PT2059525E - Partículas split-core para a apresentação de moléculas estranhas, principalmente para utilização em vacinas e processos para a sua produção - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "PARTÍCULAS SPLIT—CORE PARA A APRESENTAÇÃO DE MOLÉCULAS ESTRANHAS, PRINCIPALMENTE PARA UTILIZAÇÃO EM VACINAS E PROCESSOS PARA A SUA PRODUÇÃO"

Descrição A matéria da presente invenção são novas substâncias transportadoras de vacinas, mas também de outras moléculas, com base no antigeno do núcleo do vírus da hepatite B. Dentro do antigeno do núcleo do vírus da hepatite são introduzidas sequências estranhas de aminoácido que podem advir de agente patogénicos. Contra estas sequências protéicas formam-se anticorpos através da inserção da vacina, sendo que os anticorpos protectores ou neutralizantes são preferenciais. Através das partículas segundo a invenção, a reacção da imunidade celular (células T) pode ser também estimulada. A proteína do core da hepatite B caracteriza-se através do facto de várias cópias poderem se aglutinar, formando partículas chamadas de semelhantes a capsídeos. Estas partículas semelhantes a capsídeos (CLP) são especialmente adequadas na produção de vacinas, uma vez que estimulam o sistema imunológico e levam assim a uma produção elevada de anticorpos. A expressão "vacina" deve ser entendida no presente pedido de patente como um sistema de transporte que pode provocar reacções imunológicas tanto humorais quanto celulares.

Capsídeos dos vírus da hepatite B são nanopartícuias icosaédricas simétricas (diâmetro de ca. de 30 nm) que consistem em 180 ou 240 cópias da proteína do core virai. A proteína do core é denominada de HBcAg. Elas podem servir de transportadores particulares de moléculas estranhas; a aplicação preferencial é a de transportador de antigeno estimulador da imunidade para vacinas. Através da modificação adequada da proteína do core, as moléculas 2 estranhas podem apresentar-se à superfície (se necessário também no interior) das partículas. Para a exposição na superfície, é ideal o acoplamento da molécula estranha com resíduos de AS localizados no centro da sequência da proteína do core (área dos AS ca. entre 73-94), os quais possuem o epítopo da célula B imuno-dominante "c/el" e que são expostos mais nitidamente na estrutura em 3D na superfície da partícula (AS significa amino-ácido). WO 01/77158 descreve proteínas de fusão de antigenos do core da hepatite B, sendo que epítopos heterólogos são utilizados preferencialmente na área entre as posições 61 e 90. US 2003/0198649 descreve uma partícula de antígeno do core do vírus da hepatite B, na qual os genes da imunidade estão ligados à proteína do core do vírus da hepatite B (HBV) através de estruturas de ligação. Kratz e outros [PNAS (1999), 1915-1920] descrevem a apresentação da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) na superfície da proteína do core do HBV. Aqui foram substituídos os amino-ácidos 79 e 80 da proteína do core através da sequência longa de 238 amino-ácidos da proteína GFP.

Nassal et al [Eur. J. Immunol. (2005), p. 655-665] descrevem um produto da fusão da proteína completa OspA da Borrelia burgdorferi e da proteína capsídea do vírus da hepatite B. Também aqui foram substituídos os amino-ácidos 79 e 80 através dos amino-ácidos 18 a 273 OspA, sendo que, entretanto, foram construídas sequências linker entre a proteína do core e OspA. Skamel et al (Journal of Biological Chemistry, 2006, pág. 17474-17481) descrevem a apresentação da proteína inteira OspC da Borrelia burgdorferi com auxílio de partículas semelhantes a capsideos do vírus da hepatite B. Nas soluções conhecidas do estado da técnica concluiu-se que as proteínas do core modificadas serviam apanas paraformação de partículas semelhantes a capsideos do modo pretendido (CLPs) e que, portanto, a reacção de imunidade não era mais estimulada de 3 forma satisfatória.

Em inserções genéticas de moléculas estranhas à base de peptideos e proteínas na proteína do core, isto significa que a sequência estranha pode estar ligada à proteína do core tanto através de seu término C como através de seu término N. Constatou-se, portanto, que a ligação mútua limita drasticamente o tipo e a variedade de sequências estranhas adequadas. 0 sistema "split-core" (core dividido) aqui descrito elimina essas limitações, ao passo em que a proteína do core é produzida em duas partes separadas que se aglutinam surpreendentemente de forma espontânea e formam partículas capsídeas comparáveis à cadeia contínua de proteínas.

Moléculas estranhas podem-se fundir com o fragmento terminal N ("N-core") ou com o fragmento terminal C ("C-core") e estão ligadas assim somente por um único terminal com a proteína transportadora. As limitações estruturais da ligação mútua durante a inserção de sequências estranhas na cadeia contínua de peptideos da proteína do core desaparecem portanto quase de todo. 0 sistema split-core segundo a invenção permite portanto: (i) a apresentação de partículas estranhas que, em virtude de seu tamanho e/ou estrutura do contexto contínuo convencional, não podem ser apresentadas ou apenas podem ser apresentadas com grande dificuldade; (ii) a apresentação de proteínas estranhas heterodímeras; (iii) a apresentação de moléculas estranhas capazes de interagir de uma forma flexível e de fácil acesso, facilitando essencialmente a interacção com moléculas parceiras pretendidas; (iv) a apresentação de moléculas estranhas adicionais através dos términos N e C expostos na superfície e presentes no sistema split-core, porém não no sistema do core contínuo tradicional. 4 Vírus da hepatite B (HBVs) são vírus cobertos. 0 capsídeo do core interno é denominado também "núcleo" ("core"); serologicamente, ele é definido como antígeno do core da hepatite B (HbcAg). Núcleos (cores) consistem em 180 ou 240 cópias da proteína do core de 183-185 amino-ácidos de comprimento (dependendo do subtipo do HBV). A proteína do core pode ser expressa heterologicamente (em bactérias, leveduras, células eucarióticas); aqui se formam espontaneamente "partículas semelhantes a capsídeos" ("capsid-like particles" = CLPs) . Uma vez que elas não contêm nem o genoma do vírus nem sua capa externa, elas não são infecciosas. Tais CLPs podem ser extraídas igualmente dos HBVs mais próximos dos mamíferos (por ex. da marmota = woodchuck; do esquilo = grounds squirrel; e de outros), assim como daqueles HBVs mais distantes das aves (por ex. do pato = duck; da garça = heron; e de outros) . Por principio podem ser utilizadas todas as sequências do HBV. Preferenciais, contudo, são as sequências de HBVs capazes de infectar também os seres humanos. A sequência de aminoácidos ou sequência nucleotídea da proteína do core do HBV é conhecida [Galibert et al, Nature (1979), pág. 646-650; Nassal, Gene (1988), páginas 279-294 ou WO 01/77158]. Faz-se referência aqui a essas publicações. Preferencial é a utilização da sequência da proteína do core do subtipo "ayw". Podem, contudo, ser aplicadas também as variações, as modificações da sequência do HBV, como a sequência de HBVs de outros mamíferos ou dos HBVs das aves. As sequências estão arquivadas nos bancos de dados públicos.

Ao lado do vírus da hepatite B humanopatogênico (HBV strictu sensu) há também uma série de vírus da hepatite B próximos, específicos de animais, por ex. o HBV da marmota norte-americana (em inglês: wood-chuck; zool. Marmota monax; woodchuck hepatitis B virus = WHV), o HBV do esquilo da Califórnia (em inglês: Califórnia ground squirrel; zool. 5

Spermophilus beecheyi; ground squirrel hepatitis B virus = GSHV), assim como de outros animais.

Estes virus possuem uma estrutura genética parecida com a do HBV humano, apresentando, porém, diferenças distintas na sequência nucleotidea e, com isto, de aminoácidos de suas proteínas. A utilização do core do HBV humano como transportador da vacina está submetido a duas limitações possíveis: 1. Pessoas com uma infecção crónica com HBV toleram apenas parcialmente antígenos do HBV (esta reacção imunológica inexistente é co-responsável pela persistência da infecção). 0 core age também como antígeno dependente da célula T. Epítopos da célula T na sequência da proteína do core participam, portanto, da forte imunogenidade de vacinas à base de proteínas do core CLP do HBV. Em pacientes crónicos do HBV, isto provavelmente não surtiria efeito, em virtude da tolerância de sua célula T contra o core do HBV. Tal tolerância não persiste, contudo, contra o core do WHV e de outros HBVs de animais (cp. Billaud JN et al, Advantages to the use of rodent hepadnavirus core proteins as vaccine platforms. Vaccine. 2007 Feb 19;25(9):1593-606). Para este círculo específico de vacinas potenciais, a utilização de uma proteína nucleica de um HBV animal como transportador pode ser vantajoso. 2. Em virtude de sua imunogenidade extraordinariamente forte, o core gera em todos os pacientes de HBV, agudos ou crónicos, uma reacção celular B fortemente anti-core (anti-HBcAg); infecções curadas caracterizam-se assim, adicionalmente, pelo surgimento de anticorpos contra as proteínas da cobertura do HBV (anti-HBsAg). Vacinas profilácticas actuais contra a infecção com o HBV baseiam-se exclusivamente na proteína de cobertura do HBV (HBsAg). A vacinação sucedida cria portanto - assim como a infecção derrotada - o surgimento de anti-HBsAg. Em alguns casos, é de interesse diagnóstico saber se uma pessoa munida de 6 anti-HBsAg os adquiriu através da infecção ou através da vacina de HbsAg - isto pode ser decidido através da prova da existência de anti-HBcAg que surge apenas após uma infecção.

Uma vacina à base do core do HBV humano cria, além da reacção pretendida contra a proteína estranha inserida, também uma certa reacção anti-core (anti-HBcAg). Isto dificulta, no caso da presença concomitante de anti-HbsAg, discernir uma infecção com o HBV de uma vacinação com HBsAg.

No sistema split-core, o surgimento de anti-HBcAg já está minimizado, uma vez que o epítopo principal, chamado de "c/el", apresenta-se separado fisicamente, não sendo mais detectável entre a maioria de anticorpos anti-HBcAg. Uma reacção residual anti-HBcAg contra outras áreas sequenciais da proteína do core mostra-se, contudo, presente. Isto pode ser reduzido ou impedido através do emprego de uma proteína do core de um HBV não-humano, preferencialmente da proteína do core do WHV como base transportadora. 0 componente essencial do sistema split-core de acordo com a invenção é, por um lado, a proteína do core de um vírus da hepatite B e, por outro lado, a molécula estranha, contra a qual deve ser provocada uma reação imunológica. A proteína do core é extraída da forma mais ampla de consistência a partir de qualquer vírus da hepatite B. São conhecidos diversos vírus da hepatite B. Preferenciais são, segundo a invenção, a sequências que foram extraídas de vírus da hepatite B isoladas de mamíferos e que são específicas destes. De maior preferência aplica-se o HBV humano. Além deste, podem também aqueles vírus da hepatite B criar a sequência da proteína do core, oriundos de outros animais, por exemplo de aves, como patos ou garças. A outra componente, ou seja, a molécula estranha, contra a qual se espera uma reacção imunológica, pode ser, 7 por princípio, qualquer molécula. Preferencialmente, trata-se aqui de sequências protéicas e, de maior preferência, daquelas sequências protéicas que podem ser achadas nas superfícies de agente patogénicos e que podem entrar em contacto com o sistema imunológico. Quando o sistema imunológico pode formar anticorpos contra tais estruturas superficiais de agente patogénicos, os agente patogénicos são desactivados após o contacto com as componentes individuais do sistema imunológico do paciente vacinado, sendo que o agente patogénico intruso é destruído via de regra.

Quando as sequências do vírus da hepatite B da marmota (woodchuck Hepatitis B-Virus = WHV), disponíveis em bancos de dados, são comparadas com aquelas da proteína do core do aminoácido do HBV (subtipo "ayw"), constata-se a existência de uma identidade de cerca de 60 %. As diferenças sequenciais são especialmente nítidas na área entre as posições de aminoácidos 66 e 94, sendo que esta sequência contém o epítopo "c/el" e a posição divisória no sistema split-core do HBV entre a área terminal N e a área terminal C da proteína do core. Esta posição divisória encontra-se, de forma especialmente preferencial, entre os amino-ácidos 79 e 81.

