PT2780036T - Composições de nanopartículas para gerar células t reguladoras e para o tratamento de doenças auto-imunoes e outras condições inflamatórias crónicas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES DE NANOPARTÍCULAS PARA GERAR CÉLULAS T REGULADORAS E PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTO-IMUNOES E OUTRAS CONDIÇÕES INFLAMATÓRIAS CRÓNICAS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a nanopartícuias para a administração direccionada de antigénio a células do fígado, em particular, células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSEC) e/ou células de Kupffer, e para a geração in vivo de células T reguladoras, especialmente Células T reguladoras CD4+CD25+FOXP3+ (Treg). A invenção proporciona composições e métodos para a prevenção e o tratamento de doenças auto-imunes, alergias ou outras condições inflamatórias crónicas e para a geração de células T reguladoras. A tolerância imune aos auto-antigénios é mantida por múltiplos mecanismos que controlam linfócitos auto-reactivos potencialmente patogénicos, incluindo deleção, anergia clonal ou supressão por células T reguladoras (1-3) . A doença auto-imune pode, portanto, resultar do controlo insuficiente de linfócitos auto-reactivos (4,5), e o principal objectivo da imunoterapia para doenças auto-imunes é a indução de tolerância aos auto-antigénios por restauração da regulação (6). Uma maneira particularmente promissora de restaurar a auto-tolerância parece ser a manipulação de células T reguladoras CD4+CD25+FOXP3+ (Treg) especificas para o auto-antigénio; a transferência adoptiva dessas células pode prevenir condições auto-imunes ou inflamatórias (6-10). Na verdade, Treg possuem várias moléculas secretadas ou ligadas à membrana que comunicam sinais inibitórios a outras células T efectoras, suprimindo assim a proliferação e a secreção inflamatória de citocinas (11,12) . In vivo, a maioria das Treg parece ser gerada no timo (8); no entanto, essas células também podem ser geradas na periferia (9,10) . De facto, evidências crescentes sugerem que as Treg periféricas podem ser geradas não apenas pela expansão periférica do Treg timico (13,14), mas também pela conversão de novo de Células T CD4+Foxp3+ convencionais (15-18). Até agora, no entanto, não é claro, como o potencial terapêutico da geração de Treg especifica na periferia pode ser efectivamente traduzida para terapias clinicamente aplicáveis. O microambiente do fígado favorece a tolerância imune, presumivelmente por uma combinação de células apresentadoras de antigénios tolerantes e citocinas (19— 22). Assim, em muitas situações, o resultado da estimulação das células T pelas células do fígado é a tolerância imune. Essa indução de tolerância hepática pode não só funcionar localmente no fígado, mas também sistemicamente. Com efeito, demonstrou-se que os aloenxertos de fígado não só são bem aceites, como, além disso, podem facilitar a aceitação de enxertos de pele do doador de fígado; enquanto os enxertos de pele de terceiros, pelo contrário, são rapidamente rejeitados (23). A tolerância oral, que é induzida pela administração oral do antigénio, parece ser, pelo menos em parte, facilitada pelo fígado (24) . Além disso, os inventores mostraram anteriormente que a tolerância hepática poderia ser utilizada para induzir Treg específica do neuroantigénio e protecção contra doença neuroinflamatória autoimune (25), usando a transferência de genes para células do fígado. A geração de células Treg foi independente do timo, exigiu expressão ectópica do neuroantigénio no fígado, e ocorreu por conversão de células T CD4+CD25- convencionais (25, 34) . Foi sugerido que a administração de genes a hepatócitos pode ser útil para terapia de doença autoimune humana (25, 33).

Nanopartícuias, incluindo nanopartícuias magnéticas, foram divulgadas em muitas publicações, incluindo WO 2009/126835 A2; Gunn, J. et ai., Small, 2008 Junho: 4(6): 712-715, EP 2 255 831; Sun, C. et al. , ACS Nano. 27 de Abril de 2010; 4(4); 2402-2410; EP 2 226 634 A2; US 2010/059550, Cho, YS. et al. , Cancer Lett. 18 Dez 2010; 299(1): 63-71; Garden, OA et al., J Immunol Methods. 31 Jul 2006; 314(1-2): 123-33; e US 2011/054255. Estas partículas foram principalmente usadas para a marcação e imagiologia de células assim como para imunoterapia do cancro. Outro documento relevante da técnica anterior é WO 2009/067349 que divulga uma composição farmacêutica compreendendo uma nanopartícuia biocompatível ligada a um ligando de factor de transcrição receptor hidrocarboneto de arilo (AHR) para utilização no tratamento de doenças autoimunes pelo aumento do número e/ou da actividade de células T reguladoras (Treg). À luz do estado da técnica, os inventores resolveram o problema de proporcionar uma composição farmacêutica capaz de induzir células T reguladoras e, portanto, útil para tratar e prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica, por exemplo, uma doença auto-imune, uma alergia ou uma doença em que a inflamação é excessiva, crónica ou adversa, em que a referida composição farmacêutica é adequada para utilização em indivíduos humanos e evita, por exemplo, problemas potencialmente associados à transferência de genes. A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para uso na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para o tratamento ou a prevenção de uma doença, em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica, em que a composição compreende uma nanopartícuia, compreendendo a referida nanopartícuia a) uma micela compreendendo um polímero anfifílico que torna a nanopartícuia solúvel em água, e b) um péptido compreendendo pelo menos um epitopo de células T associado com a parte externa da micela.

No contexto da invenção, o termo "nanopartίcuia" é utilizado de forma intercambiável com "partícula nanométrica". Tais partículas têm um diâmetro de 1-999 nm, de preferência, de cerca de 2 a cerca de 600 nm, cerca de 5 a cerca de 500 nm, cerca de 10 a cerca de 300 nm, cerca de 30 a cerca de 100 nm, cerca de 40 a cerca de 50 nm.

Os inventores descobriram que, após administração in vivo a um indivíduo das nanopartícuias específicas da invenção associadas a um péptido tal como descrito acima, essas nanopartícuias se localizam no fígado, em particular, nas células endoteliais sinusoidais do fígado e são capazes de induzir células T reguladoras específicas para o péptido associado. As células T reguladoras induzidas foram capazes de suprimir a encefalite autoimune experimental (EAE) num modelo animal.

Anteriormente, descobriu-se que as nanopartícuias se localizavam numa variedade de tecidos, incluindo células hepáticas (35-38), e também tinham uma variedade diversa de efeitos no sistema imunológico (36-38). Tanto a localização predominante das nanopartícuias actualmente administradas nas células endoteliais sinusoidais do fígado como a indução clara de células T reguladoras pelas nanopartícuias da invenção foi, portanto, surpreendente.

As nanopartícuias utilizadas na invenção compreendem uma micela que compreende um polímero anfifílico que torna a nanopartícula solúvel em água. No contexto da presente invenção, o termo "micela" refere-se a um agregado de moléculas anfifilicas dispersas numa solução aquosa. As partes hidrofilicas das moléculas anfifilicas estão em contacto com o solvente envolvente, sequestrando as regiões hidrofóbicas da "cauda" das moléculas anfifilicas no interior da micela e, assim, tornam a nanoparticula solúvel em água. Este tipo de micela também é conhecido como uma micela de fase normal (ou micela de óleo em água) . No contexto da invenção, a micela é formada por uma única camada de um polímero anfifílico. É claro para um especialista que tal micela é estruturalmente distinta de uma bicamada ou de um lipossoma formado por um polímero anfifílico. Tais estruturas não são, pelo menos numa percentagem significativa (por exemplo, não mais de 10%, mais de 5% ou, de preferência, mais de 1%) , compreendidas na composição farmacêutica.

