PT2945651T

PT2945651T - Anticorpo específico para mdr e. coli

Info

Publication number: PT2945651T
Application number: PT147037832T
Authority: PT
Inventors: Nagy Eszter; Badarau Adriana; Nagy Gábor; Mirkina Irina; Szijárto Valéria; Magyarics Zoltán; Guachalla Luis; Zauner Gerhild; Lukasiewicz Jolanta
Original assignee: Arsanis Biosciences Gmbh
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2018-06-12
Also published as: JP6643454B2; CN105120896B; JP6553517B2; IL273685A; BR112015014991B1; RU2711512C2; ZA201503282B; AU2018204437A1; EP3167903B1; MX365331B; US20150322138A1; CA2895327C; US20170087236A1; MX2019001795A; US20230277643A1; BR112015014991A8; EP2945651B1; US20250170230A1; ES2718051T3; PL2945651T3

Description

Descrição

Anticorpo especifico para Mdr e. coli CAMPO DE INVENÇÃO A invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente ao antigénio LPS 025b de E resistente a múltiplos fármacos (MDR) estirpes de coli.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Lipopolissacarideo (LPS) é o antigeno mais abundante na superfície de patógenos enterobacterianos. Tipicamente, o LPS tem três partes estruturais: i) Lípido A (também conhecido como endotoxina), ii) oligossacárido do núcleo e iii) O-antigénio. Este último é composto de subunidades de repetição de 3-6 açúcares (dependendo do sorotipo). 0 Lípido A e o núcleo OS estão relativamente bem conservados numa única espécie enterobacteriana, no entanto, a sua acessibilidade aos anticorpos é limitada. Por outro lado, os O-antigénios são altamente acessíveis, mas muito diversos no que diz respeito à sua estrutura (em E. coli existem ~ 180 O-tipos).

Anticorpos contra O-antigénios podem ligar-se à superfície de E. coli; portanto, eles são usados tanto para diagnósticos (por exemplo, 0-tipagem para estudos epidemiológicos) como são propostos como medidas terapêuticas. No entanto, dada a enorme variabilidade estrutural, uma proteção de amplo espectro com anticorpos específicos do 0-antígeno é incomoda.

Infecções extraintestinais causadas por E. coli são comuns, causando morbidade e mortalidade significativas. Cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR) de E. coli que surgiram recentemente causam uma proporção considerável de infecções por E. coli.

As opções de tratamento contra esses esforços de MDR estão ficando muito limitadas, pois elas desenvolveram resistência à maioria das classes de antibióticos clinicamente relevantes. Portanto, uma opção de tratamento alternativa, por exemplo, a imunização passiva com anticorpos monoclonais (mAbs) é uma grande promessa para o futuro.

Nos últimos anos, uma linhagem clonal bem definida de MDR E. coli. o ST131-025b:H4 emergiu, causando aproximadamente 10% de todas as infecções extra-intestinais de E. coli e cerca de metade das infeções por E. coli MDR (Peirano et al. Int. Antimicrob Agents 2010 Apr; 35 (4): 316-21; Rogers et al., J. Antimicrob Chemother 2011 Jan; 66 (1): 1-14; Woodford et al., FEMS Microbiol Rev 2011 Sep; 35 (5): 736-55.). As estirpes pertencentes a esta linhagem apresentam uma heterogeneidade limitada, podendo ser consideradas muito semelhantes no que se refere ao repertório antigénico. A maioria dos esforços pertencentes a este cluster expressa o antigeno 025b e, portanto, um gene específico (dentro do locus de síntese LPS) que codifica as enzimas que sintetizam este antigeno é usado para a identificação deste clone (Clermont et al. J Antimicrob Chemother 2008 maio; 61 (5): 1024-8.).

Alternativamente, a aglutinação com os soros de tipagem 025 pode ser usada, apesar de o antigeno O dessa linhagem diferir dos antígenos 025 clássicos (daí ter sido denominado 025b) como sugerido pelas diferenças genéticas. No entanto, o 025 soros de tipagem não podem distinguir entre os clones não-MDR 025 e MDR 025b.

Rogers et al. (J Antimicrob Chemother 2011 Jan; 66 (1): 1- 14) descrevem a detecção do esforço E. coli 025b-ST131 por três caracteristicas principais, ou seja, o seu sorogrupo (025b), o seu grupo filogenético (B2) e o seu ST ( ST131) . Cada uma destas caracteristicas é divulgada para auxiliar a detecção. É descrita uma variedade de técnicas moleculares, isto é, MLST, métodos de detecção rápida baseados em PCR, PCR de sequência repetitiva e PFGE. Os anti-soros policlonais (criados contra uma estirpe 025a) incluindo uma variedade de imunoglobulinas foram utilizados para determinar o antigénio 025, não diferenciando subtipos.

Jadhav et al. (PLOS ONE 2011; 6 (3): el8063) descrevem as caracteristicas de virulência e afinidades genéticas de estirpes que foram positivas para o subgrupo 025b que está ligado ao tipo virulento/multi-resistente B2-025b-ST131-CTX-M-15. Os isolados clinicos humanos foram analisados e classificados em sorotipos e perfis de marcadores de virulência e foram obtidos. A estirpe 025 positiva foi identificada por sorotipagem usando antissoros policlonais contra antigenos 0 - 01 a 0173. 0 025. As estirpes positivas foram ainda submetidas a genotipagem por um PCR especifico para o alelo visando o locus do gene do subgrupo rfb025b.

Mora et al. (Int. J. Antimicrobial Agents 2011;37 (1): 16- 21) descrevem a emergência de alguns grupos clonais entre clinicos isolados de E. coli produtores de CTX-M-14, entre eles 025b: H4-B2-ST131. A tipagem foi feita com antissoro 0 especifico (policlonal).

Clermont et al. (J Antimicrob Chemother 2008 May; 61 (5): 1024-8) divulga um ensaio de PCR pabB especifico de alelo especifico para 025b ST131E. coli.

Szijarto et al, (FEMS Microbiol Lett 2012; 332: 131-6) descrevem a tipagem molecular de isolados de cepas de E. coli na estrutura do núcleo da molécula LPS. 0 tipo de núcleo dos isolados foi determinado por PCR usando primers visando genes no operão central e específicos para os tipos centrais Rl-4 e K-12, respectivamente.

SUMARIO DA INVENÇÃO 0 objectivo da presente invenção é proporcionar um anticorpo dirigido contra estirpes MDR de E. coli com especificidade melhorada para utilização na prevenção ou terapêutica de infecções por E. coli causadas por estirpes transportadoras de LPS 025b. É ainda objectivo fornecer meios e métodos capazes de diagnosticar bactérias MDR E. coli de uma maneira rápida e fiável. 0 objeto é resolvido pelo objeto da presente invenção.

De acordo com a invenção, proporcionado um anticorpo isolado compreendendo um sitio de ligação ao antigénio que reconhece especificamente o antigio 025b de estirpes de E. coli resistentes a múltiplos fármacos (MDR).

Especificamente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Especificamente, o anticorpo é específico para a ligação apenas do antígeno 025b, ou específico cruzado para ligar um epitopo compartilhado pelos antígenos 025a e 025b.

De acordo com um aspecto especifico, o anticorpo especifico para ligação aos antigénios 025b e 025 ou 025a, por exemplo, com afinidades iguais, mais do que iguais, semelhantes ou diferentes.

Especif icamente, aqui descrito é um anticorpo que se liga preferencialmente ao antigénio 025b em relação ao antigénio de E. coli 025a, ou pelo menos com igual afinidade para ambos os antigénios.

De acordo com uma forma de realização específica, o anticorpo tem uma afinidade pelo menos duas vezes maior para ligação ao antigénio 025b em comparação com o antigénio 025a, especificamente com uma diferença de pelo menos dois ou pelo menos três vezes pelo menos quatro vezes pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes a diferença na ligação ao antigénio 025b ou 025a, eg, afinidade e/ou diferença de avidez.

De acordo com um aspecto específico, a ligação específica a 025b é caracterizada pela maior afinidade de ligação ao antígeno 025b em comparação com a ligação do antígeno 025b a anticorpos policlonais do soro criados contra cepas de E. coli 025 ou 025a, conforme determinado por imunoensaio, preferencialmente imunotransferência, ELISA ou outros métodos imunológicos. A maior afinidade de ligação é especificamente com uma diferença de pelo menos duas vezes, ou pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes a diferença.

Especificamente, o antigénio 025b como o alvo de anticorpo aqui descrito é prevalente num ou mais, e mais especificamente presente na clara maioria das estirpes de ST131.

Especificamente, o epitopo reconhecido pelo anticorpo encontra-se na superfície de estirpes ST131-025b:H4 encapsuladas e não encapsuladas, por exemplo, estirpes mutantes.

De acordo com outro aspecto particular, o anticorpo possui um sitio de ligação de um anticorpo monoclonal de comprimento total ou um seu fragmento de anticorpo compreendendo pelo menos um domínio de anticorpo incorporando um local de ligação, anticorpo esse preferido de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo de murino, humano, anticorpos de cadeia pesada humana ou humana, anticorpos de cadeia pesada, Fab, Fd, scFv e anticorpos de domínio, tais como VH, VHH ou VL, preferivelmente um anticorpo IgG humano ou um anticorpo IgG murino.

De acordo com um outro aspecto específico, o anticorpo tem uma afinidade para ligar o antigénio 025b a um Kd inferior a 10‘7M, de preferência inferior a 10‘8M, especif icamente num estado monomérico.

De acordo com um outro aspecto específico, o anticorpo exibe

Potência bactericida in vitro numa amostra de soro compreendendo estirpes MDR de E. coli do tipo selvagem viva.

De acordo com outro aspecto específico, o anticorpo estimula a captação de cepas MDR de E. coli do tipo selvagem por células fagocitárias in vitro.

De acordo com outro aspecto especifico, o anticorpo liga-se ao mesmo epitope que o anticorpo designado 8D5-1G10 ou 8D10-C8.

De acordo com outro aspecto especifico, o anticorpo compreendendo o mesmo local de ligação que o anticorpo designado como 8D5-1G10 ou 8D10-C8.

De acordo com um aspecto especifico, aqui descrito um anticorpo monoclonal isolado liga-se especificamente ao antigénio 025b de estirpes de E. coli resistentes a múltiplos fármacos (MDR) compreendendo o sitio de ligação ao antigénio do anticorpo 8D5-1G10 ou derivado do anticorpo. 8D5-1G10, ou uma variante funcionalmente ativa do anticorpo 8D5-1G10, de preferência que é caracterizada por a) a região variável da cadeia leve do anticorpo produzido pela célula hospedeira depositada sob o DSM 26763; e b) a região variével da cadeia pesada do anticorpo produzido pela célula hospedeira depositada sob o DSM 26762; c) ou uma variante funcionalmente activa de (a) e/ou (b) é empregue.

De acordo com uma forma de realização específica, o anticorpo é o anticorpo 8D5-1G10 ou uma sua variante funcionalmente ativa.

Outros anticorpos são aqui exemplificados, os quais são desiqnados 6D1-1B2 e 8A1-1G8. Estes são clones com sequências de CDR tais como 8D5-1G10, aqui também entendidas como variantes de CDR funcionalmente activas.

Especificamente, o anticorpo designado 8D5-1G10 consiste numa cadeia leve de anticorpo compreendendo a região variável codificada pela sequência codificadora do plasmideo compreendida na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 26763, e uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a região variável codificado pela sequência de codificação do plasmideo compreendida na célula hospedeira de E. coli depositada sob o DSM 26762.

De acordo com um aspecto especifico adicional, o anticorpo derivado do anticorpo 8D5-1G10, em que a região variável da cadeia leve do anticorpo codificada por um plasmideo compreendido na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 26763, ou uma base funcionalmente activa da sua variante; e/ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo codificada por um plasmideo compreendido na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 26762, ou uma sua variante funcionalmente activa.

De acordo com outro aspecto especifico, o anticorpo derivado de um anticorpo, em que -a região variável da cadeia leve do anticorpo é produzida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 26763, ou funcionalmente a sua variante ativa; e/ou -a região variável da cadeia pesada do anticorpo produzida por uma célula hospedeira depositada sob DSM 26762, ou uma sua variante funcionalmente activa.

De acordo com outro aspecto especifico, aqui descrito um anticorpo monoclonal isolado especifico em cruz para a ligação a um epitope partilhado pelos antigénios 025a e 025b e que compreende o local de ligação ao antigénio do anticorpo 8D10-C8 ou que deriva do anticorpo 8D10. Anticorpo C8, ou uma variante funcionalmente ativa do anticorpo 8D10-C8, preferencialmente em que o anticorpo 8D10-C8 é caracterizado por a) a região variável da cadeia leve do anticorpo produzido pela célula hospedeira depositada sob o DSM 28171; e/ou b) a região variével da cadeia pesada do anticorpo produzido pela célula hospedeira depositada sob o DSM 28172; c) ou uma variante funcionalmente activa de (a) e/ou (b) é empregue.

De acordo com uma forma de realização especifica, o anticorpo é o anticorpo 8D10-C8 ou uma sua variante funcionalmente ativa.

Especificamente, o anticorpo designado como 8D10-C8 composto por uma cadeia leve do anticorpo compreendendo a região variável codificada pela sequência de codificação do plasmideo compreendido na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 28171 e uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a região variável codificada pela sequência de codificação do plasmideo compreendido na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 28172.

De acordo com um outro aspecto especifico, o anticorpo é derivado do anticorpo 8D10-C8, em que - a região variável da cadeia leve do anticorpo codificada por um plasmideo compreendido na célula hospedeira de E. coli depositada sob o DSM 28171, ou uma sua variante funcionalmente activa; e/ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo codificada por um plasmideo compreendido na célula hospedeira de E. coli depositada sob DSM 28172, ou uma sua variante funcionalmente activa.

De acordo com um outro aspecto especifico, o anticorpo derivado de um anticorpo, em que - a região variável da cadeia leve do anticorpo é produzida por uma célula hospedeira depositada sob o DSM 28171, ou uma sua variante funcionalmente ativa; e/ou - a região variável da cadeia pesada do anticorpo produzida por uma célula hospedeira depositada sob o DSM 28172, ou uma sua variante funcionalmente activa.

Especificamente, a variante funcionalmente activa é uma variante de CDR, por exemplo, que compreende uma CDR, mais especificamente uma sequência de laçada CDR, com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70%, 80% ou 90% de identidade de sequência.

Especificamente, o anticorpo é derivado de tais anticorpos, empregando as respectivas sequências de CDR, ou mutantes de CDR, incluindo variantes de CDR funcionalmente ativas, por exemplo, com mutações de 1, 2 ou 3 pontos dentro de um laço de CDR.

Especificamente, a variante funcionalmente activa difere do anticorpo parental em pelo menos uma mutação pontual na sequência de aminoácidos, preferencialmente na CDR, em que o número de mutações pontuais em cada uma das sequências de aminoácidos da CDR é 0, 1, 2 ou 3.

De acordo com um outro aspecto especifico, aqui proporcionado um plasmideo compreendendo uma sequência nucleotica A codificação da região variável da cadeia leve do anticorpo designada 8D5-1G10-LC compreendida numa célula hospedeira depositada sob o DSM 26763; e/ou

codificando a região variável da cadeia pesada do anticorpo designada 8D5-1G10-HC compreendida numa célula hospedeira depositada sob DSM 26762; ou B - codificando a região variável da cadeia leve do anticorpo designada 8D10-C8-LC compreendida numa célula hospedeira depositada sob DSM 28171; e/ou codificando a região variável da cadeia pesada do anticorpo designada 8D10-C8-HC compreendida numa célula hospedeira depositada sob DSM 28172.

De acordo com um outro aspecto especifico, a invenção proporciona uma cassete de expressão compreendendo uma sequência de codificação para expressar uma cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo da invenção, cuja sequência de codificação compreende, - uma sequência nucleotica codificando a região variável da cadeia leve do anticorpo designada 8D5-1G10-LC compreendida numa célula hospedeira depositada sob o DSM 26763; e - uma sequência nucleotica codificando a região variável da cadeia pesada do anticorpo designada 8D5-1G10-HC compreendida numa célula hospedeira depositada sob o DSM 26762.

De acordo com um outro aspecto especifico, aqui descrito um modo de produção de um anticorpo, em que uma célula hospedeira transformada com um plasmideo ou com a cassete de expressão aqui descrito.

De acordo com um outro aspecto especifico, a célula hospedeira compreende um plasmideo ou a cassete de expressão da invenção aqui descrito.

Especificamente, a célula hospedeira é depositada sob A DSM 26763 e/ou DSM 26762; ou B DSM 28171 e/ou DSM 28172.

Uma forma de realização especifica refere-se a um método de produção de um anticorpo da invenção, em que uma célula hospedeira da invenção é cultivada ou mantida sob condições para produzir o referido anticorpo.

De acordo com um outro aspecto especifico, aqui descrito, um modo de identificação de um anticorpo candidato compreendendo: (a) fornecer uma amostra contendo um anticorpo ou célula produtora de anticorpos; e (b) avaliar a ligação de um anticorpo na amostra ou produzida pela amostra com um epitopo reconhecido pelo anticorpo designado como 8D5-1G10 ou 8D10-C8, em que uma reacção positiva entre o anticorpo e o epitopo identifica o anticorpo como anticorpo candidato.

