PT2367552T - Nanoformulação antibacteriana e antifúngica à base de sílica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

NANOFORMULAÇÃO ANTIBACTERIANA E ΑΝΤΙFÚNGICA À BASE DE

SÍLICA

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a nanoformulações à base de sílica, método de síntese e uso e, em particular, a composições e métodos para o fabrico de nanopartícuias à base de sílica e nanogéis à base de sílica, ou uma combinação dos mesmos, que fornecem um nanoambiente único para hospedar agentes antibacterianos e antifúngicos. ANTECEDENTES E TÉCNICA ANTERIOR Preocupação global A globalização dos negócios, viagens e comunicação provoca um aumento da atenção aos intercâmbios a nível mundial entre as comunidades e países, incluindo a potencial globalização do ecossistema patogénico e de bactérias. Os bactericidas e fungicidas têm sido desenvolvidos para o controlo de doenças no homem, animais e plantas e devem evoluir para permanecerem eficazes, uma vez que aparecem cada vez mais e mais antibióticos, pesticidas e inseticidas resistentes a bactérias e fungos por todo o mundo. A resistência bacteriana aos agentes antimicrobianos também surgiu, em todo o mundo, como uma das grandes ameaças para o homem e o estilo de vida agrária. A resistência a agentes antibacterianos e antifúngicos tem emergido como um problema agrícola que requer atenção e melhorias nos materiais de tratamento em uso hoje em dia.

Por exemplo, relativamente as plantas, existem mais de 300.000 doenças que afligem as plantas em todo o mundo, resultando em milhares de milhões de dólares em perdas anuais de cultura agrícola. Em 1990, foram gastos mais de 7,3 milhares de milhões de dólares nos Estados Unidos em produtos pesticidas.

Os agentes antibacterianos e antifúngicos (anti-B/F) incluem, mas não se limitam a, cobre metálico (Cu), sais de cobre, complexos de cobre, zinco metálico (Zn), óxidos de zinco, sais de zinco, prata metálica (Ag), sais de prata, complexos de prata, dióxido de titânio (Ti02) , óxidos de cério, óxidos de magnésio, óxidos de zircónio, polietilenoimina (PEI), carbono, carbono misturado ou fuligem, fulerenos, nanotubos de carbono e semelhantes. Os compostos anteriores são apenas alguns exemplos de agentes antibacterianos e antifúngicos utilizados pelo homem numa tentativa de controlar ou eliminar as doenças infeciosas no nosso ambiente mundial.

As formulações antibacterianas / antifúngicas (anti-B/F) existentes hoj e em dia poderiam ser melhoradas e tornadas mais eficazes se as caraterísticas que se seguem fossem incluídas na formulação. Por exemplo, uma formulação desejável teria uma maior distribuição uniforme numa área de superfície tratada, uma melhor adesão à superfície tratada, um meio para controlar e manter a libertação dos ingredientes ativos e, níveis de dosagem que evitam qualquer impacto tóxico no ambiente e/ou na superfície tratada. A presente invenção proporciona uma composição que hospeda formulações antibacterianas / antifúngicas e, em conjunto, a composição hospedeira e os ingredientes antibacterianos / antifúngicos proporcionam benefícios funcionais que resolvem muitos problemas e superam muitas limitações na técnica anterior. é relatado um método de síntese para a preparação de uma matriz de sílica com partículas metálicas incorporadas na patente US 6 548 264 de Tan et al., US 6 924 116 de Tan et al. e na patente US 7 332 351 de Tan et al.

Uso de fungicidas / bactericidas de cobre (Cu)

Na agricultura moderna os compostos de cobre (Cu) são muito usados como fungicidas / bactericidas. Os compostos de Cu, em concentrações relativamente baixas, são bastante tóxicos para os organismos talófitos, tal como os fungos, as bactérias e as algas. Esta propriedade de toxicidade tem sido utilizada há mais de 100 anos para o controlo de doenças de plantas provocadas por fungos e bactérias. Em 1761, foi descoberto que os grãos de sementes embebidos numa solução fraca de sulfato de Cu inibiam os fungos com origem nas sementes. O maior avanço para os sais de Cu veio, sem dúvida, quando o cientista francês Millardet anunciou ao mundo, em 1885, que tinha encontrado uma cura para o temido míldio utilizando misturas de sulfato de Cu, cal e água (conhecida como a mistura Bordeaux). Os fungicidas / bactericidas à base de Cu são usados em todo o mundo, porque os compostos de Cu são relativamente seguros; o desenvolvimento de resistência por patogéneos de plantas tem sido mínimo; há procura por parte dos países do terceiro mundo em desenvolvimento e o aumento dos requisitos para alimentos que necessitam de uma agricultura mais eficiente; e um aumento nos regulamentos e restrições governamentais ou a proibição total de produtos alternativos devido ao seu impacto toxicológico e ambiental requer formulações de tratamento seguras, tal como discutido por H.W. Richardson no Handbook of Copper Compounds and Applications, "Copper fungicides/bactericides" H. W. Richardson, Editor, 1997, Marcel Dekker, Inc.: Nova Iorque, NY, páginas 93-122. A toxicidade do Cu é em grande parte devida à sua tendência para alternar entre os seus estados de oxidação cuproso, Cu(I) e cúprico, Cu(II). Em condições aeróbicas, este ciclo redox conduz à formação de radicais hidroxilo altamente reativos, que prontamente e eficientemente danificam as biomoléculas, tais como o ADN, as proteínas e os lípidos. As reações semelhantes a Fenton subjacentes que envolvem espécies reativas de oxigénio podem ser descritas como reações de Haber-Weiss catalisadas por Cu. Embora a reação de perõxido de hidrogénio com superóxido tenha principalmente uma taxa negligenciável constante, tal como mostrado de seguida na equação 1, esta taxa é muito acelerada na presença de Cu. H202 + 02- - 02 + OH" + OH* (1)

Acredita-se que os iões de Cu catalisem esta reação, tal como mostrado nas equações 2 e 3. 0 Cu(II) é inicialmente reduzido pelo superóxido, tal como mostrado na equação 2,

Cu (II) + 02“ - Cu(I) + 02 (2) seguido pela reoxidação por peróxido de hidrogénio, tal como mostrado na equação 3,

Cu (I) + H202 - Cu(II) + 02 + OH" + OH* (3) resultando numa produção líquida do radical hidroxilo. A maioria dos fungicidas e bactericidas fazem pouco para matar uma infeção estabelecida, respetivamente, de fungos e bactérias, mas atuam protegendo o hospedeiro contra a possibilidade de infeção. Se o protetor é aplicado após o início dos sintomas da doença, o controlo será, muitas vezes, mínimo. Do mesmo modo, os compostos de Cu inibem a germinação do esporo do fungo ou de células bacterianas, as "sementes" primárias responsáveis pela disseminação e reprodução do fungo ou bactéria. Uma vez que o esporo ou a célula removido do atual ciclo de infeção não amadurece, nem se reproduz na presença de Cu, o fungo ou bactéria são eficazmente mortos. 0 valor do fungicida / bactericida é uma medida da toxicidade de um material para o patogéneo e, é geralmente expressa como uma LD50, que é principalmente uma medida da toxicidade in vitro levada a cabo em laboratório, em que LD significa dose letal e LD50 é a quantidade de material ou dose que provoca a morte de 50 % da população alvo. 0 valor protetor é uma medida da capacidade de um material para proteger o organismo hospedeiro, por exemplo, uma planta, da infeção, que é principalmente uma medida em condições de campo. Por exemplo, o sulfato de Cu tem uma excelente capacidade para inibir a germinação de esporos de fungos ou células bacterianas no laboratório, no entanto, em campo, não exibe persistência, por causa da sua solubilidade. Tem um valor protetor limitado, porque é rapidamente removido da superfície da planta aquando da primeira chuva. Para além disso, o sulfato de Cu pode produzir Cu solúvel suficiente para ser tóxico para a planta (fitotóxico). Deve ser escolhido um composto de Cu que é relativamente resistente às intempéries e fornece suficiente Cu para ser tóxico para os esporos de fungos e células bacterianas, sem prejudicar a planta.

Uma consideração importante é decidir usar o cobre (Cu) "solúvel" ou "insolúvel" para proteção fungicida ou bactericida de longo prazo. 0 Cu "solúvel" refere-se a sais com base de Cu (tal como sulfato de Cu) que se hidrolisam completamente em água, produzindo Cu iónico. Os compostos de Cu "insolúvel" (moderadamente solúvel) atuam como um reservatório a partir do qual o ião de Cu é libertado para a superfície da planta na qual os compostos foram depositados após aplicação. A estimativa do mercado mundial de fungicidas e bactericidas por tipo de composto de Cu e ano de introdução é mostrada na tabela 1 que se segue (dados publicados em 1988, Fonte: H. W. Richardson, Handbook of Copper Compounds and Applications, supra) .

Tabela 1 - Estimativa do mercado mundial de fungicidas / bactericidas oor tino de comDosto de Cu

É evidente que os fungicidas / bactericidas à base de Cu têm sido aplicados desde há muito tempo e têm um elevado impacto social e económico na agricultura, no tratamento da água e na vida doméstica. Há aproximadamente 2.000 produtos registados que contêm compostos de cobre como ingredientes ativos.

Estão registados nos Estados Unidos vários compostos de Cu para a gestão de mais de 100 doenças em quase 50 culturas alimentares. Os compostos de Cu apresentam diferentes graus de eficácia para qualquer organismo alvo num determinado hospedeiro. As formas mais comuns de Cu que satisfazem estas condições em diferentes graus são os produtos da hidrólise normal de sais de Cu (I) e de Cu (II) (também conhecidos como compostos de "Cu insolúvel"): óxido de Cu (I) (Cu203) , oxicloreto de Cu(II) (CuCl2.3Cu (OH) 2) , sulfato de Cu (II) tribásico (CuS04.3Cu (OH) 2 e hidróxido de Cu (Cu (OH) 2) . Em meados da década de 1930, a mistura Bordeaux foi, em grande parte, substituída por sulfato de Cu (11) básico, óxido de Cu(I) e oxicloreto de Cu (11) . Estes compostos de Cu são fáceis de manusear e relativamente menos fitotóxicos em comparação com a mistura Bordeaux. 0 hidróxido de Cu foi introduzido em 1960. 0 Kocide® 3000 é o produto a base de hidróxido de Cu mais recente, disponibilizado por DuPont Company, Wilmington, DE, o qual é um dos fungicidas / bactericidas mais populares.

Os compostos de Cu usados atualmente possuem um conjunto único de propriedades físicas e químicas. Diferem na sua quantidade total de teor de Cu metálico e solubilidade em água. É bem entendido que a atividade antibacteriana irá depender da disponibilidade de ióes de Cu solúvel na formulação. Entre os compostos de Cu existentes, os sulfatos de Cu tribásicos e o óxido cuproso são os menos solúveis, enquanto que os hidróxidos de Cu são mais solúveis do que o oxicloreto de Cu.

Mais uma vez, muito Cu irá causar f itotoxicidade e afetar negativamente o ambiente, enquanto que os compostos de Cu moderadamente solúveis serão menos eficazes, exigindo múltiplas aplicações e, como tal, serão mais trabalhosos. Uma formulação de Cu robusta deve satisfazer, pelo menos, os três critérios que se seguem: (i) a taxa de libertação de Cu deve ser mantida a um nível ótimo (mecanismo de libertação sustentada ao mesmo tempo que minimiza a fitotoxicidade) para proporcionar proteção a longo prazo contra patogéneos, (ii) o composto de Cu deve aderir bem à superfície da planta para resistir à chuva soprada pelo vento, de modo a que não sejam necessárias várias aplicações e, (iii) o composto de Cu não irá causar toxicidade ao ambiente (isto é, ambientalmente seguro). No entanto, devido às propriedades químicas e físicas inerentes, os compostos de Cu existentes são seriamente limitados para satisfazer estes critérios.

