ES2593277T3 - Nuevo epítopo de inmunización contra el virus de la influenza - Google Patents

Abstract

Un bcido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica que codifica una hemaglutinina (HA) del virus de la influenza que comprende un dominio HA1, en el que dicho dominio HA1 se modifica para que estb libre de sitios de glicosilacibn ligada a N en la posicibn 154,165 y 286, a. modificando la posicibn 154 para codificar una no asparagina y/o modificando la posicibn 156 para codificar una no serina o no treonina; b. modificando la posicibn 165 para codificar una no asparagina y/o modificando la posicibn 167 para codificar una no serina o no treonina; y c. modificando la posicibn 286 para codificar una no asparagina y/o modificando la posicibn 288 para codificar una no serina o no treonina, en el que la numeracibn es segun la cepa A/Vietnam/1194/04 y en el que la secuencia nucleotidica estb ligada a una regibn reguladora activa en una planta.

Description

Nuevo epitopo de inmunizacibn contra el virus de la influenza.

5 CAMPO DE LA INVENCI6N

La presente invencibn se refiere a la produccibn de particulas pseudovlricas. Mbs especlficamente, la presente invencibn se dirige a la produccibn de particulas pseudovlricas que comprenden antlgenos de influenza, mucho mbs particularmente antlgenos de influenza modificados que tienen amplia reactividad cruzada con otras cepas de 10 influenza.

ANTECEDENTES DE LA INVENClbN

La influenza es la principal causa de muerte en humanos debido a un virus respiratorio. Los slntomas comunes 15 incluyen fiebre, dolor de garganta, falta de aliento, y dolor muscular, entre otros. Durante la temporada de gripe, el virus de la influenza infecta al 10-20 % de la poblacibn mundial, lo que conduce a 250-500.000 muertes anualmente.

Los virus de la influenza son virus encapsulados que brotan de la membrana de plasma de cblulas de mamlfero infectado. Se clasifican en tipos A, B o C, basado en las nucleoprotelnas y antlgenos de protelna de matriz 20 presentes. Los virus de la influenza tipo A se pueden dividir adicionalmente en subtipos de acuerdo con la combinacibn de glicoprotelnas de superficie de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) presentadas. La HA gobierna la capacidad del virus para unirse a y atravesar la cblula hubsped. La NA elimina los residuos de bcido siblico terminal de cadenas de glicano sobre cblula huesped y protelnas de superficie vlrica, que previene agregacibn vlrica y facilita la movilidad del virus. Actualmente, se reconocen 16 subtipos de HA (H1 - H16) y 9 de NA 25 (N1-N9). Cada virus de influenza tipo A presenta un tipo de HA y un tipo de glicoprotelna NA. Generalmente, cada subtipo muestra especificidad de especies; por ejemplo, se sabe que todos los subtipos HA y NA infectan a las aves, mientras que solamente los subtipos H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 y N7 ban mostrado infectar a humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005). Los virus de la influenza que comprenden H5, H7 y H9 se consideran las formas mbs altamente patbgenas de los virus de la influenza A, y es mbs probable que causen pandemias futuras.

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Las pandemias de influenza normalmente son causadas por los virus de la influenza altamente transmisibles y virulentos, y pueden conducir a niveles elevados de enfermedad y muerte en el mundo. La aparicibn de nuevos subtipos de influenza A dio como resultado 4 pandemias importantes en el siglo 20. La gripe espafiola, causada por un virus H1N1, en 1918-1919 llevb a la muerte de mbs de 50 millones de personas en todo el mundo entre 1917 y 35 1920. Actualmente, el riesgo de la aparicibn de un nuevo subtipo, o de la transmisibn a humanos de un subtipo endbmico en animales, estb siempre presente. Es de particular interes una forma altamente virulenta de influenza aviar (tambibn llamada "gripe aviar"), cuyos brotes se han notificado en diversos paises alrededor del mundo. En muchos casos, esta gripe aviar puede dar como resultado velocidades de mortalidad que se aproximan al 100 % en 48 horas. La propagacibn del virus de la influenza aviar (H5N1), se identified por primera vez en Hong Kong en 1997, 40 a otros paises de Asia y Europa se han postulado que estb ligada a los patrones migratorios de aves silvestres.

El mbtodo actual para combatir la influenza en humanos es por vacunacibn anual. La vacuna es normalmente una combinacibn de varias cepas que se prevb que son las cepas dominantes para la prbxima "temporada de gripe". La prediccibn se coordina por la Organizacibn Mundial de la Salud. Generalmente, el numero de dosis de vacuna 45 producidas cada afio no es suficiente para vacunar a la poblacibn mundial. Por ejemplo, Canadb y los Estados Unidos obtienen suficientes dosis de vacunas para inmunizar aproximadamente un tercio de su poblacibn, mientras que solamente el 17% de la poblacibn de la Unibn Europea se puede vacunar. Es evidente que la produccibn mundial actual de vacuna de influenza podrla ser insuficiente en el caso de una pandemia de gripe en todo el mundo. Incluso si la produccibn anual necesaria puede de alguna manera atenderse en un afio determinado, las 50 cepas dominantes cambian de afio a afio, por lo tanto el almacenamiento en tiempo de baja necesidad en el afio no es prbctico. La produccibn a gran escala, econbmica de una vacuna de influenza eficaz es de interes importante para el gobierno y la industria privada por igual.

Actualmente, las reservas vlricas de la fuente mbs importante para su uso en vacunas se producen en huevos 55 fertilizados. Las particulas de virus se cosechan, y para una vacuna viral inactivada, se interrumpe por un detergente para inactivarla. Las vacunas vivas atenuadas se hacen de virus de influenza que se adaptan para el crecimiento a baja temperatura, lo que significa que a una temperatura corporal normal, la vacuna se atenua. Tal vacuna se autoriza en Estados Unidos para su uso en individuos de 5 a 49 afios de edad. Las vacunas de virus completo inactivadas se hacen inofensivas por inactivacibn con agentes qulmicos y se han producido en huevos embrionarios

o cultivo celular de mamlfero. Todos estos tipos de vacunas muestran algunas ventajas y desventajas especlficas. Una ventaja de las vacunas derivadas de virus completes es el tipo de inmunidad inducida por tales vacunas. En general, las vacunas divididas inducen una fuerte respuesta de anticuerpos mientras que las vacunas hechas de virus completes inducen tanto una respuesta de anticuerpo (humoral) como celular. Aunque una respuesta de 5 anticuerpo funcional es un criterio para obtener licencia que se correlaciona con la proteccibn inducida por una vacuna, cada vez hay mbs evidencia de que una respuesta de los linfocitos T tambibn es importante en la inmunidad a la influenza - esto tambibn puede proporcionar mejor proteccibn en las personas mayores.

Con objeto de indudr una respuesta inmunitaria celular, se desarrollaron vacunas hechas de virus completes. 10 Debido a la alta patogenicidad de la cepa de la influenza (por ejemplo, H5N1), estas vacunas se producen en una instalacibn BL3+. Para cepas de influenza altamente patbgenas, tal como H5N1, algunos fabricates han modificado la secuencia de gen de hemaglutinina con objeto de reducir la patogenicidad de la cepa de influenza y para hacerla avirulenta y producirla mas fbcilmente en huevos embrionarios o cultivo celular de mamlfero. Otros tambibn usan cepas de influenza recombinante en las que las secuencias genbticas para las protelnas de hemaglutinina y 15 neuraminidasa se clonan en una cepa de donante de influenza de baja patogenicidad de alto rendimiento (A/PR/8/34; Quan F-S y col., 2007). Mientras que estos mbtodos pueden producir vacunas utiles, no proporcionan una solucibn a la necesidad de alto volumen, bajo coste y rbpida produccibn de vacunas a la escala necesaria para cumplir la necesidad mundial en un aflo normal, y casi con toda seguridad es insuficiente en el caso de una pandemia.

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Usando esta tecnologia genbtica inversa, tambibn puede ser necesario mutar la secuencia genbtica de la protelna HA para hacerla avirulenta. Para cepas de influenza altamente patbgenas, la produccibn de vacunas de virus completes requiere procedimientos de confinamiento o que las vacunas resultantes no coincidan exactamente con la secuencia genbtica del virus circulate. En el caso de vacunas atenuadas vivas, todavia hay un riesgo de que la 25 vacuna administrada pueda recombinarse con un virus de influenza del hubsped, lo que conduce a un nuevo virus de influenza.

Aunque este mbtodo mantiene el epitopo antigbnico y modificaciones post-traduccionales, hay varios inconvenientes que incluyen el riesgo de contaminacibn debido al uso de virus complete y rendimientos variables dependiendo de la 30 cepa del virus. Los niveles sub-bptimos de proteccibn pueden ser resultado de la heterogeneidad genbtica en el virus debido a su introduccibn en huevos. Otras desventajas incluyen una amplia planificacibn para obtener huevos, riesgos de contaminacibn debido a productos quimicos usados en la purificacibn, y tiempos de produccibn largos. Adembs, las personas hipersensibles a las protelnas de huevo pueden no ser candidates aptos para recibir la vacuna.

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En el caso de una pandemia, la produccibn de vacuna dividida se reduce por la necesidad de adaptar la cepa por crecimiento en huevos y los rendimientos de produccibn variable alcanzados. Aunque esta tecnologia se ha usado durante aflos para la produccibn de vacunas estacionales, diflcilmente puede responder en un plazo razonable a una pandemia ya que la capacidad de fabricacibn en todo el mundo es limitada.

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El reciente brote en Mbxico de Influenza tipo A H1N1 tambibn destaca la necesidad mbdica urgente de desarrollar una rbpida metodologla para la produccibn de vacunas de cepas de aparicibn reciente.

Para evitar el uso de huevos, los virus de la influenza tambibn se han producido en cultivo celular de mamlfero, por 45 ejemplo en MDCK o cblulas PERC.6, o similares. Otro enfoque es genbtica inversa, en la cual los virus se producen por transformacibn celular con genes virales. Estos mbtodos, sin embargo, tambibn requieren el uso de virus complete, as! como mbtodos de elaboracibn y entomos de cultivo especlficos.

Se han desarrollado diversos productos recombinates como candidates de vacuna de influenza recombinante. 50 Estos enfoques se han centrado en la expresibn, produccibn y purificacibn de protelnas HA y NA de influenza tipo A, incluyendo la expresibn de estas protelnas usando cblulas de insecto infectadas con baculovirus (Crawford y col., 1999; Johansson, 1999), vectores virales, y construcciones de vacuna de ADN (Olsen y col., 1997).

Se conocen bien los especlficos de una infeccibn de virus de influenza. En resumen, el ciclo infeccioso se inicia por 55 el enlace de la protelna HA de superficie del viribn a un receptor celular que contiene bcido siblico (glicoprotelnas y glucollpidos). La protelna NA media el procesamiento del receptor de bcido siblico, y la penetracibn de virus en la cblula depende de la endocitosis mediada por el receptor dependiente de HA. En los llmites bcidos de los endosomas interiorizados que contienen un viribn de influenza, la protelna HA experimenta cambios conformacionales que llevan a fusibn de membranas virales y celulares y el virus no recubierto y la liberacibn

mediada por M2 de proteinas M1 de ribonucleoproteinas (RNP) asociadas a nucleocdpside, que migran al nucleo celular para la slntesis de ARN vlrico. Los anticuerpos para protelnas HA previenen la infeccidn de virus neutralizando la infectividad del virus, mientras que los anticuerpos para proteinas NA median su efecto en las etapas tempranas de la replicacidn viral.

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Crawford y col. (1999) desvelan la expresidn de HA de influenza en cdlulas de insecto infectadas con baculovirus. Las proteinas expresadas se describen como capaces de prevenir la enfermedad de influenza letal causada por los subtipos de influenza H5 y H7 aviar. Johansson y col. (1999) indican que las proteinas HA y NA de influenza expresadas por baculovirus inducen respuestas inmunitarias en animales superiores a las inducidas por una vacuna 10 convencional. La inmunogenicidad y eficacia de la hemaglutinina expresada por baculovirus del virus de influenza equina se compard con un candidato de vacuna de ADN homdlogo (Olsen y col., 1997). En conjunto, estos datos demuestran que puede inducirse un alto grado de proteccion contra la estimulacidn del virus de la influenza con proteinas HA o NA recombinantes, usando diversos enfoques experimentales y en diferentes modelos animales.

15 Ya que la investigacidn previa ha mostrado que las glicoprotelnas de influenza de superficie, HA y NA, son las dianas principales para provocar inmunidad protectora contra virus de influenza y que M1 proporciona una diana conservada para la inmunidad celular a influenza, un nuevo candidato de vacuna puede incluir estos antigenos virales como una partlcula macromolecular de proteina, tal como particulas pseudovlricas (VLP). Como productos de vacuna, las VLP ofrecen la ventaja de ser mds inmundgenas que la subunidad o los antigenos recombinantes y son 20 capaces de estimular tanto la respuesta inmune humoral como celular (Grgacic y Anderson, 2006). Ademds, la partlcula con estos antigenos de influenza puede mostrar epitopos conformacionales que provocan anticuerpos de neutralizacion para multiples cepas de virus de influenza.

La produccidn de una cepa de virus de influenza no infecciosa para fines de vacunacidn es una forma de evitar una 25 infeccidn accidental. Como alternativa, se han investigado las particulas pseudoviricas (VLP) como sustitutos para el virus cultivado. Las VLP imitan la estructura de la cdpside virica, pero carecen de un genoma y, por lo tanto, no pueden replicarse o proporcionar un medio para una infecci6n secundaria.

Varios estudios han demostrado que las proteinas de influenza recombinante se auto-ensamblan en las VLP en 30 cultivo celular usando pldsmidos de expresidn de mamiferos o vectores de baculovirus (Gomez-Puertas y col., 1999; Neumann y col., 2000; Latham y Galarza, 2001). Gomez-Puertas y col. (1999) desvelan que la formacidn eficiente de VLP de influenza depende de los niveles de expresidn de varias proteinas viricas. Neumann y col. (2000) establecieron un sistema basado en pldsmido de expresidn de mamifero para generar particulas pseudoviricas de influenza infecciosas en su totalidad de ADNc clonados. Latham y Galarza (2001) indicaron la formacidn de VLP de 35 influenza en cdlulas de insecto infectadas con genes HA, NA, M1 y M2 que co-expresan baculovirus recombinantes. Estos estudios demostraron que las proteinas de viridn de influenza pueden auto-ensamblarse tras la co-expresi6n en cdlulas eucaridticas.

Gomez-Puertas y col. (2000) indican que, ademds de la hemaglutinina (HA), la proteina de matriz (M1) del virus de 40 influenza es esencial para la germinacion de VLP a partir de cdlulas de insecto. Sin embargo, Chen y col. (2007) indican que M1 podria no requerirse para la formacidn de VLP, y observaron que la liberacidn eficiente de M1 y VLP requeria la presencia de HA y actividad de sialidasa proporcionada por NA. La NA escinde los dcidos sidlicos de las glicoprotelnas en la superficie de las cdlulas que producen las VLP, y que liberan las VLP en el medio.

45 Quan y col. 2007 indican que una vacuna de VLP producida en un sistema de expresidn de baculovirus (cdlula de insecto) induce una inmunidad protectora contra algunas cepas del virus de la influenza (A/PR8/34 (H1N1)). Se observd que las VLP estudiadas por Quan brotan de la membrana plasmdtica, y se considerd que eran del tamafto y morfologia correctos, similares a las obtenidas en un sistema de mamifero (cdlulas MDCK).

