PT2318530T - Novo epítopo de imunização contra o vírus da gripe - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

NOVO EPÍTOPO DE IMUNIZAÇÃO CONTRA O VÍRUS DA GRIPE CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com a produção de particulas semelhantes a virus. Mars especificamente, a presente invenção é dirigida para a produção de partículas semelhantes a vírus que compreendem antigénios da gripe, mais particularmente, antigénios da gripe modificados que têm uma ampla reatividade cruzada com outras estirpes da gripe.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A gripe é a causa principal de morte em seres humanos devido a um vírus respiratório. Os sintomas mais comuns incluem febre, dor de garganta, falta de ar e dor muscular, entre outros. Durante a época de gripe, os vírus da gripe infectam 10-20% da população mundial, levando a 250-500000 mortes anualmente

Os vírus da gripe são vírus com envelope que brotam da membrana plasmática de células de mamífero infetadas. São classificados em tipos A, B, ou C, com base nas nucleoproteínas e antigénios de proteína de matriz presente. O vírus da gripe do tipo A pode ser adicionalmente dividido em subtipos de acordo com a combinação de glicoproteínas de superfície hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) apresentadas. A HA governa a capacidade do vírus para se ligar a e penetrar na célula hospedeira. A NA remove resíduos de ácido siálico terminais de cadeias de glicano na célula hospedeira e proteínas virais de superfície, que impede a agregação virai e facilita a mobilidade do vírus. Atualmente, 16 HA (H1-H16) e 9 NA (Nl-N9) subtipos são reconhecidos. Cada tipo A do vírus da gripe apresenta um tipo de glicoproteína HA e um tipo de NA. Geralmente, cada subtipo exibe especificidade de espécie; Por exemplo, todos os subtipos HA e NA são conhecidos por infetar aves, enquanto apenas os subtipos Hl, H2, H3, H5, H7, H9, H10, Nl, N2, N3 e N7 foram mostrados para infetar os seres humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005) . Os vírus da gripe que compreendem H5, H7 e H9 são consideradas as formas de mais elevada patogenicidade do vírus gripe A, e são mais suscetíveis de causar pandemias futuras.

As pandemias de gripe são geralmente causadas por vírus da gripe altamente transmissíveis e virulentos, e pode levar a níveis elevados de doença e morte em todo o mundo. O surgimento de novos subtipos de gripe A resultou em 4 grandes pandemias no século 20. A gripe espanhola, causada por um vírus HlNl, em 1918-1919 levou à morte de mais de 50 milhões de pessoas em todo o mundo entre 1917 e 1920. Atualmente, o risco do surgimento de um novo subtipo, ou da transmissão para os seres humanos de um subtipo endémico em animais, está sempre presente. De particular preocupação é uma forma altamente virulenta da gripe aviária (também chamada de "gripe do frango"), cujos surtos êm sido relatados em vários países ao redor do mundo. Em muitos casos, esta gripe das aves pode resultar em taxas de mortalidade que se aproximam de 100% dentro de 48 horas. A propagação do vírus da gripe aviária (H5N1), identificado pela primeira vez em Hong Kong em 1997, a outros países asiáticos e à Europa tem sido postulada como estando ligada aos padrões migratórios das aves selvagens. O atual método de luta contra a gripe em humanos é através da vacinação anual. A vacina é geralmente uma combinação de várias estirpes que estão previstas ser as estirpes dominantes para a "temporada da gripe". A previsão é coordenada pela Organização Mundial de Saúde. Geralmente, o número de doses de vacina produzidas anualmente não é suficiente para vacinar a população mundial. Por exemplo, o Canadá e os Estados-Membros obtêm doses de vacinas suficientes para imunizar cerca de um terço da sua população, enquanto apenas 17% da população da União Europeia pode ser vacinada. É evidente que a produção atual da vacina contra a qripe em todo o mundo não seria suficiente em face de uma pandemia de gripe mundial. Mesmo se a produção anual necessário fosse atingida num determinado ano, as estirpes dominantes mudam de ano para ano, assim, o armazenamento não é prático. Economicamente, a produção em grande escala da uma vacina contra a gripe eficaz é de interesse significativo para o governo e a indústria privada.

Atualmente, os mais importantes stocks virais para utilização em vacinas são produzidos em ovos fertilizados. As partículas de vírus são colhidos, e para uma vacina virai inativada, interrompidas por detergente para as inativar. As vacinas vivas atenuadas são feitas de vírus da gripe que foram adaptados para o crescimento a uma temperatura baixa, o que significa que à temperatura normal do corpo, a vacina é atenuada. Uma tal vacina está licenciada nos EUA para utilização em indivíduos a partir de 5 a 49 anos de idade. As vacinas de vírus inteiros inativados são inofensivas por inativação com agentes químicos e que foram produzidas em ovos embrionários ou cultura de células de mamíferos. Todos estes tipos de vacina mostram algumas vantagens e desvantagens específicas. Uma vantagem das vacinas derivadas de vírus inteiros é o tipo de imunidade induzida por estas vacinas. Em geral, as vacinas de divisão induzem uma resposta forte do anticorpo enquanto as vacinas feitas de vírus inteiros induzem tanto um anticorpo (humoral) como a resposta celular. Apesar de uma resposta de anticorpo funcional seja um critério para o licenciamento que se correlaciona com a proteção induzida por uma vacina, existe evidência crescente de que uma resposta das células T é também importante na imunidade à gripe - esta pode também proporciona uma melhor proteção nos idosos. A fim de induzir uma resposta imunitária celular, foram desenvolvidas vacinas feitas de vírus inteiros. Devido à elevada patogenicidade da estirpe da gripe (por exemplo, H5N1), estas vacinas são produzidas em instalações BL3+. Para as estirpes altamente patogénicas, tais como a H5N1, alguns fabricantes modificaram a sequência do gene da hemaglutinina, a fim de reduzir a patogenicidade da estirpe de gripe e para a tornar mais virulenta e ser produzida mais facilmente em ovos embrionários ou em cultura de células de mamífero. Outros utilizam, também, estirpes de gripe recombinantes nas quais as sequências genéticas para as proteínas hemaglutinina e neuraminidase são clonadas num doador patogénico de baixa estirpe de gripe de alto rendimento (A/PR/8/34; Quan F-S et al, 2007). Embora estes métodos possam produzir vacinas úteis, não fornecem uma solução para a necessidade de alto volume, baixo custo e produção rápida de vacinas em escala necessária para atender à necessidade global num ano normal, e quase certamente seria insuficiente em face duma pandemia.

Usando esta tecnologia genética reversa, também pode precisar de mutação da sequência genética da proteína HA para a tornar virulenta. Para as estirpes de gripe de alta patogenicidade, a produção de vacinas de vírus inteiros tanto requer procedimentos de confinamento ou as vacinas resultantes não correspondem exatamente à sequência genética do vírus em circulação. No caso de vacinas vivas atenuadas, ainda há um risco de que a vacina administrada possa recombinar-se com um vírus da gripe a partir do hospedeiro, conduzindo a um novo vírus da gripe.

Enquanto este método mantém o epítopo do antigénio e modificações pós-traducionais, há uma série de desvantagens, incluindo o risco de contaminação devido à utilização de virus inteiros e rendimentos variáveis, dependendo da estirpe do virus. Níveis sub-ótimos de proteção podem resultar da heterogeneidade genética do vírus, devido à sua introdução em ovos. Outras desvantagens incluem uma planificação extensa para a obtenção de ovos, riscos de contaminação devido aos produtos químicos utilizados na purificação e tempos de produção longos. Além disso, pessoas hipersensíveis às proteínas do ovo não podem ser candidatos elegíveis para receber a vacina.

No caso de uma pandemia, a produção de vacina fracionada é retardada pela necessidade de adaptar a estirpe para o crescimento em ovos e os rendimentos de produção variáveis alcançados. Embora esta tecnologia tenha sido usada há anos para a produção de vacinas sazonais, dificilmente pode responder num prazo razoável, a uma pandemia uma vez que a capacidade de produção mundial é limitada. 0 recente surto no México do tipo de Gripe A H1N1 também destaca a necessidade médica urgente de desenvolver uma metodologia rápida para produção de vacinas de estirpes emergentes.

Para evitar a utilização de ovos, os vírus da gripe também foram produzidos em cultura de células de mamífero, por exemplo, em células de MDCK ou PERC.6, ou semelhantes. Outra abordagem é a genética inversa, em que os vírus são produzidos por transformação de células com genes virais. Estes métodos, no entanto, também requerem a utilização de vírus completos, bem como métodos elaborados e ambientes de cultura específicos. Vários produtos recombinantes têm sido desenvolvidos como candidatos a vacinas de gripe recombinantes. Estas abordagens incidiram sobre a expressão, produção e purificação da gripe tipo A das proteínas HA e NA, incluindo a expressão destas proteínas, utilizando células de inseto infetadas com baculovírus (Crawford et al, 1999; Johansson, 1999), vectores virais, e vacina de construções de ADN (Olsen et al., 1997).

As especificidades de uma infeção pelo vírus da gripe são bem conhecidas. Resumidamente, o ciclo infecioso é iniciado pela ligação da proteína de HA da superfície do virião de um recetor contendo ácido siálico celular (glicoproteínas e glicolípidos). A proteína NA medeia o processamento do recetor de ácido siálico, e a penetração do vírus na célula depende da endocitose mediada por um recetor dependente de HA. Nos limites ácidos dos endossomas internalizados contendo um virião de gripe, a proteína HA sofre alterações conformacionais que levam à fusão das membranas virais e celulares e ao desencapsulamento do vírus e libertação de proteínas Ml mediadas por M2 de ribonucleoproteínas associadas com nucleocapsídeos (RNPs), que migram para o núcleo da célula para a síntese de ARN virai. Os anticorpos para proteínas HA previnem a infeção por vírus por neutralizar a infectividade do vírus, enquanto os anticorpos para as proteínas de NA medeiam o seu efeito sobre os primeiros passos da replicação virai.

Crawford et al. (1999) descrevem a expressão da gripe HA em células de inseto infetadas com baculovírus. As proteínas expressas são descritos como sendo capazes de prevenir a doença da gripe letal causada por H5 aviária e subtipos de gripe H7. Johansson et al. (1999) ensinam que a gripe HA expressa em baculovírus e proteínas NA induzem respostas imunológicas em animais superiores às que foram induzidas por uma vacina convencional. A imunogenicidade e a eficácia de hemaglutinina expressa por baculovírus do vírus da gripe equina foi comparado com um candidato a vacina de ADN homólogo (Olsen et al. , 1997). Coletivamente, estes dados demonstram que um elevado grau de proteção contra o desafio com o virus da gripe pode ser induzido com proteínas recombinantes HA ou NA, utilizando diversas abordagens experimentais e em diferentes modelos animais.

Uma vez que estudos anteriores mostraram que as glicoproteínas de superfície da gripe, HA e NA, são os alvos principais para a indução de imunidade protetora contra o vírus da gripe e que Ml fornece um alvo conservado para a imunidade celular à gripe, um novo candidato a vacina pode incluir estes antigénios virais como um partícula macromolecular de proteína, tais como partículas semelhantes a vírus (VLPs). Como produtos de vacina, as VLP oferecem a vantagem de serem mais imunogénicas do que a subunidade ou antigénios recombinantes e são capazes de estimular tanto a resposta imune humoral como celular (Grgacic e Anderson, 2006). Além disso, a partícula com estes antigénios da gripe podem apresentar epítopos conformacionais que provocam anticorpos neutralizantes contra múltiplas estirpes de vírus da gripe. A produção de uma estirpe do vírus da gripe não infeciosa para fins de vacina é uma maneira de evitar a infeção acidental. Em alternativa, foram investigadas as partículas semelhantes a vírus (VLPs) como substitutos para o vírus em cultura. As VLPs imitam a estrutura da cápside virai, mas não têm um genoma e, portanto, não podem replicar ou proporcionar um meio para uma infeção secundária. Vários estudos têm demonstrado que as proteínas de gripe recombinante se auto-montam em VLPs em cultura de células utilizando plasmídeos de expressão de mamífero ou vetores de baculovírus (Gomez-Puertas et al,. 1999; Neumann et al,. 2000; Latham e Galarza, 2001). Gomez-Puertas et al. (1999) revela que a formação eficiente de VLP da gripe depende dos niveis de expressão de várias proteínas virais. Neumann et al. (2000) estabeleceu um sistema baseado em plasmídeos de expressão de mamíferos para a geração de partículas semelhantes a vírus da gripe infeciosos inteiramente a partir de ADNc clonado. Latham e Galarza (2001) relataram a formação de VLP da gripe em células de inseto infetadas com baculovírus recombinante que co-expressam os genes HA, NA, Ml e M2. Estes estudos demonstraram que as proteínas do virião da gripe podem auto-montar em presença de co-expressão em células eucarióticas.

Gomez-Puertas et al. (2000) ensinam que, adicionalmente à hemaglutinina (HA), a proteína da matriz (Ml) do vírus da gripe é essencial para o brotamento de VLP a partir de células de insetos. No entanto, Chen et al. (2007) ensinam que Ml pode não ser necessária para a formação de VLP, e observaram que a libertação eficiente de Ml e VLP necessita da presença de HA e a atividade de sialidase fornecida pela NA. A NA cliva ácidos siálicos das glicoproteínas na superfície das células que produzem as VLPs, e libertando as VLPs no meio.

Quan et al. (2007) ensinam que uma vacina de VLP produzidas num sistema de expressão de baculovírus (células de inseto) induz uma imunidade protetora contra algumas estirpes do vírus da gripe (A/PR8/34 (HlNl)). As VLP estudadas por Quan foram observadas a partir da membrana plasmática, e foram consideradas como sendo do tamanho correto e morfologia, semelhante às obtidas num sistema de mamífero (células MDCK).

Os vírus de envelope podem obter o seu envelope lipídico quando "construídos" para fora da célula infetada e obter a membrana a partir da membrana de plasma, ou a partir de uma organela interna. As partículas do vírus da gripe e VLP brotam a partir da membrana plasmática da célula hospedeira. Em sistemas de células de mamífero ou de baculovírus, por exemplo, rebentos de gripe a partir da membrana plasmática (Quan et al. 2007).

Apenas alguns vírus com envelope são conhecidos por infetar plantas (por exemplo, membros das Topoviruses e Rabdoviruses). Dos vírus encapsulados de plantas conhecidos, são caracterizados por gemulação a partir de membranas internas da célula hospedeira, e não a partir da membrana plasmática. Apesar de um pequeno número de VLP recombinantes serem produzidos em hospedeiros vegetais, nenhum foi derivado a partir da membrana plasmática. Tecnologias de produção de VLP da gripe correntes contam com a co-expressão de várias proteínas virais, e esta dependência representa uma desvantagem destas tecnologias uma vez que em caso de pandemia e de epidemias anuais, o tempo de resposta é crucial para a vacinação. Um sistema de produção de VLP mais simples, baseando-se na expressão de uma única proteína virai é desejável para acelerar o desenvolvimento da vacina. A produção de HA da gripe VLP no sistema baseado em plantas foi descrito na WO 2009/009876 que, essencialmente, mostrou que a gripe HA é capaz de se auto-montar em células hospedeiras de plantas e germinar a partir de membranas de plasma em partículas semelhantes a vírus. A WO 1986/003224 ensina a eliminação de glicosilação ligada a N por exposição da gripe HA à desglicosilação enzimática, e a WO 2004/019094 ensina locais potenciais de substituição de aminoácidos. A fim de proteger a população mundial da gripe e para evitar futuras pandemias, os fabricantes de vacinas terão de desenvolver métodos rápidos e eficazes que produzam doses de vacina. O uso atual de ovos fertilizados para produzir vacinas é insuficiente e envolve um processo demorado. As proteínas HA utilizadas são específicas para cada estirpe e não reagem de forma cruzada com outras estirpes ara fornecer vacinas de espectro mais amplo necessitando, portanto, de produção constante ou curto tempo de reação, uma vez que uma nova estirpe é identificada.

Certas modificações e/ou mutações podem ser trazidas para a proteína nativa de HA utilizada para a produção de VLP, tais modificações de que resulte uma proteína da hemaglutinina que tem espectro mais amplo para induzir a neutralização de anticorpos para mais do que uma, ou várias estirpes de gripe, mesmo após uma única administração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um aspeto da invenção proporcionar uma vacina da gripe melhorada. É um aspeto adicional da descrição proporcionar novas partículas semelhantes a vírus da gripe. É um aspeto adicional da descrição proporcionar uma proteína de hemaglutinina que foi modificada para proporcionar uma reação mais ampla do espectro de anticorpos. A presente descrição contempla um polipéptido possuindo uma sequência de resíduos de aminoácidos substancialmente idêntica à de um envelope virai duma glicoproteína ligada a N, mas que é parcialmente ou totalmente livre de hidratos de carbono ligados a N (ou seja, tem um ou mais sítios de glicosilação que é abolidos quando comparados com uma sequência original de HA nativa), bem como métodos para a produção e utilização do polipéptido. É um aspeto adicional da descrição proporcionar uma proteína HA, em que um ou mais dos sítios de glicosilação ligados a N do domínio HAl foram modificados/suprimidos/mutados/ removidos/abolidos para produzir VLPs da gripe para a preparação de uma vacina da gripe de amplo espectro.

Particularmente, o domínio HA1 compreende os aminoácidos localizados nas posições 1 a 331 como numerados de acordo com a estirpe A/Vietnam/1194-1104; SEQ ID N°.34). Mais em particular, o domínio HA1 compreende a porção de cabeça globular e o domínio F'2 da proteína, o que corresponde aos aminoácidos entre as posições 39-331 da proteína tal como numerados em conformidade com a estirpe A/Vietnam/1194-1104; SEQ ID N°. 34). Particularmente, o local de glicosilação que é abolido está originalmente presente na porção de cabeça globular da proteína que corresponde, em particular, aos aminoácidos localizados entre as posições 39-273 da SEQ ID N°.34. Mais particularmente, o sítio de glicosilação suprimido está originalmente localizado no domínio F'2 da proteína, particularmente correspondendo aos aminoácidos localizados entre as posições 274-331 da SEQ ID N°.34 . A presente invenção proporciona substituições de aminoácidos na molécula de hemaglutinina (NA) da gripe A que podem alterar a antigenicidade e imunogenicidade de HA. Estas substituições podem alterar os locais antigénicos por alteração da especificidade do recetor e/ou ligação do anticorpo-antigénio. Na variedade de formas de realização, a antigenicidade aumentada resultante da substituição pode ser útil para a produção de vacinas com reatividade cruzada mais ampla para a gripe. Particularmente, a substituição de aminoácidos resulta em moléculas com as características da imunogenicidade da substituição de aminoácidos de resíduos não-asparagina da proteína HA no local correspondente à ligação do local do recetor e, em particular, correspondente à localização 154 e/ou 165 e/ou 286 (em que a numeração é de acordo com a estirpe A/Vietnam/1194-1104; SEQ ID N°.34 ). Em formas de realização particulares, a substituição de um aminoácido remove/exclui/suprime um local de glicosilação. 0 virus da gripe que aumenta a antigenicidade da molécula de HA pode incluir um, ou mais, aminoácidos não-glicosilados correspondendo às posições 154 e/ou 165 e/ou 286 em H5 HA, onde a remoção de qualquer urn desses locais de glicosilação resulta num aumento da reatividade com antissoros derivados a partir de um animal exposto a um vírus da gripe de tipo selvagem com uma molécula de HA. A fim de destruir um local de glicosilação, o sinal tríade N-X-S/T (onde N é Asn, X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro, e S/T pode ser tanto Ser ou Thr) pode ser modificado por manipulação de proteínas. A primeira abordagem utilizada pode ser para substituir o Asn por outro aminoácido. A segunda abordagem consiste em substituir o aminoácido S/T na posição n + 2 em relação à asparagina para ser glicosilada, por qualquer outro resíduo de aminoácido. Um aminoácido adequado utilizado para substituir a asparagina, serina ou treonina é a alanina, mas outro aminoácido também pode ser usado. Por exemplo, Asn pode ser substituída por Leu, Ile, Vai, Thr, Ser ou Ala. Além disso, Ser ou Thr podem ser substituídos por Ala, Vai, Ile ou Leu.

Em particular, o aumento da antigenicidade da molécula de HA do vírus da gripe pode incluir um aminoácido diferente da asparagina nas posições 154 e/ou 165 e/ou 286 em H5 HA. 0 aumento da antigenicidade da molécula de HA pelo virus da gripe pode incluir a proteína HA, em que parte da cabeça é desprovida de sítios de glicosilação ligados a N, ou seja, todos os três sítios de glicosilação foram abolidos. 0 aumento da antigenicidade da molécula de HA pelo vírus da gripe pode incluir um, ou mais do que um, local de glicosilação que é removido, selecionado a partir do grupo que consiste em N-154, N-165 e N-286 (em que a numeração é de acordo com a estirpe A/Vietnam/1194-1104). A presente invenção proporciona uma hemaglutinina modificada (HA) a partir de diferentes estirpes de gripe. A presente invenção também proporciona um método de produção de partículas de vírus da gripe como partículas (VLPs) num organismo hospedeiro não-sialilado compreendendo: a) introdução de um ácido nucleico que codifica um antigénio de hemaglutinina da gripe (HA), tal como definido acima, operacionalmente ligado a uma região reguladora ativa num organismo hospedeiro não-sialilado ou uma porção do mesmo, e b) incubar o hospedeiro ou uma porção do mesmo em condições que permitam a expressão do ácido nucleico, produzindo desse modo as VLPs. A presente memória descritiva inclui o método acima, em que, no passo de introdução (passo a), o ácido nucleico pode ser transientemente expresso no hospedeiro, ou expresso de forma estável no hospedeiro. Além disso, as VLPs podem ser purificadas utilizando, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho.

Além disso, a presente descrição refere-se a um organismo hospedeiro não-sialilado utilizado para a produção de partículas semelhantes a vírus (VLP) que compreendem uma proteína HA do vírus da gripe. Particularmente, hospedeiros adequados capazes de produzir uma VLP, são, por exemplo, uma planta ou uma porção da mesma, uma célula vegetal, um inseto ou uma sua porção, ou uma célula de inseto, ou uma levedura ou uma sua porção, ou uma célula de levedura.

De acordo com a presente descrição, é proporcionado um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica uma HA da gripe modificada, tal como definido acima, operacionalmente ligado a uma região reguladora ativa num organismo hospedeiro não-sialilado. 0 antigénio pode ser uma hemaglutinina da gripe (HA) desprovida de um ou mais dos sítios de glicosilação ligados a N da porção de cabeça da molécula (locais antigénicos que estão normalmente presentes na sequência nativa). A presente divulgação também proporciona uma partícula semelhante a vírus (VLP) que compreende uma proteína HA do vírus da gripe, tal como aqui e um ou mais de um lípido hospedeiro definido. Se o hospedeiro é um inseto, então a partícula semelhante a vírus (VLP) pode compreender uma proteína HA do vírus da gripe e um ou mais de um lípido de insetos, ou se o hospedeiro é uma levedura, então a partícula semelhante a vírus (VLP) pode compreender uma proteína HA do vírus gripe e um ou mais de um lípido de levedura, se o hospedeiro é uma planta, então a partícula semelhante a vírus (VLP) pode compreender uma proteína HA do vírus da gripe e um ou mais de um lípido da planta. A descrição proporciona ainda VLPs que são produzidas numa planta contendo, assim, um ou mais de um lípido de origem vegetal (normalmente referido como "lípidos de plantas"). A descrição proporciona ainda VLPs produzidas em células de inseto compreendendo lípidos da membrana plasmática de células de inseto (geralmente referidos como "lípidos de insetos"). A descrição proporciona ainda VLPs produzidas em leveduras compreendendo lípidos da membrana plasmática de células de levedura (geralmente referidos como "lípidos de levedura").