No que diz respeito aos compostos de cobre (Cu) , a eficácia de um composto de Cu pode ser consideravelmente melhorada através da redução do tamanho das partículas de acordo com Torgeson, D.C., ed. Fungicides - An Advanced Treatise, Agricultural and Industrial Applications and Environmental Interaction. Vol. 1. (1967), Academic Press:

Nova Iorque, N. Y, página 697. Quanto menor for o tamanho da partícula, maior é o número de partículas por grama e, portanto, maior será a atividade fungicida ou bacteriana. Isto dã as boas-vindas à nanociência e nanotecnologia que lidam com assuntos na dimensão da nanoescala, tipicamente no intervalo nanométrico de 1 - 100.

Navarro, E. , et al., em "Environmental behavior and ecotoxicity of engineered nanoparticles to algae, plants, and fungi," Ecotoxicology, 2008. 17(5): páginas 372-386 ensina que uma área de superfície específica, tal como mostrado na figura la, aumenta exponencialmente à medida que o tamanho da partícula diminui abaixo de 100 nanõmetros. Da mesma forma, Qberdorster, G. et al, em Nanotoxicology: An Emerging Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles, Environmental Health Perspectives, 2005. 113(7): páginas 823-839 ensina que a percentagem de átomos da superfície aumenta exponencialmente à medida que o tamanho da partícula diminui abaixo de 100 nm, tal como mostrado na figura 1b. Por conseguinte, a cobertura é melhorada com partículas mais pequenas e, há significativamente mais área de superfície disponível por grama de produto para libertar iões de Cu na presença de humidade.

As partículas mais pequenas também resistem melhor ao deslocamento, uma vez que são mais leves e têm uma área de superfície maior em relação ao seu peso e, consequentemente, uma maior área de contacto com a superfície da planta, e o resultado é um aumento na força de adesão total. As formulações de Cu com partículas mais pequenas irão, por conseguinte, produzir melhorias no controlo da doença através de uma melhor cobertura, resistência à chuva, longevidade do produto e libertação de iões de Cu na superfície da planta. A este respeito, durante a última década, têm sido feitas algumas melhorias na qualidade do produto nos compostos de Cu. No entanto, até a data, não foi feito nenhum grande avanço que poderia ser considerado revolucionário. Isto exige fortemente o desenvolvimento de uma nova geração de fungicidas / bactericidas à base de Cu que irão satisfazer os critérios mencionados anteriormente.

Inibindo o crescimento de bolor e míldio 0 crescimento de fungos, tais como, fungos de bolor e de míldio é um problema sério em ambientes húmidos quentes, tais como em climas tropicais. Na presença de nutrientes que são encontrados em abundância em materiais de casa / construção, tais como paredes secas, madeira, argamassa, forro de carpetes e similares, o bolor e o míldio prosperam. 0 bolor e o míldio têm caraterísticas semelhantes, mas são tipos diferentes de fungos microscópicos e são muitas vezes diferentes em cor e textura e, podem ser vistos a crescer em objetos tanto no interior como no exterior de edifícios. 0 crescimento do bolor e do míldio não é apenas prejudicial para a saúde, mas também apresentam uma aparência desagradável quando as colónias se estabelecem nas superfícies interiores ou exteriores de edifícios. 0 míldio é mais frequentemente encontrado em duches de casas de banho, banheiras, argamassa dos azulejos de cerâmica, papel e tecido. 0 bolor é normalmente encontrado em alimentos. Podem ser difíceis de distinguir, uma vez que ambos usam esporos para a sua reprodução. 0 bolor é frequentemente de cor preta, verde, vermelha ou azul, enquanto que o míldio é geralmente cinzento ou branco. Os odores de mofo e bolorentos são produzidos por mudanças químicas que ocorrem durante o processo de vida do bolor e, são designados cientificamente como compostos orgânicos voláteis microbianos (mVOC). Os produtos residuais são emitidos por bolores em crescimento ativo.

Os esporos de bolor presentes no ar podem comprometer seriamente a qualidade do ar interior e provocar alergia grave, asma e outros problemas imunológicos. Efeitos na saúde, tais como dores de cabeça, tonturas, náuseas e tosse foram ligados à exposição a mVOC. Também pode ocorrer irritação dos olhos e da garganta, como resultado de respirar toxinas do bolor. Os alimentos bolorentos não devem ser ingeridos. Uma infestação de míldio em papel e alguns tecidos não pode ser esfregada, mas um removedor de míldio pode geralmente remove-lo em superfícies mais duras, tais como, superfícies em casas de banho, cozinhas e nas paredes exteriores.

Os esporos de bolor são resistentes a altas temperaturas, luz UV e dessecação. Os esporos são abundantes no meio ambiente e permanecem dormentes em condições desfavoráveis, mas germinam rapidamente num ambiente favorável (calor, humidade e nutrientes). As soluções de lixívia são eficazes para matar tanto o bolor como o míldio e são consideradas um tratamento muito eficaz a nível mundial. No entanto, a ação da lixívia não dura muito tempo e, como tal, são necessárias múltiplas aplicações no espaço de uma ou duas semanas. A patente US 3 992 146 de Fazzalari descreve um processo que utiliza soluções biocidas que contêm sulfato de cobre e um agente tensioativo para inibir o crescimento de fungos sobre superfícies porosas duras, tais como a argamassa. É desejável usar a nanotecnologia para expandir o uso de formulações de nanopartícuias / nanogel de sílica carregada com cobre (Cu) com atividade antibacteriana superior, para o tratamento de áreas que favorecem e promovem o crescimento de bolor e míldio. Para além disso, é desejável que um único tratamento mantenha a eficácia durante, pelo menos, dois a seis meses, devido à libertação de Cu iónico ocorrer de uma forma lenta, sustentada e em quantidades que não violariam a Regra EPA de padrões de qualidade da água, emitida em 1 de dezembro de 1992, que define os padrões de qualidade da água para o cobre como um poluente tóxico prioritário.

Tratamento de doenças em plantas 0 estado da técnica para métodos e tratamentos de doenças em plantas e, especificamente, do cancro de citrinos, é encontrado numa amostra representativa de patentes listadas de seguida: A patente US 3 983 214 de Misato et al., ensina composições fungicidas e o método para a proteção de plantas através do uso de composições que contêm ácidos orgânicos como um ingrediente ativo, sais de metais alcalinos destes ácidos orgânicos, citrato férrico, lactato férrico, glicerina, cloreto de alumínio e ésteres formados entre o açúcar e ácidos gordos superiores que possuem de 8 a 18 átomos de carbono. As composições não têm fitotoxicidade e nenhuma toxicidade para mamíferos e não apresentam qualquer risco de poluição do solo. A patente US 5 462 738 de LeFiles et al., divulga um bactericida / fungicida fluido, seco, de hidróxido de cobre granular com atividade biológica melhorada e um método de o produzir e utilizar. A patente US 5 939 357 de Jones et al. , fornece uma composição fungicida que tem um ingrediente de sal inorgânico que contém bicarbonato, que aumenta a eficácia de um ingrediente fungicida para o tratamento de culturas cultivadas. A patente US 6 471 976 de Taylor et al., divulga um bactericida / fungicida melhorado de complexo de cobre que contém um ácido policarboxílico parcialmente neutralizado e um método de o produzir e utilizar. A patente US 7 163 709 de Cook et al. , divulga uma composição e um método para proporcionar formas iónicas ou compostos de qualquer combinação de três metais (cobre, ouro e prata), para produzir um produto que pode ser utilizado como um agente antimicrobiano, um desinfetante de superfícies duras, um pulverizador foliar ou um tratamento de água. A composição é aerossolisada, nebulizada, vaporizada, embaciada, humidificada para produzir partículas micronizadas que são capazes de permanecer em suspensão no ar por longos períodos de tempo para atuarem em esporos de fungos presentes no ar e/ou patogéneos. Esta seria uma composição extremamente dispendiosa. A patente US 7 226 610 de Winniczuk ensina composições e métodos para o tratamento e prevenção de doenças em plantas, especialmente o cancro de citrinos, utilizando composições que incluem várias combinações de d-limoneno, cera e álcool mono-hídrico. A publicação de patente US n.° US 200110051174 de Staats proporciona uma composição antimicrobiana que contém compostos de amónio quaternário, um agente tensioativo, um agente de humedecimento, um agente de secagem 10, um agente formador de película hidrofílica, um agente hidrofóbico à prova de água e água, que possui propriedades antivirais, antibacterianas e antifúngicas, aplicada a plantas e árvores por revestimento por pulverização e/ou através de entrega sistémica para proteger contra os organismos nocivos e destrutivos. A publicação de patente US n.° VS 2007/0087023 e a publicação de patente US n.° US 15 2007/0098806 ambas de Ismail et al., divulgam um agente antimicrobiano à base de polímero que inclui um polímero solúvel em água e iões metálicos oligodinâmicos (por exemplo, partículas de prata nanométricas), que interagem com o polímero solúvel em água para tratar ou prevenir o cancro de citrinos. 0 documento US 2004/0096421 Al divulga materiais de complexos de domínio orgânico / domínio inorgânico que compreendem uma composição de acordo com o preâmbulo da reivindicação independente 2 e, um método para a síntese destes materiais de acordo com o preâmbulo da reivindicação independente 1. Os materiais híbridos conhecidos podem ser usados como reagente de hidrofilicidade e podem ser aplicados às superfícies de várias substâncias, tais como uma superfície de resina e uma superfície revestida. Os materiais híbridos também podem ser utilizados como um reagente antibacteriano / antifúngico, o qual pode ser especialmente usado na forma de uma mistura dos mesmos com um cimento. 0 documento US 2007/0140951 AI divulga partículas nanométricas, processos de preparação e composições das mesmas. As nanopartícuias são à base de óxido de metal. Um exemplo de nanopartículas à base de óxido de metal são os nanocristais de óxido de cobre do sistema Cu/Cu20/Cu0. Os nanocristais de óxido de cobre são feitos por um processo que envolve a decomposição térmica de acetato de cobre(I) a uma temperatura elevada na presença de um agente tensioativo. Isto resulta em nanopartículas cristalinas e altamente mono dispersas de Cu20. A evidência de Cu2° na caraterização por XPS e ótica do nanocristal sugeriu a existência de uma camada fina de CuO amorfo na interface nanocristal - ligando.

Por conseguinte, há uma grande variedade de composições fungicidas / bactericidas representadas na literatura de patentes com formulações que incluem ácidos, compostos poliméricos, iões metálicos, 20 componentes indesejáveis, tais como agentes tensioativos ou óleos. Também são considerações o custo, a eficácia e a resistência bacteriana ou fúngica ao tratamento.

No que diz respeito ao cancro de citrinos, desenvolveu-se nos Estados Unidos uma situação crítica e particularmente grave. 0 cancro de citrinos é uma doença bacteriana de citrinos que provoca a queda prematura da folha e do fruto. Os sintomas da doença são exibidos nas folhas e frutos através de lesões elevadas, castanhas, rodeadas por uma margem ensopada em água, oleosa e um anel ou halo amarelo. As lesões antigas nas folhas podem cair, criando um efeito de buraco de bala. 0 cancro de citrinos não prejudica os seres humanos, animais ou plantas com exceção dos citrinos. No entanto, o cancro de citrinos afeta todos os tipos de citrinos, incluindo as laranjas, as laranjas azedas, a toranja, as tangerinas, os limões e as limas. 0 cancro faz com que a árvore de citrinos esteja continuamente em deterioração na saúde e na produção de fruto. Em última análise, a árvore não irá produzir nenhum fruto. 0 cancro de citrinos é altamente contagioso e pode ser transmitido rapidamente pela chuva com vento, cortadores de relva e outros equipamentos de paisagismo, pessoas que transportam a infeção nas mãos, roupas ou equipamento, na movimentação de plantas ou partes de plantas infetadas ou expostas. 0 Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) retirou o financiamento do programa de erradicação devido aos impactos de restrições legais e aos furacões de 2004/2005, que fizeram com que o cancro se espalhasse tanto que a erradicação jã não era possível. A Flórida está atualmente sob uma quarentena estadual pelo USDA e nenhum citrino pode deixar o estado, a menos que o USDA tenha emitido uma autorização limitada. Nenhum citrino cultivado na Flórida pode entrar em nenhuns estados ou territórios que produzam citrinos. Nenhumas plantas de citrinos ou partes podem entrar ou sair da Flórida.