50 Los virus encapsulados pueden obtener su envoltura lipidica cuando "brotan" fuera de la cdlula infectada y obtienen la membrana de la membrana plasmdtica, o de la de un organelo interno. Las particulas de virus de la influenza y las VLP brotan de la membrana plasmdtica de la cdlula hudsped. En sistemas de cdlulas de mamiferos o de baculovirus, por ejemplo, la influenza brota de la membrana plasmdtica (Quan y col. 2007).

55 Se sabe que sdlo unos pocos virus encapsulados infectan plantas (por ejemplo, miembros de los Tospovirus y Rabdovirus). Los virus conocidos encapsulados de plantas, se caracterizan por brotar de las membranas internas de la cdlula hudsped, y no de la membrana plasmdtica. Aunque un pequefio numero de VLP recombinantes se han producido en plantas hudsped, ninguna se derivd de la membrana plasmdtica. Las tecnologias actuates para la produccidn de VLP de influenza se basan en la coexpresidn de multiples proteinas virales, y esta dependencia

representa una desventaja de estas tecnologlas ya que en caso de una pandemia y de epidemias anuales, el tiempo de respuesta es crucial para la vacunacidn. Es deseable un sistema de produccibn mbs simple de VLP, que se basa en la expresibn de sdlo una protelna virica para acelerar el desarrollo de la vacuna.

5 La produccibn de VLP de influenza HA en un sistema basado en plantas se ha descrito en el documento WO 2009/009876, que bbsicamente muestra que la HA de influenza es capaz de auto-ensamblarse en cblulas hubsped vegetales y brotar de membranas de plasma en partlculas pseudoviricas. El documento WO 1986/003224 indica la eliminacibn de glicosilacidn ligada a N por exposicibn de HA de influenza a desglicosilacibn enzimbtica, y el documento WO 2004/019094 indica los sitios de sustitucidn de aminobcidos potenciales.

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Con el fin de proteger a la poblaci6n mundial de la influenza y para evitar futuras pandemias, los fabricates de vacunas necesitarbn desarrollar mbtodos rbpidos y eficaces para producir dosis de vacunas. El uso actual de huevos fertilizados para producir vacunas es insuficiente e implica un proceso lento. Las protelnas HA usadas son especificas para cada cepa y no tienen reaccibn cruzada con otras cepas para proporcionar vacunas de espectro 15 mbs amplio, necesitando de esta manera un produccibn constante o corto tiempo de reaccibn una vez que se identifica una nueva cepa.

Ciertas modificaciones y/o mutaciones se pueden aportar a la protelna nativa HA usada para producir VLP, facilitando dichas modificaciones una protelna de hemaglutinina que tiene un espectro mbs amplio para inducir un 20 anticuerpo que neutraliza a mbs de una, o varias cepas de gripe, aun despuds de solamente una unica administracibn.

RESUMEN DE LA INVENCI6N

25 Es un aspecto de la invencidn proporcionar una vacuna de influenza mejorada.

Es un aspecto adicional de la divulgacidn proporcionar partlculas pseudoviricas de influenza novedosas.

Es un aspecto adicional de la divulgacidn proporcionar una protelna de hemaglutinina que se ha modificado para 30 proporcionar una reaccidn de anticuerpo de espectro mbs amplio.

La presente divulgacidn contempla un polipbptido que tiene una secuencia de residuo aminoacldico sustancialmente idbntica a la de una glicoprotelna ligada a N de envoltura virica pero que estb parcial o totalmente libre de carbohidratos ligados a N (es decir, tiene uno o mbs sitios de glicosilacidn que se suprimen cuando se compara con 35 una secuencia HA nativa original), as! como mbtodos para producir y utilizar el polipbptido.

Es un aspecto adicional de la divulgacidn se proporciona una protelna HA en la que uno o mbs de los sitios de glicosilacidn ligada a N del dominio HA1 se han modificado/eliminado/mutado/retirado/suprimido para producir VLP de influenza para la preparacidn de una vacuna de influenza de amplio espectro.

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Particularmente, el dominio HA1 comprende aminobcidos situados en las posiciones 1 a 331 como se enumera de acuerdo con la cepa A/Vietnam/1194/04; SEQ ID NO. 34). Mbs particularmente, el dominio HA1 comprende la porcidn principal globular y el dominio F'2 de la protelna, que corresponde a los aminobcidos entre las posiciones 39 a 331 de la protelna como se enumera de acuerdo con la cepa A/Vietnam/1194/04; SEQ ID NO. 34). 45 Particularmente, el sitio de glicosilacidn que se suprime se presenta originalmente en la porcidn principal globular de la protelna, particularmente que corresponde a aminobcidos ubicados entre las posiciones 39 a 273 de la SEQ ID No. 34. Mbs particularmente, el sitio de glicosilacidn suprimido se ubica originalmente en el dominio F'2 de la protelna, particularmente que corresponde a los aminobcidos ubicados entre posiciones 274-331 de la SEQ ID NO. 34.

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La presente divulgacidn proporciona sustituciones aminoacldicas en la molbcula de hemaglutinina (NA) de influenza A que pueden alterar la antigenicidad e inmunogenicidad de la HA. Estas sustituciones pueden alterar los sitios antigbnicos al alterar la especificidad del receptor y/o la unidn anticuerpo-antlgeno. En una diversidad de realizaciones, el aumento de antigenicidad resultante de la sustitucidn puede ser util para la produccidn de vacunas 55 con reactividad cruzada mbs amplia para influenza. Particularmente, la sustitucidn de aminobcido da como resultado molbculas con las caracterlsticas de inmunogenicidad de la sustitucidn aminoacldica de un residuo sin asparagina de la protelna HA en la ubicacidn que corresponde al sitio de unidn al receptor y particularmente que corresponde a la ubicacidn 154 y/o 165 y/o 286 (donde la numeracidn es segun la cepa A/Vietnam/1194/04; SEQ ID NO. 34). En realizaciones particulars, la sustitucidn aminoacldica retira/elimina/suprime un sitio de glicosilacidn.

La molbcula HA de antigenicidad aumentada del virus de influenza puede incluir uno o mbs aminobcidos no glicosilados que corresponden a las posiciones 154 y/o 165 y/o 286 en H5 HA, donde la retirada de cualquiera de estos sitios de glicosilacibn da como resultado un aumento de la reactividad con antisueros obtenidos de un animal 5 expuesto a un virus de influenza con una molbcula HA de tipo silvestre.

Con objeto de destruir un sitio de glicosilacibn, la sefial de trlada N-X-S/T (donde N es un Asn, X puede ser cualquier aminobcido excepto Pro, y S/T puede ser tanto Ser como Thr) se puede modificar por disefto de protelnas. El primer enfoque usado puede ser reemplazar el Asn por otro aminobcido. El segundo enfoque es reemplazar el aminobcido 10 S/T en la posicibn n+2 con respecto a la asparagina glicosilar, por cualquier otro residuo aminoacidico. Un aminobcido apropiado usado para reemplazar la asparagina, serina o treonina es alanina, pero tambibn puede usarse otro aminobcido. Por ejemplo, Asn se puede reemplazar por Leu, lie, Val, Thr, Ser o Ala. Adembs, Ser o Thr se puede reemplazar por Ala, Val, lie o Leu.

15 Particularmente, la molbcula HA de antigenicidad aumentada del virus de influenza puede incluir un aminobcido sin asparagina en las posiciones 154 y/o 165 y/o 286 en H5 HA.

La molbcula HA de antigenicidad aumentada del virus de influenza puede incluir protelna HA donde la porcibn principal carece de sitios de glicosilacibn ligados a N es decir, los tres sitios de glicosilacibn se han suprimido.

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La molbcula HA de antigenicidad aumentada del virus de influenza puede incluir uno o mbs de un sitio de glicosilacibn que se elimina, seleccionado del grupo que consiste en: N-154, N-165 y N-286 (donde la numeracibn es segun la cepa A/Vietnam/1194/04).

25 La presente divulgacibn proporciona una hemaglutinina modificada (HA) de diferentes cepas de influenza.

La presente divulgacibn tambibn proporciona un mbtodo para producir partlculas pseudovlricas de influenza (VLP) en un organismo hubsped sin sialilacibn que comprende:

30 a) introducir un bcido nucleico que codifica un antlgeno de hemaglutinina (HA) de influenza como se ha

definido anteriormente, ligando operativamente a una regibn reguladora activa en un organismo hubsped sin sialilacibn o una porcibn del mismo,

b) incubar el hubsped o una porcibn del mismo, en condiciones que permiten la expresibn del bcido 35 nucleico, produciendo de esta manera las VLP.

La presente divulgacibn incluye el mbtodo anterior en el que, en la etapa de introduccibn (etapa a), el bcido nucleico puede ser cualquiera expresado de forma transitoria en el hubsped, o expresado establemente en el hubsped. Adembs, las VLP se pueden purificar usando, por ejemplo, cromatografia por exclusibn de tamafio.

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Adicionalmente la presente divulgacibn se refiere a un organismo hubsped sin sialilacibn usado para la produccibn de una partlcula pseudovlrica (VLP) que comprende una protelna HA de virus de influenza. Particularmente, el hubsped adecuado capaz de producir una VLP es, por ejemplo, una planta o una porcibn de la misma, una cblula vegetal, un insecto o una porcibn del mismo, o una cblula de insecto, o una levadura o porcibn de la misma, o una 45 cblula de levadura.

De acuerdo con la presente divulgacibn, se proporciona un bcido nucleico que comprende una secuencia nucleotldica que codifica una HA de influenza modificada como se ha definido anteriormente operativamente ligada a una regibn reguladora activa en un organismo hubsped sin sialilacibn. El antlgeno puede ser una hemaglutinina 50 (HA) de influenza que carece de uno o mbs los sitios de glicosilacibn ligados a N de la porcibn principal de la molbcula (sitios antigbnicos que estbn normalmente presentes en la secuencia nativa).

La presente divulgacibn tambibn proporciona una partlcula pseudovlrica (VLP) que comprende un protelna HA de virus de influenza como se define en el presente documento y uno o mbs de un llpido hubsped. Si el hubsped es un 55 insecto, entonces la partlcula pseudovlrica (VLP) puede comprender una protelna HA de virus de influenza y uno o mbs de un llpido de insecto, o si el hubsped es una levadura, entonces la partlcula pseudovlrica (VLP) puede comprender una protelna HA de virus de influenza y uno o mbs de un llpido de levadura, si el hubsped es una planta, entonces la partlcula pseudovlrica (VLP) puede comprender una protelna HA de virus de influenza y uno o mbs de un llpido vegetal.

La divulgacibn proporciona adicionalmente las VLP que se producen en una planta, que contienen de esta manera uno o mbs de un llpido de origen vegetal (generalmente denominados como "llpidos vegetales").

5 La divulgacibn proporciona adicionalmente las VLP producidas en cblulas de insecto que comprenden llpidos de la membrana plasmbtica de cblulas de insecto (generalmente denominados como "llpidos de insecto").

La divulgacibn proporciona adicionalmente las VLP producidas en levadura que comprenden llpidos de la membrana plasmbtica de las cblulas de levadura (generalmente denominados como "llpidos de levadura").

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Tambibn se incluye en la presente divulgacibn una composicibn que comprende una dosis eficaz de una VLP que comprende una protelna HA de virus de influenza, uno o mbs de un llpido obtenido de una cblula de produccibn de hubsped sin sialilacibn, en mezcla con un vehlculo farmacbuticamente aceptable. El vehlculo farmacbuticamente aceptable puede ser adecuado para administracibn oral, intradbrmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, 15 intravenosa o subcutbnea.

Adembs se incluye en la presente divulgacibn, una composicibn de vacuna que comprende una dosis inmunolbgicamente eficaz de una VLP como se define en el presente documento en mezcla con un vehlculo farmacbuticamente aceptable con o sin la presencia de un adyuvante. La vacuna se puede administrar por via oral, 20 intradbrmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutbnea. Particularmente, la vacuna se administra sin el uso de un adyuvante.

La presente divulgacibn tambibn proporciona un mbtodo para inducir inmunidad a una infeccibn de virus de influenza en un sujeto, comprendiendo el mbtodo administrar al sujeto las partlculas pseudovlricas que comprenden una 25 protelna HA de virus de influenza, uno o mbs de un llpido hubsped, y un vehlculo farmacbuticamente aceptable. La partlcula pseudovlrica se puede administrar a un sujeto por via oral, intradbrmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutbnea.

La presente divulgacibn pertenece a un mbtodo para inducir inmunidad a la infeccibn de virus de influenza en un 30 sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis eficaz de una vacuna que comprende uno o mbs de una VLP como se define en el presente documento.

El sujeto que se trata por los mbtodos como se han definido anteriormente se puede seleccionar del grupo que comprende humanos, primates, caballos, cerdos, aves (aviar), aves acubticas, aves migratorias, codomiz, pato, 35 ganso, aves de corral, polios, camellos, caninos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, civeta, visbn, gardufla, hurones, animates dombsticos, ganado, ratones, ratas, foca, ballenas y similares. Particularmente, el sujeto puede ser un paciente humano o aves en general (que incluyen aves acubticas, aves migratorias, aves de corral tales como codomiz, pato, ganso, pavos, polios), particularmente aves migratorias o aves de corral para el consumo humano (codomiz, pato, ganso, pavo, polio).

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La presente divulgacibn tambibn proporciona un recipiente, tal como una jeringa, asl como kits que comprenden tal recipiente, comprendiendo cada uno de los cuales la composicibn de vacuna como se define en el presente documento.