Para a produção dos sistemas transportadores WHVsplit-core segundo a invenção, a sequência da proteína do core do WHV foi cindida ao nível do ácido nucleico entre a posição 79 (codificada para o aminoácido Glu) e a posição 80 (codificada para o aminoácido glutamina). No nível nucleotídeo foi introduzida uma interface BamHI codificadora de sequência junto aa zona terminal carboxi do terminal N do segmento da proteína do core (brevemente designada de WN nucleico). A esta juntou-se mais uma conexão de ribossomos, assim como uma interface para a endonuclease de restrição Ndel, a qual, entretanto, se confunde com o código de início do segmento do WHV co-reC (WC nucleico) . Este posicionamento é idêntico ao posicionamento preferencial nas construções split-core correspondentes do HBV. Assim podem ser transferidas as inserções directamente com auxilio de uma digestão BamHI-Ndel de um para o outro sistema. No caso especificamente descrito aqui, o WN nucleico possui uma intercessão conservadora através da interface de BamHI introduzida, especificamente E79D, e adicionalmente um P como aminoácido terminal C. Isto não é nocivo para a capacidade de formação de partículas e o terminal C Prolina eleva, em virtude de sua resistência à protease, a estabilidade da proteína divisora. De forma análoga, no sistema HBV split-core, Wco-reC contém uma mationina inicial adicional, neste caso antes de Q80, no HBV antes de 381. Esta construcção WHV-split-core forma partículas tão bem quanto a construção HBV- split-core correspondente.

Numa outra forma de emprego da presente invenção, as áreas terminais de C e N da proteína do core podem advir de vírus distintos da hepatite B. 0 sistema transportador, híbrido, split-core da presente invenção apresenta neste caso, essencialmente, três componentes, a área terminal N da proteína do core de um vírus da hepatite B, por exemplo, um vírus da hepatite B humana, a molécula estranha, contra a qual pode ser criada uma reacção imunológica e o terminal C da proteína do core, oriundo de outro vírus da hepatite B, por exemplo, do vírus da marmota WHV. Também de tal construção de um sistema híbrido, split-core foram formadas partículas sem problema. Uma vez que as sequências de amino-ácidos da proteína do core de vírus distintos da hepatite B diferem umas das outras, os epítopos das células B e T diferem também. Assim, a reacção imunológica contra o transportador particular pode ser influenciada objectivamente através do sistema híbrido split-core.

Para a produção de sistemas transportadores híbridos split-core foi separada a sequência da proteína do core do 9 WHV entre a posição 79 (codificada para o aminoácido Glu) e a posição 80 (codificada para o aminoácido glutamina) no nivel do ácido nucleico. No nível nucleotídeo foi introduzida uma interface BamHI codificadora de sequência junto aa zona terminal carboxi do terminal N do segmento da proteína do core (brevemente designada de WN nucleico). A esta juntou-se mais uma conexão de ribossomos, assim como uma interface para endonuclease de restrição Ndel, a qual, entretanto, se confunde com o código de inicio do segmento do WHV co-reC (WC nucleico). Este posicionamento é idêntico ao posicionamento preferencial nas construções HBV split-core. Assim podem ser transferidas as inserções directamente com auxílio de uma digestão BamHI-Ndel de um para o outro sistema. No caso especificamente descrito aqui, o WN nucleico possui uma intercessão conservadora através da interface de BamHI introduzida, especificamente E79D, e adicionalmente um P como aminoácido terminal C. Isto não é nocivo para a capacidade de formação de partículas e o terminal C Prolina eleva, em virtude de sua resistência à protease, a estabilidade da proteína divisora. Analogicamente, no sistema HBV split-core, Wco-reC possui uma metionina adicional inicial, neste caso antes de Q80, em HBV antes de S81. Nesta construção, partículas podem ser formadas sem qualquer problema. HBcAg natural, assim como HBV CLPs recombinantes são altamente imunógenas (independentes das células T e do antígeno dependente da célula T) . Essencial, para tanto, é a estrutura simétrica, multimera, particular da partícula do core. Esta pode ser apresentada em microscopia electrónica convencional "negative stain" e também em microscopia electrónica crio-eletrónica. Bioquimicamente a natureza particular pode ser comprovada através de sedimentação em gradientes de sacarose (co-eficiente de sedimentação de 6 0 a 80 S segundo cada variante; por comparação: proteínas monómeras solúveis de ca. 1-5 S; 10 subunidades ribossomais eucarióticas 40S+ 60S). Além disto, as partículas apresentam um comportamento em execução distinto durante a electroforese nativa em gel de agarose, diferente das formas não particulares. Através disto constata-se, se a proteína CLP pode se formar ou se as proteínas formadas não possuem a estrutura CLP. A proteína do core CLP do HBV apresenta 183 ou 185 amino-ácidos (a do WHV 187 amino-ácidos) e consiste em dois domínios: os primeiros ca.140 amino-ácidos são necessários e suficientes para o acoplamento às CLPs ("domínio Assembly"); a região de terminais C é rica em amino-ácidos básicos e liga ácidos nucleicos. Uma variação da proteína do core terminal C (AS1-149) foi bem melhor extraída essencialmente dos sistemas de expressão originais E. coli do que a proteína de comprimento completo. CLPs de proteína do core 1-149, ou seja, sem o domínio de ligação com o ácido nucleico, foram utilizadas em análises de estruturas EM. Assim, a estrutura cristalina das CLPs e da proteína puderam ser definidas. Como previsto bioquimicamente, a proteína do core forma dímeros bastante estáveis, simétricos, que se juntam em CLPs de 90 ou 120 dímeros.

As partículas do core possuem pontas ("spikes") notáveis; cada dímero forma uma ponta ("spike") que consiste estruturalmente em um feixe de 4-Helix, para o qual cada monómero contribui com 2 a-Helices longas, posicionadas no centro da sequência de amino-ácido. As extremidades das pontas abrangem os amino-ácidos (AS) na região de amino-ácidos de 74-85. Esta região carrega igualmente o epítopo da célula B imuno-dominante do HBcAg (epítopo c/el). Sua imunogenidade especialmente elevada se explica através da exposição superficial destes resíduos. A figura 1 apresenta a estrutura da proteína do core de forma esquemática. No lado esquerdo da figura 1, apresenta-se a sequência primária da proteína do core do HBV. A proteína inteira consiste em 183 AS (em alguns 11 subtipos de HBV em 185 AS); somente os terminais N de ca. 140 AS são exigidos para a formação de CLP (domínios Assembly); uma posição preferencial do AS no terminal C é a 149; nesta e na próxima AS, até a AS 183, pode-se obter uma fusão "His-tag" sem perturbar a CLP. O epítopo "c/el" encontra-se na área das AS 78 - 83 e forma uma parte do loops entre as α-Helices centrais (abaixo à esquerda). As Hélices propriamente ditas podem ser reduzidas; minimamente necessários são provavelmente os resíduos AS em N nucleico até a posição Gly73, em C nucleico os resíduos a partir de AS Gly94. O lado direito da figura 1 apresenta uma visão esquemática de um dímero da proteína do core. Somente ambas as hélices centrais por monómero são apresentadas. 0 epítopo "c/el" encontra-se numa superfície da partícula.

Para uma formação sucedida da partícula, a sequência do core AS precisa conter pelo menos a posição 140, preferencialmente pelo menos a posição 149, mas pode igualmente se prolongar até AS 183 ou 185 do terminal C, dependendo de cada subtipo do HBV. A sequência AS a jusante da posição 140, melhor 149, pode ser substituída por sequências estranhas. Estas sequências estranhas encontram-se então, normalmente, no interior das CLPs. Contra tais amino-ácidos estranhos não são formados anticorpos logo de início, mas elas podem exercer outras funções.

Em virtude da imunogenidade extraordinariamente elevada do HBcAg, as CLPs do HBV recombinantes são atraentes para a utilização como transportadoras ("carrier") de antigenos estranhos que elevam a imunogenidade. como a mais

Uma solução alternativa é o acoplamento químico de moléculas estranhas às CLPs pré-formadas. Na presente invenção ocorre uma fusão genética de sequências estranhas AS à proteína do core. Aqui mostrou ser a região do epítopo c/el, antes do esclarecimento da estrutura cristalográfica de raio-X, segundo tentativas empíricas, 12 adequada para a indução de reacções de células B potentes. Em virtude da estrutura tornou-se óbvio hoje que tais fusões representam inserções no laço ("loop") entre as Hélices centrais. Uma vez que este loop por si só não possui uma função provedora de estrutura, a estrutura em 3D da proteína do core pode ser conservada na inserção de sequências estranhas, ao menos, basicamente. Dependendo da sequência estranha inserida, algumas proteínas de fusão desta natureza podem formar CLPs regulares, porém, isto não é sempre garantido, pois a sequência de aminoácido estranho pode avariar negativamente a forma da estrutura da proteína de fusão. A estrutura particular, por sua vez, é essencial para uma imunogenidade elevada. Já foram inseridas várias sequências estranhas à proteína do core, parcialmente também já foi comprovada, experimentalmente, a imunogenidade elevada [Ulrich et al, Adv. Virus Res. (1998), pág. 141-182]. Uma vez que muitas tentativas de inserção de sequências estranhas mais longas com mais de ca. de 40 AS, entretanto, fracassaram (sem nenhuma formação de partículas), presumiu-se que haveria um limite natural de aceitação de sequências estranhas de até 40 AS ou, num caso especial, de até 120 AS.

Constatou-se que sequências estranhas de amino-ácido, que fundiram num terminal C e N com a proteína do core, só formam partículas, quando pelo menos dois critérios essenciais foram cumpridos: (i) a estrutura 3D da proteína estranha deve ser de tal forma, que seus términos N e C se adaptem à posição física dos pontos de acoplamento n proteína do core (término C da parte do core da zona terminal N, ou seja AS nucleico de ca. 1- até 78 [N nucleico]; término N da zona terminal C da parte do core, ou seja AS nucleico de ca. 80 até 149 ou 183 [C nucleico]); (ii) se a proteína estranha incorrer por ela mesma em interacções homómeras (dímeros, trímeros, etc.), a 13 estrutura destes homo-oligómeros também tem que se adaptar à estrutura de ambas as partes da proteína do core.

Bastante adequadas para a apresentação em proteínas de fusão já antes conhecidas são portanto as proteínas estranhas, cujos termos N e C se acham próximos uns dos outros na estrutura nativa em 3D. GFP preenche ambos destes pré-requisitos, porém muitas outras proteínas não o fazem; um exemplo disto é a proteína outer surface protein A (OspA) do agente patogénico da Lyme-borreliose Borrelia burgdorferi, cujos termos N e C se encontram de lados opostos da estrutura longe línea em 3D. A inserção da OspA ou de proteínas similarmente inadequadas em suas estruturas traz conflitos na proteína de fusão. Ou a proteína estranha permanece correctamente convoluta e impede a aproximação de ambas as partes da proteína do core, de modo que a sua convolução, dimerização posterior e formação de partículas são impedidas; ou a convolução da parte da proteína do core prejudica a convolução da proteína estranha, de modo que esta não se mostra mais como nativa (> antigenidade modificada) , ou -caso mal convoluta, de forma massiva - acarretando agregação.

No caso da OspA este problema pode ser evitado apenas parcialmente através da utilização de sequências de ligação bastante longas ("Linker"). Especialmente na utilização de vacinas, as sequências Linker representam um problema potencial, uma vez que estas podem possuir uma antigenidade própria indesejada, que pode acarretar em reacções cruzadas nocivas, por ex. com os antígenos do próprio corpo. Além disto, preparações proteicas correspondentes são apenas capazes de formar CLPs regulares em escala muito reduzida.