Foram destruídas mais de 16 milhões de árvores na Flórida desde que o cancro foi identificado pela primeira vez na Flórida, em 1910. 0 estado da Flórida declarou por duas vezes que o cancro tinha sido erradicado, em 1933 e novamente em 1994, tendo a doença do cancro ressurgido uma terceira vez em 1995, perto do Aeroporto Internacional de Miami. Em 2008, a indústria de citrinos na Flórida está agora em quarentena por causa da doença do cancro que se espalhou pelos furacões de 2004/2005. Pomares, terra e árvores que foram em tempos produtivas estão a tornar-se improdutivas a um enorme custo para o estado e os seus cidadãos. 0 número de pomares comerciais na Flórida caiu de cerca de 857.000 acres em 1996 para 621.000 acres em 2006, de acordo com H. Florin em "The Sour State of Florida Citrus", publicado em linha em http: /,/www. time . com/ time/nation/article/0,8599,1836766,00.h tml para Time Magazine, em 28 de agosto de 2008.

Mundialmente, o cancro de citrinos é uma das doenças mais devastadoras que afetou seriamente a indústria de citrinos em mais de trinta países da Ásia, no Pacífico e ilhas do Oceano índico, na América do Sul e no sudeste dos EUA, tal como relatado por A. K. Das em "Citrus Canker-A review", J. Appl. Hort. 2003, 5 (1), 52-60. Esta doença é causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, uma bactéria Gram-negativa. 0 patogéneo provoca lesões necróticas nas folhas, caules e frutos. As infeções graves podem causar desfoliação, fruto muito deteriorado, queda prematura dos frutos, dieback dos ramos e declínio geral da árvore, tal como discutido por T. S. Schubert et al., em Plant Disease, 2001, 85 (4) . A tenacidade da doença do cancro de citrinos e infeção é discutida por C. H. Bock, et al., "Efficacy of Cankerguard(R) Sprays for Effective Decontamination of Citrus Canker" em Phytophology 2009, 99, (6) , página S13- resumo de apresentações, 2009 Encontro anual APS. Bock et al., descobriram que após o tratamento a infeção ocorreu, durante ou logo após, a inoculação, uma vez que a descontaminação não reduziu a incidência ou gravidade da doença. A consequência mais grave da infestação do cancro de citrinos é o impacto no comércio resultante de restrições ao transporte e venda interestadual e internacional de frutos provenientes de áreas infestadas, causando uma enorme perda económica cada ano. Os produtores de citrinos estão agressivamente à procura de um remédio robusto.

Existe uma necessidade contínua e urgente para o desenvolvimento de fungicidas / bactericidas novos e mais eficazes, que sejam baratos e fáceis de fabricar, que possuam atividade preventiva, curativa e sistémica para a proteção não só de árvores de citrinos, mas de todas as plantas cultivadas, com um mínimo de efeitos secundários fitotóxicos. A presente invenção usa a nanotecnologia para satisfazer a necessidade de um fungicida / bactericida barato, mais eficaz.

Para além disso, os desenvolvimentos inovadores da presente invenção são baseados em nanogel de sílica carregado com Cu (CuSiNG) . Em comparação com os produtos disponíveis comercialmente, a tecnologia de nanogel aqui mencionada demonstrou a sua superioridade ao melhorar a biodisponibilidade de Cu, a cobertura da superfície da planta e a longevidade e, fornece um meio para detetar quando o CuSiNG deve ser reaplicado para a máxima proteção. SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um método para sintetizar uma nanoformulação à base de sílica de acordo com a reivindicação independente 1 e, uma composição para o tratamento e prevenção de doenças em espécies de plantas de acordo com a presente reivindicação 2. As reivindicações dependentes 3 a 5 são dirigidas a formas de realização preferidas da composição da presente invenção.

Um primeiro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma composição e método para o fabrico de uma nanoformulação à base de sílica, que fornece um nanoambiente único para hospedar agentes antibacterianos e antifúngicos.

Um segundo objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica, que fornece um nanoambiente único para hospedar agentes antibacterianos e antifúngicos, com uma cinética de libertação controlada que estabelece um mecanismo de libertação sustentada.

Um terceiro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica, que proporciona um nanoambiente único para hospedar agentes antibacterianos e antifúngicos (anti-B/F) , para melhorar a eficácia dos agentes anti-B/F.

Um quarto objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação que consiste de nanopartícuias de sílica (SiNP) ou nanogel de sílica (SiNG) ou uma combinação de SiNP e SiNG.

Um quinto objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um método de fabrico ou de síntese simples, de baixo custo, para uma nanoformulação à base de sílica com conteúdo antibacteriano e antifúngico, que pode ser preparada no local em poucas horas, num método de síntese de recipiente único, sem necessidade de etapas de purificação.

Um sexto objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um método de fabrico ou de síntese simples, de baixo custo, para uma nanoformulação concentrada à base de sílica com conteúdo antibacteriano e antifúngico, que pode ser preparada no local e diluída para aplicação no campo por uma pessoa não especializada.

Um sétimo objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica com conteúdo antibacteriano e antifúngico para o tratamento de uma superfície propensa à doença do cancro de citrinos, que proporciona uma cobertura uniforme a essa superfície, uma adesão de superfície por um período satisfatório de tempo, uma libertação sustentada ao longo do tempo, um melhor controlo da libertação de anti-B/F, uma redução da toxicidade e stress para o meio ambiente na área tratada.

Um oitavo objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica com conteúdo antibacteriano e antifúngico para o tratamento de uma superfície propensa ã doença do cancro de citrinos com uma ampla gama de benefícios, incluindo, mas não se limitando a, adesão de superfície por um período satisfatório de tempo, libertação sustentada ao longo do tempo, controlo da libertação de anti-B/F, redução da toxicidade e stress para o meio ambiente na área tratada.

Um nono objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica com conteúdo antibacteriano e antifúngico, para o tratamento do cancro de citrinos e prevenção da doença do cancro durante um período de cinco a nove meses.

Um décimo objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica com conteúdo antibacteriano e antifúngico, para a indústria da agricultura (legumes, flores, relva e outras plantas), aplicações domésticas (tecidos, couro, plásticos, tintas e similares).

Um décimo primeiro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica carregada com cobre (Cu), com propriedades fertilizantes residuais para o solo, em que as folhas e ramos das plantas tratadas com a nanoformulação continuam a libertar nutrientes de Cu quando as folhas e os ramos caem no solo.

Um décimo segundo objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica carregada com cobre (Cu), com propriedades fertilizantes residuais para o solo, em que, quando as plantas e as árvores tratadas com a nanoformulação aqui mencionada são colhidas para cobertura vegetal ou composto, o solo é enriquecido com iões de Cu residuais.

Um outro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma nanoformulação à base de sílica carregada com cobre (Cu), com propriedades antifúngicas superiores para inibir o crescimento de bolor e míldio, durante pelo menos seis meses, através da libertação de um fungicida de uma maneira lenta e sustentada.

Para além dos objetivos mencionados anteriormente, os desenvolvimentos e melhorias inovadoras utilizando o nanogel de sílica carregado com Cu (CuSiNG) incluem um objetivo adicional de reduzir a população bacteriana na superfície da planta e folhagem, melhorando a biodisponibilidade de cobre.

Um outro objetivo da presente invenção consiste em otimizar a carga de cobre (Cu) de várias formas de valência (estados de Cu01' e Cu2°) , bem como as suas formas cristalina (óxido de Cu) e amorfa (complexado com uma matriz de sílica) de cobre dentro do nanogel de sílica, para controlar a cinética de libertação de cobre. É também um objetivo da presente invenção proporcionar cobre numa aplicação de pulverização de CuSiNG com longevidade de residência na planta, em que o CuSiNG se difunde para fora e cobre a superfície do tecido recém-exposta de frutos e folhas jovens em rápido crescimento, minimizando assim o número de aplicações por estação de crescimento.

Um outro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um nanogel de sílica fluorescente, que incorpora um corante à base de ruténio (RuCuSiNG) para fornecer um meio para medir a propriedade de difusão de CuSiNG, observando visualmente a propriedade de adesão de CuSiNG e determinando quando é necessária a reaplicação de CuSiNG.

Um método preferido para sintetizar uma nanoformulação à base de sílica que contém agentes antibacterianos e antifúngicos usando um processo sol-gel de um recipiente único, catalisado por ácido, inclui a seleção de um recipiente de reação contendo um meio de reação ácido, a adição de tetraetoxissilano (TEOS), água, etanol e um agente antibacteriano ou antifúngico que contém iões de cobre ao recipiente de reação com o meio ácido para formar uma mistura I, permitir que a reação da mistura I continue durante aproximadamente uma hora para facilitar a formação de uma pluralidade de nanopartícuias à base de sílica, a adição de um agente de neutralização após a formação de uma pluralidade de nanopartículas para ajustar o valor do pH da mistura de reação para aproximadamente 7,0, permitir que a reação neutralizada da mistura I continue durante aproximadamente 12 horas, de preferência durante a noite, para permitir que ocorra gelificação, em que a estrutura do nanogel consiste em nanopartículas interligadas e, a recolha de um nanogel poroso à base de sílica que possui agentes antibacterianos e antifúngicos ligados numa pluralidade de nanopartículas interligadas do nanogel. 0 meio de reação ácido preferido do método é uma solução aquosa de um ácido selecionado de entre ácido clorídrico, ácido sulfúrico e ácido nítrico. O agente antibacteriano ou antifúngico preferido é uma pluralidade de iões de cobre (Cu) provenientes de um composto de cobre. É também preferido que a reação da mistura I ocorra a temperaturas e pressões ambiente. É preferido que a pluralidade de nanopartículas interligadas do nanogel contenha uma pluralidade de iões de Cu ligados eletrostaticamente ao núcleo da nanopartícula, uma pluralidade de iões de Cu ligados covalentemente a uma superfície envoltório hidratada e nanoporos da nanopartícula e, uma pluralidade de óxido / hidróxido de Cu como nanoclusters / nanopartículas ligados à superfície da nanopartícula.

Uma composição e método preferido para o tratamento e prevenção de doenças em espécies de plantas consiste de uma nanoformulação à base de sílica, de preferência, contendo uma pluralidade de iões de cobre incorporados numa pluralidade de nanopartícuias de sílica e, mais preferencialmente, uma pluralidade de iões de cobre incorporados num nanogel de sílica. De preferência, a pluralidade de iões de cobre é de compostos de cobre, tais como, o cobre metálico, o óxido de cobre, o oxicloreto de cobre, o sulfato de cobre, o hidróxido de cobre e misturas dos mesmos.

De preferência, a planta doente tratada pela composição preferida é um membro das espécies de citrinos, em que a doença é o cancro de citrinos provocado por qualquer espécie de Xanthomonas. É preferido que durante o tratamento, a pluralidade de iões de cobre (Cu) seja libertada de uma forma sustentada para tratamento a longo prazo da planta, durante um período de tempo de pelo menos seis meses.