Também incluída na presente descrição está uma composição que compreende uma dose eficaz de uma VLP compreendendo uma proteína HA do vírus da gripe, um ou mais de um lípido derivado de uma célula hospedeira de produção não-sialilada, em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável. 0 transportador farmaceuticamente aceitável pode ser adequada para administração oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, ou subcutânea.

Além disso incluído na presente invenção está uma composição de vacina compreendendo uma dose imunologicamente eficaz de uma VLP, como aqui definido, em mistura com um veiculo farmaceuticamente aceitável com ou sem a presença de um adjuvante. A vacina pode ser administrada por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, ou subcutânea. Em particular, a vacina é administrada sem a utilização de um adjuvante. A presente descrição também proporciona um método de indução de imunidade para a infeção de vírus da gripe num sujeito, o método compreendendo a administração ao sujeito do vírus como partículas que compreendem uma proteína HA do vírus da gripe, um ou mais de um lípido hospedeiro, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A partícula semelhante a vírus pode ser administrada a um sujeito por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, ou subcutânea. A presente divulgação refere-se a um método para induzir imunidade à infeção pelo vírus da gripe num sujeito, compreendendo a administração ao indivíduo de uma dose eficaz de uma vacina compreendendo um ou mais duma VLP, como aqui definido. 0 sujeito a ser tratado pelos métodos tal como definidos acima pode ser selecionado a partir do grupo que compreende os seres humanos, primatas, cavalos, porcos, aves (aves), aves aquáticas, pássaros migratório, codorniz, pato, ganso, aves de capoeira, frangos, camelos, caninos, cães, felinos, gatos, tigres, leopardos, civeta, marta, fuinha, furões, animais domésticos, gado, ratos, ratazanas, focas, baleias e similares. Particularmente, o sujeito pode ser um paciente humano ou aves em geral (incluindo aves aquáticas, aves migratórias, aves como a codorniz, pato, ganso, peru, frango), particularmente, aves migratórios ou aves para consumo humano (codorniz, pato, gansos, peru, frango). A presente invenção também proporciona para um recipiente tal como uma seringa, bem como kits que compreendem um tal recipiente, todos compreendendo a composição de vacina tal como aqui definido.

Este resumo da descrição não descreve necessariamente todos os aspetos da descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Estas e outras caracteristicas da invenção vão tornar-se mais evidentes a partir da descrição seguinte na qual é feita referência aos desenhos em anexo, em que: A Figura IA representa a localização de locais de glicosilação no vírus gripe HA H5 A/Indonésia/5/05. A identidade dos aminoácidos, a posição e localização estão indicados por analogia com a estrutura de A/Vietnam/1194-1104; SEQ ID N° . 34 (arquivo PDB: 2IBX) . O mutante triplo foi feito pela destruição dos locais de glicosilação N154, N165, e N286 localizados na cabeça globular. O estudo de Bright et al. (2003) foi utilizado para localizar os potenciais locais antigénicos. O tipo de glicosilação foi determinado com base no que está escrito na literatura sobre HAs Hl, H3 e H7 (Abe Y. et al. (2004); Vigerust DJ et al. (2007), e Kuroda et al. (1990); A Figura 1B é uma ilustração dos subdomínios do monómero HA: Os subdomínios F'l (1-38 como numerados de acordo com A/Vietnam/1194-1104; SEQ ID N°.34), F'2 (274-331) e F estão representados. 0 sítio de ligação do recetor e subdomínios da esterase que juntos formam a cabeça globular (39-273) . 0 péptido de fusão é representada como uma caixa branca. 0 DTM e o citotail não pode ser visto em todas as estruturas de HA uma vez que apenas os produtos de bromelaína solúveis foram cristalizados e estruturalmente elucidados; A Figura 2 representa as estruturas de um monómero de HA a partir de diferentes subtipos A. A camada dupla de lípido, com o seu homólogo alifático e a sua cabeça polar é também apresentado. Estruturas tomadas a partir Ha et al. (Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002) aviária H5; A Figura 3 mostra uma sequência de uma cassete de expressão à base de plastocianina de alfafa utilizada para a expressão de Hl de acordo com uma forma de realização da presente invenção (SEQ ID N°: 8) . O péptido de sinal isomerase de proteína de dissulfureto (PDI) está sublinhado. Os sítios de restrição BglII (AGATCT) e Saci (GAGCTC) utilizados para a clonagem são exibidos em negrito; A Figura 4 mostra uma representação de plasmídeo 660 montado para a expressão de HA de tipo selvagem subtipo H5 de A/ Indonésia/5/05 ; A Figura 5 mostra uma representação do plasmídeo 680 montado para a expressão da mutação de HA não glicosilada do subtipo H5 de A/lndonésia/5/05; A Figura 6 mostra os títulos de anticorpos contra o vírus completo inativado (WTV) após a primeira e segunda dose. A reatividade do soro de ratos imunizados com VLP ou o mutante triplo de VLP (não glicosilada) foi avaliada após a primeira (14 dias) ou a segunda imunização (dia 35) . A imunorreatividade foi avaliada contra vários vírus H5N1; A Figura 7 representa a inibição de hemaglutinação (Hl) de títulos de anticorpos após a primeira e a segunda dose. Os títulos Hl de ratos imunizados com o wt ou o triplo mutante de VLP (não glicosilado) foram avaliados 14 dias após a primeiro e ou a segunda (dia 35) imunização (dia 14) . A munorreatividade foi avaliada contra vários vírus H5N1 e o um vírus H1N1; A Figura 8 representa a listagem de sequência para um vírus da gripe HAO; A Figura 9 representa a listagem de sequência para um subtipo H2 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 10 representa a listagem de sequência para um subtipo H3 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 11 representa a listagem de sequência para um subtipo H4 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 12 representa a listagem de sequência para um subtipo H5 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 13 representa a listagem de sequência para um subtipo H6 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 14 representa a listagem de sequência para um subtipo H7 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 15 representa a listagem de sequência para um subtipo H8 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 16 representa a listagem de sequência para um subtipo H9 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 17 representa a listagem de sequência para um subtipo H10 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 18 representa a sequência de listagem para um subtipo Hll da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 19 representa a listagem de sequência para um subtipo H12 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 20 representa a listagem de sequência para um subtipo H13 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 21 representa a listagem de sequência para um subtipo H14 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 22 representa a listagem de sequência para um subtipo H15 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 23 representa a listagem de sequência para um subtipo Hl 6 da proteína do vírus da gripe HA; A Figura 24 representa a listagem de sequência para o vetor de expressão 660 pCAMBIA contendo a sequência completa H5 do tipo selvagem; A Figura 25 A-J representa as listagens de sequências de iniciadores utilizados para a amplificação por PCR; A Figura 26 representa a listagem de sequência para o fragmento produzido, que contém a região de codificação completa H5 incluindo o péptido de sinal nativo flanqueado por um local HindIII imediatamente a montante do ATG inicial e um local de Saci imediatamente a jusante do codão de terminação (TAA); A Figura 27 representa a listagem de sequência para o fragmento produzido, contendo a região de codificação completa H5 adaptadas para remover todos os três sítios de glicosilação, incluindo o péptido de sinal nativo flanqueado por um local HindIII imediatamente a montante do ATG inicial, e um local de Saci imediatamente a jusante do codão de terminação (TAA); A Figura 28 A-D representam as listagens de sequências de iniciadores para amplificação PCR. A Figura 29 representa a sequência de aminoácidos de H5 madura a partir da estirpe A/Vietnam/1194-1104; e A Figura 30 A-B representa o ácido nucleico e as sequências de aminoácidos, respetivamente, de HA madura da estirpe B/Florida/4/2006.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS A presente invenção relaciona-se com a produção de partículas semelhantes a vírus (VLP). Mais particularmente, a presente invenção é dirigida para a produção de partículas semelhantes a vírus que compreendem antigénios da gripe.

A descrição seguinte é de uma forma de realização particular. 1- Proteína HA

Tal como aqui utilizado, uma "proteína" refere-se geralmente a uma série de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica, a qual pode ser dobrada em estrutura secundária, terciária ou quaternária para alcançar uma morfologia específica. Em alternativa, os termos polipéptido, péptido ou fragmentos de péptido podem ser utilizados num contexto semelhante. 0 termo "domínio de hemaglutinina" refere-se a um péptido compreendendo quer o polipéptido precursor de HAO, ou os domínios HAl e HA2. O domínio de hemaglutinina não inclui o péptido de sinal, domínio transmembranar, ou a cauda citoplasmática encontrada na proteína de ocorrência natural.

Com referência ao vírus da gripe, o termo "hemaglutinina" ou "HA", tal como aqui utilizado refere-se a uma glicoproteína encontrada na parte externa das partículas virais da gripe. HA é uma glicoproteína de membrana homotrimérica do tipo 1 que compreende, geralmente, um péptido de sinal, um domínio HAl, HA2 e um domínio que compreende um local de âncora que atravessa a membrana na extremidade do terminal C e uma pequena cauda citoplásmica (Figura 1B) . As sequências de nucleótidos que codificam HA são bem conhecidos e estão disponíveis - ver, por exemplo, a base de BioDefense Public Health (Vírus da Gripe, ver URL: biohealthbase.org) ou Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov), ambos os quais são aqui incorporados por referência.

Informações estruturais sobre a gripe HAs 0 monôómero HA podem ser subdividido em 2 domínios funcionais distintos, o domínio de cabeça globular e o domínio da haste. A correspondência destes domínios entre a sequência primária e a estrutura de HA está ilustrada nas Figuras 1B e 2. 0 domínio da haste está envolvido na infecciosidade e a patogenicidade do vírus através da mudança conformacional extraordinária que pode executar em pH ácido. É ainda descrito como 4 subdomínios, o péptido de fusão (trecho hidrófobo de 26 aminoácidos responsáveis pela fusão com a membrana hospedeira no estado conformacional de pH baixo); o domínio haste em si (que pode acomodar 2 conformações extremamente diferentes), o domínio transmembranar (TMD) (determina a afinidade de HA para jangadas lipídicas), a cauda citoplasmática (Ctail) (está envolvida na secreção de HA) . A cabeça globular é dividido em 2 subdomínios, o domínio de ligação ao recetor (RB) e o domínio de esterase vestigial (E) . 0 subdomínio da esterase é, por sua vez, enterrado na superfície da proteína e, por conseguinte, a maioria dos anticorpos produzidos contra HA ligam-se ao domínio de ligação ao recetor (representada pela parte superior da cabeça na Figura 2). 0 termo "homotrímero" ou "homotrimérico" indica que um oligómero é formado por três moléculas de proteína HA. A proteína HA é sintetizada como uma proteína precursora de 75 kDa monomérica (HAO), que monta na superfície numa proteína trimérica alongada. Para as estirpes aviárias altamente patogénicas, a proteína precursora é clivada intracelularmente a um local de clivagem de ativação conservada (também referido como péptido de fusão) em 2 cadeias polipeptídicas, HAl (328 aminoácidos) e HA2 (221 aminoácidos; compreendendo a região transmembranar), ligados por uma ligação dissulfureto antes da ocorrência de trimerização. Embora este passo seja essencial para a infectividade do vírus, não é essencial para a trimerização da proteína. Para as estirpes do vírus da gripe de aves e de mamíferos apatogénicas, o precursor HAO é clivado extracelularmente por proteases segregadas por células do trato respiratório do hospedeiro, ou por uma bactéria ou micoplasma co-infectante. A inserção de HA dentro da membrana do retículo endoplasmático (ER) da célula hospedeira, clivagem do péptido de sinal e glicosilação de proteínas são eventos co-translacionais. A redobragem correta de HA requer a glicosilação da proteína e a formação de 6 ligações dissulfureto intra-cadeias. 0 trímero HA monta dentro do complexo de cis- e trans-Golgi, o domínio transmembranar desempenha um papel no processo de trimerização. As estruturas cristalinas de proteínas HA tratadas com bromelaina, às quais falta o domínio transmembranar, têm mostrado uma estrutura altamente conservada entre as estirpes da gripe. Também foi estabelecido que a HA sofre grandes alterações conformacionais durante o processo de infeção, o que requer que o precursor HAO seja clivado em duas cadeias de polipéptido, HAl e HA2. A proteína HA pode ser processada (isto é, compreender os domínios HAl e HA2), ou pode ser não transformadas (isto é, compreender o domínio HAO) . A presente divulgação refere-se à utilização de uma proteína HA que compreende o domínio transmembranar e inclui os domínios HA 1 e HA2, por exemplo, a proteína HA pode ser HAO, ou HA processado compreendendo HAl e HA2. A HA da presente divulgação pode ser obtida a partir de qualquer subtipo. Por exemplo, a HA pode ser do subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou Hl 6. A presente revelação inclui VLP compreendendo HA com glicanos N modificados. A HA recombinante da presente invenção pode também compreender uma sequência de aminoácidos baseada na sequência de qualquer hemaglutinina conhecido na técnica-ver, por exemplo, a base de BioDefense Public Health (vírus da gripe; ver URL: biohealthbase.org) ou National Center for Biotechnology Information (ver URL: ncbi.nlm.nih.gov) em que os locais de glicosilação ligados a N nativas foram removidos/mutados/suprimidos/modifiçados para remover os resíduos de açúcar que mascaram os locais antigénicos peptídicos.

Além disso, a HA pode ser baseada na sequência de uma hemaglutinina que é isolada a partir de um ou mais vírus da gripe emergentes ou recentemente identificados.

Além disso, as VLP podem ser produzidas que compreendem uma combinação de subtipos HA. Por exemplo, as VLP podem compreender um ou mais do que uma de HA do subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HlO, Hll, H12, H13, H14, H15, Hl6, ou uma combinação da mesma. A seleção da combinação do HAs pode ser determinada pela utilização pretendida da vacina preparada a partir da VLP. Por exemplo, uma vacina para utilização em inoculação de aves pode compreender qualquer combinação de subtipos HA, enquanto as VLPs úteis para inocular os seres humanos pode compreender subtipos de um ou mais de um dos subtipos de Hl, H2, H3 ou H5. No entanto, outras combinações de subtipos de HA podem ser preparados dependendo da utilização da VLP. A fim de produzir VLPs que compreendem combinações de subtipos de HA, o subtipo de HA desejada pode ser co-expresso na mesma célula, por exemplo uma célula de planta.

Particularmente, as VLP produzidas como aqui descrito não compreendem a neuraminidase (NA). No entanto, a NA pode ser co-expressa com HA devendo ser desejado que a VLP compreenda HA e NA. 2 - Subtipos da gripe A divulgação inclui todos os tipos de virus da gripe humana, incluindo, por exemplo, mas não limitado, aos muito prevalentes subtipos A, e o menos comum tipo B, e tipo C, obtido de outros subtipos da gripe. A presente memória descritiva também inclui VLPs que compreendem HAs obtidas a partir de um ou mais do que um subtipo de gripe. Por exemplo, as VLP podem compreender um ou mais do que uma de HA do subtipo Hl (codificado pela SEQ ID N°: 1), H2 (codificado pela SEQ ID N°: 2), H3 (codificado pela SEQ ID N°: 3), H4 (codificado pela SEQ ID N°: 4), H5

(codificado pela SEQ ID N°: 5), H6 (codificado pela SEQ ID N°: 6), H7 (codificado pela SEQ ID N°: 7), H8 (codificado pela SEQ ID N°: 8), H9 (codificado pela SEQ ID N°: 9), H10

(codificado pela SEQ ID N°: 10), Hll (codificada pela SEQ ID N°: 11), H12 (codificado pela SEQ ID N°: 12), H13 (codificado pela SEQ ID N°: 13), H14 (codificado pela SEQ ID N°: 14), H15 (codificado pela SEQ ID N°: 15), H16 (codificado pela SEQ ID N°: 16), ou uma combinação das mesmas. Uma ou mais de HA de um ou mais de subtipos da gripe podem ser co-expressas dentro de uma planta ou célula de inseto para assegurar que a síntese de uma ou mais HA resulta na formação de VLP compreendendo uma combinação de HAs obtidas a partir de um ou mais dum subtipo de gripe. A seleção da combinação de HAs pode ser determinada pela utilização pretendida da vacina preparada a partir da VLP. Por exemplo, uma vacina para utilização em inoculação de humanos pode compreender qualquer combinação de subtipos de HA, em particular, um ou mais de um dos subtipos de Hl, H2, H3, H5, H7, H9, H10, Nl, N2, N3 e N7. Particularmente, Hl, H2, H3, H5.

No entanto, outras combinações de subtipos de HA podem ser preparadas dependendo da utilização do inoculo. 3- Método de produção

Além disso, a presente invenção proporciona um método de produção de partículas semelhantes a vírus (VLPs) num hospedeiro. Por conseguinte, a invenção proporciona para as VLPs, e um método para a produção de VLP virais num sistema de expressão hospedeiro, a partir da expressão de uma única proteína de envelope. 0 método envolve a introdução de um ácido nucleico que codifica um antigénio operacionalmente ligado a uma região reguladora ativa no hospedeiro ou uma porção do mesmo, e incubando o hospedeiro ou uma porção do hospedeiro sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico, produzindo desse modo a VLP.

Os elementos reguladores da presente divulgação podem também ser combinados com a região de codificação de interesse para expressão dentro de uma gama de organismos hospedeiros que são passíveis de transformação, ou expressão transiente, tal como, particularmente, planta, inseto ou levedura.

Particularmente, tal organismo são plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, por exemplo, mas não se limitando a milho, plantas de cereais, trigo, cevada, aveia, Nicotiana spp, Brassica spp, soja, feijão, ervilhas, alfafa, batata, tomate, ginseng e Arabidopsis.

Os métodos para a transformação estável e regeneração destes organismos são estabelecidas na técnica e são conhecidas dos peritos. Os métodos de obtenção de plantas transformadas e regeneradas são também bem conhecidos na técnica.

Por "transformação" pretende-se significar a transferência interespecifica estável de informação genética (sequência de nucleótidos), que se manifesta genotipicamente, fenotipicamente ou ambos. A transferência interespecifica de informação genética a partir de uma construção quimérica para um hospedeiro pode ser hereditária e a transferência de informação genética considerada estável ou a transferência pode ser transitória e a transferência de informação genética não é hereditária.

Os métodos de expressão transiente podem ser usados para expressar as construções da presente invenção (ver Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; que é aqui incorporado por referência). Em alternativa, pode ser utilizado um método de expressão transiente à base de vácuo, tal como descrito por Kapila et al.r 1997, (aqui incorporado por referência) . Estes métodos podem incluir, por exemplo, mas não estão limitados a, um método de agro-inoculação ou agro-infiltração, no entanto, podem também ser utilizados outros métodos transientes conforme observado acima. Tanto com a agro-inoculação como com a agro-infiltração, uma mistura de Agrobacteria compreendendo o ácido nucleico desejado introduz-se nos espaços intercelulares de um tecido, por exemplo, as folhas, a parte aérea da planta (incluindo fragmentos de caules, folhas e flores), a outra porção da planta (caule, raiz, flor), ou a planta inteira. Depois de atravessar a epiderme, a

Agrobacterium infeta e transfere cópias de t-ADN para as células. 0 t-ADN é epissomicamente transcrito e o ARNm traduzido, conduzindo à produção da proteína de interesse em células infetadas, no entanto, a passagem de t-DNA dentro do núcleo é transiente. 4 — Organismo hospedeiro

As VLP da presente memória descritiva podem ser produzidas numa célula hospedeira que é caracterizada pela falta de capacidade para sialilar proteínas, por exemplo falta de sialidase, tal como uma célula de planta, uma célula de inseto, fungos, e outros organismos, incluindo esponja, coelenterara, annelida, arthoropoda, moluscos, nemathelminthea, trochelmintes, Plathelminthes, Chaetognatha, tentaculate, clamídia, espiroquetas, bactérias gram-positivas, cianobactérias, arqueobactérias, conforme identificado na glycoforum (ver, por exemplo, a URL: glycoforum.gr.jp/science/word /evolution/ES-A03E.html).

As VLP produzidas como aqui descrito não compreendem, tipicamente, a neuraminidase (NA). No entanto, a NA pode ser co-expressa com HA devendo ser desejado que as VLP compreendam HA e NA.

Particularmente, as VLP da presente divulgação podem ser produzidas em células de plantas, uma planta inteira ou suas porções, tais como folhas, sementes, ou qualquer outro material vegetal.

Pelo termo "material vegetal" entende-se qualquer material derivado de uma planta. A matéria vegetal pode compreender uma planta inteira, tecido, células, ou qualquer fração da mesma. Além disso, a matéria vegetal pode compreender componentes intracelulares de plantas, componentes de plantas, extratos extracelulares líquidos ou sólidos de plantas, ou uma combinação dos mesmos. Além disso, a matéria vegetal pode compreender plantas, células vegetais, tecido, extrato líquido, ou uma combinação dos mesmos, a partir de folhas de plantas, caules, flores, frutas, raizes, ou uma combinação dos mesmos. A matéria vegetal pode compreender uma planta ou parte da mesma que não tenha sido submetida a quaisquer passos de processamento. No entanto, é também contemplado que o material de planta pode ser sujeito a passos de processamento mínimo, tal como definido abaixo, ou um processamento mais rigoroso, incluindo purificação de proteínas parcial ou substancial usando técnicas geralmente conhecidas na arte incluindo, mas não se limitando a cromatografia, eletroforese e semelhantes.

Pelo termo "processamento mínimo" pretende-se significar a matéria vegetal, por exemplo, uma planta ou parte da mesma que compreende uma proteína de interesse, que é parcialmente purificada, para se obter um extrato de planta, homogenato, fração de homogeneizado de planta ou semelhantes (ou seja, minimamente processado) . A purificação parcial pode incluir, mas não está limitado a, perturbar as estruturas celulares da planta criando, assim, uma composição que compreende componentes vegetais solúveis, e componentes vegetais insolúveis, que podem ser separados, por exemplo, mas não limitado a, por centrifugação, filtração ou uma combinação dos mesmos. A este respeito, as proteínas segregadas no espaço extracelular da folha ou de outros tecidos podem ser prontamente obtidas utilizando vácuo ou extração centrífuga, ou tecidos pode ser extraídos sob pressão pela passagem através de rolos ou moagem ou algo semelhante para apertar ou libertar a proteína livre de dentro do espaço extracelular. 0 processamento mínimo poderia também envolver a preparação de extratos brutos de proteínas solúveis, uma vez que estas preparações teriam uma contaminação insignificante a partir de produtos vegetais secundários. Além disso, o processamento mínimo pode envolver a extração aquosa de proteína solúvel das folhas, seguido por precipitação com qualquer sal adequado. Outros métodos podem incluir a maceração e extração em larga escala de suco, a fim de permitir a utilização direta do extrato. A matéria vegetal, sob a forma de material vegetal ou de tecido pode ser entregue por via oral a um sujeito. A matéria vegetal pode ser administrada como parte de um suplemento dietético, juntamente com outros alimentos, ou encapsulada. A matéria vegetal ou tecido pode também ser concentrada para melhorar ou aumentar a palatabilidade, ou fornecida, juntamente com outros materiais, ou ingredientes, excipientes farmacêuticos, conforme necessário.