Numa concretização preferida, o polímero anfifílico que forma a micela é um polímero sintético. Pode compreender uma região hidrofóbica compreendendo uma "cauda" hidrofóbica, por exemplo, carboxílica, tendo um comprimento de cerca de 14-22, de preferência 16-18 átomos de C. A região hidrofílica do polímero pode ser carregada negativamente numa solução aquosa. A massa molecular do polímero pode ser, por exemplo, cerca de 30 000 a 50 000 g/mol. De preferência, o polímero é um copolímero maleico, tal como poli (anidrido maleico-alt-l-octadeceno) (disponível, por exemplo, da Sigma Aldrich). O polímero também pode ser, por exemplo, poli(anidrido maleico-alt-1- tetradeceno) ou copolímero de bloco de poli-isopreno e óxido de polietileno (PI-b-PEO). A micela pode ser formada por uma, mas também por mais do que uma, por exemplo, duas, três ou quatro moléculas anfifílicas poliméricas. Em geral, no contexto da especificação, não se pretende que "um" ou "o" se limite a "um", a menos que seja especificamente divulgado.

Numa forma de realização da invenção, o núcleo da micela não compreende moléculas ou compostos adicionais, mas consiste nas regiões hidrofóbicas dos polímeros anfifílicos (uma tal micela é mostrada esquematicamente na Fig. 3A).

Noutra concretização, a micela reveste um núcleo hidrofóbico sólido (como mostrado esquematicamente na Fig. 3B), que de preferência é um núcleo inorgânico. 0 núcleo inorgânico é de preferência um núcleo inorgânico detectável, por exemplo, que compreende óxido de ferro, CdSe, prata ou ouro. 0 diâmetro do núcleo é de cerca de 2 a cerca de 500 nm, de preferência, cerca de 5 a cerca de 30 nm, mais preferencialmente, cerca de 9 a cerca de 12 nm.

Exemplos de núcleos inorgânicos são nanopartícuias de FeO estabilizadas por ácido oleico ou outro ácido carboxílico (C14-C22, de preferência, C16-18), pontos quânticos (CdSe/CdS/ZnS estabilizados, por exemplo, por óxido de trioctiloxinofosfina), nanopartícuias de ouro, por exemplo, estabilizadas por composto sulfónicos. Tais núcleos inorgânicos por si só não são tipicamente estáveis num solvente aquoso tal como água, mas a sua incorporação nas micelas poliméricas torna-os solúveis em água. As partes hidrofóbicas do polímero anfifílico interagem com o núcleo hidrofóbico da nanopartícuia, levando à formação de uma única camada de revestimento de polímero em torno do núcleo.

Os núcleos tornam preferencialmente as nanopartícuias da invenção detectáveis, por exemplo, pelas suas características em fluorescência, microscopia electrónica ou outro método de detecção.

Numa forma de realização preferida da invenção, a nanopartícuia compreende um núcleo de óxido de ferro com um diâmetro de cerca de 9 a cerca de 12 nm encapsulado por um revestimento de poli(anidrido maleico-alt-l-octadeceno) ao qual um péptido compreendendo um epitopo de células T está ligado, de preferência, ligado covalentemente. De acordo com uma forma de realização, as nanopartícuias compreendem um núcleo de óxido de ferro lipofílico, sintetizado de acordo com um método de Colvin (26), de preferência, com uma modificação do tempo de reacção para produzir partículas de cerca de 9-12 nm como descrito nos exemplos. De acordo com uma forma de realização, as nanopartículas de óxido de ferro são encapsuladas por incubação com solução de poli(anidrido maleico-alt-l-octadeceno) de acordo com um protocolo modificado de (27) para produzir partículas solúveis em água. A nanopartícuia, em virtude do polímero que forma a micela, pode ser carregada negativamente ou não carregada, de preferência é carregada negativamente. 0 revestimento de polímero pode compreender grupos ácido, por exemplo, ácido carboxílico, conduzindo a uma carga negativa. 0 péptido é de preferência ligado covalentemente às micelas, por exemplo, por acoplamento de carbodi-imida ou succinimida, por exemplo, conjugação através de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (como, por exemplo, no exemplo 4 abaixo), ou por outro método de acoplamento covalente de péptidos. 0 péptido está localizado no exterior das micelas. 0 péptido também pode ser associado não covalentemente à nanopartícuia. Tais nanopartícuias podem ser preparadas, por exemplo, por imersão e secagem, como descrito por Giri et al. (36). Não se pretende que o termo "péptido" seja limitante quanto ao tamanho, em particular, o péptido pode compreender uma proteína completa ou cerca de 8 a cerca de 2000 aminoácidos, de preferência 8-200 aminoácidos, 8-100 aminoácidos, 9-60 Aminoácidos ou 10-20 aminoácidos. O termo também compreende combinações de diferentes péptidos, que podem estar ligados entre si como polipéptidos de fusão. O péptido compreende pelo menos um epitopo de células T ao qual as células T reguladoras serão geradas. É preciso que pelo menos um epitopo seja capaz de ser apresentado por células do indivíduo ao qual as nanopartícuias devem ser administradas, isto é, o péptido e/ou o indivíduo precisam de ser apropriadamente seleccionados. De preferência, o péptido compreende vários epitopos que permitem que ele seja apresentado numa pluralidade de tipos do Complexo de Histocompatibilidade Maior.

Como as células T reguladoras são predominantemente CD4+, a apresentação em MHC de classe II é de maior interesse a este respeito. 0 fenótipo de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, pode ser facilmente testado. Os epitopos de um péptido específico que pode ser apresentado em moléculas MHC específicas são conhecidos e/ou podem ser rotineiramente seleccionados, por exemplo, por software apropriado. De preferência, o péptido compreende um número e selecção suficientes de epitopos para permitir que seja apresentado pelo menos em 20%, de preferência, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% de uma população de indivíduos, em que a população de indivíduos pode ser a população em geral, ou, de preferência, uma população de indivíduos com uma determinada doença, condição ou distúrbio associado ao péptido como descrito abaixo. De preferência, o indivíduo é humano, mas também pode ser rato, rato, coelho, cobaia, porco, macaco, macaco, gado, ovelha, cabra, gato ou cão.

O péptido pode ser sintetizado, expresso de forma recombinante ou isolado ou modificado de fontes naturais. O péptido, ou pelo menos o epitopo contra o qual as células T reguladoras devem ser geradas, é preferencialmente derivado de um péptido/proteína contra o qual uma resposta imune inflamatória deve ser suprimida, por exemplo, no contexto de tratamento ou prevenção de uma doença autoimune ou de uma alergia. 0 péptido pode, por exemplo, ser um alergénio, um antigénio autoimune conhecido, ou um seu fragmento ou derivado. 0 péptido pode combinar vários epitopos de vários antigénios.

