PT2064327T - Dbait e suas utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DBAIT E SUAS UTILIZAÇÕES"

Esta invenção refere-se a composições e métodos de interferência com vias de reparação de DNA em células de mamífero. A invenção refere-se particularmente a moléculas de ácido nucleico que interferem nas vias de deteção, sinalização e/ou reparação de danos do DNA, em particular a via de junção de extremidades não homólogas (NHEJ) da reparação de quebras da cadeia dupla (DSB), bem como as suas utilizações, particularmente para desencadear a letalidade celular de tumores submetidos a terapias anticancerígenas. A invenção refere-se a uma nova classe de moléculas de ácido nucleico, denominadas "isco DSB" ou "Dbait", que podem ser utilizadas numa variedade de condições terapêuticas em sujeitos mamíferos, para interferir nas vias de reparação de DSB do DNA.

Antecedentes da Invenção A radioterapia e a quimioterapia, separadamente ou combinação com a cirurgia, são arsenais terapêuticos essenciais contra o cancro humano.

As radiações ionizantes causam quebras da cadeia dupla (DSBs) direta ou indiretamente e desencadeiam a morte celular/tecido (necrose ou apoptose). 0 efeito citotóxico da radiação ionizante constitui a base da radioterapia, que é amplamente utilizada no tratamento do cancro humano. A eficácia da radioterapia é atualmente limitada pela radio-resistência de certos tumores (por exemplo, glioblastoma, carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço) e pelos efeitos secundários causados pela irradiação de tecidos normais próximos (por exemplo, no tratamento de cancro de mama e cancro cervical).

Nos últimos anos, muitos estudos se concentraram em mecanismos biológicos relacionados com resposta à radiação ionizante, a fim de obter conhecimento sobre a complexidade dos fenómenos subjacentes à radiosensibilidade ou à radio-resistência das células tumorais. A compreensão das diferentes vias que regulam de modo preciso a resposta às radiações ionizantes é um passo importante para a identificação de alvos moleculares para novos fármacos e terapias que, em associação com a radioterapia, podem melhorar as hipóteses de recuperação de tumores altamente resistentes à radiação, tais como tumores do cérebro ou cabeça e pescoço. 0 uso de agentes quimioterapêuticos pode causar danos ao DNA, incluindo DSBs diretas ou indiretas. Os exemplos de famílias de agentes quimioterapêuticos (citotóxicos químicos) utilizados na maior parte são: inibidores de topoisomerases I ou II (camptotecina/topotecano, epirrubicina/etopósido), agentes de reticulação do DNA (cisplatina/carboplatina/oxaliplatina) , agentes de alquilação do DNA (carmustina/dacarbazina) ou agentes anti-metabólicos (5-fluorouracilo/gemcitabina/capecitabina), bem como inibidores do fuso mitótico (pad it axel /doce taxel/vinorelbina) . 0 progresso recente no desenvolvimento de fármacos biológicos (anticorpos monoclonais, inibidores de citocinas/cinase, imunoterapias/vacinas) provou sua eficiência e especificidade em relação a um subconjunto de tumores. Mas estes são frequentemente usados em combinação com substâncias químicas citotóxicas. Apesar de muitos progressos no desenvolvimento de novos fármacos citotóxicos, a resistência a medicamentos na quimioterapia ainda é uma grande preocupação clínica no tratamento do cancro. A compreensão do mecanismo de resistência a medicamentos relacionada com a absorção/efluxo de fármacos, degradação metabólica, mutagénese do alvo, reparação melhorada, marcação da morte celular (apoptose e necrose) é essencial para garantir a eficiência da quimioterapia e melhorar o índice terapêutico, especialmente em alguns tumores resistentes ao tratamento. A associação entre quimioterapia e radioterapia foi amplamente utilizada no tratamento do cancro. Embora ainda não esteja completamente elucidada, a base biológica da ação dos citotóxicos depende de mecanismos celulares, como o ciclo celular ou a degradação do DNA, o que também é importante para a morte celular induzida por radioterapia, levando a benefícios aditivos ou mesmo melhores sinérgicos ao combinar diferentes tratamentos em terapias contra o cancro.

Na última década, muitas investigações foram realizadas neste campo, e a complexidade da transdução de sinal em resposta à radiação começou a ser delineada. A este respeito, os genes de interesse particular para serem direcionados com radiações ionizantes são aqueles envolvidos na regulação de mecanismos de letalidade induzidos por radiação, como apoptose ou reparação de DNA. Como as DSBs são os danos mais letais do DNA, a eficácia das radiações ionizantes diminui à medida que aumenta a reparação de DSB.

Dois mecanismos estão envolvidos na reparação de DSBs: via de junção de extremidades não homólogas (NHEJ, via independente da sequência) e recombinação homóloga (HR, via dependente da sequência) (revisão por Jackson, 2002) . Os genes alvo envolvidos nestas duas vias principais de reparação de DSB conduziram até agora a radiosensibilidade baixa ou moderada, dependendo das abordagens usadas e das linhas celulares de cancro (Belenkov et al., 2002; Marangoni et al., 2000; Ohnishi et al., 1998).

As proteínas Ku (por exemplo, Ku70 e Ku80) e DNA-PKcs são importantes na reparação de DSBs de DNA induzidas por radiação ou quimioterapia. Se o dano não puder ser reparado a tempo, as células morrem. Portanto, elas representam alvos moleculares potencialmente interessantes para a sensibilização de células e tecidos alvo para radioterapia e quimioterapia. Muitas abordagens foram assim concebidas e realizadas para tentar inibir essas proteínas chave (Ku70/Ku80, DNA-PKcs, etc.) envolvidas na via NHEJ, que é predominante em células de mamífero: 1) Inibidores de PI3K (fosfatidilinositol-3-cinase) (isto é, DNA-PKcs, ATM, ATR) (Boulton et al. , 2000; Durant & Karran, 2003; Willmore et al., 2004; Vauger et al., 2004); 2) Dominante negativo e péptidos (C-terminal de KU80) (Marangoni et al., 2000; Kim et al., 2002); 3) Fragmentos variáveis de anticorpos de cadeia única (scFv) (DNA-PKcs) (Li et al., 2003); 4) Aptâmeros de RNA (SELEX: Ku de ligação a RNA) (Yoo & Dynan, 1998); 5) Antissentido (Ku70, Ku80, DNA-PKcs) (Li et al., 2003b; Marangoni et al., 2000; Sak et al., 2002); 6) siRNA (DNA-PKcs) (Peng et al., 2000).

Apesar desses enormes esforços, a combinação de genes alvo envolvidos em vias de reparação do DNA e terapias do cancro ainda está em estágio experimental inicial e nenhum estudo clinico mostrou nenhum beneficio comprovado até o momento. É de referir que as abordagens descritas acima têm em comum uma caracteristica: eles têm como alvo um único efetor (proteína) envolvido numa via de cascata complexa (como NHEJ) com possível derivação ou compensação.

Sumario da invenção 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não se enquadra nas reivindicações é fornecida apenas para informação. A presente divulgação refere-se a novas composições e métodos de interferência com vias de reparação do DNA em células de mamífero. A divulgação refere-se particularmente a moléculas de ácido nucleico que interferem, de uma maneira não específica de gene, com a deteção de danos do DNA, vias de sinalização e/ou reparação, bem como aos seus usos, particularmente para desencadear a letalidade celular de tumores submetidos a terapia anticancerígena.

Os inventores descobriram que a sensibilidade das células a terapias que causam danos ao DNA direta ou indiretamente pode ser melhorada usando moléculas pequenas de dsDNA (modificadas quimicamente ou não) que atuam como mímicos de fragmentos de DNA danificado e são reconhecidos como locais DSB induzidos pelos tratamentos que causam danos ao DNA (ou seja, os mímicos do substrato de DSB).

Como mostrado nos exemplos, as moléculas desta divulgação são eficazes in vitro, bem como in vivo, e podem ser usadas para conferir ou aumentar a sensibilidade de qualquer célula tumoral à terapia anticancerígena que danifica o DNA.

Um objeto da invenção relaciona-se assim com tais moléculas de dsDNA, também designadas pelo nome de moléculas "isco DSB" (abreviadamente Dbait), que são capazes de aumentar a resposta de tumores resistentes ao tratamento para radioterapia e quimioterapia. Como será divulgado posteriormente neste documento, as moléculas Dbait agem atraindo e sequestrando o holocomplexo de enzimas de reparação de DNA, e assim interferindo nos processos de deteção, sinalização e/ou reparação de lesões de DNA. Esta nova abordagem é chamada de "isco de DNA".

Num aspeto preferido, a divulgação refere-se a uma molécula Dbait que é uma molécula de ácido nucleico, em que a referida molécula compreende uma porção de cadeia dupla de pelo menos 24 pb, tem pelo menos uma extremidade livre, é desprovida de CpG, tem menos do que 70% de identidade de sequência para qualquer gene num genoma humano, compreende um ou vários fosforotioatos ou nucleótidos com estrutura base de metilfosfonato na extremidade de cada cadeia ou pelo menos na extremidade 3' da cadeia, e em que a referida molécula é um substrato para ligação pelo menos uma proteína Ku envolvida na via NHEJ de reparação de quebras da cadeia dupla (DSB). Preferencialmente, a molécula Dbait é selecionada do grupo que consiste em Dbait32Ha, Dbait32Hb, Dbait32Hc, Dbait32Hd, Dbait32Hc-3'mp, Dbait32Hc-5'3'mp, Dbait32Hc-Cy3, Dbait32Hc-Cy5 e Dbait32Hd-FITC. Ainda mais preferencialmente, a molécula Dbait é Dbait32Hc.

Um outro aspeto desta descrição reside numa composição compreendendo uma molécula Dbait e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Num aspeto particular, a composição é adequada para via oral ou para injeção intravenosa, intratumoral ou subcutânea, ou para injeção ou infusão intracraniana ou intra-arterial ou para administração tópica.

Um aspeto adicional desta descrição reside numa molécula Dbait em combinação com (a) agente(s) físico(s) e/ou químico(s) que podem causar, de forma direta ou indireta, as DSBs do DNA. Em particular, a divulgação refere-se a um produto farmacêutico compreendendo uma molécula Dbait da divulgação e um agente químico que pode, direta ou indiretamente, causar quebras da cadeia dupla do DNA como uma preparação combinada para utilização no tratamento de cancro. Preferencialmente, a molécula Dbait deve ser administrada antes ou juntamente com o agente químico.

Um outro aspeto desta divulgação é um método para tratar um distúrbio proliferativo (por exemplo, um cancro) utilizando uma combinação de uma molécula Dbait e uma terapia que causa direta ou indiretamente dano(s) no DNA. Assim, a presente divulgação diz respeito à utilização de uma molécula Dbait da divulgação para a produção de um medicamento para o tratamento de cancro a ser utilizado em combinação com uma terapia anticancerígena que danifica o DNA. Em particular, a terapia anticancerígena que danifica o DNA é selecionada a partir de radioterapia e quimioterapia. Preferencialmente, a molécula Dbait deve ser administrada antes da radioterapia. Alternativamente, a molécula Dbait é administrada antes ou juntamente com a quimioterapia. Num aspeto particular, a molécula deve ser administrada por via oral ou por injeção intravenosa, intratumoral ou subcutânea, ou por injeção ou infusão intracraniana ou intra-arterial ou para administração tópica. Preferencialmente, o cancro é selecionado do SNC, cabeça e pescoço, colorretal, figado, trato gastrointestinal, trato genito-urinário, pulmão, pele, cancro de mama e cancro cervical.

Outro aspeto da divulgação refere-se à utilização de moléculas Dbait para fazer um adjuvante terapêutico anticancerigeno para aumentar a eficiência do tratamento contra o cancro, particularmente para os tumores que respondem fracamente a radioterapia e/ou quimioterapia.

Um outro aspeto desta descrição é um método para aumentar a sensibilidade do tumor a uma terapia anticancerigena que danifica o DNA, compreendendo o método a administração a um sujeito de uma molécula Dbait como definido acima.

Consequentemente, a presente divulgação diz respeito à utilização de uma molécula Dbait da divulgação para a produção de um medicamento para aumentar a sensibilidade do tumor a uma terapia anticancerigena que danifica o DNA. Em particular, a terapia anticancerigena que danifica o DNA é selecionada a partir de radioterapia e quimioterapia. Preferencialmente, a molécula Dbait deve ser administrada antes da radioterapia. Alternativamente, a molécula Dbait é administrada antes ou juntamente com a quimioterapia. Numa forma de realização particular, a molécula deve ser administrada por via oral ou por injeção intravenosa, intratumoral ou subcutânea, ou por injeção ou infusão intracraniana ou intra-arterial ou para administração tópica. Preferencialmente, o cancro é selecionado do SNC, cabeça e pescoço, colorretal, figado, trato gastrointestinal, trato genito-urinário, pulmão, pele, cancro de mama e cancro cervical.

Um outro aspeto desta divulgação é um método de tratamento do cancro, compreendendo o método a administração a um sujeito, uma molécula Dbait em combinação com uma terapia anticancerigena que danifica o DNA.

Um outro aspeto desta divulgação é uma composição para utilização em associação com um tratamento de quebra de DNA, particularmente radioterapia ou quimioterapia, a referida composição compreendendo pelo menos uma molécula Dbait em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz a ser introduzida no núcleo das células tumorais. A invenção pode ser usada para conferir sensibilidade a terapia do cancro em vários tipos de cancros em sujeitos mamíferos, particularmente em sujeitos humanos, tais como cancros sólidos e leucemia, particularmente cancros resistentes a quimioterapia ou radioterapia.

Descrição das Figuras

Figura 1.1: Ensaios de alteração da mobilidade eletroforética realizados em diferentes moléculas Dbait marcadas radioativamente com 32P na presença de várias quantidades de extrato nuclear ( 0, 10, 20, 40, 80, 160, 320 ng/pL) de células Hep2. As bandas deslocadas foram numeradas 1 e 2. A banda 3 é o poço de carregamento.

Figura 1.2: Identificação da presença de proteínas Ku nas bandas retardadas de diferentes moléculas Dbait marcadas radioativamente com 32P que envolvem proteínas no extrato nuclear celular Hep2 (0, 20, 80, 320 ng/pL). Na linha a-Ku, é indicado quando os anticorpos anti-Ku foram adicionados ( + ) ou não (-) à reação de ligação antes do carregamento da amostra no gel. As bandas deslocadas foram numeradas 1, 2 e 3 e uma estrela foi adicionada ao número para bandas que mostram uma migração deslocada após a ligação de anti-Ku.

Figura 1.3: Ensaio de união de extremidades de DNA com 20 pg de extrato de proteína nuclear Hep2. Painel superior: a ligação de fragmentos de DNA marcados com 0,2 pM de 32P na ausência e na presença de Dbait 20 pM em 20 pL de tampão de ensaio em vários tempos. As bandas 1-4 indicam os fragmentos iniciais de DNA de 605 pb (monómeros [1]), os produtos de ligação que migram como dímeros [2], trímeros [3] ou tetrâmeros [4] . Painel inferior: a percentagem de produtos de ligação foi quantificada e mostrada em função do tempo (diamantes, sem Dbait, círculos com 200 nM Dbait32H), e em função da estrutura química das moléculas Dbait (após 2 horas de incubação com 200 nM de diferentes Dbait).

Figura 1.4: Ensaio de atividade da proteína cinase dependente do DNA (DNA-PK) em 1,5 pg de extrato de proteína nuclear Hep2 de um número de 2 pg de moléculas Dbait com vários comprimentos, sequências e estruturas químicas, incluindo as estruturas base modificadas: Dbait32ss e Dbait32css são dois DNA de cadeia simples de 32-nt; Dbait32C é um DNA de dupla cadeia dumbbell de 32 pb (sem extremidade abrupta livre); Dbait8H, DbaitlôH, Dbait24H e Dbait32H são DNA de cadeia dupla com uma forquilha de 8, 16, 24 e 32 pb, respetivamente. Dbait32H,

Dbait32Hb, Dbait32Hc e Dbait32Hd são DNA de forquilha de 32 pb com sequências diferentes, mas a mesma composição de bases; Dbait32d-F e DbaitHc-cy3 são fluoresceina e cianina 3 marcando Dbait32Hd e Dbat32Hc, respetivamente; Dbait32H-po é um fosfodiéster Dbait32H de tamanho completo, em comparação com outras moléculas Dbait que possuem fosforotioato de 3 pb na extremidade abrupta livre, exceto DbaitHc-3'mp e Dbait32Hc-5'3'mp que possuem 3-n-metilfosfonato quer na extremidade 3' ou em ambas as extremidades 5' e 3', respetivamente. Dbait32Hc5'5' tem uma ligação 3'-3', exibindo assim uma extremidade abrupta 5'/ 5'; ver tabela 1.1 e tabela 1.2 para os detalhes dessas moléculas Dbait. Os dados representam o valor médio e o desvio padrão de pelo menos 3 experiências independentes.