45 Este resumen de la divulgacibn no describe necesariamente todos los aspectos de la divulgacibn.

DESCRIPClbN DETALLADA DE LA INVENCION

BREVE DESCRIPClbN DE LOS DIBUJOS

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Estas y otras caracterlsticas de la invencibn se harbn mbs evidentes a partir de la siguiente descripcibn en la que se hace referenda a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1A representa la localizacibn de sitios de glicosilacibn en el virus de influenza HA H5 55 A/lndonesia/5/05. La identidad, posicibn y ubicadbn de los aminobcidos se indican por analogla en la

estructura de la AA/ietnam/1194/04; SEQ ID NO. 34 (archivo PDB: 2IBX). El triple mutante se ha hecho por la destruccibn de los sitios de glicosilacibn N154, N165 y N286 ubicados en la cabeza globular. El estudio de Bright y col. (2003) se ha usado para ubicar los sitios antigbnicos potenciales. El tipo de glicosilacibn se ha determinado en base a lo que se escribe en la bibliografla sobre HA H1, H3 y H7 (Abe Y. y col. (2004);

Vigerust DJ y col. (2007); y Kuroda y col. (1990);

la figura 1B es una ilustracidn de los subdominios del mondmero HA: Los subdominios F1 (1-38 como se enumeran de acuerdo con AA/ietnam/1194/04; SEQ ID NO. 34), F2 (274-331) y F se representan. El sitio de unidn al receptor y los sub-dominios de esterasa forman juntos la cabeza globular (39-273). El pdptido 5 de fusibn se representa como un cuadro de color bianco. El TmD y la cola cito no pueden verse en ninguna

de las estructuras HA ya que solamente los productos de bromelalna solubles de las HA se han cristalizado y la estructura se ha dilucidado;

la figura 2 representa las estructuras de un mondmero de HA de diferentes subtipos A. Tambidn se representa bicapa lipldica, con su contraparte alifbtica y su cabeza polar. Las estructuras se toman de Ha y 10 col. (Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002) H5 avian;

la figura 3 muestra una secuencia de un casete de expresidn basado en plastocianina de alfalfa usada para la expresidn de H1 de acuerdo con una realizacidn de la presente divulgacidn (SEQ ID NO: 8). El pdptido de serial de isomerasa (PDI) de disulfuro de protelna estb subrayado. Los sitios de restriccidn Bglll (AGATCT) y Sad (GAGCTC) usados para la clonacidn se muestran en negrita;

15 la figura 4 muestra una representacidn del pldsmido 660 ensamblado para la expresidn del subtipo H5 de

HA de tipo silvestre de A/lndonesia/5/05;

la Figura 5 muestra una representacidn del pldsmido 680 ensamblado para la expresidn del subtipo H5 de HA mutado no glicosilado de A/lndonesia/5/05;

la figura 6 muestra tltulos de anticuerpo contra virus inactivados completos (WIV) despuds de una primera 20 y segunda dosis. La reactividad de los sueros de ratas inmunizadas con VLP wt o la VLP de triple mutante

(no glicosilada) se evalud despuds de la primera (14 dlas) o la segunda inmunizacidn (35dlas). La inmunoreactividad se evalud contra varios virus H5N1;

la figura 7 representa tltulos de anticuerpo de inhibicidn de la hemaglutinacidn (HI) despuds de la primera y la segunda dosis. Los tltulos HI de ratas inmunizadas con la VLP wt o triple mutante (no glicosilada) se 25 evaluaron 14 dlas despuds de la primera (Dla 14) o la segunda inmunizacidn (Dla 35). La

inmunoreactividad se evalud contra varios virus H5N1 y un virus H1N1; la figura 8 representa la lista de secuencias para una HA0 de influenza; la figura 9 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H2;

la figura 10 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H3;

30

la figura 11 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H4;

la figura 12 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H5;

la figura 13 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H6;

la figura 14 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H7;

la figura 15 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H8;

35

la figura 16 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H9;

la figura 17 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H10

la figura 18 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H11

la figura 19 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H12

la figura 20 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H13

40

la figura 21 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H14

la figura 22 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H15

la figura 23 representa la lista de secuencias para una protelna HA de influenza de subtipo H16

la figura 24 representa la lista de secuencias para el vector de expresidn 660 pCAMBIA que contiene la secuencia H5 de tipo silvestre completa;

45 la figura 25A-J representa la lista de secuencias de los cebadores usados para amplificacidn por PCR,

la figura 26 representa la lista de secuencias para el fragmento producido, que contiene la regidn codificante de H5 completo que incluye el pdptido de seflal nativo flanqueado por un sitio HindiII inmediatamente aguas arriba del ATG inicial, y un sitio Sacl inmediatamente aguas abajo del coddn de detencidn (TAA);

50 la figura 27 representa la lista de secuencias para el fragmento producido, que contiene la regidn

codificante de H5 completo modificada para eliminar los tres sitios de glicosilacidn, incluyendo el pdptido seflal nativo flanqueado por un sitio Hindlll inmediatamente aguas arriba del ATG inicial, y un sitio Sacl inmediatamente aguas abajo del coddn de detencidn (TAA);

la figura 28A-D representa la lista de secuencias para cebadores para amplificacidn por PCR.

55 la figura 29 representa la secuencia aminoacldica de H5 maduro de la cepa A/Vietnam/1194/04; y

la figura 30A-B representa las secuencias de dcido nucleico y aminodcidos respectivamente de la HA madura de la cepa B/Florida/4/2006.

DESCRIPCI6N DETALLADA de LA INVENCI6N

La presente invenci6n se refiere a la produccibn de particulas pseudoviricas (VLP). Mbs particularmente, la presente invencibn se dirige a la produccibn de particulas pseudoviricas que comprenden antlgenos de influenza.

5 La siguiente descripcibn es de una realizacibn particular.

1 - Protelna HA

Como se usa en el presente documento, una "protelna" se refiere generalmente a una cadena de aminobcidos 10 conectados por un enlace peptldico, que se puede plegar en estructura secundaria, terciaria o cuaternaria para lograr una morfologla particular. Como altemativa, los tbrminos polipbptido, pbptido o fragmentos de pbptido se pueden usar en un contexto similar.

La expresibn "dominio de hemaglutinina" se refiere a un pbptido que comprende el polipbptido precursor HAO, o los 15 dominios HA1 y HA2. El dominio de hemaglutinina no incluye el pbptido serial, el dominio transmembrana, o la cola citoplbsmica encontrada en la protelna de origen natural.

Con referenda al virus de influenza, el tbrmino "hemaglutinina" o "HA", como se usa en el presente documento, se refiere a una glicoprotelna encontrada en el exterior de las particulas vlricas de influenza. La HA es una 20 glicoprotelna tipo I de membrana homotrimbrica, que comprende generalmente un pbptido serial, un dominio HA1, y un dominio HA2 que comprende un sitio de anclaje que abarca la membrana en el extremo C y una cola citoplbsmica pequefia (figura 1B) . Las secuencias nucleotldicas que codifican HA se conocen bien y estbn disponibles - vbase, por ejemplo, la base BioDefence Public Health (Virus de influenza; vbase URL: biohealthbase.org) o National Center for Biotechnology Information (vbase URL: ncbi.nlm.nih.gov), ambas de los 25 cuales se incorporan en el presente documento por referenda.

Informacidn estructural en las HA de influenza

El monomero HA puede subdividirse en 2 dominios funcionales distintos, el dominio de cabeza globular y el dominio 30 tallo. La correspondencia de estos dominios entre la secuencia primaria y la estructura de HA se ilustra en las figuras 1B y 2. El dominio tallo estb involucrado en la infectividad y patogenicidad del virus a travbs del cambio conformacional extraordinario que puede realizarse en pH bcido. Se describe adembs como 4 subdominios, el pbptido de fusibn (extensibn hidrbfoba de 26 aminobcidos responsables de la fusibn con la membrana huesped en el estado conformacional de pH bajo); el propio dominio tallo (que puede alojar 2 conformaciones extremadamente 35 diferentes), el dominio transmembrana (TmD) (determina la afinidad de HA para balsas de lipidos), la cola citoplbsmica (Ctail) (estb involucrada en la secrecibn de HA). La cabeza globular se divide en 2 subdominios, el dominio de unibn al receptor (RB) y el dominio de esterasa vestigial (E). El subdominio de esterasa estb mbs bien enterrado desde la superficie de la protelna y, por lo tanto, la mayorla de anticuerpos elevados contra HA se unen al dominio de unibn al receptor (representado por la parte superior de la cabeza en la figura 2).

40

El tbrmino "homotrlmero" u "homotrimbrico" indica que un oligbmero estb formado por tres molbculas de protelna HA. La protelna HA se sintetiza como una protelna precursora monombrica de 75 kDa (HAO), que se acumula en la superficie en una protelna trimbrica alargada. Para cepas aviares altamente patbgenas, la protelna precursora se escinde intracelularmente en un sitio de escisibn de activacibn conservada (tambibn denominado como pbptido de 45 fusibn) en 2 cadenas polipeptldicas, HA1 (328 aminobcidos) y HA2 (221 aminobcidos; que comprende la regibn transmembrana), ligadas por un enlace disulfuro antes de que ocurra la trimerizacibn. Aunque esta etapa es importante para la infectividad del virus, no es esencial para la trimerizacibn de la protelna. Para cepas del virus de influenza aviar de mamlfero y patbgenas, el precursor HAO se escinde extracelularmente por proteasas secretadas por cblulas del tracto respiratorio del hubsped, o coinfectando bacterias o micoplasma. La insercibn de HA en la 50 membrana del retlculo endoplasmbtico (ER) de la cblula hubsped, la escisibn del pbptido serial y la glicosilacibn de protelnas son eventos co-traduccionales. El repliegue correcto de la HA requiere la glicosilacibn de la protelna y la formacibn de 6 enlaces disulfuro de intra-cadena. El trlmero HA se acumula dentro del complejo cis y trans-Golgi, teniendo el dominio transmembrana un papel en el proceso de trimerizacibn. Las estructuras de cristal de las protelnas HA tratadas con bromelalna, que carecen del dominio transmembrana, han mostrado una estructura 55 altamente conservada entre las cepas de influenza. Tambibn se ha establecido que HA experimenta mayores cambios conformacionales durante el proceso de infeccibn, lo que requiere el precursor HAO para escindirse en las 2 cadenas polipeptldicas HA1 y HA2. La protelna HA puede procesarse (es decir, comprender los dominios HA1 y HA2), o puede no procesarse (es decir, comprender el dominio HAO).

La presente divulgacibn se refiere al uso de una proteina HA que comprende el dominio transmembrana e incluye los dominios HA1 y HA2, por ejemplo la proteina HA puede ser HAO, o HA procesada que comprende HA1 y HA2.

La HA de la presente divulgaci6n puede obtenerse a partir de cualquier subtipo. Por ejemplo, la HA puede ser del 5 subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15oH16.

La presente divulgacibn incluye VLP que comprenden HA que tienen N-glicanos modificados. La HA recombinante de la presente divulgacibn tambibn puede comprender una secuencia aminoacldica en base a la secuencia de cualquier hemaglutinina conocida en la tbcnica - vbase, por ejemplo, la base BioDefence Public Health (Virus de 10 Influenza; vbase URL: biohealthbase.org) o el National Center for Biotechnology Information (vbase URL: ncbi.nlm.nih.gov), donde los sitios de glicosilacibn ligados a N nativos se han retirado/mutado/eliminado/modificado para eliminar los residuos de azucar que enmascaran los sitios antigbnicos peptldicos.

Adembs, la HA puede basarse en la secuencia de una hemaglutinina que estb aislada de uno o mbs virus de 15 influenza emergentes o recibn identificados.

Adembs, las VLP pueden producirse, que comprenden una combinacibn de subtipos de HA. Por ejemplo, las VLP pueden comprender una o mbs que una HA del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, o una combinacibn de las mismas. La seleccibn de la combinacibn de HA puede determinarse por el 20 uso pretendido de la vacuna preparada a partir de la VLP. Por ejemplo, una vacuna para su uso en la inoculacion en pbjaros puede comprender cualquier combinacibn de subtipos de HA, mientras que las VLP utiles para inocular humanos pueden comprender subtipos de uno o mbs de uno de los subtipos H1, H2, H3 o H5. Sin embargo, pueden prepararse otras combinaciones de subtipos de HA dependiendo del uso de la VLP. Con objeto de producir VLP que comprenden combinaciones de subtipos de HA, el subtipo de HA deseado puede co-expresarse dentro de la misma 25 cblula, por ejemplo una cblula vegetal.

Particularmente, las VLP producidas como se describe en el presente documento no comprenden neuraminidasa (NA). Sin embargo, la NA puede coexpresarse con HA si se desean VLP que comprendan HA y NA.

30 2 - Subtipos de gripe

La divulgacibn incluye todos los tipos de virus de influenza humana, incluyendo por ejemplo, pero sin limitacibn, los sub-tipos A muy prevalentes, y el tipo B menos comun, y el tipo C, y las HA obtenidas de otros subtipos de influenza.

35 La presente divulgacibn tambibn incluye las VLP que comprenden HA obtenidas de uno o mbs de un subtipo de influenza. Por ejemplo, las VLP pueden comprender una o mbs de una HA del subtipo H1 (codificada por la SEQ ID NO: 1), H2 (codificada por la SEQ ID NO: 2), H3 (codificada por la SEQ ID NO: 3), H4 (codificada por la SEQ ID NO: 4), H5 (codificada por la SEQ ID NO: 5), H6 (codificada por la SEQ ID NO: 6), H7 (codificada por la SEQ ID NO: 7), H8 (codificada por la SEQ ID NO: 8), H9 (codificada por la SEQ ID NO: 9), H10 (codificada por la SEQ ID NO: 10), 40 H11 (codificada por la SEQ ID NO: 11), H12 (codificada por la SEQ ID NO: 12), H13 (codificada por la SEQ ID NO: 13), H14 (codificada por la SEQ ID NO: 14), H15 (codificada por la SEQ ID NO: 15), H16 (codificada por la SEQ ID NO: 16), o una combinacibn de las mismas. Una o mbs que una HA de uno o mbs de un subtipos de influenza pueden co-expresarse dentro de una cblula vegetal o de insecto para asegurar que la slntesis de una o mbs que una HA da como resultado la formacibn de VLP que comprenden una combinacibn de HA obtenidas de uno o mbs de un 45 subtipo de influenza. La seleccibn de la combinacibn de HA puede determinarse por el uso pretendido de la vacuna preparada de la VLP. Por ejemplo, una vacuna para su uso en la inoculacibn de seres humanos puede comprender cualquier combinacibn de subtipos de HA, particularmente, uno o mbs de uno de los subtipos H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 y N7. Particularmente, H1, H2, H3, H5.

50 Sin embargo, pueden prepararse otras combinaciones de subtipos de HA dependiendo del uso del inoculo.

3 - Mbtodo de produccibn

Adembs, la presente invencibn proporciona un mbtodo para producir partlculas pseudovlricas (VLP) en un hubsped. 55 Por lo tanto, la divulgacibn proporciona las VLP, y un mbtodo para producir VLP vincas en un sistema de expresibn hubsped, de la expresibn de una unica proteina de envoltura. El mbtodo implica introducir un bcido nucleico que codifica un antlgeno operativamente ligado a una regibn reguladora activa en el hubsped o una porcion del mismo, e incubar el hubsped o una porcibn del hubsped en condiciones que permitan la expresibn del bcido nucleico, produciendo de esta manera las VLP.

Los elementos reguladores de la presente divulgacibn tambibn pueden combinarse con la regibn codificante de interbs para la expresibn dentro de una gama de organismos hubsped que son susceptibles a transformacibn, o expresibn transitoria, tales como particularmente una planta, insecto o levadura.

Particularmente, tales organismos son plantas, tanto monocotiledbneas como dicotiledbneas, por ejemplo, pero sin limitacibn, malz, plantas de cereal, trigo, cebada, avena, Nicotiana spp, Brassica spp, soja, judla, guisante, alfalfa, patata, tomate, ginseng y Arabidopsis.

10 Los mbtodos para la transformacibn estable, y la regeneracibn de estos organismos se establecen en la tbcnica y se conocen por un experto en la tbcnica. Los mbtodos para obtener plantas transformadas y regeneradas tambibn se conocen bien en la tbcnica.

Por "transformacibn" se refiere a la transferencia interespeclfica estable de informacibn genbtica (secuencia 15 nucleotldica) que se manifiesta genotlpicamente, fenotlpicamente o ambas. La transferencia interespeclfica de informacibn genbtica de una construccibn quimbrica a un hubsped puede ser hereditaria y la transferencia de informacibn genbtica puede considerarse estable, o la transferencia puede ser transitoria y la transferencia de informacibn genbtica no es hereditaria.

20 Pueden usarse mbtodos de expresibn transitoria para expresar las construcciones de la presente divulgacibn (vbase Liu y Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343-348; que se incorpora en el presente documento por referenda). Como alternativa, puede usarse un mbtodo de expresibn transitorio a base de vaclo, como se describe por Kapila y col. 1997 (incorporado en el presente documento por referenda). Estos mbtodos pueden incluir, por ejemplo, pero sin limitadbn, un mbtodo de Agro-inoculacibn o Agro-infiltracibn, sin embargo, tambibn 25 pueden usarse otros mbtodos transitorios como se ha indicado anteriormente. Con la Agro-inoculacibn o Agro- infiltracibn, una mezcla de Agrobacterias que comprende el bcido nucleico deseado entra en los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo las hojas, la porcibn abrea de la planta (incluyendo el tallo, hojas y flores), otra porcibn de la planta (tallo, ralz, flores), o la planta completa. Despubs de cruzar la epidermis, las copias de t- ADN se transfieren e infectan de Agrobacteria a las cblulas. El t-ADN se transcribe de manera episomal y el ARNm 30 se traduce, lo que conduce a la producdbn de la protelna de interbs en cblulas infectadas, sin embargo, el pase de t- ADN dentro del nucleo es transitorio.