Um método preferido para o tratamento ou prevenção de doenças em espécies de plantas compreende a aplicação às espécies de plantas de uma composição que compreende uma nanoformulação à base de sílica, em que a composição preferida compreende ainda uma pluralidade de iões de cobre incorporados numa pluralidade de nanopartícuias de sílica, mais preferencialmente, uma pluralidade de iões de cobre incorporados num nanogel de sílica. A composição inclui ainda uma pluralidade de iões de cobre de compostos de cobre, tais como, o cobre metálico, o óxido de cobre, o oxicloreto de cobre, o sulfato de cobre, o hidróxido de cobre e misturas dos mesmos.

Um método preferido para o tratamento e inibição do crescimento de bolor e míldio numa superfície selecionada a partir do grupo que consiste em paredes exteriores e interiores de edifícios, tetos, argamassa de azulejos de cerâmica e acessórios de casa de banho, compreende a aplicação de uma composição que compreende uma nanoformulação à base de sílica à superfície. A nanoformulação à base de sílica preferida é uma pluralidade de nanopartícuias interligadas do nanogel que contém uma pluralidade de iões de Cu ligados eletrostaticamente ao núcleo da nanopartí cuia, uma pluralidade de iões de Cu ligados covalentemente a uma superfície envoltório hidratada e nanoporos da nanopartícula e, uma pluralidade de óxido / hidróxido de Cu como nanoclusters / nanopartículas ligados à superfície da nanopartícula. A fonte preferida da pluralidade de iões de Cu é selecionada de entre o cobre metálico, o óxido de cobre, o oxicloreto de cobre, o sulfato de cobre, o hidróxido de cobre e misturas dos mesmos.

Um método preferido para a adição de nutrientes ao solo inclui o tratamento da vegetação com uma formulação de nanopartículas de sílica carregada com cobre (Cu), permitir que as folhas e ramos caiam no solo e, deixar que as folhas e os ramos tratados se biodegradem e que, consequentemente, fertilizem o solo com nutrientes de ião de Cu de uma forma não fitotóxica, de libertação lenta.

Um outro método preferido para a adição de nutrientes ao solo inclui o tratamento da vegetação com uma formulação de nanopartículas de sílica carregada com cobre (Cu), a colheita e cominuição da vegetação para formar cobertura vegetal ou composto e, espalhar a cobertura vegetal ou composto sobre o solo para permitir a lixiviação de nutrientes de ião de Cu de uma forma não fitotóxica, de libertação lenta, com exposição a condições atmosféricas selecionadas de entre, pelo menos, chuva, vento, neve e luz solar. É proporcionada uma nanoformulação à base de sílica preferida, em que uma matriz de sílica tem um nanogel de sílica carregado com ião de cobre (CuSiNG), que hospeda simultaneamente duas formas ativas de cobre, em que uma primeira forma de cobre é amorfa e uma segunda forma de cobre é cristalina e, o equilíbrio estabelecido pelas duas formas ativas de cobre pode ser ajustado para controlar a cinética de libertação de iões de cobre e melhorar a biodisponibilidade de iões de cobre.

Uma outra nanoformulação à base de sílica preferida exibe uma propriedade em que uma pluralidade de iões de cobre se difunde para fora a partir de um local de aplicação sobre uma superfície de tecido de planta num ambiente húmido e, cobre a superfície do tecido exposta de frutos e folhas em rápido crescimento, minimizando assim a frequência de aplicação por estação de crescimento e aumentando a cobertura da superfície da planta e longevidade da cobertura. É também preferido que a formulação à base de sílica da presente invenção inclua ainda um composto precursor de silano para alcançar a cobertura uniforme da superfície da planta, modular a taxa de libertação de iões de cobre, melhorar a resistência à chuva e aumentar a longevidade da cobertura da superfície da planta. Um composto precursor de silano preferido é o metilfosfonato de 3-(trihidroxisilil) propilo (THPMP).

Uma outra nanoformulação à base de sílica preferida inclui um corante fluorescente à base de ruténio (RuCuSiNG), para avaliar a níveis microscópicos as propriedades de adesão do nanogel de sílica (SiNG) e, um corante fluorescente à base de ruténio preferido é o hexahidrato de tris (2,2'-bipiridil diclororuténio) (Rubpy) e, o corante fluorescente à base de ruténio, hexahidrato de tris (2,2'-bipiridil diclororuténio) (Rubpy), é usado para monitorizar a libertação, em tempo real, de iões de cobre a partir do nanogel de sílica carregado com cobre (CuSiNG).

Para além disso, o corante fluorescente à base de ruténio preferido, hexahidrato de tris (2,2'-bipiridil diclororuténio) (Rubpy), é usado para medir a quantidade de nanogel de sílica carregado com cobre (CuSiNG) remanescente sobre a superfície de uma planta, para determinar se é necessária uma aplicação repetida. É proporcionada uma nanoformulação à base de sílica híbrida mais preferida, em que uma matriz de sílica inclui uma pluralidade de iões de cobre e um precursor de silano, metilfosfonato de 3-(trihidroxisilil) propilo (THPMP), carregados no nanogel de sílica carregado com cobre (CuSiNG), para alcançar uma cobertura uniforme da superfície da planta e fornecer uma cobertura de superfície que se expande com o crescimento da planta.

Outros objetos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue de uma forma de realização presentemente preferida, que está ilustrada esquematicamente nos desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura la é um gráfico que mostra o aumento exponencial de moléculas de superfície como uma função do tamanho de partícula decrescente. (técnica anterior) A figura 1b é um gráfico da relação entre a área de superfície específica de uma partícula esférica e o tamanho da partícula (diâmetro em nm) . (técnica anterior) A figura 2 é uma representação esquemática da nanoformulação à base de sílica da presente invenção, que mostra uma nanopartícula de sílica carregada com cobre (Cu) (CuSiNP). A figura 3 é uma imagem de microscopia eletrónica de transmissão (TEM) de uma formulação de nanogel de sílica carregada com cobre (CuSiNG), que consiste em nanopartículas de sílica de aproximadamente 10 nm de diâmetro, que estão interligadas. A figura 4a mostra o material de nanogel de sílica carregado com cobre (Cu) (SiNG) disperso em água. A figura 4b mostra o CuSiNG dispersível em água após centrifugação com a separação do resíduo do líquido sobrenadante. A figura 4c mostra uma mistura de CuSiNG dispersível em água tratada com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA, um forte agente quelante) a formar um complexo de Cu-EDTA solúvel em água. A figura 4d mostra o complexo Cu-EDTA solúvel em água após centrifugação, com a separação do complexo de Cu-EDTA e um resíduo de nanogel de sílica (SiNG). A figura 5 é um padrão de difração de raios X (DRX) de uma amostra de CuSiNG e um bactericida / fungicida disponível comercialmente, DuPont™ Kocide® 3000. A figura 6a é o espetro de espetroscopia fotoeletrónica de raios X de alta resolução (XPS) da amostra de CuSiNG, que mostra picos de Cu 2p. A figura 6b é a espetroscopia fotoeletrónica de raios-X (XPS) de uma amostra de CuSiNG, que mostra o espetro a nível do núcleo de Cu 2p sem picos satélite. A figura 6c é o espetro de espetroscopia fotoeletrónica de raios X (XPS) para o oxigénio (0) ls numa amostra de CuSiNG. A figura 6d é o espetro de espetroscopia fotoeletrónica de raios X (XPS) para o silício (Si) 2p3 numa amostra de CuSiNG. A figura 7a é um desenho de um ensaio de difusão em disco de CuSiNG disperso em água desionizada com um pH de aproximadamente 7. A figura 7b é um desenho de um ensaio de difusão em disco de solução de sulfato de cobre (CuS04) em água desionizada. A figura 7c é um desenho de um ensaio de difusão em disco do fungicida / bactericida Kocide® 3000 de DuPont™ disperso em água desionizada. A figura 8 é uma imagem digital de uma folha de limoeiro feita 5 dias após a aplicação inicial de uma nanoformulação à base de sílica da presente invenção (CuSiNG) ser exposta a condições de chuva forte, vento e trovoada num ambiente ao ar livre. A figura 9a mostra uma imagem de campo digital de CuSiNG na superfície da folha antes de a água da chuva ser pulverizada na superfície da folha. A figura 9b é um desenho da imagem fluorescente da folha na figura 9a, que mostra a adesão de CuSiNG antes de a água da chuva ser pulverizada na superfície da folha. A figura 9c mostra uma imagem de campo digital de CuSiNG na superfície da folha após aproximadamente 5 minutos de pulverização contínua de água da chuva na superfície da folha. A figura 9d é um desenho da imagem fluorescente da folha na figura 9c, que mostra a adesão de CuSiNG após aproximadamente 5 minutos de pulverização contínua de água da chuva na superfície da folha. A figura 10a mostra a formação de uma estrutura tipo rede interligada de CuSiNG. A figura 10b mostra o aparecimento de zonas escuras dispersas na matriz de sílica, confirmando a presença de materiais ricos em eletrões na matriz amorfa. A figura 10c mostra o padrão de difração de eletrões da área selecionada (SAED) de CuSiNG, o que indica a formação de CuSiNG amorfo. A figura lOd é uma imagem de microscopia eletrónica de transmissão de alta resolução (HRTEM), que revela a formação de partículas de contraste escuro de 1 - 3 nanómetros (nm) de cristais de Cu20, confirmado por medição de espaçamento de malha, incorporadas numa matriz de sílica amorfa. A figura 11a é uma imagem de um disco tratado com CuSiNG (ensaio de difusão em disco), que mostra uma área sem crescimento de Xanthomonas alfafa (X. alfalfae) , um substituto do cancro de citrinos em redor do disco central. A figura 11b é uma imagem de um disco tratado com

Kocide® 3000 (ensaio de difusão em disco), que mostra uma área sem crescimento de X. alfafa em redor do disco central saturado com Kocide® 3000, em que a área sem crescimento de X. alfalfae em redor do disco central é menor do que a área sem crescimento em redor do disco tratado com CuSiNG de igual teor de Cu metálico na figura 11a. A figura 11c é uma imagem de um disco tratado com sulfato de Cu (ensaio de difusão em disco), que mostra uma área sem crescimento de X. alfalfae em redor do disco central saturado com sulfato de Cu, em que a área sem crescimento de X. alfalfae em redor do disco central é menor do que a área sem crescimento em redor do disco tratado com CuSiNG de igual teor de Cu metálico na figura 11a e do disco tratado com Kocide® 3000 de igual teor de Cu metálico na figura 11b. A figura lld é uma imagem de um disco tratado com o nanogel de sílica (SiNG) (ensaio de difusão em disco), que mostra crescimento de X. alfalfae a rodear completamente o disco central tratado com SiNG, confirmando assim que SiNG não tem propriedades ant. ibac terianas . A figura 12a é uma imagem de fluorescência de um disco em branco sobre uma placa de nutriente de ágar. A figura 12b é uma imagem fluorescente de um disco tratado com RuSiNG na placa de nutriente de ãgar da figura 12a após refrigeração durante 7 dias. A figura 12c é uma imagem fluorescente da placa de nutriente de ágar da figura 12b, em que o disco tratado com RuSiNG foi removido.