Figura 2.1: Ensaio de sobrevivência clonogénica de células de Hela após irradiação de 4x0,5Gy (espaçadas 2 horas) realizada com raios γ de uma fonte de 137Cesium na presença de várias moléculas Dbait. Painel A: Dependência da dose do número de clones sobreviventes normalizada na presença de Dbait32 e Dbait32H. Painel B: Número de clones sobreviventes normalizado na presença de diferentes moléculas Dbait a 83 nM (concentração em meio de cultura) .

Figura 2.2: Ensaio adicional de sobrevivência clonogénica de células de Hela após irradiação de 4x0,5Gy (espaçada 2 horas) realizada com raios γ de uma fonte de 137Cesium na presença de várias moléculas Dbait. Painel superior: Dependência da dose do número de clones sobreviventes normalizada na presença de Dbait32H e Dbait8H. Painel inferior: número de clone sobreviventes normalizado na presença de 2 pg de diferentes moléculas Dbait.

Figura 2.3: Inibição da integração ilegítima aumentada por radiação de um fragmento de plasmídeo linear (2 pg) que transporta o gene que codifica a resistência à neomicina por 2 pg de moléculas Dbait32H.

Figura 2.4: Ensaios adicionais da inibição da integração ilegítima aumentada por radiação de um fragmento de plasmídeo linear (2 pg) que transporta o gene que codifica a resistência à puromicina por várias moléculas Dbait32 (2 pg) . Painel superior: Dependência da dose da molécula Dait32H na presença de irradiação fracionada (4x0,5Gy) (círculos preenchidos) ou na ausência de irradiação (triângulos cheios); Painel inferior: A eficiência da integração do plasmídeo na presença de 2 pg de várias moléculas Dbait ou inibidores de DNA-PK a 200 pM (wortmanina ou NU7026) e com (preto) ou sem irradiação (cinza) .

Figura 2.5: Imunodeteção de locais de quebra de cadeia dupla (DSB) como revelado pelos focos γ-Η2ΑΧ em células Hela transfectadas por moléculas fluorescentes Dbait32H-FITC às 2 horas após a irradiação de 2Gy. Painel esquerdo: fluorescência de Dbait32H-FITC (pontos e manchas brilhantes) e locais DSB detetados pela imunofluorescência do anticorpo γ-Η2ΑΧ em núcleos; Painel direito: a mesma imagem de núcleos com locais DSB detetados por imunofluorescência do anticorpo y-H2AX e contra coloração DAPI. As setas no canto inferior esquerdo mostram a ausência do sinal Dbait32H-FITC e y-H2AX no núcleo. As setas no canto superior direito mostram os sinais Dbait32H-FITC e γ-Η2ΑΧ co-localizados.

Figura 2.6: Painel superior: fosforilação da histona H2AX por PIKKs. Os extratos celulares totais foram analisados por Western blot para o nivel da forma fosforilada da histona H2AX (γ-Η2ΑΧ) em comparação com a proteína H2AX total. As células Hep2 foram transfectadas 5 horas com várias moléculas Dbait 32Hc, 24H, 16H e 8H durante 5 h, ou não transfectadas. Elas foram irradiadas no final da transfecção, incubadas durante uma hora e depois analisadas. As resultantes são apresentadas como histograma da razão normalizada de γ-Η2ΑΧ/Η2ΑΧ. Painel inferior: cinética da persistência dos locais DSB revelados pelos focos γ-Η2ΑΧ por FACS nas células irradiadas (IR): Dbait32Hc+IR (linha contínua), IR apenas (linha tracejada) e não tratada (linha pontilhada).

Figura 3.1: Análises FACS das células GMA32 não tratadas, células transfectadas isoladamente ou transfectadas com diferentes moléculas Dbait pela lipofectamina, mas sem irradiação adicional ou tratamento com inibidores mitóticos. A fase Ml representa a percentagem de células no estágio sub-Gl indicativo de morte celular.

Figura 3.2: Imunodeteção de focos de reparação de DNA por marcação γ-Η2ΑΧ (pontos brilhantes ou manchas em núcleos) nas células GMA32 não tratadas, células transfectadas isoladamente ou transfectadas com diferentes moléculas Dbait por lipofectamina. A contra coloração de membranas e núcleos celulares foi realizada por FITC-DÍ0C6 e DAPI.

Figura 3.3: Análise de Western blot do estado de fosforilação do resíduo de serina 15 de p53 das células GMA32 não tratadas, células transfectadas isoladamente ou transfectadas com diferentes moléculas Dbait por lipofectamina, mas sem tratamento adicional de irradiaçao ou inibidor mitótico.

Figura 3.4: Sobrevida clonogénica de células GMA32 não tratadas e tratadas por irradiação de 4Gy ou por diferentes inibidores mitóticos (200nM de nocodazol, lOOnM de navelbina (vinorelbina) ou 200 nM de taxol (paclitaxel)) na presença de diferentes moléculas Dbait.

Figura 4.1: Crescimento do tumor de laringe humana xenotransplantado em ratinhos monitorizados como a proporção do volume do tumor no tempo t sobre o volume inicial (Vt/Vi) com ou sem tratamentos. Painel A: braço não tratado (n=38); Painel B: braço controlo com 20 pL de meio de cultura (MEM) + 3x2Gy/semana de irradiação (n=30); Painel C: o braço com 1 nmole (20 pg) Dbait32H + 3x2Gy/semana de irradiação (n=35). MEM ou Dbait32H foi administrado por injeção intratumoral 5 horas antes da irradiação. A dose de irradiação dividida (2Gy) foi administrada uma em cada dois dias, três vezes por semana. O tratamento durou 5 semanas totalizando a irradiação de 30Gy. Os pontos representam o curso do tempo do volume tumoral de cada ratinho. As linhas continuas são o melhor ajuste polinomial. O painel D mostra um gráfico de Kaplan-Meier de todos os ratinhos, nos quais o aumento do volume tumoral (Vt/V±) <5.

Figura 4.2: Distribuição de Dbait32H marcado com cianina C3 em tumor Hep2 de xenotransplante em ratinhos nus. 20 pg Dbait32H-Cy3 formulado com Superfect (agente de transfecção) foi injetado em 1,5 cm3 de tumor Hep2. Os ratinhos foram sacrificados 6 horas após a injeção. Os tumores foram retirados e crio-cortados para análise sem fixação. DAPI foi usado para coloração de núcleos.

Figura 4.3: Radiosensibilização de tumores xenotransplantados com Hep2 em ratinhos nus. 0 crescimento tumoral foi monitorizado durante o tratamento (15 sessões durante 35 dias; fundo cinza) e após (fundo branco) em quatro grupos de 10 animais com diferentes tratamentos. O crescimento individual do tumor é indicado para cada animal. O protocolo de tratamento foi indicado no topo. Para cada sessão de tratamento, injetou-se 2 pg de Dbait32H formulado com agente de transfecção (PEI) no tumor 5 horas antes da irradiação de 2Gy. Os tempos médios para o aumento de 5 vezes do volume tumoral de cada grupo também são indicados. O valor de p foi calculado para o grupo de recebendo tratamento combinado em comparação com o grupo que recebeu a irradiação apenas.

Figura 4.4: Painel superior: representação Kaplan-Meier da sobrevivência de ratinhos nus xenotransplantados subcutaneamente pelo tumor Hep2. O protocolo de tratamento foi descrito na figura 4.3. Os cinco grupos foram incluídos: não tratados, transfectados com mock e irradiados, tratados por combinação de irradiação e quantidade crescente de Dbait32H (20, 60 e 120 pg/sessão). O número de animais para cada grupo é indicado na tabela 3.2. O fundo cinzento indica o período de tratamento. Painel inferior: Fotos de tumores representativos dos três grupos (não tratados, tratados com 20 e 60 pg de Dbait32H/sessão associado à irradiação de 2Gy) que foram retirados 15 dias após o início do tratamento, no final do tratamento (35 dias) e 13 dias após O fim do tratamento (35 + 13 dias) .

Figura 4.5: Análise histológica de tumores de Hep2 xenotransplantados no tratamento intercalar (7 sessões). Os tumores foram retirados 20 dias após o inicio dos vários protocolos de tratamento, conforme indicado. Eles foram fixados em formalina e as secções de tecido foram coradas com hematoxilina, eosina e safran. Dois tumores para cada protocolo de tratamento foram analisados por microscopia. Painel a: Imagens de campos representativos de cada protocolo. As barras da escala indicam 400 mm (painéis 1-4) e 100 mm (painéis 5-8) . Imagens a cores estão disponíveis mediante solicitação. Painel b: A extensão da necrose é expressa como a proporção da área superficial da seção de tecido analisada que era necrótica. O número de células mitóticas e células apoptóticas foi estimado de campos não necróticos representativos de cerca de 1.000 células analisadas com alta potência.

Figura 4.6: Imagem de RMN de tumores de Hep2 xenotransplantados no tratamento intercalar (7 sessões). Três imagens representativas da seção transversal foram mostradas com tumor não tratado, tumor tratado por irradiação (2Gy/sessão) e pela combinação de Dbait32H (20 pg/sessão) e irradiação (2Gy/sessão). Os tumores são delineados por círculo branco. A massa cinzenta dentro do tumor indica a área necrótica.

Figura 4.7: Representação de Kaplan-Meier de sobrevivência de ratinhos nus subcutaneamente xenotransplantados por vários tumores (Hep2: carcinoma de células escamosas, U87: glioblastoma, LU1205 e SK28: dois tipos de melanoma). O período de tratamento é indicado pela área cinzenta.

Figura 5.1: Painel A: Protocolo de tratamento para três grupos/braços dos ratinhos transgénicos K-Rasvl2GxApc1638N na idade média de 12 semanas: o grupo controlo (não tratado), o grupo tratado com 5FU+CPT11, o grupo tratado por 5FU+CPT11 e Dbait32H. Foi realizada por três ciclos de tratamento. Cada ciclo consiste em injeção intraperitoneal de 0,6 mg de 5FU e 0,6 mg de CPT11, juntamente com 0,1 mg de Dbait32H por administração oral, três vezes por semana, seguido de uma semana de descanso. O número de ratinhos envolvidos em cada grupo é indicado entre parênteses. O ponto terminal é o tempo de sobrevivência; Painel B: gráfico de Kaplan-Meier de curvas de sobrevivência dos três grupos; Painel C: o tempo mediano de sobrevivência de três grupos como mostrado no painel B.

Figura 5.2: Número médio de tumores no trato digestivo por animal por exame de macroscopia ou histologia dos grupos tratados com 5FU+CPT11 e por 5FU+CPT11 e Dbait32H. O número de animais em cada grupo foi indicado entre parênteses. Todos os ratinhos foram sacrificados duas semanas (semana 18) após o protocolo mostrado no painel superior. O número médio do braço de controlo (grupo não tratado, n=101) é de 30,8/animal (dados não mostrados).

Figura 5.3: Análise de microscopia de fluorescência do tecido do aparelho digestivo. Painel A: Esquema do protocolo (i.p.: injeção intraperitoneal, o.: administração oral). Painel B: Fluorescência de moléculas Dbait32H-FITC (esquerda) e de imunofluorescência de γ-H2AX marcado (direita) na seção de 5 pm do tecido tumoral do animal tratado de acordo com o protocolo fornecido no painel A. As partes inferiores mostram os detalhes (usando

Lente 63x) da zona indicada nas partes superiores (usando lente lOx, caixa branca). A co-localização do Dbait32H-FITC fluorescente e ο γ-Η2ΑΧ marcado aparecem como pontos brilhantes sobre os núcleos contra corados DAPI.

Descrição Detalhada da Invenção

Como discutido acima, a invenção descreve uma nova classe de moléculas terapêuticas que podem interferir, de uma maneira não especifica de gene, com sistemas de reparação de DNA em células de mamífero. Essas novas moléculas, denominadas moléculas Dbait, são substratos para o holocomplexo das proteínas envolvidas na via NHEJ (via independente da sequência), particularmente proteínas Ku e/ou DNA-PKcs, e podem neutralizar a capacidade de reparação do DNA das células, aumentando assim a sensibilidade aos tratamentos que causam danos ao DNA. A invenção refere-se assim a tais moléculas, à sua produção e à sua utilização terapêutica, particularmente para o tratamento de doenças proliferativas em combinação com um tratamento que causa danos ao DNA.

As moléculas Dbait da presente divulgação podem ser definidas por uma série de características, tais como o seu comprimento mínimo, a presença de pelo menos uma extremidade livre e a presença de uma porção de cadeia dupla. Como será discutido abaixo, uma característica importante das moléculas Dbait é que sua sequência precisa de nucleótidos não tem impacto substancial na sua atividade. Além disso, as moléculas Dbait podem conter uma estrutura base modificada e/ou não natural.

Por conseguinte, um primeiro aspeto desta descrição reside numa molécula de ácido nucleico, em que a referida molécula compreende uma porção de cadeia dupla de pelo menos cerca de 16 pb, tem pelo menos uma extremidade livre e liga pelo menos um complexo Ku envolvido na via NHEJ. A molécula é de preferência de origem não humana (isto é, a sua sequência de nucleótidos e/ou conformação (por exemplo, forquilha) não existe como tal numa célula humana), mais preferencialmente de origem recombinante e/ou sintética.

De acordo com o mecanismo de ação das moléculas Dbait, a sequência das moléculas Dbait desempenha pouco, se algum papel. Assim, em contraste com as moléculas utilizadas na técnica anterior para o direcionamento especifico do gene/proteina (por exemplo, antissentido, antigénio, siRNA, aptâmero, ribozima, etc.), as moléculas Dbait podem não ter qualquer grau significativo de homologia ou identidade de sequência com genes, promotores, potenciadores, sequências a montante 5' ou 3', exões, intrões, etc. conhecidos. Em outras palavras, a ação das moléculas Dbait para interferir na via NHEJ é independente da sequência, e as moléculas Dbait podem ter menos de 70 %, mesmo menos de 50% de identidade de sequência para qualquer gene num genoma humano.

Este mecanismo de ação independente de sequência é uma caracteristica das moléculas Dbait, que as distingue claramente de outros agentes terapêuticos específicos de genes ou específicos de proteína (dependentes da sequência), tais como oligonucleótidos antissentido, pequenos RNA de interferência (siRNA, shRNA e miRNA), e oligonucleótidos CpG imunoestimuladores, bem como aptâmeros projetados para capturar proteínas específicas.

Num aspeto preferido, a sequência das moléculas Dbait tem um grau geral de identidade para sequências de ácido nucleico humano que é inferior a cerca de 70%, 60%, 55% ou 50%. Os métodos para determinar a identidade de sequência são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, Blast.

Num aspeto particular, a molécula Dbait não híbrida, em condições rigorosas, com DNA genómico humano. Condições rigorosas típicas são tais que permitem diferenciar ácidos nucleicos totalmente complementares de ácidos nucleicos parcialmente complementares (ver, por exemplo, Sambrook et al.) .

Num aspeto preferido, a sequência das moléculas Dbait é desprovida de CpG de modo a evitar as reações imunológicas bem conhecidas mediadas pelo recetor do tipo toll, se esse efeito não for desejável. CpG refere-se a um dinucleótido constituído por uma citosina seguida por uma guanina.

Considerando o seu mecanismo de ação, o comprimento das moléculas Dbait pode ser variável, desde que seja suficiente para permitir a ligação apropriada do complexo da proteína Ku. A seção experimental mostra que o comprimento mínimo das moléculas Dbait é de cerca de 16 pb, para garantir a ligação a um complexo Ku. Preferencialmente, as moléculas Dbait compreendem entre 16-200 pb, e mais preferencialmente entre 24-100 pb. Exemplos específicos de moléculas Dbait contêm 24 pb, mais preferencialmente 32 pb. Como mostrado nos exemplos, esse comprimento é suficiente para permitir a ligação de um complexo Ku que compreende proteínas Ku e DNA-PKc.