Os inventores descobriram que as nanopartícuias da presente invenção são adequadas para transferir o péptido para células endoteliais sinusoidais hepáticas de um indivíduo in vivo. Conforme descrito abaixo, outras células também são alvo, no entanto - sem pretender ficar vinculado pela teoria - direccionar as células endoteliais sinusoidais do fígado parece ser importante para a geração de células T reguladoras, pois a composição farmacêutica induz a geração de células T reguladoras específicas para o pelo menos um epitopo através da apresentação do referido epitopo por células endoteliais sinusoidais hepáticas. De preferência, pelo menos 60% das nanopartícuias encontradas no fígado após a administração localizar em células endoteliais sinusoidais hepáticas, mais preferencialmente, pelo menos 70% ou pelo menos 80%. Uma percentagem menor também pode ser encontrada em células de Kupffer ou em células endoteliais de veias intestinais que alimentam a veia porta.

As nanopartícuias utilizadas na presente invenção podem ser seleccionadas pela sua capacidade de serem carregadas com péptido de carga e pela sua capacidade de direccionar tal péptido de carga para células de fígado, nomeadamente células endoteliais sinusoidais hepáticas.

As nanopartícuias podem compreender uma porção, por exemplo, um hidrato de carbono ou uma proteína que as direcciona, ou aumenta o direccionamento para células específicas, tais como células endoteliais sinusoidais hepáticas e/ou células de Kupffer. Tal porção poderia, por exemplo, aumentar ou acelerar a absorção da circulação através de endocitose mediada pelo receptor. Exemplos de modificações adequadas são hidratos de carbono como a manose. Contudo, os inventores mostraram que, vantajosamente, tais porções adicionais de direccionamento não são necessárias no contexto da invenção. A composição farmacêutica da invenção pode ainda compreender pelo menos um excipiente e/ou diluente adequado. 0 diluente preferencialmente é água ou à base de água, por exemplo, um tampão tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) , solução de Ringer ou solução de cloreto de sódio. Conservantes adequados podem ou não estar contidos. É evidente que, em particular para a administração a um indivíduo humano, a composição é de preferência estéril e biologicamente compatível. A composição farmacêutica pode ainda compreender uma citocina tal como TGFB .

Pretende-se que as nanopartícuias sejam utilizadas em e formuladas para administração a um indivíduo com uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica. A dose requerida e a concentração para administração ao indivíduo podem ser determinadas pelo médico responsável de acordo com os factos e circunstâncias do caso. Uma dose exemplificativa pode compreender 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, de preferência, cerca de 0,5-2 mg/kg de peso corporal ou cerca de 1 mg/kg de peso corporal, por exemplo, para um indivíduo humano. A administração pode ser repetida, por exemplo, duas vezes, três ou quatro vezes, por exemplo, com, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 ou 14 dias entre as administrações.

De preferência, a composição farmacêutica é para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica, em que a referida doença é seleccionada do grupo que compreende uma doença auto-imune, uma alergia ou uma doença em que a inflamação é excessiva, crónica ou adversa. Tal doença pode estar associada a inflamação excessiva ou crónica. As nanopartícuias também podem ser utilizadas no tratamento de condições clínicas associadas a um desfecho adverso da inflamação. Doenças e condições inflamatórias que podem ser tratadas pela composição farmacêutica da invenção incluem, mas não estão limitadas a, esclerose múltipla, diabetes tipo I, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, degeneração após trauma ou acidente vascular cerebral, doença de enxerto contra o hospedeiro, rejeição de transplante , Doença inflamatória do intestino (IBD), asma, alergias, por exemplo, rinite alérgica, eczema alérgico e semelhantes. 0 termo "tratamento", tal como aqui utilizado, refere-se ao alivio dos sintomas de uma doença particular num indivíduo e/ou melhoria de uma medida determinável associada a um distúrbio particular.

As composições para uso na invenção podem ser administradas a um indivíduo que dela necessite uma composição farmacêutica compreendendo uma nanopartícuia como aqui definida. Conforme descrito, tais nanopartículas podem ser carregadas com autoantigénio, aloantigénio ou outro antigénio ao qual a resposta inflamatória adversa é dirigida, ou com péptidos compreendendo uma sequência de aminoácidos derivada ou modificada desse antigénio.

Embora, por algum tempo, tenha sido possível gerar respostas imunitárias protectoras, por exemplo, inflamatórias em indivíduos, por exemplo, humanos, para protegê-los, por exemplo, contra doenças induzidas por agentes patogénicos, há bastante tempo que se procura um método para inibir efectivamente e especificamente reacções imunes adversas em seres humanos, por exemplo, no contexto de doenças auto-imunes, de inflamações crónicas e de alergia. A presente invenção finalmente proporciona composições farmacêuticas e métodos para a geração de células imunes reguladoras especificas, que são, como demonstrado num sistema modelo, até capazes de suprimir a doença auto-imune.

Legendas das figuras

Fig. 1: geração eficiente de células Treg a partir de células T não-reguladoras CD4+CD25 por vários tipos de células hepáticas, mas não por células dendriticas esplénicas.

Fig. 2: Melhoria e atraso no inicio da neuroinflamação autoimune experimental por transferência de células T especificas de neuroantigénio estimuladas por LSEC.

Fig. 3: Desenho esquemático de exemplos de micelas para administração direccionada de péptidos para células hepáticas. A: Uma micela formada por um polímero anfifílico. As partes hidrofóbicas do polímero formam o centro da micela, enquanto as partes hidrofílicas são voltadas para o exterior e tornam a micela solúvel em água. No exemplo mostrado, as partes hidrofílicas são carregadas negativamente. B: Uma micela, formada como em A, reveste um núcleo sólido. 0 núcleo sólido pode ser, por exemplo, um núcleo inorgânico tal como uma nanopartícuia FeO estabilizada por moléculas de ácido oleico. As partes hidrofóbicas do polímero interagem com o núcleo hidrofóbico, formando assim uma micela em torno do núcleo.

Fig. 4A: as nanopartícuias fluorescentes da invenção são rapidamente e especificamente removidas da circulação e acumulam-se predominantemente nas células endoteliais sinusoidais do fígado (LSEC), como demonstrado pela microscopia intravital. Além das nanopartículas fluorescentes tomadas no revestimento LSEC dos sinusoides hepáticos, os núcleos (redondos) são corados com DAPI.

Fig._4B: Confirmação da localização de nanopartículas da invenção em células endoteliais sinusoidais hepáticas por microscopia electrónica de transmissão.

Fig. 4C: As nanopartículas incorporadas em lipossomas lipoprotéicos ricos em triglicerídeos recombinantes preparados de acordo com Bruns et ai., 2009, são especificamente removidos da circulação e acumulam-se predominantemente em células de Kupffer, como demonstrado pela microscopia intravital (a) em ratinhos tratados com controlo, (b) Em ratinhos tratados com clodronato, em que as células de Kupffer foram esgotadas, a assimilação das nanopartículas lipossómicas é significativamente reduzida, confirmando a acumulação em células de Kupffer em ratinhos normais.

Fig. 5: Administração direccionada de péptido neuroantigénico a células hepáticas por conjugados péptido-nanoparticulas, mas não nanoparticulas isentas de péptidos induz protecção total da doença neuroinflamatória clinica.