A figura 13a é um desenho de um material de SiNG carregado com corante fluorescente (Rubpy) (RuSiNG) aplicado a uma superfície da folha, antes de se lavar a folha. A figura 13b é um desenho de uma superfície da folha à qual é aplicada RuSiNG após uma lavagem de um minuto (1 min) sob uma torneira com muito fluxo. A figura 13c é um desenho de uma superfície da folha com uma aplicação de RuSiNG após uma lavagem de 6 minutos sob uma torneira com muito fluxo. A figura 13d é um desenho de uma superfície da folha com uma aplicação de RuSiNG após uma lavagem de 16 minutos sob uma torneira com muito fluxo. A figura 14a mostra, à esquerda, um tubo centrifugado de RuCuSiNG e, à direita, um tubo de ensaio de material de RuCuSiNG centrifugado tratado com EDTA, tal como aparece sob luz ambiente. A figura 14b mostra, à esquerda, um tubo centrifugado de RuCuSiNG e, à direita, um tubo de ensaio de material de RuCuSiNG centrifugado tratado com EDTA, tal como aparece sob iluminação de uma fonte de excitação de mão de UV a 366 nm.

DESCRIÇÃO DA FORMA DE REALIZAÇÃO PREFERIDA

Antes de explicar em detalhe a forma de realização divulgada da presente invenção, deve ser entendido que a invenção não está limitada na sua aplicação aos detalhes da disposição particular mostrada, uma vez que a invenção é capaz de outras formas de realização. Para além disso, a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrição e não de limitação.

Seria útil discutir o significado de alguns termos e abreviaturas aqui utilizados para explicar a invenção em maior detalhe.

Cu representa o elemento de cobre metálico.

CuSiNG representa o nanogel de sílica carregado com cobre.

CuSiNP representa a nanopartícula de sílica carregada com cobre.

Fungicida / bactericida Kocide® 3000; Kocide é uma marca registada de E.I. du Pont de Nemours and Company. NG representa nanogel, que é a substância semelhante a gel formada pela interligação de nanopartículas. NP representa nanopartículas, que têm um tamanho de partícula de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 50 nm.

Ru representa Rubpy, um corante fluorescente à base de ruténio, hexahidrato de tris (2,2'-bipiridil diclororuténio) [Ru(bpy)]. É adequado para utilização na presente invenção qualquer corante fluorescente ou nanopartícula fluorescente (tais como pontos quânticos) que sofra extinção de fluorescência na presença de Cu ou qualquer outro dito agente / ingrediente ativo antibacteriano / antifúngico.

Si é aqui utilizado para significar dióxido de silício, que também é comummente conhecido como "sílica". A presente invenção envolve uma aplicação única de nanociência e nanotecnologia para desenvolver um material de nanogel de sílica carregado com cobre Cu (11) (CuSiNG). A nanotecnologia permite a manipulação de um nanoambiente de sílica em redor de Cu, que estabelece um mecanismo sustentado de libertação de iões de Cu. 0 novo design de CuSiNP mostrado na figura 2 permite a associação de cobre (Cu) ao NG de sílica em três formas diferentes, permitindo a libertação sustentada de Cu. Em primeiro lugar, iões de Cu ligados eletrostaticamente no núcleo 10. Em segundo lugar, Cu ligado covalentemente na superfície da partícula hidratada 20 e nanoporos 30. Em terceiro lugar, Cu ligado à superfície como nanoclusters / nanopartículas de hidróxido / óxido 40. A estrutura do nanogel consiste em nanopartículas ultrapequenas (CuSiNPs), inferiores a aproximadamente 50 nm de diâmetro, para proporcionar uma melhor cobertura da superfície da planta e melhores propriedades de adesão. Todas estas caraterísticas atraentes irão formar uma base sólida para a proteção a longo prazo das plantas de patogéneos, utilizando o material de CuSiNG.

Devido à engenharia de nanoescala, o CuSiNG da presente invenção tem as seguintes vantagens sobre os compostos à base de Cu existentes: uma cobertura uniforme da superfície da planta por causa do tamanho de partícula ultrapequeno, uma melhor propriedade de adesão devido à nanoestrutura semelhante a gel, um perfil de libertação de Cu sustentado (a longo prazo), um melhor controlo sobre a taxa de libertação de Cu (razão ajustável de Cu "solúvel" para "insolúvel"), mais atividade antibacteriana / antifúngica com menos quantidade de teor de Cu, um efeito fitotóxico reduzido por causa da razão ajustável de Cu "solúvel" para "insolúvel" e seguro para o ambiente devido ao menor teor de Cu, nenhuma formação de subproduto prejudicial, uma síntese à base de água, utilização de CuSiNG em excesso como nutriente de plantas e uma possibilidade mínima de ter concentração local de Cu elevada que poderia causar toxicidade ambiental. 0 protocolo de síntese tem as vantagens que se seguem: (i) simplicidade, (ii) à base de água, (ii) adaptável a aplicações de campo, (iii) método de síntese em recipiente único, sem necessidade de etapas de purificação e (v) o material de CuSiNG concentrado pode ser facilmente diluído para aplicação em campo. Uma pessoa não especialista pode fazer esta tarefa através da adição de uma quantidade adequada de água, reduzindo assim os custos de envio. 0 método também utiliza matérias-primas químicas de baixo custo e é facilmente produzido de uma maneira economicamente eficiente.

Exemplo 1 - Síntese de CuSiNG A síntese do nanogel de cobre / sílica (CuSiNG) foi levada a cabo à temperatura ambiente por meio de um processo sol-gel de uma etapa, catalizada por ácido, utilizando tetraetoxissilano (TEOS), água, etanol e sulfato de Cu (II) . A hidrólise, tal como mostrada de seguida na equação 4 e as reações de condensação nas equações 5 e 6 abaixo, resultaram na formação de nanopartícuias ultrapequenas de sílica carregadas com Cu (CuSiNPs) (< 10 nm de tamanho). Quando mantidas em condições ácidas durante várias horas, dá-se a ocorrência de gelificação. A figura 3 mostra a formação de CuSiNG quando as CuSiNPs estão interligadas. (RO) 3SiOR + H20 --> (RO) 3SiOH + ROH (4) 2 (RO) 3SiOH --> (RO) 3Si-0-Si (OR) 3 + H20 (5) (RO) 3SiOH + ROSi (OR) 3 --> (R0)3Si-0-Si(0R)3 + ROH (6) O processo geral de síntese irá envolver duas etapas simples: primeiro, a adição de sais de Cu (II) ao meio de reação ácido no início da síntese de nanopartícuias e, segundo, a adição de um agente de neutralização, tal como, hidróxido de sódio (NaOH) após a síntese para ajustar o pH para 7,0. 0 meio de reação ácido é formado com qualquer ácido inorgânico, tal como o ácido clorídrico (HC1), o ácido sulfúrico (H2S04) , o ácido nítrico (HN03) e semelhantes. O agente de neutralização é qualquer composto com um pH alcalino, tal como o hidróxido de sódio, o hidróxido de amónio, o hidróxido de potássio e semelhantes. A gelificação de partículas sol terá lugar ao longo do tempo. A viscosidade do gel resultante pode ser facilmente controlada por ajuste do pH e do tempo entre estas duas etapas simples de síntese. Esta é uma técnica simples de síntese, de um recipiente único e com duração de muito poucas horas, que não requer purificação. Devido a esta simplicidade, é viável a produção de CuSiNG em grande escala, escala de multitonelada. 0 processo é seguro para o ambiente, porque é uma técnica de "síntese verde" à base de água, que resulta na ausência de subprodutos prejudiciais, tanto a sílica como o Cu são encontrados naturalmente no meio ambiente, o CuSiNG terá Cu "insolúvel" em níveis baixos e o CuSiNG não vai elevar os níveis locais de Cu no solo, uma vez que vai ser consumido como um nutriente de plantas. 0 método também utiliza matérias-primas químicas de baixo custo prontamente disponíveis para a síntese de CuSiNG.

Para estudar a ligação de Cu iónico a SiNG, ê sintetizado CuSiNG num meio de reação de pH ácido, tal como uma solução de ácido clorídrico a 1 %. No entanto, não é adicionado um agente de neutralização. 0 material de CuSiNG é recolhido por centrifugação para remover o sobrenadante que contenha quaisquer iões de Cu livres. 0 CuSiNG é lavado várias vezes com água desionizada (Dl). Neste material de CuSiNG, a superfície de CuSiNP estará livre de precipitado de hidróxido / óxido de Cu e o Cu apenas vai ser encontrado na sua forma iónica e, é daqui em diante identificado como "CuSiNP-limpo". 0 CuSiNG (nanogel) consiste em CuSiNPs (partículas) interligadas de tamanho uniforme ultrapequeno, tal como mostrado na figura 2, que formam uma estrutura semelhante a gel, tal como mostrado na figura 3. Estas CuSiNPs vão ter uma nanoestrutura de núcleo-envoltório. 0 núcleo 10 irá consistir de sílica carregada com iões de Cu e o envoltório 20 vai sustentar os nanoclusters de hidróxido / óxido de Cu 40 que vão ser depositados sobre a superfície do envoltório 20. 0 tamanho da CuSiNP é ajustável e o tamanho de partícula varia de 10 nm a 50 nm, controlando o processo de nucleação e crescimento. A razão da variação do tamanho de partícula é controlar a razão de superfície para volume. Um maior tamanho de partícula terá menos área de superfície, mas mais volume de núcleo. Isto irá proporcionar uma oportunidade única para manipular a razão de Cu iónico no núcleo de CuSiNP 20 para o Cu iónico ligado à superfície 40. Deve também notar-se que a sílica amorfa é altamente porosa, consistindo de numerosos nanoeanais hidratados 30. O diâmetro do canal é tipicamente de 1 - 2 nm. As moléculas de água e etanol preenchem a pluralidade de nanocanais (ligadas através de ligações de hidrogénio) e fornecem um nanoambiente único aos iões de Cu. Deve notar-se que a polaridade e a capacidade de ligação de hidrogénio podem ser facilmente ajustadas dentro do nanocanal 30, fazendo variar a razão de etanol para água, proporcionando um bom controlo sobre a libertação de iões de Cu a partir dos canais. O núcleo 10 da partícula tem um ambiente polar reduzido e é desprovido de moléculas de solvente. Este ambiente irã facilitar a formação de nanocristais de sal de Cu, onde os iões de Cu e de sulfato estarão presentes num ambiente polar reduzido, tal como mostrado na figura 2.

No CuSiNG, o Cu iõnico ligado à superfície irã preencher a superfície da partícula, bem como na interface partícula - partícula. Portanto, o design único da CuSiNP fornece três nanoambientes diferentes de Cu: (i) Cu mantido eletrostaticamente no núcleo 10, isto é, Cu iónico no núcleo do NG; (ii) Cu iónico ligado covalentemente dentro dos nano-canais 30, na superfície da partícula 20 e na interface e (iii) Cu depositado sobre a superfície da partícula na sua forma de hidróxido / óxido 40; a forma de superfície 40 de Cu será altamente exposta ao ambiente circundante. O Cu presente nestes três nanoambientes irá estabelecer diferentes cinéticas de libertação de Cu que podem ser controladas de forma sustentada. É esperado que o CuSiNG tenha uma cobertura muito uniforme na superfície da planta, devido ao menor tamanho de partícula. Mais uma vez, é esperada uma propriedade de adesão à superfície muito melhorada, por causa da nanoestrutura semelhante a gel do CuSiNG (já que tem a vantagem de propriedade de adesão combinada de CuSiNPs individuais na rede). O novo design do CuSiNG fornece mais Cu solúvel ("livre e ativo") para uma melhor atividade antifúngica / antibacteriana, apesar de que vai ter menor teor de Cu metálico por grama de material. Durante a aplicação da pulverização no campo, alguma quantidade do CuSiNG vai ser depositado no solo, servindo como nutriente à base de Cu para a planta. Portanto, irá ser utilizado um teor reduzido de Cu no CuSiNG com dois propósitos: primeiro, como um micronutriente essencial e, segundo, como um fungicida / bactericida, ao mesmo tempo que minimiza a toxicidade relacionada com Cu no ambiente.