As moléculas Dbait particularmente preferidas compreendem 24-100 pb, e mais vantajosamente 32-100 pb.

As moléculas Dbait de acordo com a divulgação devem ter pelo menos uma extremidade livre, como um mímico de DSB. A referida extremidade livre pode ser uma extremidade abrupta ou uma extremidade coesiva 5'-/3' livre. Num aspeto particular, estas contêm apenas uma extremidade livre. Em outro aspeto particular, estas contêm duas extremidades livres.

As moléculas Dbait podem ser lineares ou, preferencialmente, constituídas por ácidos nucleicos de cadeia dupla em forma de forquilha. Nesse caso, a alça pode ser ácidos nucleicos ou outros grupos químicos conhecidos por peritos na técnica, de preferência um ligante tal como hexaetilenoglicol ou tetradeoxitimidilato (T4).

Num aspeto preferido, as moléculas Dbait são tais que: 1) as moléculas Dbait de cadeia dupla são capazes de serem assimiladas pelas células/corpo do tecido no núcleo da célula quando utilizadas com veículos/excipientes farmaceuticamente aceitáveis; 2) a pelo menos uma extremidade livre das moléculas Dbait é reconhecível pelo holocomplexo de enzimas envolvidas nos processos de deteção, sinalização e/ou reparação de dano de DSB; 3) a pelo menos uma extremidade livre das moléculas Dbait é passível do referido complexo ser incorporado no DNA genómico das células tumorais.

Num aspeto particular, as moléculas Dbait têm uma estrutura não replicativa, devido à sua estrutura e/ou estrutura base. A este respeito, as moléculas Dbait de acordo com a divulgação podem ter, exclusivamente ou principalmente (acima de 50%) uma estrutura base de fosfodiéster nativo ou uma estrutura base fosfodiéster quimicamente modificado, ou outra estrutura base com grupos químicos ou misturas de grupos químicos, desde que o dsDNA modificado permaneça substrato para o holocomplexo envolvido na via do NHEJ, particularmente as proteínas Ku e DA-PKcs, bem como a deteção de danos ou via de sinalização DSB. Vantajosamente, as modificações químicas destinam-se a conferir estabilidade química às moléculas Dbait e/ou a evitar a posterior replicação (causa potencial do efeito mutagénico) após a sua integração genómica se esta ocorrer.

Estas também podem ter mímicos de açúcar, tais como 2 '-0-alquilribose, ribose ramificada 2'-0-alquil-C4', ciclobutilos ou outros grupos carbocíclicos ou hexitol em vez do grupo pentofuranosilo. A Dbait preferida compreende um ou vários grupos químicos no final de uma ou de cada cadeia. Grupos químicos preferidos compreendem fosforotioatos. Alternativamente, a Dbait preferida tem nucleótidos com estrutura base de metilfosfonato.

Outras estruturas base modificadas da divulgação compreendem os fosforamidatos, ácido nucleico de morfolino, ácido nucleico bloqueado na ligação 2'-0,4'-C metileno/etileno, ácido nucleico peptídico (PNA), e ligações de alquilo de cadeia curta, ou ligações de cicloalquilo entre açúcares ou ligações de cadeia curta heteroatómicas ou heterocíclicas entre açúcares de comprimento variável, ou quaisquer nucleótidos modificados conhecidos por peritos. A Patente EUA No. 5,677,437 descreve ligações heteroaromáticas de oligonucleósidos. Os ligantes de nitrogénio ou os grupos que contêm nitrogénio também podem ser usados para preparar mímicos de oligonucleótidos (Patentes EUA No. 5,792,844 e No. 5,783,682). A Patente EUA No. 5,637,684 descreve compostos oligoméricos de fosforamidato e fosforotioamidato. Também são previstos oligonucleótidos possuindo estruturas com estrutura base morfolino (Patente EUA No. 5,034,506). Noutros aspetos, tais como a estrutura base de ácido nucleico peptídico (PNA), a estrutura base do fosfodiéster do oligonucleótido pode ser substituída por uma estrutura base de poliamida, sendo as bases ligadas direta ou indiretamente aos átomos de azoto aza da estrutura de poliamida. Outros oligonucleótidos sintéticos podem conter regiões de açúcar substituídas compreendendo um dos seguintes na posição 2': OH, SH, OCH3, SCH3, F, OCN, 0CH2CH20CH3, 0(CH2) NH2 ou O (CH2) nCH3 onde n é de 1 a cerca de 10; Cl a CIO alquilo inferior, alquilo inferior substituído, alcarilo ou aralquilo; Cl; Br; CN; CF3; OCF3.; 0-S-; ou N-alquilo; 0-, S- ou N-alquenilo; SOCH3; S02CH3; ONO; NO; N3.

0(s) elemento(s) não replicável(eis) podem ser incorporados na posição interna ou no final do fragmento de cadeia dupla. Estes (eles) podem compreender: a) uma unidade que não pode ser utilizada como molde para a replicação de DNA, tal como uma cadeia de polietilenoglicol, preferencialmente uma cadeia de hexaetilenoglicol, ou qualquer cadeia de hidrocarbono, eventualmente interrompida e/ou substituída por um ou mais heteroátomos por exemplo grupos oxigénio, enxofre, nitrogénio ou heteroatómicos ou heterocíclicos compreendendo um ou mais heteroátomos; b) uma unidade que é um elemento de bloqueio, uma vez que não é passível de DNA polimerases ou exonucleases, tais como quaisquer nucleótidos modificados em 3', ou outros conhecidos por peritos; c) um oligonucleótido nativo, tal como Tn, quando utilizado na alça de uma forquilha, tal como um tetradeoxitimidilato (T4) .

As referidas cadeias são feitas por síntese química, semi-biossíntese ou biossíntese, qualquer método de amplificação, seguido de qualquer método de extração e preparação e qualquer modificação química. A bioatividade das moléculas Dbait pode ser avaliada por ensaios in vitro e baseados em células cultivadas, como descrito, por exemplo, nos exemplos 2 e 3 e/ou também por ensaios in vivo, como descrito, por exemplo, nos exemplos 4 e 5. 0 ensaio mais fácil e relevante é o ensaio da atividade da proteína cinase dependente do DNA (ver exemplo 2, figura 1.4) . Este ensaio simples tem sido até agora preditivo da atividade in vivo das moléculas Dbait. No entanto, outros ensaios baseados em células cultivadas, como o ensaio da inibição da integração ilegítima aumentada por radiação também são relevantes (ver exemplo 3, figura 2.3 e figura 2.4) .

Num aspeto particular, as moléculas Dbait desta divulgação são capazes de ativar DNA-PK.

Num aspeto particular, as moléculas Dbait desta descrição são capazes de inibir a integração de DNA ilegítimo com aumento de radiação.

Em outro aspeto particular, as moléculas Dbait desta divulgação ligam um complexo Ku in vitro, por exemplo, conforme determinado pelo ensaio de alteração da mobilidade eletroforética. Um tal complexo Ku pode compreender uma ou várias proteínas Ku apenas, tais como Ku70 e/ou Ku80, ou uma combinação de uma ou várias proteínas Ku e pelo menos uma proteína DNA-PKc.

Em outro aspeto particular, as moléculas Dbait desta divulgação penetram no núcleo.

As moléculas Dbait mais preferidas desta divulgação combinam várias ou todas as características acima.

As experiências realizadas em células cultivadas e em tumores xenotransplantados em ratinhos nus e ratinhos geneticamente modificados mostraram que as moléculas Dbait desta invenção causam a letalidade de célula/tecido de tumores submetidos a uma radioterapia e/ou quimioterapia. A invenção também se refere também a composições adjuvantes a serem usadas em associação com um tratamento de quebra de DNA, as referidas composições compreendendo uma molécula Dbait tal como acima definida, em combinação com um veículo/excipiente farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz a ser introduzida no núcleo das células tumorais. A invenção também se refere a um método para promover a sensibilidade do tumor a terapias anticancerígenas que compreende, em associação, • introdução de moléculas Dbait em células/tecido de cancro, como acima definido, e • indução em células, da quebra de DNA por um método que causa danos ao DNA.

De acordo com um aspeto da divulgação, um agente de transfecção é utilizado no referido passo de introdução.

Com base no protocolo utilizado em estudos in vivo, a divulgação proporciona base racional para estabelecer o protocolo clinico do uso de moléculas Dbait em combinação com radioterapia ou quimioterapia. A base racional subjacente a qualquer protocolo é que as moléculas Dbait devem ser entregues no núcleo das células quando ocorre o evento que causa danos ao DNA. Portanto, as moléculas Dbait devem preferencialmente ser administradas antes da radioterapia, enquanto podem ser administradas juntamente com o(s) agente(s) quimioterapêuticos (s), dependendo do modo de administração e da farmacocinética de cada fármaco.

Um protocolo tipico compreende a administração de moléculas Dbait antes da irradiação, por exemplo 5 horas. 0 uso de uma irradiação fracionada é particularmente eficiente, por exemplo 15x2Gy em seis semanas, ou 6x5Gy em duas semanas.

Vantajosamente, o referido método compreende a associação do tratamento com moléculas Dbait com uma quimioterapia dupla. Por exemplo, 5FU e CPT 11 são injetados juntos 3 vezes, 3 dias consecutivos, espaçados por uma semana completa de descanso. Em alternativa, o tratamento com moléculas Dbait é associado com a radioterapia.

Será facilmente adaptado para seres humanos pelo perito na técnica, particularmente dependendo do peso/superficie do corpo do paciente.

Num aspeto preferido, as moléculas Dbait são moléculas Dbait quimicamente modificadas, tal como anteriormente definido neste documento e outras práticas em terapia humana.

Em outro aspeto, as moléculas Dbait não são quimicamente modificadas e correspondem a fragmentos de ácido nucleico nativos, mas exibem as caracteristicas de fragmentos modificados quimicamente, particularmente têm o número de pares de bases e as propriedades definidas em relação às referidas moléculas Dbait quimicamente modificadas.

Mais particularmente, a quebra de cadeia de DNA é conseguida por radiação ionizada (radioterapia) ou reação química (quimioterapia).

Um tal método é um novo adjuvante terapêutico em conjunto com terapias que causam danos ao DNA para o tratamento das doenças resultantes da proliferação celular descontrolada, em particular cancro. Em outras palavras, Dbait destina-se principalmente a ser usada em terapias anticancerígenas, mas também pode ser usada em muitos tratamentos anti proliferação, como no tratamento da psoriase.

Este método é endereçável para tratar distúrbios proliferativos:

Eles podem não ser malignos, como psoriase e estenose/reestenose proliferativa vascular.

Estes podem ser malignos. 0 órgão ou região em causa pode ser: pulmão e brônquios, cabeça e pescoço, trato gastrointestinal, cancro colorretal, trato genito-urinário, órgãos ginecológicos, mama, endócrinos, pele, retina, SNC, órgãos hematológicos, metástases conhecidas ou local primário desconhecido, restantes (timo, por exemplo). A natureza histológica pode ser epitelial, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de transição, fibroblasto/angioblasto (sarcomas), neuronal, derivado de glia, endócrino, carcinoide, estroma gastrointestinal, endotelial, hematopoiético, embrionário. A invenção também se refere à utilização das referidas moléculas Dbait não modificadas quimicamente para a preparação de fármacos anticancerigenos para o tratamento de tumores, particularmente tumores altamente resistentes a radioterapia e/ou quimioterapia, sendo utilizados os referidos fármacos em associação com um tratamento de quebra de DNA (por exemplo, que causa dano), particularmente radioterapia ou quimioterapia.

In vivo, as moléculas Dbait modificadas quimicamente ou não modificadas são administradas por qualquer via apropriada, com um veiculo/excipiente aceitável apropriado, tal como administração oral, intravenosa ou intratumoral, ou injeções subcutâneas ou administração tópica, ou outros.

Um aspeto adicional desta divulgação é uma composição para utilização em associação com um tratamento de quebra de DNA, particularmente radioterapia ou quimioterapia, a referida composição compreendendo pelo menos uma molécula Dbait em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável, numa quantidade eficaz a ser introduzida no núcleo das células tumorais. Por exemplo, quando a administração intratumoral é utilizada, a referida quantidade eficaz é pelo menos 0,01 mg por 1 cm3 de tumor, preferencialmente 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, mais preferencialmente 0,5 mg por 1 cm3 de tumor. A quantidade eficaz pode ser administrada num protocolo de tratamento diário (por exemplo, 5 dias por semana durante 3 a 6 semanas consecutivas ou 3 vezes por semana durante 3 a 6 semanas consecutivas). Em alternativa, uma quantidade eficaz de pelo menos 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, preferencialmente 0,5 mg por 1 cm3 de tumor, mais preferencialmente 1 mg por 1 cm3 de tumor, pode ser administrada num protocolo de tratamento semanal durante 3 a 6 semanas consecutivas, por exemplo. Quando são utilizadas outras vias de administração, o perito na técnica pode adaptar a quantidade de modo a obter uma quantidade eficaz das moléculas Dbait no tumor de pelo menos 0,01 mg por 1 cm3 de tumor, preferencialmente 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, mais preferencialmente 0,5 mg por 1 cm3 de tumor, em particular num protocolo de tratamento diário, ou para obter uma quantidade eficaz das moléculas Dbait em tumor de pelo menos 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, preferencialmente 0,5 mg por 1 cm3 de tumor, mais preferencialmente 1 mg por 1 cm3 de tumor, em particular num protocolo de tratamento semanal. Naturalmente, a dosagem e o regime podem ser adaptados pelo perito na técnica em consideração ao regime de quimioterapia e/ou radioterapia.

Um aspeto adicional desta descrição reside na utilização de uma molécula Dbait como definido acima para a produção de um medicamento para aumentar a sensibilidade das células (por exemplo, tumor) à terapia que causa danos ao DNA.

Um aspeto adicional desta descrição reside na utilização de uma molécula Dbait como definido acima para a produção de medicamentos para o tratamento de cancro em combinação com uma terapia anticancerigena que causa danos ao DNA.

Preferencialmente, a terapia anticancerigena que causa danos ao DNA é selecionada de radioterapia e quimioterapia. Mais preferencialmente, a molécula é administrada antes da radioterapia e/ou antes e/ou juntamente com a quimioterapia.

Outras caracteristicas e vantagens da divulgação serão dadas nos seguintes exemplos, com referência às figuras e Tabelas em anexo.

Exemplos

Estudos moleculares e celulares, bem como ensaios em tumores radioresistentes humanos xenotransplantados (carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, glioblastoma, melanoma) em ratinhos nus e em tumor induzido em trato digestivo com mutação dupla Rasvl2G x Apc1638N em ratinhos transgénicos foram realizados de modo a: i) avaliar as atividades biológicas das moléculas Dbait; ii) validar a abordagem do isco de DNA usando moléculas Dbait na sensibilização em terapias anticancerigenas; iii) elucidar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à sensibilização mediada por Dbait observada. Os resultados dessas investigações são delineados e resumidos nos exemplos.

Exemplo 1: Conceção, síntese e preparação de moléculas Dbait.

Dois tipos de moléculas Dbait foram concebidas: fragmentos de dsDNA lineares ou em forquilha. Para as moléculas Dbait em forquilha, um ligante de hexaetilenoglicol ou um tetradeoxitimidilato foi utilizado como alça. A(s) extremidade(s) da haste de dsDNA podem ser protegidas contra a degradação química por 3 '-exonucleases pela incorporação de fosforotioatos, metilfosfonatos ou ligação de nucleótidos 3'-3'. Em princípio, outras modificações químicas podem ser usadas desde que sejam compatíveis com ligação Ku70/Ku80 e ativação de DNA-PKcs (Martensson &amp; Hammarten, 2002). Foram testadas diferentes moléculas Dbait com vários tamanhos de haste 8 pb (Dbait8H), 16 pb (DbaitlôH), 24 pb (Dbait24H) e 32 pb (DBait32H como descrito em WO-A-2005/040378) assim como diferentes sequências de haste. Um fragmento de dsDNA dumbell (Dbait32C), em que ambas as extremidades foram seladas por duas alças de hexaetileno, também foi concebido, como controlo. Algumas moléculas Dbait foram marcadas através de um T marcado com fluoresceína (Dbait32H-FITC), cianina 3 (Dbait32H-Cy3), cianina 5 (Dbait32Hc-Cy5) ou biotina (Dbait32H-Biot). A Tabela 1.1, 1.2 e 1.3 resumem as sequências e as estruturas químicas das moléculas Dbait usadas neste trabalho.