Fig. 6: Conversão de Treg dependente de TGFp por células apresentadoras de antigénio do fígado. As não-Tregs CD4+ Foxp3 específicas para MBP foram estimuladas com péptido MBP por DC, LSEC, KC de fígado, ou DC esplénico em presença (A) ou ausência (B) de TGFp e as taxas de conversão para Tregs Foxp3+ foram determinadas. C) Conversão de Treg defeituosa por células T CD4 insensíveis ao TGFp. D) Colocalização de GARP ou LAP e CD31 em seções de fígado de ratinhos de tipo selvagem revelados por microscopia confocal. E) Expressão de GARP e LAP (linhas sólidas) por LSEC (painéis superiores) recentemente isolados ou DC esplénicos (painéis inferiores) determinados por citometria de fluxo (controlos de isotipo em cinza). F) não-Tregs CD4+CD25- específicos para MBP foram estimulados por LSEC com péptido MBP e transferidos para ratinhos B10.PL (10 5 células/ratinho; n = 8), em que a EAE foi induzida. Os ratinhos de controlo receberam PBS (n = 9) . São apresentadas as pontuações EAE médias ± d.p.m.; P = 0,0025.

Fig. 7: Administração directa de péptidos MBP para LSEC com nanoparticulas. A) Taxas de depuração plasmática do péptido MBP acoplado a 59Fe-NP (MBP- 59Fe-NP) e péptido 14C-MBP acoplado a NP não marcada (14C-MBP-NP) . B)

Distribuição nos órgãos de MBP-59Fe-NP e 14C-MBP-NP 60 minutos após a injecção intravenosa. Apresentam-se valores médios ± d.p.m. (n = 4). C) Imagens RM coronais e transversais representativas de ratos pré e pós-injecção de NP ou MBP-NP não carregados. D) Microscopia confocal intravital do fígado que mostra a absorção de MBP-NP ou NP não carregada pela LSEC. Os núcleos também foram corados. Painel direito: LSEC (FITC-dextrano) , painel esquerdo: NP com marcação com pontos quânticos; barra de escala: 20 pm. E) Microscopia electrónica de fígado, 60 min após injecção intravenosa de MBP-NP ou NP não carregada.

Fig. 8: A administração à base de nanopartícuias de péptidos neuroantigénicos para LSEC previne a indução de EAE. A EAE foi induzida em Ratinhos B10.PL de tipo selvagem (A, E) ou ratinhos tg4 (B) por imunização a MBP. Nos ratinhos de tipo selvagem C57BL/6 (C) ou ratinhos hCD2-AkTpRII (D), a EAE foi induzida por imunização para MOG. Um dia após a indução de EAE, os ratinhos foram injectados uma vez por via intravenosa com PBS (A-E) ou nanopartí cuias carregadas com péptido neuroantigénio (MBP-NP (A, B, E) ou MOG-NP (C, D). Como controlo, os ratinhos receberam quantidades equivalentes de NP (A, C) não carregado ou péptido MBP não conjugado (B). E, Duas vezes por semana, os ratinhos tratados com MBP-NP foram injectados intraperitonealmente com anticorpo PC61 que esgota Treg (MBP-NP/Treg-esgotado) ou anticorpo de controlo ajustado ao isotipo (MBP-NP). São apresentadas as médias das pontuações EAE ± d.p.m. (n = 5-7).

Fig. 9: Terapia de EAE estabelecida por transferência do péptido MOG baseado em nanoparticulas para LSEC. A EAE foi induzida em ratinhos C57BL/6 por imunização ao MOG. Após o inicio da doença (dia 8-12, indicado pela seta), os ratinhos foram tratados com uma única injecção de nanoparticulas carregadas com MOG (n = 10, linha cinza) ou PBS (n = 17, linha preta) . A) Evolução de EAE durante um período de observação prolongado de mais de nove semanas após o tratamento com MOG-NP (cinza) ou PBS (preto) . São apresentados valores EAE médios ± d.p.m. B) Alteração da pontuação média individual da doença após o tratamento com MOG-NP (cinza) ou PBS (preto) ; "EAE score = diferença de pontuação em relação ao tempo do tratamento.

Fig. 10: Eficiência de acoplamento do péptido ao NP. Número calculado de moléculas peptídicas acopladas a NP após incubação com quantidades crescentes de péptido MBP marcado radioactivamente. São apresentados valores médios ± d.p.m. (n = 3).

Fig. 11: Conversão eficiente de Treg por LSEC in vitro usando péptido MBP conjugado com nanoparticulas ou péptido MBP livre. Células T CD4+ Foxp3- esplénicas de ratinhos tg4 x Foxp3gfp.KI foram co-cultivadas com LSEC na presença de TGFp (2 ng/mL) e de péptido MBP livre (5 ng/mL) ou uma dose equivalente de péptido MBP acoplado a nanoparticulas (MBP-NP) durante quatro dias. A indução de Foxp3 em células T CD4+ foi então analisada por citometria de fluxo. Para análise estatística, foi realizado o teste de Mann-Whitney (MBP livre: 32,16 ± 1,075; MBP-NP: 29,63 ± 1,558; P = 0,2857). n.s. = Não significativo.

Fig. 12: Características de NP e MBP-NP. A) Os potenciais Zeta de NP e MBP-NP foram medidos a 20°C usando um instrumento Malvern Zetasizer Nano-ZS. Ambas as amostras apresentam uma carga de superfície negativa comparável (potencial Zeta médio de NP -58 mV, MBP-NP -61,6 mV) (MBP-NP: pico mais alto, NP: pico mais baixo). Não foi detectada nenhuma diferença de tamanho por B) cromatografia de exclusão molecular (MBP-NP: linha da esquerda, NP: linha da direita) ou C) por microscopia electrónica de transmissão. Para microscopia electrónica, as amostras foram coradas com 1% de silicotungstato de sódio, pH 7, de modo que a casca orgânica aparece clara e o núcleo de óxido de ferro escuro.

Fig. 13: Esgotamento de Treg CD25 + Foxp3 + CD4 + in vivo por administração repetida de anticorpo PC61. Os ratinhos B10.PL foram imunizados para péptido MBP e tratados no dia seguinte com PBS (n = 7) ou nanopartícuias acopladas a péptido MBP (MBP-NP). Os ratinhos, que receberam MBP-NP, foram então ou tratados duas vezes por semana com anticorpo PC61 de redução de Treg (n = 5) ou com anticorpo de controlo ajustado ao isotipo não redutor (n = 6) . Os ratinhos foram sacrificados no dia 29 após a imunização e os baços foram analisados quanto à eficiência de depleção de Treg por citometria de fluxo. Os resultados são representados como % média de CD25 + Foxp3 + das células T CD4 + ± d.p.m. (PBS 17,16 ± 0,3422; MBP-NP + isotipo 15,08 ± 0,8594; MBP-NP + PC61 3,160 ± 0,4643; P <0,001). Para comparação de grupos múltiplos, foram realizados testes ANOVA unidireccional e de Tukey.

Fig. 14: Pontuações EAE iniciais no momento da administração terapêutica MOG-NP ou PBS. Os ratinhos C57BL/6 foram imunizados a péptido MOG e desenvolveram sintomas clínicos de EAE. Após o início da doença (dia 8-12), os ratinhos foram tratados com uma única injecção de nanopartícuias carregadas com MOG (n = 10) ou PBS (n = 17); no momento do tratamento, as pontuações médias da doença inicial entre os grupos eram indiferentes (média ± d.p.m.: 1,59 ± 0,12 vs. 1.60 ± 0.19; P = 0,9195).