De acordo com um outro aspecto especifico, a invenção proporciona um modo de identificação de um anticorpo candidato composto: (a) fornecer uma amostra contendo um anticorpo ou célula produtora de anticorpos; e (b) avaliar a ligação de um anticorpo ou produzido pela amostra com o antigénio 025b de uma estirpe ST131-025b: H4 e 025 antigénios de uma estirpe de E. coli n MDR, ou o antigénio 025a, em que uma reacção positiva especifica entre o anticorpo e o antigeno 025b, em relação ao antigeno 025 ou antigeno 025a, identificam o anticorpo como anticorpo candidato.

Especificamente, o anticorpo candidato é um anticorpo protector candidato, tal como para uso terapêutico, ou um anticorpo diagnóstico candidato.

Ainda, de acordo com um outro aspecto especifico, a invenção proporciona um modo para produzir um anticorpo da invenção, compreendendo (a) proporcionar um anticorpo candidato identificado de acordo com a invenção; e (b) produzir um anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo candidato, ou um derivado com a mesma especificidade de ligação ao epitopo que o anticorpo candidato.

De acordo com outro aspecto especifico, aqui descrito é um método de produzir um anticorpo aqui descrito, compreendendo (a) imunizar um animal não humano com um epitopo reconhecido pelo anticorpo designado como 8D5-1G10 ou 8D10-C8; (b) formar linhas celulares imortalizadas a partir das células B isoladas; (c) rastreio das linhas celulares obtidas em b) para identificar uma linha celular que produz um anticorpo monoclonal que se liga ao epitopo; e (d) produzir o anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo, ou um seu derivado com a mesma especificidade de ligação ao epitopo que o anticorpo monoclonal.

De acordo com outro aspecto especifico, aqui descrito é um método de produzir um anticorpo aqui descrito, compreendendo (a) imunizar um animal não humano com o antigénio 025b de uma estirpe ST131-025b: H4 e isolar as células B que produzem anticorpos; (b) formar linhas celulares imortalizadas a partir das células B isoladas; (c) rastreio das linhas celulares para identificar uma linha celular que produz um anticorpo monoclonal que se liga preferencialmente ao antigénio 025b em relação aos antigenios 025 ou ao antigénio 025a de E. coli; e (d) produzir o anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo, ou um seu derivado com a mesma especificidade de ligação ao epitopo que o anticorpo monoclonal.

De acordo com um outro aspecto, a invenção proporciona a utilização médica de um anticorpo da invenção.

Especificamente, o anticorpo é fornecido para uso no tratamento de um individuo em risco ou sofrendo de uma infecção por E. coli MDR. compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz do anticorpo para limitar a infecção no sujeito ou melhorar uma doença resultante da referida infecção, de preferência para tratamento ou profilaxia de pielonefrite, bacteremia secundária, sepsia, peritonite, meningite e pneumonia associada a ventilador.

Especificamente, o anticorpo é fornecido para matar bactericida de MDR E. coli, preferivelmente uma estirpe ST131-025b:H4 independentemente do polissacárido capsular expresso pela estirpe.

De acordo com um aspecto especifico, é ainda proporcionado um método de tratamento em que um indivíduo em risco ou sofrendo de uma infecção por E. coli MDR é tratado, pelo método que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo para limitar a infecção no sujeito ou para melhorar um estado de doença resultante da referida infecção preferivelmente um método para tratamento ou profilaxia de pielonefrite, bacteremia secundária, sépsis, peritonite, meningite e pneumonia associada à ventilação mecânica.

Especificamente, o método de tratamento é proporcionado para matar bactericida de MDR E. coli, de um modo preferido, uma estirpe ST131-025b: H4, independentemente do polissacarídeo capsular expresso pela estirpe.

De acordo com um aspecto especifico, a imunoterapia utilizando o anticorpo aqui descrito pode proteger eficazmente contra o desafio bacteriano vivo, por exemplo, como determinado em vários modelos de animais. 0 anticorpo pode neutralizar especificamente a endotoxemia letal. Tal atividade funcional pode ser determinada num modelo in vivo apropriado (desafio com LPS purificado). 0 anticorpo é especificamente eficaz contra MDR E. coli por morte mediada por complemento, por exemplo, como determinado por um ensaio bactericida do soro (SBA) in vitro, por exemplo, com pelo menos 20% da morte de bactérias acima das amostras de controlo (sem anticorpo ou mAb de controlo irrelevante adicionado). O anticorpo é especificamente eficaz contra MDR E. coli por fagocitose mediada por anticorpo, por exemplo, como determinado por um ensaio de morte opsonofagocica in vitro (ΟΡΚ) , por exemplo, com pelo menos 20% de absorção de bactérias de entrada ou 20% de contagem final de ufc acima das amostras de controlo (nenhum anticorpo ou mAb de controlo irrelevante adicionado). O anticorpo é especificamente eficaz contra MDR E. coli neutralizando as funções da endotoxina, por exemplo, como determinado por um ensaio LAL in vitro, ou por um ensaio repórter Toll-like receptor 4 (TLR4), por exemplo, com pelo menos 20% de redução na endotoxina com actividades em comparação com amostras de controlo (sem anticorpo ou mAb de controlo irrelevante adicionado).

De acordo com uma forma de realização especifica, o anticorpo é administrado numa formulação parentérica ou mucosa.

De acordo com um outro aspecto, a invenção proporciona uma preparação farmacêutica de um anticorpo da invenção, preferivelmente compreendendo uma formulação parentérica ou mucosa, contendo opcionalmente um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

De acordo com um outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo da invenção, para utilização em diagnóstico para detectar ou determinar a infecção por E. coli num individuo provocada por estirpes MDR que expressam o antigio LPS 025b, tal como com o antigio superior e infecções do tracto urinário inferior, incluindo cistite ou uretrite, pielonefrite ascendente ou hematogica, especialmente em doentes diabéticos, bem como com bacteriemia, sepsia, peritonite ou colonização intestinal, utilizando o anticorpo da invenção, em que a infecção determinada ex vivo contactando uma amostra de um fluido corporal do referido sujeito com o anticorpo, em que uma reação imunitária especifica do anticorpo determina a infecção.

Especificamente, o anticorpo é fornecido para utilização de acordo com a invenção, em que uma infecção sistémica com MDR E. coli num individuo é determinado ex vivo por contacto de uma amostra de fluido corporal do referido sujeito com o anticorpo, em que uma reacção imunitária especifica do anticorpo determina a infecção.

Especificamente, uma amostra de fluido corporal é testada para a reação imune especifica, amostra essa que é selecionada do grupo consistindo de urina, sangue, isolados sanguíneos ou hemocultura, aspirado, expectoração, fluido de lavagem de sujeitos intubados e fezes.

Especificamente, o uso diagnóstico aqui descrito refere-se à determinação do sorotipo de E. coli in vitro a partir de um puro E.coli recuperada de uma amostra clínica.

De acordo com um outro aspecto, a invenção proporciona uma preparação de diagnóstico de um anticorpo da invenção, contendo opcionalmente o anticorpo com um marcador e/ou um reagente de diagnóstico adicional com um marcador, tal como um reagente que reconhece especificamente o anticorpo ou um anticorpo imune. Complexo do anticorpo com o respectivo antigénio alvo e/ou uma fase sólida para imobilizar pelo menos um dos anticorpos e o reagente de diagnóstico. A preparação de diagnóstico pode ser fornecida como uma composição ou como um kit de partes, por exemplo, compreendendo componentes, tais como componentes compreendendo a) a preparação de anticorpo de diagnóstico e/ou b) o reagente de diagnóstico adicional, e/ou uma fase sólida para imobilizar pelo menos um dos anticorpos e o reagente de diagnóstico, como um componente separado ou como portador de qualquer um dos componentes a) e/ou b) acima.

Ensaios de diagnóstico preferidos aqui descritos compreendem o anticorpo aqui descrito imobilizado numa fase sida, por exemplo, grulos de lex, partulas de ouro, etc., por exemplo, para testar a aglutinação pelo anticorpo de bactérias que expressam o antigénio 025b ou o antigénio 025b livre (ou isolado) obtido a partir de uma amostra a ser testada.

Alguns ensaios de diagnóstico podem envolver dois anticorpos diferentes com diferente especificidade e/ou afinidade para ligar 025b e/ou 025a, de modo a possivelmente diferenciar entre os antigénios 025b e 025a.

De acordo com um aspecto especifico, são aqui descritos diagnósticos associados para determinar a infecção de um sujeito com MDR E. coli pelos diagnósticos aqui descritos ou pelo método de diagnóstico aqui descrito, para proporcionar a base do tratamento com um terapêutico contra tal infecção, por exemplo, empregando imunoterapia, tal como tratamento com um anticorpo aqui descrito.

De acordo com um aspecto especifico, são aqui descritos diagnósticos sensiveis à beira do leito para diagnosticar a infecção de um individuo com E. coli MDR, determinando LPS, por exemplo, de espécime clinico onde o número de bactérias vivas é limitado. A sensibilidade de tal ensaio é especificamente inferior a 100 ng, de preferência inferior a 10 ng de LPS.

De acordo com um outro aspecto, aqui descrito é um epitopo isolado reconhecido pelo anticorpo designado 8D5-1G10 ou 8D10-C8. Esse epitopo pode consistir num simples epitopo ou numa mistura de epitopos compreendendo variantes de epitopo, cada um reconhecido pelo anticorpo especifico designado 8D5-1G10 ou 8D10-C8. Especificamente, o epitopo do anticorpo 8D10-C8 é um anticorpo comum e prevalente em ambos os antigenos 025b e 025a, assim, o anticorpo é considerado como sendo especifico cruzado, mas preferencialmente ligando o antigeno 025b pelo menos igual à ligação do 025a de antigeno.

De acordo com um outro aspecto, aqui descrito, é um imunogénio compreendendo: (a) um epitopo aqui descrito; (b) opcionalmente outros epitopos nativamente associados com o referido epitopo de (a); e (c) um portador.

Especificamente, o transportador é um transportador farmaceuticamente aceitável, compreendendo preferencialmente substâncias tampão e/ou adjuvantes. 0 imunogénio aqui descrito é preferencialmente fornecido numa formulação de vacina, preferencialmente para utilização parentérica.

Especificamente, o imunogénio aqui descrito é proporcionado para utilização médica, especificamente para utilização no tratamento de um sujeito por administração de uma quantidade eficaz do referido imunogénio para proteger o sujeito de uma infecção por E. coli MDR, ou para prevenir uma doença resultante do referido infecção.

Especificamente, o imunogénio aqui descrito é proporcionado para induzir uma resposta imunitária protectora.

De acordo com um aspecto especifico, é ainda proporcionado um método de tratamento em que um indivíduo em risco para infecção por MDR de E. coli é tratado, cujo método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do imunogénio para prevenir infecções no indivíduo, para proteger contra patógeno MDR E. coli.

De acordo com um outro aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo da invenção.

FIGURAS

Figura 1: Coloração de superfície de diferentes estirpes de ST131: 025b expressando antigénios 025b, 025a ou 02 por mAb específicos de 025b (com ou sem reactividade cruzada com o antigénio 025a).

Figura 2: reactividade de diferentes mAbs e 025 soro de coelho para as moléculas 025a e 025b LPS purificadas num immunoblot teste.

Figura 3: (a): Estrutura da unidade de repetição de antígeno de E. coli 025b. (b) : estrutura de unidade de repetição de E. coli 025a (também referida como 025, por vezes referida como 025 (a)) para comparação (Kenne et al., 1985).

Figura 4: Deteção de estirpes de E. coli que expressam o antigio 025b com ensaio de aglutinao usando mAb 8D5-1G10 acoplado para contas de látex.

Figura 5: Deteção do antigénio 025b solúvel com ensaio de aglutinação utilizando mAb 8D5-1G10 acoplado a polas lex.

Figura 6: Proteção proporcionado por imunização passiva de mAb murinos específicos para 025b contra um desafio letal intravenoso subsequente por um isolado cíclico ST131: 025b. Figura 7: Complemento bacteriano dependente mediado por mAbs específicos de 025b.

DESCRIÇÃO DETALHADA 0 termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, refere-se a polipéptidos ou proteínas que consistem ou compreendem domínios de anticorpo, que são entendidos como domínios constantes e/ou variáveis das cadeias pesadas e/ou leves da imunoglobulina, com ou sem uma corda de vinculador. Os polipéptidos são entendidos como domínios de anticorpos se compreenderem uma estrutura de barril beta consistindo em pelo menos duas cadeias beta de uma estrutura de dominio de anticorpo ligada por uma sequência de laço. Os dominios de anticorpo podem ser de estrutura nativa ou modificados por mutagese ou derivatização, por exemplo, para modificar as propriedades de ligação ao antigénio ou qualquer outra propriedade, tal como estabilidade ou propriedades funcionais, tais como ligação aos receptores FcRn e/ou Fcgamma do receptor Fc. 0 anticorpo, tal como aqui utilizado, tem um local de ligação especifico para a ligação de um ou mais antigénios ou um ou mais epitopos de tais antigénios, compreendendo especificamente um sitio de ligação a CDR de um dominio de anticorpo variante, tal como VH, VL ou VHH ou um sitio de ligação de pares de dominios de anticorpo variantes, tais como um par VL/VH, um anticorpo compreendendo um par de domios VL/VH e dominios de anticorpo constantes, tais como Fab, F (ab'), (Fab) 2, scFv, Fv ou um anticorpo de comprimento total. 0 termo "anticorpo" tal como aqui utilizado refere-se particularmente a formatos de anticorpo compreendendo ou consistindo num único dominio de anticorpo variável, tal como VH, VL ou VHH, ou combinações de dominios de anticorpo variáveis e/ou constantes com ou sem uma sequência de ligação ou uma dobradiça região, incluindo pares de dominios de anticorpos variáveis, como um par VL/VH, um compreendendo ou consistindo num par de dominios VL/VH e dominios de anticorpos constantes, tais como anticorpos de cadeia pesada, Fab, F (ab'), (Fab) 2, scFv, Fd, Fv ou um anticorpo de comprimento total, por exemplo, um tipo de IgG (por exemplo, um subtipo de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgAl, IgA2, IgD, IgE ou IgM. 0 termo "anticorpo de comprimento total" pode ser usado para se referir a qualquer anticorpo molécula compreendendo pelo menos a maior parte do domínio Fc e outros domínios normalmente encontrados num monómero de anticorpo que ocorre naturalmente. Esta frase é aqui usada para enfatizar que uma molécula de anticorpo não é um fragmento de anticorpo. 0 termo "anticorpo" deve incluir especificamente anticorpos na forma isolada, por exemplo, que estão substancialmente isentos de outros anticorpos dirigidos contra diferentes antigénios alvo ou compreendendo um arranjo estrutural diferente de dominios de anticorpos. Adicionalmente, um anticorpo isolado pode ser compreendido numa preparação de combinação, contendo uma combinação do anticorpo isolado, por exemplo, com pelo menos um outro anticorpo, como anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos especificidades diferentes. 0 termo "anticorpo" aplica-se a anticorpos de origem animal, incluindo espécies humanas, tais como mamíferos, incluindo humanos, murinos, coelhos, cabras, lhamas, vacas e cavalos, ou aves, como galinhas. 0 termo "anticorpo" aplica-se ainda a anticorpos quiméricos tendo sequências de origem de espécies distintas, tais como sequências de origem murina e humana. 0 termo "quimérico" como utilizado em relação a um anticorpo refere-se aos anticorpos em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve é homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie ou pertencente a uma classe, enquanto o segmento restante da cadeia é homóloga às sequências correspondentes em outra espécie ou classe.

Tipicamente, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada mimetiza as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero, enquanto as porções constantes são homogéneas a sequências de anticorpos derivados de outra. Por exemplo, a região variável pode ser derivada de fontes presentemente conhecidas utilizando células B prontamente disponíveis ou hibridomas de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. 0 termo "anticorpo" ainda se aplica a anticorpos humanizados. 0 termo "humanizado" como utilizado em ligação com um anticorpo refere-se a uma molécula possuindo um local de ligação ao antigénio que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula é baseada na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana. 0 local de ligação ao antigénio pode compreender domínios variáveis completos fundidos com domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas em regiões estruturais apropriadas nos domínios alvo Tr. Os locais de ligação ao antigénio podem ser do tipo selvagem ou modificados, por exemplo, por uma ou mais substituições de aminoácidos, preferencialmente modificadas para se assemelharem mais às imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de ratinho humanizado que contém todas as seis CDR do anticorpo de ratinho) . Outras formas têm uma ou mais CDRs que são alteradas em relação ao anticorpo original. 0 termo "anticorpo" ainda se aplica a anticorpos humanos. 0 termo "humano" como utilizado em ligação com um anticorpo, inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. 0 anticorpo humano da invenção pode incluir residuos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese especifica de local ou in vivo in vitro ou por somatostatina in vivo), por exemplo em CDRs. Anticorpos humanos incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos para um ou mais imunoglobulina. 0 termo aplica-se especificamente a anticorpos de qualquer classe ou subclasse. Dependendo da sequência de aminoácidos do dominio constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos podem ser atribuídos às principais classes de anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários deles podem ser divididos em subclasses (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. 0 termo aplica-se ainda a anticorpos monoclonais ou policlonais, especificamente um anticorpo recombinante, cujo termo inclui todos os anticorpos e estruturas de anticorpo que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos de animais, por exemplo, mamíferos incluindo humanos, compreendendo genes ou sequências de diferentes origens, por exemplo, anticorpos químicos, humanizados, ou anticorpos derivados de hibridoma. Outros exemplos são dirigidos a anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, ou anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória recombinante de anticorpos ou domínios de anticorpos, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o processamento do anticorpo, do gene e sequências para outras sequências de DNA.