Exemplo 2 - Ligação de cobre ao nanogel de sílica A ligação de Cu ao SiNG foi claramente evidente através do aparecimento da cor azul do produto mostrado na figura 4a. O produto é dispersível em água. Após a centrifugação, foi obtido um resíduo azul e o sobrenadante estava transparente, tal como mostrado na figura 4b. Em contraste, o NG de sílica, quando preparado na ausência de iões de Cu, apresentou a cor branca caraterística da sílica.

Para avaliar o quão bem o Cu se ligou ao NG de sílica, o CuSiNG foi tratado com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) , um quelante poderoso de iões de Cu. Ao fim de alguns minutos, formou-se um complexo de Cu-EDTA solúvel em água, tal como mostrado na figura 4c. Após a centrifugação, foi obtido um resíduo de cor branca de NG sílica e sobrenadante de cor azul de complexo de Cu-EDTA, tal como mostrado na figura 4d. Estes resultados demonstram claramente que a ligação do Cu à sílica não é tão forte como no complexo de Cu-EDTA. Portanto, o Cu carregado poderia ser libertado lentamente na sua forma iónica do CuSiNG.

Caraterização do produto de CuSiNG.

As amostras foram caraterizadas por microscopia eletrónica de transmissão (TEM), difração de raios X (XRD), espetroscopia fotoeletrónica de raios X (XPS) e espetroscopia por dispersão de energia (EDS).

Tamanho 0 tamanho do CuSiNG foi determinado usando microscopia eletrónica de transmissão (TEM). 0 CuSiNG consistiu de nanopartícuias interligadas de tamanho ultrapequeno (~ 10 nm) (NPs), formando uma nanoestrutura semelhante a gel, tal como mostrado na figura 3. A difração de raios X (XRD) foi usada para determinar a cristalinidade (se existente) do CuSiNG e comparar com os dados de Kocide® 3000. 0 padrão de XRD distingue claramente o CuSiNG de Kocide® 3000. Tal como mostrado na figura 5, o Kocide® 3000 foi principalmente material de hidróxido / óxido de Cu cristalino, enquanto que o CuSiNG foi puramente amorfo em natureza. A microscopia eletrónica de varrimento com espetroscopia por dispersão de energia (SEM-EDS, uma técnica de análise elementar) mostrou que a quantidade de Cu (em percentagem atómica, estimativa qualitativa) presente em Kocide® 3000 e no CuSiNG é, respetivamente, de 54 % at. e 13 % at. O estado de oxidação do Cu no CuSiNG foi determinado por espetroscopia fotoeletrónica de raios X (XPS). A XPS é capaz de fornecer informação sobre o estado de oxidação de cada componente na amostra, bem como a composição da superfície de amostra.

Energia de ligação (eV)

Os espetros regionais de alta resolução da composição elementar principal fornecem informações detalhadas de componentes individuais, tais como deslocamento químico e mudanças de intensidade, indicando mudanças de ligação entre os elementos individuais. Os espetros por XPS de alta resolução do cobre (Cu) 2p, oxigénio (O) Is e sílica (Si) 2p3 são mostrados na figura 6. Os picos de Cu 2p à energia de ligação de 933,3 eV foram atribuídos ao Cu2° ambiente. Os picos satélite largos a energias de ligação mais altas também sugerem a presença de estados iónicos de Cu‘'°. A componente de energia de ligação mais alta situada em 935,2 eV foi atribuída a espécies de Cu (OH) 2 - Os picos de O ls e Si 2p3 foram localizados, respetivamente, na energia de ligação de 532,1 eV e 103,1 eV. A energia de ligação de Si 2p correlaciona-se bem com os dados publicados pelo National Institute of Standard and Technology dos EUA, que é o Si na amostra de CuSiNG na forma de Si02.

Análise da composição A análise composicional semiquantitativa é possível através da comparação dos dados de XPS e de EDS, uma vez que a XPS é um método sensível à superfície e a EDS é um método em massa de análise composicional. Foram determinadas as razões atómicas de Si/Cu por XPS e EDS integrando as áreas de pico e dividindo pelos fatores de sensibilidade. As razões de Si/Cu dos dados de EDS e XPS foram identificadas, respetivamente, como 2,3 e 7,3, confirmando que o Cu é distribuído por todo o CuSiNG. Atividade antibacteriana A avaliação da atividade antibacteriana de CuSiNG foi realizada utilizando E. colí como um sistema modelo. 0 ensaio de difusão em disco, considerado como um dos métodos microbiológicos mais comuns para a avaliação de potenciais agentes antibióticos, foi usado para avaliar a atividade antimicrobiana do material de CuSiNG. Especificamente, as E. coli (estirpe 8739 da ATCC) cultivadas em placas de nutriente de ágar foram incubadas com discos de papel de filtro contendo igual volume e concentração de Cu de soluções aquosas de Kocide® 3000 50, sulfato de Cu (pH 7) 60, CuSiNG (pH 7) 70 ou de nanopartícuias de sílica pura (NPs) (pH 7) (não mostrado) . Após uma incubação durante a noite a 37 °C, verificou-se que o CuSiNG exibiu uma atividade antimicrobiana muito significativa, tal como mostrado na figura 7a, indicada por uma zona livre delimitada que se estende a partir do disco correspondente 70. Notavelmente, a atividade do CuSiNG foi mais pronunciada do que a da solução de sulfato de cobre no disco 60, tal como mostrado na figura 7b e de Kocide® 3000 no disco 50, tal mostrado na figura 7c, embora o teor de Cu no CuSiNG seja cerca de 4 vezes menos do que o teor de Cu em Kocide® 3000 (tal como determinado pelas medições de SEM-EDS) . A área sem crescimento de E. coli em redor do disco de papel de filtro 50 com Kocide® 3000 é aproximadamente metade da área sem crescimento de E. coli para o disco 70 com CuSiNG, o que confirma a eficácia da formulação de CuSiNG com um quarto do teor de cobre, a formulação de CuSiNG tem duas vezes a atividade antimicrobiana de Kocide® 3000. Deve notar-se que o NG de sílica pura, preparado sem os iões de Cu, não mostrou qualquer atividade antibacteriana.

Propriedade de adesão A análise da propriedade de adesão de CuSiNG foi avaliada qualitativamente num limoeiro. A planta foi obtida numa loja de ferragens Home Depot® em Orlando, FL. Num procedimento experimental típico, uma primeira pulverização de uma suspensão aquosa de CuSiNG e Kocide® 3000 foi pulverizada uniformemente a uma distância de 6 polegadas sobre meia dúzia folhas experimentais pré-selecionadas, designadas para cada amostra, utilizando uma garrafa de pulverização de mão. 0 excesso de líquido gotejou para fora da superfície da folha. Nesta fase, foram tiradas imagens digitais da superfície da folha pulverizada com Kocide® 3000, CuSiNP e CuSiNG, os resultados de adesão são registados na tabela II que se segue. 0 líquido pulverizado foi deixado secar completamente e foram novamente tiradas imagens da superfície da folha seca pulverizada com Kocide® 3000 e CuSiNG. Cerca de 2 horas mais tarde, foi pulverizada continuamente água da chuva natural durante aproximadamente 5 minutos, sobre as mesmas folhas experimentais e, as folhas com uma pulverização contínua de água da chuva foram deixadas secar completamente. Nesta fase, são avaliadas visualmente para a adesão de agente antibacteriano / antifúngico à superfície da folha as imagens digitais das folhas secas com uma primeira pulverização de Kocide® 3000, CuSiNP e CuSiNG e uma segunda pulverização de água da chuva. É usada uma escala de 1 a 5 para avaliar a adesão. 1 = 1 - 5 % da composição antibacteriana / antifúngica está na superfície da folha; 2 = 6 - 15 % da composição antibacteriana / antifúngica está na superfície da folha; 3 = 16 - 40 % da composição antibacteriana / antifúngica está na superfície da folha; 4 = 41 - 75 % da composição antibacteriana / antifúngica está na superfície da folha,· 5 = 76 - 95 % da composição antibacteriana / antifúngica está na superfície da folha.

Tabela II - Adesão da composição antibacteriana / _antifúngica à superfície da folha_

PRODUTO KOCIDE® CuSiNP CuSiNG __3000___

Primeira pulverização (produto 5 55 aplicado)__

Secagem__4__4 5

Segunda pulverização (5 minutos - - de água da chuva)___

Secagem__2__3 4

Produto na folha_ 1 2 4

Os resultados indicam claramente a propriedade de adesão superior da suspensão de CuSiNG em relação a Kocide® 3000. Tal como esperado, o CuSiNG mostrou uma cobertura mais uniforme sobre a superfície da folha. Curiosamente, a aplicação de CuSiNG a uma folha de limoeiro resistiu muito bem à queda forte de chuva e trovoada que foi experimentada continuamente durante cinco dias e, é mostrado na figura 8; uma imagem ampliada de uma folha de limoeiro com uma cobertura protetora marmoreada e visualmente percetível de CuSiNG. A maior parte da formulação de Kocide® 3000 foi removida após um par de minutos de pulverização de água da chuva.

Para avaliar ainda mais a propriedade de adesão de CuSiNG, foi usada uma técnica de fluorescência. As folhas de limoeiro foram marcadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC), um corante fluorescente de emissão verde. 0 corante ligou-se covalentemente à sílica. 0 objetivo da marcação de fluorescência foi monitorizar a propriedade de adesão de SiNG de uma forma mais sensível usando medições de fluorescência. Foi criada uma matriz de pontos na folha experimental mostrada na figura 9a com material de SiNG fluorescente e, foi deixada secar completamente sob um ambiente escuro para evitar a fotodegradação dos corantes FITC.

Usando uma fonte de luz UV portátil (366 nm de excitação multibanda), foram claramente observados pontos de fluorescência verde a partir da superfície da folha antes da pulverização de água da chuva. A figura 9b é um desenho da imagem fluorescente que mostra os pontos fluorescentes de CuSiNG no mesmo padrão que a folha na figura 9a.

Depois de aproximadamente 3 horas, foi pulverizada água da chuva natural durante cerca de 5 minutos sobre a folha na figura 9b, a pulverização foi deixada secar completamente, novamente no escuro e, a folha seca é mostrada na figura 9c, com vários pontos de CuSiNG sobre a superfície. Usando uma fonte de luz UV portátil (366 nm de excitação multibanda) , foram claramente observados pontos de fluorescência verde a partir da superfície da folha após a pulverização de água da chuva. A figura 9d é um desenho da imagem fluorescente que mostra o material de CuSiNG fluorescente ainda aderido à folha na figura 9c, num padrão similar ao mostrado na folha da figura 9c. As imagens fluorescentes nas figuras 9b e 9d confirmam que o material de CuSiNG não é removido da folha quando esta é submetida a pulverização de água da chuva. A enorme área de superfície dos materiais de nanogel (NG) é, de facto, um fator que contribui para a libertação de uma quantidade adequada de Cu "solúvel". A matriz de nanogel de sílica (SiNG) é porosa e a superfície é altamente hidratada, tal como divulgado por S. Santra et al. , em "Fluorescence Lifetime Measurements to Determine the Core-Shell Nanostructure of FITC-doped Silica Nanoparticles: An Optical Approach to Evaluate Nanoparticle Photostability", Journal of Luminescence, 2006, 117(1): páginas 75-82. Esta matriz de sílica proporciona um ambiente único que permite a incorporação de vários iões metálicos, tal como divulgado na patente US 6 548 264 de Tan, et al. , bem como de moléculas, sem uma alteração significativa nas propriedades físicas e químicas. Os estudos de caraterização mostram claramente que os iões de Cu são incorporados com sucesso dentro da matriz de sílica e os iões de Cu incorporados são libertados de uma maneira sustentada. A adesão e a libertação sustentada, lenta de iões de Cu fornecem várias outras vantagens para a presente invenção. Em primeiro lugar, quando aplicada a plantas, árvores e semelhantes, as folhas e/ou os ramos que caem no solo fornecem cobre, um nutriente altamente desejado para o solo e em níveis muito baixos que não são nocivos para o ambiente. Em segundo lugar, quando as plantas e as árvores são colhidas ou removidas da produção agrícola, a vegetação tratada pode ser utilizada para cobertura vegetal ou compostagem e proporcionar nutrientes de Cu adicionais como um fertilizante. São fornecidos novos dados, desempenho e formulações de biocidas de nanogel à base de Cu. A nova geração de biocidas de nanogel à base de Cu melhoraram a biodisponibilidade de Cu, um ambiente de Cu no material de CuSiNG que é único e manipulável, uma composição â base de Cu com melhores propriedades de adesão e propriedades que permitem a monitorização para determinar se o biocida deve ser reaplicado.