Em virtude da estrutura dímera do transportador de proteína do core e da superfície geometricamente reduzida das partículas transportadoras, pode um impedimento estérico geral adicional representar um problema em 14 proteínas estranhas que diferem muito de uma estrutura globular grande (o espaço disponível na "superfície esférica" das CLPs é limitado). 0 tamanho máximo da proteína estranha depende de vários factores. Através do processo segundo a invenção já se obteve a apresentação de uma proteína estranha, abrangendo ca. de 320 AS (CSP). A matéria da presente invenção é, portanto, uma vacina split-core que apresenta, enquanto polipeptídeo, o domínio C-core e o domínio N-core da proteína do core de um vírus da hepatite B e ao menos uma sequência estranha de amino-ácidos, contra a qual uma reacção de imunidade humoral ou eventualmente celular deve ser provocada, sendo que a sequência estranha de amino-ácidos está fundida aa zona terminal C do domínio N-core ou ao domínio C-core da zona terminal N e a proteína do core é capaz de ligar partículas semelhantes a capsídeos. Preferencialmente são criados anticorpos neutralizantes através do sistema transportador.

Essencial na vacina split-core de acordo com a invenção é o facto de que a proteína do core no epítopo "c/el", ou seja, por exemplo, entre os amino-ácidos 73 e 94, seja interrompida, ou seja, separada. A sequência estranha de aminoácido só se pode fundir ao fim da zona terminal C da área do core N. Neste caso, o fim da zona terminal N da parte C do core começa com aquele aminoácido, do qual a proteína N do core foi separada. É possível também que uma parte do epítopo "c/el" tenha sido deletadas, ou seja, que um ou mais amino-ácidos da área entre o aminoácido 73 e 94 tenham sido retirados. Como alternativa é possível que a sequência estranha de amino-ácidos, contra a qual devem se formar anticorpos, esteja fundida ao fim do terminal N da área do core C. Neste caso, a área terminal C do núcleo N acaba com o amino-ácido, do qual a proteína do core foi separada. Um efeito essencial que a vacina split-core deve manter é o de que as partículas split-core, que carregam sequências estranhas 15 fundidas de amino-ácido, possam formar mesmo assim particulas semelhantes a capsideos nucleicos. Isto pode ser conferido ou nos gradientes de sacarose ou na eletroforese nativa de gel de agarose. Também é possivel a supervisão com auxilio de um microscópio eletrónico.

Na sequência estranha de amino-ácido, contra a qual devem se formar anticorpos, trata-se preferencialmente de sequências oriundas de estruturas superficiais de micro-organismos. Tais micro-organismos provocam via de regra doenças humanas. Se anticorpos neutralizantes podem se formar contra estas estruturas, isto provoca o que a defesa imunológica pode eliminar micro-organismos invasores muito rapidamente. Uma bactéria, na qual o desenvolvimento da vacina já está bastante avançado, é a Borrelia burgdorferi, o agente patogénico da doença de Lyme. Preferencialmente são utilizadas no âmbito da invenção enquanto sequências estranhas de aminoácido as proteínas superficiais OspA e OspC da Borrolia burgdorferi. Estas sequências estranhas de aminoácido podem ser também outras sequências, oriundas de organismos patogénicos. Um exemplo disto é o agente patogénico da malária Plasmodium falciparum.

Em outras sequências estranhas de amino-ácido, contra as quais devem se formar anticorpos, trata-se de sequências oriundas de vírus. Preferencialmente são utilizadas essas sequências estranhas de amino-ácido, oriundas de proteínas de vírus, que possam entrar em contacto com o sistema imunológico do organismo anfitrião. De início trata-se aqui de proteínas superficiais, uma vez que estas entram primeiramente em contacto, via de regra, com o sistema imunológico do organismo anfitrião. Como alternativa pode se tratar de substâncias libertadas ao longo do ciclo de vida virai. Aqui pode se tratar, dependendo do tipo do vírus, por exemplo, de uma proteína do core ou proteína núcleo-capsídea de um vírus.

Com a presente vacina split-core, podem ser produzidos 16 não apenas anticorpos contra sequências de aminoácido estranhas ao corpo, como também anticorpos contra estruturas próprias do corpo indesejadas, como, por exemplo, marcadores tumorais. Células de tumor exprimem frequentemente outras substâncias marcadoras como células saudáveis. Se essas sequências estranhas de aminoácido próprias do corpo se apresentarem na vacina split-core, será estimulada uma reacção imunológica, de modo que o corpo forme anticorpos contra células de tumor em volume elevado. Através destes anticorpos, as células de tumor podem ser facilmente reconhecidas pela defesa imunológica e eliminadas a seguir. Através do sistema transportador de acordo com a invenção, a reacção imunológica celular pode também ser estimulada, o que pode levar a uma maior eficiência.

Matéria do presente pedido de patente é também um processo para a produção de uma vacina contra sequência heterológica de proteína. A vacina split-core consiste em duas partes do antígeno nucleico de um vírus da hepatite B, sendo que ou a região N-core está fundida com a sequência proteica heterológica, ou fundida ao fim terminal C da sequência proteica heterológica. Aquela posição na cadeia de amino-ácidos, na qual ambos os domínios estão separados um do outro, encontra-se entre a posição 73 e a posição 94. Amino-ácidos individuais desta região de aminoácidos, que representam o epítopo "c/el", podem ser deletados. 0 processo de acordo com a invenção pode ser executado, por principio, de duas formas. Quando ambas as partes do antígeno split-core só podem ser exprimidas como uma cadeia de polipeptídeos, uma sequência de reconhecimento de acordo com a invenção é introduzida na posição prevista para executar uma protease. Através disto um polipeptídeo pode ser dividido, após a expressão, através da protease em duas partes definidas. Nesta forma de execução é possível igualmente co-expressar aquela 17 protease que corta a interface prevista. A sequência genética codificadora para tal pode se encontrar no mesmo vector ou num vector separado.

Numa outra forma de execução preferencial, ambos os polipeptídeos mencionados acima são expressos através de um vector especial. Preferencialmente é utilizado o denominado vector bicistrónico. Isto significa que uma parte da vacina núcleo-divisora (split-core) é exprimida como cadeia polipeptidea e que um códon de exterminação se encontra num término C. Pouco depois podem surgir de novo ribossomas e exprimir o segundo polipeptideo. Assim assegura-se que ambas as partes da vacina split-corese formem em quantidade idêntica e que não sejam necessárias quaisquer medidas de cautela, para que o organismo anfitrião não perca um dos vectores, o que levaria à consequência de que apenas uma parte split-core da vacina ficaria pronta. A expressão "proteína de fusão" ou "fundida" significa que duas proteínas diferentes ou polipeptídeos estão ligados uns com os outros através de uma ligação peptídea. Tais proteínas de fusão surgem através da expressão das sequências de ácidos nucleicos codificadoras, conectadas em série.

Constatou-se no âmbito da invenção que o problema principal químico-protêico para um emprego mais amplo do sistema transportador HBV-CLP (especificamente como transportador da vacina, em geral para a apresentação das moléculas estranhas) representa o acoplamento bilateral da proteína estranha inserida através da zona terminal N e C. Se uma das duas ligações covalentes se soltar (num dos dois lados inseridos nos terminais N ou C) e formar uma partícula, porque as duas partes separadas núcleo-divisoras da proteína do core se desdobraram correctamente ("split-core"), a quantidade e o tipo das proteínas estranhas inseríveis aumenta drasticamente. Isto é um aspecto essencial da presente invenção. 18 A figura 2 mostra esquematicamente que a inserção de uma proteína estranha com estrutura 3D inadequada (pro ex. OspA) pode impedir a formação de uma estrutura capaz de formar partículas de um transportador de proteína do core (solução acima); como alternativa pode a formação de uma estrutura 3D correcta do transportador da proteína do core impedir a formação da estrutura 3D nativa da proteína estranha (solução abaixo). Isto influenciaria negativamente a ligação dos anticorpos pretendidos. Esta problemática estérica é eliminada, quando um dos dois acoplamentos covalentes entre a inserção da proteína estranha e o transportador é solto (no lado de inserção da zona terminal C ou N) (seta) . Uma possibilidade de execução é a divisão posterior de uma proteína de fusão contínua; isto exige a introdução adicional de uma interface para uma protease específica. Preferencialmente são expressos portanto ambos os fragmentos como entidades separadas desde o inicio.

Através da solução segundo a invenção ocorrem as seguintes outras consequências: (i) uma vez que o epítopo "c/el" se encontra na superfície da partícula, surgem nesta mesma superfície novos términos N e C que podem ser derivatizados mais vezes. Por exemplo, o fragmento nucleico N pode se fundir com uma molécula estranha X, e a molécula estranha Y pode se fundir com o fragmento C-core. Uma aplicação possível é a apresentação de moléculas estranhas heterodímeras. Deve-se observar aqui, entretanto, que não ocorra nenhum impedimento estérico das partes em fusão. (ii) regiões parciais específicas de uma sequência estranha inserida, por ex., um epítopo bastante importante, podem ser orientadas em direcção à superfície da partícula através de um término N ou C, dependendo do acoplamento. Um exemplo é o chamado epítopo LA2 de B. burgdorferi OspA que se encontra na área terminal C. Anticorpos que reconhecem este epítopo são neutralizantes. 19

Isto é importante também para a inserção de sequências estranhas que, por sua vez, oferecem outras superfícies de interacção (para o vínculo de terceiras moléculas; ver exemplos). Uma vez que é acoplada apenas de um lado, não se força nenhuma estrutura 3D à sequência estranha capaz de interação; ao contrário, ela é, dependendo do tipo, flexível ou pode assumir sua estrutura 3D correcta sem distúrbios. Assim as interacções são facilitadas com seus parceiros de interacção. A matéria da presente invenção são também medicamentos, principalmente vacinas que contêm partículas semelhantes a capsídeos, baseadas no sistema split-core.

Os medicamentos de acordo com a invenção contêm partículas semelhantes a capsídeos de acordo com a invenção, sendo que os medicamentos apresentam preferencialmente uma influência positiva no sistema imunológico. Normalmente, o sistema transportador split-core de acordo com a invenção oferece ao sistema imunológico uma sequência estranha de amino-ácidos, contra a qual o sistema imunológico produz anticorpos, preferencialmente neutralizantes. Estes anticorpos agem principalmente no combate a micro-organismos ou vírus invasores, ou ajudam na destruição específica de células de tumor indesejadas.

Numa outra forma de execução, o sistema transportador split-core de acordo com a invenção pode ser utilizado como meio diagnóstico e/ou analítico. Nos exemplos 12 e 13, tais aplicações foram elucidadas amiúde. Nestes meios, partículas auto-fluorescentes, formadoras de anticorpos, podem se tornar acessíveis ao acoplamento de antígenos que, por sua vez, se tornam visíveis através da fluorescência. Numa outra forma de execução, os sistemas transportadores núcleo-divisores (split-core) de acordo com a invenção podem conter sequências de peptídeos que ligam certos lantanídeos e metaliões. Quando tais peptídeos são 20 incorporados ao sistema split-core, são preparadas partículas contendo individualmente muitos destes átomos/íons de reportagem que são mais facilmente comprováveis.

Exemplo 1

Proteína do core tipo selvagem com protease TEV inserida na sequência de reconhecimento

No epítopo "c/el" da proteína do core wt de 1-149 foi introduzida uma sequência de reconhecimento para a protease do vírus tobacco-etch (TEV) (substituição dos AS P79+A80 através de GGGGT-ENLYFQGT-GGGG; resíduos G como Linker, a fim de garantir o acesso da sequência de reconhecimento para a protease). A proteína recombinante criou partículas. Estas foram incubadas com a protease TEV. 0 êxito da reacção divisória através de SDS-PAGE foi conferido. A acção da digestão da protease foi sedimentada em seguida por um gradiente de sacarose. Foi realizada praticamente uma divisão completa da posição esperada, uma vez que praticamente dois fragmentos grandes foram gerados. Apesar da divisão, a proteína foi sedimentada no gradiente, por exemplo, na mesma posição que a proteína do core não dividida "wt" 1-149. Resultados comparáveis foram gerados pela proteína de fusão com base na proteína do core de comprimento completo 1-183.