Entende-se que o termo "anticorpo" também se refere a derivados de um anticorpo, em particular derivados funcionalmente activos. Um derivado de anticorpo é entendido como qualquer combinação de um ou mais domínios de anticorpos ou anticorpos e/ou uma proteína de fusão, em que qualquer domínio do anticorpo pode ser fundido em qualquer posição de uma ou mais outras proteas, tal como outros anticorpos, por exemplo, uma estrutura de ligação compreendendo alças CDR, um polipeptídeo receptor, mas também ligantes, estrutura, proteínas, enzimas, toxinas e afins. Um derivado do anticorpo pode ser obtido por associação ou ligação a outros substâncias por várias técnicas químicas tais como o acoplamento covalente, a interação eletrostática, a ligação do di-sulfureto, etc. As outras substâncias ligadas ao anticorpo podem ser lipidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas organicas e inorgânicas ou qualquer combinação (por exemplo, PEG, prodrogas ou fármacos). Numa forma de realização especifica, o anticorpo é um derivado compreendendo uma etiqueta adicional permitindo a interacção especifica com um composto biologicamente aceitável. Não existe uma limitação específica em relação à etiqueta utilizável na presente invenção, desde que não tenha ou tenha um impacto negativo tolerável na ligação do anticorpo ao seu alvo. Exemplos de marcadores adequados incluem etiqueta His, etiqueta Myc, etiqueta FLAG, etiqueta Strep, etiqueta Calmodulina, etiqueta GST, etiqueta MBP e etiqueta S. Noutra forma de realização específica, o anticorpo é um derivado que compreende um marcador. 0 termo "marcador", tal como aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado directa ou indirectamente ao anticorpo para gerar um anticorpo "marcado". 0 marcador pode ser detectável por si próprio, por exemplo, marcadores radioisoticos ou marcadores fluorescentes, ou, no caso de um marcador enzimico, podem catalisar a alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável.

Os derivados preferidos, como aqui descritos, são funcionalmente activos em relação à ligação ao antigénio, de preferência que têm uma potência para combater a E. coli MDR e a sua endotoxina, por exemplo, como determinado num ensaio SBA, OPK ou LAL, ou para proteger contra o desafio bacteriano ou para neutralizar a endotoxemia letal.

Anticorpos derivados de um anticorpo parental ou sequência de anticorpo são aqui entendidos particularmente como mutantes ou variantes obtidas por, exemplo, engenharia in silico ou recombinante ou então por derivatização ou síntese química.

Especificamente, um anticorpo derivado de um anticorpo do invento pode compreender pelo menos uma ou mais regiões CDR ou variantes CDR das mesmas sendo funcionalmente activas na ligação diferenciada ao antigénio 025b, por exemplo, especificamente ou seletivamente ligando o antígeno 025b. Entende-se que o termo "anticorpo" também se refere a variantes de um anticorpo. 0 termo "variante" refere-se particularmente a anticorpos, tais como anticorpos mutantes ou fragmentos de anticorpos, por exemplo, obtido por métodos de mutagénese, para eliminar, trocar, introduzir inseriveis numa sequência ou região de aminoácidos de anticorpo especifico ou derivar quimicamente uma sequência de aminoácidos, por exemplo, nos domínios constantes para manipular a estabilidade do anticorpo, função efectora ou semi-vida, ou nos domínios variáveis para melhorar as propriedades de ligação ao antigénio, por exemplo, por técnicas de maturação por afinidade. Qualquer um dos métodos de mutagénese conhecidos pode ser utilizado, incluindo mutações pontuais nas posições desejadas, por exemplo, obtido por técnicas de aleatorização. Em alguns casos, as posições são escolhidas aleatoriamente, por exemplo, com qualquer um dos possíveis aminoácidos ou uma selecção de aminoácidos preferidos para aleatorizar as sequências de anticorpo. 0 termo "mutagénese" refere-se a qualquer técnica reconhecida na arte para alterar uma sequência polinucleotídica ou polipeptídica. Tipos preferidos de mutagénese incluem mutagénese por PCR propensa a erros, mutagénese por saturação ou outra mutagénese dirigida ao local. 0 termo "variante" deve incluir especificamente variantes funcionalmente ativas. 0 termo "variante funcionalmente activa" de um anticorpo tal como aqui utilizado, significa uma sequência resultante da modificação desta sequência (um anticorpo parente ou uma sequência parental), por exemplo, por inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos, como por técnicas de recombinação ou derivatização química de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos, ou nucleotídeos dentro da sequência de nucleotídeos, ou numa ou ambas as extremidades distais da sequência, e qual modificação não afeta (em particular prejudica) a atividade desta sequência. No caso de um sítio de ligação com especificidade para um antigénio alvo seleccionado, a variante funcionalmente activa de um anticorpo ainda teria a especificidade de ligação predeterminada, embora isto possa ser alterado, por exemplo, para alterar a especificidade fina para um epopo especifico, a afinidade, a avidez, a taxa Kon ou Koff, etc. Especif icamente, as variantes funcionalmente activas de um anticorpo aqui descrito tem a potência para se ligar ao antigénio 025b e a especificidade ou selectividade para ligar-se preferencialmente ao antigeno 025b em relação a outros antigenos de E. coli, por ligao a 025b e n ligao ao antigio 025a de E. coli ou ligação significativa do antigénio 025a ou ligação especificamente cruzada de ambos os antigénios 025b e 025a, mas não se ligando a outros antigénios de E. coli.

Variantes funcionalmente activas podem ser obtidas, por exemplo, alterando a sequência de um anticorpo parental, por exemplo, um anticorpo compreendendo o mesmo local de ligação que o anticorpo designado 6D1-1 B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 ou 8D10-C8, mas com modificações dentro de uma região de anticorpo além do sitio de ligação, ou derivado de um anticorpo parental, que é qualquer um dos anticorpos 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 ou 8D10-C8, por uma modificação dentro do local de ligação mas que não prejudica a ligação ao antigénio e, de um modo preferido, teria uma actividade biológica semelhante ao anticorpo parental, incluindo a capacidade de se ligar especificamente ou seletivamente ao antigeno 025b, por ligação a 025b e não se liga ao antigeno 025a de E. coli, ou não se ligando significativamente ao antigeno 025a, ou ligando-se especificamente a ambos os antigenos 025b e 025a, mas não se ligando a outros antigenos de E. coli. Opcionalmente, as variantes funcionalmente activas podem ainda incluir uma potência de morte mediada pelo complemento num ensaio de SBA, e/ou opcionalmente incluir ainda uma potência de uma fagocitose mediada por anticorpo num ensaio de OPK e/ou opcionalmente incluir ainda a função de neutralização de endotoxina num LAL ensaio, por exemplo com substancialmente a mesma actividade biológica, como determinado pelo ensaio de ligação especifica ou teste funcional para visar MDR E. coli.

Por exemplo, as variantes funcionalmente activas dos anticorpos 6D1-1B2 e 8A1-1G8 têm substancialmente as mesmas e semelhantes afinidades de ligação que o anticorpo 8D5-1G10 (ver tabela abaixo).

0 termo "substancialmente a mesma actividade biológica" como aqui utilizado refere-se à actividade indicada substancialmente pela mesma actividade sendo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 100% ou pelo menos 110%, ou pelo menos 120%, ou pelo menos 130%, ou pelo menos 140%, ou pelo menos 150%, ou pelo menos 160%, ou pelo menos 170%, ou pelo menos 180%, ou pelo menos 190%, por exemplo até 200% da atividade, conforme determinado para o parente do anticorpo.

As variantes ou derivados preferidos, como aqui descritos, são funcionalmente activos em relação com a ligação ao antigénio, de preferência com uma potência para se ligar especificamente ao antigénio 025b e não se ligam a outros antigéios de E. coli, por exemplo, ligação a 025b e nenhuma ligação ao antigénio 025a de E. coli, ou ligação significativa do antigénio 025a, ou especificamente reticulação dos antigénios 025b e 025, por exemplo, de preferência ligando o antigénio 025b a 025a, ou ligando 025b com maior afinidade em comparação com os soros de tipagem policlonais actuais criados contra as estirpes 025 (025a). As variantes preferidas não ligam outros antigénios de E. coli com uma diferença de valor de Kd de pelo menos 2 cálculos, de preferência pelo menos 3 cálculos, e opcionalmente incluindo ainda um poder de morte mediado pelo complemento num ensaio SBA, por exemplo, para conseguir redução significativa nas contagens bacterianas em relação a amostras de controlo contendo o anticorpo, e/ou opcionalmente incluindo ainda uma potência de fagocitose mediada por anticorpo num ensaio de OPK, tal como conseguindo redução significativa em contagens bacterianas em relação a amostras de anticorpo de controlo contendo o anticorpo e/ou opcionalmente incluindo ainda a função de neutralização de endotoxina num ensaio de sinalização LAL ou TLR4, tal como para conseguir uma redução significativa em LPS livre para amostras de controlo não contendo o anticorpo, por exemplo com substancialmente a mesma actividade biológica, conforme determinado pelo ensaio de ligação especifica ou ensaio funcional para atingir MDR de E. coli. Redução significativa de analitos nos vários ensaios tipicamente significa a redução de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% para uma redução completa de cerca de 100%-1%).

Numa forma de realização preferida, a variante funcionalmente activa de um anticorpo parental a) é um fragmento biologicamente activo do anticorpo, compreendendo o fragmento pelo menos 50% da sequência da molécula, preferivelmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95 % e mais preferivelmente pelo menos 97%, 98% ou 99%; b) é derivado do anticorpo por pelo menos uma substituição, adição e/ou deleção de aminoácidos, em que a variante funcionalmente ativa possui uma identidade de sequência com a molécula ou parte dela, como um anticorpo de pelo menos 50% preferencialmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, e mais preferencialmente pelo menos 97%, 98% ou 99%; e/ou c) consiste no anticorpo ou numa sua variante funcionalmente activa e, além disso, pelo menos um aminoácido ou nucleótido heterólogo ao polipéptido ou sequência nucleotidica.

Numa forma de realização preferida da invenção, a variante funcionalmente activa do anticorpo de acordo com a invenção é essencialmente idêntica à variante descrita acima, mas difere do seu polipeptídeo ou da sequência de nucleotideos, respectivamente, por derivar de uma sequência homóloga de uma espécie diferente. Estes são referidos como naturalmente ocorrendo variantes ou análogos. O termo "variante funcionalmente ativa" também inclui variantes alélicas naturais, assim como mutantes ou quaisquer outras variantes de ocorrência não natural. Como é conhecido na arte, uma variante alélica é uma forma alternativa de um (poli) péptido que é caracterizado como tendo uma substituição, deleção ou adição de um ou mais aminoácidos que essencialmente não alteram a função biológica do polipéptido.

Variantes funcionalmente ativas podem ser obtidas por alterações de sequência no polipeptideo ou no nucleotideo sequência, por exemplo, por uma ou mais mutações pontuais, em que as alterações de sequência mantêm uma função do inalterado polipéptido ou a sequência nucleotidica, quando utilizado em combinação da invenção. Tais alterações de sequência podem incluir, mas não se limitam a, substituições (conservativas), adições, eliminações, mutações e inserções.

Variantes funcionalmente ativas especificas são variantes de CDR. Uma variante CDR inclui uma sequência de aminoácidos modificada por pelo menos um aminoácido na região CDR, em que a referida modificação pode ser uma alteração química ou parcial da sequência de aminoácidos, cuja modificação permite que a variante retenha as caracteristicas biológicas da sequência. Uma alteração parcial da sequência de aminoácidos da CDR pode ser por eliminação ou substituição de uma a várias aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoidos, ou por adição ou inserção de um a vários aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoidos, ou por uma derivação quimica de um a vários aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos ou combinação destes. As substituições nos resíduos de aminoácidos podem ser substituições conservativas, por exemplo, substituindo um aminoácido drofóbico para um aminoácido hidrofóbico alternativo.

Substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados em seu lado cadeias e propriedades químicas. Exemplos de tais famílias são aminoácidos com cadeias laterais básicas, com lados ácidos de cadeias laterais alifáticas não polares, com cadeias laterais aromáticas não polares, com cadeias laterais polares não carregadas, com pequenas correntes laterais, com grandes correntes laterais, etc.

Uma mutação pontual é particularmente entendida como a engenharia de um polinucleotídeo que resulta na expressão de uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos não manipulada na substituição ou troca, deleção ou inserção de um ou mais simples (não consecutivos) ou dupletos de aminoácidos para diferentes aminoácidos.

Mutações pontuais preferidas referem-se à troca de aminoácidos da mesma polaridade e/ou carga. No que diz respeito, aos aminoácidos, estes referem-se a vinte aminoácidos naturais codificados por sessenta e quatro codões tripletos. Estes 20 aminoácidos podem ser divididos nos que têm cargas neutras, cargas positivas e cargas negativas: O "neutro" aminoácidos são mostrados abaixo junto com os seus respectivos códigos de três letras de polaridade: Alanina: (Ala, A) não polar, neutra;

Asparagina: (Asn, N) polar, neutro;

Cisteína: (Cys, C) não polar, neutra;

Glutamina: (Gin, Q) polar, neutro;

Glicina: (Gly, G) não polar, neutra;

Isoleucina: (mentira, eu) não polar, neutra;

Leucina: (Leu, L) não polar, neutra;

Metionina: (Met, M) não polar, neutra;

Fenilalanina: (Phe, F) não polar, neutra;

Prolina: (Pro, P) não polar, neutra;

Serina: (Ser, S) polar, neutro;

Treonina: (Thr, T) polar, neutro;

Triptofano: (Trp, W) não polar, neutro;

Tirosina: (Tyr, Y) polar, neutro;

Valina: (Vai, V) não polar, neutra; e

Histidina: (His, H) polar, positiva (10%) neutra (90%). O "positivamente"aminoácidos carregados são:

Arginina: (Arg, R) polar, positiva; e Lisina: (Lys, K) polar, positiva. O "negativamente" aminoácidos carregados são: Ácido aspártico: (Asp, D) polar, negativo; e Ácido glutâmico: (Glu, E) polar, negativo. "Percentagem (%) da identidade da sequência de aminoácidos" em relação às sequências de anticorpos e homólogos descritos aqui definido como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos ao aminoácidos resíduos ácidos na sequência polipeptídica específica, após o alinhamento da sequência e introdução de intervalos, se necessário, atingir a percentagem máxima de identidade de sequência, e não considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. Esses skna arte podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de toda a extensão das sequências comparadas.

Uma variante de anticorpo é especificamente entendida para incluir homólogos, análogos, fragmentos, modificações ou variantes com um padrão de glicosilação específico, por exemplo, produzidos por glicoengenharia, que são funcionais e podem servir como equivalentes funcionais, por exemplo, alvos específicos e propriedades funcionais.

Um anticorpo da presente invenção pode ou não exibir a função efectora Fc. De um modo preferido, o anticorpo exibe a função efectora de Fc e é funcionalmente activo num ensaio SBA e/ou OPK. Os anticorpos específicos podem ser desprovidos de uma fração Fc activa, portanto, compostos por domínios de anticorpos que não contém uma parte Fc de um anticorpo ou que não contém um sítio de ligação ao receptor Fcgamma ou compreendem domínios de anticorpo sem função efectora Fc, por exemplo, por modificações para reduzir funções efetoras Fc. Os anticorpos alternativos podem ser manipulados para incorporar modificações para melhorar as funções Fc efectoras para melhorar a actividade de OPK e/ou SBA.

Tais modificações podem ser efectuadas por mutagese, por exemplo, mutações no sítio de ligação do receptor Fcgamma ou derivados ou agentes para interferir com a atividade ADCC e/ou CDC de um formato de anticorpo, de modo a obter redução ou aumento na função efetora de Fc.

Uma redução significativa da função efectora Fc tipicamente, entendida como referindo-se função efectora Fc inferior a 10% de formato não modificado (tipo selvagem), de preferência inferior a 5%, como medido pela actividade de ADCC e/ou CDC. Um aumento significativo na função efectora Fc é tipicamente entendido como referindo um aumento na função efetora Fc de pelo menos 10% do formato não modificado (tipo selvagem), preferencialmente pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50%, como medido pela atividade do ADCC e/ou do CDC. 0 termo "variantes glicosiladas" em relação às sequências de anticorpo deve referir-se a variantes de glicosilação possuindo propriedades imunogénicas modificadas, ADCC e/ou CDC como resultado da glicoengenharia. Todos os anticorpos contêm estruturas de carboidratos em posições conservadas nas regiões constantes da cadeia pesada, com cada isotipo tendo uma matriz distinta de estruturas de carboidratos ligados em N, que afetam de forma variável a montagem de proteinas, secreção ou atividade funcional.