Também considerados parte desta divulgação são as plantas transgénicas, células de plantas ou sementes contendo a construção do gene quimérico da presente divulgação. Os métodos de regenerar plantas inteiras a partir de células de plantas são também conhecidos na técnica. Em geral, as células de planta transformadas são cultivadas num meio apropriado, o qual pode conter agentes seletivos tais como antibióticos, marcadores selecionáveis, que são usados para facilitar a identificação de células vegetais transformadas. Uma vez os caules formados, a formação pode ser encorajada pela utilização de hormonas vegetais adequadas, de acordo com os métodos conhecidos e os rebentos transferidos para meio de enraizamento para regeneração das plantas. As plantas podem então ser utilizadas para estabelecer gerações repetitivas, ou a partir de sementes ou utilizando técnicas de propagação vegetativas. As plantas transgénicas podem também ser geradas sem a utilização de culturas de tecidos.

Também considerado parte desta divulgação são as plantas transgénicas, árvores, leveduras, bactérias, fungos, células de inseto e animais, contendo a construção do gene quimérico que compreende um ácido nucleico que codifica para HAO recombinante para a produção de VLP, em conformidade com a presente divulgação. É contemplado que uma planta compreendendo a proteína de interesse, ou expressando a VLP compreendendo a proteína de interesse, pode ser administrada a um indivíduo ou organismo alvo, numa variedade de formas, dependendo da necessidade e da situação. Por exemplo, a proteína de interesse obtida a partir da planta pode ser extraída antes da sua utilização quer em bruto, parcialmente purificada ou na forma purificada. Se a proteína é para ser purificada, em seguida, pode ser produzida tanto em plantas comestíveis ou não comestíveis. Além disso, se a proteína for administrada por via oral, o tecido de planta pode ser recolhido e fornecido diretamente ao sujeito, ou o tecido recolhido pode ser seco antes da alimentação, ou a um animal pode ser permitido pastar na planta sem lugar a colheita prévia. Considera-se também dentro do âmbito da presente memória descritiva, os tecidos da planta colhida a serem fornecidos como um suplemento alimentar dentro de alimentos para animais. Se o tecido da planta é para alimentar a um animal, com pouco ou nenhum processamento adicional, é preferível que o tecido da planta a ser administrado seja comestível. 0 gene de silenciamento pós-transcricional (PTGS) pode estar envolvido na limitação expressão de transgenes em plantas, e a co-expressão de um supressor de silenciamento do vírus Y da batata (HCPro) pode ser utilizado para neutralizar a degradação específica do ARNm do transgene (Brigneti et ai., 1998). Supressores de silenciamento alternativos são bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados como aqui descrito (Chiba et al., 2006, Virology 346: 7-14; que é aqui incorporado por referência), por exemplo, mas não limitado a, TEV-pl/HC-Pro (vírus etch do tabaco pl/HC-Pro), BYV-p21, vírus pl9 de tomate enfezado vermelho (TBSV P19), cápside da proteína do vírus do tomate dobrado (TCV -CP), 2b do vírus do mosaico do pepino; CMV-2b), p25 do vírus da batata X (PVX-p25) , pll do vírus da batata M (PVM-pll pll do vírus da batata S (PVS-pll), pl6 do vírus do mirtilo, (BScV-pl6), p23 de vírus Citrus tristexa (CTV-p23), p24 de Grapevine associada ao enrolamento do vírus-2, (GLRaV-2 p24), plO do vírus Grapevine A (GVA-plO), pl4 do vírus Grapevine B (GVB-pl4), plO de vírus latente Heracleum (HLV-plO), ou pl6 do vírus latente do aAlho comum (GCLV-pl6). Portanto, um supressor de silenciamento, por exemplo, mas não limitado a, HCPro, TEV-Pl/HC-Pro, BYV-p21, TBSV pl9, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-pl 1, PVS-pll, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-pl4, HLV-plO, GCLV-pl6 ou GVA-plO, talvez co-expresso juntamente com a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse para garantir níveis de produção de proteínas ainda mais elevados dentro de uma planta. VLPs de vírus envelopados geralmente adquirem o seu envelope da membrana de que brotam. Membranas plasmáticas de plantas têm um complemento de fitosterol que pode ter efeitos imunoestimulantes. Para investigar esta possibilidade, H5 VLPs feitos de plantas foram administrados aos animais, na presença de um adjuvante, e o HAI (hemaglutinação da resposta de anticorpo de inibição) determinado (Figura 7). A produção de VLP em plantas apresenta várias vantagens sobre a produção destas partículas em cultura de células de inseto. Os lípidos de plantas podem estimular células específicas do sistema imunológico e melhorar a resposta imunitária induzida. As membranas celulares das plantas são feitos de lípidos, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), e também contêm glicoesfingolípidos que são únicos para as plantas e algumas bactérias e protozoários. Os esfingolípidos são invulgares na medida em que não são ésteres de glicerol como PC ou PE, mas sim constituídos por um amino álcool de cadeia longa que forma uma ligação amida a uma cadeia de ácido gordo contendo mais de 18 átomos de carbono. PC e PE, bem como glicoesfingolípidos, podem ligar-se a moléculas CDl expressas por células imunitárias de mamíferos, tais como células apresentadoras de antigénio (APCs), tais como, macrófagos e células dendríticas e outras células, incluindo os linfócitos B e T no timo e fígado (Tsuji M, . 2006) . Além disso, para além do efeito adjuvante potencial da presença de lípidos de plantas, a capacidade dos glicanos N da planta para facilitar a captura dos antigénios da glicoproteína por células apresentadoras de antígenos (Saint-Jore-Dupas, 2007), pode ser vantajoso da produção de VLP em plantas.

Sem se pretender ficar limitado pela teoria, espera-se que as VLPs feitas à planta vai induzir uma reação imune mais forte do que as VLPs feitas em outros sistemas de produção/fabrico e a reação imunológica induzida por estas VLP feitas de plantas será mais forte quando comparada à reação imune induzida pelas vacinas de virus inteiros vivas ou atenuadas.

Ao contrário das vacinas feitas de virus inteiros, as VLP proporcionam a vantagem de que não são infeciosas, assim, a contenção biológica restritiva não é tão significativa como um problema que seria trabalhar com um todo, o virus infecioso, e não é necessária para a produção. VLP feita de plantas proporciona uma vantagem adicional novamente, permitindo que o sistema de expressão seja cultivada numa estufa ou campo sendo, assim, significativamente mais económico e apropriado para produção em escala.

Além disso, as plantas não compreendem as enzimas envolvidas na síntese e adição de resíduos de ácido siálico a proteínas. As VLPs podem ser produzidas na ausência de neuraminidase (NA), e não há necessidade de co-expressarem NA, ou para tratarem as células que produzem ou extrato com sialidase (neuraminidase), para assegurar a produção de VLP em plantas.

Particularmente, as VLP produzidas de acordo com a presente invenção não compreendem a proteína Ml que é conhecida por se ligar a ARN. 0 ARN é um contaminante da preparação de VLP e é indesejável quando se obtém aprovação reguladora para o produto de VLP para utilização como uma vacina humana. 5 - Ácidos nucleicos A presente invenção proporciona um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um antigénio da hemaglutinina do vírus da gripe (HA), ligada operativamente a uma região reguladora ativa num organismo hospedeiro não-sialilado. A presente revelação descreve, mas não está limitado a, a clonagem de um ácido nucleico que codifica HA, por exemplo, mas não limitado a, vírus A da gripe humana HA num vetor de expressão hospedeiro, e a produção de VLPs da gripe a partir do hospedeiro, adequados para a produção de vacinas. As VLP podem também ser utilizadas para produzir reagentes constituídos por proteínas recombinantes estruturais da gripe que se auto-montam em estruturas de proteínas funcionais e imunogénicas homotípicas macromoleculares, incluindo partículas subvirais de gripe e VLP da gripe, em células de hospedeiros transformadas, por exemplo, células vegetais ou células de inseto. A presente memória descritiva também inclui sequências de nucleótidos Hl (codificado pela SEQ ID N° : 1), H2 (codificado pela SEQ ID N°: 2), H3 (codificado pela SEQ ID N°: 3), H4 (codificado pela SEQ ID N°: 4), H5 (codificado pela SEQ ID N°: 5), H6 (codificado pela SEQ ID N°: 6), H7 (codificado pela SEQ ID N°: 7), H8 (codificado pela SEQ ID N° : 8), H9 (codificado pela SEQ ID N°: 9), H10 (codificado pela SEQ ID N°: 10), Hl 1 (codificado pela SEQ ID N°: 11), H12 (codificado pela SEQ ID N°: 12), H13 (codificado pela SEQ ID N°: 13), H14 (codificado pela SEQ ID N°: 14), H15 (codificado pela SEQ ID N°: 15), e H16 (codificado pela SEQ ID N°: 16).

Particularmente, a presente invenção inclui sequências de nucleótidos da SEQ ID N°: 1; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 7 que codifica HA de Hl, H5 ou H7, respetivamente; uma sequência de nucleótidos da SEQ ID N°: 1; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 7, que híbrida sob condições de hibridação rigorosas com um ácido nucleico que codifica a HA de Hl, H5 ou H7, respetivamente; ou uma sequência de nucleótidos da SEQ ID N°: 1; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 7, que híbrida sob condições de hibridação rigorosas a um complemento de um ácido nucleico que codifica a HA de Hl, H5 ou H7, respetivamente; em que a sequência de nucleótidos codifica uma proteína da hemaglutinina que, quando expressa forma uma VLP, e que a VLP induz a produção de um anticorpo. Por exemplo, a expressão da sequência nucleotídica numa célula hospedeira forma uma VLP, e a VLP pode ser usada para produzir um anticorpo que é capaz de se ligar a HA, incluindo HA madura, HAO, HA1 ou HA2. A VLP, quando administrada a um sujeito, induz uma resposta imune.

A hibridação em condições de hibridação rigorosas é conhecida na técnica (ver, por exemplo Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 and supplements; Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook and Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition 2001; cada um dos quais é aqui incorporado por referência). Um exemplo de uma dessas condições severas de hibridização pode ser cerca de 16-20 horas de hibridação em 4 X SSC a 65°C, seguido por lavagem em 0,1 X SSC a 65°C durante uma hora, ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C por cada 20 ou 30 minutos. Em alternativa, uma condição de hibridação rigorosa exemplar pode ser durante a noite (16-20 horas) em 50% de formamida, SSC 4 x a 42°C, seguido por lavagem em 0,1 X SSC a 65°C durante uma hora, ou 2 lavagens em 0,1 X SSC a 65°C por cada 20 ou 30 minutos, ou durante a noite (16-20 horas), ou hibridação em tampão de fosfato aquoso Church (SDS a 7%; NaP04 0,5 M, pH 7,2; EDTA a 10 mM) a 65°C, com 2 lavagens quer a 50°C em 0,1 X SSC, 0,1% SDS durante 20 ou 30 minutos cada, ou 2 lavagens a 65°C em 2 x SSC, SDS a 0,1% durante 20 a 30 minutos cada.

Além disso, a presente invenção inclui sequências de nucleótidos que são caracterizados como tendo cerca de 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou qualquer quantidade entre aquelas, de identidade de sequência, ou similaridade de sequência, com a sequência de nucleótidos que codificam HA de Hl (SEQ ID N°: 1), H5 (SEQ ID N°: 5) ou H7 (SEQ ID N°: 7), em que a sequência de nucleótidos codifica uma proteína da hemaglutinina que quando expressa forma uma VLP, e em que a VLP induz a produção de um anticorpo. Por exemplo, a expressão da sequência nucleotídica dentro de uma célula de planta forma uma VLP, e a VLP pode ser usada para produzir um anticorpo que é capaz de se ligar a HA, incluindo HA madura, HA0, HAl ou HA2. A VLP, quando administrada a um sujeito, induz uma resposta imune. A identidade de sequências ou semelhança de sequências pode ser determinada utilizando um programa de comparação de sequências de nucleótidos, tais como o fornecido por DNASIS (por exemplo, usando, mas não limitado a, os seguintes parâmetros: Penalidade de Lacuna 5, #diagonais de topo 5, penalidade BPA fixa de 10, k-tuple 2, gap flutuante 10, e o tamanho da janela 5). No entanto, outros métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica, por exemplo, os algoritmos de Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444, e por implementações computadorizadas destes algoritmos (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA e BLAST), ou por alinhamento manual e inspeção visual.

Portanto, a presente invenção inclui adicionalmente um vetor adequado que compreende a construção quimérica adequado para uso com qualquer dos sistemas de expressão estável ou transiente. A informação genética pode também ser fornecida dentro de uma ou mais do que uma construção. Por exemplo, uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de interesse pode ser introduzida numa construção, e uma segunda sequência de nucleótidos que codifica uma proteína que modifica a glicosilação da proteína de interesse pode ser introduzida utilizando uma construção separada. Estas sequências de nucleótidos podem então ser co-expressas num hospedeiro. No entanto, pode também ser utilizada uma construção compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica tanto a proteína de interesse e a proteína que modifica o perfil de glicosilação da proteína de interesse. Neste caso, a sequência de nucleótidos que compreende uma primeira sequência compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse operativamente ligada a um promotor ou uma região reguladora, e uma segunda sequência compreendendo uma sequência de ácido nucleico segundo que codifica a proteína que modifica o perfil de glicosilação da proteína de interesse, a segunda sequência operativamente ligada a um promotor ou região reguladora.

Por "co-expressa" entende-se que duas, ou mais do que duas, sequências de nucleótidos são expressas em aproximadamente o mesmo tempo no interior do hospedeiro, e dentro do mesmo tecido do hospedeiro. No entanto, as sequências de nucleótidos não necessitam de ser expressas exatamente ao mesmo tempo. Em vez disso, as duas ou mais sequências de nucleótidos são expressas de um modo tal que os produtos codificados têm uma oportunidade para interagir. Por exemplo, a proteína que modifica a glicosilação da proteína de interesse pode ser expressa ou antes ou durante o período em que a proteína de interesse é expressa de modo que a modificação da glicosilação da proteína de interesse tem lugar. As duas ou mais de duas sequências de nucleótidos podem ser co-expressas utilizando um sistema de expressão transiente, onde as duas ou mais sequências são introduzidas dentro do hospedeiro, ou menos ao mesmo tempo, em condições que ambas as sequências são expressas. Em alternativa, um hospedeiro plataforma compreendendo uma das sequências de nucleótidos, por exemplo, a sequência que codifica a proteína que modifica o perfil de glicosilação da proteína de interesse, pode ser transformado, quer transitoriamente ou de uma maneira estável, com uma sequência adicional que codifica a proteína de interesse. Neste caso, a sequência que codifica a proteína que modifica o perfil de glicosilação da proteína de interesse pode ser expresso dentro de um tecido desejado, durante um estágio de desenvolvimento desejado, ou a sua expressão pode ser induzida utilizando um promotor induzível, e a sequência que codifica adicionalmente a proteína de interesse pode ser expressa sob condições semelhantes e no mesmo tecido, para assegurar que as sequências de nucleótidos são co-expressas.

As construções da presente invenção podem ser introduzidas em células vegetais utilizando plasmídeos Ti, plasmídeos Ri, vetores de vírus de plantas, transformação direta de ADN, microinjeção, eletroporação, etc. Para revisões de tais técnicas ver, por exemplo Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); andMiki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997) . Outros métodos incluem a absorção direta de ADN, a utilização de lipossomas, eletroporação, por exemplo, utilizando protoplastos, microinjeção, microprojéteis ou bigodes, e infiltração por vácuo. Ver, por exemplo, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J. Virol Meth, 105:343-348, 2002), as Patentes US 4945050; 5036006; e 5100792, o pedido de patente US Ser. 08/438.666, apresentado a 10 de Maio de 1995 e 07/951715, apresentado a 25 de Setembro de 1992, (todos os quais são aqui incorporados por referência).

Por "região reguladora" "elemento regulador" ou "promotor" entende-se uma porção de ácido nucleico tipicamente, mas nem sempre, a montante da região de um gene, que pode ser composto de ADN ou ARN, ou tanto de ADN que codifica proteínas e ARN. Quando uma região reguladora é ativa, e em associação operativa, ou operativamente ligada, com um gene de interesse, isto pode resultar na expressão do gene de interesse. Um elemento regulador pode ser capaz de mediar a especificidade do órgão, ou o controlo da ativação de genes de desenvolvimento ou temporal. Uma "região reguladora" inclui elementos promotores, elementos do promotor do núcleo que apresentam uma atividade de promotor basal, elementos que são indutiveis em resposta a um estimulo externo, elementos que medeiam a atividade do promotor, tal como, elementos reguladores negativos ou potenciadores da transcrição. "Região reguladora", tal como aqui utilizado, também inclui elementos ativos que estão a seguir a transcrição, por exemplo, elementos reguladores que modulam a expressão de genes, tais como intensificadores de transcrição e translação, repressores translacionais e transcricionais, sequências de ativação a montante, e fatores de instabilidade do ARNm. Vários destes últimos elementos podem estar localizados proximal à região de codificação.

No contexto da presente memória descritiva, o termo "elemento regulador" ou "região reguladora" tipicamente refere-se a uma sequência de ADN, normalmente, mas não sempre, a montante (5') a sequência de codificação de um gene estrutural, o qual controla a expressão da região de codificação ao proporcionar o reconhecimento para a polimerase de ARN e/ou outros fatores requeridos para a transcrição se iniciar num sitio particular. No entanto, é para ser entendido que outras sequências de nucleótidos, localizados dentro de intrões, ou 3' da sequência podem também contribuir para a regulação da expressão de uma região de codificação de interesse. Um exemplo de um elemento regulador que prevê o reconhecimento para a polimerase de ARN e outros fatores de transcrição para assegurar a iniciação num sitio particular é um elemento promotor. A maioria, mas não todos, os elementos promotores eucarióticos contêm uma caixa TATA, uma sequência de ácido nucleico conservado composto de adenosina e timidina de bases de nucleótidos pares geralmente situados a cerca de 25 pares de bases a montante de um sítio de início da transcrição. Um elemento promotor compreende um elemento de promotor basal, responsável pela iniciação da transcrição, assim como outros elementos reguladores (como listado acima) que modificam a expressão do gene.

Existem vários tipos de regiões reguladoras, incluindo aquelas que são reguladas pelo desenvolvimento, indutivo ou constitutivo. Uma região reguladora que é regulada pelo desenvolvimento, ou controla a expressão diferencial de um gene sob o seu controlo, é ativada dentro de certos órgãos ou tecidos de um órgão em tempos específicos durante o desenvolvimento do referido órgão ou tecido. No entanto, algumas regiões reguladoras que são regulados relativamente ao desenvolvimento podem, preferencialmente, estar ativas dentro de certos órgãos ou tecidos em fases específicas do desenvolvimento, podem, também, ser ativas de uma forma regulada pelo desenvolvimento, ou a um nível basal de outros órgãos ou tecidos, bem como, dentro da planta. Exemplos de regiões reguladoras específicas de tecido, por exemplo, uma região reguladora específica, inclui o promotor de napina e o promotor de cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130) . Um exemplo de um promotor específico de folha inclui o promotor de plastocianina (Figura 3; US 7125978, que é aqui incorporado por referência).

Uma região reguladora induzível é uma que é capaz de, direta ou indiretamente, ativar a transcrição de uma ou mais sequências de ADN ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as sequências de ADN ou genes não serão transcritas. Tipicamente o fator de proteína que se liga especificamente a uma região reguladora induzível para ativar a transcrição pode estar presente numa forma inativa, que é então convertida, direta ou indiretamente, para a forma ativa pelo indutor. No entanto, o fator de proteína, também pode estar ausente. 0 indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, regulador do crescimento, herbicida ou composto fenólico ou uma tensão fisiológica diretamente aplicada pelo calor, frio, sal, ou elementos tóxicos ou indiretamente pela ação de um agente patogénico ou doença, tal como, um vírus. Uma célula de planta contendo uma região reguladora induzível pode ser exposta a um indutor aplicando-se externamente o indutor para a célula ou planta, tal como, por pulverização, rega, aquecimento ou métodos semelhantes. Elementos reguladores induzíveis podem ser derivados a partir de genes de plantas, quer ou não vegetais (por exemplo, Gatz, C. e Lenk, IRP de 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; que é aqui incorporado por referência). Exemplos, de potenciais promotores induzíveis incluem, mas não se limitando ao promotor induzível por tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Physiol Plant. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; que é aqui incorporado por referência), o promotor induzível esteroide (Aoyama, T. e Chua, NH, 1997, Plant J. 2, 397-404; que é aqui incorporada por referência) e promotor induzível etanol (Salter, MG, et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, MX, et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, que são incorporados por referência) e os genes induzíveis da citocinina IB6 e CKIl (Brandstatter, I. e Kieber, JJ 1998, Plant Cell 10, 1009-1019;Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985; que são aqui incorporados por referência) e o elemento induzível auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1.963-1.971; que é aqui incorporado por referência).

Uma região de regulação constitutiva dirige a expressão de um gene ao longo das várias partes de uma planta e continuamente ao longo do desenvolvimento da planta. Exemplos de elementos reguladores constitutivos conhecidos incluem promotores associados com o transcrito CaMV 35S. (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), actina do arroz 1 (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), zctina 2 (An et al., 1996, Plant J., 10:. 107-121), ou tms 2 (US 5428147, que é aqui incorporado por referência), e isomerase de triosefosfato 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467) genes, do gene da ubiquitina de milho 1 (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), genes da ubiquitina Arabidopsis 1 e 6 (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), e o gene de translação do fator de iniciação do tabaco 4A (Mandei et al., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004). O termo "constitutivo", tal como é aqui utilizado, não significa necessariamente que um gene sob o controlo da região reguladora constitutiva é expresso ao mesmo nivel em todos os tipos celulares, mas que o gene é expresso numa grande variedade de tipos de células, apesar de variação em abundância ser muitas vezes observada.

Por "operacionalmente ligado" pretende-se significar que as sequências particulares, por exemplo, um elemento regulador e uma região de codificação de interesse, interagem, direta ou indiretamente, para realizar uma função a que se destinam, tais como, a mediação ou modulação da expressão do gene. A interação de sequências operacionalmente ligadas pode, por exemplo, ser mediada por proteínas que interagem com as sequências operacionalmente ligadas. A sequência de um ou mais do que um nucleótido da presente divulgação podem ser expressas em qualquer planta hospedeira adequada, que é transformada pela sequência de nucleótidos, ou construções, ou vetores da presente divulgação. Exemplos de hospedeiros adequados incluem, mas não estão limitados a, culturas agrícolas, incluindo alfafa, canola, Brassica spp., Milho, Nicotiana spp., alfafa, batata, ginseng, ervilha, aveia, arroz, soja, trigo, cevada, girassol, algodão e similares. A uma ou mais construções genéticas quiméricas da presente invenção pode ainda compreender uma região 3' não traduzida. Uma região 3' não traduzida refere-se à porção de um gene que compreende um segmento de ADN que contém um sinal de poliadenilação e quaisquer outros sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mARN ou a expressão do gene. 0 sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado por afetar a adição de faixas de ácido poliadenilico à extremidade 3' do precursor de mARN. Os sinais de poliadenilação são vulgarmente reconhecidos pela presença de homologia à forma canónica 5' AATAAA-3' embora as variações não sejam incomuns. Uma ou mais das construções genéticas quiméricas da presente invenção também podem incluir outros intensificadores, tanto intensificadores de transcrição como de tradução, como seja necessário. Estas regiões potenciadoras são bem conhecidos para as pessoas peritas na técnica, e podem incluir o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. 0 codão de iniciação deve estar em fase com a grelha de leitura da sequência de codificação para assegurar a tradução da sequência inteira.