Exemplo 2

Variações da proteína do core com maiores sequências estranhas inseridas

Como exemplo para uma proteína de fusão com inserção moderada foi inserida no epítopo " c/el" a sequência para o peptídeo artificial "ACID" (acompanhada por Linkers ricos em Gly; no total 65 AS), a qual pode interagir com um peptídeo complementar "BASE" [0'Shea et al, Curr.Biol. (1993), p.658-667]; em seguida a sequência de reconhecimento da protease TEV GGGGSGGGVEDGGGGSGGGGT-AQLEKELQALE-KENAQLEWELQALEKELAQTG-ENLYFQGTGGGG. 21 A proteína de fusão formou CLPs. Estes foram isolados e incubados com a protease TEV acima. Também aqui ocorreu uma divisão específica, porém as partículas ficaram intactas. Neste caso, os fragmentos divisórios TEV são diferentemente grandes e podem ser diferenciados no gel SDS directamente. Apesar da divisão, os fragmentos co-sedimentam nas fracções gradientes específicas da CLP.

Este exemplo mostra que também as CLPs da proteína do core podem ser especificamente divididas com um peptídeo inserido de 65 AS (Linker + ACID + interface TEV) , porém deixando a estrutura particular intacta.

Exemplo 3

Outro exemplo é a tentativa respectiva com uma proteína do core, contendo a sequência AS 18-273 da proteína do Borrelia burgdorferi OspA. A proteína respectiva sem a posição divisória TEV foi descrita em Nassal et al, 2005; somente um fragmento da mesma formou partículas regulares, o que se mostrou também numa distribuição no gradiente da sacarose. A vacina não cortada só pode ser utilizada restritivamente. Uma vez que sequências de Linker muito longas com potencial antígeno indesejado se fizeram necessárias para conservar pelo menos uma pequena parcela do preparado em forma CLP, esta vacina não cortada não seria aplicável ao ser humano.

Após a introdução de uma posição divisória TEV, a proteína de fusão foi tratada com protease TEV como no exemplo 2, em seguida sedimentada no gradiente da sacarose. Também aqui ocorreu uma divisão especifica. Porém, incompleta (supostamente através de impedimento estérico via OspA com acesso piorado pela interface TEV) ; organização dos fragmentos através de anticorpos monoclonais, que reconhecem especificamente a parte do core da zona terminal N e da zona terminal C; o anticorpo a-N nucleico reage respectivamente com a proteína de fusão não dividida, assim como com o fragmento divisório da zona 22 terminal N. Mesmo assim, o material demonstrou um comportamento em execução tipico das partículas. Estes dados indicam que através da abertura de uma das duas ligações entre a proteína estranha inserida e o transportador nucleico a formação de partículas pode ser nitidamente aperfeiçoada. 0 exemplo comprova que uma proteína do core de fusão pode ser dividida especificamente por uma inserção grande de proteína estranha (255 AS OspA + Linker + interface TEV) (porém menos eficiente). Enquanto a proteína de fusão contínua descrita anteriormente a OspA do core é distribuída amplamente pelo gradiente (Nassal e outros, 2005), a proteína de fusão (parcial) é acrescida distintamente das fracções típicas de partículas gradientes. Isto é um indício para uma eficiência melhorada da formação de partículas através da divisão.

Numa outra tentativa demonstrou-se que (a partir de um plasmídeo compatível) uma protease TEV co-expressa cria a divisão de proteínas de fusão do core contendo interfaces TEV, parcialmente mais eficientes do que na divisão posterior in vitro. Também para as proteínas de fusão divididas nas bactérias, a formação de partículas pode ser comprovada através da sedimentação de gradientes da sacarose.

Os exemplos 1 a 3 mostram que as CLPs pré-formadas permanecem intactas após a divisão da área do epítopo "c/el". Isto pode ser explicado estruturalmente pelo facto de que o nó de elo entre as Hélices formadoras de pontas ("spikes") não exercem um papel por si só estrutural, o que não era esperado desta forma. Isto acarretou na forma de execução preferida, na qual, ao invés da divisão posterior da cadeia contínua de proteínas, as partes do N nucleico e C nucleico são expressas directamente como segmentos separados de proteína, sendo que elas se juntam espontaneamente, formando partículas. Tal situação 23 apresenta pelo menos três vantagens essenciais: (i) Facilitação: o passo divisório adicional com protease TEV (ou com uma outra) protease não é mais necessário (ii) nenhuma sequência adicional de peptídeos na proteína de fusão é necessária para o reconhecimento específico da protease (iii) uma formação - embora apenas parcial - de partículas com proteína estranha estericamente inadequada como a OspA requer sequências muito longas de Linkers; estas são imprescindíveis, quando impedimentos estéricos devem ser evitados através da ligação bilateral desnecessária com a proteína do core.

Os pontos (ii) e (iii) são principalmente relevantes para aplicações da vacina, pois toda e qualquer sequência adicional pode levar a consequências imunológicas imprevisíveis (epítopos novos através das sequências adicionais, possivelmente reacções cruzadas com epítopos próprios do corpo)

Exemplo 4

Construções de expressão para a expressão quase equimolar de fragmentos N nucleico e C nucleico

Na cadeia contínua de peptídeos, os produtos posteriores da divisão se apresentam forçadamente em quantidades equimolares. Numa expressão separada, ambas as partes deveriam surgir igualmente em quantidades forçadamente equimolares para uma conservação conjunta mais eficiente. Nas primeiras tentativas foram utilizados dois plasmideos compatíveis, separados para expressão de ambas as partes da proteína transportadora, porém com sucesso médo.

Na forma preferencial da execução são utilizados vectores bicistrónicos que apresentam adicionalmente a vantagem de que se pode evitar uma selecção com outro antibiótico (para a conservação do segundo plasmídeo, necessário no caso contrário). 24

Construções do tipo 1 possuem atrás de um promotor conjunto (aqui um promotor de polimerase T7 Phagen RNA) duas caixas de expressão com uma posição adiantada de acoplamento de ribossomas em cada caixa (ribosome binding site, RBS; sequência "Shine-Dalgarno"). Nos vectores construídos aqui, a translação do fragmento N nucleico termina através de um códon Stop artificial após a prolina AS 79 (P79), a iniciação da translação do segundo fragmento é possibilitada através de um códon de iniciação do segundo fragmento através de um códon Stop artificial antes de AS serina 81 (S81). Tal construção operacional é frequentemente presente nas bactérias ("mRNAs policistrônicos"; ribossomas podem se juntar com relativa independência a cada RBS na mRNA e iniciar a translação dos genes situados em 3'). Nas construções executadas, o segundo RBS é uma cópia exacta do primeiro RBS, oriundo de um vector pET original; outras sequências RBS são igualmente possíveis com certeza. 0 códon de iniciação ATG do segundo cístron é uma parte de uma interface Nde (CATATG) para a inclonização facilitada de sequências estranhas.

Construções do Tipo 2 ("stop/start") não possuem um segundo RBS separado; ao invés disto, um códon de iniciação se confunde com o códon de cessão (stop codon) dos genes upstream (NNN TGA) para os genes downstream (NNA TGA) numa leitura de quadros deslocada. Neste caso, os risbossomas podem ser reinicializados directamente após a leitura dos primeiros genes no ATG dos segundos genes; essa organização permite a co-expressão de dois genes; arranjos semelhantes Stop-Start encontram-se em alguns bacteriófagos. Esta organização foi realizada também em alguns retrotransportadores eucarióticos não-LTR (ligação 0RF1/0RF2). Através das sequências conhecidas, por ex. no E. coli Trp Operon, outras combinações de códons Stop/Start vizinhos ou conjuntos (por ex. TAA TG, TGA TG, etc.) podem 25 ser igualmente adequadas.

Vectores preferenciais de expressão são apresentados esquematicamente na figura 3.

Acima: Construções do Tipo 1. Um promotor, por ex. para a polimerase T7 RNA, leva à transcrição de um mRNA bicistrónico (para uma terminação eficiente pode ser inserida uma sequência de terminação eficiente trilateral). 0 primeiro cistron codifica a sequência AS 1-79 da proteína do core do HBV. Uma posição de acoplamento adiantada de ribossomas (RBS1) permite a iniciação da translação (subunidades pequenas e grandes de ribossomas são apresentados como ovais) . Ao fim 3' do códon para a P79 segue-se um códon stop. Ao fim 5' do segundo cistron encontra-se outro RBS (RBS2) para iniciação da translação do fragmento C nucleico. Este dispõe para tanto de um códon próprio de iniciação (ATG). No exemplo apresentado a sequência do C nucleico começa com Ala80; ela pode se estender até a posição AS 140, melhor 149, ou até um fim autêntico na Pos. 183. A sequência AS a partir da Pos. 140, melhor 149, pode ser também substituída por sequências estranhas.

Abaixo: Construções do Tipo 2. Estas contêm somente uma RBS antes do primeiro cistron. A translação do fragmento C nucleico ocorre através de reinicialização, no qual o códon Start de C nucleico (ATG) se confunde com o códon Stop de N nucleico (TGA) como demonstrado. Neste exemplo a sequência de C nucleico começa com Ser81.

As posições AS 77, 78 e 79 da proteína do core são glutamato (E; códons: GAA, GAG), aspartato (D; códons: GAC ou GAT) , proteína AS 79 (P; códons: CCN) . Nas construções realizadas do Tipo 1 foi escolhida a sequência nucleotídea GAG GAT CCN para a sequência AS EDP, através da qual surge uma interface para BamHI (GGATCC); através deste corte singular BamHI torna-se possível uma inclonização simples de fragmentos distintos de DNA codificadores de N nucleico 26 e C nucleico. 0 nucleotídeo N não está definido no códon de prolina CCN; o códon Stop pode ser TAA, TAG ou TGA.

Nas construções do tipo 2, a sequência até o fim do primeiro gem é G GAT CCa TGA. Também aqui se encontra uma interface BamHI (sublinhada) para a inclonização de fragmentos diferentes de ADN codificadores de N nucleico ou C nucleico. Para a P79 deve constar o códon CCa nas construções do tipo 2 executadas, o códon Stop deve ser TGA (> CCa TGA), a fim de permitir o surgimento de um códon de inicialização ATG conjunto para o segundo gene. 0 códon para a primeira AS do segundo gene após o códon de inicialização ATG deve começar com A. Sequências Nt-Stop/Start seriam TGA TG ou TAA TG como em E. coli Trp Operon entre TrpE e TrpD ou também entre TrpB e TrpA [Das and Yanofsky (1989), Nucl. Acids Res., p. 9333-9340; Oppenheim and Yanofsky (1980), Genetics, p. 785-795].

Nos vectores realizados (pET28a2-xxx) a estrutura básica consiste no vector comercial pET-28, no qual, contudo, o gene de resistência canamicina foi trocado por aquele de resistência contra ampicilina. Com certeza são utilizáveis, porém, outras estruturas básicas de vectores (oris de replicação diferentes, genes diferentes de resistência, promotores diferentes, RBS diferentes).

Essencial é a organização bicistrónica dos genes para o N nucleico e C nucleico, ou através de 2 RBS separados, ou através do posicionamento Stop/Start. Em algumas tentativas, várias proteínas split-core do tipo 1 deixaram-se expressar por construções do tipo 2. Para construções do tipo 2 (Stop/Start) isto se constatou apenas em número reduzido de construções. Além disto, a variabilidade sequencial possível das construções do tipo 2 é reduzida (ver acima). Construções do tipo 1 são portanto aplicáveis mais amplamente.

Como AS da zona terminal C da parte N do core foi escolhida a P79, uma vez que a prolina é especialmente 27 resistente à protease, minimizando assim a degradação do fragmento. Em virtude da estrutura conhecida em 3D assim como das alternativas de deleção nesta região central, pode-se contudo assumir que (i) o fim do fragmento N nucleico se encontra na área dos AS a partir de cerca da Pos. 72 - 74, especialmente Gly73 (ii) e o inicio do fragmento C nucleico pode se encontrar na área dos AS a partir de cerca da Pos. 78-86, possivelmente até Gly94, sem que outros resultados essencialmente diferentes daqueles dentro dos limites aqui escolhidos pudessem ser atingidos (fim do N nucleico em P79, inicio do C nucleico em S81, com Start-ATG adiantado).