Anticorpos do tipo IgGl são glicoproteinas possuindo um local de glicosilação ligado a N conservado em Asn297 em cada dominio CH2. Os dois oligossacarideos bi-antenários complexos ligados a Asn297 são enterrados entre os domínios CH2, formando contatos extensos com o esqueleto polipeptídico, e a sua presença é essencial para o anticorpo mediar funções efetoras, tais como morte bacteriana mediada por complemento dependente de anticorpos ou células fagocíticas. Remoção de N-Glicano em N297, por exemplo, por mutação N297, por exemplo, para A, ou T299 resulta tipicamente num formato de anticorpo glicosilado com função efectora reduzida.

Diferenças significativas na glicosilação do anticorpo ocorrem entre linhas celulares, e mesmo pequenas diferenças são observadas para uma dada linha celular cultivada sob diferentes condições de cultura. A expressão em células bacterianas tipicamente proporciona um anticorpo glicosilado. Células CHO com expressão regulada por tetraciclina de β (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII), uma formação catalisadora de glicosiltransferase de GlcNAc bissectante foi relatada como tendo atividade funcional aprimorada (ADCC) (Umana et al., 1999, Nature

Biotech, 17: 176-180). Além da escolha das células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, formulação de meios, densidade de cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e semelhantes. O termo "local de ligação ao antigénio" ou "local de ligação" refere-se à parte de um anticorpo que participa na ligação ao antigénio. O local de ligação ao antigénio formado por residuos de aminoácidos das regiões variáveis do terminal N ("V") das cadeias pesadas ("H") e/ou leves ("L") ou dos seus dominios variáveis. Três porções altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesada e leve, referidas como "regiões hipervariáveis", estão interpostas entre as passagens flanqueadoras mais conservadas conhecidas como regiões estruturais. O local de ligação ao antigénio proporciona uma superficie que complementar da superfie tridimensional de um epopo ou antigénio ligado e as regiões hipervariáveis são referidas como "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". O local de ligação incorporado na CDR é também aqui referido como o "local de ligação da CDR". O termo "antigeno" como usado alternativamente aqui como "alvo" ou "antigeno alvo" refere-se a uma molécula alvo inteira ou um fragmento dessa molécula reconhecido por um sitio de ligação de anticorpo. Especificamente, subestruturas de um por antigénio, por exemplo, uma estrutura polipeptidica ou hidrato de carbono, geralmente designado por "epitopes"; por exemplo, B-células ou epitope das células T, que são imunologicamente relevantes, podem ser reconhecidas por tal local de ligação. Antigenos específicos, como os antigenos 025b ou 025a que são fornecidos como antígenos isolados, ou na forma de células de E. coli ou frações celulares. 0 termo "epitope" como aqui utilizado refere-se em particular a uma estrutura molecular que pode constituir completamente um parceiro de ligação especifica ou ser parte de um parceiro de ligação especifico a um local de ligação de um anticorpo. Um epitopo pode estar ocorrendo na natureza ou artificialmente e é composto por um hidrato de carbono, uma estrutura de peptidos, um iodo gordo, uma substância orgânica, bioquímica ou inorgânica ou seus derivados e quaisquer combinantes destes. Se um epitopo estiver compreendido numa estrutura peptídica, tal como um péptido, um polipéptido ou uma proteína, incluirá normalmente pelo menos 3 aminoácidos, de preferência 5 a 40 aminoácidos, e mais preferivelmente entre cerca de 10-20 aminoácidos. Os epítopos podem ser epítopos lineares ou conformacionais. Um epitopo linear é constituído por um único segmento de uma sequência primária de um polipéptido ou cadeia de hidratos de carbono. Os epítopos lineares podem ser contíguos ou sobrepostos. Os epítopos conformacionais são constituídos por aminoácidos ou hidratos de carbono reunidos por dobragem do polipéptido para formar uma estrutura terciária e os aminoácidos não são necessariamente adjacentes uns aos outros na sequência linear. Especificamente e no que se refere a antigenes polipepticos, um epitopo conformacional ou descontinuo caracterizado pela presente de dois ou mais resíduos discretos de aminoácidos, separados na sequência primária, mas reunidos numa estrutura consistente na superfície da molécula quando o polipéptido se dobra para o interior da molécula proteína/antígeno nativo.

Aqui, o termo "epítopo" refere-se particularmente ao epitopo iónico reconhecido por um anticorpo, ou a mistura de epitopos compreendendo variantes de epitopo, cada um reconhecido por um anticorpo que reconhece especificamente o alvo, por exemplo, o epitopo especificamente reconhecido por um anticorpo seleccionado do grupo consistindo de anticorpos designados como 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 e 8D10-C8. Especificamente, o epitopo alvo de um anticorpo seleccionado do grupo que consiste de 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 e 8D10-C8 é um epitopo de hidrato de carbono. 0 termo "expressão" é entendido da seguinte maneira. Moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência codificante desejada de um produto de expressão tal como, por exemplo, um anticorpo como aqui descrito e sequências de controlo, tais como, por exemplo, um promotor em ligação operável, pode ser utilizado para fins de expressão. Hospedeiros transformados ou transfectados com estas sequências são capazes de produzir as proteínas codificadas. De modo a efectuar a transformação, o sistema de expressão pode ser incluído num vector; no entanto, o DNA relevante também pode ser integrado ao cromossomo hospedeiro. Especificamente, o termo refere-se a uma célula hospedeira e a um vector compatível sob condições adequadas, por exemplo, para a expressão de uma proteína codificada por ADN estranho transportado pelo vector e introduzido na célula hospedeira. 0 ADN codificador é uma sequência de ADN que codifica uma sequência particular de aminoácidos para um polipéptido ou proteína particular, tal como, por exemplo, um anticorpo. 0 DNA promotor é uma sequência de DNA que inicia, regula ou de outro modo medeia ou controla a expressão do DNA codificador. 0 DNA promotor e o DNA codificador podem ser do mesmo gene ou de genes diferentes e podem ser do mesmo ou de diferentes organismos. Os vectores de clonagem recombinantes incluirão frequentemente um ou mais sistemas de replicação para clonagem ou expressão, um ou mais marcadores para selecção no hospedeiro, por exemplo, resistência a antibióticos e uma ou mais cassetes de expressão. "Vectores" aqui utilizados são definidos como sequências de ADN que são necessárias para a transcrição de sequências nucleotidicas recombinantes clonadas, por exemplo, de genes recombinantes e a tradução do seu ARNm num organismo hospedeiro adequado.

Uma "cassete de expressão" refere-se a uma sequência de codificação de ADN ou segmento de ADN que codifica para um produto de expressão que pode ser inserido num vector em locais de restrição definidos. Os locais de restrição da cassete foram concebidos para garantir a inserção da cassete na estrutura de leitura adequada. Geralmente, o DNA estranho é inserido num ou mais locais de restrição do DNA do vetor e, em seguida, é transportado pelo vetor para uma célula hospedeira juntamente com o DNA do vetor transmissivel. Um segmento ou sequência de ADN tendo ADN inserido ou adicionado, tal como um vector de expressão, também pode ser designado por "construção de ADN".

Os vectores de expressão compreendem a cassete de expressão e compreendem adicionalmente uma origem para replicação autónoma nas células hospedeiras ou num local de integração do genoma, um ou mais marcadores seleccionáveis (por exemplo, um gene de sintese de aminoácidos ou um gene que confere resistência a antibióticos tais como zeocina, canamicina, G418 ou higromicina), um número de locais de clivagem por enzimas de restrição, uma sequência promotora adequada e um terminador de transcrição, componentes esses que estão operativamente ligados em conjunto. 0 termo "vector", tal como aqui utilizado, inclui sequências nucleotidicas de replicação autónoma, assim como sequências nucleotidicas integrantes do genoma. Um tipo comum de vetor é um "plasmideo", que geralmente é uma molécula independente de DNA de fita dupla que pode aceitar prontamente DNA adicional (estranho) e que pode ser facilmente introduzido numa célula hospedeira adequada. Um vector plasmidico contém frequentemente ADN codificador e ADN promotor e possui um ou mais locais de restrição adequados para a inserção de ADN estranho. Especificamente, o termo "vector" ou "plasmideo" refere-se a um veiculo pelo qual uma sequência de DNA ou RNA (por exemplo, um gene estranho) pode ser introduzida numa célula hospedeira, de modo a transformar o hospedeiro e promover a expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida. 0 termo "célula hospedeira", como aqui utilizado, referir-se-á a células primárias sujeitas transformadas para produzir uma proteína recombinante particular, tal como um anticorpo como aqui descrito, e qualquer sua descendência. Deve ser entendido que nem toda a descendência é exactamente idêntica à célula parental (devido a mutações deliberadas ou inadvertidas ou diferenças no ambiente), no entanto, essa descendência alterada está incluída nestes termos, desde que a progénie mantenha a mesma funcionalidade que aquela da célula originalmente transformada. 0 termo "linha celular hospedeira" refere-se a uma linha celular de células hospedeiras como utilizada para expressar um gene recombinante para produzir polipéptidos recombinantes, tais como anticorpos recombinantes. 0 termo "linha celular", tal como é aqui utilizado, refere-se a um clone estabelecido de um tipo de célula particular que adquiriu a capacidade de proliferar durante um periodo de tempo prolonqado. Tal célula hospedeira ou linha celular hospedeira pode ser mantida em cultura celular e/ou cultivada para produzir um polipéptido recombinante.

Uma "resposta imunitária" a uma composição, por exemplo, uma composição imunoqénica, aqui também denominada "imunogénica" compreendendo um antigénio ou epitopo, ou uma vacina como aqui descrita, o desenvolvimento no hospedeiro ou sujeito de uma resposta imunitária celular e/ou mediada por anticorpo composição ou vacina de interesse. Normalmente, uma tal resposta consiste no indivíduo que produz anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas dirigidas especificamente a um antigénio ou antigénios incluídos na composição ou vacina de interesse.

Uma "resposta imunitária protectora" é entendida como resposta imunitária terapêutica e refere-se a uma resposta imunitária a um antigénio derivado de um patogénio, que de alguma forma previne, melhora, trata ou pelo menos parcialmente detém sintomas da doença, efeitos secundários ou progressão. Especificamente, desencadeia-se a resposta imunitária protectora que proporciona um resultado significativamente melhor de uma infecção induzida ou natural ou desafio com toxina, em comparação com a da população não imune.

Um imunogénico ou composição imunogénica normalmente compreende o antigénio ou epitopo e um transportador, o qual pode especificamente incluir um adjuvante. 0 termo "adjuvante" refere-se a um composto que quando administrado em conjunção com um antígeno aumenta e/ou redireciona a resposta imune ao antígeno, mas quando administrado isoladamente não gera uma resposta imune ao antigeno. Os adjuvantes podem aumentar uma resposta imunitária por vários mecanismos, incluindo recrutamento de linfócitos, estimulação de células B e/ou T e estimulação de macrófagos. Veiculos exemplificativos são lipossomas ou péptidos catiónicos; adjuvantes exemplificativos são fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio, MF59 ou oligonucleótidos CpG. 0 termo "isolado" ou "isolamento" como aqui utilizado em relação a um ácido nucleico, um anticorpo ou outro composto deve referir-se a esse composto que foi suficientemente separado do ambiente com o qual estaria naturalmente associado, de modo a existir em forma "substancialmente pura". "Isolado" não significa necessariamente a exclusão de misturas artificiais ou sintéticas com outros compostos ou materiais, ou a presença de impurezas que não interfiram com a atividade fundamental, e que podem estar presentes, por exemplo, devido a purificação incompleta. Em particular, as molulas de ácido nucleico isoladas da presente invenção também pretendem incluir aquelas quimicamente sintetizadas.

Com referência aos ácidos nucleicos da invenção, o termo "ácido nucleico isolado" é por vezes utilizado. Este termo, quando aplicado ao DNA, refere-se a uma molécula de DNA que é separada das sequências com as quais é imediatamente contígua no genoma natural do organismo em que se originou. Por exemplo, um "ácido nucleico isolado" pode compreender uma molula de ADN inserida num vector, tal como um vector plásmico ou virai, ou integrada no ADN genómico de uma célula procariótica ou eucariótica ou organismo hospedeiro. Quando aplicado ao ARN, o termo "ácido nucleico isolado" refere-se principalmente a uma molécula de ARN codificada por uma molécula de ADN isolada como acima definida. Alternativamente, o termo pode referir-se a uma molécula de RNA que tenha sido suficientemente separada de outros ácidos nucléicos com os quais estaria associada ao seu estado natural (isto é, em células ou tecidos). Um "ácido nucleico isolado" (DNA ou RNA) também pode representar uma molécula produzida diretamente por meios biológicos ou sintéticos e separada de outros componentes presentes durante a sua produção.

Com referência a polipéptidos ou proteínas, tais como anticorpos ou epitopos da invenção, o termo "isolado" deve referir-se especificamente a compostos que são livres ou substancialmente isentos de material com o qual estão naturalmente associados, tais como outros compostos com os quais estão no seu ambiente natural, ou o ambiente no qual são preparados (por exemplo, cultura de células), quando a preparação é por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os compostos isolados podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e, adicionalmente, para fins práticos, podem ser isolados - por exemplo, os polipéptidos ou polinucleóditos podem ser misturados com veiculos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis quando utilizados no diagnóstico ou terapia. Em particular, o anticorpo isolado da invenção difere das preparações do soro policlonal criadas contra as estirpes 025 (a), porque é proporcionado na forma isolada e purificada, preferivelmente proporcionado numa preparação compreendendo o anticorpo isolado como a única substância activa. Isto, no entanto, não impede que o anticorpo isolado seja proporcionado num produto de combinação compreendendo um número limitado de outros anticorpos (isolados) bem definidos. Anticorpos isolados podem também ser proporcionados num transportador sólido, semi-liquido ou liquido, tais como contas. 0 termo "neutralizando" ou "neutralização" Aqui utilizado no sentido mais amplo refere-se a qualquer molécula que inibe um patógeno, como MDR de E. coli de infectar um indivíduo, ou inibe o patógeno de promover infecções produzindo toxinas proteicas potentes ou inibir as toxinas de danificar uma célula-alvo num sujeito, independentemente do mecanismo pelo qual a neutralização é alcançada. A neutralização pode ser conseguida, por exemplo, por um anticorpo que inibe a ligação e/ou a interacção da endotoxina MDR de E. coli com o seu receptor cognato nas células alvo (por exemplo, ligação ao receptor de TLR4). A neutralização pode ainda ocorrer por remoção de moléculas de endotoxina da circulação por funções mediadas por Fc. 0 poder de neutralização é tipicamente determinado num ensaio padrão, por exemplo, teste de LAL, em que a inibição da actividade biológica da endotoxina é medida, por exemplo, por colorimetria. 0 termo "MDR E. coli" é entendido como se segue: Infecções com E. coli multirresistente a drogas estão numa porção significativa devido à linhagem clonal ST131-025b: H4, que emergiu apenas na última década e se tornou dominante o clone resistente E. coli multi-resistente é particularmente entendido como as estirpes que demonstram a resistência a três ou mais classes de antibióticos, por exemplo os seguintes agentes/grupos: penincilinas, cefalosporinas, carbapenemos, aminoglicosidos, tetraciclinas, fenoquinolonas, nitrofurantoína, trimetoprima (e suas combinações), fosfomicina, polimixinas, cloranfenicol, aztreonam, tigeciclina 0 polissacarídeo de ácido capsular (CPS) é uma camada espessa de polissacarídeo do tipo mucosa que envolve a maioria dos patógenos E. coli. é, portanto, surpreendente que o epítopo específico reconhecido por um anticorpo da invenção seja especificamente estar acessível tanto na estirpe MDR E. coli encapsulada como não encapsulada.

Anticorpos que combatem ou neutralizam MDR E. coli estão interferindo com patógenos e reações patogênicas, e podem limitar ou prevenir a infecção e/ou melhorar uma condição de doença resultante de tal infecção, ou inibir a patogênese MDR de E. coli, em particular disseminação e replicação em ou dentro de compartimentos/locais hospedeiros estéreis. A este respeito, "anticorpos protectores" são aqui entendidos como anticorpos que são responsáveis pela imunidade a um agente infeccioso observado na imunidade activa ou passiva. Em particular, os anticorpos protectores como aqui descritos são possivelmente utilizados para fins terapêuticos, por exemplo, para profilaxia ou terapia, para prevenir, melhorar, tratar ou pelo menos parcialmente interromper os sintomas da doença, efeitos colaterais ou progressão da doença induzida por um patógeno. Especificamente, anticorpos protetores são capazes de matar ou prevenir a replicação de células de E. coli vivas, por exemplo, induzir actividades bactericidas ou opsonofagocíticas no soro, ou remover células bacterianas inteiras ou as suas moléculas de LPS de locais de corpo estéreis após aplicações terapêuticas (por exemplo, administradas numa infecção estabelecida). Alternativamente, os anticorpos protectores aplicados profilacticamente inibem o estabelecimento de uma infecção (isto é, E. coli espalhada de locais não estéreis para compartimentos estéreis do corpo) através de um dos mecanismos acima mencionados ou outros. 0 termo "antigeno 025b" é aqui entendido como o 0-antigeno LPS com estrutura elucidada no exemplo 2 e na Figura 3 (a). A estrutura é semelhante, mas distinta da do antigeno 025 (a). 025b é entendido aqui como um serotipo, que é semelhante mas distinto do 025a (ver Figura 3 (a)). 0 termo "antigeno 025" é aqui entendido como o antigeno formado pela unidade de repetição do pentassacarideo descrito por Kenne et al. (Kenne L, Lindberg B, J. Madden JK, Lindberg AA, Gemski P. Jr. Estudos estruturais de Escherichia coli 0-antigen 25. Carbohydr Res. 28:122 (2): 249-56, 1983). Antes de identificar o antigio 025b, o termo 025 representa 025a como aqui descrito (ver Figura 3 (b)). 0 termo "antigeno 025a" é aqui entendido como sinónimo de antigeno 025. 0 termo "recombinante", tal como aqui utilizado, significará "estar preparado por ou o resultado de engenharia genética". Um hospedeiro recombinante compreende especificamente um vector de expressão ou vector de clonagem, ou foi geneticamente modificado para conter uma sequência de acido nucleico recombinante, em particular empregando uma sequência nucleotica estranha ao hospedeiro. É produzida uma proteína recombinante expressando um respectivo ácido nucleico recombinante num hospedeiro. 0 termo "anticorpo recombinante" como aqui utilizado inclui anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um ratinho) que é transgénico ou transcromossómico para humanos genes de imunoglobulina ou um hibridoma preparado a partir do mesmo, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, um transfectomo, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos combinatórios recombinantes humanos, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o processamento de outras sequências de DNA de imunoglobulina humana. Tais anticorpos recombinantes compreendem anticorpos manipulados para incluir rearranjos e mutações que ocorrem, por exemplo, durante a maturação do anticorpo.