4 - Oroanismo hubsped

35 Las VLP de la presente divulgacibn pueden producirse en una cblula hubsped que se caracteriza por carecer de la capacidad de sialilar protelnas, por ejemplo carece de sialidasa, tal como una cblula vegetal, una cblula de insecto, hongos, y otros organismos, incluyendo esponja, coelenterara, anblidos, artrbpodos, moluscos, nematelmintos, troquelmintos, platelmintos, quetognatos, tentaculados, clamidia, espiroquetas, bacterias gram positivas, cianobacterias. arqueobacterias, como se identifican en el glycoforum (vbase, por ejemplo, la URL: 40 glycoforum.gr.jp/science/word/evolution/ES-AOSE. htmI).

Las VLP producidas como se describe en el presente documento no comprenden tlpicamente neuraminidasa (NA). Sin embargo, la NA puede co-expresarse con HA si se desean VLP que comprendan HA y NA.

45 Particularmente, las VLP de la presente divulgacibn pueden producirse en cblulas vegetales, una planta completa o porciones de la misma, tales como la hoja, semillas, o cualquier otra materia de la planta.

Por la expresibn "materia vegetal", se refiere a cualquier material obtenido a partir de una planta. La materia vegetal puede comprender una planta completa, tejido, cblulas, o cualquier fraccibn de la misma. Adembs, la materia vegetal 50 puede comprender componentes de planta intracelulares, componentes de planta extracelulares, extractos llquidos o sblidos de plantas, o una combinacibn de los mismos. Adembs, la materia vegetal puede comprender plantas, cblulas de planta, tejido, un extracto llquido, o una combinacibn de los mismos, de hojas, tallos, flores, frutos, ralces de la planta o una combinacibn de los mismos. La materia vegetal puede comprender una planta o porcibn del mismo que no se ha sometido a ninguna de las etapas de procesamiento. Sin embargo, tambibn se contempla que 55 el material vegetal pueda someterse a las etapas de procesamiento mlnimas como se define a continuacibn, o un procesamiento mbs riguroso, incluyendo la purificacibn de proteina sustancial o parcial usando tbcnicas comunmente conocidas dentro de la tbcnica incluyendo, pero sin limitacibn, cromatografla, electroforesis y similares.

Por la expresibn "procesamiento mlnimo" se refiere a la materia vegetal, por ejemplo, una planta o porcibn de la

misma, que comprende una protelna de interns que se purifica parcialmente para proporcionar un extracto vegetal, homogenado, fraccibn del homogenado vegetal o similares (es decir, mmimamente procesado). La purificacibn parcial puede comprender, pero sin limitacibn, interrumpir las estructuras celulares de la planta creando de esta manera una composicibn que comprende componentes vegetales solubles, y componentes vegetales insolubles, 5 que pueden separarse por ejemplo, pero sin limitacibn, por centrifugacibn, filtracibn o una combinacibn de los mismos. En este sentido, las protefnas secretadas dentro del espacio extracelular de la hoja u otros tejidos pueden obtenerse fbcilmente usando extraccibn de vacio o centrlfuga, o los tejidos pueden extraerse a presibn al pasar a travbs de rodillos o molinos o similares para apretar o liberar la protelna libre dentro del espacio extracelular. El procesamiento mlnimo puede tambibn involucrar la preparacibn de extractos en bruto de protefnas solubles, ya que 10 estas preparaciones tendrbn una contaminacibn insignificante de productos vegetales secundarios. Adembs, el procesamiento mlnimo puede implicar la extraccibn acuosa de protelna soluble de las hojas, seguido de precipitacibn con cualquier sal adecuada. Otros mbtodos pueden incluir maceracibn a gran escala y extraccibn de jugo con objeto de permitir el uso directo del extracto.

15 La materia vegetal, en la forma de material o tejido vegetal puede administrarse por via oral a un sujeto. La materia vegetal se puede administrar como parte de un suplemento dietbtico, junto con otros alimentos, o encapsulada. La materia o tejido vegetal tambibn puede concentrarse para mejorar o incrementar la palatabilidad, o proporcionarse junto con otros materiales, ingredientes, o excipientes farmacbuticos, segun se requiera.

20 Tambibn se consideran parte de esta divulgacibn las plantas transgbnicas, cblulas vegetales o semillas que contienen la construccibn del gen quimbrico de la presente divulgacibn. Los mbtodos para regenerar las plantas completas a partir de cblulas vegetales tambibn se conocen en la tbcnica. En general, las cblulas vegetales transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes selectivos tales como antibibticos, donde los marcadores seleccionados se usan para facilitar la identificacibn de cblulas vegetales transformadas. Una 25 vez que el callo se forma, la formacibn del brote puede fomentarse al emplear las hormonas vegetales apropiadas de acuerdo con mbtodos conocidos y los brotes se transfieren al medio de raiz para regeneracibn de las plantas. Despubs, las plantas pueden usarse para establecer generaciones repetitivas, de semillas o usando tbcnicas de propagacibn vegetativa. Las plantas transgbnicas tambibn pueden generarse sin usar cultivos tisulares.

30 Tambibn se consideran parte de esta divulgacibn las plantas transgbnicas, brboles, levadura, bacterias, hongos, cblulas de insecto y animales que contienen la construccibn del gen quimbrico que comprende un bcido nucleico que codifica HAO recombinante para produccibn de VLP, de acuerdo con la presente divulgacibn.

Se contempla que una planta que comprende la protelna de interbs, o que expresa la VLP que comprende la 35 protelna de interbs, se puede administrar a un sujeto u organismo diana, en una diversidad de formas dependiendo de la necesidad y la situacibn. Por ejemplo, la protelna de interbs obtenida de la planta puede extraerse antes de su uso en una forma cruda, parcialmente purificada o purificada. Si la protelna se va a purificar, entonces puede producirse en plantas comestibles o no comestibles. Adembs, si la protelna se administra por via oral, el tejido vegetal se puede cosechar y suministrarse directamente al sujeto, o el tejido cosechado puede secarse antes de 40 alimentarse, o se puede permitir que un animal paste en la planta sin que se produzca una cosecha previa. Tambibn se considera dentro del alcance de esta divulgacibn que los tejidos vegetales cosechados se proporcionen como un complemento alimenticio en el alimento del animal. Si el tejido vegetal se va a suministrar a un animal con poco o sin procesamiento adicional, se prefiere que el tejido vegetal que se administra sea comestible.

45 El silenciamiento del gen post-transcripcional (PTGS) puede estar implicado en la limitacibn de la expresibn de los transgenes en plantas, y puede usarse la co-expresibn de un supresor de silenciamiento del virus de patata Y (HcPro) para contrarrestar la degradacibn especlfica de ARNm de transgen (Brigneti y col., 1998). Los supresores alternos de silenciamiento se conocen bien en la tbcnica y se pueden usar como se describe en el presente documento (Chiba y col., 2006, Virology 346: 7-14; que se incorpora en el presente documento por referenda), por 50 ejemplo, pero sin limitacibn, TEV-p1/HC-Pro (Virus de grabado del Tabaco-p1/HC-Pro), BYV-p21, p19 de virus del enanismo arbustivo del tomate (TBSV p19), protelna de cbpside del virus de oruga de tomate (TCV-CP), 2b de virus de mosaico de pepino; CMV-2b), p25 del Virus de patata X (PVX-p25), p11 del virus de patata M (PVM-p11), p11 del virus de patata S (PVS-p11), p16 del virus de quemadura de arbndano, (BScV-p16), p23 del virus de la tristeza de los cltricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado con el enrollamiento de parra, (GLRaV-2 p24), p10 del virus A de 55 parra, (GVA-p10), p14 del virus B de parra (GVB-p14), p10 del virus latente de Heracleum (HLV-p10), o p16 del virus latente comun del ajo (GCLV-p16). Por lo tanto, un supresor de silenciamiento, por ejemplo, pero sin limitacibn, HcPro, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV- p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10, puede co-expresarse junto con la secuencia de bcido nucleico que codifica la protelna de interbs para asegurar adembs niveles altos de la produccibn de protelna

en una planta.

Las VLP de virus envueltos generalmente adquieren su envoltura de la membrana que brota a travbs. Las membranas de plasma vegetal tienen un complemento de fitoesterol que puede tener efectos inmunoestimuladores. 5 Para investigar esta posibilidad, las VLP H5 hechas de planta se administraron a animales en presencia de un adyuvante, y se determinb la HAI (respuesta de anticuerpo a la inhibicibn de hemaglutinacibn) (figura 7).

La produccibn de VLP en plantas presenta diversas ventajas sobre la produccibn de estas partlculas en cultivo celular de insecto. Los llpidos vegetales pueden estimular cblulas inmunitarias especlficas y potenciar la respuesta 10 inmunitaria inducida. Las membranas de planta se hacen de llpidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE), y tambibn contienen glicoesfingollpidos que son unicos para las plantas y algunas bacterias y protozoos. Los esfingollpidos son inusuales ya que no son bsteres de glicerol tipo PC o PE pero al contrario consisten en un alcohol amino de cadena larga que forma una ligadura amida para una cadena de bcido graso que contiene mbs de 18 carbonos. La PC y la PE, as! como los glicoesfingollpidos pueden unirse a molbculas CD1 expresadas por cblulas 15 inmunitarias de mamlfero, tales como cblulas que presentan antlgeno (APC) tipo cblulas dentrlticas y macrbfagos y otras cblulas, incluyendo linfocitos B y T en el timo e hlgado (Tsuji M,. 2006). Por otra parte, adembs del efecto adyuvante potencial de la presencia de los llpidos vegetales, la capacidad de N-glicanos para facilitar la captura de antlgenos de glicoprotelna por cblulas que presentan antlgeno (Saint-Jore-Dupas, 2007), puede ver ventajosa de la produccibn de VLP en plantas.

20

Sin desear quedar ligado a la teorla, se anticipa que las VLP hechas de planta inducirbn una reacci6n inmunitaria mbs fuerte que las VLP hechas en otros sistemas de produccibn/fabricacibn y que la reaccibn inmunitaria inducida por estas VLP hechas de planta serb mbs fuerte cuando se compara con la reaccibn inmunitaria inducida por vacunas de virus completos vivos o atenuados.

25

Al contrario que las vacunas hechas de virus completos, las VLP proporcionan la ventaja de que no son infecciosas, por lo tanto la contencibn biolbgica restrictiva no es tan importante como al trabajar con un virus infeccioso completo, y no se requiere para produccibn. Las VLP hechas de planta proporcionan una ventaja adicional de nuevo permitiendo que el sistema de expresibn crezca en un invernadero o campo, siendo de esta manera 30 significativamente mbs econbmicas y adecuadas a gran escala.

Adicionalmente, las plantas no comprenden las enzimas involucradas en la sintetizacibn y agregacibn de residuos de bcido siblico a las protelnas. Las VLP pueden producirse en ausencia de neuraminidasa (NA), y no necesitan co- expresar la NA, o tratar las cblulas producidas o extraerse con sialidasa (neuraminidasa), para asegurar la 35 produccibn de VLP en plantas.

Particularmente, las VLP producidas de acuerdo con la presente invencibn no comprenden la proteina M1 que se sabe que se une al ARN. El ARN es un contaminante de la preparacibn VLP y no se desea cuando se obtiene la aprobacibn reguladora para el producto VLP para su uso como una vacuna humana.

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5 - Acidos nucleicos

La presente divulgacibn proporciona un bcido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica que codifica un antlgeno de hemaglutinina (HA) del virus de influenza, operativamente ligado a una regibn reguladora activa en un 45 organismo hubsped sin sialilacibn.

La presente divulgacibn describe, pero sin limitacibn, la clonacibn de un bcido nucleico que codifica HA, por ejemplo, pero sin limitacibn, una HA del virus de influenza A humana en un vector de expresibn hubsped, y la produccibn de VLP de influenza del hubsped, adecuada para produccibn de vacunas. Las VLP tambibn pueden usarse para 50 producir reactivos compuestos por protelnas estructurales de influenza recombinante que se auto-ensamblan en estructuras de proteinas macromoleculares homotlpicas funcionales e inmunbgenas, incluyendo partlculas de influenza subvlricas y VLP de influenza, en cblulas hubsped transformadas, por ejemplo cblulas vegetales o cblulas de insecto.

55 La presente invencibn tambibn incluye las secuencias nucleotldicas H1 (codificada por la SEQ ID NO: 1), H2 (codificada por la SEQ ID NO: 2), H3 (codificada por la SEQ ID NO: 3), H4 (codificada por la SEQ ID NO: 4), H5 (codificada por la SEQ ID NO: 5), H6 (codificada por la SEQ ID NO: 6), H7 (codificada por la SEQ ID NO: 7), H8 (codificada por la SEQ ID NO. 8), H9 (codificada por la SEQ ID NO: 9), H10 (codificada por la SEQ ID NO. 10), H11 (codificada por la SEQ ID NO: 11), H12 (codificada por la SEQ ID NO: 12), H13 (codificada por la SEQ ID NO: 13),

H14 (codificada por la SEQ ID NO: 14), H15 (codificada por la SEQ ID NO: 15), y H16 (codificada por la SEQ ID NO:

16).

Particularmente, la presente divulgacibn incluye las secuencias nucleotldicas SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID 5 NO: 7 que codifican HA de H1, H5 o H7 respectivamente; una secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, que hibrida en condiciones de hibridacibn rigurosas con respecto a un bcido nucleico que codifica la HA de H1, H5 o H7, respectivamente: o una secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, que hibrida en condiciones de hibridacibn rigurosas con respecto a un complemento de un bcido nucleico que codifica la HA de H1, H5 o H7 respectivamente; donde la secuencia nucleotldica codifica una protelna de 10 hemaglutinina que, al expresarse, forma una VLP, y que la VLP induce la produccibn de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresibn de la secuencia nucleotldica dentro de una cblula hubsped forma una VLP, y la VLP se puede usar para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a HA, incluyendo HA madura, HAO, HA1 o HA2. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria.

15 La hibridacibn en condiciones de hibridacibn rigurosas se conoce en la tbcnica (vbase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds. 1995 y complementos; Maniatis y col., en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook y Russell, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicibn 2001; cada uno de las cuales se incorpora en el presente documento por referenda). Un ejemplo de tales condiciones de hibridacibn rigurosas puede ser aproximadamente 16-20 horas de hibridacibn en 4 x SSC a 20 65 °C seguido de lavado en 0,1 x SSC a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en 0,1 x SSC a 65 °C, cada uno durante 20 o 30 minutos. Como alternativa, una condicion de hibridacibn rigurosa ejemplar puede ser durante la noche (16-20 horas) en formamida al 50 %, 4 x SSC a 42 °C, seguido de lavado en 0,1 x SSC a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en 0,1 x SSC a 65 °C cada uno durante 20 o 30 minutos, o durante la noche (16-20 horas), o hibridacibn en tampbn fosfato acuoso Church (SDS al 7 %; tampbn de NaP04 0,5 M pH 7,2; EDTA 10 mM) a 65 °C, 25 con 2 lavados a 50 °C en 0,1 x SSC, SDS al 0,1 % durante 20 o 30 minutos cada uno, o 2 lavados a 65 °C en 2 x SSC, SDS al durante 20 o 30 minutos cada uno.

Adicionalmente, la presente divulgacibn incluye secuencias nucleotldicas que se caracterizan por tener aproximadamente el 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % o cualquier cantidad entre las 30 mismas, de identidad de secuencia, o similitud de secuencia, con la secuencia nucleotldica que codifican HA de H1 (SEQ ID NO: 1), H5 (SEQ ID NO: 5) o H7 (SEQ ID NO: 7), donde la secuencia nucleotldica codifica una protelna de hemaglutinina que, al expresarse, forma una VLP, y que la VLP induce la produccibn de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresibn de la secuencia nucleotldica en una cblula vegetal forma una VLP, y la VLP se puede usar para producir un anticuerpo que es capaz de enlazar HA, incluyendo HA madura, HAO, HA1, o HA2. La VLP, cuando se 35 administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria.