Para a expressão em células eucarióticas, as construções descritas não são aplicáveis em virtude do mecanismo diferente de transcrição e translação; ao invés do promotor procariótico deve ser utilizado um promotor eucariótico (por ex. CMV-IE e muitos outros), assim como um sinal de poliadenilização (por ex. do virus SV40 ou muitos outros), induzido após o fim da leitura aberta de quadros.

Uma expressão quase idêntica do N nucleico e C nucleico em eucariotas pode ser atingida através de: (i) co-transfecção de dois plasmideos (um para N nucleico, um para o C nucleico); (ii) transfecção de um plasmideo com duas caixas de expressão independentes; (iii) transfecção de um plasmideo com mRNA funcional bicistrónico; por ex., o segundo gene pode ser expresso por uma entrada "internai ribosome entry site" (IRES) adiantada; (iv) Possivelmente, uma organização Stop/Start de vectores do tipo 2 em eucariotas pode ser funcional.

Exemplo 5

Expressão separada de fragmentos de wt-N nucleico e C nucleico leva à formação de CLPs intactas

Por intermédio de vectores de expressão com base no 28 tipo 1 (figura 3), foi expressa uma proteína do core do tipo selvagem em duas partes nas células do E. coli BL21, uma com base nos AS 1-149, outra com base nos AS 1-183. Ambos os fragmentos esperados se formaram e foram depositados em conjunto nas CLPs intactas. Ambos apresentaram comprovadamente gradientes de sacarose e eletroforese do gel de agarose nativa. Como prova directa para a formação de CLPs foi feita uma comparação microscópica de electrões (negative staining) de partículas da cadeia de AS 1-183 contínua com partículas His6-Tag com término C contra partículas do respectivo sistema split-core. Como resultado não foram detectadas quaisquer diferenças. CLPs do Wt-HBV são bastante robustas e constantes contra ureia em concentrações molares; CLPs 1-149 da proteína do core da zona terminal C podem ser desassociadas através de 3-5 M de ureia em dimeros e re-associadas como CLPs através da modificação das condições (afastamento da ureia, pH neutro, concentração de sal elevada) in vitro. Uma análise comparativa sobre a estabilidade das CLPs do sistema split-core mostrou uma estabilidade elevada semelhante (split-core). Isto comprova a elevada afinidade das partes de N nucleico e C nucleico entre si, e é importante para a aplicação do sistema transportador para moléculas estranhas.

Exemplo 6

Expressão separada de N nucleico de proteína estranha fundida com fragmentos wt-C nucleicos, e vice-versa, leva à formação de CLPs intactas

Para comprovar a adequação fundamental do sistema núcleo-divisor para a formação de CLPs e a apresentação de proteínas estranhas foi fundida como modelo a GFP com um N nucleico ou um C nucleico; para construção do N nucleico foi utilizado um tipo 1 (segundo RBS) ou Tipo 2 vector (Stop/Start). Todas as construções levaram a uma expressão 29 de proteínas verdes fluorescentes que formaram partículas de sedimentação em gradientes de sacarose.

Como outro comprovante da associação física dos respectivos fragmentos N nucleico e C nucleico foram submetidas alíquotas das fracções gradientes à electroforese em geles nativos de agarose. Aqui as partículas se conservaram intactas, assim como o cromóforo GFP. Nas fracções constatou-se tanto no GFP do N nucleico, como no GFP do C nucleico, uma substância distinta, verde e fluorescente; o GFP não acoplado da proteína de fusão permaneceu nas fracções superiores de gradientes, e mostrou um outro comportamento em execução, assim como uma distribuição mais difusa (difusão acelerada em gel em virtude da estrutura menor essencial, comparada à partícula das subunidades 180 ou 240). Tanto para o GFP do N nucleico como para aquele do C nucleico foi possível comprovar a presença de anticorpos no C nucleico na substância verde fluorescente (contendo o dito GFP).

Este exemplo comprova duas coisas: (i) No sistema split-core uma proteína estranha pode ser de cerca 240 AS, aqui GFP, fundida tanto com N nucleico quanto com C nucleico sem destruir a formação de CLP. (ii) Tanto o tipo 1 quanto o tipo 2 dos vectores núcleo-divisores (split-core) são adequados para a co-expressão de N nucleico e C nucleico com sequência estranha co-fundida. Exemplo 7

Apresentação de CLP de proteínas estranhas medicinalmente relevantes no sistema split-core, que são possíveis em quantidade reduzida e inconvencional da Borrelia burgdorferi OspA

Como apresentado inicialmente, a ligação bilateral da proteína estranha inserida, necessária no sistema até então, com a proteína transportadora leva a limitações tipológicas significantes. Enquanto a GFP possui uma forma natural de "passe", o mesmo não acontece com a OspA. Como 30 preveniência para uma proteína estranha estruturada de forma inadequada, foi aplicada portanto a OspA no sistema split-core e fundida com um N nucleico ou um C nucleico. Ao contrário da construção contínua antiga [descrita em Nassa et ai, 2005] com distribuição ampla no gradiente, ambas as proteínas de fusão foram enriquecidas distintamente de fracções de partículas típicas. Uma análise microscópica de electrões mostrou uma eficiência de formação drasticamente mais eficiente de CLP comparada com a construção anterior contínua, tanto na fusão de OspA com o N nucleico como com o C nucleico.

Este exemplo demonstra que (i) o sistema split-core permite a apresentação de CLP de proteínas estranhas, cuja estrutura interfere com a formação de CLP no sistema nucleico contínuo tradicional, (ii) a formação eficiente de CLP do sistema split-core através da fusão da proteína estranha tanto com o N nucleico quanto com o C nucleico também é possível.

De maneira análoga foi apresentada também com sucesso a Borrelia burg-dorferi OspC no sistema split-core da invenção.

Exemplo 8

Proteína circumporozóide do agente patogénico da malária Plasmodium falciparum

Uma outra proteína patogénica altamente relevante do ponto de vista das vacinas é a proteína circumporozóide (CSP) do agente patogénico da malária Plasmodium falciparum. A CSP (forma utilizada aqui: comprimento total de 319 AS) contém uma sequência repetitiva de motivos tetrapeptídeos NANP/NVDP no comprimento de cerca de 110 AS. A estrutura de CSP não é conhecida; os términos de C com domínio de cerca de 50 AS com resíduos de 4 Cys tem provavelmente (em virtude da homologia sequencial) uma convolução semelhante da Trombospondina do tipo 1. A sequência repetida é imunógena, possivelmente contida 31 também em outras regiões de epítopos importantes da CSP. No sistema nucleico convencional continuo a CSP de comprimento completo não pode ser preparada na forma da CLP. Ao contrário disto, no sistema split-core isto foi perfeitamente possível. Dados nítidos se apresentam actualmente para a fusão de CSP com o N nucleico; na co-expressão com o C nucleico (tanto na construção 149 como na construção 183) formam-se estruturas particulares eficientes.

Foi produzida uma série de construções (tanto com base nos núcleos 1-149 como 1-183), contendo apenas a sequência repetitiva ou CSP truncado sem domínios ricos em Cys respectivamente no sistema contínuo ou split-core; aqui o CSP completo se funde com o N nucleico. As preparações de CLP foram utilizadas num estudo comparativo de imunogenidade em camundongos, mas que não puderam ser concluídos. Os dados presentes mostram que a vacina produzida pelo sistema split-core apresenta características superiores. Isto reporta ao facto de que o CSP completo do sistema transportador da invenção apresenta capacidade de formação de CLPs somente mediante a utilização do sistema transportador da invenção. Em outros sistemas, ao contrário, não se formam CLPs. Portanto as vacinas formadas com auxílio do sistema transportador da invenção devem apresentar uma imunogenidade superior e induzir anticorpos especialmente neutralizantes.

Exemplo 9 CLPs split-core como transportadoras de proteínas estranhas elevam a reacção das células B contra a proteína estranha

Num estudo de imunogenidade em camundongos foram analisados 5 construções de cores OspA do sistema split-core com OspA do core não fundida, lipidada (LipOspA); esta é a base da vacina comercial Lymerix, portanto o "padrão de ouro" actual de uma vacina de combate ao agente patogénico de Lyme. A parte lipidada na LipOspA (Tris-Palmitoil- 32

Cisteína-(Pam3-Cys)) é essencial para a sua imunogenidade relativamente elevada, OspA não lipidada é apenas fracamente imunógena (cp. Nassal et al, 2005). Três das construções do core OspA contêm OspA de comprimento completo (AS 18-273), duas outras comprimento de OspA reduzido (começando com AS 185 até AS 273). 6 grupos com 5 camundongos BALB/c cada foram imunizados com 10 |mg de antigeno cada um 4 vezes (dias 0, 14, 29, 49) :

Grupo 1: LipOspA Grupo 2 : OspA de comprimento completo (AS 18-273 nucleico, C nucleico de AS 81 a 183 Grupo 3 : OspA de comprimento completo (AS 18-273 nucleico, C nucleico de AS 81 até 149 Grupo 4 : OspA reduzido (AS 185 a 273) no N nucleico, C nucleico de AS 81 a 183

Grupo 5: OspA reduzido (AS 185 a 273) no N nucleico, C nucleico AS 81 a 149

Grupo 6: OspA de comprimento completo (AS 18 a 273) no C nucleico até AS 183, N nucleico de AS 1 até 79.

Para determinar os anticorpos induzidos foi retirado sangue no dia -1 (= 1 dia antes da primeira imunização; = solução pré-imunizante) , assim como nos dias 8, 26, 36 e 57. Mediante ELISA foram determinadas: a cinética da formação de anticorpos específicos da OspA; a respectiva parte de anticorpos equivalentes a LA2, sendo que LA2 é um anticorpo monoclonal, reconhecidamente neutralizante, que reconhece um epítopo complexo conforme das sequências AS descontínuas downstream do AS 185 OspA.

Os resultados desta tentativa foram demonstrados na figura 4 detalhadamente. A figura 4A mostra a cinética da indução do anticorpo completo anti-OspA (em |mg específicos Ak por ml da solução) . Logo após a segunda imunização, as soluções dos camundongos, imunizadas com OspA núcleo-divisores de 33 comprimento completo contêm construções comprovadas e títulos anti-OspA comparáveis com aqueles provocados pela LipOspA. Após a 3a. e 4a. imunização os títulos anti-OspA excedem os OspA núcleo-divisores de comprimento completo dos camundongos imunizados nitidamente aqueles dos camundongos imunizados com LipOspA; especialmente elevados são os títulos após a imunização com OspA18-273 no C nucleico (grupo 6) . OspA 185-273 reduzido provoca no contexto de 149 nucleico (grupo 5) e 183 nucleico (grupo 4) uma reacção específica de OspA essencialmente reduzida. A figura 4B compara directamente os títulos Ak anti-OspA completos com aqueles direccionados contra o epítopo, LA2 neutralizante na área terminal C da OspA. OspA de comprimento completo no N nucleico, tanto no contexto 149 nucleico como 183 nucleico (grupos 2 e 3) induzem títulos Ak como anti-LA2- mais elevados enquanto LipOspA, enquanto OspA de comprimento completo no C nucleico induz títulos bem reduzidos. Uma análise sobre o conteúdo respectivo de Ak neutralizantes (protecção contra agente patogénicos B.burgdorferi) é conduzida continuamente. 0 exemplo mostra que anticorpos de CLPs especificamente split-core induzem proteínas estranhas contra a OspA de comprimento completo apresentada, sendo que os títulos são mais elevados do que com a LipOspA lipidada estabelecida, na qual a parte lipidada é essencial para a imunogenidade. A parte diferente de Ak equivalente a LA2 após a imunização com OspA no N nucleico (ca. 30 %) contra OspA no C nucleico (< 5 %) mostra que o tipo de utilização influencia o tipo dos Ak que surgem; vide aqui o exemplo 10.