Tabela 1.1: Sequências e estruturas químicas das moléculas Dbait. As letras maiúsculas são nucleótidos com estrutura base de fosfodiéster. As letras maiúsculas em negrito são nucleótidos com estrutura base de fosforotioato. A linha contínua de meio círculo simboliza o ligante de hexaetilenoglicol. Dbait32-T4 contém quatro timinas (T4) como um ligante em vez de um ligante hexaetilenoglicol.

Dbait32C é uma molécula dumbbell (fechada). Dbait32Hc-5'5'tem uma sequência baralhada (mesma composição de base, mas em ordem diferente, ver Dbait32Hb na tabela 1.1) e uma ligação 3'-3' . Dbait32Ha, Dbait32Hb, Dbait32Hc e Dbait32Hd têm a mesma composição de base, mas em ordem diferente em comparação com a sequência de Dbait32H.

Moléculas Dbait Sequência e estrutura quiiaica 5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCTS‘

Db3fâ2 3'TG CGTGCCCAC AACGCAGC AAACAAGCCT AG A5'

Dba«35-T4 5'ACGCàCGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGG.ViCT -v 3' IGCGTGCCCACAACCCAGCAAACM.GCCTAGS. -/

Dbsí32H po 5'ACGCACGGGTSTTGGGTCGTTTCTTCGGATCT3' "v SU-GCGJGCCCACMCCCAGCÃAàCAAGCCTAG.AS'

Dbsits^H 3 r acgcacgggtgttgggt cgt ttgtt cggatct 3 -·. 3' TGCGXGCCCACAACCCAGCÍíAP.CAAGCCIAGAS'

Dbait24H Gi Ttí^GTCGTT ; GT 3" ",v 3r TGCGTGCCfl^CAACCCAGCAAACA5r —^

Dbait16H 3' ACGCAC GGGTGTTGGC-13 * 3,rTGCGXGGCCACAACCCS'

DbaiffiH VACGCAC3G3'-x 3' TGCGIGCCj'-^

Dbaií32Ha 3'GCTAGGTCTGTTTGGTGGCTT7G0AGTGG0AC3' 3 ' CGAT CCAGACAAACCACCGtYÃAiCGTCACCGTG 5'

Dbait32Hb ·' ’^AGGC7TSTTTGCTGGGTTG7a«X;ACA«;3' —x 3' CGATCCGAACAAACGACCCAACAXCCGTGTCG5 ' —^

Dbait32Hr 5' SCTGTGCCCACAACC0AGCAAACAAGCCTAGA3' 3'OGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGAICT5' —^ { cíontinuacãc)

Molscuias Di>a.it Sequência. e estrutura quiiaicía.

Dbaft32Hd 5 ' GCTAGGTCTGTTTGGT GGC TTTGCAGTGGC&amp;C ‘3' -v 3'CGATCCAGACAAfiCCACCGAAACGICACCGTG5r n, wou -j- 5'GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3 '

Dbattí2He-3 nip } 3' cgaiGÃCGGGTGTTGG GTC GT TTGTTCGGATCX 5f ..„™, r.„, 5 'getGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3f

DbattG2Hc-5 3 mp A 3'cgaCACGGGTGTTGG GIC GT TTGTTCGGATCT 5'

Qbait32Hc-5:5' 5 ’ GC TAG GCTTGTTTGCTGGGTTGTAGGCACAGC 3' -v a'C3f-3'GATCCGAACAAACGÃCCCAÃCATCCGTGTCG5' -*

5'ACGCACGGGIGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3' -HH

Dbaft32-hHz

3' TGCGTGGCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5' -ÍSÍG

DbaiíS^i /^"5'ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3' -v

3fTGCGT GCCCACAACCCAGCAAACAAGCCXAGA5' -S

Dbait32ss 5 ACGCACGGGT GTT GGGTCGTTT GTT CGGATCT-3'

DbaiS32Hcss-po S’GCT GT GCCCACAACCGAGCAAACAAG CGT AG A3’

Sequências das moléculas Dbait e estruturas químicas

Tabela 1.2: Sequências e estruturas químicas de várias moléculas Dbait marcadas como indicado. As letras maiúsculas são nucleótidos com estrutura base de fosfodiéster. As letras maiúsculas em negrito são nucleótidos com estrutura base de fosforotioato. As letras minúsculas em negrito são nucleótidos com estrutura base de metilfosfonato. A linha contínua de meio círculo simboliza o ligante de hexaetilenoglicol. São indicadas várias moléculas marcadas (cianina 3 ou 5, FITC) Dbat8Hc, Dbait32H, Dbait32Hc e Dbait32Hd.

Dbaít32H-FITC

Dbaít32H-Cy3 5 · ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATC £3 ' -x

Dbait32H-Biot 3' TGCGTGCCCAC AAC CCAGCAAACAAGCCTAGA5 ' t — fluoiesceiriA (FITC) , aianina 3 ou naroado o-ofti bio tina (Biot)

Dbaif8Hc-Cy3 5' GCTGTGCA3 3'CGACACGt5 t = T rTkaxcjadLc. ci.arii.rta 3 (Gy3)

Dbait32Hc-Cy3 5 > GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA3' “X

Dbaft32Hc-Cy5 3 'CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCtS'

t = T marcado cianina 3 (Cy3) ou Cianina 5 ÍCySJ

DbaÍt32Hd-RTC 5 ' QCTAGGTCTGTiTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC3f —\ 3'CGATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGtG5' ^ t = T marcado fluoresceina (FITC)

Sequências das moléculas Dbait e estruturas químicas

Tabela 1.3: Sequências e estruturas químicas de moléculas Dbait64 e Dbait64L de 64 pb. As letras maiúsculas são nucleótidos com estrutura base de fosfodiéster. As letras maiúsculas em negrito são nucleótidos com estrutura base de fosforotioato. A linha contínua simboliza um ligante de hexaetilenoglicol.

Dbaií64 δ * ACâCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCTACGCACGGTCGTTTGTTCGGTGTTGGCGÃTCT31 31TGCGTGCGCACAACCCAGCAAACAAGCC TAGATGCGTGCCAGCAAACAAGCCACAACCGC L&amp;GÃ5’

Dfeaií84L 5 * ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT ACGCACGGTCGT ϊΪGTTCGGTGϊTGGCGATCT 3' 3 ’ TGC G TGCC CACAACCCAGCAAACAAGC C TAG A TGCGT GC C AGC AAACAAG CC AC AAC C G C TAGA5'

Todas as moléculas Dbait foram feitas por síntese automatizada de oligonucleótidos em fase sólida (Eurogentec, Bélgica). Estas foram purificadas por HPLC desnaturante em fase reversa.

Eletroforese em gel desnaturante capilar. MALDI-TOF/LC-MS foram utilizados para controlo de qualidade. Mais de 90% dos oligonucleótidos sao de comprimento total. Todas as amostras foram liofilizadas antes do envio.

Após a receção, todas as amostras foram dissolvidas em água bidestilada. As concentrações de moléculas Dbait foram calculadas da absorvência a 260nm (Cantor &amp; Warshaw, 1970) sob condição de desnaturação (60 °C-90 °C dependendo da

estabilidade térmica das moléculas Dbait). As concentrações de moléculas Dbait marcadas com corantes fluorescentes foram calculadas da absorvância no comprimento de onda apropriado do corante particular (FITC: ε=80000 M_1. cm-1 a 490nm; Cy3: ε=150000 Nb1. crrr1 a 550nm; Cy5: ε=250000 M_1. cm-1 a 650nm) . O fragmento dsDNA dumbell (Dbait32C) foi preparado por emparelhamento e ligação por ligase de DNA T4 (BioLabs) de duas forquilhas contendo ligante de hexaetilenoglicol e com extremidades 3' salientes e complementares.

Com base nas considerações termodinâmicas e cinéticas, foram utilizados os seguintes protocolos para a preparação das amostras de moléculas Dbait, de acordo com a sua molecularidade: - Para moléculas bi-moleculares Dbait (Dbait32, Dbait32-NH2, Dbait64 e Dbait64L): A mistura de solução mãe 1:1 (maior concentração possível) de cada cadeia em água bidestilada tem de ser aquecida a 90 °C durante 5 minutos para a desnaturação completa de cada cadeia. O emparelhamento foi realizado por retorno suave à temperatura ambiente (as amostras são tipicamente deixadas em banho-maria) e as moléculas dúplex resultantes foram armazenadas em alíquotas a -20 °C. - Para moléculas mono-moleculares Dbait (forquilha): A solução contendo 200 μΜ de moléculas Dbait em forquilha em água bidestilada tem de ser aquecida a 90 °C durante 5 minutos para desnaturação completa. O emparelhamento deve ser realizado por arrefecimento das amostras em água gelada (0 °C). O armazenamento de alíquotas foi a -20 °C.

Exemplo 2: Análise bioquímica de moléculas Dbait.

Como o primeiro passo para dissecar o mecanismo de ação das moléculas Dbait, uma série de ensaios de alteração da mobilidade eletroforética foi realizada com diferentes moléculas Dbait marcadas radioativamente com 32P na presença de extratos de proteínas nucleares de células Hep2 de acordo com o protocolo padrão. Tipicamente, incubaram-se 10 nM de moléculas Dbait marcadas radioativamente com 32P na presença de várias concentrações de proteínas nucleares (0, 10, 20, 40, 80, 160 e 320 ng/pL) a 30 °C durante 10 minutos em tampão TBE. Em seguida, as amostras foram carregadas num gel nativo de acrilamida a 5%. A eletroforese foi executada a 95 V durante 2 horas a 4 °C. O gel foi seco e digitalizado por sistema de aquisição imagens de fluorescência (Molecular Dynamics). A Figura 1.1 mostra o padrão de banda retardada da titulação de extratos de proteínas nucleares Hep2 com várias moléculas Dbait de diferentes comprimentos. Exceto para a molécula Dbait de 8 pb de comprimento mais curto (Dbait8H) , foram observadas até 2 bandas retardadas para moléculas Dbait mais longas: uma banda retardada foi observada para as moléculas Dbait de 16, 24 pb de comprimento (Dbaitl6H e Dbait24H) , enquanto duas bandas retardadas foi observada para moléculas Dbait de 32 pb de comprimento (Dbait32H, Dbait32H-po e Dbait32) . Para moléculas Dbait de 32 pb, a intensidade da banda retardada 1 aumenta e, em seguida, diminui à medida que a concentração de proteína aumenta, enquanto a intensidade da banda retardada 2 aumenta em função da concentração de extratos de proteínas nucleares. A combinação de ensaios de imunoligação e de alteração da mobilidade eletroforética com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-Ku70 (Santa Cruz Biotechnology) revelou que as bandas retardadas 1 e 2 contêm o complexo Ku, Banda 1 e 2 foram adicionalmente deslocadas para banda 1* e 2* após a adição de anticorpo anti-Ku70 (figura 1.2). É provável que a banda 1 tenha um complexo Ku70/80 ligado ao Dbait de 16 a 32 pb, enquanto que a banda 2 possui dois complexos Ku70/80 ligados às moléculas Dbait de 32 pb. As experiências de controlo realizadas com proteínas Ku purificadas confirmaram esta interpretação. A identificação de proteínas Ku indica claramente que as moléculas Dbait interagem com a maquinaria NHEJ de uma maneira dependente do comprimento. A união das extremidades do DNA foi monitorizada por incubação de fragmentos de DNA linear de 605 pb marcados com 32P com extrato nuclear de Hep2 na presença de várias moléculas Dbait. Os produtos de ligação migram como dímeros, trímeros ou tetrâmeros, iniciando o monómero de 605 pb. A Figura 1.3 mostra o efeito de várias moléculas Dbait na reação de união das extremidades de DNA nos extratos nucleares de células Hep2. Aproximadamente 16% das moléculas lineares de DNA dúplex abruptas marcadas com 32P foram ligadas em dímeros e trímeros durante as primeiras 2 h de incubação. A quantidade de produtos de ligação de alto peso molecular aumentou até 30% do DNA de input após 16 h. Quando Dbait32H foi adicionada à reação num excesso molar de 100 vezes em comparação com o fragmento linear marcado com 32P, a reação foi fortemente inibida. Inibição semelhante da atividade de junção das extremidades também foi observada com extratos preparados de células HeLa (dados não mostrados). Na maioria das experiências, Dbait32H foi adicionada simultaneamente com os fragmentos de DNA marcados ao extrato nuclear. Quando Dbait32H foi incubada com o extrato durante 30 min antes da adição de fragmentos, a extensão da inibição foi semelhante. Em contraste, quando Dbait32H foi adicionada 30 minutos após o extrato nuclear, não houve inibição da ligação (dados não mostrados). Esses dados indicam que as moléculas Dbait são competidores da reação da união das extremidades do DNA, mas não deslocam o complexo ligado.

Diversas moléculas Dbait foram testadas quanto ao seu efeito no ensaio sem células, adicionando as moléculas ao extrato nuclear e incubando durante 2 h com os fragmentos de DNA. A ligação não foi em grande medida afetada pela molécula curta (Dbait8H), a molécula de uma única cadeia de 32-nt (Dbait32ss) ou a molécula dumbell (Dbait32C). Dbait24H e DbaitlôH, que se ligam apenas a um heterodímero Ku, inibiram a ligação tão eficientemente quanto Dbait32H. Esses dados indicam que a religação do fragmento de DNA é fortemente inibida por moléculas Dbait que são capazes de recrutar Ku. A atividade de DNA-PK foi monitorizada usando o kit SignaTECT DNA-dependent Protein Kinase Assay System (Promega, Madison, EUA) . As quantidades crescentes de extrato nuclear Hep2 (limpo de DNA endógeno por filtração DEAE-Sepharose) foram ensaiadas na presença de Dbait a 250 nM. O extrato, o substrato peptidico biotinilado e várias quantidades de extrato nuclear foram incubados 5 minutos a 30 °C com (γ-32P)ATP de acordo com as indicações do fabricante. O substrato biotinilado foi capturado na membrana de estreptavidina, lavado e registada num contador de cintilação. A percentagem de fosforilação é calculada dividindo a radioatividade ligada pela contagem total de (γ-32P)ATP por amostra. Realizaram-se reações (10 pL) em KOAc a 60 mM, BSA a 100 pg/mL, Mg(Cl)2 a 0,5 mM, 1 pL de tampão T4 DNA ligase 10X (Promega, Madison, EUA). O extrato nuclear e Dbait foram incubados 2 minutos antes da adição de DNA marcado com 32P (10 ng) . As amostras foram incubadas várias vezes a 37 °C antes da ligação ser interrompida por EDTA a 20 mM e adição de 1 mg/mL de Proteinase K. Os produtos de ligação foram analisados por eletroforese através de géis de agarose a 0,7%, seguidos de autorradiografia e quantificação por Phosphor-imaging. A Figura 1.4 mostra a atividade da proteína cinase dependente do DNA (DNA-PK) de um número de 2 pg de moléculas Dbait com vários comprimentos, sequências e estruturas químicas, incluindo as estruturas base modificadas, em 1,5 pg de extrato de proteína nuclear Hep2. A atividade de cinase dependia diretamente do comprimento e estrutura da "haste" da cadeia dupla da molécula Dbait. A grande ativação da DNA-PK foi observada com as moléculas Dbait de 32 pb de comprimento que estavam ligadas por dois complexos dímeros Ku. As moléculas Dbait que ligavam apenas um dímero Ku (Dbaitl6H e Dbait24H) eram tão ineficientes como o Dbait8H curto que não ligava Ku. Da mesma forma, Dbait32ss/Dbait32css e Dbait32C dumbell de cadeia simples, que não tem extremidades de cadeia dupla livres, não ativou DNA-PK. Além disso, várias modificações da estrutura base (fosfotioato, metifosfonato, ligação 3'-3') na extremidade abrupta livre (até 3 pb), bem como os ligandos marcados internamente (por exemplo, corantes fluorescentes) são capazes de ativar atividade da DNA-PK. Vale a pena notar que a atividade da DNA-PK não depende significativamente, se alguma coisa, da sequência de moléculas Dbait, como mostrado por Dbait32H, Dbait32Hb, Dbait32Hc e Dbait32Hd.