Exemplos não limitativos de regiões 3' adequadas são as regiões não traduzidas 3' transcritas contendo um sinal de poliadenilação de tumor de Agrobacterium induzindo (Ti) genes de plasmídeos, tais como a sintase de nopalina (gene NOS) e os genes de plantas, tais como, genes da proteína de armazenamento da soja, o gene da subunidade pequena da carboxilase de ribulose-1,5-bifosfato (ssRUBISCO; US 4962028; a qual é aqui incorporada por referência), o promotor utilizado na regulação da expressão da plastocianina (Pwee e Gray, 1993; que é aqui incorporado por referência). Um exemplo de um promotor de plastocianina é descrito em US 7125978 (que é aqui incorporada por referência).

Como aqui descrito, os promotores que compreendem sequências potenciadoras com eficácia demonstrada em expressão de folha, foram encontrados para serem eficazes na expressão transiente. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, a ligação de elementos reguladores a montante de um gene fotossintético por ligação à matriz nuclear pode mediar fortemente a expressão. Por exemplo, até -784 a partir do sítio do início da tradução do gene da plastocianina da ervilha pode ser utilizado para mediar fortemente a expressão do gene repórter. A utilização de uma região reguladora de um gene fotossintético, por exemplo, mas não limitado a, uma região reguladora de plastocianina (US 7125978; que é aqui incorporado por referência), ou uma região reguladora obtida a partir da carboxilase de ribulose 1,5-bifosfato/oxigenase (RuBisCO; US 4962028; que é aqui incorporado por referência), a proteína de ligação da clorofila a/b (CAB; Leutwiler et al; 1986; que é aqui incorporado por referência), ST-LS1 (associada com o complexo de evolução de oxigénio do fotossistema II, Stockhaus et al. 1989; que é aqui incorporado por referência) podem ser utilizados de acordo com a presente divulgação.

Para ajudar na identificação de células de planta transformadas, as construções da presente memória descritiva podem ser adicionalmente manipuladas para incluir marcadores de planta selecionáveis. Os marcadores selecionáveis úteis incluem enzimas que proporcionam a resistência a produtos químicos, tais como um antibiótico, por exemplo, gentamicina, higromicina, canamicina, ou herbicidas, tais como, fosfinotricina, glifosato, clorosulfuron e semelhantes. Do mesmo modo, as enzimas que fornecem a produção de um composto identificável através da mudança de cor como a GUS (beta-glucoronidase) , ou luminescência, tal como, a luciferase ou GFP, pode ser utilizado.

As cópias de cADN resultantes destes genes podem ser clonadas num vetor de expressão adequado, conforme exigido pelo sistema de expressão do hospedeiro. Exemplos de vetores de expressão apropriados para plantas são descritos abaixo, em alternativa, vetor de expressão de baculovírus, por exemplo, pFastBacl (Invitrogen) , resultando nos plasmideos baseados em pFastBacl, usando métodos conhecidos, e pode ser utilizada a informação fornecida por instruções do fabricante. A presente divulgação é ainda dirigida a uma construção de genes compreendendo um ácido nucleico de codificação de HA, como descrito acima, ligada operativamente a um elemento regulador que é operativo numa planta. Exemplos de elementos reguladores operacionais numa célula de planta e que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, uma região reguladora de plastocianina (US 7125978; que é aqui incorporado por referência), ou uma região reguladora obtida a partir da carboxilase de ribulose 1,5-bifosfato/oxigenase (RuBisCO; US 4962028; que é aqui incorporado por referência), a proteína de ligação da clorofila a/b (CAB; Leutwiler et al; 1986; que é aqui incorporado por referência), ST-LS1 (associada com o complexo de evolução de oxigénio do fotossistema II, Stockhaus et al. 1989; que é aqui incorporado por referência). Se a construção é expressa numa célula de inseto, exemplos de elementos reguladores operacionais numa célula de inseto incluem, mas não estão limitados, ao promotor do poliedro, o promotor gp64 e semelhantes. A presente divulgação proporciona ainda a clonagem de um ácido nucleico que codifica uma HA, por exemplo, mas não se limitando a, gripe humana A/Indonésia/5/05 do vírus HA (H5N1) numa planta, levedura ou vetor de expressão de inseto (por exemplo, vetor de expressão de baculovírus) e produção de vacinas candidatas contra a gripe ou reagentes constituídos por proteínas estruturais de gripe recombinante que se auto-montam em estruturas de proteínas funcionais e imunogénicas homotípicas macromoleculares, incluindo partículas subvirais de gripe e VLP de gripe, em células vegetais transformadas ou células de insetos transformadas. 0 ácido nucleico que codifica a HA, por exemplo, mas não limitado a, gripe humana A/New Caledonia/20/99 (HlNl) de HA, ou a gripe humana A/Indonésia/5/05 do gene de HA do vírus pode ser expressa, por exemplo, utilizando um sistema de expressão de baculovírus numa linha de células apropriada, por exemplo, células de Spodoptera frugiperda (por exemplo, linha de células Sf-9; ATCC PTA-4047). Podem também ser utilizadas outras linhas de células de insetos. O ácido nucleico que codifica a HA pode, em alternativa, ser expresso numa célula de planta, ou numa planta. A HA que codifica o ácido nucleico pode ser sintetizada por reação em cadeia da polimerase e a transcrição inversa (PCR) utilizando ARN de HA. Como um exemplo, o ARN pode ser isolado a partir dum vírus da gripe humana A/New Caledonia/20/99 (HlNl) ou do vírus da gripe humana A/Indonésia/5/05 (H5N1), ou a partir de células infetadas com um vírus da gripe. Para a transcrição reversa e PCR, os iniciadores oligonucleotídicos específicos para HA ARN, por exemplo, mas não se limitando a genes HA de gripe humana A/New Caledonia/20/99 (HlNl) ou genes de vírus HAO de gripe humana A/Indonésia/5/05 (H5N1) podem ser utilizados. Além disso, a HA que codifica o ácido nucleico pode ser quimicamente sintetizada utilizando métodos como seria conhecido de um perito na técnica. 6 - Proteínas A presente memória descritiva também inclui um ou mais do que uma proteína HA codificada pelas sequências de nucleótidos SEQ ID N° : 1; SEQ ID N° : 5; SEQ ID N°: 7 (que codifica para HA de Hl, H5 ou H7, respetivamente), uma sequência de nucleótidos da SEQ ID N°: 1; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 7, que híbrida sob condições de hibridação rigorosas com um ácido nucleico que codifica a HA de Hl, H5 ou H7, respetivamente, ou uma sequência de nucleótidos da SEQ ID N°: 1; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 7, que hibrida sob condições de hibridação rigorosas com o complemento de um ácido nucleico que codifica a HA de Hl, H5 ou H7, respetivamente, em que a sequência de nucleótidos codifica uma proteína da hemaglutinina que, quando expressa, forma uma VLP, e que a VLP induz a produção de um anticorpo.

Do mesmo modo, a presente revelação inclui HAs associadas com os seguintes subtipos Hl (codificado pela SEQ ID N°: 1), H2 (codificado pela SEQ ID N°: 2), H3 (codificado pela SEQ ID N°: 3), H4 (codificado pela SEQ ID N°: 4), H5 (codificado pela SEQ ID N°: 5), H6 (codificado pela SEQ ID N°: 6), H7 (codificado pela SEQ ID N°: 7), H8 (codificado pela SEQ ID N°: 8), H9 (codificado pela SEQ ID N°: 9), H10 (codificado pela SEQ ID N°: 10), Hll (codificado pela SEQ ID N°: 11), H12 (codificado pela SEQ ID N°: 12), H13 (codificado pela SEQ ID N°: 13), H14 (codificado pela SEQ ID N°: 14), H15 (codificado pela SEQ ID N°: 15), H16 (codificado pela SEQ ID N°: 16); e sequências de nucleótidos que são caracterizados como tendo cerca de 60 a 100% ou qualquer quantidade entre identidade de sequência, particularmente de cerca de 70 a 100% de homologia ou qualquer quantidade entre aquelas, de 80 a 100% ou qualquer quantidade entre ela, 90-100% ou qualquer quantidade entre ela, ou 95-100%, ou qualquer quantidade entre elas, de identidade de sequência com Hl (SEQ ID N°: 1), H2 (SEQ ID N° : 2), H3 (SEQ ID N° : 3), H4 (SEQ ID N°: 4), H5 (SEQ ID N° : 5), H6 (SEQ ID N° : 6), H7

(SEQ ID N°: 7), H8 (SEQ ID N° : 8), H9 (SEQ ID N° : 9), HlO (SEQ ID N°: 10), Hll (SEQ ID N°: 11), H12 (SEQ ID N°: 12),

Hi3 (SEQ ID N°: 13), H14 (SEQ ID N°: 14), H15 (SEQ ID N° : 15), H16 (SEQ ID N°: 16), em que a sequência de nucleótidos codifica uma proteína da hemaglutinina que, quando expressa, forma uma VLP, e que a VLP induz a produção de um anticorpo, por exemplo, a expressão da sequência nucleotídica dentro de um célula vegetal forma uma VLP, e a VLP pode ser usada para produzir um anticorpo que é capaz de se ligar a HA, incluindo HA madura, HAO, HAl, HA2 ou as VLPs, quando administradas a um sujeito, induzem uma resposta imune.

7 - VLP

Por conseguinte, a presente descrição é dirigida a uma VLP compreendendo um ou mais do que um tipo ou subtipo de HA. O termo "partícula semelhante a vírus" (VLP), ou "partículas semelhantes a vírus" ou "VLP" refere-se a estruturas que se auto-montam e compreendem as proteínas estruturais, tais como, proteínas HA da gripe. As VLPs são geralmente morfologicamente e antigenicamente semelhantes a viriões produzidos numa infeção, mas a que falta informação genética suficiente para replicar e, portanto, não são infeciosas. Em alguns exemplos, as VLPs podem compreender uma única espécie de proteínas, ou mais do que uma espécie de proteína. Para as VLP compreendendo mais do que uma espécie de proteínas, as espécies de proteína podem ser proveniente da mesma espécie de vírus, ou podem compreender uma proteína de uma espécie diferente, género, subfamília ou família de vírus (conforme designado pela nomenclatura ICTV). Em outros exemplos, um ou mais das espécies de proteína compreendendo uma VLP podem ser modificadas a partir da sequência que ocorre naturalmente. As VLP podem ser produzidas em células hospedeiras adequadas, incluindo células hospedeiras de inseto e plantas. A seguir à extração a partir da célula hospedeira e após o isolamento e purificação adicional, sob condições adequadas, as VLP podem ser purificados como estruturas intactas. A divulgação também inclui, mas não está limitado a, VLP derivada da gripe que obtêm um envelope lipídico da membrana plasmática da célula no qual as proteínas são expressas de VLP. Por exemplo, se a VLP é expressa num sistema à base de plantas, a VLP pode obter um envelope lipídico da membrana plasmática da célula.

Geralmente, o termo "lípido" refere-se a um polímero solúvel em gordura (lipofílico), moléculas de ocorrência natural. 0 termo é também utilizado mais especificamente para referir-se ácidos gordos e seus derivados (incluindo os tri-, di- e monoglicéridos e fosfolípidos), bem como outros metabolitos contendo esterol solúvel em gordura ou esteróis. Os fosfolípidos são um componente importante de todas as membranas biológicas, juntamente com os glicolípidos, proteínas e esteróis. Exemplos de fosfolípidos incluem fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, e semelhantes. Os exemplos de esteróis incluem zooestérois (por exemplo, colesterol) e fitosteróis. Mais de 200 fitoesteróis foram identificados em várias espécies de plantas, sendo os mais comuns, campesterol, estigmasterol, ergosterol, brassicasterol, delta-7-estigmasterol, delta-7-avenasterol, daunosterol, sitosterol, 24 metilcolesterol, colesterol ou beta-sitosterol. Como um especialista na técnica iria entender, a composição lipídica da membrana plasmática de uma célula pode variar com as condições de cultura ou crescimento da célula ou do organismo a partir do qual é obtido a célula.

As membranas celulares compreendem geralmente bicamadas lipídicas, bem como as proteínas para diversas funções. As concentrações localizadas de lípidos específicos podem ser encontradas na bicamada lipídica, referido como "jangadas lipídicas". Sem se pretender ficar limitado pela teoria, as jangadas lipídicas podem ter papéis importantes em endo e exocitose, entrada ou a saída de vírus ou outros agentes infeciosos, transdução de sinal intercelular, a interação com outros componentes estruturais da célula ou do organismo, tais como, matrizes intracelulares e extracelulares.

As VLPs produzidas a partir de proteínas derivadas da gripe, de acordo com a presente invenção não compreendem a proteína Ml. A proteína Ml é conhecido por se ligar ARN (Wakefield e Brownlee, 1989) que é um contaminante da preparação de VLP. A presença de ARN é indesejável quando a obtenção de aprovação reguladora para o produto de VLP, por conseguinte, uma preparação de VLP a que falta ARN pode ser vantajosa.

Uma VLP produzida em unidades de acordo com alguns aspetos da presente descrição pode ser complexada com lípidos derivados de plantas. A VLP pode compreender um péptido HAO, HAl ou HA2 ou suas combinações. Os lípidos derivados de plantas podem estar sob a forma de uma bicamada lipídica, e podem compreender adicionalmente um envelope em torno da VLP. Os lípidos derivados de plantas podem compreender os componentes lipídicos da membrana plasmática da unidade em que a VLP é produzida, incluindo, e um ou mais do que um derivado de lípidos da planta, por exemplo, mas não limitado a, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) , glicoesfingolípidos, fitosteróis ou uma combinação dos mesmos. Um lípido de origem vegetal pode, em alternativa, ser referido como um "lípido de planta '.

Em plantas, as VLP de gripe brotam a partir da membrana plasmática, por conseguinte, a composição lipídica da VLP reflete a sua origem. As VLP produzidas de acordo com a presente invenção compreendem HA, complexada com lípidos derivados de plantas. Os lípidos de plantas podem estimular as células específicas do sistema imunológico e melhorar a resposta imunitária induzida. Membranas celulares das plantas são feitos de lípidos, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), e também contêm glicoesfingolípidos, saponinas, e fitosteróis. Além disso, as jangadas lipídicas também são encontradas em membranas plasmáticas da planta - estes microdomínios são enriquecidos em esfingolípidos e esteróis. Em plantas, uma variedade de fitoesteróis são conhecidos por ocorrer, incluindo estigmasterol, sitosterol, 24 metilcolesterol e colesterol (Mongrand et al., 2004). PC e PE, bem como, glicoesfingolípidos, podem ligar-se a moléculas CDl expressas por células imunitárias de mamíferos, tais como células apresentadoras de antigénio (APCs), tais como, macrófagos e células dendriticas e outras células, incluindo os linfócitos B e T no timo e fígado (Tsuji M, . 2006). As moléculas CDl são estruturalmente semelhantes a grandes moléculas de complexo de histocompatibilidade (MHC) de classe I e o seu papel é apresentar antígenos glicolípidos para células NKT (células T assassinas naturais). Após a ativação, as células NKT ativam células imunes inatas, tais como as células NK e células dendriticas e também ativam células do sistema imune adaptativo, como as células B produtoras de anticorpos e células T.

Uma variedade de fitoesteróis podem ser encontrados numa membrana de plasma - o complemento específico pode variar, dependendo das espécies, condições de crescimento, fontes de nutrientes ou estados patogénicos, para citar alguns fatores. Geralmente, o beta-sitosterol é o fitosterol mais abundante.

Os fitoesteróis presentes numa VLP de gripe complexada com uma bicamada lipídica, tal como um envelope derivado de membrana do plasma pode proporcionar uma composição de vacina vantajosa. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, as VLP feita de plantas complexados com uma bicamada lipídica, tal como um envelope derivado de membrana do plasma, podem induzir uma reação imunitária mais forte do que as VLPs feitas em outros sistemas de expressão, e pode ser semelhante à reação imunitária induzida por vacinas de vírus inteiros vivos ou atenuados.

Portanto, em algumas formas de realização, a invenção proporciona uma VLP complexada com uma bicamada de lípido de origem vegetal. Em algumas formas de realização, a bicamada de lípido de origem vegetal pode compreender o envelope da VLP. 8 - Composição

Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma dose eficaz de uma VLP compreendendo uma proteína HA do vírus da gripe, um ou mais de um lípido de plantas, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A proteína HA do vírus da gripe pode ser H5 Indonésia. Também fornecido é um método de indução de imunidade de uma infeção pelo vírus da gripe num sujeito. 0 método compreendendo a administração da partícula semelhante a vírus que compreende uma proteína HA do vírus da gripe, um ou mais de um lípido de plantas, e um veículo farmaceuticamente aceitável. A partícula semelhante a vírus pode ser administrada a um sujeito por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, ou subcutânea. 9 - Método de tratamento A presente invenção proporciona um método de indução de imunidade ou "provocar uma resposta imunológica" a uma infeção por vírus da gripe num sujeito, o método compreendendo a administração da composição, tal como aqui definida.

Uma "resposta imunitária" refere-se geralmente a uma resposta do sistema imunitário adaptativo. 0 sistema imunitário adaptativo compreende geralmente uma resposta humoral e uma resposta mediada por células. A resposta humoral é o aspeto da imunidade que é mediada por anticorpos segregados, produzida nas células da linhagem de linfócitos B (células B) . Os anticorpos segregados ligam-se a antigénios nas superfícies de micróbios invasores (tais como vírus ou bactérias), que os assinala para serem destruídos. A imunidade humoral é usado geralmente para referir a produção de anticorpos e os processos que o acompanham, bem como as funções efectoras dos anticorpos, incluindo a ativação de células Th2 e a produção de citoquinas, a produção de células de memória, promoção de opsoninas da fagocitose, eliminação de agentes patogénicos e semelhantes.

Uma resposta mediada pelas células é uma resposta imune que não envolve anticorpos, mas em vez disso, envolve a ativação de macrófagos, células assassinas naturais (NK), linfócitos T citotóxicos específicos para o antigénio e a libertação de várias citoquinas em resposta a um antigénio. A imunidade mediada por células é usada geralmente para referir alguma ativação celular Th, ativação das células Tc e respostas mediadas por células T. A imunidade mediada por células é de particular importância em resposta a infeções virais. A HA recombinante VLP da presente divulgação pode ser utilizada em conjunto com vacinas contra a gripe existentes, para complementar as vacinas, torná-las mais eficazes, e para reduzir a administração de doses necessárias. Tal como seria conhecido por uma pessoa com conhecimentos na técnica, a vacina pode ser dirigida contra um ou mais de um virus da gripe. Exemplos de vacinas adequadas incluem, mas não estão limitadas a aqueles comercialmente disponível a partir de Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals e similares.

Se desejado, as VLPs da presente divulgação podem ser misturadas com um adjuvante adequado como será conhecido de um perito na técnica. Além disso, a VLP pode ser utilizada numa composição de vacina compreendendo uma dose eficaz da VLP para o tratamento de um organismo alvo, tal como definido acima. Além disso, a VLP produzida de acordo com a presente invenção pode ser combinada com partículas VLP de gripe obtidas a partir de proteínas diferentes, por exemplo, a neuraminidase (ADN).

Por conseguinte, a presente invenção proporciona um método para induzir imunidade à infeção pelo vírus da gripe num organismo animal ou alvo compreendendo a administração de uma dose eficaz de uma vacina compreendendo uma ou mais do que uma VLP. A vacina pode ser administrada por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, ou subcutânea.

Como mostrado na Figuras 6 e 7 os ensaios in vitro que mostram a reatividade cruzada de anticorpos criados contra o A/Indonésia/5/05 mutante H5 VLPs e outras estirpes de gripe tais como A/Vietname/1203-1204; A/Anhui/1/05 e A/Turquia/582/06 (todas as estirpes H5N1), ao passo que mostrou menos reatividade da hemaglutinação contra o único HlNl testado (Figura 7).

Significativamente, os anticorpos produzidos após uma única dose de H5N1 mutado (proteína H5 não glicosilada) induziram uma resposta maior contra todas as estirpes H5 testadas após 14 dias do que os anticorpos produzidos contra o tipo selvagem H5, indicando que este imunogénio não glicosilado pode dar uma resposta mais rápida que o tipo selvagem.

Estes dados, portanto, demonstram que as partículas VLP de gripe feitas de plantas que compreendem os hidratos de carbono mutados H5 da proteína virai hemaglutinina desprovidas de N-ligados induzem uma resposta imunitária específica para estirpes de gripe patogénicas, e que esta resposta é uma reação cruzada e pode ser rápida após uma dose única. 10 - Sujeito

Exemplos de um sujeito ou organismo alvo que as VLPs da presente divulgação podem ser administradas incluem, mas não estão limitados a, seres humanos, primatas, aves, aves aquáticas, aves migratórias, codorniz, pato, ganso, aves de capoeira, peru, galinha, suínos, ovinos, equinos, cavalo, camelo, canino, cães, felino, gatos, tigre, leopardo, civeta, marta, fuinha, furões, animais domésticos, gado, coelhos, ratos, ratos, cobaias e outros roedores, foca, baleia e semelhantes. Tais organismos alvo são exemplares, e não são para ser considerados como limitativos para as aplicações e utilizações da presente divulgação. A presente divulgação também se refere a vírus da gripe que infetam outros mamíferos ou animais hospedeiros, por exemplo, humanos, primatas, cavalos, porcos, pássaros, aves aquáticas, aves migratórias, codorniz, pato, gansos, aves de capoeira, peru, frango, camelo, canino, cães, felino, gatos, tigre, leopardo, civeta, marta, fuinha, furões, animais domésticos, animais, ratos, ratazanas, foca, baleia e similares.

Particularmente, o sujeito a ser tratado pelo método, tal como definido acima, pode ser selecionado a partir do grupo que compreende os seres humanos, primatas, cavalos, porcos, aves (aviárias), galinha da água, aves migratórias, codorniz, pato, gansos, galinhas, cães, gatos, furões, pecuária e afins. Particularmente, o sujeito pode ser um paciente humano ou aves em geral (incluindo aves aquáticas, aves migratórias, aves como codorniz, pato, ganso, peru, frango), particularmente, aves migratórios ou aves para consumo humano (codorniz, pato, gansos, peru, frango). Mais particularmente, o sujeito é humano. 11 - Recipientes, seringas e kits etc. A presente invenção também proporciona um recipiente que compreende a composição tal como aqui definida. Particularmente, o recipiente contém uma dose unitária ou numa forma de dosagem múltipla com um agente conservante. Mais particularmente, o recipiente é uma seringa "pronto-para-usas" precheia com a composição ou vacina tal como aqui definida.

Mais particularmente, a invenção também proporciona um kit compreendendo um recipiente que compreende a vacina ou composição, tal como aqui definida, e instruções sobre como usar/administrar a referida composição/vacina. A invenção vai agora ser descrita em pormenor por meio de referência apenas aos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

Material e métodos 1. Mutação de tipo selvagem H5 de A/Indonésia/5/05 (SEQ IP N°. 17) para se obter H5mutado não glicosilado 0 mutante triplo foi feito através da remoção dos locais de glicosilação N154, N165, e N286 localizados na cabeça globular de tipo selvagem HAs, mais especificamente através da substituição do Thr ou Ser fechado na sequência padrão de glicosilação NXT/S por um resíduo Ala. Assim, o mutante triplo continha as seguintes substituições de três aminoácidos: ΊΊ56Α, T167A e S288A (numerados de acordo com a SEQ ID N° 17 de partida). A substituição de três aminoácidos foi realizada pelo método de ligação à base de PCR apresentado na Darveau et al. (1995), utilizando o vetor de expressão de HA do tipo selvagem (construção 660, Figura 4) como modelo.

Resumidamente, foram realizadas três amplificações por PCR em paralelo no vetor de expressão 660 pCAMBIA como modelo com 3 pares diferentes de iniciadores: 1) Plato-443c (SEQ ID N°: 18) e HA5-Tl56A.r (SEQ ID N°: 19); 2) HA5-T167A.C (SEQ ID N° : 20) e HA5-S288A.r (SEQ ID N° : 21); e 3) HA5-S288A.C (SEQ ID N°: 22) e HA (Ind) -Sacl.r (SEQ ID N° : 23) .