Exemplo 10

Indução objectiva de anticorpos de região especifica contra uma proteína estranha através da fusão alternativa com um N nucleico ou C nucleico

Em proteínas, cujos termos N e C não são directamente 34 avizinhados como em GFP, a fusão no N nucleico leva a uma outra orientação mais relativa à superfície da partícula do que a fusão no C nucleico (N nucleico: término C da proteína estranha "out"; C nucleico: Término N da proteína estranha "out"). Espera-se que através da aplicação como vacina de célula B, as partes da proteína mais imbuída da solução provoquem reacção mais forte dos anticorpos. Assim, deixam-se induzir anticorpos diferentes de região especifica, em que a proteína estranha se funde com o N nucleico (lado terminal C da proteína estranha "out") ou C nucleico (lado terminal N da proteína estranha "out"). A figura 5 mostra esquematicamente como uma proteína estranha com estrutura estendida, como aqui a OspA, pode ser definida através da fusão com N nucleico ou C nucleico, no aspecto de que qual parte da molécula mais se afasta da superfície CLP. Um epítopo bem mapeado na OspA é LA2 na área terminal C, reconhecido por um anticorpo monoclonal neutralizante, LA2. Como esperado, as CLPs de OspA split-core com OspA no N nucleico (portanto OspA exposta na zona terminal C) provocam uma reacção forte, equivalente a LA2, CLPs com OspA no C nucleico provocam uma reacção equivalente a LA2 fraca. Em compensação, a reacção contra outras áreas da OspA é fortalecida.

Para a OspA como proteína estranha esperava-se que uma fusão no N nucleico o epítopo LA2 na área terminal C tornasse o acesso à área OspA mais fácil, uma fusão no C nucleico, ao contrário, levasse à região até aqui imunologicamente mal caracterizada da OspA terminal N. Os dados demonstrados acima comprovam nitidamente este conceito (OspA no C nucleico apresenta títulos anti-OspA bastante elevados, porém títulos Ak equivalentes a LA2 bastante reduzidos). 0 sistema split-core possui portanto uma actividade alta de elevação da imunidade, tanto durante a fusão da proteína estranha no N nucleico como no C nucleico. 35

Através da escolha do local de acoplamento (N nucleico contra C nucleico), o tipo e a especificidade da região dos anticorpos induzidos podem ser controlados. Para resultados de vacinação excelentes, misturas de vacinas split-core podem ser utilizadas, nas quais a sequência heterológica de amino-ácidos estranhos seja fundida uma vez com o N nucleico N e uma vez com a parte C-core, de modo que epitopos diferentes possam ser apresentados de maneira ideal.

Exemplo 11

Fusões de significado além do emprego na vacinação

Ao lado do significado directo como transportador particular de elevação da imunidade para vacinas peptídeas e aqui especialmente para vacinas de antigenos proteicos, há uma variedade de outras aplicações imagináveis para tal plataforma de transporte. Sempre se leva uma grande quantidade de moléculas apresentadas (180 ou 240) a uma vizinhança próxima, simétrica: Quando se trata de moléculas estranhas capazes de interagir (a vacina representa um caso especial: interacção com anticorpos), a partícula com várias cópias da molécula estranha apresenta uma avidez drasticamente elevada, se comparada com a molécula estranha monómera (cp. penámeros naturais IgM; também tetrámeros MHC no diagnóstico imunológico). Para que tais moléculas estranhas capazes de interagir possam reagir com seus parceiros de interacção, elas precisam ser acessíveis na superfície CLP. Isto é mais fácil no sistema split-core em comparação ao sistema continuo convencional.

Uma série de sequências estranhas como modelos foram expressas no sistema split-core, todas as inserções testadas formaram CLPs. Em algumas a capacidade de interacção foi comprovada directamente.

O arranjo divisório torna novos terminais acessíveis na superfície da CLP para outra derivatização. A figura 5 mostra um dímero split-core com peptídeo ACID fundido com N 36 nucleico, o qual pode reagir com o peptídeo BASE complementar. Se o peptídeo BASE funde com uma molécula X, a molécula X se acopla às ACID-CLPs. Através da organização divisória o ACID é flexível; ACID inserido no sistema nucleico contínuo interage com peptídeos BASE, pois uma helix dupla rígida coiled-coil se forma entre os peptídeos ACID e BASE-Peptid [0'Shea et al, 1993], a estrutura do transportador nucleico se torna instável, as CLPs se desfazem. Na organização divisória as CLPs deveriam, ao contrário, permanecer estáveis. Este acoplamento é generalizável: Ao invés do peptídeo ACID-, uma outra molécula N no N nucleico capaz de interacção pode estar fundida com C nucleico. CLPs respectivas podem portanto interagir com B, um parceiro específico de interacção A. Esses pares de parceiros de interacção são His6-Ni-NTA, peptídeo biotina-receptor- estreptavidina; Z33 imunoglobulina.

Outras possibilidades de acoplamento são elucidadas a seguir: a) His6-tag:

Fundido no N nucleico via Linker Gly2; forma partículas, que ligam a agarose Ni2+NTA. His-tag acessível livremente ao contrário do sistema acessível livremente. Inserção comparável (His7) em "c/el" do sistema contínuo do sistema nucleico não resultou em nenhuma quantidade relevante de proteína, porque o resíduo dos His6-tag estéricos não estavam acessíveis. b) Peptídeo receptor de biotina (BA):

Receptor de biotina (BA23) é um peptídeo artificial de 13 AS de comprimento (GLNDIFEAQKIEWH) ) , o qual é biotinilado através da ligase de biotina BirA do E. coli. Biotinilação eficiente exige acessibilidade livre; esta se dá no sistema split-core, porém não ou apenas de forma reduzida no sistema contínuo nucleico. A proteína de fusão núcleo-divisora BA (split-core) forma CLPs e é biotinalada 37 no E. coli. À biotina apresentada pela CLP pode se juntar à avidina/estreptavidina ou a os seus conjugados.

c) Domínio Z 33 da proteína A A Proteína A S. aureus forma imunoglobulinas com alta afinidade ("sefarose da proteína A" para a precipitação imunológica). A proteína A consiste em 5 domínios de ligação estruturalmente semelhantes. Z33 é um único domínio com sequência modificada AS; comprimento total de 33 AS. Z33 possui sempre grande afinidade com os Ig's (Kd 40 nM) . A ligação a diversos Ig's requer flexibilidade estrutural, além disto, acessibilidade. A sequência Z33 foi fundida com o N nucleico através de uma sequência de Linker longa: GGGGSGGGVEDGGGGSGGGGT-FNMQQQRR-FYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIREDP.

No sistema split-core formam-se CLPs. Após a adição de imoglubulinas marcada por FITC e uma sedimentação repetida, uma parte da fluorescência pode ser comprovada nas fracções gradientes típicas das partículas. Isto não é o caso, quando ao invés da fusão Z33-Fusion da proteína do core "wt", CLPs são utilizadas.

d) Inserção de peptideo ACID O peptideo ACID inserido no sistema nucleico contínuo interage com o peptideo complementar do peptideo BASE ("peptideo velcro") através da formação coiled-coil dos peptídeos; [0'Shea et al, 1993] sob alterações massivas da estrutura do core até a sua destruição. A razão é que o peptideo ACID assume apenas uma estrutura flexível que não exerce qualquer stress na estrutura do core. A adição do paptideo BASE leva a uma interacção com a sequência ACID, através da qual ambas as sequências de peptídeos assumem uma conformação rígida helical coiled-coil. Através da ligação bilateral gera-se tensão. Um ACID fixado unilateralmente deveria ser livre de tensões com o peptideo BASE adicional, ou o peptideo BASE funde com outros parceiros passíveis de intera~cção. De qualquer forma, a estrutura particular da proteína de fusão ACID no sistema 38 nucleico contínuo tradicional adquire protease TEV após a divisão da ligação terminal C do transportador nucleico. Núcleo-divisores com sequência exposta ACID podem ser carregados com proteínas estranhas, acopladas ao peptídeo BASE complementar. Esta é uma das várias possibilidades de carregar CLPs split-core posteriormente com moléculas estranhas a escolher.

Através dos mecanismos de acoplamento descritos acima é possível preparar CLPs com uma parte do acoplamento. A proteína fundida com outra parte do acoplamento pode ser acoplada facilmente às CLPs. Desta forma, estruturas não peptídeas podem, por exemplo, ser apresentadas ao sistema imunológico. e) Fusão simultânea de moléculas estranhas distintas no N nucleico e C nucleico

Nos exemplos até então foi sempre fundida uma sequência estranha no N nucleico ou C nucleico. Por princípio podem até duas moléculas estranhas diferentes fundir simultaneamente com o N nucleico e C nucleico; estas podem ser, por exemplo, ambas as subunidades de uma proteína estranha heterodímera. Como modelo foi utilizado um GFP dividido por dois, do qual um segmento, contendo os primeiros 10 dos 11 fios β de GFP, foi fundido com o N nucleico e o segundo segmento, contendo o 11°. fio β de GFP, foi fundido com o C nucleico. A co-expressão de um vector do tipo 1 levou ao surgimento de CLPs verdes fluorescentes. Assim juntaram-se tanto os domínios N nucleicos quanto os domínios C-nucleicos numa estrutura de CLP capaz de associação, assim como ambas as partes GFP se complementaram numa estrutura 3D correcta, formando um cromóforo GFP. O exemplo mostra que é possível uma fusão simultânea de diversas sequências estranhas com N nucleico e C nucleico sob a formação de estruturas funcionais tanto do transportador split-core quanto de ambas as distintas 39 sequências estranhas fundidas com o N nucleico e o C. Exemplo 12 CLPs núcleo-divisoras, as quais apresentam o domínio GBl da proteína G na superfície

Como outro exemplo concreto foi introduzido o denominado domínio GBl da "proteína G", proteína de ligação de imunoglobulinas do Streptococcus spp., funcionalmente aparentado da proteína A, no sistema split-core do HBV. A proteína G consiste igualmente em vários domínios semelhantes. A proteína G se associa como a proteína A a imunoglobulinas, apresentando, entretanto, outras especificidades relativamente à origem da espécie e aos subtipos dos IgGs. Em virtude desta complementaridade entre a proteína G e a proteína A, ambas são oferecidas como reagentes comerciais para comprovantes imunológicos, que se baseiam na ligação a imunoglobulinas diferentes. Como a proteína A, a proteína G e o domínio GBl, oriundo da mesma, ligam a parte constante (Fc) do anticorpo. A parte do anticorpo que reconhece o antígeno permanece acessível à ligação com o antígeno. Assim, uma variedade de anticorpos diversos pode ser ligada.

Neste exemplo o domínio GBl foi introduzido no sistema split-core e mostrou que (i) CLPs foram formadas e que (ii) estas CLPs - porém não as CLPs de controlo sem GBl - são capazes de ligar anticorpos diferentes.

Analogicamente aos exemplos supracitados, o domínio GBl foi fundido geneticamente com o N nucleico ou C nucleico e co-expressado com os C nucleicos respectivamente ausentes ou com os fragmentos N nucleicos.

A sequência específica AS corresponde a AS 229 até 284 da proteína precursora da proteína G (Swiss Prot Accession: P06654); a estrutura 3D é conhecida (PDB Accession: 1 PGA; Ref: Gallagher T, Alexander P, Bryan P, Gilliland GL (1994) Two crystal structures of the BI immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR 40

Biochemistry 33: 4721-4729) coreOlQ-GGGGSGGGGTQ- YKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQY-ANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEdP. A ligação ao N nucleico ocorreu através de um Linker G4SG4TQ; o penúltimo AS K foi substituído por D (letra minúscula na sequência); o resíduo E antecedente é o último AS visível na estrutura de raio-X; através da troca K>D pode ser introduzida uma interface BamHI no nível nucleotídeo (GAg gat cct TAG) ; esta se encontra assim em posição homóloga às contrucções descritas previamente.

Como nos outros exemplos ocorreu uma formação eficiente de partículas, comprovada através da sedimentação através de gradiente de sacaroses, do comportamento em execução no gel de agarose nativo e da microscopia de electrões.

Para comprovar a capacidade de interacção dos domínios GB1 carregados de CLPs, as partículas foram incubadas com imunoglobulinas, em seguida sedimentadas novamente em gradientes de sacarose; aqui existiu uma co-sedimentação nítida dos anticorpos com as partículas. Adicionalmente a ligação IgG pode ser também comprovada pelo facto de que o fragmento GB1 N nucleico em Western Blots reagiu directamente com os conjugados de anticorpos secundários segundo a eletroforese de gel SDS. Também no contexto da fusão no N nucleico, o GB1 modificado foi capaz de renaturar e de se ligar aos seus ligantes IgG.