Este simples ensaio livre de células de atividade da DNA-PK revela que apenas o comprimento (pelo menos cerca de 32 pb) e o DNA de cadeia dupla com uma extremidade livre de moléculas Dbait são necessários para a ativação da cinase, independentemente da sua sequência e modificações químicas até certo ponto. Isto é consistente com a implicação da DNA-PK na via NHEJ, um mecanismo independente da sequência da união das extremidades de DNA.

Exemplo 3: Atividade in vitro de moléculas Dbait A atividade das moléculas Dbait em células cultivadas foi estudada por ensaio clonogénico de sobrevivência em duas linhas celulares de cancro humano radioresistentes derivadas de um carcinoma cervical feminino (HeLa) e de HNSCC (Hep2) em associação com a radiação ionizante, pela inibição de integração ilegítima de fragmento de DNA exógeno e por deteção dos focos de DSB persistentes após irradiação nas células transfectadas por moléculas Dbait.

Foram utilizadas linhas de células humanas estabelecidas Hep2 (carcinoma das células escamosas da cabeça e pescoço, HNSCC), LU1205 e SK28 (melanomas) para estudos em animais. Os estudos das células em cultura foram realizados utilizando Hep2, HeLa S3 (carcinoma cervical epitelial), M059K e M059J (glioblastoma) . As células foram cultivadas a 37 °C em culturas em monocamadas em DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS, Invitrogen, Cergy Pontoise, França) e antibióticos (100 pg/mL de estreptomicina e 100 μ/mL de penicilina) em condições de 100% de humidade, 95% de ar e 5% de CO2. LU1205 foram cultivadas em MCDB contendo 4% de FBS inativado por calor, 1% de glutamina e antibióticos (100 pg/mL de estreptomicina e 100 pg/mL de penicilina).

As células com crescimento exponencial em placas de seis poços foram recolhidas e incubadas com 700 mL de DMEM completo contendo uma mistura de moléculas Dbait e reagente Superfect (Qiagen, Courtaboeuf, França) numa proporção de 10 pL de Superfect por pg de DNA. Após 5 h a 37 °C sob condições padrão, as células foram lavadas com PBS e foi adicionado DMEM. Quando indicado, as células foram expostas à irradiação numa sessão (10 Gy) 5 h após o início da transfecção ou em quatro sessões de 0,5 Gy administradas com uma unidade de 137Cs (1 Gy/min) 3, 4, 5 e 6 h após o início da transfecção e permitido crescer durante duas semanas. Quando a integração do plasmídeo foi medida, 2 pg de plasmídeo foram adicionadas à transfecção Dbait e a puromicina (1,7 pg/mL) foi adicionada ao meio de crescimento 48 h após a transfecção. A eficiência de transfecção do plasmídeo foi estimada pela análise de 10.000 células para a expressão de GFP num citómetro de fluxo FACScan (FACSalibur, Beckton-Dickinson, EUA). 3.1) Letalidade celular induzida

Após 8 horas de transfecção das moléculas Dbait em células Hela e quatro irradiações com irradiação fracionada de 0,5 Gy espaçada 2 horas (4x0,5 Gy) , realizadas com raios γ de uma fonte de 137Cs, uma redução significativa da sobrevivência clonogénica foi observada em comparação com as células não transfectadas. Os resultados são apresentados na figura 2.1, em que o Painel A fornece a dependência da dose do número de clones sobreviventes normalizado na presença de Dbait32 e Dbait32H, e o Painel B, o número de clones sobreviventes normalizado na presença de diferentes moléculas Dbait a 83 nM (concentração em meio de cultura). A cultura das células foi realizada em MEM suplementado com 10% de soro. Superfect (Qiagen) foi usado como agente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. A sobrevivência clonogénica foi estimada como o número de células tratadas formando colónias no número de células não tratadas. O efeito depende do comprimento e da natureza química das moléculas Dbait de uma maneira dependente da dose. Neste ensaio, as moléculas Dbait de forquilha (Dbait32H, Dbait32-T4 e Dbait24H) e as moléculas lineares de Dbait de cadeia dupla (Dbait64 e Dbait64L) reduziram significativamente a sobrevivência clonogénica. Vale ressaltar que a molécula Dbait32C dumbell que não possui extremidades dsDNA livres (protegidas por um ligador de hexoetilenoglicol em ambas as extremidades) não apresentou nenhum efeito. A natureza química da alça não importa (Dbait32H versus Dbait32-T4) . Essas observações indicam que algumas das moléculas Dbait podem efetivamente sensibilizar células para radiação ionizante em células cultivadas. A Figura 2.2 confirma as observações anteriores e fornece dados adicionais que uma cadeia simples ou moléculas Dbait curtas de 8 pb não tiveram nenhum efeito. Além disso, mostra que o efeito não era dependente da sequência (Dbait32H versus Dbait32Hc).

Tabela 2: Sobrevivência celular em células competentes DNA-PK (M059K) e células deficientes DNA-PK (M059J) após tratamento com radiação e Dbait. As células foram diluídas e plaqueadas para formar colónias em frascos que foram então irradiados com 10 Gy e/ou transfectados com 2 pg de Dbait32Hc. Quando ambos os tratamentos foram conjugados, a irradiação foi realizada 5 h após a transfecção. A sobrevivência é calculada como o número de células que formam clones após o tratamento dividido pelo número de células que formam clones na amostra não tratada. O valor médio e o desvio padrão (entre parênteses) foram calculados de três experiências independentes. tratamento a-

Linha celular Irradiação Transfecção sobrevivência. M059K não não 100(4.41} 10 Gy oao 9.63(0.61) 10 Gy Dbait32Hc 3,47(1,01) MOS9J não não 100(2,97} DNA-PK-nuio 10 Gy não 3,97 (0,36) 10 Gy Dbait32Hc 3,98(0,35) 0 efeito da transfecção de Dbait32Hc na sobrevivência de células de tipo selvagem e mutantes em DNA-PK após a irradiação com γ foi estimado pela formação de colónias. A sobrevivência após a irradiação diminuiu de 9,83% em células M059K não transfectadas para 3,47% em células transfectadas com Dbait32Hc. Na correspondente linha de células mutantes DNA-PK-nulo, M059J, por contraste, a sobrevivência não foi afetada pela transfecção com Dbait32Hc. 0 nivel de sobrevivência foi semelhante na linha celular de tipo selvagem irradiada e transfectada com Dbait32Hc em relação ao observado nas células mutantes DNA-PK-nulo após apenas irradiação (3,47% em comparação com 3,97%) . Isso sugere que Dbait32Hc inibe a reparação dependente de DNA-PK nas células transfectadas de tipo selvagem. 3.2) Inibição da integração ilegítima de DNA exógeno por moléculas Dbait A radiação ionizante é conhecida por melhorar a integração ilegítima de DNA exógeno, um processo denominado integração melhorada por radiação. A cultura de células Hela foi utilizada para este ensaio. As células foram transfectadas durante 8 horas por 2 pg de um plasmideo linear que possui o gene que codifica a resistência à neomicina e três diferentes proporções de DNA/Superfect (1:2, 1:5, 1:10). Durante o tempo de transfecção, as células foram expostas a diferentes protocolos de irradiação: sem irradiação, uma única irradiação de lGy e 2Gy, bem como uma irradiação de 2Gy administrada por doses fracionadas de 0,5 Gy a cada 2 horas (4x0,5Gy). A integração do plasmideo foi monitorizada por seleção de células NeoR crescendo num meio contendo 0,6 mg/mL de G418. A integração do plasmideo foi significativamente aumentada pelo protocolo de irradiação fracionada. Quando foram adicionados 2 pg de moléculas Dbait32H à mistura de transfecção, a integração aumentada por radiação foi suprimida (figura 2.3). A Figura 2.4 fornece dados adicionais que mostram que apenas as moléculas Dbait de 32 pb (Dbait32H e Dbait32Hc) foram capazes de inibir a integração ilegítima aumentada por radiação de um plasmideo circular que transportava o gene codificando para a resistência à puromicina, enquanto moléculas Dbait mais curtas (DbaitlôH, Dbait8H), moléculas Dbait de uma cadeia simples ou dumble (Dbait32ss e Dbait32C) não foram eficazes. Wortmanina (Wort) e NU7026 (NU) que são inibidores conhecidos da PI3K (incluindo DNA-PK) foram utilizados como controlo.

Estas experiências mostraram que a integração ilegítima aumentada por radiação de DNA exógeno que requere proteínas Ku, DNA-PK e ATM (Nimura et al., 2002) é inibida por moléculas Dbait 32 pb de uma maneira independente da sequência, como esperado, uma vez que o mecanismo de ação dessas moléculas Dbait atua através do sequestro das proteínas envolvidas numa via NHEJ. 3.3) Persistência dos locais de DSB após irradiação nas células transfectadas por moléculas Dbait

Os locais de DSB nos núcleos podem ser monitorizados por imunofluorescência do anticorpo γ-Η2ΑΧ que se liga no H2AX fosforilado (uma variante da histona H2A) . A maioria dos focos γ-Η2ΑΧ aparecem rapidamente após a irradiação e desapareceram à medida que o processo de reparação das DSB progrediu.

Os protocolos de transfecção e irradiação foram semelhantes aos descritos acima. Para a imunodeteção, as células foram cultivadas em lamelas de superfície em placas de Petri de 5 cm de diâmetro, transfectadas com 2 pg de moléculas Dbait32H-FITC marcadas com FITC com Superfect (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Quatro horas após o início da transfecção, as células foram irradiadas (2Gy), depois em repouso durante 2 horas no meio de cultura a 37 °C. Após 3 ciclos de lavagem, as células foram fixadas com 2% de PFA durante 10 minutos. Após uma lavagem adicional, a presença de γ-Η2ΑΧ foi detetada com anticorpo de coelho anti-Y-H2AX (4411-PC, Trevigen) diluído 1/100 em 1 x PBS, 1% de BSA. As células foram lavadas três vezes com lx PBS, 0,5% de TritonX-100, depois incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpos de cabra conjugados com rodamina anti-coelho, diluídos 1/100 em lx PBS, 1% de BSA. As células foram visualizadas por microscopia de epifluorescência. A Figura 2.5 mostra os resultados obtidos com células Hela transfectadas por moléculas fluorescentes Dbait32H-FITC às 2 horas após a irradiação 2Gy. Painel esquerdo: fluorescência de Dbait32H-FITC (pontos e manchas brilhantes) e focos de DBS detetados por imunofluorescência do anticorpo γ-Η2ΑΧ em núcleos; Painel direito: a mesma imagem de núcleos com focos DSB detetados por imunofluorescência do anticorpo γ-Η2ΑΧ e contra coloração com DAPI. As setas no canto inferior esquerdo mostram a ausência do sinal Dbait32H-FITC e γ-Η2ΑΧ no núcleo. As setas no canto superior direito mostram os sinais Dbait32H-FITC e γ-Η2ΑΧ co-localizados. Conforme mostrado na figura 2.5, os locais DSB persistiram em células Hela transfectadas por moléculas Dbait32H-FITC duas horas após a irradiação (2Gy), como mostrado pela marcação dupla fluorescente com Dbait32H-FITC e a do anticorpo γ-Η2ΑΧ. Vale a pena notar que os focos DSB eram quase indetetáveis nas células que não eram eficientemente transfectadas por Dbait32H-FITC. Esses dados sugerem que a reparação das DSB foi prejudicada nas células eficientemente transfectadas por Dbait32H, enquanto a reparação do DNA estava completa nas células menos bem transfectadas. A Western blot foi realizada usando anticorpo monoclonal de coelho anti-fosfoThr68-Chk2 (Cell Signaling Technology, Denver, EUA), monoclonal clone AC-15 antί-β-actina (Sigma, MS, EUA), anti-H2AX (Cell Signaling Technology, Denver, EUA) e um H2AX de ratinho anti-fosfo-histona (Serl39) (Upstate, Tempcula, CA, EUA). 0 painel superior da Figura 2.6 mostra a análise de Western Blot da forma fosforilada da histona H2AX (γ-Η2ΑΧ) em comparação com a fosforilação total da proteína H2AX da histona H2AX por PIKKs. As células Hep2 foram transfectadas 5 horas com várias moléculas Dbait 32Hc, 24H, 16H e 8H durante 5 h, ou não transfectadas. Elas foram irradiadas no final da transfecção, incubadas durante uma hora e depois analisadas. Isto mostra que Dbait32Hc aumentou bastante a forma fosforilada de H2AX (γ-Η2ΑΧ) em comparação com o controlo (ambas as células irradiadas ou nenhuma). Outras moléculas Dbait mais curtas tiveram efeito muito menor ou nenhum.

Para investigar o efeito de Dbait sobre formação e perda de focos γ-Η2ΑΧ induzidos por radiação ionizante, Dbait32H-Cy3 foi transfectada nas células Hep2 por Superfect (Qiagen). As células Hep2 transfectadas ou não transfectadas foram irradiadas a 10 Gy. As células foram fixadas em horários diferentes (0 min, 30 min, 1 hora, 5 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 7 dias). O anticorpo monoclonal primário de ratinho para g-H2AX (serl39) (Upstate, Tempcula, CA, EUA) foi utilizado numa diluição 1/500 e incubado durante 2 horas a 0 °C, depois lavado por tampão PBS e incubado com o segundo anticorpo conjugado Alexa 488 anti-IgG de ratinho (Molecular Probe, Eugene, OR, EUA) diluído em 1/200 durante 1 hora na sala escura. A cinética da persistência dos locais DSB foi revelada por γ-Η2ΑΧ nas células irradiadas pelo citómetro de fluxo FACScan (FACSalibur, Beckton-Dickinson, EUA). A Figura 2.6 painel inferior mostra que o nivel de γ-Η2ΑΧ permaneceu alto e longo nas células transfectadas Dbait32H em comparação com os controlos (células irradiadas, mas não transfectadas ou não tratadas). Esta experiência indicou que Dbait32H retardou substancialmente a reparação de DSBs induzida por radiação ionizante.

Exemplo 4: Efeitos das moléculas Dbait na linha celular GMA32 e sua associação com a irradiação ou inibidores mitóticos.

As células de fibroblastos de hamster chinês GMA32 permissivas de quebras de DNA foram mantidas em meio MEM (Gibco) suplementado com piruvato de sódio a 1 mM, glutamina a 2 mM, lx MEM aminoácidos não essenciais, lx penicilina/estreptomicina e 10% de soro de cavalo. Tipicamente, 2xl05 a 4xl05 de células foram inoculadas em meio sem antibióticos, em placas de Petri de 5 cm de diâmetro 24 horas antes da transfecção de diferentes moléculas Dbait (4,5 pg) com lipofectamina 2000 (Life Technologies) como agente de transfecção (numa proporção de 1:3), de acordo com as instruções do fabricante. No final da transfecção, as células foram irradiadas (4Gy) ou tratadas com inibidores mitóticos: nocodazol (200nM), navelbina (lOOnM) ou taxol (200 nM).

Aproximadamente 16 horas depois, o fármaco foi removido e as células foram deixadas para se recuperar. A irradiação celular foi realizada com raios γ de uma fonte de 137Cs. Após uma recuperação de 24 horas, as células foram recolhidas e utilizadas para análise FACS, western blot ou para determinar a clonogenicidade (sobrevivência) e o efeito de cada tratamento . A Figura 3.1 mostra as análises FACS das células GMA32 não tratadas, as células transfectadas isoladamente, ou transfectadas com diferentes moléculas Dbait por lipofectamina, mas sem tratamento adicional de irradiação ou inibidor mitótico. A fase Ml representa a percentagem de células no estágio sub-Gl indicativo de morte celular. A morte celular significativa foi observada apenas na presença de moléculas Dbait32 de cadeia dupla e Dbait32H de forquilha, enquanto que a DbaitlôH de forquilha e a Dbait32ss de cadeia simples induziram morte celular intermediária e moderada, respetivamente. A Dbait8H mais curta não conseguiu desencadear a morte celular em comparação com o controlo (células transfectadas apenas com lipofectamina).

As experiências foram realizadas com um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson). As células foram recolhidas, suspensas em 1 mL de tampão de GM frio (glucose a 6,5 mM, NaCl a 137 mM, KC1 a 5,4 mM, Na2HP04 a 2 mM, KHP04 a 1 mM, EDTA a 0,5 mM) e armazenados a 4 °C durante pelo menos 2 horas após a adição de 3 mL de etanol a 100% frio.