Exemplos

Exemplo 1: Geração de células T reguladoras por células endoteliais sinusoidais hepáticas e células de Kupffer. Células não-parenquimatosas do fígado de ratinho foram isoladas aplicando um protocolo modificado de (28) . Resumidamente, realizou-se perfusão dos fígados de ratinhos com 0,05% de colagenase IV (Sigma; Taufkirchen, Alemanha) na solução de sal equilibrada de Gey, foram dissecados mecanicamente e digeridos adicionalmente em 0,05% de colagenase IV na solução de sal equilibrada de Gey durante 25 minutos a 37°C a rotação constante (240 rpm). Os hepatócitos e detritos foram sedimentados duas vezes a 40g e as células não parenquimatosas foram recuperadas por centrifugação num gradiente Optiprep a 17% (Sigma) a 400 g.

As células endoteliais sinusoidais do fígado (LSEC) foram purificadas a partir das células não parenquimatosas como descrito (29) por triagem magnética com o anticorpo ME-9F1 (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemanha). As LSEC foram semeadas em placas de cultura revestidas de colagénio (Serva, Heidelberg, Alemanha) . Após a cultura durante a noite no meio de Dulbecco modificado por Iscove suplementado com 5% de FCS, as células não aderentes foram removidas por mudança de meio. Deste modo, as células de Kupffer foram purificadas a partir das células não parenquimatosas por triagem magnética com anticorpo F4/80 biotinilado (eBioscience, Frankfurt, Alemanha) e microesferas anti-biotina (Miltenyi).

Alternativamente, os hepatócitos foram isolados de fígados de ratinhos como descrito (30); e as células dendríticas foram isoladas a partir de baço de ratinho por separação de células magnéticas para CDllc como descrito (30) . 105 LSEC, 105 células de Kupffer, ou 5xl03 hepatócitos foram semeados em placas de 96 poços e utilizados no dia seguinte para estimulação de células T CD25+CD25-. Alternativamente, 5xl04 células dendríticas, foram semeadas em placas de 96 poços e usadas no mesmo dia para estimulação de células T CD25+CD25-. Essas células T não-reguladoras CD4+CD25- foram isoladas a partir de baços de ratinho por separação magnética de células e 5xl05 linfócitos purificados por poço foram então estimulados nas células apresentadoras de antigénio indicadas em meio isento de soro (Pan Biotech, Aidenbach, Alemanha) com anticorpo de soluto para CD3 (BD Bioscience, Heidelberg, Alemanha). Após quatro dias de cultura, as células T foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo para a percentagem de células Treg CD4+CD25 + FOXP3+. Conforme indicado, o factor de crescimento transformante beta (TGFB) foi adicionado a algumas culturas de estimulação.

Resultados: Como mostrado na Figura 1, as células dendriticas foram fracos indutores de Treg. Na ausência de TGFB exógeno, a geração de células Treg induzidas por células dendriticas foi insignificante e, na presença de TGFB exógeno, apenas 7,5% das células T estimadas por células dendriticas foram Treg. Pelo contrário, os vários tipos de células do fígado - LSEC, células de Kupffer e hepatócitos - foram indutores eficientes de Treg, pelo menos na presença de TGFB exógeno, com pelo menos 20% das células T estimuladas por células hepáticas sendo Treg. Especialmente, LSEC foram geradores eficientes de Treg, uma vez que, na presença de TGFh, 38% das células estimuladas foram Treg e, mesmo na ausência de TGFB exógeno, 16,3% das células T estimuladas foram Treg.

Exemplo 2: Supressão da neuroinflamação autoimune experimental por células T CD4 sinusoidais estimuladas por células do fígado

As LSEC foram isoladas como descrito no exemplo 1 e utilizadas para estimular células T CD25+CD25- não reguladoras purificadas a partir de ratinhos tg4, que transportam um receptor de células T transgénicas especifico para a proteína básica de mielina (25). Após 4 dias de estimulação de células T com a proteína-péptido básica especifico de mielina (5 ng/ml) em LSEC, realizada como descrito no exemplo 1, 105 células T estimuladas com LSEC foram transferidas para ratinhos B10.PL que foram imunizados um dia antes com um péptido de proteína básica de mielina para induzir os sintomas clínicos da encefalomielite autoimune experimental (EAE), conforme descrito em (25).

Resultados: A transferência adoptiva de células T específicas de proteína básica de mielina estimulada por LSEC induz um curso retardado e fortemente melhorado de EAE, indicando que as células Treg específicas de neuroantigénio induzidas por LSEC são capazes de melhorar a neuroinflamação auto-imune.

Exemplo 3: Direccionamento selectivo e específico de nanopartícuias para células endoteliais sinusoidais hepáticas in vivo a) As nanopartícuias foram geradas sintetizando primeiramente núcleos de óxido de ferro de cerca de 11 nm de acordo com (26) com 0,18 g de FeOOH, 2,31 g de ácido oleico e 6,4 mL (5,0 g) de 1-octadeceno; o protocolo foi modificado ao interromper a reacção após uma hora para produzir tamanhos de núcleo maiores de cerca de 11 nm.

Em seguida, seguiu-se o encapsulamento dos núcleos de acordo com (27) com algumas modificações: adicionou-se 2 mL de solução de poli(anidrido maleico-alt-1-octadeceno) (c = 0,01 g/mL em CHCI3) a uma solução de 2 mg de nanoparticulas dissolvidas em 2 mL de clorofórmio e agitou-se à temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi então evaporado por exposição a uma corrente constante de N2 e foram adicionados 2 mL de tampão TBE a 20%. A solução foi sonicada três vezes durante 10 minutos, permitindo que a solução arrefecesse no meio. Posteriormente, a solução foi aquecida a 60°C durante 10 minutos. Os agregados que se formaram foram removidos por centrifugação a 2400 g (três vezes por 10 minutos) e o excesso de polímero foi removido por ultracentrifugação (1 h, 50 000 g, 4°C) . Finalmente, a solução foi filtrada sequencialmente através de filtros com tamanhos de poros de 0,45 pm, 0,2 pm e 0,1 pm. A qualidade das partículas foi confirmada por cromatografia de exclusão molecular e microscopia electrónica de transmissão. O teor de ferro foi medido pelo tratamento de 200 pL de uma amostra diluída com 50 pL de ácido clorídrico a 5 M a 70°C durante 30 minutos (31). Posteriormente, adicionou-se 150 pL de um tampão de acetato 2 M (pH = 4,8) contendo ácido ascórbico a 10% a 50 μύ de cada amostra, seguido por 100 μύ de uma solução de 50 mg de batofenantrolina em 50 mL de água. Após 15 minutos, a absorção foi medida a 540 nm. 0 desenho geral das nanoparticulas está ilustrado na Figura 3. b) Foram geradas nanoparticulas comparativas, nanossomas que compreendem uma bicamada lipidica, pelo procedimento descrito em Bruns, et al., Nat. Nanotechnol. 2009, 4 193-201.