Os produtos de amplificação obtidos a partir das três reações foram misturados em conjunto e a mistura serviu como modelo para uma quarta reação (reação de montagem) usando Plato-443c (SEQ ID N°: 18) e HA (Ind)-Sac.r (SEQ ID N°: 23) como iniciadores. O fragmento resultante foi digerido com BamHI (localizado no promotor de plastocianina) e Saci (na extremidade 3' do fragmento) e clonado em pCAMBIAPlasto previamente digerido com as mesmas enzimas. 0 plasmídeo resultante, denominado 680, é apresentado na Figura 5 (SEQ ID N°.29). 2. Montagem de cassetes de expressão

Todas as manipulações foram realizadas utilizando os protocolos de biologia molecular geral de Sambrook e Russell (2001; que é aqui incorporado por referência). O primeiro passo de clonagem consistiu na montagem de um plasmídeo recetor que contém elementos reguladores a montante e a jusante do gene plastocianina da alfafa. O promotor e as sequências de plastocianina 5'UTR foram amplificados a partir de ADN genómico da alfafa utilizando iniciadores oligonucleotídicos Xmal-pPlas.c (SEQ ID N°: 24) e SacI-ATG-pPlas.r (SEQ ID N° : 25) . O produto de amplificação resultante foi digerido com Xmal e Saci e ligado no pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra), previamente digerido com as mesmas enzimas, para criar pCAMBIApromo Plasto. Do mesmo modo, as sequências 3'UTR e o terminador do gene plastocianina foram amplificadas a partir de ADN genómico da alfafa usando os seguintes iniciadores: Saci-PlasTer.c (SEQ ID N°: 26) e EcoRI-

PlasTer.r (SEQ ID N°: 27), e o produto foi digerido com Saci e EcoRI antes de ser inserido nos mesmos locais do pCAMBIApromoPlasto para criar pCAMBIAPlasto. 3. Montagem da cassete de expressão H5

Um fragmento que codifica a hemaglutinina da estirpe da gripe A/Indonésia/5/05 (H5N1;. Acc. N° LANL ISDN125873) foi sintetizada pela Epoch Biolabs (Sugar Land, Texas, EUA) . O fragmento produzido, contendo a região de codificação completa H5 (SEQ ID N°.17 ) incluindo o péptido de sinal nativo flanqueado por um local HindIII imediatamente a montante do ATG inicial, e um local de Saci imediatamente a jusante do codão de paragem (TAA), é apresentada em SEQ ID N° : 28 (SEQ ID N°.29 e no caso do mutante H5) . A região codificante de H5 foi clonada numa cassete de expressão à base de plastocianina pelo método de ligação à base de PCR apresentado na Darveau et al. (1995) . Resumidamente, uma primeira amplificação por PCR foi obtida utilizando iniciadores Plato-443c (SEQ ID N°: 30) e SPHA (Ind)-Plasto. r (SEQ ID N°: 31) e pCAMBIA promoPlasto como modelo. Em paralelo, uma segunda amplificação foi realizada com os iniciadores plasto-SPHA (Ind).c (SEQ ID N°: 6) e HA (Ind)-Sac.r (SEQ ID N°: 32) com codificação do fragmento H5 como modelo. A amplificação obtida a partir de ambas as reações foi misturada em conjunto e a mistura serviu como modelo para uma terceira reação (reação de montagem) utilizando Plato-443c (SEQ ID N°: 4) e HA (Ind)-Sac.r (SEQ ID N°: 33) como iniciadores. O fragmento resultante foi digerido com BamHI (na região promotora de plastocianina) e Saci (na extremidade 3' do fragmento) e clonado em pCAMBIAPlasto previamente digerido com as mesmas enzimas. O plasmídeo resultante, denominado 660, é apresentado na Figura 5, enquanto o plasmídeo resultante da proteína H5 "mutada" foi nomeado 680.

Uma construção HCPro (35HcPro) foi preparada como descrito em Hamilton et al. (2002) . Todos os clones foram sequenciados para confirmar a integridade das construções. Os plasmídeos foram usados para transformar Agrobacterium tumefaciens AGLl (ATCC, Manassas, VA 20108, USA) por eletroporação (Mattanovich et ai,. 1989) . A integridade de todas as estirpes de Agrobacterium A. foi confirmada por mapeamento de restrição. 4. Preparação de biomassa vegetal, inoculo, agroinfiltração, e colheita

As plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em apartamentos cheios com um substrato de turfa comercial. As plantas foram deixadas crescer na estufa sob um fotoperíodo de 16/8 e um regime de temperatura de 25°C dia/noite de 20°C. Três semanas após a semeadura, as plântulas individuais foram escolhidas, transplantadas em vasos e deixadas crescer na estufa durante três semanas adicionais sob as mesmas condições ambientais. Antes da transformação, apical e brotos axilares foram removidos em vários momentos, como indicado abaixo, quer comprimindo os botões da planta, ou por tratamento químico da planta

Agrobacteria transfectadas com plasmídeos 660 ou 680 foram cultivadas em meio de YEB suplementado com 2-[N-morfolino] etanossulfónico 10 mM ácido (MES), acetossiringona 20 μΜ, 50 yg/ml de canamicina e 25 yg/ml de carbenicilina, pH 5,6, até alcançarem um OD600 entre 0,6 e 1,6. As suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes da utilização e ressuspensas em meio de infiltração (MgCl 2 10 mM e MES 10 mM pH 5,6). A infiltração por seringa foi realizada como descrito por Liu e Lomonossoff (2002, Journal of virológicos Methods, 105: 343-348). Para infiltração em vácuo, suspensões de A. tumefaciens foram centrifugadas, ressuspensas em meio de infiltração e armazenadas durante a noite a 4°C. No dia da infiltração, lotes de cultura foram diluídas em 2,5 volumes de cultura e deixados aquecer antes da utilização. As plantas inteiras de Nicotiana benthamiana foram colocados de cabeça para baixo na suspensão bacteriana num tanque de aço inoxidável impermeável ao ar sob um vácuo de 20-40 Torr durante 2 min. Seguindo infiltração por seringa ou por vácuo, as plantas foram retornadas para a estufa por um período de incubação de 4-5 dias até à colheita. 5. Amostragem de folha e extração de proteína total

Após a incubação, a parte aérea das plantas foi colhida, congelada a -80°C, esmagada em pedaços. As proteínas solúveis totais foram extraídas por homogeneização (Polytron) a cada amostra de material vegetal congelado esmagado em 3 volumes de tampão Tris 50 mM frio, pH 7,4, NaCl 0,15 M, e fluoreto de fenilmetano-sulfonilo 1 mM. Após homogeneização, as suspensões foram centrifugadas a 20000 g durante 20 min a 4°C e estes extratos brutos clarificados (sobrenadante) reservados para análises. O conteúdo de proteína total de extratos brutos clarificados foi determinado pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando albumina de soro de bovino como o padrão de referência. 6. Análise de proteína e imunotransferência

As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio de proteína BCA (Pierce Biochemicals, Rockport IL) . As proteínas foram separadas por SDS-PAGE sob condições redutoras e coradas com Azul de Coomassie. Os géis manchados foram digitalizados e realizada análise de densitometria utilizando ImageJ Software (NIH).

As proteínas a partir da fração de eluição a partir de SEC foram precipitados com acetona (Bollag et al., 1996), ressuspensas em 1/5 do volume de tampão de equilíbrio/eluição e separadas por SDS-PAGE sob condições redutoras e electrotransferidas para membranas de difluoreto de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para imunodeteção. Antes de imunotransferência, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado e 0,1% de Tween-20 em solução salina tamponada com Tris (TBS-T) durante 16-18h a 4°C. A imunotransferência foi realizada por incubação com os anticorpos seguintes: para a detecção de Hl, anticorpo monoclonal de ratinho anti-gripe A (Fitzgerald Industries International, Concord, MA, EUA, Cat No. 10-150.) (2 pg/ml em 2% de leite desnatado em TBS-Tween 20 a 0,1%), e para a deteção de H5, um anticorpo de coelho anti-H5 (Vietname) (Immune Technology, Woodside, NY, EUA, Cat N° IT-003-005V) diluída a 1/4000 em 2% de leite desnatado em TBS-Tween 20 a 0,1%. Um anticorpo de cabra conjugado com peroxidase de IgG anti-ratinho (H + L) (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, EUA, Cat. No. 115-035-146) (diluído 1/12 000 em leite desnatado a 2% em TBS Tween 20 a 0,1%) foi utilizado como anticorpo secundário. Os complexos imunorreativos foram detetados por quimiluminescência utilizando luminol como o substrato (Roche Diagnostics Corporation). A conjugação da enzima com peroxidase de rábano de anticorpo IgG humano foi realizada utilizando o kit de conjugação ativada de peroxidase EZ-Link Plus© (Pierce, Rockford, IL). O ensaio de hemaglutinação para H5 baseou-se num método descrito por Nayak. e Reichl (2004). Resumidamente, diluições em série duplas das amostras de teste (100 pL) foram realizadas em placas de microtitulação de 96 cavidades com o fundo em V contendo 100 μΐ de PBS, deixando 100 pL de amostra diluída por poço. Cem microlitros de 0,25% de suspensão de glóbulos vermelhos de cavalo (Bio ligação Inc., Syracuse, NY) foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas durante 2h à temperatura ambiente. O recíproco da diluição mais elevada que mostra a hemaglutinação completa foi registada como atividade de HA. Em paralelo, um padrão de HA recombinante (A/Vietnam/ 1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) foi diluído em PBS e usada como um controlo em cada placa. 7. Purificação de VLP de H5

Folhas de N. benthamiana congeladas 660- ou 680- infiltradas foram homogeneizados em 1,5 volumes de Tris 50 mM, pH 8, NaCl 50 mM e 0,04% de meta-bissulfito de sódio usando um misturador comercial. O extrato resultante foi suplementado com PMSF 1 mM e ajustado para pH 6 com ácido acético 1 M, antes de ser aquecido a 42 °C durante 5 min. A terra de diatomáceas (DE) foi adicionada ao extrato tratado termicamente para adsorver os contaminantes precipitados pela mudança do pH e tratamento térmico, e a suspensão foi filtrada através de um filtro de papel Whatman. O extrato clarificado resultante foi centrifugado a 10.000 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente para remover o residual DE, passada através de 20 filtros 0,8/0,2 Acropack e carregada numa coluna de afinidade de fetuína-agarose (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, EUA) . Após um passo de lavagem em NaCl 400 mM, Tris 25 mM, pH 6, as proteínas ligadas foram eluídas com NaCl 1,5 M, MES 50 mM, pH 6. A VLP eluída foi suplementada com Tween-80 a uma concentração final de 0,0005% (v/v) . As VLP foram concentradas sobre uma membrana de 100 kDa MWCO Amicon, centrifugou-se a 10000 xg durante 30 minutos a 4°C e ressuspensas em PBS a pH 7,4 com 0,01% de Tween-80 e 0,01% de timerosal. As VLP suspensas foram esterilizadas através dum filtro antes da utilização. 8. Estudos em animais

Os estudos sobre a resposta imunológica à administração de VLP de gripe foram realizados em ratas Wistar com 6-8 semanas de idade (Charles River Laboratories). Treze ratazanas foram divididas aleatoriamente em três grupos que vão desde três para o grupo de controlo a cinco animais, tanto para os grupos de vacina da vacina feita de plantas de tipo selvagem VLP H5 (660) e o mutante (680) . Oito grupos foram usados para a imunização intramuscular e seis grupos foram utilizados para testar a via de administração intranasal. Todos os grupos foram imunizados num regime de duas doses, a imunização de reforço foi feita 14 dias após a primeira imunização.

Para administração intramuscular nas patas traseiras, ratos não anestesiados foram imunizados com a vacina feita de plantas H5 de VLP (15 yg), a vacina da forma mutante de VLP H5 feita de plantas ou PBS.

Todas as preparações de antigénio foram misturados com Alhydrogel a uma concentração final de 1% (alúmen; Accurate Chemical Scientific Corporation e, Wesbury, Nova Iorque, EUA) numa mistura 1:1 em volume antes da imunização.

Recolha de sangue e recolha do baço A recolha de sangue da veia jugular foi realizada catorze dias após a primeira imunização e catorze dias após a segunda imunização em animais anestesiados. 0 soro foi recolhido por centrifugação a 8000 g durante 10 min.

Três semanas após a segunda imunização, os ratos foram anestesiados com C02 e imediatamente após a rescisão, a punção cardíaca foi utilizado para recolher sangue. A recolha do baço foi realizada e os baços recolhidos foram colocados em meio RPMI suplementado com gentamicina e triturados num tubo de 50 ml com um êmbolo de uma seringa de 10 ml. Os baços triturados foram lavados 2 vezes e centrifugou-se a 2000 rpm durante 5 minutos e ressuspensos em tampão de lise ACK durante 5 min à temperatura ambiente. Os esplenócitos foram lavados em PBS-gentamicina, ressuspenderam-se em 5% de RPMI e contados. Os esplenócitos foram usados para o ensaio de proliferação. Títulos de anticoiqpos: A/ Vietnam/1203/2004 (HSN1); A/Anhui/1/05 (HSN1) ; A/Turquia/Turquia/1/05 (H5N1) ; A/New Caledonia/20/99 (H1N2)

Os títulos de anticorpos anti-gripe de soro foram medidos no dia 14 após a primeira imunização, bem como 21 dias após a segunda imunização (na altura do sacrifício). Os títulos foram determinados por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), utilizando o vírus inativado A/lndonésia/5/05 como o antigénio de revestimento. 0 ponto final (títulos foram expressos como o valor recíproco da diluição mais elevada que atingiu um valor de DO de pelo menos 0,1 mais elevado do que a de amostras de controlo negativo.

Para a determinação de classe de anticorpo (IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM), os títulos foram avaliadas em sangramento final, por meio de ELISA tal como anteriormente descrito. Títulos de inibição da hemaglutinação (Hl)

Os títulos de inibição da hemaglutinação (Hl) dos soros foram medidos nos dias 14 e 35 após a segunda imunização, como anteriormente descrito (OMS, 2002; Kendal 1982). As preparações de vírus inativados das estirpes A/Indonésia/ 5/05; A/Anhui/1/05 (H5N1); A/Turquia/Turquia/1/05 (H5N1) ou A/Vietnam/1203/2004, foram usadas para testar amostras de soro de rato para a atividade Hl. Os soros foram pré-tratados com a enzima destruidora de recetor de II (RDE II) (Denka Seiken Co., Tóquio, Japão) preparado a partir de Vibrio cholerae (Kendal 1982). Os ensaios de Hl foram realizados com células vermelhas do sangue de cavalo a 0,5%. Os títulos em anticorpos Hl foram definidos como o recíproco da diluição mais elevada, causando a inibição completa da aglutinação.

Resultados A reatividade do soro de ratos imunizados com VLP ou VLP mutante foi avaliada 14 dias após a primeira (dia 14) ou a

segunda imunização (dia 35). Todos os ratos foram imunizados com 15 yg do antigénio formulada com alúmen. A imunorreatividade foi avaliada contra o virus H5N1 do ciado 1 (A/Vietnam/1203/04), ciado 2.1 (A/lndonésia/5/05), ciado 2.2 (A/Turquia/Turquia/1/05) e ciado 2.3 (A/Anhui/ 1/05). Após a primeira dose, a VLP mutante induziu uma reação de anticorpos mais elevados do que o peso de todas as estirpes H5N1 testadas (Figura 6) . A imunorreatividade contra a estirpe aviária A/Turquia/Turquia/1/05 foi estatisticamente significativa (p <0,05) após a primeira dose. A imunorreatividade foi também avaliada contra o virus HlNl (A/New Caledonia/20/99) mostrando imunorreatividade após a injeção de reforço. GMT: titulo médio geométrico. Os valores são GMT (In) dos títulos de ponto final recíproco de cinco ratos por grupo. As barras representam desvio médio. * P <0,05 em comparação com o peso de VLP

Os títulos Hl de ratos imunizados com o wt ou a VLP mutante foram avaliados 14 dias após o primeiro (dia 14) ou o segundo (dia 35) dia de imunização. As respostas de anticorpos Hl foram medidas usando vírus H5N1 inteiros inativados. Após a primeira imunização, a VLP mutante induz uma resposta de anticorpos mais elevada do que a VLP Hl em peso contra todos os vírus H5N1 testadas (Figura 7). A significância estatística foi atingida por estirpes de gripe A/Indonésia/ 5/05 e A/Turquia/Turquia/1/05. GMT: título médio geométrico. Os valores são GMT (In) dos títulos de ponto final recíproco de cinco ratos por grupo. As barras representam desvio médio. * P <0,05 em comparação com wt de VLP.

Estes dados sugerem fortemente que o "mutante" da proteína não glicosilada H5 representa uma alternativa muito interessante para a proteína H5 nativa para a produção de VLP de largo espectro e a vacina da gripe ativa e rápida.

Todas as citações são aqui incorporadas por referência. A presente invenção tem sido descrita no que diz respeito a uma ou mais formas de realização particulares. No entanto, será evidente para os peritos na técnica que um número de variações e modificações podem ser feitas sem se afastarem do âmbito da invenção, tal como definido nas reivindicações.

Referências

Abe Y. et ai. Journal of virology. (2004) 78 : 9605-9611.

Bollag, D.M., Rozycki, M.D., and Edelstein, S.J. (1996) Protein methods (2nd edition). Wiley-Liss, New York, USA.

Bligh, E.G., &amp; Dyer, W.J. Can. J. Med. Sci. 37, 911-917 (1959) .

Bright et al. Virology. (2003) 308: 270-278.

Chen, B.J., Leser, G.P., Morita, E., and Lamb R.A. (2007) Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles. J. Virol. 81, 7111- 7123 .

Crawford, J., Wilkinson, B., Vosnesensky, A., Smith, G., Garcia, M., Stone, H., and Perdue, M. L. (1999) . Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes. Vaccine 17,2265-2274.

Darveau, A., Pelletier, A. &amp; Perreault, J. PCR-mediated synthesis of chimeric molecules. Methods Neurose. 26, 77-85 (1995).

Grgacic EVL, Anderson DA. Virus-like particles: passport to immune recognition. Methods 2006; 40: 60-65.

Gillim-Ross, L., and Subbarao, K. (2006) Emerging respiratory viruses: challenges and vaccine strategies. Clin. Microbiol. Rev. 19, 614-636.

Gomez-Puertas, P., Mena, 1., Castillo, M., Vivo, A., Perez-Pastrana, E. and Portela, A. (1999) Efficient formation of influenza virus-like particles: dependence on the expression level of viral proteins. J. Gen. Virol. 80, 1635-1645.

Gomez-Puertas, P., Albo, C., Perez-Pastrana, E., Vivo, A., and Portela, A. (2000) Influenza Virus protein is the major driving force in virus budding. J Virol. 74, 11538-11547.

Hamilton, A., Voinnet, 0., Chappell, L. &amp; Baulcombe, D. Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. EMBO J. 21, 4671-4679 (2002) . Hõfgen, R. &amp; Willinitzer, L. Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic Acid Res. 16, 9877 (1988) .

Harbury PB, Zhang T, Kim PS, Alber T. (1993) A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science; 262: 1401-1407)

Horimoto T., Kawaoka Y. Strategies for developing vaccines against h5Nl influenza a viruses. Trends in Mol. Med. 2006; 12 (11) :506-514.

Huang Z, Elkin G, Maloney BJ, Beuhner N, Arntzen CJ, Thanavala Y, Mason HS. Virus-like particle expression and assembly in plants: hepatitis B and Norwalk viruses. Vaccine. 2005 Mar 7;23 (15) :1851-8.

Johansson, B. E. (1999) . Immunization with influenza A virus hemagglutinin and neuraminidase produced in recombinant baculovirus results in a balanced and broadened immune response superior to conventional vaccine. Vaccine 17, 2073-2080 .

Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M. &amp; Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 122, 101-108 (1997).

Kuroda et al. (1990) Virology. 174 : 418-429.

Latham., T., and Galarza, J. M. (2001). Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. J. Virol. 75,6154- 6165.

Lefebvre, B. et al. Plant Physiol. 144, 402-418 (2007) .

Liu, L &amp; Lomonossoff, G.P. Agroinfection as a rapid method for propagating Cowpea mosaic virus-based constructs. J. Virol. Methods 105, 343-348 (2002).

Macala, L.J., Yo, R.K. &amp; Ando, S. J Lipid Res. 24, 1243-1250 (1983)

Mattanovich, D., Ruker, F., da Câmara Machado, A., Laimer, M., Regner, F., Steinkellner, H., Himmler, G., and Katinger, H. (1989) Efficient transformation of Agrobacterium spp. By electroporation. Nucl. Ac. Res. 17, 6747.

Mena, I,, Vivo, A., Perez, E., and Portela, A. (1996) Rescue of synthetic chloramphenicol acetyltransferase RNA into influenza virus-like particles obtained from recombinant plasmids. J. Virol. 70, 5016-5024.

Mongrand S, Morel J, Laroche J, Claverol S, Carde JP, Hartmann MA et al., Lipid rafts in higher plant cells. The Journal of Biological Chemistry 2004; 279(35): 36277-36286.

Neumann, G., Watanabe, T., and Kawaoka, Y. (2000) Plasmid-driven formation of virus-like particles. J. Virol. 74, 547-551.

Nayak DP, Reichl U. (2004) Neuraminidase activity assays for monitoring MDCK cell culture derived influenza virus. J Virol Methods 122(1):9-15.

Olsen, C. W., McGregor, M. W. , Dybdahl-Sissoko, N. , Schram, B. R., Nelson, K. M., Lunn, D., Macklin, M. D. , and Swain, W. F. (1997). Immunogenicity and efficacy of baculovirus-expressed and DNA-based equine influenza virus hemagglutinin vaccines in mice. Vaccine 15, 1149-1156.

Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM. Virus-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous strains of influenza virus. Journal of Virology 2007; 81(7): 3514-3524.

Saint-Jore-Dupas C, Faye L, Gomord V. (2007) From plants to pharma with glycosylation in the toolbox. Trends in biotech, 25(7) 317-323.

Sambrook J, and Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Suzuki, Y. (2005) Sialobiology of influenza. Molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. Biol. Pharm. Bull 28, 399-408.

Tsuji M., Cell. Mol. Life Sci., 63 (2006); 1889-1898.

Vigerust DJ et al. Journal of virology. (2007) 81: 8593-8600 .

Wakefield L., G.G. Brownlee Nuc Acid Res. 17 (1989); 8569- 8580 .

Kendal, AP, Pereira MS, Skehel J. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta:CDC; 1982. p.B17-B35. WHO. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. Department of communicable disease surveillance and response. World Health Organisation Global Influenza Program. 2002.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> MEDICAGO INC.