Nesta fase, as células foram eventualmente lavadas com lx PBS, depois coradas durante 30 minutos à temperatura ambiente na solução de PI (iodeto de propídio a 50 pg, 25 pg/mL de RNase A em lx tampão PBS). Foram analisados 10.000 eventos com o software Cellquest, e os agregados celulares foram colocados fora da seleção. A percentagem de células com um conteúdo sub-Gl de DNA foi marcada.

Nas mesmas condições, a imunodeteção de focos DSB de γ-Η2ΑΧ fosforiladas em serina 139 por marcação γ-Η2ΑΧ (pontos brilhantes ou manchas em núcleos) foi realizada nas células GMA32 não tratadas, as células transfectadas isoladamente ou transfectadas com diferentes moléculas Dbait por lipofectamina. A contra coloração de membranas e núcleos celulares foi realizada por FITC-DÍ0C6 e DAPI. Foram observados efeitos semelhantes das moléculas Dbait (Figura 3.2) . Esta experiência mostra que tanto Dbait32 de cadeia dupla quanto a Dbait32H de forquilha podem efetivamente desencadear resposta celular semelhante, como se os danos do DNA fossem ocorridos nos núcleos. Isso fornece evidência visual de que essas moléculas Dbait podem ser usadas para capturar proteínas envolvidas na reparação DSB através da via NHEJ.

Para a imunodeteção, as células foram cultivadas em lamelas em placas de Petri de 5 cm de diâmetro 24 horas antes da transfecção com diferentes moléculas Dbait. Um dia após a transfecção, FITC-DÍ0C6 (Molecular Probes) foi adicionado no meio 5 minutos a 37 °C (corante de contraste para as membranas). Após 3 ciclos de lavagem, as células foram fixadas com 4% de PFA durante 20 minutos.

Após a lavagem adicional, γ-Η2ΑΧ fosforilada na serina 139 (γ-Η2ΑΧ) foi detetada com anticorpo de coelho anti-Y-H2AX (4411-PC, Trevigen) diluído 1/100 em lx PBS, 1% de BSA. As células foram lavadas três vezes com lx PBS, 0,5% TritonX-100, depois incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpos Alexa 594 de cabra anti-coelho (Molecular Probes) diluído 1/100 em lx PBS, 1% de BSA. As células foram visualizadas por microscopia de epifluorescência.

Experiências adicionais foram realizadas para procurar evidências de sinalização de danos no DNA. A proteína p53 é uma proteína principal bem conhecida na mediação da sinalização da degradação do DNA e na coordenação de respostas apropriadas (reparação do DNA, apoptose, etc.), por alteração do seu estado de fosforilação. Em particular, a fosforilação do resíduo de serina 15 está envolvida na interação com a proteína MDM2 que atua como retrocontrolo. Assim, o estado de fosforilação da serina 15 de p53 foi avaliado por Western blot. A Figura 3.3 mostra que a serina 15 de p53 foi altamente fosforilada quando as células foram transfectadas por Dbait32 de cadeia dupla ou moléculas Dbait32H de forquilha, enquanto que a DbaitlôH mais curta de forquilha induziu fosforilação moderada. Nem as Dbait8H mais curtas nem as moléculas Dbaut32ss de cadeia simples foram capazes de induzir fosforilação significativa na serina 15 da proteína p53 .

Esta experiência fornece evidências adicionais de que a presença de Dbait32 de cadeia dupla e Dbait32H de forquilha em células GMA32 foi detetada coma degradação do DNA e induziu o sinal às respostas dos transdutores, como a fosforilação da proteína p53, provavelmente através da via de ativação ATM.

Para a análise de Western blot, as células foram lisadas no tampão Laemmli. Quantidades iguais de lisados foram resolvidas em 12% de gel de poliacrilamida. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose, que foram bloqueadas com 5% de leite desnatado (1 hora) antes da incubação durante a noite com anticorpo anti-p53Serl5 (9284, Cell Signalling) diluído 500 vezes em tampão TBST (Tris-HCl a 10 mM pH 7,5, NaCl a 150 mM, Tween 20 a 0,1%) contendo 5% de leite desnatado. As membranas foram então incubadas com anticorpos secundários IgG de cabra conjugados com peroxidase de rábano anti-coelho (P0448, Dako) diluídos 1/5000 em TBST. Os complexos proteína-anticorpo foram detetados por quimiluminescência melhorada (RPN2106 ECL, Amersham). O efeito da radiosensibilização e quimiosensibilização das moléculas Dbait em células GMA32 foi avaliado pelo teste de clonogenicidade (sobrevivência clonal). Para o ensaio de clonogenicidade, as diluições em série foram feitas depois de contar as células para inocular placas de Petri de 5 cm com diferentes quantidades de células. O número de células varia de 100-200 (células de controlo) a 3000 (células transfectadas e/ou tratadas). Dez dias depois, as células (formando clone) foram fixadas com paraformaldeido a 4% (20 minutos), depois coradas com azul de metileno (15 minutos) e o número de clones em cada placa (em triplicado) foi avaliado. A Figura 3.4 mostra que a radiosensibilização para a irradiação 4Gy foi observada em células GMA32 transfectadas com Dbait32 de cadeia dupla ou moléculas Dbait32H de forquilha. Além disso, a quimiosensibilização também foi observada para células GMA32 transfectadas com Dbait32 de cadeia dupla ou moléculas Dbait32H de forquilha quando foram tratadas por inibidores mitóticos (nocnazol a 200nM, navelbina a 100nM (vinorelbina) ou taxol a 200nM (paclitaxel)). Esses fármacos são conhecidos como potentes inibidores da polimerização ou despolimerização de microtúbulos. Dbait32 e Dait32H foram capazes de aumentar a atividade citotóxica desses inibidores mitóticos.

Exemplo 5: Radiosensibilização do tratamento de tumores humanos xenotransplantados em ratinhos nus A atividade in vivo das moléculas Dbait em associação com a radioterapia foi avaliada utilizando ratinhos nus xenotransplantados com tumores humanos por injeção subcutânea de linhas celulares radioresistentes (Hep2 derivado de carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, HNSCC) ou fragmentos de tumor (anteriormente obtidos por injeção subcutânea das linhas celulares U87 derivadas do glioblastoma).

As investigações foram realizadas principalmente nos ratinhos xenotransplantados com tumores HNSCC humanos radioresistentes, a fim de estabelecer a validação do conceito in vivo. A irradiação foi realizada com raios γ de uma fonte de 137Cs com proteção adequada de ratinhos, a fim de realizar a irradiação localizada de tumores. As condições típicas do ensaio consistem na injeção intratumoral de 1 nmole de uma preparação apropriada de moléculas Dbait com agentes de transfecção (dendrímero catiónico (Superfect, Qiagen), dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS, Polyplus transfection), polietilenimina (PEI, Polyplus transfection) de acordo com as instruções do fabricante, 5 horas antes da irradiação. Uma dose total de 30 Gy foi administrada em 5 semanas: i) 3x2Gy/semana (cerca de um a cada dois dias); ii) 5Gy/semana; iii) 15Gy/2 semanas.

O tamanho do tumor foi medido 2-3 vezes por semana. O tratamento por irradiação e injeção intratumoral de meio MEM (o tampão de diluição de Dbait) foi utilizado como controlo do tratamento de irradiação sem Dbait. O volume de tumor foi calculado (V = 2xaxb2, onde a = comprimento, b = largura). A proporção de volume medido em t tempo sobre o volume inicial (Vt/Vi) foi utilizada como indicador da progressão tumoral. Os ratinhos foram seguidos até 100 dias. Pelo menos 4 séries independentes de seis animais foram testadas.

Os resultados são ilustrados pela figura 4.1 (Painel A: Braço não tratado (n = 38); Painel B: braço de controlo com 20 pL de meio de cultura (MEM) + 3x2Gy/semana de irradiação (n = 30); Painel C: o braço com 1 nmole (20 pg) Dbait32H + 3x2Gy/semana de irradiação (n = 35). O MEM ou Dbait32H foi administrado por injeção intratumoral 5 horas antes da irradiação. A dose de irradiação fracionada (2 Gy) foi administrada uma de cada dois dias, três vezes por semana. O tratamento durou 5 semanas totalizando a irradiação de 30 Gy. Os pontos representam o curso do tempo do volume tumoral de cada ratinho. As linhas contínuas são o melhor ajuste polinomial. O painel D mostra um gráfico de Kaplan-Meier de todos os ratinhos, dos quais o aumento do volume tumoral (Vt/Vi) <5.

Uma quantidade significativa de dados foi acumulada no braço de Dbait32H com irradiação de 3x2Gy/semana (painel C, n=35) que mostrou claramente a radiosensibilização em comparação com os braços controlo: não tratados (painel A, n=38), MEM+3x2Gy (painel B, n=30). O teste estatístico de Man e Whitney deu valor de p=0,00067 para o braço de Dbait32H+3x2Gy versus MEM+3x2Gy. A mesma tendência foi observada num gráfico Kaplan-Meier de ratinhos com volume tumoral (Vt/V± <5) menor do que cinco vezes o volume inicial (painel D).

Investigações adicionais foram realizadas subsequentemente em ratinhos com tumores HNSCC, U87, LU1205 e SK28 humanos xenotransplantados de modo a definir caracteristicas moleculares de moléculas Dait e protocolo ótimo para atividade in vivo. Os dados obtidos da coorte estudada foram consistentes com caracteristicas moleculares das moléculas Dbait observadas em estudos bioquímicos e in vitro (ver exemplos 2, 3 e 4) . Além disso, foi demonstrado que a radiosensibilização depende da duração do ensaio entre a injeção intratumoral de Dbait32H e a radiação ionizante: 5 horas >> 1 hora. A radiosensibilização também foi observada em ratinhos xenotransplantados com tumores de glioblastoma humano. 0 glioblastoma é o grau mais alto de tumor cerebral, e é caracterizado pela sua extraordinária progressão agressiva com resultado fatal rápido e resistência a radioterapia e quimioterapia. 2-3 milhões de células U87 derivadas de glioblastoma humano foram primeiro injetadas subcutaneamente em ratos nus. 0 tumor transplantado foi então retirado e utilizado para inocular posteriormente outros ratinhos nus por transplante subcutâneo de tumor de glioblastoma de cerca de 8 mm3. A Tabela 3.1 mostra os dados de uma série piloto de tumores de glioblastoma humano xenotransplantado em ratinhos nus. 50% dos ratinhos no braço que receberam Dbait32H (lnmole) por injeção intratumoral e irradiação (1x15 Gy/semana ou 3x5Gy/semana, seguido de uma semana de descanso, depois um segundo ciclo de tratamento, a dose total de radiação ionizante foi de 30Gy) apresentaram volume tumoral <4cm3 no dia 25 após o início do tratamento, enquanto que 100% de ratinhos nos braços controlo (não tratados ou irradiados e injetados com solução salina (PBS)) apresentaram volume tumoral bem superior a 4 cm3 e foram mortos antes do final do ensaio de acordo com regulamentação atual sobre ética animal antes do final do tratamento.

Tabela 3.1: Ensaio de radiosensibilização de glioblastoma humano xenotransplantado em ratinhos nus por Dbait32H (1 nmole/injeção intratumoral). Foram utilizados dois protocolos de irradiação (5 horas após a injeção intratumoral): lxl5Gy/semana, ou 3x5Gy/semana, seguido de uma semana de descanso, o segundo ciclo de tratamento. A dose total de irradiação foi de 30Gy. Os grupos de controlo foram os não tratados ou os grupos receberam injeção de solução salina (PBS).

Srupos analisados {Slioblastoasa xenotransplantado) Número de ratinhos onde o Volume do Tumor <4chv* No dia 25 (5 ratinhos por grupo) Não tratado 0/6 PBS + 1 X15 Gy /semana 0 / 6

Dbait32H+ 1 Xl 5 Gy /semana 3 / 6 PBS + 3x5 Gy/semana 0 / 6

Dbaií32Ht 3x5 Gy /semana 3 / 6

Com base nesses dados encorajadores in vivo que forneceram evidências de que as moléculas Dbait podem melhorar eficientemente a eficácia da radioterapia, experiências adicionais foram projetadas e realizadas para fornecer dados adicionais relacionados ao uso das moléculas Dbait como agente adjuvante para sensibilização da radioterapia e para fortalecer a prova do principio da abordagem do isco de DNA na terapia anticancerigena. A Figura 4.2 mostra a distribuição de Dbait32H marcado com cianina C3 em tumor Hep2 de xenotransplante em ratinhos nus (linha de células HNSCC) em ratinhos nus. 20 pg de Dbait32H-Cy3 formulada com Superfect (agente de transfecção) foram injetados em 1,5 cm3 de tumor Hep2. Os ratinhos foram sacrificados 6 horas após a injeção. Os tumores foram retirados e crio-cortados para análise sem fixação. DAPI foi usado para coloração de núcleos. A fluorescência da cianina 3 mostra que as moléculas Dbait32H-Cy3 foram distribuídas no tecido tumoral do vaso capilar do sangue e estavam localizadas no núcleo celular. A Figura 4.3 mostra outra experiência em tumores xenotransplantados Hep2 como descrito na figura 4.1. 0 crescimento tumoral foi monitorizado durante o tratamento e depois em quatro grupos de 10 animais com diferentes tratamentos (não tratados, tratados com Dbait32H apenas, tratados apenas por irradiação e Dbait32H e irradiação em combinação). O crescimento individual do tumor é indicado para cada animal. O protocolo de tratamento foi o mesmo como descrito na figura 4.1. A experiência começou quando o volume dos tumores Hep2 atingiu 150-200mm3. Para cada sessão de tratamento, 20 pg de Dbait32H formulados com polietilenoimina (PEI, Polyplus Transfection, Estrasburgo, França) de acordo com as instruções do fabricante foram injetadas no tumor 5 horas antes da irradiação com 2Gy. O crescimento tumoral foi grandemente reduzido no grupo tratado com Dbait32H e irradiação combinados em comparação com os grupos tratados por irradiação ou Dbait32H apenas. A Figura 4.4 mostra a representação de Kaplan-Meier da sobrevivência de ratinhos nus subcutaneamente xenotransplantados pelo tumor Hep2. Por razões éticas, os animais foram sacrificados quando seus tumores atingiram 2cm3. Este ponto terminal foi usado como morte na análise de sobrevivência. O protocolo de tratamento foi descrito na figura 4.3. Os cinco grupos foram incluídos: não tratados, tratados com mock e irradiados, tratados por irradiação e quantidade crescente de Dbait32H (20, 60 e 120 pg/sessão) em combinação. 0 número de animais para cada grupo é indicado na tabela 3.2. Observou-se um efeito claro dependente da dose nos grupos tratados com Dbait32H e irradiação com 2Gy. Imagens de tumores representativos dos grupos (não tratados, tratados com 20 e 60 pg de Dbait32H/sessão associados à irradiação com 2Gy) que foram tiradas 15 dias após o inicio do tratamento, no final do tratamento (35 dias) e 13 dias após o final do tratamento (35 + 13 dias). Estas forneceram uma comparação visual clara do beneficio do tratamento de Dbait32H e irradiação combinados. A Figura 4.5 mostra a análise histológica de tumores xenotransplantados de Hep2 no tratamento intercalar (7 sessões). Os tumores foram retirados 20 dias após o inicio dos vários protocolos de tratamento, conforme indicado na figura 4.3. Eles foram fixados em formalina e as secções de tecido foram coradas com hematoxilina, eosina e safran. Dois tumores para cada protocolo de tratamento foram analisados por microscopia. O aumento da necrose e da apoptose foi observado nos tumores tratados por Dbait32H e irradiação combinados em comparação com os tumores tratados por irradiação apenas. A Figura 4.6 mostra a RMN de tumores xenotransplantados de Hep2 no tratamento intercalar (7 sessões) . Três imagens de representativas do corte transversal são mostradas com tumor não tratado, tumor tratado por irradiação e por combinação de Dbait32H (20 pg/sessão) e irradiação (2Gy/sessão). A área necrótica foi mais importante no tumor tratado com Dbait32H e irradiação do que o tratado por irradiação apenas. Isto é consistente com a análise citológica dos tumores (ver figura 4.5) . A Figura 4.7 mostra a representação de Kaplan-Meier da sobrevivência de ratinhos nus xenotransplantados subcutaneamente com tumores Hep2, U87, LU1205 e SK28 e os seus grupos de controlo (não tratados, tratados apenas por irradiação). 0 protocolo de Hep2 foi descrito na figura 4.3. Outros tumores foram tratados por um protocolo modificado em que uma irradiação fracionada de 5Gy foi aplicada em três dias consecutivos, e seguida de quatro dias de repouso, e o tratamento foi repetido uma vez. A dose total de irradiação (6x5Gy) é igual à do protocolo utilizado para tratar o tumor Hep2 (15x2Gy). 0 resultado favorável da combinação de Dbaut32H e irradiação foram observados em todos os quatro tumores humanos xenotransplantados. Como mecanismo de ação subjacente das moléculas Dbait e a via ubíqua do NHEJ em todas as células, prevê-se que isto seja válido para outros tumores com diferentes histologias.