Resultados: a) As nanoparticulas obtidas foram injectadas em ratinhos e, conforme avaliado por imagiologia de ressonância magnética, verificou-se que se acumulam especificamente no fígado. Além disso, a marcação radioactiva dos núcleos com 59Fe mostrou que cerca de 80% das partículas injectadas foram retidas no fígado. Para confirmar o hepatotropismo e ainda identificar as células alvo específicas, os núcleos CdSe/ZnS semicondutores fluorescentes (pontos quânticos), como descrito em (32), foram utilizados como núcleo em vez de óxido de ferro, deixando a cápsula e a superfície de contacto das nanoparticulas inalteradas. A microscopia intravital foi então realizada após a injecção dessas nanoparticulas fluorescentes em ratinhos, mostrando que essas nanoparticulas se acumulam rapidamente em LSEC (Figura 4A). Uma fracção menor das nanoparticulas injectadas foi encontrada em células de Kupffer ou nalgumas células endoteliais de veias intestinais que alimentam a veia porta.

As nanoparticulas obtidas para utilização na invenção foram adicionalmente injectadas em ratinhos e descobriu-se que se acumulam em células endoteliais sinusoidais hepáticas como avaliadas por microscopia electrónica de transmissão (Figura 4B). b) Para comparação, nanossomas fluorescentes de preparados acordo com Bruns et ai., 2009, foram injectados em ratinhos que dois dias antes tinham sido esgotados de células de Kupffer por meio da injecção de lipossomas contendo clodronato (Figura 4C: b) ou não esgotadas de células de Kupffer Através da injecção de lipossomas falsos (Figura 4C: a). Nos ratinhos de controlo, os lipossomas são internalizados pelas células de Kupffer, como inferido pelo padrão de coloração característico. Em ratinhos tratados com clodronato, a assimilação de partículas foi substancialmente reduzida, confirmando que nanocristais incorporados em lipoproteínas são de fato internalizados pelas células de Kupffer. A Figura 4C mostra que os nanossomas se acumulam nas células de Kupffer, mas não em LSEC.

Exemplo 4: Tratamento de neuroinflamação experimental com nanoparticulas carregadas com autoantigénio in vivo

Para a conjugação covalente do péptido neuroantigénico (péptido encefalitogénico Acl-9 derivado da sequência de aminoácidos da proteína básica de mielina), sintetizaram-se nanopartícuias de núcleo de óxido de ferro como descrito no exemplo 3 e ajustaram-se a uma concentração de 6 pmol/L em tampão SBB 50 mM (pH = 9) . Adicionou-se uma quantidade igual de l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (c = 60 nmol/L), dissolvida num tampão SBB 50 mM (pH = 9) . Após 5 minutos, foi adicionado um excesso de 1000 vezes do péptido neuroantigénico e a solução foi incubada sob rotação durante 2 h à temperatura ambiente e depois durante a noite a 4°C. No dia seguinte, a solução foi filtrada sob força centrífuga num dispositivo de filtro (100 kDa, 2500 g, 4°C) e o remanescente ressuspenso em PBS. Este procedimento foi repetido 20 vezes para remover todo o excesso de péptido. Os conjugados de péptido-partícuia obtidos foram dissolvidos em PBS e submetidos a cromatografia de exclusão molecular para assegurar a ausência de péptido livre. Em seguida, o conteúdo de ferro foi medido para determinar a concentração da suspensão péptido-partícuia.

Resultados: As nanopartícuias carregadas com péptidos assim obtidas ou, como controlo, nanopartícuias sem péptidos não conjugadas foram então injectadas em ratinhos B10.PL (n = 6), um dia após a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) por imunização ao péptido de proteína básica de mielina Acl-9 (25). Conforme mostrado na Figura 5, apenas as nanopartícuias carregadas com neuropéptidos induziram uma protecção completa da EAE clínica. Em contraste, as nanopartícuias sem péptidos não protegem da EAE e os ratinhos desenvolveram pontuações de EAE clínica semelhantes às dos ratinhos tratados com PBS.

Exemplo 5: Controlo mediado por T-reg de auto-imunidade por administração de antigénio à base de nanopartícuias a células de fígado tolerogénicas

As células dendríticas do fígado (DC), as células endoteliais sinusoidais do fígado (LSEC) e as células de Kupffer (KC) são células apresentadoras de antigénios residentes no fígado que expressam constitutivamente moléculas MHC II e capazes de estimular células T CD4+. Para testar se essas células do fígado estão envolvidas na indução de Treg, usaram-se DC, LSEC ou KC primárias de fígado para estimular células não Treg CD4+Foxp3“ do baço de ratinhos Fl (tg4 x Foxp3gfp.KI). Essas células não-Treg reconhecem especificamente a proteína básica de mielina (MBP) e permitem a monitorização da conversão de Treg com base na expressão ligada à Foxp3 de proteína fluorescente verde (GFP). A estimulação de células não-Treg foi realizada na presença do péptido MBP específico e de TGFp exógeno, que é necessário para conversão de Treg. Todos os tipos de células de fígado testadas foram capazes de induzir Tregs Foxp3+ específicas de MBP; No entanto, as LSEC foram mais eficientes na indução de Tregs do que KC e DC de fígado (Figura 6A) . A capacidade das células do fígado para proporcionar sinais de TGFp na ausência de TGFp exógeno foi então testada. As KC e DC de fígado não foram eficientes na indução de Tregs (Figura 6B) , enquanto as LSEC puderam induzir a conversão de Treg a taxas mais elevadas (Figura 6B). Para confirmar que a LSEC pode fornecer sinais de TGFp que promovem a conversão de Treg, não-Tregs CD4+CD25- de ratinhos Fl (hCD2-AkTp RII x tg4) foram estimulados em LSEC; essas células T carregam um receptor TGF3 de tipo II negativo dominante e, portanto, apresentam sensibilidade reduzida ao Τ6Γβ. Os inventores encontraram taxas de conversão fortemente reduzidas de células T insensíveis a TGFp em Tregs Foxp3+ , em comparação com células T de tipo selvagem (Figura 6C) , indicando que a eficiência da LSEC para induzir Tregs depende da sinalização de ΤΰΓβ. Embora as LSEC pareçam fornecer sinais de ΤΰΓβ para a indução de Treg (Figura 6B), ο ΤΰΡβ activo em sobrenadantes de LSEC não foi detectado (não mostrado). Por conseguinte, os inventores testaram se LSEC ligaram ο ΤΰΓβ às suas membranas; em complexo com péptido associado à latência (LAP) (40, 41), ο ΤΰΓβ pode ser ligado à superfície das células através de repetições de glicoproteína-A predominantes (GARP, também conhecido como LRRC32) (42) . Tais ΤΰΓβ ligados à membrana mostraram induzir um fenótipo tolerogénico e expressão de Foxp3 em células T estimuladas (41). Com efeito, os inventores verificaram por imuno-histoquímica que GARP, bem como LAP eram co-localizados com CD31 + LSEC (Figura 6D) , enquanto a expressão de GARP e LAP foi indetectável em outras células do fígado. A quantificação da expressão de GARP e LAP por citometria de fluxo confirmou a expressão à superfície celular de GARP e LAP por LSEC, mas não por DC esplénica (Figura 6E) . Estas descobertas indicam que a LSEC pode induzir eficientemente Tregs específicas de antigénios através de TGF-β ligado a membrana.