Couture, Manon Vezina, Louis-Phllippe Landry, Nathalie

<120> NEW INFLUENZA VIRUS IMMUNIZING EPITOPE

<130> 05014149-21 PCI <150> US 61/081,811 <151> 2008-07-18 <160> 36 <170> Patentln version 3.5

<210> 1 <211> 1556 <212> DNA <213> Influenza A virus, subtype H1 <400> 1 iàg&amp;fcçttggd tgacacaata tgtatagget actóafefcéáa caactcaacc gacactgttg 60 acacagtact tgagaagaat gtgacagtga eaeactctgt caacctact.í gaggaeagtc 120 açaacggasa actatgfccta ctaaaaggaa tagccecact ac&amp;attgggt aattgeagcg 180 fetgccggtâfcg gatcfctagga ãacccagaafc gcgaafctact gatttcca&amp;g gaatcratggfc 240

cctacattgt o.gaaacaet.a aatoctgaga atggaaeatg ttacccaggg tat.t.Kcgccg 3ÓO actatgagga actcagggag caattgagtt cagtatcetc atctgagaga ttcgaaatat 360 tccccaaaga aagctcatgg cccaaccaca ccgtaaocgg agtatcagca scatgcf.ccá 4?0 ataatgggaa aagcagtttt fcacagaaatc. cgctatggst. gaeggggaag aatggtttge 4:80 acccaaacct gagcaagtec tatgtaaaca acaaagagaa. agaagtcctt: gtactatggg 540

gtgtçcatca cccgcçtaac atagggaace aaagggeact cfcateataca gaaaakgctt 60S àfcgtfcfeèfcgt agtgfceÊtçá: cattafeagea gaagattcac cccagaaata gccaaaagac 660 ceaaagtaag agatcaggaa ggaagaatca actactactg gactctgetg gaacetgggg 720 atacaataat atttgaggca aatggaaatc tsatagcgcc atggtat.gct tttgcacC.ga 7S0 gtagaggctt tggatcagga atcatcacct caaatgcacc aatggatgaa tgtgatgcga 840 agtgtcaaaç àcc;tcag:ggà gctacaaaca geagtcttcc tttccagaat gtacacccag 900 tcacaatagg agagtgteca aagtatgtca ggagtgeaaa atfcaaggafcg gttacaggae 8S0 taaggaacat cccatccatt caatccagag gttcgtttgg agccatfcgcc ggtttcattg 1020 aaggggggtg gactggaatg gtagafegggt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag 1080 gatctggcta tgctgcagat caaaaaag:Ça; cacaaaatge cactaacggg attacaaaca 114 0 aggtcaattc tgtaattgag aaaatgaaea ctcaattcae agctgtgggc aaagagttca 1200 acaaattgga aagaaggatg gaaaacttaa afcaaaaaagt tgatgatggg tttctagaca 1260 'ttífeggàGátá taatgcagaa ttgttggctc tactggaaaa tgaaaggact ttggattvcc 1320 atgaefcçcaa tgtgaagaat etg-cafcgaga aagtaaaaag cca.attaaag aataatgcca 1380 aagaaafc&amp;gg âàacgggtgt cttgagttcÇ âtGaâ;áá§Çg taacaatgaa tgCiatggaga 1440 gtgtgaaaaa tggtaççtat gaçtatçqas .aataèteega. agaatcaaag tKaaagaggg 1500 agaaaattgs Oggàgtgaaa ttggaatcaa tgggagtata ctaagagctc aggccfc 1556

<21θ>:2 c211> 1773 <212> D NA <213> lnflueRíaA;vif^'S8b!É^.'!H2 «100> 2 agcaaaagca ggggctatac eatagacaac caaaggcaag acaatggcca tcatttatct SO aattcttctg ttcacagcag tgagagggga eeàãàtaÊgtí attggatacc attccaacaa 120 ttctacagaa aaggttgaca caatcetaga gagaaatgtc actgtgactc acgetgagga ISO catfccttgag aagâctcaea atigggaagtt afcgcaaaefca aatggaafcec cftceactfcga 240 attaagggat tgcagcattg ccggatggct ccttgggaat ccagaatgfcg atatacttct 300 aactgtgcca gaatggtcat acataataga aaaagaaaat ccaaggaacg gcttgtgeta 360 cecaggcagt ttcaatgatt atgaagaatt gaagcatctt atcagcagcg fcgacacattt 420 tgagaaagta aag&amp;ttctgc ccagaaatga atggacacag catacaacaa ctggaggttc 480 ^aeaggcfcligii gcagaetafcg :g'Ègcf&amp;écg£c attcttccgg aacacggtet ggttgacaaa 540 gaaagggtcg aattatccaa ttgceaaaag atettacaac aatacaagtg gggaacaaafc 600 gctgatcatt tgggggatac atcaceçcaa tgatgaaagt gaacaaagag cattgtatca 660 gaatgtgggg acctatgtgt cagtacgaac atcaaeaetg aacaaaagat catcceeaga 220 aatagcaaca agacctaaag tgaatggaca aggaggcaga atggaattct cgtggactat 700 cttagatata tgggacacaa taaattttga gagtactggc aatctaattg caccag&amp;ata 840 tggtfctcaaa atafcccaaac gaggfcagtóç agggafcoatg aaaasagaag gasaacttga 900 aaactgcgag accaagtgcc aaactccttt gggagcaata aatacaacat taccctttca 960 caatatccac ccactgacea ttggtgagtg eccsraaseat gtaaaatcgg aaag&amp;ttagt 1020 cttagcaaca ggactaaga.a acgtccctca gsttgagtca aggggattgt ttggggcaat 1080 agctggtfctt atagagggtg gatggcaagg aatggttgat ggtfcggcatg ggtatcatea 1140 cagcaatgac cagggatctg ggtatgeagc agacaaagaâ tccactcaaa aggcaattga 1200 tggaateaee aaeaaggtaa attctgtgat cgaaaagatg aaeacccaat tcggagctgt 1260 cggaaaagaa ttcagtaact tggagagaag actggagaac ttgaataaaa agafcggágga 1320 cggatttcta gatgtgtgga catacaatgc cgagctccta gtcctaacgg áaaatgagag 1380 gacãOtfcgac tttcatgaftft etaatsgtcaa gaacctatat gataaagtca gaatgcraact 1440 gagagacaat gcaaaagaae tsagggaafegg atgctttgaa ttctatcaca aatgtgatga 1S60 tgaatgcatg aacagtgtga agaatgggac atatgattat tccaagtatg aagaggagtc 1860 taaactaaac aggactgaaa tcaaaggggt taaattgagc aatatggggg tfctatcaaafe 1620 cctfcgccatc tatget&amp;eag tagcaggfctc ecfcgrfccacfcg gcaatcatga tagctgggat 1660 ttctatatgg atgtgctcca àègggCctct gcaatgcaga atctgcatat gatcatcagc 1240 cattfctgtaa ttaaaaacac ccttgtttct act 1773 <2tO>3 <211> 1086

<212> DNA <213> influenza A viras, subiyps H3 <4«>3 :-çãàfi#acttc ccggaaatga caacagcacg gcaacgctgt gccttggggá céàtgçagfcà 60 ceaaacggaa cgafcagtgaa aaeaatcacg aatgaccaaa ttgaagttae feaatgctact: 120 gagçtggtae âgagttcctc aacaggtgga atatgcgaca gtgefccafeca gafcccfcbgafe 130 ggagaaaact gcacactaat agatgctcta ttgggagaec ctcagtgtga teggOtfceçaá 240 aataagaa&amp;t gggacctttt tgttgaacgc agcaaagccfc acagcaactg tt&amp;cccttat 300 gatgtgccgg atcatgectc cettaggtca ctagfctgcet eatecggcac actggagttt 360 aacáàfegáaa gcttcgafctg gactggagtc actcagaatg gaaeaagccc tgcttgcaaa 420 aggagatcta ataaaagttt ctttagtaga ttgaattggt tgacccactt aaaateasaaa 480 táiGètsagcafe tgaaegfcgac tatgccaaac aatgaaaaat ttgaeaa&amp;tt gtacattfcgg S40 ggggttcacc acccgggtac ggacagtgac caaatcagcc tatatgctca agcatcagga 600 agaatcacag tctctaccaa aagaagccaa caaactgtaa tcccgaatat cggatcfcaga 660 .cceagggfeaa, ggg&amp;tgtete eageegaata ágoatefcatt ggacaatagt aaaaccggga ^20· gacatacttt tgatcaacag eacagggaat cfcaattgctc ctcggggtta cttcaaaata 380: egaagtggga aaagctcaat aatgagatca gatgcaceca ctggcaaatg caat.tccgaa 840 tgcatcactc caaatggaag cattcccaat gacaaaccat ttcaaaatgt aaacaggatc 300 acatatgggg cctgtcccag acatgttaag caaaacactc tgaaattggc aacagggatg 360 cgaaatgtac cagagaaaca aactagaggc at&amp;tttggcg Gaatcgcggg Cttcatagaa 1020 aatggctggg agggaatggt ggacggttgg tacggttcea ggcatcaaaa ctctgagggc 1080 acagga 1086 <210··· 4

«211M048 <212> DNA <213> InfluerizffA s/irusv SabliOe H4 <400>:4 ãifegçfcstóáà tcacgattct gcttctgctc atagcagagg ggfcÇcKcteá gaattacaca 60 gggaatcccg tg-atatgect gggacatcat gecgtatcca atgggacaat ggtgaaaacc 120 ctgactgstg accaagtaga agttgtçact gçccaagaat fcagtggaatc gcaacateta 180 ccggagttgt gt.eetagecc tttaagatta gtagafeggac aaacfcEgfcga çaccgEcaat 240 ggfcgcctegg ggagtceagg ctgtgatcaç ttgaatggtg cagaatggga tgtcttcata 300 gaaegSeeea eígetgbggá eacttgtfeat éeafctefcgátg tgceggatta ccagagcctá 300 cggagtatcc tagcaaaéáâ tgggaaatfcí: fágttcáttg ctg&amp;ggaatst ccaatggaac 420 acagtcaaac aaaatgggaa atccggagca tgcaaaagag caaatgtgaa tgaçtttfcte 480 aaçagattga actggctgac caaatctgat gggaatgcat acccacttca aaaeetgaea 540 aaggttaaca acggggacta tgcaagactt tacatatggg gagttcatca tccttcaact 800 gacaeagaac aaaccaactt gtataagaac aacectggga gageaactgt ttecaecaaa 880 accagtcaaa caagtgtggt accaaacatt ggcagtagac cafcgggtaag aggccaaagc 720 ggcaggatta gettctattg gacaattgtg gagccaggag acctcatagt cttcaacaçc 780 átagggaatt taattgctcc gagaggtcafc taeaagctta acagteaaaa gaagagcaca 840 attctgaata ctgcaattcc cataggatct tgtgttagta aatgtcacac agataggggt 800 tG8ãtç£e0a caaecaaacc etttcagaac atctcaagaa tatcaacegg ggaetgtccc 880 aagtatgtca aacagggatc cttgaaacta gctacaggaa tgaggaatac ccctgagaaa 1020 gcââGGágág gectgtttgg tgcaattg 1048 <210>6:

<2f1> 1767 4g1g> PNA <213> iiifteeríza A virus, subtype H5 : <4M>: 5 acggagaaaa tagfcgcttct tcetgeaata gtcagtçttg ttaaaagtga fccagattfcgc 60 attggttaec acgcaaacaa cccgacagag caggfctgaca caataatgga aaagaacgtt ISO aGfcgttacag afcgcccaaga cacactggaa aagacacaca acgggaaaco efcgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggafcggct: eçfccgg&amp;aaè 240 GCtatgtgtg acgaattcat caafcgtgceg gaatggtctt acatagtgga gaaggecagt 300 ècagêeâ&amp;bg aeOfeeegfetsa coeaggggáfc ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360 fctgagcagaa taaaecacfct tgagàaaáfet cagefecafceà ceaaaagtcc ttggtccaat 420 catgaagcct eaee&amp;ggggt gagcgcagca tgtccatacc atgggaagcc ctccttttte 480 agaaatgtgg feafcggcttat caaaaagaac -agtgcatacc çaacaataaa gaggagctac 540 aabsakseea accaagaaga tcttttggta ctgtggggga vtcaccatcc caatgatgcg 600 gàág&amp;gcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg aacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtccc aaaaatagct actag&amp;tcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 «gaatggagfe tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ccataaatct ògagSgtàát 780 ggaaafefctea ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaafcfc 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc a&amp;tgggggcg 900 iâMàácfcGta gtatgceatt ccacaacata caccctctea caatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaaeagatt agtçettgçg actgg&amp;ctca ga&amp;ataecce teaaagagat 1020 agaagaagfia aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 G^ggaeOgg feagafeggsfctg gfcafcgggtac caccatagca atgagcaggg gagfcggataç 1140 gctgcagaca aagaatceac tcaaaaggca atagatggag te&amp;ccaataa ggtcaactcg 1200 à^cáefcgàca aãafegaápae: tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa fcaacttagaa 1260 aggaggatag aaaatttaaa caagaagatg gaagaeggat tcctagafcgt ctggacttar. 1320 aatgctgaac ttctggttct cacggaaaac gagagaactc tagactctca tgattcaaat 1380 gtcaagaacc tttacaacsa ggtccgaota cagcfctaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aatggtfcgtt tcgagttcta tcacaaatgt gacaatgaat gtatggaaag tgtaaaaaaé ISOO ggg&amp;cgtatg actacccgca gt&amp;ttcagaa gaagcaagac taaacagaga ggaaataagt ÍS6Ò ggagtaaaat tggaatcaat gggaactfcac caâafcaetgt caatttatfcc aacagtggcg 1620 agttecctag cactggcaat catg-gtagct ggtctatctt tatggatgtg ctçc.aa.tggg 1680 fccgttacaat gcagaatttg catttaa 1707 c210> 6

«211 > 1050 <212> DNA «213» Influenza A virtis, subtype: H6 <400>® atgattgcaa tcattgtaat agcgatactg gcagcagccg gaaagtcaga caagatctgc 60

attgggtatc atgccaacaa ttcaaeaaca caggtggata cgatactfcga gaagaatgta ISO accgtcacac acteagtetga attgecggag aatcagaagg aagaaagatt ctgeaagatc 180 ttgaacaagg cccctctcga ectaaaggga tgcaccatag agggtfcggat cfciggggaat 240 ccccaatgcg atctgttgct tggtgaccaa agctggtcat atatagtgga Sajacetaet 300 gcccaaaatg ggatatgcta cccaggagct ttgaatgagg tagaagaact gaaagcattt 360 atcgg&amp;tcag gagaaagggt agagagattt gagatgtttc ccaaaagcac atgggcaggg 420 gtagacacca gcagtggggt aacaaaagct tgtecttata atagtggttc atctttctac 480 agaaaeefcec tatggataat aaagaccaag tcageagcgt atccagtaat taagggaact 540 taeagcaaea cfcggaaacca gccaatcetc tatttctggg gtgtgcacca tcctcctgac 600 accaatgagc aaaatactct gtatggctct ggcgatcggt. atgttaggat gggaactgag 660 agcatgaatt ttgccaagag cccagaaatt geggcaagac ccgctgtgaa tggccaaaga 220 ggtcgaattg attattaetg gtctgtttta aaaccaggag aaaccttgaa tgtggaatct 280 aatggaaatc taatcgctcc ttggtatgca tacaaatttg tcaacacaaa taataaggga 840 gccgtcttea agtcaaattt accaatcgag aattgcgatg ecacatgcca gactattgca 300 ggagtectaa ggaccaataa aacatttcag aatgfcgagcc ctctgtggat aggagaatge 960 cecaagtatg tgaaaagtga aagtctaagg cttgctactg gactaagaaa tgttccacag 1020 attgaaacca gagggctttfc cggagctatc 1050

«210» T <211> 1828 <212> DNA <213> Infiuenza À víms, subtype NΤ' <40©>:7 gácaàáatat gtcttgggca coatgctgtg gcaáatggáá caaaagtgaa cacattaaca €0 gsçtgaggggga ttgaagt&amp;gt g&amp;acgccaça gagacggtgg aaactgcgaa tatcaagaaa 120 atacgtattc aagggaaaag gecaacagat ctgggacaat gtggacttct aggaacceta 180 ataggaccte cceaafcgtga tcaatteetg gagtttta.ct etgatttgat aatfcgagcga 240 agagaaggaa ccgatgtgtg ctatcccggt aaattcacaa atgaagaatc a tgajgcàg 300 atfficfcfcegag ggtcaggagg aattgataag gagtcaatgg gtttcaccta tagtggaata 360 agaaccaátg gagcgacaag tgcctgcaaa agatcaggtt cttctttcta tgcagagatg 420 aagtggfetgç: tgtcgaatcc agaeaatgcg gcattcccte aaatgacaaa gtegtataga -400 aatcccagaa acaaaccagc tctgataatt tggggagttc atcactctgg atcggttagc §40 gagcagacca aactctatgg aagtggaaac aagttgataa cagtaggáàg ctcaaaatac 600 eageaatcafc fccaceeeaag tcggggagciá cggceacaag tgaatggãca atcagggaga 660 ategafcfcfcfic actggctact ccttgatcec aatgacacag tgagcttcac ttteaatggg 720 gcafctcatag cccctgacag ggcaagttte ttfcagaggag aatcactagg agtccagagt 760 gatgttcctc tggattctag ttgtggaggg gattgctttc acagtggggg tacgatagtc 640 agttccctgc cattccaaaa catcaaccct agaactgtgg ggagatgccc tcggtatgtc 900 aaacagacaa gcctcctfctfc ggctacagga atgagaaatg tcccagagaa tccaaagccc 960 agaggccttt ttggagcaafc tgctggattc atagagaatg gatgggággg tctcatcgat 1020 ggatggtatg gtttcag&amp;ca tcaaaatgca caaggggaag gaactgcagc tgactacaaa 1080 agcacccaat ctgcaataga tcagatcaca ggcaaattga atcgtctgat tgacaaaaes 1140 aatcagcagt ttgagctgat agacaatgag ctcaatgaga tagaacaaca aataggaaac |200 gtcattaatt ggacacgaga cgcaatgact gaggtatggt cgtataatgc tgagctgttg 1260 gtggcaatgg aaaateagea tac&amp;atagat ettgcggact cagáaatgaa caaactttat 1320 gagcgfcgtea gaaaacaact aagggagaat getgaagaag atggaacegg atgtttfcgag 1380 afcateecafca agtgtgatga tcagtgcacg gagagcataa ggaacaaeac ttatgaccat 1440 actcaataca gaacagagtc attgcagaat agaatacaga tagacccagt gaaattgagt 1500 agtggataca aagacataat çtfcatggttt agcttcgggg catcatgttt tcttcttcta 1560 gccgttgtea tgggattggt tttcatttgc ataaagaatg gaaacatgcg gtgeacçatt 1620 tgtatataa 1529

<21Q»:S <2t ·> 1698 «213> Influenza A virus, subtype Η8 «400 8 atggaaaaat tcatcgcaat agcaaccttg gcgagcacaa atgcatacga taggatatgc 60 attgggtacc aatcaaacaa ctccacagac acagtgaaca ctctcataga acagaatgta 120

ccagtcaccc aaacaafcgga gctcgtggaa acagagaaae atcccgctta ttgtaacact ISO gatttaggtg ccccattgga actgcgagac tgcaagattg aggcagtaat ctatgggaac 240 cccaagtgtg aeatecatct gaaggatcaa ggttggtcat acatagtgga gaggcccagc 300 gcaccagaag ggatgtgfcta ccctggatcC gtggaaaatc tagaagaact gaggtttgtc 360 ttctccagtg ctgcatctta caagagaata agactatttg actattccag gtggaatgtg 420 actagatctg gaacgagtaa agcafcgcaafc gcafccaacag gtggocaatc cttctatagg 480 agcatcaatt ggttgaccaa aaaggaacca gacacttatg acttcaatga aggagcttat 540 gttaataatg aagatggaga cateattttc ttatggggga tccatcatcc gccggacaca 600 aaagagcaga caacactata taaaaatgca aacactttga gtagtgtfcac tactaacact 660 ataaacagaa gctttcaacc aaatattggt cccagaccat tagtaagagg acagcaaggg 720 aggatggatt actattgggg cattctgaaa agaggggaga ctctgaagat caggaccaac 7Θ0 ggaaatttaa tcgcacctga atttggctat ctgctcaaag gtgaaagcta cggcagaata 840 atteaaaatg aggatatacc catcgggaac tgtaacacaa aatgfccaaac atatgcggga 900 gcaatcaata gcagoaaacc ctttcagaat gcaagtaggc attacatggg agaatgfcecc 960 aàataftgfega agaaggcaag cttgcgactt gcagttgggc ttaggaatac gecttctgtt 1020 gaacccagag gactgtttgg agccattgct ggtttcattg aaggaggatg gtctggaatg 1080 attgatgggc ggtatggatt tcatcacagc aafctcagagg gaacaggaat ggcagctgac 1140 cagaaatcaa cacaagaagc catcgataag atcaccaata aagtcaacaa cat.agttgac 1200 aagatgaaca gggagtttga agttgtgaat eatgagttct ctgaagttga aaaaagaata 1280 aacatgataa acgataaaat agatgaecaa attgaagatc tttgggctta caatgcagag 1320 ctccttgtgc tcttagagaa ccagaaaacg ctagacgaac atgattccaa tgtcaaaaac 1380 ctfcfcttgáfcg aagtgaaaag gagactgtca gccaatgcaa tagatgctgg gaacggttgc 1440 tctgacacac ttcacaaatg cgacaatgag tgtatggaaa ctataaagaa cggaacttac 1500 gafceafeaagg aatatgaaga ggaggetaaa ctagaaagga gcaagataaa tggagtaaaa 1500 ctagaagaga acaccactta caaaatfcctt agçatttaca gfcacagtggc ggccagtctt 1620 tgcttggcaa fccctgattgc tggaggttta atcctgggca tgcaaaatgg accttgtaga 1080 tgcatgttct gtatttga 1698 <21G=> 9 «211» 1363

«212* DMA «213» fnfiueniaÀ.^%sOhs^08'.Mi9·· «40O>9 atggaaacag tatcacfcaat gactatacta ctagtagcaa eagcaagcaa tgcagacaaa 60 afcçt-gOafeçg «ceaceagte aacaaactcc acagaaactg tggacacget aacagaaaec 120 aatgttcctg tgacacatgc caaagaattg ctcca.cacag agcacaatgg aatgctgtgt 180 geaacaaatc tgggacat.cc cctaatctta gacacgtgea ctattgaagg actgatctat 240 ggtaaccctt cttgtgaefct gctgttggga gga&amp;gagaat ggtcctacat cgtcgâaagg 300 tcatcagctg taaatggaac gtgttaccct gggaatgtag agaaccfcaga ggaactcagg 360 acacfctttfca gUccgctag ttcctaccgs agaatecaaa tcttcecaga cacaatcfcgg 420 aatgtgactt acactggaae aagcaaagca cgttcagatt cattctacag gagtatgaga 480 aa&amp;aáágegg gftettaicèéfe gtteaagacg ctcaatacac aaataatatg 540 ggaaagagca ttcttttcgfe gfcggggcata catcacecac ccaotgaagc tgcac&amp;g&amp;ca 600 aatttgtaca caagaaccga eacaaeaaea agcgtgacaa cagaagactt aaataggatc 660 ttcaaaccga tggtagggcc aaggcccctt gtcaatggtc tgcagggaag aattaatfcat 720 tattggtcgg taetaaaacc aggccagaca ctgegagtaa gatccaatgg gaatctaatt 780 gctccatggt atggacacat tctttcggga gggagccatg gaagaatcct gaagacfcgat 840 ttaaaaagta gtaattgcgt agtgcaatgt cagactgaaa aaggeggctt aaacagtaca 900 ttgccgttcc acaatatcag taaatatgca tttggaaact gtcccaaata tgttagagtt 960 aaaagtctca aactggcagt agggttgagg aacgtgcctg ctagatcaag tagaggacta 1020 ttcggagcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagtcgc tggttggtafc 1080 ggtttccagc attcaaatga tcaaggggtt ggtafctgcgg cagataggga ttcaactcaa 1140 aaggcaattg atagaataac aaccaaggtg aataatatag tcgacaaaat gaacaaacaa 1200 tatgaaataa ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta ggctcaacat gatoaataat 1260 aagatfcgatg accaaataca agacatatgg gcacataatg cagagttgct agtactactt 1320 gaaaaccaga aaacactcga tgagcafcgac gcaaatgtga aga 1363