Foram realizadas análises descritivas da resposta tumoral para cada tratamento e cada tipo de tumor. 0 dia 1 foi o dia da primeira sessão de tratamento. Todos os animais foram seguidos por pelo menos 150 dias ou até seu sacrifício ético. A vida média foi estimada de acordo com o método de Kaplan-Meier. TGD foi calculado subtraindo o tempo médio de quadruplicação do volume do tumor do grupo de controlo dos tempos de quadruplicação do volume do tumor de ratinhos individuais em cada grupo tratado. TGD médio foi calculado para cada grupo tratado usando as medidas individuais.

As curvas de sobrevivência globais foram avaliadas por estimativas de Kaplan-Meier e comparadas usando o teste não paramétrico Log Rank, uma vez que os dados não seguem uma distribuição normal. A análise utilizou o software da versão S-Plus 6.2 (MathSoft Inc., Seattle, WA) e statEL (ad Science, Paris, França) . Um Log Rank global foi realizado pela primeira vez para cada grupo com o mesmo tipo de tumor. Em seguida, os tratamentos com Dbait foram comparados com o controlo tratado com mock. 0 número de animais (η), o risco relativo (RR) e o valor de P são apresentados na Tabela 3.2. Todos os testes foram considerados significativos no nivel de significância de 0,05.

Tabela 3.2 resume uma parte dos dados acima descritos e fornece a comparação da sobrevivência de animais xenotransplantados tratados por protocolos diferentes (várias moléculas Dbait32 + irradiação versus irradiação + Injeção de Mock) em três linhas de células tumorais humanas xenotransplantadas subcutaneamente em ratinhos nus. Além disso, mostra que a sequência de moléculas Dbait não importa, como evidenciado pelo resultado semelhante de Dbait32Hc em comparação com Dbait32H. Mostra também que a cadeia simples Dbaut32ss foi inativa mesmo em doses elevadas.

Deve ser salientado que a Dbait32Hc está desprovida de CpG na sua sequência de modo a evitar o efeito da reação imunológica devido a imunoestimulações mediadas por recetores do tipo Toll bem conhecidos.

Em conclusão, a redução significativa no crescimento tumoral de tumores radioresistentes humanos (IHep2, U87 e SK28) e tumores radiosensíveis (LU1205) xenotransplantados em ratinhos nus fornece evidência de que as moléculas Dbait podem eficientemente radiosensibilizar o efeito da radioterapia sobre esses tumores agressivos. Assim, a validação do conceito de abordagem do isco de DNA foi alcançada in vivo.

Exemplo 6: Quimiosensibilização do tratamento de tumores digestivos induzidos em ratinhos transgénicos K-

Rasvl2GxApc1638N

Um modelo de tumor endógeno de ratinho foi escolhido para avaliar a capacidade das moléculas Dbait para sensibilizar para quimioterapia anticancerigena. Para este fim, foram utilizados ratinhos transgénicos portadores de mutações K-Rasvl2G e Apc1638N. Eles foram obtidos através do cruzamento de dois ratinhos transgénicos: um portador do mutante K-Rasvl2G sob o controlo do promotor da vilina de ratinho (pVill/K-Rasvl2G) (Janssen et ai., 2002), o outro contendo a mutação Apc1638N num alelo (Fodde et ai., 1994) . Os ratinhos transgénicos com as mutações pVill/K-Rasvl2GxApc1638N desenvolveram tumores espontâneos no trato digestivo com a idade de cerca de 5 meses e morreram rapidamente.

Eles foram tratados na idade média de 12 semanas por uma combinação de quimioterapia (5FU + CPT11) e de Dbait32H versus quimioterapia apenas, de acordo com o protocolo mostrado na figura 5.1, painel A. O protocolo inclui três ciclos de tratamento.

Cada ciclo consiste em injeção intraperitoneal de 0,6 mg 5FU e 0,6 mg CPT11, juntamente com 0,1 mg de Dbait32H por administraçao oral, três vezes por semana, seguido de uma semana de descanso. 0 5FU (5-fluorouracilo, Teva) foi preparado em solução de NaCl a 0,9% à concentração de 50 mg/mL. CPTll/Irinotecano (Campto, Aventis) foi preparado em solução de NaCl a 0,9% na concentração de 20 mg/mL. 0 estado de saúde e a sobrevivência dos ratinhos foram monitorizados até a morte. Não foi observada indicação clínica de efeito tóxico adicional devido às moléculas Dbait.

Os resultados são mostrados na figura 5.1. Painel A: Protocolo de tratamento para três grupos/braços dos ratinhos transgénicos K-Rasvl2GxApc1638N na idade média de 12 semanas: o grupo controlo (não tratado), o grupo tratado com 5FU+CPT11, o grupo tratado com 5FU+CPT11 e Dbait32H. Foi realizado por três ciclos de tratamento. Cada ciclo consiste em injeção intraperitoneal de 0,6 mg 5FU e 0,6 mg CPT11, juntamente com 0,1 mg de Dbait32H por administração oral, três vezes por semana, seguido de uma semana de descanso. O número de ratinhos envolvidos em cada grupo é indicado entre parênteses. O ponto terminal é o tempo de sobrevivência; Painel B: Gráfico de Kaplan-Meier de curvas de sobrevivência dos três grupos; Painel C: O tempo médio de sobrevivência de três grupos como mostrado no painel B.

Apesar da coorte reduzida, observou-se melhoramento do tempo de sobrevivência no braço que recebeu a combinação de quimioterapia (5FU+11CPT) e Dbait32H (sobrevivência mediana=226 dias, valor p=0,2) em comparação com o braço da quimioterapia apenas (173 dias) e do controlo (175 dias) (painel B e C).

Ensaios adicionais estão atualmente em curso para aumentar os braços da coorte de 5FU+CPTll+Dbait32H e 5FU+CPT11, a fim de aumentar a significância estatística.

Uma série de ratinhos foi sacrificada duas semanas após o final do tratamento (na idade média de 18 semanas) para avaliar o número médio de tumores por animal. 0 intestino foi examinado por exame de macroscopia e histologia (coloração padrão por Hematoxilina-Eosina-Safran).

Os resultados são dados na figura 5.2. 0 número de animais em cada grupo foi indicado entre parênteses. Todos os ratos foram sacrificados duas semanas (semana 18) após o protocolo mostrado na figura 5.1, painel A. 0 número médio do braço de controlo (grupo não tratado, n = 101) é de 30,8/animal.

Ambos os exames mostraram consistentemente uma redução significativa do número de tumores (> 30%) no braço que recebeu a combinação de 5FU+CPT11 e Dbait32H (n=8) em comparação com o braço que recebeu quimioterapia apenas (n=7) (Figura 5.2). Vale a pena notar que o número médio do braço de controlo (grupo não tratado, n=101) é de 30,8/animal.

As amostras de tumores preparadas de animais tratados com moléculas Dbait marcadas com fluoresceína (Dbait32H-FITC) e 5FU+CPT11 foram analisadas utilizando métodos de coloração por imunofluorescência. Os focos marcados com γ-Η2ΑΧ foram co-corados com moléculas Dbait fluorescentes, em reminiscência do observado in vitro (ver exemplo 3.3 e 4). A Figura 5.3 mostra um ensaio adicional em que um ratinho transgénico K-Rasvl2GxApc1638N de 18 semanas de idade foi tratado consecutivamente por quimioterapia (5FU+CPT11) e Dbait32H-FITC durante três dias e sacrificado duas horas depois após o último tratamento como indicado no painel A. 0 intestino foi retirado e lavado por PBS. Em seguida, os tecidos tumorais foram recolhidos e congelados a -80 °C. Para a análise, amostras histológicas de 5 pm foram feitas dos tecidos tumorais congelados por criostato. Os focos de reparação do DNA foram detetados por imunofluorescência com anticorpo policlonal de coelho anti-Y-H2AX (Trevigen) diluído 1/500 em PBS e, em seguida, com anticorpo de cabra marcado com cianina 3 anti-coelho (Jackson) diluído 1/200 em PBS. As amostras também foram coradas por contraste por DAPI. As amostras foram visualizadas por microscopia de epifluorescência. Verificou-se que a fluorescência de Dbait32H-FITC foi disseminada heterogeneamente em tecidos tumorais (epitélio e estroma entre as estruturas glandulares) e tinha localização preferencial no núcleo (figura 5.3, painel B, esquerda). Padrão semelhante foi encontrado para locais γ-Η2ΑΧ (figura 5.3, painel B, à direita). Os sinais co-localizados Dbait32H-FITC e γ-Η2ΑΧ foram quase observados.

Em conclusão, a melhoria da sobrevivência e a redução do número de tumor por animal mostram consistentemente a evidência de quimiosensibilização do tratamento de tumores digestivos nos ratinhos transgénicos portadores de mutações K-Rasvl2GxApc1638N por moléculas Dbait (Dbait32H) . A análise aprofundada dos tecidos tumorais em animais tratados fornece evidências de que as moléculas Dbait interferem no processo de reparação do DNA.

Deve salientar-se que a administração oral de moléculas Dbait32H não incluiu nenhum agente de transfecção neste estudo.

Para resumir, os dados bioquímicos e in vitro são claramente consistentes com um mecanismo de ação das moléculas Dbait através da interferência com a reparação das DSB pela via NHEJ, e a via de transdução do sinal de reparação causada por danos diretos ou indiretos no DNA (radiação ionizante ou agentes quimioterapêuticos) . Devido à natureza independente de sequência, via NHEJ (Jackson, 2002; Barnes, 2001, Downs &amp; Jackon, 2004), não há limitação nas sequências e no comprimento das moléculas Dbait além de um comprimento mínimo (cerca de 32 pb). Estudos in vivo confirmaram uma eficiente sensibilização por moléculas Dbait da radioterapia e quimioterapia de tumores em ratinhos. Tomados em conjunto, todos os dados forneceram consistentemente provas de conceito da abordagem DNA "Isco", caracterizando as características moleculares das moléculas Dbait.

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<11Q> INSTITUT CURIE

Centre National ds la Recherche Scientifique MUSEUM NATIONAL D’HISTGIRE NATURELLE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (IHSERM) <120>Dbait e suas utilizações

<13Q> 80515WO <150> US 11/524,528 <151> 2006-09-21 <160> 27 <170> Pateotlnversão 3.3

<21G> 1 <211> 32 <212> DNA <213> sequência artificial <22Q> <223> Dbait32 <220>

<221> (Ti!sc_featiifB <223> /nota=" nas extremidades 5’ e 3' da sequência complementar os três últimos nucleotidos com estrutura base fosforotioato” <220> <221 > base_jaod± ficada <222> (1)..(3) <223>base_mc,d!= estrutura base fosforotíoato <220> <221 > fcass_KJo-dif ics-dâ <222> (30)..(32) <223>base. :···.· « ·, ra base >·::>· r < · · ·.: · <4QQ> 1 acgeacgggt gíSgggísgí tígttcggat ct 32

<210> 2 <211 >32 <212> DhiA <2T3> sequência artificial <220> <223> Dbait 32:H-po <220> <221 > haste_alç.a <222> ¢1)..(32) <220> <221 > trt:sc_feaíure <222> (32).,(32} <22?i> ãlça—liçíante huuuut 11 cr: o :fliccl <40ô> 2 acgeacgggí gtígggícgt tígttcggat ct 32

<210>3 <211 >32 <212> DMA <213> sequência artificiai <220> <223> Dbait32H <220> <221 > miscjeaíune <223> / notã="na extremidade '6 ’ da sequência cciaplementar os três últimos núcleot idos com estrutura bass fosforotioato" <220> <221 > haste alça <222> (1)..(32) <220> <221 > *·: :::·.·; : i :.t <222> (1)..(3} <223> base mod.—est.rut.ura base fosforcticat.o <220> <221 > mise_feature <222> (32)..(32) <223> alça=ligante hexaetiier.egiicoi <400>3 acgcacgggt gftgggtcgt ttgíícggat cf 32

<21G>4 <211 >24 <212» DMA <213> a;:· : -·.· artificial <22G>

<223> Dhaif24H <220> <221 > misc_fesíure <223» /nota="na extremidade 3' cia sequência complementer os três últimos micleótidos com esti\itura base fosforctioato" <220> <221 » haste_alça <222» (1)..(24) <220> <221 > base_modi ficada <222» {1)..(3) <223>basejBod.*estíutura base fosfoiotioato <22G> <221 > miscjeature <222> {24)..(24) <223 > aiça=iigante hexaetiienogiicoi <400»4 acgcacggg! gltgggfcgí ftgi 24

<210>5 <211> 1S <212» DMA <213» sequência artificiai <22G>

<223> DbaiilSH <220> <221 > misc_fe3íure <223> /nota = "na extremidade 3* da sequência complementer os t.rê:s últimos micieóticiC'S comi sstnutura &amp;3.S0 rosfoiotioato <22Q> <221> haste_alça <222» {1)..(16) <220> <221 > nase_modifícada <222> {1)..(3) <223» base mod=sstrutura base fosforotioato <22G» <221 > rntse_ feature <222> (16)..(16}

<223> aiça=Iicjante hexaetiieinogiicol <400» S acgcacgggí gtíggg 16

<210 8 <211>8 <212> DNA <213> sequência artificiai <220> <223> DbaftSH <220> <221> tnisc_feature <223> /nc'ta=”ria ext rei» ida de 3r da sequência complementar os três últimos nucleotides corn estrutura base fcsforotic-ato” <220> <221> haste_alça <222>{1}..<S) <220 <221 > base_raodificada <222> (1)..(3) <223> base_iaod*estxutura base fosforctioato <22Q> <221> misc_feaktre <222> (8)..(8)

<223> alça=i .1 gante iiexaeti 1 eno glicoI <408> 6 acgcscgg 8

<210> 7 <211 >32 <212> DMA <213> sequência artificiai <228> <223> Dbaií32ss <220 <221 > fiase_inodi ficada <222> (1)..(3) <223> base mod-estrutura base fc-sf orocioat.o <220> <221 > base_mcdi ficada <222> {30)..(32) <223> base lacd.—estrutura base fosforctioato <40O> 7 acgcacgggt gSyggtcgl ttgilcggai ct 32

<210>8 <211> 88 <212> DNA <213> Ξ&amp;ίΦ^^ηο1β artificial <220> <22â> èytó-M <220 > <2'2í> f!iisc_fe?.Í!ir« <223> -'"iv:.:"*:!-"na <S2£;tr;$ffi4;da:ííè 3’ ds eoíft^ié^éivèsr G''3. t-^:ès' àit-ÍjtLO:S ^^çi^ot.q.:çi!b.s .G:'ç-ía •&amp;si“:r:i2tvura húk&amp; ; :f ;o:5 f;&amp;r-0feioat o·”' <22f> <221> »as>:9_alçl; ''222'’ (-!). /32) <22f> <221> a3-e_Kodifiçada <222:’ (1)..(¾ <2235'B'?se_«iod=-'! “:>r=! V'Rse <220'’ <221·:' m:sc_fea!Lire <222'’ (33' \?A) <223>âiç£i <40C> 8

acgcacgggt gttggglcgt LLgltcgga;. tttfcLtagat ccgaacaaac gacctaacae 60 ccgtgcgt ÉS

<210> 9 <211> 32 <212:> DHA <22Q> <223'-’ Dbait32C <220> <221> hssce_aiça <222> {1)..(32) <220> <221” mtsc_featiífe <222> {1).,(1} <223> ;·.: γ< :- : : ·" · ; ·:.:*· :<: .· · *: <220 <221> misc_feature <222 > {323..(32) <223>alç<=ILgante hesaetiienogiicoI <40Q> 9 acgeecgggt gtígggtcgt íígtteggat ct 32