De seguida, geraram-se Treg específicas de MBP induzidas por LSEC in vitro e sua funcionalidade supressora testada in vivo num modelo de esclerose múltipla de ratinho, encefalomielite autoimune experimental (EAE). Considerando que o grupo de controle desenvolveu EAE clínica, os ratinhos que receberam Tregs específicos de MBP induzidos por LSEC (Figura 6F; T (LSEC)) foram quase completamente protegidos contra EAE induzida por MBP. No entanto, este efeito supressor foi limitado a cerca de três semanas, indicando que as Tregs transferidas não eram estáveis. Os inventores argumentaram que uma estabilidade e protecção Treg mais sustentada da EAE poderia ser alcançada por indução de Treg específica ao antigénio por LSEC in vivo.

Para desenvolver um método para administração selectiva de autoantigénio a LSEC in vivo, os inventores utilizaram nanopartícuias (NP) que são rapidamente eliminadas da circulação através da absorção por células do fígado. Especificamente, os inventores aproveitaram uma nanopartícuia revestida com polímero (43), que observaram de acumular selectivamente no endotélio sinusoidal do fígado (dados não mostrados). Para gerar um sistema de veículo de antigénio eficaz, escolheu-se uma estratégia simples de acoplamento numa etapa usando uma abordagem de reticulação de carbodi-imida para unir o péptido MBP a nanoparticulas revestidas com polimero com núcleo de óxido de ferro superparamagnético. Cada nanopartícula foi carregada no máximo com 100 moléculas peptidicas por nanopartícula como demonstrado por ensaios de ligação com péptido de MBP marcado radioactivamente com 14C (Figura 10). A carga de péptidos não influenciou o tamanho, a forma e a carga das nanoparticulas, conforme determinado pela medição do potencial Zeta, cromatografia de exclusão de tamanho e microscopia electrónica (Figura 12) . Para investigar se a carga de péptido de MBP alterava a farmacocinética e o tropismo de nossas nanoparticulas, foram realizados estudos cinéticos com conjugados nanopartícula-péptido de MBP marcado radioactivamente com 14C (14C-MBP-NP) em comparação com nanoparticulas marcadas radioactivamente com 59Fe conjugadas com péptido de MBP não marcado (MBP-59Fe-NP). Ambas as marcações radioactivas foram eliminadas com cinética similar (Figura 7A), predominantemente pelo fígado (Figura 7B). Foram detectadas baixas guantidades de radioactividade no baço e no rim, enguanto a assimilação noutros órgãos não foi significativa. Além disso, a assimilação nos órgãos foi visualizada por imagem de ressonância magnética dinâmica, revelando apenas o direccionamento hepático de ambas as nanoparticulas carregadas e não carregadas com o péptido de MBP (Figura 7C, Tabela 1 (abaixo)). Assim, os péptidos MBP não são excretados através do rim, mas são transportados pelo efeito de direccionamento desejado das nanoparticulas para utilização na invenção para células hepáticas.

Para investigar ainda mais o tropismo celular dos conjugados de péptido-nanopartícula administrados, foi realizada microscopia de fluorescência confocal convencional e intravital do fígado, utilizando nanopartícuias com um núcleo de ponto quântico fluorescente (44) . Antes da administração de conjugados de péptido de MBP fluorescente-nanopartícula, os ratos receptores foram injectados com FITC-dextrano que é rapidamente absorvido pela LSEC. Após a injecção intravenosa de nanopartícuias MBP ou nanopartícuias não carregadas, os inventores observaram uma rápida acumulação tanto de nanopartícuias não carregadas como de nanopartículas carregadas com péptido de MBP no fígado, que claramente co-localizaram com LSEC corada com FITC-dextrano (Figura 7D) . Para confirmar ainda a assimilação de nanopartículas carregadas e não carregadas com péptido por LSEC, foi realizada a microscopia electrónica de transmissão de lâminas hepáticas, e detectou-se uma internalização considerável dos conjugados péptido de MBO-nanopartícuia em compartimentos endossomais de LSEC (Figura 7E). Para confirmar que o péptido administrado pode ser apresentado às células T, estudou-se a conversão em Treg in vitro por LSEC na presença de péptido de MBP livre ou de péptido de MBP ligado a nanopartículas (MBP-NP). Os inventores descobriram que a geração Treg ocorreu com eficácia similar (Figura 11), indicando que o péptido MBP administrado por nanopartículas foi apresentado de forma eficiente às células T. Em conjunto, estas descobertas demonstram que essas nanopartí cuias, com ou sem carga de péptidos, são selectivamente assimiladas por LSEC in vivo, e assim facilitam a administração selectiva de péptidos antigénicos a LSEC.

Tabela 1: Parâmetros detalhados das sequências de MRI utilizadas para medições em animais in vivo. Abreviaturas: Sequência de eco de campo rápido (FFE), Campo de visão (FoV), ângulo de inclinação de excitação (FA), tempo de repetição (TR), tempo do eco (TE), número de médias do sinal (NSA) . As medições foram feitas no modo de imagem à temperatura ambiente de 22°C.

0 efeito imunossupressor proposto das nanoparticulas MBP in vivo foi primeiro testado em EAE induzida por MBP em Ratinhos B10.PL (Figura 8A). Uma única injecção intravenosa de nanoparticulas carregadas com péptido de MBP um dia após a indução de EAE provocou uma protecção duradoura e quase completa à EAE clinica; pelo contrário, os ratinhos de controlo tratados com PBS ou com nanoparticulas não carregadas desenvolveram sintomas clínicos de EAE (Figura 8A) . Notavelmente, mesmo ratinhos tg4 (45), que apresentam células T CD4+ específicas para MBP e desenvolvem EAE mais severa, foram protegidos da doença por uma única injecção de MBP-NP um dia após a indução de EAE (Figura 8B) ; os ratinhos de controlo que receberam uma dose equivalente de péptido MBP livre, pelo contrário, desenvolveram EAE severa (Figura 8B). Para confirmar a eficácia da abordagem do tratamento da invenção noutro modelo de doença independente, o efeito de nanoparticulas carregadas com péptidos de glicoproteína oligodendrocitária de mielina (MOG) no desenvolvimento de EAE induzida por MOG foi testado em ratinhos C57BL/6. De acordo com as observações dos inventores em EAE induzida por MBP de ratinhos B10.PL, a administração de nanoparticulas carregadas com péptidos MOG a ratinhos C57BL/6 um dia após a indução de EAE, impediu de forma duradoura que os ratinhos receptores desenvolvessem qualquer sintoma de doença clínica; pelo contrário, os ratinhos de controlo que receberam nanoparticulas não carregadas desenvolveram EAE (Figura 8C) .