Como aqui utilizado, o termo "especificidade" ou "ligação especifica" refere-se a uma reacção de ligação que é determinante do ligando cognato de interesse numa população heterogénea de moléculas. Assim, sob condições designadas (por exemplo, condições de imunoensaio), um anticorpo liga-se especif icamente ao seu alvo particular e não se liga numa quantidade significativa a outras moléculas presentes numa amostra. Ligação especifica significa que a ligação seletiva em termos de alta, média ou baixa identidade de ligação, afinidade ou avidez, conforme selecionado. A ligação selectiva é geralmente alcançada se a constante de ligação ou difinida de ligação for pelo menos 10 vezes diferente (entendida como pelo menos 1 log diferença), de preferência a diferença de ácido pelo menos 100 vezes (entendida como pelo menos 2 logs de diferença e mais preferencialmente pelo menos 1000 vezes (entendido como pelo menos 3 logs diferença) . O termo "especificidade" ou "ligação especifica" também entendido como aplicável a ligantes que se ligam a uma ou mais moléculas, por exemplo, agentes de reticulação específicos. 0 anticorpo da invenção especificamente selectivo na ligação apenas do antigénio 025b, ou ligando preferencialmente o antigénio 025b ao antigénio 025a, ou ligando o 025b com maior afinidade em comparação com o soro policlonal criado contra as estirpes 025a, cujo soro liga-se ao antigeno 025b com baixa afinidade. Assim, o anticorpo da invenção pode ser entendido como ligando diferencialmente tais antigénios, por exemplo, pelo menos com igual afinidade, ou mars do que igual afinidade, tal como com uma afinidade diferente com uma diferença de Kd de pelo menos 1 log, de preferência pelo menos 2 logs, mars preferivelmente pelo menos 3 logs. Um tal anticorpo que liga selectivamente o antigénio 025b ao antigénio 025a é de preferência utilizado para fins de diagnóstico ou terapêuticos. Para alguns fins de diagnóstico, é especificamente utilizado um anticorpo que liga o antigénio 025b de uma maneira detectável. A utilização do termo "tendo a mesma especificidade", "possuindo o mesmo local de ligação" ou "ligando o mesmo epitopo" indica que os anticorpos monoclonais equivalentes exibem as mesmas ou essencialmente as mesmas caracterticas de imunorreactividade (ligação) e competem pela ligação a uma sequência de ligação ao alvo pré-seleccionado. A especificidade relativa de uma molécula de anticorpo para um alvo particular pode ser relativamente determinada por ensaios de competição, por exemplo, como descrito em Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988). 0 termo "sujeito" como aqui utilizado refere-se a um mamifero de sangue quente, particularmente um humano. Em particular, a utilização medicinal da invenção ou o modo de tratamento da mesma aplica-se a um individuo com necessidade de profilaxia ou tratamento de um estado patologico associado a uma MDR de E. coli. infecção ou que sofrem de doença, incluindo doença em fase inicial ou tardia. 0 termo "paciente" inclui indivíduos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profilático ou terapêutico. 0 termo "tratamento" destina-se assim a incluir tanto o tratamento profilático como terapêutico.

Um assunto é, por exemplo, tratado para profilaxia ou terapia condições MRD da doença de E. coli. em particular, o sujeito é tratado, o qual está em risco de infecção ou desenvolvimento de tal doença ou recorrência de doença, ou um sujeito que está sofrendo de tal infecção e/ou doença associada com tal infecção.

Especificamente, o termo "profilaxia" refere-se a medidas preventivas que se destinam a cobrir a prevenção do aparecimento de patogénese ou medidas profiláticas para reduzir o risco de patogénese.

Especificamente, o método para o tratamento, prevenção ou retardamento de uma condição de doença num sujeito como aqui descrito está a interferir com a patogénese de MDR E. coli como agente causador da condição. 0 termo "substancialmente puro" ou "purificado" como aqui utilizado refere-se a uma preparação compreendendo pelo menos 50% (p/p), preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de um composto, tal como uma molécula de acido nucleico ou um anticorpo. A pureza medida por métodos adequados para o composto (por exemplo, métodos cromatográficos, electroforese em gel de poliacrilamida, análise por HPLC e semelhantes). 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz", utilizado indistintamente com qualquer um dos termos "quantidade eficaz" ou "quantidade suficiente" de um composto, por exemplo, um anticorpo ou imunogénio aqui descrito é uma quantidade ou actividade suficiente para, quando administrada ao efeito sujeito, resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clinicos, e como tal, uma quantidade eficaz ou sinónima depende do contexto em que está a ser aplicada.

Uma quantidade eficaz significa a quantidade de um composto que é suficiente para tratar, prevenir ou inibir tais doenças ou distúrbios. No contexto da doença, quantidades terapeuticamente eficazes do anticorpo tal como aqui descrito são especificamente utilizadas para tratar, modular, atenuar, reverter ou afectar uma doença ou condição que beneficia de uma inibição da patogénese por MDR de E. coli, por exemplo, adesão e colonização da mucosa superficies, replicação descontrolada em locais estéreis do corpo e toxicidade de células hospedeiras por produtos bacterianos. A quantidade do composto que irá corresponder a uma tal quantidade eficaz irá variar dependendo de vários factores, tais como o fármaco ou composto dado, a formulação farmacêutica, a via de administração, o tipo de doença ou distúrbio, a identidade do sujeito ou hospedeiro a ser tratado, e semelhantes, mas podem no entanto ser rotineiramente determinados por um perito na arte. 0 anticorpo ou imunogénio aqui descrito pode ser utilizado profilaticamente para inibir o inicio da infecção por MDR de E. coli, ou terapeuticamente para tratar infecção por MDR de E. coli, particularmente infecções por MDR de E. coli que são conhecidas por serem refractárias ou no caso do indivíduo, eram refratários ao tratamento com outra antibioticoterapia convencional.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como aqui descrito, como proporcionado a um doente humano com necessidade deste, pode estar especificamente na gama de 0,5-500 mg, preferivelmente 1-400 mg, ainda mais preferido até 300 mg, a 200 mg , até 100 mg ou até 10 mg, embora doses mais elevadas possam ser para o tratamento de doenças agudas.

Além disso, um regime para tratar ou prevenir um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da presente invenção pode consistir numa única administração ou, alternativamente, compreendendo várias aplicações. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado pelo menos uma vez por ano pelo menos uma vez durante meio ano ou pelo menos uma vez por mês.

Contudo, noutra forma de realização, o anticorpo pode ser administrado ao indivíduo cerca de uma vez por semana a administração diária para um dado tratamento. A duração do período de tratamento depende de uma variedade de fatores, como a gravidade da doença, seja aguda ou crónica, a idade do paciente, a concentração e a atividade do formato do anticorpo. Será também apreciado que a dosagem eficaz utilizada para o tratamento ou profilaxia pode ser aumentada ou diminuída ao longo de um tratamento particular ou regime profilático. As alterações de dosagem podem resultar e tornar-se aparentes por ensaios de diagnóstico padrão conhecidos na técnica. Em alguns casos, a administração crónica pode ser necessária.

Uma quantidade eficaz de um imunogénico como aqui descrito, como proporcionado a um doente em risco de desenvolver uma doença associada a infecção por E. coli MDR, pode estar especificamente na gama de 1-15 mg/kg por dose.

Por exemplo, o imunogenio pode ser administrado como uma primeira dose seguida por uma ou mais doses de reforço num intervalo de tempo determinado de acordo com um esquema de imunização de reforço prima para induzir uma resposta imunitária eficaz e duradoura a uma infeção por E. coli MDR. Um esquema de vacinação preferido abrangeria a administração de três doses, por exemplo, uma primeira dose no dia 0, uma segunda dose no dia 5-40 e uma terceira dose no dia 10-100, preferivelmente nos dias 0, 28 e 90. De acordo com um esquema acelerado preferido a administração pode ser nos dias 0, 7 e 14 programas acelerados podem ser indicados para profilaxia, em pacientes submetidos à cirurgia eletiva. Normalmente, o alúmen é utilizado como um adjuvante, por exemplo, como fosfato ou hidróxido.

Portanto, o presente assunto é baseado na descoberta de mAbs murinos altamente específicos para 025b. Esses anticorpos têm grande potencial como reagentes diagnósticos para a identificação de linhagens de MDR pertencentes à linhagem ST131. Além disso, em particular após a humanização, estes mAbs são adequados para serem utilizados na profilaxia (por exemplo, para grupos de alto risco) e tratamento de infecções por E. coli causadas por estirpes ST131-025b: H4.

Pensa-se que os antigénios de hidratos de carbono 025b e 025 (025a) são idênticos ou muito semelhantes com base no facto de o soro imune contra 025 ser utilizado rotineiramente na identificação de diagnóstico de estirpes de E. coli que expressam antigénios 025b. 0 fundo genético da síntese de 0-antígeno nas cepas de ST131 não está completamente elucidado, no entanto, um gene específico dentro do aglomerado de rfb (codificando a síntese de antígeno-0) forma a base da identificação baseada em PCR das cepas 025b. Além disso, nenhum dado estrutural suportou qualquer diferença entre os antígenos 025 (a) e 025b até o momento.

Foi, portanto, surpreendente que um anticorpo da invenção pudesse ligar especificamente o antigénio 025b e especificamente diferenciar entre antigénios 025b e 025a.

De modo a confirmar a diferença genética entre as estirpes de E. coli que expressam o antigénio 025b e 025a, o aglomerado rfb que codifica o stese do O-antigénio foi sequenciado a partir de uma estirpe 81009 comercialmente disponel (Szijarto et al., FEMS Microbiol Lett, 2012, 332: 131-6) utilizando um método de iniciação iniciada com oligonucleótidos específicos para genes flanqueadores conservados: gnd e galF. 0 contíguo resultante da operação de Rfb tem 11.300 pb de comprimento e apenas parcialmente homólogo ao que codifica as enzimas de síntese do antígeno 025 (número de acesso da NCBI GU014554). Descobriu-se que um segmento longo de 2043 pb na extremidade 3' operarão 025b rfb é não homóloga à região correspondente operarão 025 rfb, onde este segmento é substituído por uma sequência longa de 6267 pb que codifica a síntese da fucose e o transporte. A estrutura da unidade repetitiva biológica (RU) PS 0-específica da presente no LPS isolado de E. coli ST131 foi analisada em detalhes numa fração purificada construída pelo núcleo 0S substituindo com uma unidade de repetição (RU). A RU do LPS ST131 é um pentacárido O-acetilado com a estrutura representada na Fig. 3.

De facto, a estrutura RU do ST131 O-PS difere da LPS 025 RU reportada por Kenne et al. (Kenne, Lindberg et al., Carbohydr Res. 1983 28 de Outubro; 122 (2): 249-56) e, até onde sabemos, é um novo O-serotipo entre os lipopolissacáridos de E. coli (Stenutz et al. FEMS Microbiol Rev. 2006 May; 30 (3): 382-403. Adicionalmente, resultados preliminares de espectrometria de massa MALDI-TOF e análises da composição (análises de açúcar e metilação) de um oligossacarideo central isolado do tipo K-12 suportado por LPS ST131, o que foi anteriormente relatado por Szijártó V. et al. com base em análises genéticas (Szijarto et al.f FEMS Microbiol Lett, 2012, 332: 131-6) . Foi demonstrado que o LPS ST131 é constituido por duas glicoformas principais de oligossacáridos centrais (OS) . O tipo de glicoforma depende da presença ou ausência do polissacarideo especifico de O (PS). A glicoforma predominante do núcleo OS não substituídos são uma versão truncada do oligossacarídeos do núcleo K-12, que são desproviveis do dissacarideos 7) -α-Hepp- (1 -► 6) -a-Glcp. A presença desse dissacarídeo é a diferença entre o SO principal substituído por O-PS e nenhum SO principal substituído.

De acordo com um aspecto especifico, proporcionado um anticorpo que se liga selectivamente ao epitopo especifico de 025b, por exemplo, ligação do mesmo epitopo que o anticorpo 8D5-1G10 ou qualquer um dos anticorpos designados como 6D1-1B2 ou 8A1-1G8, ou o anticorpo 8D10-C8, cujo termo inclui variantes que se ligam essencialmente ao mesmo epitopo; ou compreendendo o mesmo sitio de ligação que o anticorpo 8D5-1G10 ou qualquer um dos anticorpos designados como 6D1-1B2 ou 8A1-1G8, ou o anticorpo 8D10-C8, cujo termo inclui variantes compreendendo essencialmente o mesmo local de ligação. Os anticorpos designados como 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 compreenderiam particularmente um local de ligação que diferencia especificamente entre o antigénio 025b e o antigénio 025a, e ligando apenas o antigénio 025b. 0 anticorpo designado como 8D10-C8 compreenderia particularmente um sitio de ligação que se liga especif icamente aos antigénios 025b e 025a, e liga preferencialmente o antigénio 025b em comparação com o antigénio 025a.

Diz-se que os anticorpos "ligam-se ao mesmo epitopo" ou "compreendendo o mesmo local de ligação" ou têm "essencialmente as mesmas caracterticas de ligação, se os anticorpos competirem de forma cruzada de modo a que apenas um anticorpo se possa ligar ao epitopo num dado ponto no tempo, por exemplo, um anticorpo previne o efeito de ligação ou modulação do outro. 0 termo "competir" ou "competição cruzada", como aqui utilizado relativamente a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, liga-se a um epitopo de uma maneira suficientemente semelhante à ligação de um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação antigénio do mesmo, tal que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com o seu epitopo cognato seja detectavelmente diminuto na presente do segundo anticorpo em comparação com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, em que a ligação do segundo anticorpo ao seu epitopo é também detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não precisa ser o caso. Ou seja, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epitopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao seu epitopo respectivo. No entanto, quando cada anticorpo inibe de forma detectável a ligação do outro anticorpo com o seu epitopo cognato, seja para a mesma, maior ou menor extensão, diz-se que os anticorpos "competem de forma cruzada" um com o outro pela ligação dos seus epitopos respectivos). Ambos os anticorpos competidores e de competição cruzada são englobados pela presente invenção.

Concorrência aqui significa uma inibição relativa maior do que cerca de 30%, conforme determinado por análise ELISA de competição, por exemplo, conforme descrito na seção Exemplos. Pode ser desejável estabelecer um limite mais alto de inibição relativa como critério do que é um nivel adequado de competição num contexto particular, por exemplo, onde a análise da competição é usada para selecionar ou selecionar novos anticorpos projetados com a função pretendida da ligação de 025b. Assim, por exemplo, é possivél estabelecer critérios para a ligação competitiva, em que seja detectada pelo menos 40% de inibição relativa, ou pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou mesmo pelo menos 100%, antes de um anticorpo ser considerado suficientemente competitivo.

Especificamente, proporcionado um anticorpo compreendendo a região variável de qualquer um dos anticorpos designados como 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 ou 8D10-C8, em particular, pelo menos, uma das sequências CDR, de preferência pelo menos dois, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos seis das sequências CDR de um anticorpo seleccionado do grupo consistindo em anticorpos 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 e 8D10-C8, ou variantes CDR destes que são funcionalmente activos. Mais especificamente, proporcionam-se quaisquer dos anticorpos designados como 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10 ou 8D10-C8.

Especificamente, o anticorpo designado como anticorpo 8D5-1G10 ou anticorpo 8D10-C8, ou qualquer uma sua variante funcionalmente ativa, pode ser produzido empregando o material depositado ou a respectiva sequência de nucleotideos nele contida, tal como um dos plasmídeos e/ou um dos depositados de células hospedeiras.