Para provar que o GB1 ligado às partículas realmente liga imunoglobulinas, uma alíquota da fracção de gradiente de sacarose correspondente foi incubada com um anticorpo de 5nm com marca dourada, um anticorpo não ligado foi separado através de nova sedimentação no gradiente de sacarose e a fracção da partícula foi analisada em microscópio de electrões. As partículas douradas, plenas de electrões, demonstraram a ligação do anticorpo às CLPs intactas. Exemplo 13

Variações contendo GFP e GFP auto-fluorescentes e CLPs 41 split-core, as quais apresentam moléculas estranhas capazes de interacção

Exemplo 11 e) elucida fusões com significado além das aplicações de vacina, sendo que uma molécula de GFP dividida em duas partes (GFP β1-10 e GFP βΐΐ) é associada sob formação de estrutura nativa GFP (fluorescência verde) e sob formação de CLPs, quando GFPL1-10 funde com N nucleico, e GFPLll funde com C nucleico.

No exemplo presente foram fundidas sequências estranhas com GFPfill, sendo estes os dominios GB1 da proteina G ou os pré-domínios "S" das proteínas de superfície do HBV humano, do HBV de patos, ou do HBV das garças. Isto só é possível, porque uma nova zona terminal N surge em GFPLll, que, além disto, está voltado da superfície CLP para fora, através de sua orientação específica para os CLPs núcleo-divisores (split-core). A construção dos plasmídeos de expressão correspondentes ocorreu analogicamente aos processos descritos nos vectores núcleo-divisores (split-core), codificados para fragmentos N nucleicos e C nucleicos separados, neste caso já ligados ao GFPÚ1-10 no N nucleico, e GFPÚll no C nucleico.

Com ajuda dos dados presentes esperava-se que a zona terminal N do segmento GFPÚll estivesse voltado para fora da superfície CLP, e que com isso, a presença de mais um domínio estranho interferiria basicamente na capacidade das partes core N e C-core de formar estruturas de partículas, e não na capacidade das partes GFPÚ1-10 e GFPhll em formar a estrutura GFP nativa. 0 resultado deste exemplo está demonstrado na figura 7 esquematicamente. Nesta figura, as imagens parciais AD demonstram o seguinte: A. Estrutura básica de ambas as partes da proteína de fusão. GFPÚ1-10 fundiu com o N nucleico, GFPÚll com o C nucleico. Uma vez que GFPÚll prepara um nova zona terminal N, outros domínios podem fundir com ele, aqui GB1. B. CLPs auto-fluorescentes surgem através da interacção do 42 N nucleico com o C nucleico (formação de CLP), e de GFPLl-10 com GFPLll (formação do cromóforo GFP), como já demonstrado. Adicionalmente, estes apresentam, no entanto, GB1 de forma acessível em sua superfície. C Anticorpos distintos podem se acoplar aos domínios GB1 através de sua parte Fc. D. Através de suas partes variáveis, os anticorpos podem interagir com seus específicos antígenos. GFP-GBl-CLPs núcleodivisores (split-core) podem substituir assim o anticorpo secundário usual, marcado pela fluorescência, na fluorescência imunológica indirecta. Uma aplicação para a marcação de tubulina em duas células diferentes foi demonstrada na imagem 7. Analogicamente, são possíveis outras aplicações baseadas na ligação de anticorpos a antígenos .

De facto, outros fragmentos ainda mais alterados poderiam ser co-expressos em E. coli e formariam de acordo com a sedimentação em gradiente de sacarose, assim como o comportamento em execução, CLPs no gel nativo de agarose. Adicionalmente, estas CLPs apresentaram a fluorescência GFP típica. Assim, as partes GFP também se encontraram da maneira correcta. 0 exemplo mostra que também as partes GB1, se achavam correctamente convolutas e acessíveis na superfície CLP.

Para comprovar a capacidade de ligação das CLPs que apresentam GB1 auto-fluorescentes aos anticorpos acoplados a antígenos, foram permeabilizados HeLa (do ser humano) ou células LMH (da galinha), em seguida incubados com um anticorpo primário do camundongo contra tubulina. Num caso, as células foram incubadas convencionalmente com um anticorpo secundário, quimicamente marcado por fluorescência (Cy2) do camundongo, ou, como alternativa, com CLPs núcleo-divisoras auto-fluorescentes, apresentando GB1, e em seguida lavadas; por fim, as células foram observadas com o microscópio de fluorescência. 43

Em ambos os casos adquiriram-se imagens fluorescentes comparáveis (como esperado, coloração citoplasmática através da exclusão do núcleo da célula). Assim, os domínios GB1 foram obrigatoriamente capazes de se ligar ao anticorpo primário anti-tubulina, ligado à tubulina. CLPs auto-fluorescentes, split-core, as quais apresentam GB1, podem assim, ser utilizadas para comprovar um anticorpo primário ligado a um antígeno como alternativa a conjugados de anticorpos secundários convencionais, marcados por fluorescência.

Isto prova que os domínios GB1 são capazes, como sempre, de interagir com IgG. Eles devem portanto estar correctamente convolutos. Além disto comprova-se que as CLPs auto-fluorescentes, apresentando GBl, podem ser utilizadas como reactivo geral de detecção (comparável a um anticorpo secundário marcado por fluorescência).

Construções analógicas foram adquiridas com variações de cor de GFP, nas quais mutações conhecidas, que modificam o espectro de absorção e emissão, foram introduzidas na construção GFP presente através de mutagénese direccionada. Variações especificamente amarelo-fluorescentes (Yellow fluorescent protein; YFP) e ciano-fluorescentes (Cyan fluorescent protein; CFP) foram produzidas. Ambas formaram CLPs, que apresentaram os respectivos espectros de absorção típicos. Assim podem ser produzidas GFP-CLPs núcleo-divisores, apresentando GBl, com características cromofóricas diferentes, adequadas para aplicações imuno-fluorescentes variadas. 0 sistema split-core permite a produção de CLPs auto-fluorescentes que apresentam em sua superfície mais uma molécula estranha capaz de interacção. Se esta molécula estranha é GBl, ela é ainda capaz de interagir especificamente com imunoglobulinas, mesmo que estas estejam ligadas ao seu antígeno final. Disto obtém-se uma possibilidade de aplicação nova que excede as aplicações de 44 vacina, ou seja a prova directa, via fluorescência, da obtenção de antigenos diferentes através das CLPs auto-fluorescentes. Especialmente adequados são estas CLPs auto-fluorescentes, split-core para aplicações diagnósticas e analíticas.

CLPs auto-fluorescentes split-core que apresentam outros dominios como GB1 da proteína G

Os resultados acima mostram que CLPs split-core, as quais contêm adicionalmente um GFP dividido em dois, podem apresentar mais um domínio estranho, GB1, em forma funcional, ou seja capaz de interagir com o ligante específico IgG. Contudo, o GB1 é um domínio relativamente pequeno com menos de 60 AS. Para comprovar a possibilidade de generalização foram produzidas construções homólogas, nas quais GB1 são substituídos por domínios pré-"S" das proteínas grandes de cobertura dos HBVs do ser humano (HBV), pato (DHBV) e garça (HHBV). Estes domínios transportam uma ligação específica dos respectivos vírus a suas células finais específicas, isto é, hepatócitos das espécies anfitriãs correspondentes. Com 108 AS para HBV, e ca. 16 0 AS para DHBV e HHBV pré-"S" elas são nitidamente maiores que GB1 e, além disto, em sua sequência de GB1 diferentes, mas também diferentes entre si.

Todos os três domínios foram, analogicamente a GB1, inseridos em proteínas de fusão GFP split-core (vide fig. 7; ao invés de GB1 os domínios pré-"S" correspondentes). Todos os 3 formaram CLPs eficientes, como através da sedimentação de gradiente de sacarose, do comportamento em execução na electroforese nativa do gel de agarose, assim como comprovado através da microscopia de electrões; as CLPs demonstraram a fluorescência típica GFP (ou seja, as partes GFP estavam associadas à estrutura 3D correcta da GFP); além disto, as CLPs pré-"S" do DBHV e do HBV reagiram com anticorpos monoclonais contra pré-"S" do HBV e pré-"S" do DHBV; um anticorpo correspondente contra o pré-"S" do 45 vírus da garça não está disponível no momento.

Uma outra aplicação é o rastreamento dos receptores celulares para os respectivos vírus. Pode-se presumir que através do grande número (240) de domínios pré-"S" por partícula, as CLPs possuam uma avidez enormemente elevada para os receptores, de modo que estes podem ser ligados com estabilidade e assim identificados. Células portadoras de receptores seriam identificadas através da fluorescência GFP das CLPs através da microscopia de fluorescência ou FACS; moléculas receptoras solubilizadas de tais células seriam incubadas com CLPs e seriam enriquecidas durante a sedimentação seguinte em sacaroses de gradientes em fracções típicas de gradientes de partículas.

Exemplo 14

CLPs split-core com OspA no N nucleico produzem títulos superiores, com OspA no C nucleico títulos inferiores em anticorpos anti-OspA protetores como LipOspA

Como demonstrado na figura 5, pode-se influenciar objectivamente a orientação de uma proteína através do acoplamento ao N nucleico ou C nucleico. No caso da OspA, expõe-se bem assim o epítopo do anticorpo monoclonal LA-2 reconhecidamente neutralizante que se encontra no terminal C (fusão no N nucleico) ou, ao contrário, a área OspA do terminal N, na qual não há epítopos neutralizantes conhecidos (fusão no C nucleico). Como demonstrado na figura 4, resultam ambas as CLPs de OspA núcleo-divisoras (grupo 2 para N nucleico-, e grupo 6 para fusão C-core) em titulos completos de anticorpos anti-OspA, a parte de anticorpos equivalentes LA-2 é, entretanto, - como se espera da estrutura - essencialmente bem mais alta ao fundir com o N nucleico.

Entretanto, trata-se aqui de dados in vitro. Para determinar o potencial protector dos anticorpos induzidos in vivo, foi registada a capacidade dos soros de imunidade respectivos para neutralização de uma infecção com B. 46 burgdorferi provocada artificialmente num modelo de camundongo estabelecido (ver Nassal et al, Eur. J. Immunol. 2005; p. 655-665) . Camundongos SCID foram inoculados com os soros imunológicos correspondentes, 2 horas mais tarde ocorreu s.c. challenge com cada 103/ espiroquetas de camundongos. Em camundongos desprotegidos, isto causa regularmente uma infecção, que se exprime pela sintomática da artrite, registada de forma semiquantitativa na articulação tibio-torsal. Como controlo negativo serviram grupos de 3 camundongos que receberam, cada um, apenas o soro do camundongo comum. Como controlo positivo serviram grupos de 6 camundongos que receberam, cada um, o anticorpo LA2 monoclonal neutralizante adequado, ou anticorpos induzidos com LipOspA. Os grupos de teste (igualmente com 6 animais cada) receberam soros imunológicos, adquiridos através de OspA split-core com OspA no N nucleico ou dito C nucleico. Para registar diferenças quantitativas ocorreu uma imunização passiva uma vez com mit 5 |mg e uma vez com 1 |mg de LA2 ou de volumes equivalentes a estas quantidades de LA2 com soros imunológicos de LipOspA ou OspA split-core no N nucleico em animais vacinados. Os resultados foram demonstrados na fig. 8.

Em virtude da parcela exígua de anticorpos equivalentes a LA2 nos soros imunológicos obtidos através da OspA split-core com OspA no C nucleico, foram utilizados volumes equivalentes de OspA split-core com OspA no N nucleico, sem levar em consideração o título equivalente de LA2. Arthritis scores foram detectadas nos dias Tag 13, 17, 21, 28, 35, 45 e 52. Os resultados para o dia 52 foram resumidos na figura 8.