Como os inventores mostraram acima que a indução de tolerância por LSEC exigiu a sinalização de TGFp para células T, eles argumentaram que o direccionamento de péptidos de autoantigénios para LSEC baseado em nanopartícuias deveria ser ineficaz em ratinhos com células T insensíveis ao TGFp. De facto, as nanopartículas carregadas com péptido MOG induziram apenas um menor grau de protecção contra a EAE nos ratinhos hCD2-Ak^RII (46), que apresentam células T insensíveis ao TGFp (Figura 8D) . Assim, pode-se concluir que também in vivo, A eficácia da indução de tolerância mediada por nanopartícuias é dependente da sinalização de TGF3 para células T. Para confirmar que a protecção mediada por nanopartículas da EAE dependia da função Treg in vivo, Tregs foram esgotados em ratinhos que receberam nanopartículas de MBP por administração repetida do anticorpo PC61 que reconhece CD25 (47) (Figura 8E) ; a eficácia do esgotamento foi confirmada pela citometria de fluxo (Figura 13). Embora a administração de nanopartículas MBP induzisse a protecção da EAE em ratinhos de controlo, as nanopartículas de MBP não podiam prevenir o desenvolvimento de doença em ratinhos com insuficiência de Treg (Figura 8E) . De facto, a gravidade da doença precipitada pela depleção de Treg foi semelhante à gravidade da doença do grupo de controlo que recebeu PBS em vez de nanopartículas de MBP (Figura 8E) , demonstrando que as Tregs estão envolvidas criticamente na indução de tolerância mediada por nanopartículas in vivo.

Tendo determinado que a NP carregada com o péptido auto-antigénico impediu eficazmente o desenvolvimento da doença autoimune, os inventores abordaram a questão ainda mais importante de se as nanopartículas carregadas com péptidos são um tratamento eficaz da doença autoimune estabelecida. Portanto, eles induziram primeiro a EAE clinica em ratinhos C57BL/6 por imunização MOG. No momento do tratamento, tanto os receptores de nanopartículas com péptido MOG como os ratinhos controlo mostraram sintomas clínicos manifestos com pontuações semelhantes de doença (Figura 14) . 0 grupo de controle progrediu na gravidade da EAE; pelo contrário, as pontuações clínicas médias de ratinhos tratados com MOG-NP melhoraram rapidamente e substancialmente (Figura 9A, Figura 9B) . De notar, a tolerância induzida por uma única injecção terapêutica de nanopartículas carregadas com péptido MOG continuou ao longo de um período prolongado de acompanhamento de 9 semanas (Figura 9A, Figura 9B) . Em conclusão, a administração de auto-antigénios mediada por nanopartículas a LSEC é terapeuticamente eficaz em doenças autoimunes.

Tomados em conjunto, os resultados dos inventores indicam que a administração directa baseada em nanopartículas de péptidos auto-antigénicos a LSEC indutoras de Treg in vivo pode restaurar a tolerância imune ao próprio e servir de tratamento efectivo da doença autoimune. Portanto, essa abordagem oferece uma solução para o problema de efectuar uma terapia baseada em Treg para doenças auto-imunes, fornecendo uma metodologia eficiente para induzir Tregs específicos para os antigénios in vivo. As LSEC são particularmente adequadas como células-alvo para o fornecimento de antigénio tolerogénico, uma vez que induzem tolerância às células T e não suportam respostas efectoras de células T inflamatórias. As nanopartícuias que visam DC esplénicas também estão a ser exploradas como ferramentas para a indução de tolerância específica ao antigénio. No entanto, as DC apresentam um elevado grau de plasticidade e facilmente podem se diferenciar em células inflamatórias, enquanto as LSEC apresentam um fenótipo robusto indutor de tolerância mesmo na presença de sinais pró-inflamatórios. Portanto, a administração de auto-antigénios a LSEC tolerogénicas robustas proporciona maior segurança, especialmente quando se tenta tratar indivíduos com inflamação em curso.

As nanopartícuias são mais comummente modificadas pela ligação de ligandos específicos à sua superfície, de modo a evitar a sua rápida eliminação pelo fígado e para redireccioná-las para alvos específicos, por exemplo, para células cancerígenas. No entanto, a eficácia de direccionamento de tal redireccionamento ainda é limitada pela assimilação indesejada no fígado. Ao tirar proveito da assimilação de nanopartículas altamente selectiva por LSEC, a abordagem da invenção evita a propagação do auto-antigénio a células potencialmente inflamatórias. De facto, esta administração eficiente e selectiva para LSEC pode explicar a eficácia de tratamento estável e potente induzida por uma única administração de nanopartículas carregadas com péptido.

Os dados dos inventores fornecem prova de conceito de que a indução de tolerância específica ao antigénio in vivo pode ser alcançada através da administração de antigénios à base de nanopartícuias a LSEC. Estas descobertas permitem o desenvolvimento de um tratamento eficaz baseado em Treg para doenças autoimunes e inflamatórias humanas em que os antigénios de direccionamento foram identificados.

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Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uma composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras especificas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune especifica é benéfica, em que a composição compreende uma nanoparticula, compreendendo a referida nanoparticula a) uma micela compreendendo um polímero anfifílico tornando a nanoparticula solúvel em água e b) um péptido compreendendo o pelo menos um epitopo de células T associado com o exterior da micela.
2. 2. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com a reivindicação 1, em que a micela não compreende um núcleo sólido .
3. 3. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com a reivindicação 1, em que a micela cobre um núcleo hidrofóbico sólido.
4. 4. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com a reivindicação 3, em que o núcleo compreende um material inorgânico rastreável seleccionado do grupo que compreende óxido de ferro, CdSe/CdS/ZnS, prata e ouro.
5. 5. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com qualquer das reivindicações 3 ou 4, em que o diâmetro do núcleo é de 5 a 30 nm, de preferência, de 9 a 12 nm.
6. 6. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o polímero é um polímero sintético seleccionado do grupo que compreende o poli(anidrido maleico-alt-l-octadeceno), o poli(anidrido maleico-alt-l-tetradeceno) e o copolímero em bloco de óxido de polietileno bloqueado com poli-isopreno, em que o polímero é de preferência poli(anidrido maleico-alt-l-octadeceno) .
7. 7. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras especificas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune especifica é benéfica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a nanoparticula é carregada negativamente.
8. 8. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras especificas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o péptido está ligado covalentemente à micela ou não está associado covalentemente.
9. 9. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a nanopartícuia compreende um núcleo sólido compreendendo óxido de ferro com um diâmetro de cerca de 9 a cerca de 12 nm, que é encapsulado por um revestimento de poli(anidrido maleico-alt-l-octadeceno) ao qual um péptido compreendendo um epitopo de células T está ligado covalentemente.
10. 10. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras especificas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune especifica é benéfica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as nanoparticulas são adequadas para transferir o péptido para células endoteliais sinusoidais hepáticas de um indivíduo in vivo.
11. 11. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras especificas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a composição farmacêutica é adequada Para induzir a geração de células T reguladoras específicas para o pelo menos um epitopo através da apresentação do referido epitopo por células endoteliais sinusoidais hepáticas e/ou células de Kupffer.
12. 12. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as nanoparticulas são formuladas para administração a um indivíduo com uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica.
13. 13. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras especificas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida doença é seleccionada a partir do grupo que compreende uma doença auto-imune, uma alergia ou uma doença em que a inflamação é excessiva, crónica ou adversa.
14. 14. A composição farmacêutica para utilização na geração de células T reguladoras específicas para pelo menos um epitopo de células T num indivíduo para tratar ou prevenir uma doença em que a supressão de uma resposta imune específica é benéfica de acordo com qualquer das reivindicações 12 ou 13, em que a doença é seleccionada do grupo que compreende esclerose múltipla, diabetes tipo I, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, degeneração após trauma ou acidente vascular cerebral, doença de enxerto contra hospedeiro, rejeição de transplante, doença inflamatória intestinal (IBD), asma e alergia.