De acordo com um aspecto especifico, o anticorpo 8D5-1G10 ou uma sua variante funcionalmente equivalente pode ser derivado de um anticorpo compreendendo uma região variável codificada por qualquer um dos plasmídeos incorporados nas cuias hospedeiras depositadas sob DSM 26763 e/ou DSM 26762; por exemplo, utilizando uma sequência de CDR parcial ou mutada (ponto) do material depositado para manipular o anticorpo especifico ou qualquer uma sua variante funcionalmente activa.

De acordo com um aspecto especifico adicional, o anticorpo 8D5-1G10 ou uma sua variante funcionalmente equivalente pode derivar ou utilizar a região variável de um anticorpo produzido por uma célula hospedeira depositada sob DSM 26763 e/ou DSM 26762; por exemplo, empregando uma sequência parcial, por exemplo, uma ou mais das sequências CDR, do material depositado para manipular o anticorpo específico ou qualquer variante funcionalmente activa.

Especificamente, a variante do anticorpo 6D1-1B2 ou 8A1-1G8 é uma variante CDR do anticorpo 8D5-1G10 que é funcionalmente activo, por exemplo, com alterações parciais em pelo menos uma das sequências CDR.

De acordo com um aspecto especifico, o anticorpo 8D10-C8 ou uma sua variante funcionalmente equivalente pode ser derivado de um anticorpo compreendendo uma região variável codificada por qualquer um dos plasmideos incorporados nas células hospedeiras depositadas sob DSM 28171 e/ou DSM 28172; por exemplo, utilizando uma sequência de CDR parcial ou mutada (ponto) do material depositado para manipular o anticorpo especifico ou qualquer variante funcionalmente activa.

De acordo com um aspecto especifico adicional, o anticorpo 8D10-C8 ou uma sua variante funcionalmente equivalente pode derivar ou utilizar a região variável de um anticorpo produzido por uma célula hospedeira depositada sob DSM 28171 e/ou DSM 28172; por exemplo, empregando uma sequência parcial, por exemplo, uma ou mais das sequências CDR, do material depositado para manipular o anticorpo especifico ou qualquer variante funcionalmente activa.

Em certos aspectos, a invenção proporciona anticorpos variantes, de preferência anticorpos monoclonais, mais preferivelmente anticorpos murinos, humanizados ou humanos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que qualquer cadeia pesada ou região variável VH ou as respectivas CDRs compreende uma sequência de aminoácidos derivada do respectivo plasmideo depositado e/ou da respectiva célula hospedeira depositada.

Em certos aspectos, a invenção proporciona anticorpos variantes, de preferência anticorpos monoclonais, mais preferivelmente anticorpos murinos, humanizados ou humanos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que qualquer uma das cadeias leve ou região variável VL ou as respectivas CDRs compreende uma sequência de aminoácidos derivada do respectivo plasmideo depositado e/ou da respectiva célula hospedeira depositada.

Em certos aspectos, a invenção proporciona anticorpos variantes, de preferência anticorpos monoclonais, mais preferencialmente anticorpos murinos, humanizados ou humanos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que qualquer uma das cadeias pesada e leve, ou as regiões variáveis VH/VL ou as respectivas CDRs compreendem uma sequência de aminoácidos como derivada dos respectivos plasmeos depositados e/ou das respectivas células hospedeiras depositadas.

Em certos aspectos, a invenção também proporciona tais anticorpos variantes, compreendendo as respectivas sequências de ligação, tais como as sequências variáveis e/ou as sequências CDR, como derivadas do material depositado, em que as sequências de ligação, por exemplo, qualquer sequência de CDR, compreende uma sequência que tem pelo menos 60%, pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos derivada a partir do material depositado, e em que a variante é uma variante funcionalmente ativa.

Como aqui descrito, num aspecto, a invenção proporciona moléculas de anticorpo caracterizadas por, por exemplo, a capacidade de competir com o anticorpo monoclonal 8D5-1G10 ou 8D10-C8 pela ligação ao antígeno 025b. Qualquer um dos anticorpos 6D1-1B2, 8A1-1G8, 8D5-1G10, é um anticorpo IgG3 murino e o anticorpo 8D10-C8 é um anticorpo IgG2b murino que transporta cadeias leves kappa, que os inventores isolaram e caracterizaram. Os dominios variáveis do anticorpo 8D5-1G10 ou do anticorpo 8D10-C8 são expressos pelo material depositado como aqui referenciado. Assim, as caracteristicas de ligação como determinadas pela cadeia leve e cadeia pesada, e os domios VL/VH do anticorpo 8D5-1G10 ou o anticorpo 8D10-C8 s totalmente divulgados aqui, permitindo a sua utilização como um anticorpo parental ou a comparação com funcionalmente, variantes activas ou anticorpos concorrentes do invento. 0 dominio variável maduro da cadeia pesada de 8D5-1G10 (8D5-1G10-HC) é, por exemplo, produzido utilizando a célula hospedeira de DSM 26762, ou a respectiva informação de sequência do plasmideo codificador incorporado no mesmo. 0 domínio variável maduro da cadeia leve de 8D5-1G10 (8D5-1G10-LC) é, por exemplo, produzido utilizando a célula hospedeira de DSM 26763, ou a respectiva informação de sequência do plasmideo codificador incorporado no mesmo. 0 domínio variável maduro da cadeia pesada de 8D10-C8 (8D10-C8-HC) é por exemplo, produzido utilizando a célula hospedeira de DSM 28172, ou a respectiva informação de sequência de plasmideo codificante incorporada na mesma. 0 domínio variável maduro da cadeia leve 8D10-C8 (8D10-C8-LC) é por exemplo, produzido utilizando a célula hospedeira de DSM 28171, ou a respectiva informação de sequência de plasmideo codificante incorporada na mesma. A afinidade de ligação diferencial para ligar preferencialmente o antigénio 025b em relação a outros antigénios de E. coli, por exemplo, quaisquer antigénios de hidratos de carbono diferentes do antigénio 025 ou de quaisquer antigénios do núcleo são preferencialmente pelo menos 10 vezes superiores, isto é, com uma diferença de Kd de pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 100 vezes superior, mais preferencialmente pelo menos 1000 vezes superior. A afinidade de ligação diferencial para se ligar preferencialmente ao antigénio 025b é especificamente pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 6 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes mais, quando comparado com o soro de tipagem comercial, tal como o anti-soro E. coli 025 de elevado rendimento de Statens Serum Institut (#81369). A afinidade de ligação diferencial para se ligar preferencialmente ao antigénio 025b em relação ao antigénio 025a é especificamente pelo menos igual ou maior que o mesmo, pelo menos 1,5 vezes, ou pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 6 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 8 ou pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes maior.

Os anticorpos preferidos da invenção são para ligar a qualquer um dos referidos antigénios individuais, em particular o antigénio 025b, com uma elevada afinidade, em particular a uma taxa elevada e/ou baixa, ou uma elevada avidez de ligação. A afinidade de ligação de um anticorpo é geralmente caracterizada em termos da concentração do anticorpo, em que metade dos locais de ligação ao antigénio estão ocupados, conhecida como a constante de dissociação (Kd ou KD). Tipicamente, um ligante é considerado um ligante de alta afinidade com um Kd<10_7M, em alguns casos, por exemplo, para fins terapêuticos com afinidades superiores, por exemplo, com um Kd<10”8M, preferivelmente um Kd<10”9M, ainda mais preferido é um Kd<10_1°M.

No entanto, numa forma de realização particularmente preferida, as afinidades individuais de ligação ao antigénio têm afinidade média, por exemplo, com um Kd inferior a 10“6 e até 10”7M, por exemplo, quando se liga a pelo menos dois antigénios.

Ligantes de média afinidade podem ser proporcionados de acordo com a invenção, preferivelmente em conjunto com um processo de maturação de afinidade, se necessário. A maturação por afinidade é o processo pelo qual os anticorpos com afinidade aumentada para um antigeno alvo são produzidos. Com alterações estruturais de um anticorpo, incluindo mutagênese de aminoácidos ou como consequência de mutação somática em segmentos de genes de imunoglobulina, variantes de um sitio de ligação a um antigeno e selecionados para maiores afinidades. Anticorpos maturados por afinidade podem exibir uma maior afinidade logarítmica do que um anticorpo parental. Anticorpos monoparentais podem estar sujeitos a maturação por afinidade. Alternativamente, os conjuntos de anticorpos com afinidade de ligação tipo alvejante podem ser considerados como estruturas parentais que são variadas para produzir conjuntos de afinidade de tais anticorpos amadurecidos por afinidade única ou maturados. A variante amadurecida por afinidade preferida de um anticorpo de acordo com o invento exibe pelo menos um aumento de 10 vezes na afinidade de ligação, de preferência pelo menos um aumento de 100 vezes. A maturação por afinidade pode ser empregue durante as campanhas de seleção, usando as respectivas bibliotecas das moléculas originais, seja com anticorpos de afinidade de ligação para obter o anticorpo da invenção possuindo a propriedade de ligação ao alvo especifico de uma afinidade de ligação Kd<10“7M. Alternativamente, a afinidade pode ser ainda aumentada por maturação por afinidade do anticorpo de acordo com a invenção para obter valores elevados correspondendo a um Kd inferior a 10‘8M ou inferior a 10~9M, de preferência inferior a 1CT10M ou ainda inferior a 10_11M, mais preferido na gama molar de pico.

Um aspecto especifico refere-se a um anticorpo da invenção caracterizado por actividade funcional antibacteriana especifica, tal como morte bacteriana mediada por complemento e morte opsonofagocica. Células efetoras fagociticas podem ser ativadas através de outra via empregando ativação do complemento. Anticorpos que se ligam a antigenos de superfície em microrganismos que atraem o primeiro componente da cascata do complemento com a sua região Fc e iniciam a ativação do sistema complemento "clássico". Isso resulta na estimulação de células efetoras fagociticas, que acabam matando as bactérias alvo por mecanismos de complemento e dependentes de anticorpos (CDC).

De acordo com uma forma de realização especifica, o anticorpo da invenção tem uma actividade citotóxica na presença de células imuno-efectoras, medida num ensaio convencional de SBA ou OPK. Uma actividade citotoxica como determinada por qualquer um dos ensaios de SBA ou OPK pode ser mostrada para um anticorpo da invenção, se houver um aumento significativo na percentagem de morte bacteriana em comparação com um controlo. A actividade bactericida relacionada com SBA ou OPK é preferencialmente medida como aumento percentual absoluto, que é de preferência superior a 5%, mais preferencialmente superior a 10%, ainda mais preferencialmente superior a 20%, 30%, 40% ou 50%.

Anticorpos da presente invenção podem ser identificados ou obtidos empregando um método de hibridoma. Em tal método, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteina utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma. O meio de cultura em que as células de hibridoma estão a crescer é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).

Por exemplo, os anticorpos do presente invento podem ser obtidos a partir de anticorpos fonte (parentais), por exemplo, obtidos por imunização de ratinhos com um mutante não encapsulado de uma estirpe ST131-025b: H4 representativa 81009 (por exemplo 81009AKps::kan) substituindo o grupo kps (que codifica a sintese capsular) por uma cassete que codifica a resistência à canamicina. As amostras de soro obtidas dos ratinhos podem então ser analisadas e o baço do ratinho que apresenta o titulo de IgG mais elevado contra o antigénio 025b (em ELISA e

Western Blot) pode ser utilizado para a geração de hibridomas. A seguir à subclonagem, podem ser seleccionados clones de hibridoma, que segregam anticorpos especificos para antigénios 025b bem como se ligam à superficie de estirpes de E. coli de tipo selvagem vivas que expressam antigénios 025b. Estes mAbs podem então ser purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma para testes adicionais quanto à sua ligação especifica do antigénio 025b e possivelmente pela sua afinidade de ligação diferencial para ligar preferencialmente o antigénio 025b em relação ao antigénio 025a, e engenharia de anticorpos, por exemplo, para diferentes fins de diagnóstico ou terapêuticos, rastreio contra antigénios únicos. Para aumentar a probabilidade de isolamento de clones de ligação diferenciada, aplicar-se-ia múltiplas pressões selectivas através de rastreio processual contra os diferentes antigénios. As estratégias de seleção mAb especiais utilizam os componentes 025b e 025a ou outros antigénios de E. coli de uma maneira alternada. 0 (s) antigénio (s) recombinante (s) pode (m) ser utilizado (s) para seleccionar anticorpos de uma biblioteca de anticorpos, por exemplo, um fermento exibido na biblioteca de anticorpos.

Em qualquer dos casos, a ligação selectiva pode ser ainda melhorada por métodos de optimização de anticorpos conhecidos na técnica. Por exemplo, determinadas regiões das regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina aqui descritas podem ser submetidas a uma ou mais estratégias de optimização, incluindo embaralhamento de cadeias leves, mutagese de destino, amalgamação de CDR e mutagese dirigida de CDR seleccionadas e/ou regiões estruturais.

Os métodos de rastreio para identificar anticorpos com as propriedades de ligação selectiva desejadas podem ser feitos por tecnologias de exibição (utilizando células de fago, bacterianas, de levedura ou de mamifero). A reactividade pode ser avaliada com base em ELISA, Western blotting ou coloração de superficie com citometria de fluxo, por exemplo, usando ensaios padrão.

Uma vez identificados anticorpos de ligação diferenciada com as propriedades desejadas, o epitope dominante ou epitopes reconhecidos pelos anticorpos podem ser determinados. Os métodos para o mapeamento de epitopos são bem conhecidos na técnica e são divulgados, por exemplo, no mapeamento de epitopos:

Uma Abordagem Prática, Westwood e Hay, editores, Oxford University Press, 2001. O mapeamento de epitopes refere-se à identificação do epitope ao qual um anticorpo se liga. Existem muitos métodos conhecidos pelos peritos na arte para determinar a localização de epitopos em proteinas, incluindo análise cristalográfica do complexo anticorpo-antigénio, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmentos de genes e ensaios baseados em péptidos sintéticos. Um anticorpo que "liga o mesmo epitopo" como um anticorpo de referência é aqui entendido da seguinte maneira. Quando dois anticorpos reconhecem epitopes que são epitopes estereoquimicamente idênticos ou sobreponiveis, os anticorpos são referidos como ligando o mesmo ou essencialmente os mesmos ou substancialmente os mesmos epitopes. Um método comummente utilizado para determinar se dois anticorpos se ligam a epitopos idênticos ou sobrepostos numa forma estérica é a análise de competição, que pode ser configurada no número total de formatos utilizando antigénio marcado ou anticorpo marcado. Tipicamente, um antigénio imobilizado numa placa de 96-pos e a capacidade de anticorpos não marcados para bloquear a ligação de anticorpos marcados medida utilizando marcadores radioactivos ou enzimicos.

Uma vez identificados os anticorpos com as propriedades de ligação diferenciadas desejadas, tais anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo, podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, técnicas de hibridoma ou tecnologia de ADN recombinante.

Os anticorpos monoclonais recombinantes podem, por exemplo, ser produzidos isolando o ADN que codifica as cadeias de anticorpo requeridas e transfectando uma célula hospedeira recombinante com as sequências codificantes para expressão utilizando vectores de expressão recombinantes bem conhecidos, por exemplo, os plasmídeos da invenção ou cassetes de expressão compreendendo as sequências nucleotidicas que codificam as sequências de anticorpo. As células hospedeiras recombinantes podem ser células procarióticas e eucarióticas, tais como as descritas acima.

De acordo com um aspecto especifico, a sequência nucleotica pode ser utilizada para manipulação genérica para humanizar o anticorpo ou para melhorar a afinidade ou outras caracterticas do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser modificada para assemelhar-se mais estreitamente a regiões constantes humanas para prevenir a resposta imunitária se o anticorpo for utilizado em ensaios cíclicos e tratamentos em seres humanos. Pode ser desejável manipular geneticamente a sequência de anticorpo para obter maior afinidade para o alvo 025b e maior eficácia contra a E. coli MDR. Será evidente para um perito na arte que uma ou mais alterações polinucleotídicas podem ser feitas no anticorpo e ainda manter a sua capacidade de se ligar ao alvo 025b. A produção de moléculas de anticorpo, por vários meios, é geralmente bem compreendida. US 6331415 (Cabilly et al.) , Por exemplo, descreve um método para a produção recombinante de anticorpos em que as cadeias pesada e leve são expressas simultaneamente a partir de um único vector ou de dois vectores separados numa célula única. Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430 (2): 191-202) e Lee e Kwak (2003, J. Biotechnology 101: 189-198) descrevem a produção de anticorpos monoclonais a partir de cadeias leves e pesadas produzidas separadamente, utilizando plasmideos expressos em culturas de E. coli separadas. Várias outras técnicas relevantes para a produção de anticorpos são fornecidas, por exemplo, em Harlow, et al. , ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).

Se desejado, o anticorpo da invenção, por exemplo, ο anticorpo 8D5-1G10 ou o anticorpo 8D10-C8, ou o respectivo sitio de ligação ou CDRs podem ser sequenciados e a sequência polinucleotica ou uma variante de sequência ou mutante desta pode então ser clonada num vector para expressão ou propagação. A sequência de codificação do anticorpo pode ser mantida no vector numa célula hospedeira e a célula hospedeira pode então ser expandida e congelada para uso futuro. A produção de anticorpos monoclonais recombinantes em cultura de células pode ser realizada por clonagem de genes de anticorpos de células B por meios conhecidos na técnica.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica a produção do anticorpo recombinante da presente invenção.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência que codifica a produto do epitopo recombinante da presente invenção, ou uma molécula compreendendo esse epitopo da presente invenção. No entanto, o epitopo da invenção também pode ser produzido sinteticamente, por exemplo, por qualquer dos métodos de sintese bem conhecidos na técnica.