Todos os animais inoculados com soro de camundongo comum desenvolveram, como era esperado, artrite. A protecção através do anticorpo monoclonal LA-2 foi reduzida na sua dose de 5 a 1 |mg de 4/6 a 1/6 animais. Através do soro imunológico da LipOspA foram protegidos 5/6 animais. 47 A imunização passiva com soros imunológicos via OspA split-core com OspA no N nucleico protegeu todos os animais (6/6) de infecções, mesmo sob dosagem exigua. OspA no C nucleico apresentou actividade nitidamente inferior (4/6 animais com alta dosagem, 1/6 animais com baixa dosagem, foram protegidos). CLPs de OspA split-core com OspA no N nucleico levam a titulos elevados de anticorpos equivalentes a LA2 e estes são protectores in vivo. 0 potencial protector excede aquele dos anticorpos induzidos com LipOspA. CLPs de OspA split-core com OspA no C nucleico induzem titulos completos elevados de anticorpos anti-OspA. Estes são porém apenas em quantidade exigua equivalentes a LA-2 e possuem apenas potencial neutralizante inferior. Fusão de um antigeno estranho no N nucleico causa assim uma resposta qualitativamente distinta da fusão no C nucleico.

Exemplo 15

Proteína cirumporozóide (CSP) do agente patogénico da malária Plasmodium falciparum CSP de tamanho completo no sistema split-core induz uma reacção de imunidade mais forte e mais ampla do que a sequência repetitiva de CSP imuno-dominante no sistema nucleico convencional e contínuo.

Até então foi demonstrado que o CSP completo com um comprimento de 319 AS se deixa exprimir exclusivamente no sistema split-core sob a formação de CLP; no sistema convencional contínuo isto não foi possível.

Uma versão encurtada sem o domínio terminal C rico em cisteína (doravante CSPshort) se deixa apresentar no sistema contínuo convencional; a proteína apresenta, entretanto, depois de poucos dias, uma forte tendência à precipitação. No sistema split-core esta tendência não se apresenta, o que comprova a existência de características químico-proteicas superiores.

Uma especialidade do CSP é a presença de uma repetição 48 múltipla de motivos tetra-peptídeos NANP e NVDP (na versão de comprimento completo utilizada aqui motivos de 24 NANP e 3 NVDP); estes são reconhecidamente imunógenos e descreve-se uma vacina experimental baseada no sistema nucleico continuo convencional. Para um estudo de imunogenidade comparativa foi produzida uma construção correspondente convencional com a sequência de repetição produzida NAN-PNVDP (NANP) 3NVDP entre o núcleo AS D78 e S81, que - como esperado, uma vez que a inserção é pequena - formou CLPs. Isto serviu num estudo de imunogenidade como comparação para CSP de comprimento completo e o CSPshort terminal C. Camundongos foram imunizados com as mesmas quantidades respectivas dos CLPs correspondentes (20 |mg/camundongo) ; após 2, 4, 6 e 8 semanas, as quantidades de anticorpos formados foram definidas por ELISA; em seguida ocorreu uma imunização boost (análoga à primeira), e os títulos foram redefinidos 2, 4 e 6 semanas após o boost. Como antigenos de teste serviram CSP recombinantes (como proteína de fusão do E. coli), peptídeos NANP e NVDP, assim como HbcAg recombinante, a fim de definir a reacção da célula B contra o transportador. Os antigenos foram imobilizados em placas de ELISA, depois testados com duas séries duplas de diluições dos soros imunológicos. A diluição máxima resultante de um sinal sobre a superfície de fundo foi indicada na figura 9.

Disto resultam as seguintes conclusões: a) Reacção da célula B contra CSP recombinante

Todos os três imunógenos resultam uma reacção extremamente forte contra CSP; para CSP de comprimento completo esta reacção é ainda 4 vezes maior (Título: 1 : 12 x 106 contra 1 : 3 x 106 para CSP repetitivo ou curto) ; isto significa que uma diluição do soro imunológico de 12 milhões de vezes ( ! ) ainda assim é capaz de reconhecer a proteína CSP. b) Reacções da célula B contra peptídeos repetitivos NANP e 49

NVDP

As reacções contra peptídeos NANP são semelhantes, como era de se esperar, para todas as construções. As reacções mais raras contra o peptídeo NVDP são semelhantes, na construção CSP de comprimento completo, entretanto, nitidamente mais elevadas logo após a primeira imunização (sem boost) (Titulo 1: 2.5 x 104 vs. 1 : 5 x 103) . c) Reacções da célula B contra sequências CSP não encontradas na repetição

Exclusivamente CSPshort e CSP de comprimento completo induzem uma reacção contra os peptídeos CSP12 (EEPSDKHIEQYLKKIQNSLS; Pos. 246-264 na construção de comprimento completo núcleo-divisora) e CSP8 (GNGIQVRIK-PGSANKPKDELD; Pos. 274-294 na construção de comprimento completo núcleo-divisora). A falta de reacções correspondentes após a imunização com o peptídeo repetitivo no sistema nucleico continuo é esperada, já que as sequências CSP8 un CSP12 não estão lá contidas. 0 significado do resultado é o de que principalmente o CSP de comprimento completo pode ser produzido exclusivamente no sistema split-core. Com o sistema split-core, epítopos adicionais podem ser activados, contribuindo para o efeito protector da vacina. d) Reacções da célula B contra o transportador nucleico

Tanto o CSPshort quanto o CSP completo provocam no sistema split-core uma reacção cerca de 25 vezes menor contra o transportador nucleico do que o peptídeo repetitivo no sistema contínuo (Titulo 1: 1,25 x 105 vs. 3 x 106). Já que a reacção desejada contra a proteína estranha é tão (CSPshort) ou mais elevada (CSP completo) quanto a aplicação do peptídeo de repetição no sistema nucleico contínuo, a imunogenidade específica ou sequência estranha inserida durante a aplicação do CSP curto, e especialmente do CSP completo, é essencialmente melhor no sistema split-core. A isto junte-se o fato de que uma 50 reacção forte contra o transportador nucleico dificulta o diagnóstico diferencial de pessoas anti-HbsAg positivas (infecção contra anti-HBsAg através da vacinação); uma reacção inferior do transportador antinucleico é, portanto, bem-vinda.

e) CSP de comprimento completo no sistema split-core activa células T

Para comprovar a indução de uma reacção da célula T, células do baço dos camundongos foram imunizadas respectivamente com HBcAg ou com um peptideo conhecido da célula T (HBc 120-140) ou com CSP ou estimuladas com os peptideos de CSP NANP e CSP8, e foi medida, em seguida, a produção de IL-2. Todas as construções levaram a um surgimento de células T, activáveis através de HBcAg, HBcl20-140, CSP e NANP. Exclusivamente células do baço com CSP completo de camundongos imunizados no sistema split-core eram passíveis de activação através do peptideo CSP8 a produzir IL-2.

Também no âmbito da célula T a construção do CSP de comprimento completo provoca uma reacção mais abrangente do que a construção contínua apenas do peptideo repetitivo. 51

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. No entanto o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 0177158 A [0003] [0010] • US 20030198649 A [0003]

Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • KRATZ et al. PNAS, 1999, 1915-1920 [0003] • NASSAL et al. Eur.J.Immunol., 2005, 655-665 [0004] • SKAMEL et al. Journal of Biological Chemistry, 2006, 17474-17481 [0004] • GALIBERT et al. Nature, 1979, 646-650 [0010] • NASSAL. Gene, 1988, 279-294 [0010] • BILLAUD JN et al. Advantages to the use of rodent hepadnavirus core proteins as vaccine platforms. Vaccine, 19. Februar 2007, vol. 25 (9), 1593-606 [0013] • ULRICH et al. Adv. Virus Res., 1998, 141-182 [0030] • DAS; YANOFSKY. Nucl. Acids Res., 1989, 9333-9340 [0070] • OPPENHEIM ; YANOFSKY. Genetics, 1980, 785-795 [0070] • 0'SHEA et al. Peptid-Velcro''= Peptid-Klettverschluss. via coiled—coil Formation der Peptide, 1993 [0105] • GALLAGHER T ; ALEXANDER P ; BRYAN P ; GILLILAND GL. Two crystal structures of the BI immunoglobulin- binding domain of streptococcal protein G and comparison with NMR. Biochemistry, 1994, vol. 33, 4721-4729 [0113] • NASSAL et al. Eur. J. Immunol., 2005, 655-665 [0132]

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Sistema transportador split-core (core dividido) que apresenta os domínios N-core e C-core da proteína do core de um vírus da hepatite B como polipeptídeos separados e, pelo menos, uma molécula estranha baseada em peptídeos contra a qual uma reacção imunológica deve ser provocada, sendo que a molécula estranha está fundida com a zona terminal C do domínio N-core ou com a zona terminal N do domínio C-core e sendo que a proteína do core pode formar partículas semelhantes a capsídeos e a molécula estranha está fundida com um aminoácido da proteína do core que se encontra entre a posição 73 e 94 da proteína do core.

2. Sistema transportador split-core, segundo a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de que o vírus da hepatite B é específico para mamíferos.

3. Sistema transportador split-core, segundo a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de que a proteína do core apresenta a sequência de um vírus da hepatite B humana.

4. Sistema transportador split-core, segundo a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de que a proteína do core apresenta a sequência de aminoácidos do HBV da marmota norte-americana.

5. Sistema transportador split-core, segundo as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de que a molécula estranha é a sequência de aminoácidos de uma proteína de uma bactéria patogénica.

6. Sistema transportador split-core, segundo as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de que a molécula estranha é a sequência de aminoácidos de uma proteína de um eucariota patogénico, principalmente do agente patogénico causador da malária, Plasmodium falciparum.

7. Sistema transportador split-core, segundo as 2 reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a molécula estranha é a sequência de aminoácidos de uma proteína de um vírus.

8. Sistema transportador split-core, segundo as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de que a molécula estranha é a sequência de aminoácidos de uma proteína com potencial patogénico referenciado, principalmente uma proteína marcadora de tumores.

9. Processo para produção de um transportador de proteínas estranhas, contra a qual uma reacção imunológica deve ser induzida, apresentando, por um lado, a sequência proteica do antígeno do core de um vírus da hepatite B e, por outro lado, uma sequência proteica heteróloga como molécula estranha, sendo que a sequência proteica heteróloga está fundida com os domínios N-core ou C-core a jusante da posição 73 e a montante da posição 94 do core da hepatite B, e sendo que a cadeia de polipeptideos do transportador é interrompida a jusante do domínio N-core ou a montante do domínio C-core, caracterizada pelo facto de que ou o dominio N-core e a sequência proteica heteróloga ou o domínio C-core e a sequência proteica heteróloga são expressos separadamente como proteínas de fusão ou sendo que uma sequência de reconhecimento para uma protease é inserida entre o domínio N-core e uma sequência proteica heteróloga ou entre o domínio C-core nucleico e uma sequência proteica heteróloga e a vacina split-core é cindida em dois polipeptídeos pela protease após a expressão, mas antes da aplicação, e são formadas partículas semelhantes a capsídeos.

10. Processo segundo a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de que a sequência proteica heteróloga é ligada por fusão a jusante do aminoácido 74 e a montante do aminoácido 85 do antígeno do core da hepatite B.

11. Processo segundo uma das reivindicações 9-10, caracterizado pelo facto de que a sequência proteica 3 heteróloga estranha tem o comprimento de pelo menos 40 aminoácidos.

12. Processo segundo a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de que a sequência proteica heteróloga estranha tem o comprimento de pelo menos 120 aminoácidos.

13. Processo segundo a reivindicação 9-11, caracterizado pelo facto de que dois polipeptídeos separados são expressos com auxílio de um vector bicistrónico, sendo que um dos polipeptídeos compreende o domínio N-core e o outro polipeptídeo compreende o domínio C-core e a sequência da proteína heteróloga é fundida com a zona terminal C do domínio N-core ou com a zona terminal N do domínio C-core.

14. Medicamento que apresenta partículas semelhantes a capsídeos caracterizado pelo facto de que estas partículas apresentam um sistema transportador split-core segundo uma das reivindicações 1 a 8.

15. Medicamento segundo a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de que se trata de uma vacina.

16. Meio diagnóstico que apresenta partículas semelhantes a capsídeos, caracterizado pelo facto de que estas partículas apresentam um sistema transportador split-core segundo uma das reivindicações 1 a 8.