La identidad de secuencia o similitud de secuencia puede determinarse usando un programa de comparacibn de secuencias nucleotldicas, tal como el que se proporciona dentro de DNASIS (por ejemplo, usando, pero sin limitacibn, los siguientes parbmetros: penalizacibn por huecos 5, #de diagonales superiores 5, penalizacibn por 40 hueco fijo 10, k-tupla 2, hueco flotante 10, y tamano de la ventana 5). Sin embargo, se conocen bien en la tbcnica otros mbtodos de alineacibn de secuencias para comparacibn, por ejemplo, los algoritmos de Smith y Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482), Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), Pearson y Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444), y por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y BLAST), o por alineacibn manual e inspeccibn visual.

45

Por lo tanto, la presente divulgacibn incluye adembs un vector adecuado que comprende la construccibn quimbrica adecuada para su uso con sistemas de expresibn estables o transitorios. La informacibn genbtica tambibn puede proporcionarse dentro de una o mbs de una construccibn. Por ejemplo, una secuencia nucleotldica que codifica una protelna de interbs puede introducirse en una construccibn, y una segunda secuencia nucleotldica que codifica una 50 protelna que modifica la glicosilacibn de la protelna de interbs puede introducirse usando una construccibn separada. Estas secuencias nucleotldicas despubs pueden co-expresarse en un hubsped. Sin embargo, tambibn puede usarse una construccibn que comprende una secuencia nucleotldica que codifica tanto la protelna de interbs como la protelna que modifica el perfil de glicosilacibn de la protelna de interbs. En este caso, la secuencia nucleotldica debe comprender una primera secuencia que comprende una primera secuencia de bcido nucleico que 55 codifica la protelna de interbs operativamente ligada a una regibn promotora o reguladora, y una segunda secuencia que comprende una segunda secuencia de bcido nucleico que codifica la protelna que modifica el perfil de glicosilacibn de la protelna de interbs, la segunda secuencia operativamente ligada a una regibn promotoras o reguladora.

Por "co-expresado" significa que dos, o mbs de dos, secuencias nucleotldicas se expresan aproximadamente al mismo tiempo en el hubsped, y en el mismo tejido del hubsped. Sin embargo, las secuencias nucleotldicas no necesitan expresarse exactamente al mismo tiempo. Al contrario, las dos o mbs secuencias nucleotldicas se expresan de una manera tal que los productos codificados tienen una oportunidad de interactuar. Por ejemplo, la 5 protelna que modifica la glicosilacibn de la protelna de interns puede expresarse antes o durante el periodo en el que la protelna de interns se expresa de manera que la modificacibn de la glicosilacibn de la protelna de interbs se produzca. Las dos o mbs de dos secuencias nucleotldicas pueden co-expresarse usando un sistema de expresibn transitorio, donde las dos o mbs secuencias se introducen en el hubsped aproximadamente al mismo tiempo en condiciones que ambas secuencias se expresan. Como alternativa, un hubsped de plataforma comprende una de 10 las secuencias de nuclebtido, por ejemplo la secuencia que codifica la protelna que modifica el perfil de glicosilacibn de la protelna de interbs, puede transformarse, ya sea transitoriamente o en una manera estable, con una secuencia adicional que codifica la protelna de interbs. En este caso, la secuencia que codifica la protelna que modifica el perfil de glicosilacibn de la protelna de interbs puede expresarse dentro de un tejido deseado, durante una etapa deseada de desarrollo, o su expresibn puede inducirse usando un promotor inducible, y la secuencia adicional que codifica la 15 protelna de interbs puede expresarse en condiciones similares y en el mismo tejido, para asegurar que las secuencias nucleotldicas se co-expresan.

Las construcciones de la presente invencibn pueden introducirse en las cblulas vegetales usando plbsmidos Ti, plbsmidos Ri, vectores del virus vegetales, transformacibn de ADN directa, microinyeccibn, electroporacibn, etc. Para 20 revisiones de tales tbcnicas, vbase, por ejemplo Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, Nueva York VIII, pbgs. 421-463 (1988); Geierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2a Ed. (1988); y Miki e Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2a Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebvre, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. Londres, pbgs. 561-579 (1997). Otros mbtodos incluyen la captacibn de ADN directa, el uso de liposomas, electroporacibn, por ejemplo, usando protoplastos, microinyeccibn, 25 microproyectiles o triquitas, e infiltracibn al vaclo. Vbanse, por ejemplo, Bilang, y col. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid y col. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche y col. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause y col. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein y col., Nature 327: 70-73 (1987); Howell y col. (Science 208: 1265, 1980), Horsch y col. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock y col., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular 30 Biology (Schuler y Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu y Lomonossoff (J. Virol Meth, 105: 343-348, 2002), las Pat. de Estados Unidos n.° 4.945.050; 5.036.006; y 5.100.792, las solicitudes de patente de Estados Unidos n.° de Ser. 08/438.666, presentada el 10 de mayo de 1995, y 07/951.715, presentada el 15 de sept, de 1992 (cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referenda).

35 Por "regibn reguladora" "elemento regulador" o "promotor" se refiere a una porcibn de bcido nucleico tipicamente, pero no siempre, aguas arriba de la regibn que codifica la protelna de un gen, que puede estar compuesto por ADN o ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando una regibn reguladora estb activa, y en asodacibn operativa, u operativamente ligada, con un gen de interbs, esto puede dar como resultado la expresibn del gen de interbs. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad del brgano, o controlar el desarrollo o activacibn del 40 gen temporal. Una "regibn reguladora" incluye elementos promotores, elementos promotores del nucleo que muestran una actividad promotora inicial, elementos que pueden inducirse en respuesta a un estlmulo externo, elementos que median la actividad promotora, tales como elementos reguladores negativos o potenciadores transcripcionales. La "regibn reguladora", como se usa en el presente documento, tambibn incluye elementos que son activos despubs de la transcripcibn, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresibn del gen tales 45 como potenciadores traduccionales y transcripcionales, represores traduccionales y transcripcionales, secuencias de activacibn aguas arriba, y determinantes de inestabilidad de ARNm. Varios de estos ultimos elementos pueden localizarse prbximos a la regibn codificante.

En el contexto de esta divulgacibn, la expresibn "elemento regulador" o "regibn reguladora" tipicamente se refiere a 50 una secuencia de ADN, normalmente, pero no siempre, aguas arriba (5') a la secuencia codificante de un gen estructural, que controla la expresibn de la regibn codificante proporcionando el reconocimiento de la polimerasa de ARN y/u otros factores requeridos para iniciar la transcripcibn en un sitio particular. Sin embargo, se entiende que otras secuencias nucleotldicas, localizadas en los intrones, o 3' de la secuencia tambibn, pueden contribuir a la regulacibn de expresibn de una regibn codificante de interbs. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona 55 el reconocimiento de la ARN polimerasa u otros factores transcripcionales para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayorla, pero no todos, los elementos promotores eucaribticos contienen una caja TATA, una secuencia de bcido nucleico conservada compuesta por pares de bases de nuclebtidos de adenosina y timidina normalmente situados aproximadamente 25 pares de bases aguas arriba de un sitio de inicio transcripcional. Un elemento promotor comprende un elemento promotor inicial, responsable del inicio de

transcripcibn, as! como otros elementos reguladores (como se ha enumerado anteriormente) que modifican la expresibn gbnica.

Existen varios tipos de regiones reguladoras, incluyendo las que se regulan de manera desarrollada, inducibles o 5 constitutivas. Una regibn reguladora que se regula de manera desarrollada, o controla la expresibn diferencial de un gen bajo su control, se activa en ciertos brganos o tejidos de un brgano en momentos especlficos durante el desarrollo de tal brgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que se regulan de manera desarrollada pueden activarse preferiblemente en ciertos brganos o tejidos en fases de desarrollo especlficas, que tambibn pueden activarse en una manera regulada de manera desarrollada, o en un nivel basal en otros brganos o tejidos en 10 la planta tambibn. Los ejemplos de regiones reguladoras especlficas de tejido, por ejemplo, vbase una regibn reguladora especlfica, incluyen el promotor napina, y el promotor cruciferina (Rask y col., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau y col., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Un ejemplo de un promotor especifico de hoja incluye el promotor plastocianina (figura 3; US 7.125.978, que se incorpora en el presente documento por referenda).

15 Una regibn reguladora inducible es una que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripcibn de una o mbs secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o genes no se transcribirbn. Tlpicamente, el factor de protelna que se une especlficamente a una regibn reguladora inducible para activar la transcripcibn puede estar presente en una forma inactiva, que despubs se convertla directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor de protelna tambibn puede estar ausente. 20 El Inductor puede ser un agente qulmico tal como una protelna, metabolito, regulador del crecimiento, herbicida o compuesto fenblico o una tensibn fisiolbgica impuesta directamente por calor, frlo, sal, o elementos tbxicos o indirectamente a travbs de la accibn de un patbgeno o agente de enfermedad, tal como un virus. Una cblula vegetal que contiene una regibn reguladora inducible puede exponerse a un inductor aplicando externamente el inductor a la cblula o planta tal como por pulverizacibn, riego, calentamiento o similares. Los elementos reguladores inducible 25 pueden obtenerse a partir de genes vegetales o no vegetales (por ejemplo Gatz, C. y Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; que se incorpora por referenda). Los ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen, pero sin limitacibn, un promotor inducible por tetraciclina (Gatz, C, 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; que se incorpora por referenda), un promotor inducible por esteroides (Aoyama, T. y Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 397-404; que se incorpora por referenda) y un promotor inducible por etanol (Salter, M. G., y col., 1998, Plant 30 Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., y col.,1998, Nature Biotech. 16, 177-180, que se incorporan por referenda), genes IB6y CKI1 inducibles por citoquinina (Brandstatter, I. y Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985; que se incorporan por referenda), y el elemento inducible por auxina, DR5 (Ulmasov, T., y col., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; que se incorpora por referenda).

35 Una regibn reguladora constitutiva dirige la expresibn de un gen a travbs de las diversas partes de una planta y continuamente a lo largo del desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluyen promotores asociados con la transcripcibn CaMV 35S. (Odell y col., 1985, Nature, 313: 810-812), la actina 1 de arroz (Zhang y col., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An y col., 1996, Plant J., 10: 107-121), o tms 2 (US 5.428.147, que se incorpora en el presente documento por referenda), y genes de triosefosfato isomerasa 1 (Xu y 40 col., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), el gen de ubiquitina 1 de malz (Cornejo y col., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), los genes de Arabidopsis ubiquitina 1 y 6 (Holtorf y col., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), y el gen del factor 4A de inicio de traduccibn del tabaco (Mandel y col., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004). El tbrmino "constitutiva" como se usa en el presente documento, no necesariamente indica que un gen bajo control de la regibn reguladora constitutiva se expresa en el mismo nivel en todos los tipos de cblulas, sino que el gen se expresa en una 45 amplia gama de tipos de cblulas, aunque a menudo se observa variacibn en abundancia.

Por "ligada operativamente" significa que las secuencias particulares, por ejemplo un elemento regulador y una regibn codificante de interbs, interactuan directa o indirectamente para realizar una funcibn pretendida, tal como la mediacibn o modulacibn de la expresibn gbnica. La interaccibn de secuencias ligadas operativamente puede, por 50 ejemplo, mediarse por protelnas que interactuan con las secuencias ligadas operativamente.

La una o mbs de una secuencia nucleotldica de la presente divulgacibn puede expresarse en cualquier hubsped vegetal apropiado que se transforma por la secuencia nucleotldica, o construcciones, o vectores de la presente invencibn. Los ejemplos de hubspedes apropiados incluyen, pero sin limitacibn, cultivos agricolas, incluyendo alfalfa, 55 canola, Brassica spp., malz, Nicotiana spp., alfalfa, patata, ginseng, guisante, avena, arroz, semilla de soja, trigo, cebada, girasol, algodbn y similares.

La una o mbs construcciones genbticas quimbricas de la presente divulgacibn pueden comprender adembs una regibn no traducida 3'. Una regibn no traducida 3' se refiere a esa porcibn de un gen que comprende un segmento de

ADN que contiene una seflal de poliadenilacibn y cualquier otra seflal regulador capaz de realizar un procesamiento de ARNm o la expresibn gbnica. La serial de poliadenilacibn se caracteriza normalmente realizando la adicibn de pistas de bcido poliadenllico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las seflales de poliadenilacibn se reconocen comunmente por la presencia de homologla con respecto a la forma canbnica 5' AATAAA-3', aunque las variaciones 5 no son poco frecuentes. Una o mbs de las construcciones genbticas quimbricas de la presente divulgacibn tambibn pueden incluir potenciadores adicionales, potenciadores de traduccibn o transcripcibn, segOn se requiera. Estas regiones potenciadoras se conocen bien por los expertos en la tbcnica, y pueden incluir el codbn de inicio ATG y secuencias adyacentes. El codbn de inicio deberb estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante para asegurar la traduccibn de la secuencia completa.

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Los ejemplos no limitantes de regiones 3' apropiadas son las regiones no traducidas transcritas 3' que contienen una seflal de genes plasmldicos que inducen tumor (Ti) de Agrobacterium (Ti), tales como los genes de nopalina sintasa (gen Nos) y genes vegetales, tal como los genes de protelna de almacenamiento de soja, la subunidad pequefta del gen de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO; US 4.962.028; que se incorpora en el presente documento 15 por referenda), el promotor usado en la expresibn de plastocianina (Pwee y Gray 1993; que se incorpora en el presente documento por referenda). Un ejemplo de un promotor de plastocianina se describe en el documento US 7.125.978 (que se incorpora en el presente documento por referenda).

Como se describe en el presente documento, se ha descubierto que los promotores que comprenden secuencias 20 potenciadoras con eficiencia demostrada en la expresibn en hoja, son eficaces en la expresibn transitoria. Sin desear quedar ligando por la teorla, la unibn de elementos reguladores aguas arriba de un gen fotosintbtico por la unibn a la matriz nuclear puede mediar una expresibn fuerte. Por ejemplo hasta -784 del sitio de inicio de traduccibn del gen de plastocianina de guisante se pueden usar para mediar una expresibn del gen reportero fuerte.

25 El uso de una regibn reguladora de un gen fotosintbtico, por ejemplo, pero sin limitacibn, una region reguladora de plastocianina (US 7.125.978; que se incorpora en el presente documento por referenda), o una regibn reguladora obtenida de Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO; US 4.962.028; que se incorpora en el presente documento por referenda), protelna de unibn a clorofila a/b (CAB; Leutwiler y col.; 1986; que se incorpora en el presente documento por referenda), ST-LSI (asociado al complejo de desprendimiento de oxlgeno del fotosistema II, 30 Stockhaus y col. 1989; que se incorpora en el presente documento por referenda), se pueden usar de acuerdo con la presente divulgacibn.

Para facilitar la identificacibn de cblulas vegetales transformadas, las construcciones de esta divulgacibn pueden manipularse adembs para incluir marcadores seleccionables de plantas. Los marcadores seleccionables utiles 35 incluyen enzimas que proporcionan resistencia a productos qulmicos tales como un antibibtico, por ejemplo, gentamicina, higromicina, canamicina, o herbicidas tales como fosfinotridna, glifosato, clorosulfuro, y similares. De manera similar, pueden usarse enzimas que proporcionan la producdbn de un compuesto que puede identificarse por un cambio de color, tal como GUS (beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP.