Um anticorpo ou acido nucleico que codifica um epitopo pode ter quaisquer caracteristicas adequadas e compreender quaisquer caracteristicas adequadas ou suas combinações. Assim, por exemplo, um anticorpo ou epitopo que codifica o acido nucleico pode estar na forma de ADN, ARN ou um seu híbrido e pode incluir bases de ocorrência não natural, um esqueleto modificado, por exemplo um esqueleto de fosfotioato que promova a estabilidade do ácido nucleico, ou ambos. 0 ácido nucleico pode ser incorporado, de um modo vantajoso, numa cassete de expressão, vector ou plasmideo da invenção, compreendendo caracteristicas que promovem a expressão, replicação e/ou seleção desejadas na (s) célula (s) hospedeira (s) alvo. Exemplos de tais recursos incluem uma origem de replicação componente, um componente de gene de selecção, um componente de promotor, um componente de elemento potenciador, um componente de sequência de poliadenilação, um terminador e semelhantes, são conhecidos numerosos exemplos adequados dos quais são conhecidos. A presente divulgação proporciona ainda construções de ADN recombinante compreendendo uma ou mais das sequências nucleotídicas aqui descritas. Tais construções recombinantes são utilizadas em ligação com um vector, tal como um plasmideo, fagemideo, fago ou vector viral, no qual está inserida uma molécula de ADN que codifica qualquer anticorpo revelado.

Os anticorpos monoclonais são produzidos usando qualquer método que produza moléculas de anticorpo por meio de linhas celulares continuas em cultura. Exemplos de métodos adequados para a preparação de anticorpos monoclonais incluem os métodos de hibridoma de Kohler et al. (1975, Nature 256: 495-497) e o método do hibridoma de células B humanas (Kozbor, 1984, J. Immunol., 133: 3001; e Brodeur et al., Técnicas para Produção de Anticorpos Monoclonais e Aplicações pp 51-63 (Mareei Dekker, Inc., 1987)). A invenção proporciona ainda composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo ou um imunogénio como aqui descrito e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas de acordo com a presente invenção como uma injecção de uma pilula grande ou infusão ou por infusão continua. Veiculos farmacêuticos adequados para facilitar tais meios de entrega são bem conhecidos na técnica.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem geralmente todos e quaisquer solventes adequados, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis com um anticorpo ou composição relacionada proporcionada pela invenção. Outros exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem água estéril, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações de qualquer destes.

Em tal aspecto, um anticorpo pode ser combinado com um ou mais veiculos adequados para uma via de administração desejada, os anticorpos podem ser, por exemplo, misturado com qualquer de lactose, sacarose, amido, ésteres de celulose de ácidos alcanóicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidina, álcool polivinilico, e opcionalmente adicionalmente comprimido ou encapsulado para administração convencional. Alternativamente, um anticorpo pode ser dissolvido em solução salina, água, polietilenoglicol, soluções coloidais de pileno glicol, carboximetilcelulose, etanol, o de milho, o de amendoim, o de semente de algodão, o de samo, goma tragacanta e/ou vários tampões. Outros portadores, adjuvantes e modos de administração são bem conhecidos nas artes farmacêuticas. Um veiculo pode incluir um material de libertação controlada ou material retardador do tempo, tal como monoestearato de glicerilo ou estearato de glicerilo sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica.

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis adicionais são conhecidos na técnica e são descritos em, por exzemplo, CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE REMINGTON. As formulações liquidas podem ser soluções, emulsões ou suspensões e podem incluir excipientes tais como agentes de suspensão, solubilizantes, surfactantes, conservantes e agentes quelantes.

As composições farmacêuticas são contempladas em que um anticorpo ou imunogénio da presente invenção e um ou mais agentes terapeuticamente activos são formulados. As formulações de anticorpo estéril ou imunogénio da presente invenção são preparadas para armazenamento misturando a referida imunoglobulina possuindo o grau de pureza desejado com veiculos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Formulações a serem usadas para in vivo administração são especificamente estéreis, de preferência sob a forma de uma solução aquosa estéril. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis ou outros métodos. 0 anticorpo e outros agentes terapeuticamente activos aqui revelados podem também ser formulados como lipossomas imunes e/ou retidos em microcápsulas. A administração da composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou imunogénio da presente invenção pode ser feita numa variedade de formas, incluindo oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intranasalmente, intratecalmente, trans-dermatologicamente, mucosalmente, topicamente, geles, unguentos, loções, cremes, etc., intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonar, por exemplo empregando tecnologia inalável ou sistemas de administração pulmonar, vaginal, parenteral, rectal ou intra-ocular.

As formulações exemplificativas utilizadas para administração parenterica incluem as adequadas para injecção subcutânea, intramuscular ou intravenosa, tal como, por exemplo, uma solução estéril, emulsão ou suspensão.

Numa forma de realização, o anticorpo ou imunogénio da presente invenção é o único agente terapeuticamente activo administrado a um sujeito, por exemplo, como uma doença modificando ou prevenindo a monoterapia.

Alternativamente, o anticorpo ou imunogénio da presente invenção é administrado em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos ou profilácticos, incluindo mas não limitados a tratamento padrão, por exemplo, antibióticos, inibidores esteroides e não inflamatórios não esteroides e/ou outra terapia baseada em anticorpos, por exemplo, empregando agentes anti-bacterianos ou anti-inflamatórios. A terapia de combinação emprega, em particular, um regime padrão, por exemplo, como utilizado para o tratamento da infeção por E. coli MDR. Isto pode incluir antibióticos, por exemplo, tiazaciclina, linezolida, meticilina e/ou vancomicina.

Numa terapia de combinação, o anticorpo pode ser administrado como uma mistura ou concomitantemente com um ou mais outros regimes terapticos, por exemplo, antes, simultaneamente ou após terapia concomitante. A administração profiláctica de imunogénios em alguns casos pode empregar uma vacina compreendendo o imunogénio aqui descrito, isto uma vacina monovalente. No entanto, uma vacina multivalente compreendendo diferentes imunogénios para induzir uma resposta imunitária contra os mesmos ou diferentes patologias alvo pode ser utilizada.

As propriedades biológicas do anticorpo, imunogénio ou as suas preparações farmacêuticas podem ser caracterizadas ex vivo em experiências de células, tecidos e organismos inteiros. Como é conhecido na arte, os fármacos são frequentemente testados in vivo em animais, incluindo mas não limitados a ratinhos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e macacos, para medir a eficácia de um fármaco para o tratamento de uma doença ou doenças, modelo, ou para medir a farmacocinética, farmacodinâmica, toxicidade e outras propriedades de um fármaco. Animais podem ser referidos como modelos de doença. As terapêuticas são frequentemente testadas em ratinhos, incluindo mas não limitados a ratinhos nus, ratinhos SCID, ratinhos xenoenxertados e ratinhos transgénicos (incluindo pancadas e acontecimentos). Tal experimentação pode fornecer dados significativos para determinar o potencial do anticorpo a ser utilizado como terapêutico ou profilático com a semivida apropriada, função efectora, actividade neutralizante (reticulação) e/ou resposta imunitária após imunoterapia activa ou passiva. Qualquer organismo, de preferência mamíferos, pode ser usado para testes. Por exemplo, devido à sua semelhança genética com seres humanos, primatas, os macacos podem ser modelos terapêuticos adequados e, assim, podem ser utilizados para testar a eficácia, toxicidade, farmacocinética, farmacodinâmica, semi-vidas ou outras propriedades do agente ou composição em questão. 0 teste em humanos é, em última instância, requerido para aprovação como droga e, portanto, fica claro que tais experiências são contemplados. Assim, o anticorpo, imunogénios e respectivas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser testados em humanos para determinar a sua eficácia terapêutica ou profilática, toxicidade, imunogenicidade, farmacocinética e/ou outras propriedades clinicas. A invenção também proporciona o anticorpo em questão da invenção para fins de diagnóstico, por exemplo, para uso em métodos deteção e determinação quantitativa da concentração de uma carga bacteriana ou anticorpo como reagente imunológico ou alvo numa amostra de fluido biológico. A invenção também proporciona métodos para a deteção do grau de infeção por sepsia ou MDR de E. coli numa amostra biolólica, por exemplo, carregar uma amostra com MDR de E. coli, tal como um fluido corporal, compreendendo o passo de contactar a amostra com um anticorpo da invenção. 0 anticorpo da invenção pode ser empregue em qualquer modo de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduhe directos e indirectos, ensaios de imunoprecipitação e ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISA). 0 ensaio de diagnóstico preferido é realizado como se segue. Anticorpos específicos para o antígeno alvo são imobilizados em esferas de látex que são incubadas com bactérias presentes ou isoladas de fluidos corporais. A reação positiva pode ser detectada a olho nu, devido à agregação das esferas de látex coloridas na presença do correspondente antígeno cognato expresso na superfície da bactéria.

Um fluido corporal, tal como utilizado de acordo com a presente invenção, inclui amostras biológicas de um sujeito, tais como extracto de tecido, urina, sangue, soro, fezes e fleuma.

Numa forma de realização, o método compreende pôr em contacto um suporte sólido com um excesso de um certo tipo de fragmento de anticorpo que forma especificamente um complexo com o alvo, sob condições que permitem que o anticorpo se ligue à superfície do suporte sólido. 0 suporte sólido resultante ao qual o anticorpo está ligado é então colocado em contato com a amostra do fluido para que o alvo no fluido biológico se ligue ao anticorpo e forme um complexo alvo-anticorpo. 0 complexo pode ser rotulado com um rótulo detectável. Alternativamente, o alvo ou anticorpo pode ser marcado antes da formação do complexo. Por exemplo, um marcador detectável (etiqueta) pode ser conjugado ao anticorpo. 0 complexo pode então ser detectado e determinado quantitativamente, detectando e determinando quantitativamente a concentração do alvo na amostra do fluido biológico.

Para aplicações particulares, o anticorpo da invenção conjugado com uma molécula marcadora ou repetidor seleccionado do grupo consistindo de moléculas orgânicas, marcadores enzimáticos, marcadores radioactivos, marcadores coloridos, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, metal complexos, metais, ouro coloidal e suas misturas. Anticorpos conjugados ou etiquetas podem ser utilizados, por exemplo, em sistemas de ensaio ou modos de diagnóstico, por exemplo, para diagnosticar MDR E. coli infecção ou doenças do mesmo. 0 anticorpo da invenção pode ser conjugado com outras moléculas que permitem a deteção simples do referido conjugado em, por exemplo, ensaios de ligação (por exemplo, ELISA) e estudos de ligação.

Outro aspecto do presente invento proporciona um kit compreendendo um anticorpo, o qual pode incluir, para além de um ou mais anticorpos, vários agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Um kit também pode incluir instruções para uso num método diagnóstico ou terapêutico. Tais instruções podem, por exemplo, ser fornecidas num dispositivo incluido no kit, por exemplo, ferramentas ou um dispositivo para preparar uma amostra biológica para fins de diagnóstico, tal como separar uma fração contendo célula e/ou protease antes de determinar a carga MDR de E. coli para diagnosticar uma doença. Vantajosamente, esse kit inclui um anticorpo e um reagente ou agente de diagnóstico que pode ser utilizado em um ou mais dos vários métodos de diagnóstico aqui descritos.

Noutra concretizações preferida, o kit inclui um anticorpo, por exemplo, na forma liofilizada, opcionalmente incluindo instruções e um meio para reconstituir o liofilizado e/ou em combinação com transportador (es) farmaceuticamente aceitável que pode ser misturado antes de usar para formar uma composição injectável para administração a curto prazo.

Anticorpos designados 8D5-1G10 e 8D10-C8, especificamente qualquer uma das cadeias leves de anticorpo e/ou cadeias pesadas, são ainda caracterizados pelo material biológico depositado na DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikro organisen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb/Inhoffenstrasse 7B. 38124 Braunschweig (DE).

Os depósitos referem-se a culturas de E. coli transformadas, cada uma contendo um plasmideo clonado com uma inserção de um gene de interesse. Os genes de interesse são os dominios variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal de camundongo 8D5-1G10 (IgG3), e as cadeias pesadas e leves do anticorpo monoclonal de ratinho 8D10-C8 (IgG2b) . 0 DSM 26763 uma célula hospedeira de E. coli transformada com um plasmideo compreendendo a sequência de codificação do dominio variável da cadeia leve 8D5-1G10 (8D5-1G10-LC).

Escherichia coli 8D5-1G10-VL = DSM 26763, data de deposição: 15 de janeiro de 2013; depositante: Arsanis Biosciences GmbH, Viena, Áustria. O DSM 26762 é uma célula hospedeira de E. coli transformada com um plasmideo compreendendo a sequência de codificação do domínio variável da cadeia pesada 8D5-1G10 (8D5-1G10-HC) . Escherichia coli 8D5-1G10-VH = DSM 26762, data de deposição: 15 de janeiro de 2013; depositante: Arsanis Biosciences GmbH, Viena, Áustria. DSM 28171 é uma célula hospedeira de E. coli transformada com um plasmideo compreendendo a sequência codificadora do domínio variável da cadeia leve 8D10-C8 (8D10-C8-LC). Escherichia coli 8D10-C8-VL = DSM 28171, data de deposição: 11 de dezembro de 2013; depositante: Arsanis Biosciences GmbH, Viena, Áustria. O DSM 28172 uma célula hospedeira de E. coli transformada com um plasmideo compreendendo a sequência codificadora do domínio variável da cadeia pesada 8D10-C8 (8D10-C8-HC) . Escherichia coli 8D10-C8-VH = DSM 28172, data de deposição: 11 de dezembro de 2013; depositante: Arsanis Biosciences GmbH, Viena, Áustria. O assunto das seguintes definições é considerado formas de realização da presente invenção: 1. Um anticorpo monoclonal isolado que compreende um local de ligação ao antígeno que reconhece especificamente 025b antígeno de cepas de E. coli resistentes a múltiplas drogas (MDR). 2. O anticorpo da definição 1, que tem um local de ligação de um anticorpo monoclonal de comprimento total ou fragmento de anticorpo compreendendo pelo menos um dominio de anticorpo que incorpora um local de ligação. 3. 0 anticorpo de qualquer das definições 1 ou 2, que tem uma afinidade pela ligação ao antigénio 025b com um Kd inferior a 10_7M, de preferência inferior a 10~8M. 4. 0 anticorpo de qualquer das definições 1 a 3, que é caracterizado por: a) a região variável da cadeia leve do anticorpo produzida pela célula hospedeira depositada sob o DSM 26763; e b) a região variável do anticorpo de cadeia pesada produzida pela célula hospedeira depositada sob o DSM 26762.

Cassete de expressão compreendendo a sequência de codificação para expressar a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo de qualquer uma das definições 1 a 4, cuja sequência de codificação compreende -uma sequência nucleotidica que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo designado 8D5-1G10-LC compreendido numa célula hospedeira depositada sob DSM 26763; e -uma sequência nucleotidica codificando a região variante do anticorpo de cadeia pesada designado 8D5-1G10-HC compreendido numa célula hospedeira depositada sob o DSM 26762. 6. Uma célula hospedeira que compreende a cassete de expressão da definição 5. 7. Um método para produzir um anticorpo de qualquer uma das definições 1 a 4, em que uma célula hospedeira de acordo com a definição 6 são cultivadas ou mantidas sob condições para produzir o referido anticorpo. 8. Um método de identificação de um candidato: (a) fornecer uma amostra contendo um anticorpo ou célula produtora de anticorpos; e (b) ensaio da ligao de um anticorpo na amostra ou produzido pela amostra de antigio 025b de uma estirpe ST131-025b: H4 e antigio 025a de uma estirpe de E. coli n MDR, em que uma reaco positiva especica entre o anticorpo e o antigio. 025b em relação ao antigeno 025a identifica o anticorpo como anticorpo candidato. 9. Método para produzir um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo (a) fornecer um identificador candidato identificado de acordo com a definição 8; e (b) produzir um anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo candidato, ou um seu derivado possuindo a mesma especificidade de ligação ao epitopo que o anticorpo candidato. 10. Anticorpo de qualquer uma das definições 1 a 4 para utilização no tratamento de um indivíduo em risco ou infecção por MDR de E. coli compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo para limitar a infecção no sujeito ou para melhorar a condição do anticorpo, doença resultante da referida infecção, preferivelmente para tratamento ou profilaxia de pielonefrite, bacteremia secundária, sepsia, peritonite, meningite e pneumonia associada a ventilador. 11. Preparação farmacêutica de um anticorpo de qualquer das reivindicações 1 a 4, compreendendo uma formulação parentérica ou mucosa, contendo opcionalmente um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitavel. 12. Um método para determinar a infecção por E. coli num indivíduo causada por cepas MDR expressando LPS 025b, tais como infecções do trato urinário superior e inferior, incluindo cistite ou uretrite, pielonefrite hematogênica ou ascendente, especialmente em pacientes diabéticos, bem como bacteremia, sepse, peritonite ou colonização intestinal, utilizando o anticorpo de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a infecção é determinada in vivo colocando em contacto uma amostra de um fluido corporal do referido indivíduo com o anticorpo, em que um anticorpo reaccional é infectado. 13. Preparação de diagnóstico de um anticorpo de qualquer das definições 1 a 4, contendo opcionalmente o anticorpo com um marcador e/ou um reagente de diagnóstico adicional com um marcador e/ou uma fase sólida para imobilizar pelo menos um dos anticorpos e o diagnóstico reagente. 14. Um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo de qualquer das definições 1 a 4. A descrição anterior será melhor compreendida com referência aos exemplos seguintes. Tais exemplos são, no entanto, meramente representativos de métodos de praticar uma ou mais formas de realização da presente invenção e não devem ser interpretados como limitativos do âmbito da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: anticorpos específicos de 025b

Geramos um mutante não encapsulado de uma estirpe ST131-025b: H4 representativa 81009 (81009 Akps :: kan, [Szijarto et al., FEMS Microbiol Lett, 2012, 332: 131-6]) substituindo os kps (codificando a síntese capsular) com uma cassete que codifica a resistência à canamicina. Doses sub-letais de células inactivadas vivas ou formaldeído desta estirpe mutante foram utilizadas para imunizar murganhos 4 vezes em intervalos de duas semanas. Posteriormente, amostras de soro obtidas dos camundongos foram analisadas, e o baço do camundongo exibindo o maior título de IgG contra o antígeno 025b (em ELISA, técnica de analise e coloração de superfície) foi usado para gerar hibridoma. A seguir à subclonagem, seleccionou-se um número de clones de hibridoma que segregaram anticorpos específicos para antigénios 025b purificados, bem como estirpes de E. coli de tipo selvagem vivo ligadas a superfície que expressam antigénios 025b. Estes mAbs foram purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma para testes adicionais.