Foi descoberto recentemente que a matriz de sílica do nanogel de sílica é capaz de hospedar simultaneamente duas formas ativas de cobre, Cu° (I) e Cu"° (II) . 0 Cu (I) está presente como Cu20 na forma nanocristalina (tamanho de cristal de 1 - 3 nanometros (nm)) e o Cu(II) está presente como forma amorfa (fracamente quelatado pelos grupos silanol). 0 equilíbrio estabelecido pelas duas formas ativas de cobre afeta a cinética total de libertação de iões de Cu, consequentemente, o nanogel de sílica (SiNG) é capaz de hospedar Cu tanto como °1 (cuproso, forma cristalina) como °2 (cúprico, forma amorfa) na mesma matriz, o que contribui para uma libertação de Cu sustentada e melhor biodisponibilidade de Cu. Ao contrário de todos os compostos de Cu existentes, o ambiente de Cu no CuSiNG é único e permite a manipulação para melhorar o desempenho da composição biocida.

Outra descoberta recente é a propriedade do material de nanogel de sílica carregado com Cu (CuSiNG) de se difundir lentamente desde o local de aplicação, em ambientes húmidos. Dessa forma, em aplicações de pulverização, o CuSiNG difunde-se e cobre as superfícies de tecido recém-expostas de frutos e folhas jovens em rápido crescimento, minimizando assim o número de aplicações por estação de crescimento e aumentando a longevidade da cobertura da superfície da planta.

Uma nova geração de CuSiNG.

Tal como descrito no exemplo 1 acima, a gelificação de partículas sol ocorre ao longo do tempo. 0 processo de gelificação reúne SiNPs ultrapequenas (< 10 nm de tamanho) com um processo de condensação adicional na presença de iões de Cu, formando assim o material de CuSiNG, que possui uma estrutura semelhante a rede, tal como é apresentado na figura 10a. A composição do meio de reação, bem como o pH do meio, favorece a formação de nanopartícuias de óxido de

Cu(I) altamente cristalinas de 2 - 3 nm de tamanho 115, que permanecem incorporadas na matriz de nanogel de sílica, tal como mostrado na figura 10b e na figura lOd. 0 padrão de difração de eletrões da área selecionada (SAED) na figura 10c indica a formação de CuSiNG amorfo. A figura lOd é uma imagem de microscopia eletrónica de transmissão de alta resolução (HRTEM) que mostra a formação de partículas de contraste escuro de 1 - 3 nm 115, marcadas pelas linhas paralelas entre duas setas opostas, como cristais incorporados na matriz de sílica amorfa. O espaçamento de malha medido a partir da imagem ampliada de HRTEM é aproximadamente de 2,447 A, o que indica a formação de cristais de Cu20. A estrutura do nanogel de sílica da presente invenção é carregada com dois estados de valência de Cu que permanecem intactos. A razão de Cu cristalino para amorfo é controlada pela alteração da composição do meio de reação. Isto proporciona uma excelente oportunidade para controlar a cinética de libertação de Cu. 0 cobre amorfo é libertado rapidamente e o cobre cristalino é libertado lentamente. Para a prevenção de longo prazo da doença do cancro de citrinos, é desej ável que a formulação à base de Cu forneça iões de Cu de uma forma sustentada, sem comprometer a eficácia antibacteriana, tal como, a biodisponibilidade de Cu ao longo do tempo.

Foi sintetizado um nanogel híbrido de sílica carregado com Cu (Η-CuSiNG), em que a matriz de SiNG é carregada com um composto de silano para alcançar a cobertura uniforme da superfície da planta. É preparado um material de CuSiNG altamente disperso que inclui um precursor de silano, tal como o metilfosfonato de 3-(trihidroxisilil) propilo (THPMP), num procedimento de recipiente único, em duas etapas, tal como descrito no exemplo 1. 0 processo no exemplo 1 é modificado pela adição de um precursor de silano com os iões de cobre na etapa um, que envolve a adição de sais de Cu(II) ao meio de reação antes da síntese de nanopartícula / nanogel. Durante a formação da rede de nanopartícula / nanogel de silano, os iões de cobre (Cu) irão ser capturados. 0 THPMP é silano altamente solúvel em água que contém o grupo fosfonato carregado negativamente. Além de melhorar a dispersibilidade, o THPMP interage com os iões de Cu e modula a taxa de libertação de iões de Cu, melhorando assim a cobertura da superfície, a resistência à chuva e a longevidade da cobertura. Os compostos de silano adequados para a presente invenção estão disponíveis comercialmente a partir de fornecedores tais como, GELEST, Morrisvilie, PA 19067. A caraterização detalhada de materiais revela que o CuSiNG ê um nanomaterial único. Ao contrário de todos os outros compostos de Cu existentes, incluindo o Kocide® 3000, o CuSiNG é principalmente um material amorfo, tal como foi confirmado pelo estudo de difração de raios X (XRD), onde o Cu(II) é complexado com grupos silanol de sílica, tal como foi confirmado pelo estudo de espetroscopia fotoeletrónica de raios X (XPS). 0 estudo HRTEM confirma que o material incorpora nanopartículas de óxido de Cu (I) cristalinas de 1 - 3 nm de tamanho 115, que aparecem como áreas de contraste escuro na figura 10b. As medições BET com base nas isotermas de adsorção / dessorção de nitrogénio confirmaram que o material de CuSiNG é altamente poroso, com um tamanho de poro de aproximadamente 7,4 nm e um volume de poro de aproximadamente 1,023 cc/g e que possui uma enorme área de superfície de aproximadamente 336,1 m2/g.

Propriedade antibacteriana do material de CuSiNG. A avaliação da propriedade antibacteriana do CuSiNG foi realizada contra X. alfalfae como um sistema modelo, usando um "ensaio de difusão em disco" padrão. A cultura de X. alfalfae cultivada em placas de nutriente de ágar foi incubada com discos contendo um volume igual de soluções aquosas de Kocide® 3000, sulfato de Cu em água desionizada (Dl) , CuSiNG a um valor de pH 7 e SiNG. 0 teor de Cu metálico foi mantido idêntico em todas estas soluções aquosas à base de Cu. Após incubação durante a noite a 30 °C, foi verificado que o CuSiNG 100 na figura 11a exibiu atividade antimicrobiana muito significativa para X. alfalfa. Isto foi indicado por uma zona livre delimitada que se estende a partir do disco correspondente. Notavelmente, a atividade antibacteriana do CuSiNG foi mais pronunciada do que a de Kocide® 3000 200 na figura 11b e de sulfato de Cu 300 na figura 11c, apesar do teor de Cu metálico ter permanecido idêntico. Deve notar-se que, tal como esperado, SiNG 400 não apresentou qualquer atividade antibacteriana, tal como mostrado na figura lld.

Os resultados experimentais anteriores sugerem que a biodisponibilidade de Cu é melhorada quando são carregados dois estados de valência de Cu (Cu e Cu ) numa matriz de SiNG. Esta eficácia melhorada não pode ser explicada com base nos dados reportados de solubilidade dos materiais testados. 0 valor de solubilidade do produto (iCSP) de hidróxido de Cu é 2,20 x 10~20. Espera-se, portanto, uma libertação lenta de iões de Cu20 a partir de Kocide® 3000. Por outro lado, o sulfato de Cu é um sal altamente solúvel em água, com pH ácido (pH ~ 3,0) e, portanto, espera-se uma libertação abundante de Cu20. 0 ágar, um material à base de açúcar, é conhecido por se ligar a iões metálicos. Espera-se, portanto, que se vá ligar a iões de Cu e atrasar a difusão de Cu, independentemente dos materiais contendo Cu testados, tais como o sulfato de Cu, o Kocide® 3000 e os materiais de CuSiNG. Para além disso, os materiais de CuSiNG devem ter menos Cu solúvel em comparação com o sulfato de Cu e, mais Cu solúvel em comparação com o Kocide® 3000. Por conseguinte, a atividade antibacteriana inesperadamente alta do material de CuSiNG é possivelmente devida à sua capacidade de migrar, através de difusão, a partir do disco e interagir diretamente com as bactérias. Esta interação direta irá aumentar a concentração local de Cu sobre a superfície da célula bacteriana, matando-as assim de forma eficaz.

Difusão do material de CuSiNG. Para testar as propriedades de difusão de CuSiNG, o SiNG fluorescente foi carregado com um corante organometálico fluorescente que emite laranja - vermelho, hexahidrato de tris (2,2'-bipiridil) diclororuténio (II) (Rubpy), um corante altamente solúvel em água com excitação a comprimentos de onda de 455 nm e emissão a comprimentos de onda de 600 nm. O corante fotoestável de fluorescência brilhante adicionado ao material de SiNG é daqui em diante referido como RuSiNG. 0 RuSiNG foi lavado em água desionizada (Dl) várias vezes para assegurar a remoção de qualquer Rubpy não ligado. Foi desenvolvido um teste qualitativo para a avaliação da propriedade de difusão de SiNG carregado com Rubpy (RuSiNG) usando uma placa de nutriente de ágar como substrato. Num procedimento típico, foram administrados 200 μΐ de RuSiNG (~ 1 mg/ml) a um disco de papel branco de 13 mm. 0 disco foi então colocado no centro de uma placa de nutriente de ágar. A placa foi refrigerada durante uma semana antes de fazer a imagem sob um microscópio de fluorescência (Olympus MVX10 equipado com câmara de cor DP72; conjunto de filtros: filtro de excitação de passagem de comprimentos de onda de banda de 380 - 420 nm e filtro de emissão de passagem de comprimentos de onda longos de 475 nm) . Observou-se claramente que o RuSiNG se difundiu para fora do disco, tal como mostrado nas figuras 12a - 12c. Na figura 12a há uma imagem fluorescente de um disco branco sobre uma placa de nutriente de ágar. A figura 12b mostra uma imagem fluorescente de um disco tratado com RuSiNG sobre uma placa de nutriente de ágar após refrigeração durante 7 dias. A figura 12c é uma imagem fluorescente da mesma placa de ágar da figura 12b, em que foi removido o disco de RuSiNG. Este estudo de difusão mostra que o material de SiNG foi capaz de se difundir sobre um substrato de ãgar numa condição refrigerada.

Em resumo, o estudo de difusão indica que o material de CuSiNG da presente invenção é capaz de se difundir num ambiente húmido (por exemplo, o tempo húmido típico da Flórida) ao longo do tempo. Esta propriedade de difusão é fundamental para a proteção de frutos e folhas de citrinos jovens em rápida expansão contra a ameaça do cancro. Uma vez aplicado no início da época, o material de CuSiNG espalha-se lentamente ao longo do tempo para cobrir a superfície do tecido recém formado, não permitindo assim que as bactérias do cancro causem infeção.

