sequência que é complementar a uma sequência do miR-208.

2. Inibidor para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é um oligonucleótido curto de filamentação simples quimicamente manipulado complementar ao miR-208 que bloqueia a função do miR-208.

3. Inibidor para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleótido antissentido tem uma sequência complementar à SEQ ID NO: 5.

4. Inibidor para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonucleótido antissentido contém pelo menos um nucleótido 2'-O-metil-modifiçado.

5. Inibidor para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é administrado a um sujeito necessitado por administração intravenosa, oral, transdérmica, de libertação prolongada, de libertação controlada, de libertação retardada, por supositório, subcutânea, intraperitoneal, ou sublingual ou injeção direta em tecido cardíaco.

6. Inibidor para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é administrado a um sujeito 2 necessitado em combinação com uma segunda terapia cardíaca.

7. Inibidor para utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a referida segunda terapia é selecionada do grupo que consiste num bloqueador beta, um ionotropo, um diurético, ACE-I, antagonista de AII, BNP, um bloqueador de Ca++, um antagonista de recetores da endotelina, e um inibidor de HDAC.

8. Inibidor para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a administração do inibidor melhora um ou mais sintomas de hipertrofia cardíaca patológica, falha cardíaca, ou enfarte do miocárdio num sujeito, em que os referidos um ou mais sintomas melhorados são selecionados do grupo que consiste em capacidade de exercício aumentada, volume de ejeção cardíaca aumentado, pressão diastólica final ventricular esquerda diminuída, pressão de oclusão capilar pulmonar diminuída, débito cardíaco, ou índice cardíaco, aumentado, pressões arteriais pulmonares diminuídas, dimensões sistólica e diastólica finais do ventrículo esquerdo diminuídas, esforço diminuído das paredes ventriculares esquerda e direita, tensão diminuída das paredes, melhor qualidade de vida, e menor morbidez ou mortalidade relacionada com a doença.

9. Utilização de um inibidor do miR-208 para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a utilização num método de prevenção ou tratamento de hipertrofia cardíaca patológica, falha cardíaca, ou enfarte do miocárdio, em que o inibidor do miR-208 é um 3 3 sequência oligonucleótido antissentido possuindo uma que é complementar a uma sequência do miR-208 Lisboa, 6 de Novembro de 2012