40 Las copias de ADNc resultantes de estos genes pueden donarse en un vector de expresibn adecuado segun se requiera por el sistema de expresibn hubsped. Los ejemplos de vectores de expresibn apropiados para plantas se describen a continuacibn, como altemativa, puede usarse un vector de expresibn de baculovirus, por ejemplo, pFastBacI (InVitrogen), que da como resultado plbsmidos basados en pFastBacI, usando mbtodos conocidos, e informacibn proporcionada por las instrucciones del fabricante.

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La presente divulgacibn se dirige adicionalmente a una construccibn gbnica que comprende un bcido nudeico que codifica HA, como se ha descrito anteriormente, operativamente ligado a un elemento regulador que es operativo en una planta. Los ejemplos de elementos reguladores operativos en una cblula vegetal y que se pueden usar de acuerdo con la presente divulgacibn incluyen, pero sin limitacibn, una regibn reguladora de plastocianina (US 7.125- 50 978; que se incorpora en el presente documento por referenda), o una regibn reguladora obtenida de Ribulosa 1,5- bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO; US 4.962.028; que se incorpora en el presente documento por referenda), protelna de unibn a dorofila a/b (CAB; Leutwiler y col.; 1986; que se incorpora en el presente documento por referenda), ST-LS1 (asociado al complejo que desprende oxlgeno del fotosistema II, Stockhaus y col. 1989; que se incorpora en el presente documento por referenda). Si la construccibn se expresa en una cblula de insecto, los 55 ejemplos de elementos reguladores operativos en una cblula de insecto induyen, pero sin limitacibn, el promotor de poliedro, el promotor gp64 y similares.

La presente divulgacibn proporciona adidonalmente la clonacibn de un bcido nudeico que codifica una HA, por ejemplo, pero sin limitacibn, el virus HA de influenza humana A/lndonesia/5/05 (H5N1) en un vector de expresibn

vegetal, de levadura o insecto (por ejemplo, un vector de expresibn de baculovirus) y la produccibn de reactivos o candidates de la vacuna de influenza compuestos por protelnas estructurales de influenza recombinante que se auto-ensamblan en estructuras de protelna macromoleculares homotlpicas inmunbgenas y funcionales, incluyendo partlculas de influenza subvlricas y VLP de influenza, en cblulas vegetales transformadas o cblulas de insecto 5 transformadas.

El bcido nucleico que codifica la HA, por ejemplo, pero sin limitacibn, un virus HA de influenza humana A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), o el gen del virus HA de influenza humana A/lndonesia/5/05 pueden expresarse, por ejemplo, usando un sistema de expresibn de baculovirus en una llnea celular apropiada, por ejemplo, cblulas de 10 Spodoptera frugiperda (por ejemplo, llnea celular Sf-9; ATCC PTA-4047). Tambibn pueden usarse otras llneas de cblula de insecto.

El bcido nucleico que codifica la HA puede expresarse, como alternativa, en una cblula vegetal, o en una planta. El bcido nucleico que codifica HA puede sintetizarse por transcripcibn inversa y reaccibn en cadena de la polimerasa 15 (PCR) usando ARN de HA. Como un ejemplo, el ARN puede aislarse de virus de influenza humana A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) o el virus de influenza humana A/lndonesia/5/05 (H5N1), o de cblulas infectadas con un virus de influenza. Para la transcripcibn inversa y PCR, pueden usarse cebadores oligonucleotldicos especlficos para ARN de HA, por ejemplo, pero sin limitacibn, genes HA del virus de influenza humana A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) o genes HAO del virus de influenza humana A/lndonesia/5/05 (H5N1). Adicionalmente, el 20 bcido nucleico que codifica HA puede sintetizarse qulmicamente usando mbtodos como se conocerbn por un experto en la tecnica.

6 - Protelnas

25 La presente divulgacibn tambibn incluye una o mbs de una protelna HA codificada por las secuencias nucleotldicas SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7 (que codifican HA de H1, H5 o H7, respectivamente), una secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, que hibrida en condiciones de hibridacibn rigurosas en un bcido nucleico que codifica la HA de H1, H5 o H7, respectivamente, o una secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, que hibrida en condiciones de hibridacibn rigurosas para proporcionar un bcido 30 nucleico que codifica la HA de H1, H5 o H7, respectivamente, donde la secuencia nucleotldica codifica una protelna de hemaglutinina que, al expresarse, forma una VLP, y que la VLP incluye la produccibn de un anticuerpo.

De manera similar, la presente divulgacibn incluye HA asociadas a los siguientes subtipos H1 (codificado por la SEQ ID NO: 1), H2 (codificado por la SEQ ID NO: 2), H3 (codificado por la SEQ ID NO: 3), H4 (codificado por la SEQ ID 35 NO: 4), H5 (codificado por la SEQ ID NO: 5), H6 (codificado por la SEQ ID NO: 6), H7 (codificado por la SEQ ID NO: 7), H8 (codificado por la SEQ ID NO: 8), H9 (codificado por la SEQ ID NO: 9), H10 (codificado por la SEQ ID NO: 10), H11 (codificado por la SEQ ID NO: 11), H12 (codificado por la SEQ ID NO: 12), H13 (codificado por la SEQ ID NO: 13), H14 (codificado por la SEQ ID NO: 14), H15 (codificado por la SEQ ID NO: 15), H16 (codificado por la SEQ ID NO: 16) ; y secuencias nucleotldicas que se caracterizan por tener de aproximadamente el 60 al 100 % o 40 cualquier cantidad entre la misma de identidad de secuencia, particularmente de aproximadamente el 70 al 100 % de homologla o cualquier cantidad entre la misma, del 80 al 100 % o cualquier cantidad entre la misma, el 90-100 % o cualquier cantidad entre la misma, o el 95-100 % o cualquier cantidad entre la misma, de identidad de secuencia con H1 (SEQ ID NO: 1), H2 (SEQ ID NO: 2), H3 (SEQ ID NO: 3), H4 (SEQ ID NO: 4), H5 (SEQ ID NO: 5), H6 (SEQ ID NO: 6), H7 (SEQ ID NO. 7), H8 (SEQ ID NO: 8), H9 (SEQ ID NO: 9), H10 (SEQ ID NO: 10), H11 (SEQ ID NO: 45 11), H12 (SEQ ID NO: 12), H13 (SEQ ID NO: 13), H14 (SEQ ID NO: 14), H15 (SEQ ID NO: 15), H16 (SEQ ID NO: 16), donde la secuencia nucleotldica codifica una protelna de hemaglutinina que, al expresarse, forma una VLP, y que la VLP induce la produccibn de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresibn de la secuencia nucleotldica en una cblula vegetal forma una VLP, y la VLP se puede usar para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a HA, incluyendo HA madura, HAO, HA1, o HA2. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta 50 inmunitaria.

7-VLP

Por lo tanto, la presente divulgacibn se refiere a una VLP que comprende uno o mbs de un tipo o subtipo de HA.

55

La expresibn "partlcula pseudovlrica" (VLP), o "partlculas pseudovlricas" o ’VLP" se refiere a estructuras que se auto-ensamblan y comprenden protelnas estructurales tales como protelna HA de influenza. Las VLP generalmente son morfolbgica y antigbnicamente similares a los viriones producidos en una infeccibn, pero carecen de informacibn genbtica suficiente para replicarse y, por lo tanto, no son infecciosas. En algunos ejemplos, las VLP pueden

comprender una unica especie de protelna, o mbs de una especie de protelna. Para las VLP que comprenden mbs de una especie de protelna, la especie de protelna puede ser de la misma especie del virus, o puede comprender una protelna de una especie, gbnero, subfamilia o familia diferente del virus (como se designa por la nomenclatura ICTV). En otros ejemplos, una o mbs de la especie de protelna que comprende una VLP se puede modificar de la 5 secuencia de origen natural. Las VLP pueden producirse en cblulas hubsped adecuadas, incluyendo cblulas hubsped vegetales y de insecto. Despubs de la extraccibn de la cblula hubsped y tras el aislamiento y la purificacibn adicional en las condiciones adecuadas, las VLP se pueden purificar como estructuras intactas.

La divulgacibn tambibn incluye, pero sin limitacibn, VLP derivadas de influenza que obtienen una envoltura lipldica 10 de la membrana plasmbtica celular, en la que se expresan las protelnas VLP. Por ejemplo, si la VLP se expresa en un sistema basado en planta, la VLP puede obtener una envoltura lipldica de la membrana plasmbtica de la cblula.

Generalmente, el tbrmino "llpido" se refiere a las molbculas de origen natural y solubles en grasa (lipbfilas). El tbrmino tambibn se usa mbs especlficamente para referirse a bcidos grasos y sus derivados (incluyendo tri, di, y 15 monoglicbridos y fosfollpidos), as! como otros metabolitos o esteroles que contienen esterol soluble en grasa. Los fosfollpidos son un componente principal de todas las membranas biolbgicas, junto con los glicollpidos, estereoles y protelnas. Los ejemplos de fosfollpidos incluyen fosfatidil etanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, y similares. Los ejemplos de esteroles incluyen zooesteroles (por ejemplo, colesterol) y fitoesteroles. Se han identificado mbs de 200 fitoesteroles en diversas especies de planta, siendo las mbs comunes campesterol, 20 estigmaesterol, ergoesterol, brasicaesterol, delta-7-estigmaesterol, delta-7-avenaesterol, daunoesterol, sitoesterol, 24-metilcolesterol, colesterol o beta-sitoesterol. Como entenderb un experto en la tbcnica, la composicibn lipldica de la membrana plasmbtica de una cblula puede variar con el cultivo o las condiciones de credmiento de la cblula u organismo del que se obtiene la cblula.

25 Las membranas celulares comprenden generalmente bicapas lipldicas, as! como protelnas para diversas funciones. Las concentraciones localizadas de llpidos particulares pueden encontrarse en la bicapa lipldica, denominada como "balsas lipldicas". Sin desear quedar ligado a la teorla, las balsas lipldicas pueden tener funciones importantes en la endo y exocitosis, la entrada o egreso de virus u otros agentes infecdosos, transduccibn de serial de inter-cblula, la interaccibn con otros componentes estructurales de la cblula u organismo, tales como matrices intracelulares y 30 extracelulares.

Las VLP producidas de protelnas derivadas de influenza, de acuerdo con la presente divulgacibn no comprenden la protelna M1. Se conocen la protelna M1 para unirse a ARN (Wakefield y Brownlee, 1989) que es un contaminante de la preparacibn de VLP. La presencia de ARN es indeseada cuando se obtiene la aprobacibn reguladora para el 35 producto VLP, por lo tanto, puede ser ventajosa una preparacibn VLP que carezca de ARN.

Una VLP producida en una planta de acuerdo con algunos aspectos de la divulgacibn puede complejarse con llpidos obtenidos de plantas. La VLP puede comprender un pbptido HA0, HA1 o HA2 o combinaciones de los mismos. Los llpidos obtenidos de plantas pueden estar en la forma de una bicapa lipldica, y pueden comprender adembs una 40 envoltura que rodea la VLP. Los llpidos obtenidos de plantas pueden comprender componentes lipldicos de la membrana plasmbtica vegetal, donde la VLP se produce, incluyendo, y uno o mbs de un llpido derivado de plantas, por ejemplo, pero sin limitacibn, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), glicoesfingollpidos, fitoesteroles o una combinacibn de los mismos. Un llpido derivado de plantas puede denominarse, como alternativa, como un "llpido vegetal".

45

En las plantas, las VLP de influenza brotan de la membrana plasmbtica, por lo tanto la composicibn lipldica de las VLP refleja su origen. Las VLP producidas de acuerdo con la presente divulgacibn comprenden HA, en complejo con llpidos derivados de plantas. Los llpidos vegetales pueden estimular cblulas inmunitarias especlficas y potenciar la respuesta inmunitaria inducida. Las membranas vegetales se hacen de llpidos, fosfatidilcolina (PC) y 50 fosfatidiletanolamina (PE), y tambibn contienen glicoesfingollpidos, saponinas, y fitoesteroles. Adicionalmente, tambibn se encuentran balsas lipldicas en las membranas plasmbticas vegetales - estos microdominios se enriquecen con esfingollpidos y esteroles. En las plantas, se sabe que se produce una diversas de fitoesteroles, incluyendo estigmaesterol, sitoesterol, 24-metilcolesterol y colesterol (Mongrand y col., 2004).

55 La PC y PE, as! como los glicoesfingollpidos pueden unirse a molbculas CD1 expresadas por cblulas inmunitarias de mamlfero, tales como cblulas que presentan antlgeno (APC) tipo cblulas dendrlticas y macrbfagos y otras cblulas, incluyendo linfocitos B y T en el timo e hlgado (Tsuji M,. 2006). Las molbculas CD1 son estructuralmente similares a las molbculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I y su papel es presentar los antlgenos de glicollpido a cblulas NKT (linfocitos T asesinos naturales). Tras la activacibn, las cblulas NKT activan las cblulas

inmunitarias innatas, tales como las cblulas NK y las cblulas dendrlticas, y tambibn activan cblulas inmunitarias adaptativas como los linfocitos T y linfocitos B que producen el anticuerpo.

Pueden encontrarse una variedad de fitoesteroles en una membrana plasmbtica - el complement especifico puede 5 variar dependiendo de la especie, las condiciones de crecimiento, los recursos de nutrientes o el estado del patbgeno, por nombrar unos pocos factores. Generalmente, la beta-sitoesterol es el fitoesterol mbs abundante.

Los fitoesteroles presentes en una VLP de influenza formada en complejo con una bicapa lipldica, tal como una envoltura obtenida de la membrana plasmbtica puede proporcionar para una composicibn de vacuna ventajosa. Sin 10 desear quedar ligando por la teorla, las VLP hechas de plantas en complejo con una bicapa lipldica, tal como una envoltura obtenida de la membrana plasmbtica, puede inducir una reaccibn inmunitaria mbs fuerte que las VLP hechas en otros sistemas de expresibn, y puede ser similar a la reaccibn inmunitaria inducida por vacunas de virus completos vivas o atenuadas.

15 Por lo tanto, en algunas realizaciones, la divulgacibn proporciona una VLP en complejo con una bicapa lipldica derivada de plantas. En algunas realizaciones, la bicapa lipldica derivada de plantas puede comprender la envoltura de la VLP.

8 - Composicibn

20

Por lo tanto, la presente divulgacibn proporciona una composicibn que comprende una dosis eficaz de una VLP que comprende una protelna HA de virus de influenza, uno o mbs de un llpido vegetal, y un vehlculo farmacbuticamente aceptable. La protelna HA del virus de influenza puede ser H5 Indonesia. Tambibn se proporciona un mbtodo para inducir inmunidad a una infeccibn por virus de influenza en un sujeto. El mbtodo comprende administrar la partlcula 25 pseudovlrica que comprende una protelna HA de virus de influenza, uno o mbs de un llpido vegetal, y un vehlculo farmacbuticamente aceptable. La partlcula pseudovlrica se puede administrar a un sujeto por via oral, intradbrmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutbnea.

9 - Mbtodo de tratamiento

30

La presente divulgacibn proporciona un mbtodo para inducir inmunidad o "provocar una respuesta inmunitaria" a una infeccibn de virus de influenza en un sujeto, el mbtodo comprende administrar la composicibn como se define en el presente documento.