<210> 10 <211» 1727 <212» DNA <213> influenza A virus, subtype H10 <400» 10 agcaaaagca ggggtcacaa tgtacaaagt agtagtaata attgcgctcc ttggagcagt 60 gaaaggtctt gacagaatct gcctaggaca ceatgcggtt gccaatggaa ccattgtgaa 120 gacccttaca aatgaacaag aggaagfcgac caafcgctact gagacggtag agageacaaa 180 tttgaataaa ttgtgtatga aaggaagaag ctacaaggac ttgggcaatt gtcacccggt 240 aggaatgttg ataggaacac ctgtttgtga tccgcacttg accgggacct gggacacfcct 300 cattgagcga gagaatgcca ttgcccactg ttatccaggg gcaaccataa atgaagaagc 360 attgaggcag aaaataatgg aaagtggagg aatcagcaag atgagcactg gcttcactta 420 tgggtcttcc atcacctcag ctgggaccac taaggcatgc afcgagaaatg gaggagatag 480 tttctatgca gagcfceaaat ggctagfcgtc aaagacaaag ggacaaaatt tccctcagac 540 aacaaacacc tatcggaata cggacacagc agaacatctc ataatatggg gaattcatca 600 cccttccagc acacaggaaa agaabgactt atacggaact cagtcactat ctatatcagt 660 tgagagttct acatatcaga acaactttgt tccagttgtt ggggcaagac ctcaggtcaa 720 fcggacaaagt gggcgaattg áctfcfceactg gacaetagta cagccggcjtg acaacataac 780

ettçfccagac aatgg&amp;ggtc taatagcacc aagfeegagtt agcaaattaa cfcggaaggga 84S

tttgggaatc caatcagaag cgtcgatagá caacagttgt gaatccaaat gcttttggag SOO agggggctct ataaatacaa agcccccttt tcaaaafcctg tcacccagaa cagtaggtca 950 atgccceaaa tacgtaâàfec aga.ggagttt acfegcttgca acagggatga ggaatgrtgcc 1020 agaagtggtg cagggaaggg gtctgtttgg tgcaatagea gggttoatag aáaaçggatg 1030

ggaaggaatg gtagacggct ggtatggttt cagacaccaa aacgcccagg gcacaggcca IMO agctgctgat tae&amp;agagfca ctcaagcagc tacfcgaccaa atcacagggá aactgaacag 1200 gttgattgag aagaccaaca ctgagtttga gtcaatagaa tctgaattca gtgagactga 1260 gcatcaaar.t ggtaacgtea tcaattggac eaaagattca ataaccgaca ttcggactta 1320 èaláegçagag ctattagtgg caatggagaa tcagcacaca attgacatgg ctgattcaga 1380 gatgctaaat etgtatgaaa gggtaagaaa gcaaefccaga cagaacgcag aagaagacgg 1440 aaagggatgt tttgagsífcafc atcafcactfcg fcgatgatteg tgcatggaga gtataaggaa IS00 eaatactfcat gaccattcae aatacagaga ggaggctctt ctgaatagac tgaaéafegáa 1560 .qccágfcgaa* atfctafctcgg ggtsçâaaga.oaCçatáese tggttcagct tcggggaatc 1620 àftgetfcegtt; cttctagccg ttgtfc&amp;tggg tcttgttttc ttetgcctga aaaatggaaa 16S0 catgcgatgc acaatcugta tttagttaaa aacaccttgt ttctact 1727 <21 e> ii <211> 1698

<212> D NA <213> infíuanzâ A vírus, sabtype H íl «4QG> « atggagaaaa cactgctatt tgcagctatt ttcctttgtg tgaaagcaga tgagatctgt 60 atcgggtatt taagcaacaa ctcgacagac aaagttgaca caataattga gaacaatgtc 120 acggtcacta gctcagtgga actggttgag acagaac&amp;ea ctggatcatc ctgttcaatc 180 aatggaaaac aaccaataag ccttggagat tgotcatttg ctggatggat attaggaaac 240 CGtacgtgtg atgaact&amp;at tggaaagact tcafcggtctt acattgtgga aaaacccaat 300

ecaaeaãâtf gaatctgtta cecaggaact ttagagagtg aagaagaaet aagactgaaa ISO ttcagtggag tt.fctagaa.tt ta-âcaaattc gaagtattca catcaaatgg atggggtgct 420 gtaaattcag gagtaggagt aaccgctgca tgcaaattcg ggggttctaa ttctttcttt 4S0 cgaaacatgg tatggctgat acaceaatca ggaacatatc ctgtaataaa gagaaccttt 540 aacaacacca aagggagaga tgtactgatt gtttggggaa ttcateatcc tgctacactg 600 acagaacatc aagatetgta taaaaaggae agcteetatg tagcagtggg ttcagagacc 660 tacaacagaa gattcactcc agaaatcaac actaggccca gagtcaatgg acaggccgga 720 cggatgacat tctacfcggaa gatagtcaaa ccaggagaat caataacatt cgaatctaat 780 ggggcgttcc tagctcctag atatgctttt gagattgtct ctgttggaaa tgggaaactg 840 ttcaggagcg aactgaacat tgaatcatgc tctaccaaat gtcaaacaga aataggagga 900 attaatacga acaaaagctt ceacaatgtt eacagaaaca ctatcgggga ttgccccaag 960 tatgtgaatg tcaaatcctt aaagcttgca acaggaccta gaaatgtccc agcaatagca 1020 tcgagaggct tgtfctggagc aatagctgga ttcatagaag ggggatggcc tggactgatc 1080 aatggatggt atgggttcca acacagggac gaagaaggaa caggcattgc agcagacaag 1140 gagtcaactc aaaaggcaat agaccagata acatccaagg taaataacat cgttgacagg 1200 atgaatacaa actttgagtc tgtgcaacac gaattcagtg aaatagagga aagaataaat 1260 caattatcaa aacacgfcaga tgattctgtg gttgacatct ggtcatataa tgcacagctt 1320 ctcgttttac ttgaaaatga gaagacactg gaccfcccatg actcaaatgt caggaacctc 1380 eatgagaaag tcagaagaat gctaaaggac aatgccaaag atgaggggaa cggatgcttc 1440 accttttace ataagtgtga caataaatgc attgaacgag ttagaaacgg aacatatgat 1500 cataaagaat Ccgaggagga atcaaaaatc aatcgccagg agattgaagg ggtgaaacta 1560 gattctagtg ggaatgtgta taaaatactg tcaattCaca getgcattgc aagcagtctt 1620 gtattggcag cactcatcat ggggttcatg ttttgggcafc gcagtaatgg atcatgtaga 1680 tgtaccattt gcatttag 1698

<21Q> 12 <211>1895 <212> DNA <213> Influenza A virus, subtype H12 <400> 12 atggaaaaat tcatcatttt gagtactgtc ttggcagcaa gctttgcata tgacaaaatt 60 tgcattggat accaaacaaa caactcgact gaaacggtaa acacactaag tgaacaaaac 120 gttccggtga cgcaggtgga agaacttgta catcgfcggga tcgatccgat cctgtgtgga 180 acggaactag gatcaccact agtgcttgat gactgttcat tagagggtct aatcctaggc 240 aatcccaaat gtgatcttta tttgaatggcr agggaatggt catac&amp;tagfc agagaggccc 300 aaagagatgg aaggagtttg ctatccaggg tcaattgaaa accaggaaga gctaagatct 360 ctgttttctt ecatc&amp;aaaa atatgaaaga gtgaagafcgt fctgatttcac eaaafcggaat 420 gteacataca ctgggaccag caaggcctgc aataatacat caaaccaagg ctcattctat 480; aggagcatga gatggttgac ettaaaatca ggacaatttc eagtceaaae agatgagtac Si©' aagaacacca gagattcagá cattgtafctc acctgggcca ttcaccaccc accaacatct 600 gatgaacaag taaaattata caaaaatccfc gataetcfcct cttcagfccac caccgtagaa 660 atcaatagga gcttcaagcc ta&amp;tataggg ccaagaccac tcgtgagagg acaacaaggg ?20 agaatggatt actactgggc tgttcttaaa cctggacaaa cagteaaaat acaaaccaat 780 ggt&amp;atctta ttgcacctga atatggtcac ttaatcacag ggaaatcaca tggcaggata 840 cMaaga&amp;fca atttgcccat gggacagtgt gtgactgaat gtcaattgaa cgagggtgta SO©; «tgàgéáçaá geaaacctfct ccagaacact agtaagcact atattgggaa atgecccaaa ©f© tacataccat eagggagttt aaaattggea atagggctca ggaatgtccc acaagttcaa 1020 gafccgggggc tctttggage aactgcaggt ttcatagaag gcggatggcc agggctagtg 1080

gctggttggfc acggattfcca gcatcaaaat gçggagggga eaggcatagc tgcagacaga Í14Q gacagcacec aaagggcaat agacaaftatg caaaacaaac tcaacaatgt catcgaeaaa J.2O0 atgaataaac aatttgaagt ggtgaatcat gagttttcag aagtggaaag cagaataaac 1260 atgattaatt ccaaaattga tgatcagata actgacatat gggcatacaa tgctgaattg 1320 ettgtcctat fcggaaaatda gaagacatta gatgagcatg acgcfcaatgt aaggaatcta 1380 catgatcggg tcagaagagfc cer.gagggaa aatgcaattg acacaggaga cggctgcttt 144:0 gagaetttac ataaatgtga caacaattgfc atggacacga ttagaaacgg gacatacaat ISO© cacaaagagt atgaggaaga aagcaaaatc gaacgacaga aagfccaatgg tgtgaaactt 1S60 gaggagaa©© ctacatataa aattetgage atctacagcá gtgtfcgcefcc aagçfctagtt 1620

ctactgctca fcgatfcattgg gggtttcafct ttcgggtgtc aaaatggaaa. tgttcgttgt 168G .acfct*etegtea tttaa 1695.

<210> 13 <211> 1701 <212» DMA <213> 1 nfiuanza A virus, subtype HI 3 <400» 13 afcggctcfcaa atgtcattgc aactfctgaca cttataagtg fcafcgtgtaca tgeagacaga 60 afcatgçgtgg ggtatctgag caccaatfcca tcagaaaggg tcgacaegct cettgaaaat 120 ggggtcccag tcaccagcte cattgatctg attgagacaa accacacagg aacatactgt: 180 tctctaaatg gagtcagtcc agtgcatttg ggagattgca gctttgaagg atggattgta 240 ggaaacceag cctgcaccag caactttggg atcagagagt ggtcatacct gatcgaggac 300 cccgcggccc ctcatgggct ttgctaccct ggag&amp;attaa aeaacaatgg fcgaactcaga 360 cacttgttca gtggaatcag gtcattcagt agaacggaat tgatcccacc taccfcectgg 420 ggggaagfcae tetgacggtae aaeatctget fcgeagagata aeaegggaac caacagcttc 480 tatcgaaatt tagtttggtt fcafcaaagaag aatactagat atccagtfcat cagtaagacc 540 tacaacaata eaacgggaag ggatgtetta gttttatggg g&amp;atacatea cccagtgtct 600 gtggatgaga caaagactct gtatgtcaat agtgatccat acacactggt ttecaccaag 660 tcttggagcg agaaacataa actagaaacg ggagtccgac ctggctataa tS5*eSga35 "720 agctggatga aaatctattg gtctttgata catccagggg agatgattae tfetcgagagt 780 aatggtggat tttfcagcccc aagat.at.ggg taçataattg aagaatatgg aaaaggaagg 840 atfctfeecraga gtcgcatcag aatgtctagg tgcaacacca agtgccagac ttcggttgga 500

gggataaaca caaacagaac gttccaaaae atcgataaga atgcfccttgg tgactgtccç 9SG aaatacataa agtctggcca actcaagcta gccactggac tcagaaatgt gccagctata 1020 tcgaatagag gattgtíÇègg sgteaatfegCâ gggttcatag aaggaggctg gcraggttta 1680 atcaatggtt ggtaeggttt tcagcatcaa aatgaacagg gaacaggaac agctgcagae 1140 aaagaafceaa.. caeagaaagc tatagaccag ataacaacca aaataaataa cattattgat 1200 aaaatgaatg geaactatga ttcaattagg ggtgaattca atcaagttga gaagcgtata 1260 aacatgcttg cagacagaat agatgatgcc gtgacggaca tttggtcata caatgccaaa 1320 cttcttgtat tgctggaaaa tgataaaact fctagatatgc atgatgctaa tgtaaagaat 1380 ttacatgage aagtaegaag agaattgaag gacaatgcaa ttgaegaagg aaatggctgt 1440 ttfjgaàgtgç ttcataaatg eaatgactpc tgcatxggaaa ctataagaaa tggaaegtat 1500 gaccacactg agtatgeaga ggagtcaaag fctaaagaggc aagaaatcga tgggatcaaa 1560 ctcaaatcag aagacaacgt ttacaaagca ttatcaatat acagttgcat tgcaagtagt 1620 getgtactag taggactcat actctctttc atcatgtggg cctgtagtag tgggaattgc 1680 cgattcaatg tttgtatata a 1701 <:2i0> 14 «2:1 f> 1749

<212> DNA <213> Influenza A virus, subtype H14 <400> 14 agcaaaagca ggggaaaatg attgcactca tattggttgc actggctctg agccacactg 60 cttattctca gatcacaaat gggacaacag gaaaccccat tatatgcttg gggcatcatg 120

cagtggaaaa cggcacatct gttaaaacac taacagacaa tcacgtagaa gttgtgtcag ISO ctaaagaatt agttgagacg aaccacactg atgaactgtg cccaagcccc ttgaagcttg 240 tcgacgggca agactgccac ctcatcaatg gtgcattggg gagtccaggc tgtgaccgfct 300 tgcaggacac cacttgggat gtcfcteattg aaaggcccac tgcagtagac acatgttatc 360 cattcgacgt cccagattac cagagtctca gaagcatcct agcaagcagt gggagtttgg 420 agttcatcgc cgaacaattc acctggaatg gtgtcaaagt tgacggatca agcagtgctt 480 gtttgagggg cggtcgcaac agcttcfctcfc cccgacfcaaa ctggctaacc aaagcaacaa 540 atggaaacfca tggacctatt aacgtcacta aagaaaatac gggctcttat gtcaggctct 600 atctctgggg agtgcatcac ceatcaagcg ataatgagca aacggatctc taeaaggfcgg 660 caacagggag agtaacagta tctacccgct cggaccaaafc cagtattgtt cccaafcatag 720 gaagtagacc gagggtaagg aatcagagcg gcaggataag catctactgg accctagtaa 780 acccagggga ctccatcatt ttcaacagta ttgggaattt gattgcacca agaggccact 840 acaaaat&amp;ag caaatctaet aagagcacag tgcttaaaag tgacaaaagg attgggtcat 900 gcacaagccc ttgcttaact gataaaggtt cgatecaaag tgacaaacct tttcagaatg 960 tatcaaggat tgctatagga aactgcccga aatatgtaaa gcaagggtcc ctgatgttag 1020 caactggaat gcgoaacatc cctggcaaac aggcaaaggg cttatttggg gcaattgctg 1080 gattcattga aaatggttgg caaggcctga ttgatgggtg gtatggattc aggcaccaaa 1140 atgetgaagg aacaggaact gctgcagacc tgaagtcaac tcaggcagcc attgatcaga 1200 taaatggcaa gctgaacaga ttgatagaga agacaaatga aaaatatcac caaatagaaa 1260 aggaattcga acaggtggaã ggaagaatac aagaccttga gaagtacgtt gaggacacta 1320 agattgattt gtggfccatac aafcgctgaat tgctagtagc actagagaat cagcaçacaa 138:0 tagatgtcac agactccgaa atgaacaagc tttttgaaag agtaagaagg caattaagag 1640 agaatgcaga agatcaaggc aacggttgtt tcgagatatt ecatcagtgt gaeaacaatt 1500 gtatagaaag cattagaaac ggaacttatg accaeaacat efcacagggat gaagccatca 1560 acaatcgaat caaaafcaaat ccfcgteactt tgacgatggg gtacaaggac ataatcctgt 1620 ggattife'ctfet, ctccatgtca tgcfettgtct tcgtggcact gattetggga tttgttctat 1666 gggcttgfcca aaacgggaat atccgatgcc aaatetgtat ataaagaaaa aacacccttg 1040 tttctactc 1749

<210=· 15 <211> 1762 <212> ONA <213> Influenza JVviPMs,.ÔO&amp;fype H15 <400> 15 agcaaaagca ggggataoaa aatgaacact caaatcatcg tcattctagt cctcggaetg 60 tegratggtga gatctgacaa gatttgtctc gggcaccatg ecgtagcaaa tgggacaaaa 126

gecsaeaeac taactgagaa aggagtggaa gtggtcaatg ecacggagac agtggagatt ISO acaggaataa ataaagtgtg caeaaaaggg aagaaagcgg tggacttggg atcttgtgga 240 ataetgggaa ctatcattgg gcctccacaa tgtgacfcctc atcttaaafct eaaagctgat 30Õ etgataatag aaagaagaaa tfccaagtgac atcfcgttaec cagggaaatt cactaatgag 366 gaagcacitga gacaaataat cagagaatct ggtggaattg acaaagagcc aatgergattt 420 agatafctcag gaataa&amp;a&amp;c agacggggca accagtgcgt gtaagagaac agtgtcctct 460 ttctactcag aaatgaaatg gcttttatcc agcaaggcta aecaggtgtt cec&amp;caactg S4Ó aatcagacat aeaggaaeaa cagaaaagaa ccagccetaa ttgtttgggg agtacatcat 600 tcaagttcct tggatgagca aaataagcta tatggagctg ggaacaagct gataaeagta 660 ggaagctcaa aacaccaaca atcgttttca ccaagtecag gggacaggcc caaagtgaat 320: ggtcaggccg ggagaatcga ctttcattgg atgctattgg acccagggga tacagtcaet 380

tttaccttca atggtgcatt catagcceca gatagagcca cctttctccg ctctaatgcc b4Q ccatcgggag ttgagtacaa tgggaagtoa ctgggaatac agagtgatgc acaaattgat 900 gaatcatgtg aaggggaatg cttctacagt ggagggacaa taaacagccc tttgccattt 960 caaaacatcg atagttgggc tgtcggaagg tgecccagat atgtaaagca atcaagcctg 1020 ccgctggcct taggaatgaa aaatgtacca gagaaaatac atactagggg actgttcggt io80 gcaattgcag gattcatcga gaatggatgg gaaggactea ttgatggatg gtatggattt 1140 aggcatcaaa atgcacaggg gcagggaaca gctgctgact acaagagtac tcaggctgca 1200 attgaccaga taacagggaa acttaataga ttaattgaaa aaaccaacac acagtttgaa 1260 ctcatagaea atgagttoac tgaagtggag cagcagatag gcaatgtaat aaactggaca 1320 agggactcct tgactgagat ctggtcatac aatgctgaac ttctagtagc aatggaaaat 1330 cagcatacaa ttgaccttgc agattctgaa atgaacaaae tctatgagag agtgagaaga 1440 cagctaaggg agaatgcega ggaggatgga actggatgtt ttgagatttt ccaccgatgt 1500 gacgatcaat gtatggagag catacgaaat aatacttaca atcacactga atatcgacag 1S60 gaagccttac agaataggat aatgatcaat ccggtaaagc ttagtggtgg gtacaaagat 1620 gtgatactat ggfcttagctfc cggggcatca tgtgtaatgc ttctagccat tgctatgggt 1680 cttattttca tgtgtgtgaa aaacgggaat ctgcggtgca ctatctgtat ataattattt 1740 gaaaaacacc ctfcgtttcta ct 1762

<210> 16 <211> 1760 <212> DNA <213> Influenza A virus, subtype H16 <400> 16 agcaaaagca ggggatattg tcaaaacaac agaatggbga tcaaagtgct ctactttctc 60 atcgtattgt taagtaggta ttcgaaagca gacaaaatat gcataggata tctaageaac 120 aacgccacag acacagtaga cacactgaca gagaaeggag ttccagtgac cagctcagtt 180 gatctcgttg aaacaaacca cacaggaaca tactgctcac tgaatggaat cagcccaatt 240 catettggtg actgcagctt tgagggatgg atcgtaggaa acccttcctg tgccaccaac 300 atcaacafcca gagagtggtc gtatctaatt gaggacccea atgcccccaa caaactctgc 360 ttcccaggag agttagataa taatggagaa ttacgacatc tctfccagcgg agtgaactct 420 tttagcagaa cagaattaat aagtcccaac aaatggggag acattctgga tggagtcaec 480 gcttcttgcc gcgataatgg ggcaagcagt ttttacagaa atttggtctg gatagtgaag S40 aataaaaatg gaaaataccc tgtcataaag ggggattaca ataacacaac aggcagagat 600 gttctagtac tctggggcat tcaccatccg gatacagaaa caacagccat aaacttgtac 660 gcaagcaaaa acccctacac attagtatca acaaaggaat ggagcaaaag atatgaacta 720 gaaattggca ccagaatagg tgafcggacag agaagttgga tgaaactata ttggcacctc 780 atgcgccctg gagagaggat aatgtttgaa agcaacgggg gccttatagc gcccagatac 840 ggafcacatca ttgagaagta cggfcacagga cgaattttcc aaagtggagt gagaatggcc 900 aaatgcaaca caaagtgtca aacatcatta ggtgggataa acaccaaeaa aactttccaa 960 aacatagaga gaaatgctct tggagattgc ccaaagtaca taaagtctgg aeagctgaag 1020 cttgcaactg ggctgagaaa tgtceeatcc gttggtgaaa gaggtttgtt tggtgcaatt 1080 gcaggcttca tagaaggagg gtggcctggg ctaattaatg gatggtatgg tttccagcat 1140 cagaatgaac aggggactgg oatfcgctgca gacaaagcct ccactcagaa agcgatagat 1200 gaaataacaa caaaaattaa caatataata gagaagatga acggaaacta tgattcaata 1260 agaggggaat tcaateaagt agaaaagagg atcaaeatgc tcgctgatcg agttgatgat 1320 gcagtaactg acatatggtc gtacaatgct aaacttcttg tactgcttga aaatgggaga 1380 acattggact tacacgacgc aaatgtcagg aacttacacg ateaggtcaa gagaatattg 1440 aaaagtaatg ctatcgatga aggagatggt tgcttcaatc ttcttcacaa atgtaatgac 1500 tcatgcatgg aaacCattag aaatgggaco tacaatcatg aagattacag ggaagaatca 1560 caactgaaaa ggcaggaaat tgagggaata aaattgaagt ctgaagacaa tgtgtataaa 1620 gtactgtcga tttatagetg cattgcaagc agtattgtgc tggtaggtct catacttgcg 1680 ttcataatgt gggcatgeag caatggaaat tgccggttta atgtttgtat atagtcggaa 1740 aaaataccct tgtttctact 1760