<21 G> 10 <211» 32 <212> DHA <213> sequência ·;.· '.-.’· ;:.;: <228> <223> Dbaifâ2Ho-5'5‘ <22δ> <221 > misG_feaíure <<ί23> .· · · \.i '* ·. último nucleótido na extremidade 3! da sequência complementar está ligado com uma ligação 3 ’ - 3 ‘” <220> <221> haste_aiça <222> (1)..(33} <220> <221 > rnisc_feaíure <222> (32)..(32) <223> a ; v·':- ^ 1 g.'.rtf hexaetilenogiic-oi <400> 10 gctaggctig íifgctgggt Sgiaggeaca gc 32

<210> 11 <211 >32 <212> DMA <213>sequência artificiai <220> <223:- Obaii32-MH2 <220> <221 > mtse_feafure <223> /not5="o nucieótido na extremidade 5' da aequència complementar esta ligado ao grupo NH2" <22Q> <221 > misG_feaíure </?3> õe três ult it:s nucleótidc-s na extremidade 3* da sequência complement ar corn estrutura, base fosforotioato'· <220> <221 > base_modifícada ^22> í1)· <223-- bsse ffio^eestmtura base fosf orotioato <220> <221 > !ntSC_ ligação <222> (32). -(32) <223> ligante=íJE2 <400> 11 acgcacgggt gftgggtcgt Sgttcggai cf 32 <210> 12 <211> 32 <212> DMA <213> Artificiai <220> <223> Dbait32H-F!TC <220> <221 > uitsc_fe-3ture <223> /nota=" c«s três últimos nucleátidos na extremidade 3’ da sequência compleisientar com estrutura ba.se fc·.sf:cιrc·ticιato,' <220> <221> haste_alça <222> {1)..(32) <220» <221 > basejmodifiçada <222» ¢1)..(3) <223» base raodFe£tiut.i:ra base fcs foro ti. cato <220» <221 > misc_featune <222» (32)..(32:) <223» alça—iigsiite bexa&amp;tiiencçtiicai <220» <221» misc-iigação <222» ¢32). .{32) <223» ; ·' <400» 12 acgcacgggí giígggtegt tígitcggat ct 32 <210» 13 <211» 32 <212» DMA <213» Artificia! <220» <223» Dbait32H-Cy3 <220» <221» misc_feaíure <223» /r.cta=" os três úiciir.os nucleátidos na extremidade 3* da sequência complementar com estrutura base fos forctioato" <220» <221» :'··;'».·· ; i v · <222» ¢1)..(32) <220» <221» miscLfeaíure <222» (32)..(32) <223» aiça=liçfarite hexaetiiertoçflicoi <220> <221» m!SC'iigaçâo <222» (32)..(32) <223» i i gante·=c i a π ins 3 <400» 13 acgcacgggí giígggtcgt itgítcggaí ct 32 <210» 14 <211» 32 <212» DMA <213» Artificia! <220» <223» Dbait32H-Bioí <220 <221» miscjeaktre <223» - .· ” os rzês liltiTftos nucleotides na extreraidade 3* da sequência ceonplextentax com estrntura base foaforotioato"

<22lO <221» haste_a.lea <222» {1)..(32) <220» <221» base xicdif icsda <22?> ¢1)..(3} <223> base laodi'SEtrr.tura base fosioroticatc: <220» <221» raise-ligação <222» (32:)..(32) <223> iigante—diot-iiia <220> <221;· misc_feaSure <222» {32)..(32} <223» alça=liga rite hexaetilenoglicoi <400» 14 acgcscgggt gitgggtegt ilgttcggat ct 32

<210» 15 <211> 32 <212> DMA <213>sequência artificial <220» <223> Dbaii32Ha <220> <2/0 <223> /nota=”Tia extr eraidade 3' da sequèncià cGrapIementai: os tires úitimos nucleótidos com estrutura base fcsforotiúàtQ" <220> <221> haste_aiça <222> (1)..(32} <220> <221> -base modificada <222> ¢1)-.(3} <223» base aodsestnitura base fosforot.icscc· <220» <221 » mísc_feature <222» {32)..(32} <223» : .· o··.::'** : ; : ;'*r :*t; : : <4GO» 15 geíaggictg Ittggtggct ítgcagtggc ae 32

<210» 16 <211» 32 <212» DMA <213>sequência artificiai <220» <223» DbaiS32Hb <220» <221 > raí&amp;c_feaSure <22Í» / r;m.h -": i.t extremidade 3' de sequência campi ementar os três ultimes nucisótrdos com estrutura base fosfcrctioato" <22Q> <221 > haste_alça <222> {1)..(32:} <220» <221 > base_modificada <222'·· (1)..(3) <223>base mod-sstrutura base festorotioato <220> <221 > mtsc_feaíure <222» {32)..(32) <223»alça=lígairte hexa et,i lenoglicoi <40Q> 1β gcteggdig tttgctgggt tgtaggcaca gc 32

<210» 17 <211> 32 <212¾ DMA <213» sequência: artificiai <220» <22 3d Dbatt32Hc <220» <221» misc_Têis?ijre aiga—iigantb nox.tttilto'iculic-r'l <220» <225» miss featurs <223» /;»::.s-"r:s »»;» a»í dado .V da »»:<.»»<:» cçáípfiamêntar ris: três ::1 t ·m»» sis»»·:'».1 it ::çom estrutura case f e sf < r a ti o a t s" <223» <221» hastearga <222» Íl).,{32' <220» <221» tase_mcarft 'ata <'??>()}. i-i> <22i» base a·* ura base fosfcrofcicsto <403» 17 gclgítítúci; iai-ybueagca aaÉáBseeía. gs 32

<210» 13 <211» 32 <212» DMA <213» sequência t -· t ; cr a: <220» <223> DfaaiSSSHd <220» <221 > miso_feaisjre <223-- /p.ota=KM exoremidade 3* da sequência complementar os t.réa últimos nucieót.idos com estrutura base fosforotioato" <220» <221 » haste_aiça <222» (1)..(32} <2EG> <221 > base_mcdifica.da <222» (1).,(3) <223> bdse_Eod~estrutiiL-a base fcsforctiMto <220» <221 > íT)Ísc._fe«;iire <222» (32).,(32} <2E3> -·; : hexaet iienogiicoi <400» 18 gctaggtetg tttggtggai tsgoagtggc ac 32

<21 G> 19 <211 »32 <212» DMA <213> sequência artificial <220» <223» Dbait32HC-3'!Ttp <220» <221»fnisc_feat ure <223» /nota=" os três últimos nucleótiâos na extremidade 3f da sequência complementar com ligante meti if o.sf&amp;nato" <22G> <221 > lraste_aiça <222» (1).,(32) <220> <221 > fntsc_feaí.u!« <222» (32)..(32) <223» a lça=iigant.e i : <·;*-.: : :.·. ·: <4QG> 19 gdgfgccca c.aacccBgca aacaagccts ga 32

<210» 20 <211 >32 <212> DMA <213» sequência artificial <220> <223> Dbatf32HC-5'3'f«p <220» <221 > misc_feaíure <223? /nota=” os très últimas nucieòtidos na exlrtcdcisde J1 da sequência conçiiejieritar ecu'. Iigante metiifosfoneto" <22G> <221> h.cLsr.e_aiça <222? (1)..(32) <220? <221> P.!r·< Γ . : <222> ¢1)..(¾ <223?· · -t < . '. : ··; .::raetilfosf onato <220? <221? mise_Í8aíure <222? (32)..(32) <223? · · V-· ·. ·· : .·; :: ·:.·. J: : ·. * .· <400? 20 gcigtgccca csacccagca aacaagccia 32

<210? 21 «211> 32 <212? DMA <213? se^iiênciã arr-ificiai <223? <223? DfaaS32Hcss-po <400? 21 gdtgtgocca caacccagca aacaagecta ga 32 <210? 22 <211? 8 <212? DÍ4A <213? Artificial <220? <223? Dba«BHc-Cy3 <220? <221? miscLfeature <223? /nota="c nucieótido rta extrerardsde 5r da sequência complementar ligado a cianinaS’’ <220> <221 > mise_feature <223> / nota=" os três últimos nuc 1 eót idos na extremidade 3' da sequência complementar coro estrutura base fosforcticato” <220> <221 > itaste alca <222> ί1}..ΐδ) <220> <221 > ba,ee_irt«:<dificada <222> ÍV.J3-} <223> base Hoò-e smeera base f osf orot ioatc <220> <221 > roiscjfsature <222> m,m <223> a.iça=ligante hexaetilenogiicol <40O> 22 gctgtgca 8 <21Q> 23 <211 >32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Dbaii32He-Gy3 <220> <221 > misc_feature <223> /nota=" os três últimos nucleotides na extremidade 3T da sequência complementar cem. estrutura base fosferotioato” <220> <221 > mísc_feaíure <223>/nota="o nu:::leótido na extremidade 5’ da sequência complementar ligado a. cianina 3:l' <220> <221 > h.aste_aiça <222> (1).,(32) <220> <221 > base_rctodificada <222> (1)..(3} <223> base .EtsT-d.—'estrutura base £ o s t o r &amp; t. i o a t o <220> <221 > !T!isc_fea;ur« <222> (32). .(32} <223> alça=Iigante dexaet: ieno g i :co: <40O> 23 getgígccca caacccagca aacsagccfa ga 32 <21Q> 24 <211 >32 <212> DNA <213> Artificiai <220> <223> Dbasi32Hc-Gy5 <220> <221 > miscjesture <223> /neta=" os très últimos nucleótidos na extremidade 3' da sequência complementar com estrutura base fosforotioato” <220 <221 > misc_feaíure <223> /nota="o nucleótidc. na extremidade ^' da sequência complementar ligado a Cianiiia-5,> <220> <221 > haste_aiça <222> (1)..(32) «22S» <221lace Jicdificadá <222v ¢5)..(¾ «223» c-hxx- nix-i xesxcv.Cxra base · <55i> <22l» mfscj&amp;aturs <222' (52.:.232) <22.i> .:: p ; · : :v.; .·. he-^aesalenG^lihGl.. <··«!«.> 24 gatgigcGca saaeeesgea sacaageeta gá 33 <2ΐ0»:25 <21 »32 <3 !2> DMA <2:Í3» Âfíiíiàai <220·- <222-· Dbaií32M<i-RTC <220» <223'' 2-.<. :!' :.·!. --.2:-., -iitimos :.·;·. i-ri; λ. ·:·. .> ns axtiesaidade s' da s»·.; .a:,..:. .s comp-iasieupar com xcp-xbase fsiS'fciQcioads" «220» <25.1» miscrfsaiure <2235· /c.::t:3=" : s ecivixlo ieix i.cc ;da: c x C .r os ad a5) 1.x Ξ s::x1:n:xs .ooiaplemesiCas ll:.:s-..(..- a. xll'C.'' <223» <22-1»: (bast e^a-iça <222> {1U32j <220> <2215' Í -·.<··. <222:·- (1)..( j; <223» Lass iB*.{-‘Sãraa-ia case fosforoti-oato c.Ztf» <221'» tT-:Sc_í&amp;a;ufã <222> (32:. 132) <223» alça=la.-rajite hex:ae111c;:-. ç 1 - c:.-1 <A(i0s> 2$ geiaggicig i&amp;jgigsc! rtgcaglggc ac 32

<210» 2H <211> &amp;1 <212:- DMA <:213> sBQXi&amp;n-c-i-B· arpif/iciai <220> <223» Dixi:tC4 <220» <221» mis-c if esters «223» /notα=* ps. -tires·:: tHit i~ios·.nu>: i.egpidos n<a. extζ:·.*ϊϊιi<3a.)'át; 5.’ da s-e^gane-ia, coMpi'emeivtaPiCorit. /ss-tjríisç&amp;a: ii.ass <220> <221 > misc_fea*iire <223>/nota=” os três últimos nucleóticlos na extremidade 5r da sequência complementar com estrutura base fosforotioato” <220> <221 > ba a a_rao d i f i cad s <222> (1)..(3} ^223^ base mod.-®£trutura ba.se fosforotioato <220> <221 > bass_racdif içada <222> (621,(84} <223> base lítod.^strrutura base fosforotioato <400> 26 acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ctacgcacgg tcgtttgttc ggtgttggcg 60 atct 64 <21Q> 27 <211> 63 <212> DhiA <213> Artificia! <220>

<223> Dba:t64'L <220> <221 > misc_feaíure <223>t .õ t o =' ’ os três últimos nucleótidos na extremidade 3' da sequência comt.reitientsr com estrutura base fosforotioato” <220> <221 > misc_feaíure <223>/nota=" os três últimos nucleótioios na extremidade 5' da sequência come remontar com estrutura base fosforotioato” <22Q> <221 > base_modi £i cada <222> (1)..(3) <223> base_mC'd-iigante hexaatiienoiqlico-l <220> <221 > ·· s <222> (32)..(33) <223> t ipo._repet içã o= 1 iga„nte hexaetiienogiicol <220> <221 >fease_modi ficada <222> (61).,.(63) <223> base_mod"iigan.te hexaetiienogricol <400> 2? acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat cacgcacggt cgtttgttcg gtgttggcga 60 tct 63

Lisboa, 20 de Julho de 2017

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma molécula de ácido nucleico, em que a referida molécula compreende uma porção de cadeia dupla de 32 a 100 pb, tem pelo menos uma extremidade livre, é desprovida de CpG, tem menos de 70% de identidade de sequência para qualquer gene num genoma humano, compreende um ou vários fosforotioatos ou nucleótidos com estrutura base de metilfosfonato na extremidade de cada cadeia ou pelo menos na extremidade 3' da cadeia, e em que a referida molécula é substrato para ligação por pelo menos uma proteína Ku envolvida na via NHEJ na reparação de quebras da cadeia dupla DSB, em que a porção de cadeia dupla tem a sequência das moléculas Dbait32Hc (SEQ ID No. 17), Dbait32Hc-3'mp (SEQ ID No. 19), Dbait32Hc-5'3'mp (SEQ ID No. 20), Dbait32Hc-Cy3 (SEQ ID No. 23) e Dbait32Hc-Cy5 (SEQ ID No. 24).
2. 2. A molécula de acordo com a reivindicação 1 selecionada do grupo que consiste em Dbait32Hc (SEQ ID No. 17), Dbait32Hc-3'mp (SEQ ID No. 19), Dbait32Hc-5'3'mp (SEQ ID No. 20), Dbait32Hc-Cy3 (SEQ ID No. 23) e Dbait32Hc-Cy5 (SEQ ID No. 24).
3. 3. A molécula de acordo com a reivindicação 1, selecionada do grupo que consiste em Dbait32Hc (SEQ ID No. 17), Dbait32Hc-3'mp (SEQ ID No. 19) e Dbait32Hc-5'3'mp (SEQ ID No. 20).
4. 4. A molécula de acordo com a reivindicação 1 sendo Dbait32Hc (SEQ ID No. 17).
5. 5. Uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, preferencialmente adequado para via oral ou para injeção intravenosa, intratumoral ou subcutânea ou para injeção ou infusão intracraniana ou intra-arterial ou administração tópica.
6. 6. Produto farmacêutico compreendendo uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um agente químico anticancerígeno que causa danos ao DNA que pode, direta ou indiretamente, causar quebras da cadeia dupla do DNA como uma preparação combinada para utilização no tratamento de cancro.
7. 7. Produto farmacêutico para a utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a molécula deve ser administrada antes ou juntamente com o agente químico.
8. 8. Uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para utilização como um medicamento para o tratamento de cancro aumentando a sensibilidade do tumor a uma terapia anticancerígena que danifica o DNA ou para utilização como um medicamento para o tratamento de cancro a ser utilizado em combinação com uma terapia anticancerígena que causa danos ao DNA preferencialmente selecionada de radioterapia e quimioterapia.
9. 9. A molécula para utilização de acordo com a reivindicação 8, em que a molécula deve ser administrada antes da radioterapia ou antes ou juntamente com a quimioterapia.
10. 10. A molécula para utilização de acordo com as reivindicações 8 a 9, em que o cancro é selecionado de SNC, cabeça e pescoço, colorretal, fígado, trato gastrointestinal, trato genito-urinário, pulmão, pele, cancro de mama e cancro cervical.
11. 11. A molécula para uso de acordo com as reivindicações 8 a 10, em que a molécula deve ser administrada por via oral ou por injeção intravenosa, intratumoral ou subcutânea, ou por injeção ou infusão intracraniana ou intra-arterial ou para administração tópica. Lisboa,20 de julho de 2017