35 Una "respuesta inmunitaria" se refiere generalmente a una respuesta del sistema inmunitario adaptativo. El sistema inmunitario adaptativo generalmente comprende una respuesta humoral, y una respuesta mediada por cblulas. La respuesta humoral es el aspecto de inmunidad que estb mediado por anticuerpos secretados, producidos en las cblulas del linaje de linfocito B (cblula B). Los anticuerpos secretados se unen a antlgenos en las superficies de microbios invasores (tales como virus o bacterias), que los marcan para la destruccibn. La inmunidad humoral se usa 40 generalmente para referirse a la produccibn de anticuerpo y los procesos que lo acompaflan, as! como las funciones efectoras de los anticuerpos, incluyendo la activacibn de la cblula Th2 y la produccibn de citoquina, la generacibn de cblulas de memoria, promocibn de opsonina de fagocitosis, eliminacibn de patbgenos y similares.

Una respuesta mediada por cblulas es una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos pero al contrario implica 45 la activacibn de macrbfagos, cblulas asesinas naturales (NK), linfocitos T citotbxicos especlficos de antlgeno, y la liberacibn de varias citocinas en respuesta a un antlgeno. La inmunidad mediada por cblula se usa generalmente para referirse a alguna activacibn de cblula Th, activacibn de cblula Te y respuestas mediadas por linfocitos T. La inmunidad mediada por cblulas es de importancia particular en la respuesta a infecciones vlricas.

50 Las VLP HA recombinantes de la presente divulgacibn pueden usarse junto con vacunas de influenza existentes, para complementar la vacunas, volvibndolas mbs eficientes, y para reducir las dosificaciones de administracibn necesarias. Como se conocerb por un experto en la tbcnica, la vacuna puede dirigirse contra uno o mbs de un virus de influenza. Los ejemplos de vacunas apropiadas incluyen, pero sin limitacibn, las disponibles en el mercado en Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi- 55 Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals y similares.

Si se desea, las VLP de la presente divulgacibn pueden mezclarse con un adyuvante adecuado como se conocerb por un experto en la tbcnica. Adembs, la VLP se puede usar en una composicibn de vacuna que comprende una dosis eficaz de la VLP para el tratamiento de un organismo diana, como se ha definido anteriormente. Adembs, la

VLP producida de acuerdo con la presente divulgacibn puede combinarse con las VLP obtenidas usando diferentes protelnas de influenza, por ejemplo, neuraminidasa (NA).

Por lo tanto, la presente divulgacibn proporciona un mbtodo para inducir inmunidad para infeccibn de virus de 5 influenza en un animal u organismo diana que comprende administrar una dosis eficaz de una vacuna que comprende una o mbs de una VLP. La vacuna se puede administrar por via oral, intradbrmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o subcutbnea.

Como se muestra en las figuras 6 y 7, los ensayos in vitro muestran una reactividad cruzada de anticuerpos 10 producidos contra las VLP A/lndonesia/5/05 H5 mutadas y otras cepas de influenza tales como A/Vietnam/1203/04; A/Anhui/1/05 y A/Pavo/582/06 (todas las cepas H5N1), mientras que se mostrb menos reactividad de hemaglutinacibn contra la unica H1N1 probada (figura 7).

Significativamente, los anticuerpos producidos despubs de una unica dosis de H5N1 mutado (proteina H5 no 15 glicosilada) indujeron una respuesta mayor contra todas las cepas H5 probadas despubs de 14dias que los anticuerpos producidos contra el H5 de tipo silvestre, lo que indica que este inmunbgeno no glicosilado puede proporcionar una respuesta mbs rbpida que el tipo silvestre.

Por lo tanto, estos datos demuestran que las VLP de influenza hechas de plantas que comprende, la proteina vlrica 20 de hemaglutinina H5 mutada desprovista de carbohidratos ligados a N, inducen una respuesta inmunitaria a las cepas de influenza patbgenas, y que esta respuesta es de reactividad cruzada y puede ser rbpida despubs de una unica dosis.

10 - Suieto 25

Los ejemplos de un sujeto u organismo objetivo a los que las VLP de la presente invencibn se pueden administrar incluyen, pero sin limitacibn, seres humanos, primates, pbjaros, aves acubticas, aves migratorias, codorniz, pato, ganso, aves de corral, pavos, polios, cerdos, ovejas, equinos, caballos, camellos, caninos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, civeta, visbn, gardufta, hurones, animates dombsticos, ganado, conejos, ratones, ratas, cobayas u 30 otros roedores, focas, ballenas y similares. Dichos organismos diana son ejemplares, y no se consideran como limitantes para las aplicaciones y usos de la presente divulgacibn.

La presente divulgacibn tambibn pertenece a los virus de influenza que infectan otros mamlferos o animates hubsped, por ejemplo seres humanos, primates, caballos, cerdos, pbjaros, aves acubticas, aves migratorias, 35 codorniz, pato, ganso, aves de corral, pavos, polios, camellos, caninos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, civeta, visbn, gardufia, hurones, animates dombsticos, ganado, ratones, ratas, foca, ballena y similares.

Particularmente, el sujeto a tratar por el mbtodo como se ha definido anteriormente se puede seleccionar del grupo que comprende seres humanos, primates, caballos, cerdos, pbjaros (aves), aves acubticas, aves migratorias, 40 codorniz, pato, ganso, polios, perros, gatos, hurones, ganado y similares. Particularmente, el sujeto puede ser un paciente humano o pbjaros en general (incluyendo aves acubticas, aves migratorias, aves de corral tales como codorniz, pato, ganso, pavos, polios), particularmente aves migratorias o aves de corral para consumo humano (codorniz, pato, ganso, pavos, polios). Mbs particularmente, el sujeto es un ser humano.

45 11 - Recipientes, ierinaas v kits, etc.

La presente divulgacibn tambibn proporciona un recipiente que comprende la composicibn como se define en el presente documento. Particularmente, el recipiente contiene la dosis unitaria sencilla o en forma de dosificacibn multiple con un agente conservante. Mbs particularmente, el recipiente es una jeringa "lista para su uso" previamente 50 llenada con la composicibn o la vacuna como se define en el presente documento.

Mbs particularmente, la divulgacibn tambibn proporciona un kit que comprende un recipiente que comprende la vacuna o composicibn como se define en el presente documento, e instrucciones sobre cbmo usar/administrar dicha composicibn/vacuna.

La invencibn se describirb ahora en detalle a modo de referenda unicamente para los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

1. Mutacibn de H5 de tioo silvestre de A/lndortesia/5/05 (SEQ ID NO. 17) para obtener H5 no alicosilado mutado.

5

El mutante triple se ha elaborado eliminando los sitios de glicosilacibn N154, N165, y N286 localizados en la cabeza globular de HA de tipo silvestre, mbs especlficamente reemplazando la Thr o Ser encerrada en el patr6n de secuencia de glicosilacibn N-X-T/S por un residuo Ala. Por lo tanto, el mutante triple contenla los siguientes tres reemplazos aminoacldicos: T156A, T167A y S288A (enumerados de acuerdo con la SEQ ID NO. 17 de inicio). Los 10 tres reemplazos aminoacldicos se realizaron por un mbtodo de ligacibn basado en PCR presentado en Darveau y col. (1995) usando el vector de expresibn HA de tipo silvestre (construccibn 660, figura 4) como la plantilla.

En resumen, se realizaron tres amplificaciones PCR en paralelo en el vector de expresibn 660 pCAMBIA como la plantilla con 3 pares diferentes de cebadores:

15

1) Plato-443-c (SEQ ID NO: 18) y HA5-T156A.r (SEQ ID NO: 19);

2) HA5-T167A.C (SEQ ID NO: 20) y HA5-S288A.r (SEQ ID NO: 21); y

3) HA5-S288A.C (SEQ ID NO: 22) y HA (Ind)-Sacl. r (SEQ ID NO: 23).

20 Los productos de amplificacibn obtenidos de las tres reacciones se mezclaron juntos y la mezcla sirvib como plantilla para una cuarta reaccibn (reaccibn de ensamble) usando Plato-443c (SEQ ID NO: 18) y HA(lnd)-Sac.r (SEQ ID NO: 23) como cebadores. El fragmento resultante se digirib con BamHI (localizado en el promotor de plastocianina) y Sacl (en el extremo 3‘ del fragmento) y se clonb en pCAMBIAPIasto previamente digerido con las mismas enzimas. El plbsmido resultante, denominado 680, se presenta en la figura 5 (SEQ ID NO. 29).

25

2. Ensamble de casetes de expresibn

Todas las manipulaciones se realizaron usando los protocolos de biologla molecular generales de Sambrook y Russell (2001; que se incorpora en el presente documento por referenda). La primera etapa de clonacion consistib 30 en ensamblar un plbsmido receptor que contenla elementos reguladores aguas arriba o aguas abajo del gen de alfalfa de plastocianina. El promotor de plastocianina y las secuencias 5’UTR se amplificaron del ADN genbmico alfalfa usando cebadores oligonudeotldicos Xmal-pPlas.c (SEQ ID NO: 24) y Sacl-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 25). El producto de amplificacibn resultante se digirib con Xmal y Sacl y ligb en pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra, Australia), previamente digerido con las mismas enzimas, para crear pCAMBIApromo Plasto. De manera similar, las 35 secuencias 3'UTR y el terminador del gen de plastocianina se amplified a partir del ADN genbmico de alfalfa usando los siguientes cebadores: Sacl-PlasTer.c (SEQ ID NO: 26) y EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 27), y el producto se digirib con Sacl y EcoRI antes de insertarse en los mismos sitios de pCAMBIApromoPlasto para crear pCAMBIAPIasto.

40 3. Ensamble del casete de expresibn H5

Un fragmento que codifica hemaglutinina de la cepa de influenza A/lndonesia/5/05 (H5N1; n.° de Acc. LANL ISDN 125873) se sintetizb por Epoch Biolabs (Sugar Land, TX, Estados Unidos). El fragmento producido, que contenla la regibn codificante de H5 completa (SEQ ID NO. 17), incluyendo el pbptido serial nativo flanqueado por un sitio 45 Hindlll inmediatamente aguas arriba del ATG inicial, y un sitio Sacl inmediatamente aguas abajo del codbn de detencibn (TAA), se presenta en la SEQ ID NO: 28 (y SEQ ID N0.29 en el caso del H5 mutante). La regibn codificante H5 se clonb en un casete de expresibn basado en plastocianina por el mbtodo de ligacibn a base de PCR presentado en Daryeau y col. (1995). En resumen, se obtuvo una primera amplificacibn PCR usando los cebadores Plato-443c (SEQ ID NO: 30) y SpHA (Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO: 31) y pCAMBIA promoPlasto como plantilla. En 50 paralelo, se realizb una segunda amplificacibn con los cebadores Plasto-SpHA(lnd).c (SEQ ID NO: 6) y HA(lnd)- Sac.r (SEQ ID NO: 32) con un fragmento codificante de H5 como plantilla. La amplificacibn obtenida de ambas reacciones se mezclaron juntas y la mezcla sirve como plantilla para una tercera reaccibn (reaccibn de ensamble) usando Plato-443c (SEQ ID NO: 4) y HA(lnd)-Sac.r (SEQ ID NO: 33) como cebadores. El fragmento resultante se digirib con BamHI (en el promotor de plastocianina) y Sacl (en el extremo 3’ del fragmento) y se clonb en 55 pCAMBIAPIasto previamente digerido con las mismas enzimas. El plbsmido resultante, denominado 660, se presenta en la figura 5, mientras que el plbsmido resultante de la protelna H5 "mutada" se denominb 680.

Se preparb una construccibn HcPro (35HcPro) como se describe en Hamilton y col. (2002). Todos los clones se secuenciaron para confirmar la integridad de las construcciones. Los plbsmidos se usaron para transformar

Agrobacterium tumefaciens (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, Estados Unidos) por electroporacibn (Mattanovich y col., 1989). La integridad de todas las cepas A. tumefaciens se confirmaron por mapeo de restriccibn.

4. Preparacibn de biomasa, inbculo. aaroinfiltracibn. v cosecha de la planta 5

Las plantas de Nicotiana benthamiana se hicieron crecer a partir de semillas en llanos rellenados con un sustrato de musgo de turbera comercial. Las plantas se dejaron crecer en el invernadero bajo un fotoperiodo 16/8 y un rbgimen de temperatura de 25 °C dla/20°C noche. Tres semanas despubs de la siembra, las plbntulas individuales se seleccionaron, se transplantaron en macetas y se dejaron crecer en el invernadero durante tres semanas adicionales 10 bajo las mismas condiciones ambientales. Antes de la transformacibn, los brotes de bpice y axilares se eliminaron en diversas veces como se indica a continuacibn, al apretar los brotes de la planta, o al tratar qufmicamente la planta.

Las Agrobacterias transfectadas con plbsmidos 660 o 680 se hicieron crecer en un medio YEB complementado con bcido 2-[N-morfolino]etansulfbnico 10 mM (MES), acetosiringona 20 pM, 50pg/ml de canamicina y 25 pg/ml de 15 carbenicilina a pH 5,6, hasta que alcanzaron un OD600 entre 0,6 y 1,6. Las suspensiones de Agrobacteria se centrifugaron antes del uso y volvieron a suspender en medio de infiltracibn (MgCh 10 mM y MES 10 mM pH 5,6). La infiltracibn por jeringa se realizb como se describe por Liu y Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105: 343-348). Para infiltracibn al vaclo, las suspensiones A. tumefaciens se centrifugaron, se volvieron a suspender en el medio de infiltracibn y se almacenaron durante una noche a 4 °C. El dfa de la infiltracibn, los lotes de cultivo se 20 diluyeron en volumenes de 2,5 cultivos y se permitieron calentar antes del uso. Las plantas completas de Nicotiana benthamiana se colocaron al revbs en la suspensibn bacteriana en un tanque de acero inoxidable hermbtico a un vaclo de 20-40 Torr durante 2 min. Despubs de la infiltracibn por vaclo o jeringa, las plantas se devolvieron al invernadero durante un periodo de incubacibn de 4-5 dlas hasta la cosecha.

25 5. Muestreo de la hoia v extraccibn de la protelna total

Despubs de la incubacibn, la parte abrea de las plantas se cosechb, se congelb a -80 °C y se triturb en trozos. Las protelnas solubles totales se extrajeron mediante homogeneizacibn (Polytron) de cada muestra del material vegetal congelado-triturado en 3 volumenes de Tris 50 mM frlo a pH 7,4, NaCI 0,15 M, y fluoruro de fenilmetansulfonilo 30 1 mM. Despubs de la homogenizacibn, las suspensiones se centrifugaron en 20.000 g durante 20 min a 4 °C y estos extractos en bruto se aclarados (sobrenadantes) se conservaron para su anblisis. El contenido de protelna total de los extractos en bruto aclarados se determinb por el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albumina sbrica bovina como el estbndar de referenda.

35 6. Anblisis de protelnas e inmunotincibn

Las concentraciones de protelna se determinaron por el ensayo de protelna BCA (Pierce Biochemicals, Rockport IL). Las protelnas se separaron por SDS-PAGE bajo condidones reducidas y se tifieron con azul de Coomassie. Los geles tefiidos se exploraron y el anblisis de densitometrla se realizb usando el software ImageJ (NIH).

40

Las protelnas de la fraccibn de elucibn de SEC se predpitaron con acetona (Bollag y col., 1996), se volvieron a suspender en 1/5 volumenes en tampbn de equilibrio/elucibn y se separaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras y se electrotransfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para la inmunodeteccibn. Antes de la inmunotransferencia, las membranas se 45 bloquearon con leche desnatada al 5 % y Tween-20 al 0,1 % en una soludbn salina tamponada con Tris (TBS-T) durante 16-18 h a 4 °C.