<210> 17 <211> 1656 <212> DNA <213> pCAMBÍA expression vector 660 containing the compiete wild type H5 sequence <400> 17 gatcagattt gcattggtta ccatgcaaac aattcaacag agcaggttga cacaatcatg 60 gaaaagaacg ttactgttac acatgcccaa gacatactgg aaaagacaca caacgggaag 120 etcfcgcgatc tagatggagt gaagcctcta attttaagag attgtagtgt agcEggatgg 180 ctcctcggga acccaatgtg tgacgaattc atcaatgtac cggaatggtc ttacatagtg 240 gagaaggcca atccaaoçaa tgacctctgt tacccaggga gtttcaacga ctatgaagaa 300 ctgaaacacc tattgagcag aataaaccat tttgagaaaa ttcaaatcat ccccaaaagt 360 tettggtccg atcatgaagc ctcatcagga gttagctcag catgtccata cctgggaagt 420 ccctcctttfc ttagaaatgt ggtatggctt atcaaaaaga acagtacata cccaacaata 480 aagaaaagct acaataatac caaccaagag gatcttttgg tactgtgggg aattcaccat 540 cctaatgatg cggcagagca gacaaggcta tatcaaaacc caaccaccta tatttccatt 600 gggacatcaa eaefcaaacca gagattggta ceaaaaatag etaetagatc caaagtaaac 660 gggcaaagtg gaaggatgga gttcttctgg acaattttaa aacctaatga tgcaatcaac 720 ttcgagagta atggaaattt cattgctcca gaatatgcat acaaaattgt caagaaaggg 780 gactcagcaa ttatgaaaag tgaattggaa tatggtaact gcaacaccaa gtgteaaact 840 ccaatggggg cgataaacfcc tagtatgcca ttccacaaca tacaccctct caccatcggg 900 gaatgcccca aatatgtgaa atcaaaeaga ttagtccttg caacagggct cagaaatagc 960 cctcaaagag agagcagaag aaaaaagaga ggactatttg gagctatagc aggttttata 1020 gagggaggat ggcagggaat ggtagatggt tggtafcgggt accaccatag eaatgagcag 1080 gggagtgggt acgcfcgcaga caaagaatcc actcaaaagg caatagatgg agtcaccaat 1140 aaggtcaact caatcattga caaaatgaac actcagtttg aggccgttgg aagggaattt 1200 aataacttag aaaggagaat agagaattta aacaagaaga tggaagacgg gtttctagat 1260 gtctggactt ataatgccga acttctggtt ctcatggaaa atgagagaac tctagacttt 1320 catgactcaa atgttaagaa cctctacgac aaggtccgac tacagettag ggataatgca 1380 aaggagctgg gtaacggtfcg tttcgagttc tatcacaaat gtgataatga atgtatggaa 1440 agtataagaa acggaacgta oaactatccg cagtattcag aagaagcaag attaaaaaga 1500 gaggaaataa gtggggtaaa attggaatca ataggaactt accaaatact gtcaatttat 1560 tcaacagtgg cgagttccct agcactggca atcatgatgg ctggtctatc tttatggatg 1620 tgctccaatg gatcgttaca atgcagaatt tgcatt 1656

<210> 18 <211 >25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> «223» PCR primer <400» 18 glattagfaa ttaga»ííí§:0}|lê 25 «210» 19 <211» 50 <212» dna <213» ASifeíá I.Sequene® <220»

«223» PCR primer «400» 1S ttgtage&amp;t tetitatlgt tgggtatgca ctgttcittt tgataagcca 50

<21:0» 20 <211 > SQ <212» DNA <213» Artificial Sequence: <220.» <223» PCR primer <400» 29 acccaaiaat:a8agaa^gc1aea,aÍ3atg cçaaceaagaggaMte 50

<210» 21 <211» SO <212» DNA <213> Artificial Sequence <220> <223» PCR,primer <400> 21 gtgag9ggg{gtatgttgtf::gaa!ggea1á:geags@íte:te^:csisccát: 50

<210» 22 <211» 50 <212» DNA <213» Artificiai Sequence <220» <2Éb PCR primer <400> 22 a&amp;gasasega taaa^ctge:tei:gccati.e:caeaaGata&amp;acsetete:ac: 50

<210» 23 <211» 38 <212» DNA <213» Artificiai Sequence <220» <223» PCR primer <400» 23 actttgagct cttaaatgca aattctgcat tgtaacga 38

<210 24 *=211 > 32 <212> DNA <213> Artificia! Sequence <220> <223> PCR primer <4Q0> 24 agttccccgg gctggtatat tiatalgttg tc 32

<210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificia! Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 aatagagctc cattitctct caagatgatt aattaatiaa ttagtc 46

<210 26 <211> 46 <212> DNA <213> Artificia! Sequence <220 <223> PCR primer <400> 26 aatagagctc gttaaaatgc ttcttcgtct cctatttata atatgg 46

<210 27 <211> 48 <212> DNA <213> Artificiai Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 ttacgaattc tccttcctaa tlggtgtacl atcatttatc aaagggga 48

<210 28 <211> 1719 <212> DNA <213> Influenza A virus, subtype H5 from lndonesia/5/05 (H5N1) <400 28 aagcttatgg agaaaatagt gcttcttett gcaatagtca gtcttgttaa aagtgatçag 60 atttgcattg gttaecatgc aaacaattca acagagcagg tfcgacacaat catggaaaag 120 aaegctactg ttacaeatgc ccaagacata ctggaaaaga cacacaacgg gaagctctgc 180 gatctagarg gagtgâágcc tctaattcta agagattgta gtgtagctgg aSggctcctc 240 gggaacccaa tgtgtgat?96 attcatcaat. gtaccggaat ggtcttacat agfeggagaag 300 gccaatceaa ccaatgacct ctgttaccca gggagtttca acgactatga agaaetgaaa 360 cacctattga gcagaataaa ccattttgag aaaattcaaa tcatccccaa aagttcttgg 420 feeegafceafeg aagectcatc aggagttagc teageatgtc cataccfcggg aagtccctcc 480: ttttttagaa atgtggtafeg gcctatcaaa aagaacagta catacccaac aataaagaaa 540 agctacaata ataccaacca agaggatefct UtggtactgC ggggaattca ccatcctaat 600 gatgcggcag agcagacaag gctatateaa aaccçaacea cotatatttc cafcÇgggaca 666 tcaacactaa accagagatt ggtaccaaaa atagctacta gatccaaagt aaacgggcaa 720 agtggaagga tggagttctt cfcggacaatt ttaaaaccta atgatgcaat caactccgag 760 agt.aatggaa atttcattgc tccagaatat gcatacaaaa ttgteaagaa aggggactca 840 gcraattatga aa&amp;gfcgaatt ggaatatggt aacfegcaaea ccaagcgtca aactccaatg 900 ggggcgataa actctagfcat gccattccac aacatacacc Ctefccaceafc cggggaatgc 960 cccaaatatg tg&amp;aatcaaa eagattagtc cttgcaacag ggctcagaaa tagccctcaa 1020 agãgAgagca gaagaaaaaa gagaggacta ttfcggaggfca fcágaa.ggitfc fcafcagaggga 1080 ggatggcagg gaatggtaga tggttggtat gggtaccacc atagcaatga gcaggggagt 1140 gggtacgctg cagacaaaga atccactcaa aaggçaatag atggagtcac caataaggtc 1200 aaetcaatca ttgacaaaat gaacactcag tttgaggceg ttggaaggga átttaataac 1260 ttagaaagga gaatagagaa tttaaacaag aagat.ggaag acgggtttet agatgtctgg 1320 acttataatg ccgaacttet ggfctctcatg gaaaatgaga gaactctaga etfctcatgac 1380 tcaaatgtta agaacctcta egacaaggtc cgactacagc fctagggataa tgçaaaggag 2440 ctgggtaacg gttgtttcga gttctateac aaatgtgata atgaatgtat ggaaagtata 160:0: agaaacggaa cgtacaacta tccgcagtât teagaagaag caagattaaa aagagaggaa .1660 ataagtgggg taaaattgga afccaatagga actt&amp;eeaaa taetgtcaat ttattcaaca 1620 gtggcgagfct cectagcact ggcaatcatg atggctggtc tatctttatg gatgtgctcc 1680 aatggatcgt tacaatgcag aatttçeatt taagagctc 1719 <2 :0> 25 «211> 1656 «212> ΟΝΑ <213> pCAM B1A expression vselòrBSa eentaining IPs complete HS sOqaerioe (TripiS Matant) <4;';0> 29 gatcagattt gcattggtta ccatgcaaac aattcsaeág agcaggtfcga cacaatcatg so: gaaaagaacg ttactgttac acatgcccaa gaeatactgg· aaaagacaca caacqçrgaag 120 ctctgcgatc tagatggagt gaagcctcta attttaagag attgtagtgt agctgg&amp;tgg 180 ctcctcggga aeccaatgtg tgâcgaattc atcaatgtac cggaatggte tcacatagtg 240 gagaaggceâ afcccaaccaa tgacccctgt tacccaggga gttfcPaápga ctatgaagaa 300

ctgaaaoacc tactgagcag aataaaceat tttgagaaaa tccaaatcat ccccaaaagt 3SO fcçfctggtecg atcatgaagc ctcatcagga gtcagctcag catgtceata cefcgggaagfc 420 ccctcctttt ttagaaatgt ggtatggctt atcaaaaaga aeagtgcatá eccaacaata 480 aagaaaagct acaataatgc caaccaagag gatcttctgg cacegtgggg aattcaccat 540 cctaatgatg cggcagagca gacaaggct.a t.âtcaa&amp;acc caaccacata tatttccatt 600

gggacatcaa cactaaacca gagafctggta gçaaaaatag ctactagatc caaagfcaaae ÓSO gggeaaagtg gaaggatgga. gttcfctétgg acaatttt.aa aacctaatga tgcaafcaac 720

stc-gagagta aoggaaattt caoegctoca gaatatgcat acraaaategt; caagàaaggg ?8S gactcagcaa tiatgaaaag cgaattggaa tatggtaact gcaaoaceaa gtgteaaaet 840 eGáâEggggg cgataaactc tgctatgcca ttccacaaca tacaccctct caccatcggg 906 gaatgcçeca aatatgtgaa atcaaacaga ttagtccttg caacagggct cagaaatagc 9S0 cctcaaagag agagrcagaag aaaaaagaga ggactatttg gagctatagc aggttttata 1020 gegggaggat· ggcagggaat ggtagatggt tggtatgggt accaccatag caatgagcag 1080 gggagtgggfc aegcfcgcaga caaagaatcc actcaaaagg caatagatgg agtcaceaat 1140 aaggtcaact caaccattga caaaatgaac actcagtttg aggccgttgg aagggaafetfe 12Q0 aataactt&amp;g aaaggagaat agagaattta aaeaagaaga cggaagacgg gtttctagat 1260 gtctggactt ataatgccga acttctggtt: ctcatggaaa atgagagaac tctagaettt 1320 catgactcaa atgttaagaa ectctacgac aaggtcegae tacagcttag ggataatgca 2360 aaggagctgg gtaacggttg tófcegagfcfte tatcacaaat gtgataatga atgtatggaa 2440 agfcat&amp;agaa acggaacgta caactafceçg eagtatfccag aagaagc&amp;ag atcaaaaaga 1500 gaggaaáfcaa gfeggggtaaa attggáaOeai OtagâsAçtt accaaatacfc gtcaatttat 2566 tcaácagtgg cgagttccct agcactggca atcatgatrgg ctggtctatc tttatggatg 1620 tgctccaatg gatcgttaca atgcagaaefc tgcatt 1656

<210> 30 «211> 25 <212> QNA <213> ArtifíeiaíSgtj66oce «220> <223> PGR^Ímer <400> 30 giatiagíaa !íagaaíOg: gtgte 2a <2 iO> 3·;

«211 > 44 <?12> DMA <2Ϊ3> Artificial Sequence <22G> <223> P€R primer <400> 3t gcaagaagaa gcaétatítí cteesítiíe tctÈaágâlgatía 44

«210> 32 <21T» 45 <212> ONA «213> ArSiíscini Seeuence <220 «223> RE3f5 pf irn«r <4Q0> 32 ttaateatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttett cttgc 45

<210 33 <211> 38 <212> DNA <213=· Artificial Sequence <220 <223> PCR primer <400> 33 aclttgagct cttaaatgca aaltctgcat tgtaacga 38

<210> 34 <211 >552 <212> PRT <213> HA from influenza, H5 from AfVieinamfl 194/04 <400 34

Asp Gin lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gin Val 15 10 15

Asp Thr He Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gin Asp lie 20 25 30

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 35 40 45

Pro Leu He Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60

Pro Met Cys Asp Glu Phe lie Asn Val Pro Glu Trp ser Tyr lie Vai 65 70 75 80

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg He Asn His Phe Glu αοο los no

Lys lie Gin He He Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 115 120 125

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gin Gly Lys Ser Ser Phe Phe 130 135 140

Arg Asn Val Val Trp Leu He Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr He 145 150 155 160

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gin Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 165 170 175

Gly He His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gin Thr Lys Leu Tyr Gin ISO 185 190

Asn Pro Thr Thr Tyr He Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gin Arg 195 200 205

Leu Val Pro Arg He Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gin Ser Gly 210 215 220

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Tie Leu Lys Pro Asn Asp Ala He Asn 225 230 235 240

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe He Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys He 245 250 255

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr He Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gin Thr Pro Met Gly Ala lie Asn Ser Ser 275 280 285

Met Pro Phe His Asn He His Pro Leu Thr He Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 305 310 315 320

Pro Gin Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie 325 330 335

Ala Gly Phe lie Glu Gly Gly Trp Gin Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 340 345 350

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 355 360 365

Glu Ser Thr Gin Lys Ala lie Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 370 375 380 lie He Asp Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 385 390 395 400

Asn Asn Leu Glu Arg Arg He Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 405 410 415

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 420 425 430

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 435 440 445

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gin Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 450 455 460

Asn Gly Cys Phe Glu Phe· Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 465 470 475 480

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gin Tyr Ser Glu Glu Ala 485 490 495

Arg Leu Lys Arg Glu Glu He Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser He Gly 500 505 510 lie Tyr Gin lie Leu Ser lie Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 515 520 525

Leu Ala He Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 530 535 540

Ser Leu Gin Cys Arg lie Cys lie 545 550 <210> 35 <211> 1752

<212> DK'A <213> HA.from Influenza; strain 8/Flafitjai4/2BQ6 <400> 35 atgaaggeaa taattgtact aetc&amp;tggta gtaacatcca atgcagatcg aatctgcact 60 ggaataaeafe cttcaaactc acetcafcgtg gtcaaaacag ccactcaagg ggaggtcaat 120 gtgactggtg tgataccact a&amp;caaeaaea ccaacaaaat cttatfcttgc aastctcaaa iso ggaacaagga ccagagggaa actatgccca gacfcgtctca actgcacaga tctggatgtg 240 gcttfcgggea gaeeaatgfcg tgtgggga.cc acaccttcgg cgaaggci.tc aatactccac 300 gaagtçaaae òfcgfctacáte cgggtgcttt cctataatgc açgscagíáàe aaaaatcagg 360 caactaecca atcttetcag aggatatgaa aatatcaggc tatcaaccca aaacgtcatc 420 gafcgcgçfàaâ aggcaecagg aggaccctae agaettggaa cctcaggatc ttgccctaac 480 gctaccagta agagcggatfc tttcgcaaca atggcfctggg cfcgtcccaaa ggacaacaac 540 aaaaatgcaa cgaacccact aacagtagaa gtaccataca ttcgtacaga aggggaagac 600 caaatcactg cttgggggtt ccattcagat aacaaaaccc aaatgaagaa cctctatgga S60 gactcaaatc ctcaaaagtt caccecatct gcfe&amp;afcggag taaccacaca cfcatgtttct 720 cagattggca gcttcccaga tcaaacagaa gacggaggac taccacaaag cggcaggatfc 780 gttgttgatt acatgatgca aaaacetggg aaaaeaggaa caattgtcta ccaaagaggt 840: gttttgttgc ctcaaaaggt gtggtgcgcg agtggcagga gcaaagtaat aaaagggtcc 900 ttgcctfctaa ttggtgaagc agattgcctt catgaaaaat acggtggatt aaacaaaagc 960 aagccfcfeact açacaggaga acátgeaaaa gccataggaa at.trgcccaat atgggtgaaa 1020 aoaeetttga agctcgccaa tggaaccaaa tafcagacctc ctgca&amp;aact attaaaggaa 1080 aggggtttct tcggagctat tgctggtttc ctagaaggag gatgggaagg aatgattgea 1140 ggctggcacg gatacacatc tcacggagca catggagtgg cagtggcggc ggaccttaag 1200 lagtaegcaag aagctataaa caagataaca aaaaafcctca attct ttgag tgagctagaa 1260 gtaaagaate ttcaaagact aagtggtgcc atggatgaac tecacaacga aatactcgag 1320 ctggatgaga aagtggatga tctcagagct gacactataa gctcgca&amp;at agaacttgca 1380 gtcttgctfct ccaacgaagg aataataaac agtgaagatg agcatctatt ggcacttgag 1440 agaaaaetaa agaaaatgcfc gggtccctet gctgtagaga taggaaatgg atgcttcgaa 1500 accaaacaca agtgcaacca gacctgctta gacaggatag ctgctggc&amp;c ctttaatgca 1560 ggagaatttt ctctccccac ttttgattca ctgaaaatta ctgctgcatc tttaaatgat 1620 gatggattgg ataaccatac tatactgctc tattactcaa cfcgctgcttc tagttfcggct 1680 gtaacattga tgctagctat. ttttattgtt tatatggtct ccagagacaa cgtttcatgc 1740 tecatctgtc ta 17S2

<210> 38 <211> 569 <212> PRT <213> Mature HA from Influenza, strain B/Randa'4/2006 <400» 36

Asp Arg He Cys Thr Gly lie Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val Val 15 10 15

Lye Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val He Pro Leu 20 25 30

Thr Thr Thr Pro Thr Lye Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg 35 40 45

Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp 50 55 60

Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys 65 70 75 80

Ala Ser He Leu His Glu Val Lys Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro 85 90 95

He Met His Asp Arg Thr Lys He Arg Gin Leu Pro Asn Leu Leu Arg 100 105 110

Gly Tyr Glu Asn He Arg Leu Ser Thr Gin Asn Val He Asp Ala Glu 115 120 125

Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro 130 135 140

Asn Ala Thr Ser Lys Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Val 145 150 155 160

Pro Lys Asp Asn Asn Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val 165 170 175

Pro Tyr He Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gin lie Thr Val Trp Gly Phe 180 185 ISO

His Ser Asp Asn Lys Thr Gin Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn 195 200 205

Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val 210 215 220

Ser Gin lie Gly Ser Phe Pro Asp Gin Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro 225 230 235 240

Gin Ser Gly Arg lie Val Val Asp Tyr Met Met Gin Lys Pro Gly Lys 245 250 255

Thr Gly Thr He Val Tyr Gin Arg Gly Val Leu Leu Pro Gin Lys val 260 265 270

Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val He Lys Gly Ser Leu Pro Leu 275 280 285

He Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys 290 295 300

Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala He Gly Asn Cys 305 310 315 320

Pro He Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr 325 330 335

Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala lie 340 345 350

Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met He Ala Gly Trp His 35S 360 365

Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu 370 375 380

Lys Ser Thr Gin Glu Ala lie Asn Lys He Thr Lys Asn Leu Asn Ser 385 390 395 400

Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu Ser Gly Ala Met 405 410 415

Asp Glu Leu His Asn Glu He Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp 420 425 430

Leu Arg Ala Asp Thr lie Ser Ser Gin He Glu Leu Ala Val Leu Leu 435 440 445

Ser Asn Glu Gly He lie Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu 450 455 460

Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Glu lie Gly 465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gin Thr Cys Leu Asp 485 490 495

Arg He Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr 500 505 510

Ph® Asp Ser Leu Asn lie Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu 515 520 525

Asp Asn His Thr lie Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu 530 535 540

Ala Val Thr Leu Met Leu Ala He Phe He Val Tyr Met Val Ser Arg 545 550 555 560

Asp Asn Val Ser Cys Ser lie Cys Leu 565

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma hemaglutinina do vírus da gripe (HA) , que compreende um domínio HAl, em que o referido domínio HAl é modificado para ser livre de locais de glicosilação ligado a N na posição 154, 165, e 286, por a. posição modificada 154 que codifica uma não-asparagina e/ou modifica a posição 156 para codificar uma não-serina-uma não-treonina; b. posição modificada 165 que codifica uma não-asparagina e/ou modifica a posição 167 para codificar uma não-serina-ou uma não-treonina; e c. posição modificada 286 que codifica uma não-asparagina e/ou posição 288 modificada para codificar uma não-serina ou uma não-treonina, em que a numeração é de acordo com a estirpe A/Vietnam/ 1194/04, e em que a sequência de nucleótidos está operacionalmente ligada a uma região reguladora ativa numa planta.
2. 2. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que a referida região reguladora é selecionada a partir do grupo que consiste da região reguladora de plastocianina; promotor de napina, promotor de cruciferina, ou uma região reguladora obtida a partir da carboxilase de ribulose-1,5-bifosfato/oxigenase (RuBisCO), proteína de ligação de clorofila a/b, ST-LS, promotor poliedro, e o promotor gp64.
3. 3. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a sequência nucleotídica é definida de acordo com a SEQ ID N°. 17, em que os resíduos que codificam para os aminoácidos na posição 154, 165 e 286 codificam uma não-asparagina .
4. 4. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a sequência de nucleótidos é definida de acordo com a SEQ ID N° 17, em que os resíduos que codificam para os aminoácidos nas posições 156, 167 e 288 codificam uma não-serina, uma não-treonina ou uma alanina.
5. 5. Ácido nucleico, tal como definido na reivindicação 1, em que a sequência nucleotídica é como definida de acordo com a SEQ ID N°. 29.
6. 6. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência nucleotídica codifica uma hemaglutinina do vírus da gripe (HA), que compreende a sequência de SEQ ID N°. 34, e em que os aminoácidos nas posições 154, 165 e 286 codificam uma não-asparagina.
7. 7. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, em que os aminoácidos nas posições 156, 167 e 288 codificam uma não-serina, uma não-treonina ou uma alanina.
8. 8. Método de produção de vírus gripe similar a partículas (VLP) de uma planta, uma porção do mesmo, ou uma célula de planta, compreendendo o referido método: a) introdução do ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para a planta, uma sua porção, ou uma célula vegetal, e b) incubação da planta, uma sua porção ou a célula da planta, sob condições que permitam a expressão do ácido nucleico, produzindo desse modo as VLPs em que o ácido nucleico ou é expresso transientemente na planta, parte da mesma ou célula da planta, ou estavelmente expressa na planta, parte da mesma ou da célula vegetal; c) opcionalmente, a colheita da planta, parte da mesma ou a célula de planta e purificação das VLPs.
9. 9. Partícula semelhante a virus (VLP) que compreende uma molécula de hemaglutinina da gripe (HA) codificada pelo ácido nucleico da reivindicação 1.
10. 10. Partícula semelhante a virus (VLP) produzida pelo método da reivindicação 8.
11. 11. VLP de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que o referido local de glicosilação é constituído por uma tríade de reconhecimento da glicosilação NXS/T em que N é asparagina, X representa qualquer aminoácido exceto prolina, S é serina e T é treonina, ou o resíduo asparagina é substituída por um aminoácido não-asparagina, ou o resíduo de treonina compreendido numa tríade de reconhecimento de glicosilação NXS/T é substituído por um aminoácido não-serina e não-treonina, ou uma combinação dos mesmos.
12. 12. VLP de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que a referida gripe é do tipo A e do tipo B, ou o referido HA é a partir de um ou mais do que um subtipo A, selecionado a partir do grupo que consiste em: Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 e Hl 6.
13. 13. VLP de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, para uso como uma vacina para a prevenção ou tratamento de uma infeção virai num sujeito.
14. 14. Composição compreendendo uma dose eficaz de uma VLP de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. 15. Planta transgénica ou uma célula de planta transgénica transientemente ou estavelmente transformada com o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a célula vegetal ou planta contém o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 7.