Avaliação da propriedade de adesão do material de CuSiNG. Foi observado visualmente que o material de CuSiNG tem melhor propriedade de adesão (determinada mediante a aplicação de pulverização de água da chuva continuamente durante 5 minutos) em comparação com o Kocide® 3000, quando estudado num limoeiro. Para avaliar ainda mais a níveis microscópicos a propriedade de adesão do material de SiNG, foi usado RuSiNG fluorescente como um material modelo. Uma pequena alíquota (10 μΐ) de RuSiNG (~ 1 mg/ml) foi fornecida como um ponto sobre uma folha de citrino fresca e limpa e foi deixada secar. A folha foi observada sob um microscópio de fluorescência (microscópio Olympus MVX10 com longa distância de trabalho) após a administração inicial e após 3 lavagens subsequentes. Cada lavagem foi realizada segurando a folha sob uma torneira de fluxo forte durante um determinado período de tempo. Foram tiradas uma série de imagens de fluorescência para amostras da pré-lavagem (Figura 13a) , após uma lavagem de 1 minuto (Figura 13b) , após uma lavagem de 6 minutos (Figura 13c) e após uma lavagem de 16 minutos (Figura 13d) . As imagens mostram claramente que o material de SiNG tem uma propriedade de adesão extremamente forte para a superfície da folha de citrinos. A propriedade de adesão forte do material de SiNG reflete uma interação van der Waals forte (forças intermoleculares) entre o CuSiNG e a superfície da folha. Essa forte adesão do material de SiNG é devida às suas propriedades em nanoescala, tais como a elevada área de superfície e a estrutura semelhante a rede. Um estudo das propriedades de adesão de CuSiNG demonstra claramente o papel da nanotecnologia em melhorar drasticamente a propriedade de adesão do material à base de SiNG para uma superfície da folha de citrinos.

Fluorescência para medir a necessidade de aplicações repetidas de CuSiNG. Uma técnica de deteção à base de fluorescência permite a monitorização da libertação de Cu em tempo real. 0 mecanismo de deteção baseia-se na extinção de fluorescência. É bem conhecido que os iões de Cu podem extinguir eficazmente a fluorescência dos corantes fluorescentes através de processos de transferência de energia e/ou de eletrões. Portanto, se um corante fluorescente, tal como o Rubpy, é incorporado no material de CuSiNG, a fluorescência do corante Rubpy será extinta. Após a libertação de iões de Cu, será restaurada a fluorescência de Rubpy. A viabilidade do presente mecanismo foi testada quando o material de CuSiNG carregado com Rubpy (RuCuSiNG) foi sintetizado por mistura simples. Tal como esperado, a fluorescência de Rubpy foi completamente extinta devido à presença de iões de Cu. No entanto, a fluorescência foi completamente restaurada quando o Cu foi removido por tratamento de RuCuSiNG com ácido etilenodiamino tetra-cético (EDTA), um agente quelante forte, tal como mostrado nas figuras 14a e 14b. Na figura 14a do lado esquerdo, o material de RuCuSiNG centrifugado é mostrado como um depósito pesado 180 na parte inferior do tubo e, do lado direito, numa fase dispersa 185 no tubo, quando tratado com EDTA há evidência de fluorescência sob a luz ambiente. Na figura 14b do lado esquerdo, o material de

RuCuSiNG centrifugado 190 é tratado com EDTA, um agente quelante que remove o cobre da solução e, do lado direito, ê mostrada fluorescência brilhante 195 no tubo sob uma luz de excitação portátil de comprimento de onda UV de 366nm. Isto ocorre depois de o ião Cu ser extraído do material como complexo de Cu-EDTA. Isto proporciona uma base para utilizar uma técnica de deteção altamente sensível à base de fluorescência para monitorizar a libertação de Cu a partir do material em tempo real.

Devido à elevada sensibilidade da técnica de fluorescência e à grande razão de sinal para ruído, é antecipada uma deteção sensível de libertação de Cu. Com base neste estudo de deteção, vamos ser capazes de prever a biodisponibilidade de Cu e rastrear uma série de materiais de CuSiNG com o aumento da razão das formas amorfa (Cu2°) para cristalina (Cu10) .

Outra vantagem das nanopartículas e nanogel de sílica carregados com Cu da presente invenção envolve o controlo do crescimento de bolor e míldio. As formulações de nanopartícula / nanogel de sílica carregados com cobre (Cu) da presente invenção têm atividade antibacteriana / antifúngica superior para o tratamento de áreas que favorecem e promovem o crescimento de bolor e míldio. Para além disso, um único tratamento continua a ser eficaz desde a partir de pelo menos dois meses a aproximadamente seis meses, porque a libertação de Cu iõnico ocorre de um modo lento e sustentado e em quantidades que inibem a germinação de esporos de fungos, as "sementes" primárias responsáveis pela disseminação e reprodução do fungo ou bactéria. Uma vez que o esporo, ou célula, removido do ciclo de infeção atual não amadurece nem se reproduz na presença de cobre, o fungo, ou bactéria, é morto de forma efetiva. As casas de banho, cozinhas, áreas interiores e exteriores de estruturas sujeitas a condições quentes, húmidas permanecem livres de bolor e míldio de aparência desagradável, quando tratadas com a nanoformulação à base de sílica da presente invenção.

Em conclusão, pela primeira vez, é fornecido um mecanismo de libertação sustentada de Cu usando uma formulação de nanopartículas / nanogel de sílica contendo cobre (Cu) (SiNP/NG) de design exclusivo. A nanoformulação à base de sílica encontra uma aplicação imediata no tratamento do cancro de citrinos. Os usos adicionais de composições antibacterianas / antifúngicas que contêm SiNP/NG são para agentes antibacterianos / antifúngicos de uso geral em agricultura e horticultura, incluindo, mas não se limitando a, utilização em vegetais, flores, relva, outras plantas, aplicações domésticas, tecidos, couros, plásticos, tintas e similares. 0 design de CuSiNG melhorado por nanotecnologia é uma "reinvenção revolucionária" de Cu para aplicação segura na agricultura moderna do século 21.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não ê parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 6548264 B, Tan [0008] [0116] • US 6924116 B, Tan [0008] • US 7332351 B, Tan [0008] • US 3992146 A, Fazzalari [0029] • US 3983214 A, Misato [0031] • US 5462738 A, LeFiles [0031] • US 5939357 A, Jones [0031] • US 6471976 B, Taylor [0031] • US 7163709 B, Cook [0031] • US 7226610 B, Winniczuk [0031] • US 200110051174 A, Staats [0031] • US VS20070087023 A [0031] • US 1520070098806 A, Ismail [0031] • US 20040096421 AI [0032] • US 20070140951 AI [0033]

Documentos de patente referidos na descrição • Copper fungicides/bactericides. H.W. RICHARDSON.

Handbook of Copper Compounds and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1997, 93-122 [0010] • H. W. RICHARDSON. Handbook of Copper Compounds and

Applications. 1988 [0018] • Agricultural and Industrial Applications and

Environmental Interaction. Fungicides - An Advanced Treatise. Academic Press, 1967, vol. 1, 697 [0022] • NAVARRO, E. et al. Environmental behavior and ecotoxicity of engineered nanoparticles to algae, plants, and fungi,. Ecotoxicology, 2008, vol. 17 (5), 372-386 [0023] • OBERDORSTER, G. et al. Nanotoxicology: An Emerging

Discipline Evolving from Studies of Ultrafine Particles,. Environmental Health Perspectives, 2005, vol. 113 (7), 823-839 [0023] • H. FLORIN. The Sour State of Florida Citrus, 28 August 2008, http://www, time.com/time/nation/article/ 0,8599,1836766,00.html [0040] • A. K. DAS. Citrus Canker-A review. J. Appl. Hort., 2003, vol. 5 (1), 52-60 [0041] • T. S. SCHUBERT et al. Plant Disease, 2001, vol. 85 (4 [0041] • C.H. BOCK et al. Efficacy of Cankerguard(R) Sprays for Effective Decontamination of Citrus Canker. Phytophology, 2009, vol. 99 (6), S13 [0041] • S. SANTRA et al. Fluorescence Lifetime Measurements to Determine the Core-Shell Nanostructure of FITC-doped Silica Nanoparticles: An Optical Approach to Evaluate Nanoparticle Photostability. Journal of Luminescence, 2006, vol. 117 (1), 75-82 [0116]

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um método para sintetizar uma nanoformulação à base de sílica que contém agentes antibacterianos e antifúngicos, utilizando um processo sol-gel, de um recipiente único, catalisado por ácido, que compreende as etapas de: selecionar um recipiente de reação que contém um meio de reação ácido; adicionar tetraetoxissilano (TEOS), água, etanol e um agente antibacteriano ou antifúngico que contém iões de cobre ao recipiente de reação com o meio ácido, para formar a mistura I; permitir que a reação da mistura I continue durante aproximadamente uma hora para facilitar a formação de uma pluralidade de nanopartícuias à base de sílica; adicionar um agente de neutralização após a formação de uma pluralidade de nanopartículas para ajustar o valor de pH da mistura de reação para aproximadamente 7,0; permitir que a reação neutralizada da mistura I continue durante aproximadamente 12 horas, de preferência durante a noite, para permitir a ocorrência de gelificação e, formar uma estrutura de nanogel que consiste em nanopartículas interligadas; e recolher um nanogel poroso à base de sílica que possui agentes antibacterianos e antifúngicos ligados numa pluralidade de nanopartículas interligadas do nanogel; em que o agente antibacteriano ou antifúngico é uma pluralidade de iões de cobre (Cu) provenientes de um composto de cobre; caraterizado pelo facto de que a pluralidade de nanopartículas interligadas do nanogel contêm uma pluralidade de iões de Cu ligados eletrostaticamente ao núcleo da nanopartícuia, - uma pluralidade de nanocristais de Cu incorporados, incluindo, pelo menos, Cu20, - uma pluralidade de iões de Cu ligados covalentemente a uma matriz de sílica com uma superfície envoltório hidratada, nanoporos da nanopartícula e canais porosos de nanogel, e - uma pluralidade de óxido / hidróxido de Cu como nanoclusters / nanopartículas ligados à superfície da nanopartícula.
2. 2. Uma composição para o tratamento e prevenção de doenças em espécies de plantas que compreende uma nanoformulação à base de sílica, que compreende uma pluralidade de iões de cobre incorporados numa pluralidade de nanopartículas de sílica ou que compreende uma pluralidade de iões de cobre incorporados num nanogel de sílica, em que a nanoformulação à base de sílica inclui uma matriz de sílica num nanogel de sílica carregado com iões de cobre (CuSiNG); e caraterizada pelo facto de que a matriz de sílica no nanogel de sílica carregado com iões de cobre (CuSiNG) hospeda simultaneamente duas formas ativas de cobre, em que uma primeira forma de cobre é amorfa e uma segunda forma de cobre é cristalina e, o equilíbrio estabelecido pelas duas formas ativas de cobre pode ser ajustado para controlar a cinética de libertação de iões de cobre e melhorar a biodisponibilidade de iões de cobre.
3. 3. A composição da reivindicação 2, em que a fonte da pluralidade de iões de cobre é proveniente de compostos de cobre selecionados a partir do grupo que consiste em cobre metálico, óxido de cobre, oxicloreto de cobre, sulfato de cobre, hidróxido de cobre e misturas dos mesmos.
4. 4. A composição da reivindicação 2, incluindo ainda um composto precursor de silano para alcançar a cobertura uniforme da superfície da planta, modular a taxa de libertação de iões de cobre, melhorar a resistência à chuva e aumentar a longevidade da cobertura da superfície da planta.
5. 5. A composição da reivindicação 4, em que o composto precursor de silano é o metilfosfonato de 3-(trihidroxisilil) propilo (THPMP).