La inmunotransferencia se realizb por incubacibn con los siguientes anticuerpos: para la deteccibn de H1, un anticuerpo monoclonal de anti-influenza A de ratbn (Fitzgerald Industries International, Concord, MA, Estados 50 Unidos, n.° de Cat. 10-150) (2 (ig/ml en leche desnatada al 2 % en TBS-Tween 20 al 0,1 %), y para la deteccibn de H5, un anticuerpo anti-H5 de conejo (Vietnam) (Immune Technology, Woodside, NY, Estados Unidos, n.° de Cat. IT- 003-005V) diluido 1/4000 en leche desnatada al 2 % en TBS-Tween 20 al 0,1 %. Un anticuerpo IgG anti-ratbn de cabra conjugado con peroxidasa (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, Estados Unidos, n.° de Cat. 115-035-146) (diluido 1/12000 en leche desnatada al 2 % en TBS-Tween 20 al 0,1 %) se usb como 55 anticuerpo secundario. Los complejos inmunoreactivos se detectaron por quimioluminiscencia usando luminol como el sustrato (Roche Diagnostics Corporation). La conjugacibn de la enzima de peroxidasa de rbbano picante de anticuerpo IgG humano se realizb usando el kit de conjugacibn de Peroxidasa Activada EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, IL).

El ensayo de hemaglutinacibn para H5 se bas6 en un mbtodo descrito por Nayak y Reichl (2004). En resumen, las diluciones dobles seriadas de las muestras de ensayo (100 pi) se hicieron en placas de microtitulacibn de 96 pocillos con fondo en V que contenlan 100 pi de PBS, dejando 100 pi de muestra diluida por pocillo. Se aftadieron a cada pocillo cien mililitros de una suspensibn de gl6bulos rojos de caballo al 0,25 % (Bio Link Inc., Syracuse, NY), y las 5 placas se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. El reclproco de la diluci6n mbs alta que muestra hemaglutinacibn completa se registrb como actividad HA. En paralelo, un estbndar de HA recombinante (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) se diluyb en PBS y se realizb como un control en cada placa.

10 7. Purificacibn de H5 VLP

Se homogeneizaron 660 o 680 hojas congeladas infiltradas de N. bentamiana en 1,5 volumenes de Tris 50 mM pH 8, NaCI 50 mM y meta-bisulfito de sodio al 0,04 % usando una licuadora comercial. El extracto resultante se complemento con PMSF 1 mM y se ajustb a pH 6 con bcido acbtico 1 M antes de calentarse a 42 °C durante 5 min. 15 Se afladib tierra de diatomeas (DE) al extracto tratado con calor para adsorber los contaminantes precipitados por el cambio de pH y tratamiento con calor, y la suspensibn se filtrb a travbs de un filtro de papel Whatman. El extracto aclarado resultante se centrifugb a 10.000 x g durante 10 minutos a TA para eliminar DE residual, se pasb a travbs de filtros Acropack 20 de 0,8/0,2 pm y se cargb sobre una columna de afinidad de fetulna-agarosa (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, Estados Unidos). Despubs de una etapa de lavado en NaCI 400 mM, Tris 25 mM a pH 6, las protelnas 20 unidas se eluyeron con NaCI 1,5 M, MES 50 mM pH 6. Las VLP eluidas se complementaron con Tween-80 a una concentracibn final del 0,0005 % (v/v). Las VLP se concentraron en una membrana MWCO Amicon de 100 kDa, se centrifugaron a 10.000 x g durante 30 minutos a 4 °C y se suspendieron de nuevo en PBS pH 7,4 con Tween-80 al 0,01 % y timerosal al 0,01 %. Las VLP suspendidas se esterilizan por filtracibn antes de usarse.

25 8 . Estudios en animales

Los estudios sobre la respuesta inmunitaria a la administracibn de VLP de influenza se realizaron con ratas Wistar hembras de 6-8 semanas de edad (Charles River Laboratories). Trece ratas se dividieron aleatoriamente en tres grupos que variaban de tres para el grupo de control hasta cinco animales tanto para el grupo de vacuna de tipo 30 silvestre de VLP H5 hecha de planta (660) como el grupo de vacuna mutante (680). Se usaron ocho grupos para la inmunizacibn intramuscular y se usaron seis grupos para ensayar la via intranasal de administracibn. Todos los grupos se inmunizaron en un rbgimen de dos dosis, realizbndose la inmunizacibn de estlmulo 14 dlas despubs de la primera inmunizacibn.

35 Para la administracibn intramuscular en las patas traseras, se inmunizaron ratas no anestesiadas con la vacuna de VLP H5 hecha de plantas (15 pg), la forma mutante de VLP H5 hecha de plantas de la vacuna o PBS.

Todas las preparaciones de antlgeno se mezclaron con Alhydrogel a una concentracibn final del 1 % (alumbre; Accurate Chemical and Scientific Corporation, Wesbury, NY, Estados Unidos) en una relacibn en volumen 1:1 antes 40 de las inmunizaciones.

Recoleccidn de sangre y recoleccidn de bazos

La recoleccidn de sangre de la vena yugular se realizb catorce dlas despubs de la primera inmunizacibn y catorce 45 dlas despubs de la segunda inmunizacibn en un animal anestesiado. El suero se recogib por centrifugacibn a 8000 g durante 10 min.

Tres semanas despubs de la segunda inmunizacibn, las ratas se anestesiaron con gas CO2 e inmediatamente tras la terminacibn, se usb puncibn cardiaca para recoger sangre.

50

La recogida de sangre se realizb en bazos recuperados de ratas, que se pusieron en RPMI complementado con gentamicina y se molieron en un tubo cbnico de 50 ml con bmbolo de una jeringa de 10 ml. Los bazos molidos se aclararon 2 veces, se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min y se suspendieron de nuevo en un tampbn de lisis ACK durante 5 min a temperatura ambiente. Los esplenocitos se lavaron en PBS-gentamicina, se suspendieron de 55 nuevo en RPMI al 5 % y se contaron. Los esplenocitos se usaron para el ensayo de proliferacibn.

Tftulos de anticuerpo:

AA/ietnam/1203/2004 (H5N1); A/Anhui/1/05 (H5N1); A/pavos/Pavos/1/05 (H5N1); A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N2)

Los tftulos de anticuerpo anti-influenza de sueros se midieron 14 dias despubs de la primera inmunizacibn, as! como 21 dlas despubs de la segunda inmunizacibn (en el sacrificio). Los tftulos se determinaron por un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) usando el virus inactivado A/lndonesia/5/05 como el antfgeno de 5 recubrimiento. Los tftulos de los criterios de valoracibn se expresaron como el valor recfproco de la mayor dilucibn que alcanzaron un valor OD de al menos 0,1 mayor que el de muestras de control negativo.

Para la determinacibn de la clase de anticuerpo (lgG1, lgG2a, lgG2b, lgG3, IgM), los tftulos se evaluaron en sangrado final por ELISA como se ha descrito previamente.

10

Tftulos de inhibici6n de hemaglutinacidn (HI)

Los tftulos de inhibicibn de hemaglutinacibn (HI) de sueros se midieron los dfas 14 y 35 despubs de la segunda inmunizacibn, como se ha descrito previamente (WHO 2002; Kendal 1982). Las Preparaciones de virus inactivados 15 de las cepas A/lndonesia/5/05; A/Anhui/1/05 (H5N1); A/pavos/Pavos/1/05 (H5N1) o A/Vietnam/1203/2004 se usaron para ensayar muestras de suero de rata para la actividad HI. Los sueros se trataron previamente con enzima II destructora del receptor (RDE II) (Denka Seiken Co., Tokio, Japbn) preparada a partir de Vibrio cholerae (Kendal 1982). Los ensayos HI se realizaron con cblulas de glbbulos rojos de caballo al 0,5 %. Los tftulos de anticuerpo HI se definieron como el recfproco de la mayor dilucibn que causa la inhibicibn completa de la aglutinacibn.

20

Resultados

La reactividad de los sueros de las ratas inmunizadas con VLP wt o la VLP mutante se evalub 14 dfas despubs de la primera (Dfa 14) o la segunda inmunizacibn (Dfa 35). Todas las ratas se inmunizaron con 15 pg del antfgeno 25 formulado con alumbre. La inmunoreactividad se evalub contra los virus H5N1 de subtipo 1 (A/Vietnam/1203/04), subtipo 2.1 (A/lndonesia/5/05), subtipo 2.2 (A/pavos/Pavos/1/05) y subtipo 2.3 (A/Anhui/1/05). Despubs de la primera dosis, la VLP mutante induce una reaccibn de anticuerpo mayor que el wt para todas las cepas de H5N1 ensayadas (figura 6). La inmunoreactividad contra la cepa aviar A/pavos/Pavos/1/05 fue estadfsticamente importante (p<0,05) despubs de la primera dosis. La inmunoreactividad tambibn se evalub contra virus de H1N1 (A/Nueva 30 Caledonia/20/99) que muestran inmunoreactividad despubs de una inyeccibn de estfmulo. GMT: tftulo de media geombtrica. Los valores, son el GMT (In) de tftulos de criterios de valoracibn recfprocos de cinco ratas por grupo. Las barras representan la desviacibn media. * p< 0,05 en comparacibn con la VLP wt.

Los tftulos HI de ratas inmunizadas con la VLP wt o mutante se evaluaron 14 dfas despubs de la primera (Dfa 14) o 35 la segunda inmunizacibn (Dfa 35). Las respuestas de anticuerpo HI se midieron usando virus H5N1 completos inactivados. Despubs de la primera inmunizacibn, la VLP mutante induce una respuesta de anticuerpo HI mayor que la VLP wt contra todos los virus H5N1 ensayados (figura 7). La importancia estadfstica se alcanzb para las cepas de influenza A/lndonesia/5/05 y A/pavos/Pavos/1/05. GMT: tftulo de media geombtrica. Los valores son el GMT (In) de los tftulos de criterios de valoracibn recfprocos de cinco ratas por grupo. Las barras representan la desviacibn media. 40 * p<0,05 en comparacibn con VLP wt.

Estos datos sugieren fuertemente que la protefna H5 no glicosilada "mutada" representa una alternativa muy interesante a la protefna H5 nativa para la produccibn de las VLP como vacuna para la gripe de amplio espectro y de activacibn rbpida.

45

Todas las citas se incorporan por la presente por referenda.

La presente invencibn se ha descrito con respecto a una o mbs realizaciones particulares. Sin embargo, serb evidente para los expertos en la tbcnica que pueden hacerse varias variaciones y modificadones sin apartarse del 50 alcance de la invendbn como se define en las reivindicaciones.

Referencias

• Abe Y. et al. Journal of virology. (2004) 78 : 9605-9611.

55 ■ Bollag, D.M., Rozycki, M.D., and Edelstein, S.J. (1996) Protein methods (2nd edition). Wiley-Liss, New

York, USA.

- Bligh, E.G., & Dyer, W.J. Can. J. Med. Sci. 37, 911-917 (1959).

■ Bright et al. Virology. (2003) 308 : 270-278.

■ Chen, B.J., Leser, G.P., Morita, E., and Lamb R.A. (2007) Influenza virus hemagglutinin and

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un bcido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica que codifica una hemaglutinina (HA) del virus de la influenza que comprende un dominio HA1, en el que dicho dominio HA1 se modifica para que estb libre

   5 de sitios de glicosilacibn ligada a N en la posicibn 154,165 y 286,

   a. modificando la posicibn 154 para codificar una no asparagina y/o modificando la posicibn 156 para codificar una no serina o no treonina;

   b. modificando la posicibn 165 para codificar una no asparagina y/o modificando la posicibn 167 para codificar una 10 no serina o no treonina; y

   c. modificando la posicibn 286 para codificar una no asparagina y/o modificando la posicibn 288 para codificar una no serina o no treonina,

   en el que la numeracibn es segun la cepa A/Vietnam/1194/04 y en el que la secuencia nucleotidica estb ligada a una 15 regibn reguladora activa en una planta.
2. 2. El bcido nucleico de acuerdo con la reivindicacibn 1, en el que dicha regibn reguladora se selecciona del grupo que consiste en una regibn reguladora de plastocianina; promotor de napina, el promotor de cruciferina, o una regibn reguladora obtenida a partir de Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO), protelna de

   20 unibn a clorofila a/b, ST-LS, promotor de poliedro, y el promotor de gp64.
3. 3. El bcido nucleico de acuerdo con la reivindicacibn 1 o 2, en el que la secuencia nucleotidica se define de acuerdo con la SEQ ID NO. 17, en la que los residuos que codifican los aminobcidos en la posicibn 154, 165 y 286 codifican una no asparagina.

   25
4. 4. El bcido nucleico de acuerdo con la reivindicacibn 1 o 2, en el que la secuencia nucleotidica se define de acuerdo con la SEQ ID NO. 17, en el que los residuos que codifican los aminobcidos en las posiciones 156,167 y 288 codifican una no serina, una no treonina o una alanina.

   30 5. El bcido nucleico como se ha definido en la reivindicacibn 1, en el que la secuencia nucleotidica es

   como se define de acuerdo con la SEQ ID NO. 29.
5. 6. El bcido nucleico de acuerdo con la reivindicacibn 1, en el que la secuencia nucleotidica codifica una hemaglutinina del virus de la influenza (HA) que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. 34, y en el que los

   35 aminobcidos en las posiciones 154, 165 y 286 codifican una no asparagina.
6. 7. El bcido nucleico de acuerdo con la reivindicacibn 6, en el que los aminobcidos en la posicibn 156, 167 y 288 codifican una no serina, una no treonina o una alanina.

   40 8. Un mbtodo para producir partlculas pseudoviricas (VLP) de influenza en una implanta, una porcibn de

   la misma, o una cblula vegetal, comprendiendo dicho mbtodo:

   a) introducir el bcido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la planta, una porcibn de la misma, o la cblula vegetal, y

   45 b) incubar la planta, una porcibn de la misma, o la cblula vegetal en condiciones que permitan la expresibn

   del bcido nucleico, produciendo de esta manera las VLP donde el bcido nucleico se expresa de forma transitoria en la planta, una porcibn de la misma, o la cblula vegetal, o se expresa de forma estable en la planta, una porcibn de la misma, o la cblula vegetal;

   c) cosechar opcionalmente la planta, una porcibn de la misma o la cblula vegetal y purificar las VLP.

   50
7. 9. Una particula pseudovlrica (VLP) que comprende una molbcula de hemaglutinina (HA) de influenza codificada por el bcido nucleico de la reivindicacibn 1.
8. 10. Una particula pseudovirica (VLP) producida por el mbtodo de la reivindicacibn 8.

   55
9. 11. La VLP de la reivindicacibn 9 o 10, en la que dicho sitio de glicosilacibn consiste en una triada de reconocimiento de glicosilacibn N-X-S/T en la que N es asparagina, X es cualquier aminobcido excepto prolina, S es serina y T es treonina, o el residuo de asparagina estb sustituido por un aminobcido sin asparagina, o el residuo de treonina comprendiendo en una triada de reconocimiento de glicosilacibn N-X-S/T estb sustituido por un aminobcido

   sin serina y sin treonina, o una combinaci6n de los mismos.
10. 12. La VLP de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha influenza es de tipo A y de tipo B, o dicha HA es de uno o mbs de un subtipo HA seleccionado del grupo que consiste en: H1, H2,

    5 H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15y H16.
11. 13. La VLP de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para su uso como una vacuna para la prevencibn o tratamiento de una infeccibn vlrica en un sujeto.

    10 14. Una composici6n que comprende una dosis eficaz de una VLP de acuerdo con una cualquiera de las

    reivindicaciones 9 a 12, en mezcla con un vehlculo farmacbuticamente aceptable.
12. 15. Una planta transgbnica o una cblula vegetal transgbnica transformada de forma transitoria o estable

    con el acido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la planta o cblula 15 vegetal contiene el bcido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.