Como representado na Fig. 1, todos os anticorpos ligados a vários isolados clínicos diferentes foram determinados como ST131-025b: H4 cepas, independentemente do polissacarídeo capsular expresso (K5, K2 ou tipos K desconhecidos). No que diz respeito à ligação a estirpes que expressam o antigénio 025a, foram identificados dois tipos de mAbs. Um grupo representado pelo mAb 8D5-1G10 não se ligou à superfie das estirpes 025a, enquanto o outro grupo de mAb representado por 8D10-C8 teve reacção cruzada com as estirpes 025a. Nenhum dos mAbs, contudo, pode ligar-se a quaisquer estirpes de E. coli que expressem antigénios não relacionados, isto é, 02 (Fig. 1) ou outros tipos 0 (não mostrados). A especificidade dos mAbs foi adicionalmente confirmada por análise de imunotransferência utilizando LPS purificado (Figura 2). Os mAbs reconheceram as moléculas LPS das cepas ST131 contendo o antigeno 025b, mas foram diferentes em seu potencial de reação cruzada aos antigenos LPS 025a. Enquanto o mAb 8D5-1G10 reagiu exclusivamente ao antigeno 025b, o mAb 8D10-C8 teve reatividade cruzada com 025a. Esta reactividade cruzada observada foi comparada com aquela exibida pelo soro de tipagem comercial 025 (Statens Serum Institut, alta concentrao anti-tumoral E. coli 025, # 81369) utilizado rotineiramente para a detecção de estirpes ST131: 025b). 0 soro comercial de coelho mostrou uma clara preferência pela ligação aos antigenos 025a vs. 025b LPS. Em contraste, o mAb murino 8D10-C8 reagiu com as moléculas 025b LPS pelo menos com a mesma intensidade que as moléculas 025a. A análise quantitativa subsequente revelou que a razão entre a intensidade da ligação para 025b e 025a é pelo menos 10 vezes maior no caso do mAb 8D10-C8 em comparação com o soro de tipagem comercial.

Os dados acima juntos sugerem que existem dois tipos de mAbs específicos de 025b, aqueles que são altamente específicos para 025b e aqueles que reconhecem um epitopo compartilhado pelos antigenos 025a e 025b. Consequentemente, os nossos dados confirmam que a estrutura de 025b difere efectivamente da do antigénio clássico 025 (isto é, 025a) . A nova estrutura da subunidade 025b foi elucidada como descrito no Exemplo 2.

Os domínios variaveis pesados (VH) e de cadeia leve (VL) de mAbs especificos para 025b foram amplificados a partir de clones de hibridoma utilizando RT-PCR com iniciadores de cadeia pesada e leve degenerados e sequenciados. As sequências foram analisadas com o BLAST para a base de dados Ig, bem como com IMGT/V-QUEST, e as regiões CDR foram definidas de acordo com a nomenclatura Rabat.

As sequências variáveis da cadeia pesada e leve do mAb 8D5-1G10 foram clonadas nos vectores respectivos, que foram utilizados para transformar as células hospedeiras de E. coli depositadas no DSMZ com números de acesso: DSM 26763 e DSM 26762.

As sequências variáveis de cadeia leve e pesada do mAb 8D10-C8 foram clonadas nos vectores respectivos, que foram utilizados para transformar as células hospedeiras de E. coli depositadas na DSMZ com os números de acesso: DSM 28171 e DSM 28172.

Exemplo 2: Análise estrutural do antígeno 025b 0 LPS de E. coli ST131 foi isolado pelo método quente de fenol/água e purificado por diálise, digestão com proteinase K e ultracentrifugação. 0 rendimento médio das preparações de LPS foi de 2,61% de massa bacteriana seca. 0 LPS foi analisado por SDS-PAGE, mostrando fracções consistindo em oligossacárido do núcleo (OS) substituído com números diferentes de unidades repetitivas de oligossacáridos (RU) bem como oligossacáridos centrais não substituídos. 0 polissacarídeo O-específico (0-PS) e diferentes componentes de oligossacarídeos foram libertados por hidrólise ácida suave e isolados por filtração em gel em Bio-Gel P-10 as frações foram analisadas por análises de açúcar e metilação, espectroscopia de RMN e espectrometria de massa MALDI-TOF (MS). A estrutura da O-PS RU foi determinada com o uso de uma fração consistindo no núcleo OS substituído por uma única RU. A análise de monossacarídeos indicou a presença de Rha, Glc, Gal, Hep e menor quantidade de GlcN. Quantidades equimolares de derivados de Rhap terminal, Glcp terminal, Glcp substituída em 3,6, Rhap 3-substituído, com quantidades vestigiais de GlcpN substituídas em 3 foram identificadas e designadas como O-PS RU. Os acetatos de alditol parcialmente metilados remanescentes de Hepp 7-substituído, Glcp 6-substituído, Glcp 2-substituído, Galp terminal, Glcp 3 6 -substituída e Hepp terminal, constituíram o núcleo oligossacarídeo do tipo K-12. Derivados de Hepp 3,4-substituído, Hepp 3,4,7-substituído e Kdo não puderam ser detectados durante a metilação padrão e análise de açúcar devido à substituição por P e PPEn e presença de grupo carboxila, respectivamente. A estrutura da RU do PS O-específico de LPS ST131 foi determinada com o uso de espectroscopia de RMN. A completa atribuição das ressonâncias O-PS 3H e 13C foi obtida combinando as informações obtidas em experimentos COSY, TOCSY e NOESY, bem como HSQC-DEPT, HMBC e HSQC-TOCSY. 0 espectro 1H-13C HSQC-DEPT continha sinais para 13 prótons anoméricos e carbonos, e um sistema de spin Kdo. Estes sinais derivam do oligossacárido do núcleo, bem como da RU do PS específico de 0. A região de alto campo continha um sinal de CH3 do grupo 0-acetilo, um sinal de CH3 do grupo N-acetilo, bem como dois sinais ascendentes de CH3 caracteristicos para os açúcares 6-desoxi (Rha). Os espectros indicaram uma estrutura de tetradecassacárido do oligossacárido investigado. Devido à alta heterogeneidade relacionada a P, PP e PEtn, os sistemas completos de rotação de oito açúcares do sistema não redutor não foram completamente resolvidos com ênfase na estrutura do RU e a sua ligação com o núcleo do K-12.

As conectividades inter-residuais entre residuos de açúcar adjacentes foram observadas por experimentos de NOESY e HMBC. Os espectros de HMBC exibiram picos cruzados entre o próton anomérico e o carbono na posição de ligação e entre o carbono anomérico e o próton na posição de ligação, o que confirmou a sequência de residuos de açúcar na região não redutora do polissacarideo.

Com base nestas medições, foi determinada a unidade de repetição do PS especifico de 025b (Fig.3 (a)), que é um pentacárido com -► 3) -β-GlcpNAc (resíduo K) como um resíduo de RU substituindo o primeiro resíduo do núcleo do sistema operacional: -► 7) -a-Hepp (resíduo L) . Devido a uma possível contaminação das frações PS mais longas, foi impossível identificar a posição de substituição da primeira UR pela RU subsequente da cadeia O-específica. Além disso, sem análises estruturais detalhadas adicionais dessas fracções, a presença de GlcNAc em unidades repetitivas subsequentes como anómero a (o que foi anteriormente descrito para alguns dos lipopolissacáridos de E. coli) pode ser excluída.

Pesos moleculares do núcleo do sistema operacional, núcleo OS substituído com um RU e, finalmente, o 0-PS RU foi confirmado com o uso de MALDI-TOF MS (dados não mostrados). Todos os espectros foram interpretados com base na estrutura aqui elucidada da RU de LPS ST131 e glicoformas de núcleo K-12 anteriormente identificadas (Duda et ai. Microbiology. 2011 Jun; 157 (Pt 6): 1750-60. Doi: 10.1099/mic.0.046912-0, Epub 2011 Mar 3; Muller-Loennies e outros J Biol Chem. 2003 5 de setembro; 278 (36) : 34090- 101. Epub 2003 20 de junho). A análise MALDI-MS dos espectros de baixa resolução da fração consistindo do núcleo OS substituído por O-PS mais curto mostrou aglomerados de ions com os seguintes ions predominantes: m/z 2797,2, m/z 3659.6, m/z4522.0 e m/z 5383.6 atribuídas ao núcleo OS (com P e PPEtn) substituídas por 1, 2, 3 e 4 RUs, respectivamente. A diferença média de massa entre estes iões foi de 862,1 Da e a massa média calculada foi igual à PSRU específica de O (861,8 Da, RU-H20).

Levando em consideração o peso molecular da RU e comparando os resultados da MS para outras frações, mostramos a presença de glicoformas de núcleo OS mais longas consistindo em -► 7) -α-Hepp- (1 ->· 6) - a-Glcp dissacarídeo no núcleo externo região como local de substituição com a primeira UR (Fig. 3 (a)). Foi demonstrado que o LPS ST131 consistia em duas glicoformas principais do núcleo OS. O tipo de glicoforma depende da presença ou ausência do PS específico de O. A glicoforma predominante do sistema operacional central não-substituído é uma versão truncada do oligossacarídeo do núcleo K-12, que é desprovido de -► 7) -α-Hepp - (1^6) dissacarídeo -α-Glcp. Esse dissacarídeo é a diferença entre o SO principal substituído por O-PS e nenhum SO principal substituído.

Exemplo 3: Ensaio de diagnóstico especifico de E. coli 025b O mAb 8D5-1G10 específico de 025b foi ligado a esferas de látex de 1 mm de diâmetro (Policiências) seguindo as instruções do fabricante. As esferas acopladas a látex foram testadas quanto ao seu potencial para aglutinar diferentes estirpes de E. coli. Uma alça de bactérias (aprox. 108 ufc) foi misturada com 10 ml de 1% de suspensão de contas de látex acopladas com mAb em PBS. Como representado na Fig. 4, as cepas de E. coli expressando antigenos 025b mostraram um forte padrão de aglutinação após agitação suave por alguns segundos. Pelo contrário, as estirpes de E. coli que expressam antigénios 025a ou 02 não se aglutinaram com o mesmo reagente. Por conseguinte, este reagente de diagnóstico putativo é considerado ser mais especifico do que o reagente de aglutinação do estado da técnica correntemente utilizado (isto é, soro de coelho policlonal contra 025) utilizado para a detecção de E. coli positiva para 025b (e 025a).

Além disso, como o soro comercial anti-025 é recomendado para ser usado com células E.coli mortas pelo calor (por exemplo, lisadas) em ensaios de aglutinação, nós testamos se os mAbs 025b - purificados ou acoplados às esferas de látex - teriam uma maior sensibilidade, por exemplo, se eles são capazes de aglutinar ao vivo E .coli células na presença de polissacarideos capsulares intactos. Um grande painel de isolados clinicos 025b foi testado e os resultados com algumas cepas representativas são apresentados na Tabela I. A melhoria na sensibilidade foi encontrada em dois aspectos: i) cepas representativas # 1 e # 2 foram aglutináveis com 025b- mAbs específicos numa forma sem calor aquecido (isto bactérias vivas directamente retiradas de uma placa de agar), enquanto a aglutinação com o soro de coelho comercial 025 requere análise de calor anterior das bactérias, ii) as estirpes representativas # 3 e # 4 não foram capazes de ser aglutinadas com o soro comercial, mesmo sob uma forma termicamente morta, enquanto que os mesmos lisados deram resultados positivos com o mAb 8D5-1G10 purificado. Importante, quando o mesmo anticorpo foi acoplado a esferas de látex, a aglutinação desenvolveu-se mesmo com células bacterianas nativas. Estes resultados indicam uma sensibilidade superior dos mAbs acoplados a esferas num ensaio de aglutinado, o que corroborado pelo facto de todas as estirpes de E. coli positivas para 025b testadas até agora terem dado um aglutinado positivo com este reagente mesmo sem qualquer tratamento anterior (por exemplo sem produzir um lisado morto pelo calor). Além disso, o uso deste reagente como uma ferramenta de diagnóstico para a detecção de bactérias que expressam 025b tem a vantagem sobre a técnica baseada em PCR que apenas dá um resultado positivo com bactérias expressando de fato o antigeno alvo. Por exemplo, a estirpe # 5 representativa na Tabela I foi positiva para PCR para o gene especifico de 025b rotineiramente utilizado em diagnósticos, no entanto, foi negativa em quaisquer ensaios de aglutinação. Está comprovado que esta cepa exibe um fenótipo LPS áspero (sem antigenos 0 expressos) , portanto, o resultado da PCR pode ser considerado falso e positivo. Evitar essa falsa positividade é de grande importância, quando tais testes são usados como diagnósticos associados, ou seja, para selecionar pacientes infectados com a estirpe de E. coli que expressa 025b e que poderiam beneficiar de abordagens terapêuticas especificas de 025b. 0 potencial de detectar moléculas livres de 025b LPS pelos mAbs acoplados a contas de látex foi também testado. Quantidades diferentes de 025b LPS altamente purificado na gama de 1-1000 ng foram incubadas com 10 yL de suspensão de esferas a 1% em PBS. Como representado na Fig. 5, foi observado um padrão de aglutinação dependente da dose: os melhores resultados foram obtidos com 100 ng de LPS livre, a aglutinação ainda era detectável com 1000 ou 10 ng, enquanto era indetectével com 1 ng de 025b LPS livre.

Tabela I: Comparação dos resultados de aglutinação obtidos com várias estirpes de 025b utilizando soro de tipagem comercial 025 e mAb especifico de 025b 8D5-1G10.

Exemplo 4: Efeito antibacteriano de mAbs específicos de 025b O potencial efeito protector dos AcM específicos de 025b (com ou sem reactividade cruzada para 025a) foi testado num modelo letal de bacteremia murina. Grupos de 5 ratinhos receberam 100 yg de 8D5-1G10 purificado ou 8D10-C8, intraperitoneal. 24 h depois os ratinhos foram desafiados

intravenosamente por uma dose letal (previamente determinada numa experiência piloto) da estirpe de E. coli 81009 (2xl08 CFU/murganho) expressando o antigénio 025b. A letalidade dos ratos foi monitorizada diariamente durante 3 semanas. Fig. 6 mostra resultados combinados de 2 experiências independentes com resultados semelhantes. Enquanto 90% dos camundongos simulados imunizados com PBS sucumbiram à infecção, ambos os mAbs testados forneceram estatisticamente (teste de Logrank) um aumento significativo na sobrevida ao longo do período de 3 semanas pós-infecção monitorado. O efeito protector potencial de mAbs específicos de 025b (com ou sem reactividade cruzada com 025a) foi testado num modelo letal de bacteremia murina. Grupos de 5 ratinhos receberam 100 mg de 8D5-1G10 purificado ou 8D10-C8, intraperitonealmente. 24 h depois os ratinhos foram desafiados intravenosamente por uma dose letal (previamente determinada numa experiência piloto) da estirpe de E. coli 81009 (2x108 CFU/murganho) expressando o antigénio 025b. A letalidade dos ratos foi monitorizada diariamente durante 3 semanas. Fig. 6 mostra resultados combinados de 2 experiências independentes com resultados semelhantes. Enquanto 90% dos camundongos simulados imunizados com PBS sucumbiram à infecção, ambos os mAbs testados forneceram estatisticamente (teste de Logrank) um aumento significativo na sobrevida ao longo do período de 3 semanas pós-infecção monitorado.

De modo a corroborar estes dados in vivo, o efeito bactericida de mAbs purificados foi também testado in vitro. 2 ml de cultura de meio-log da estirpe de E. coli 81009 foram lavados duas vezes em PBS e ressuspensos para uma concentração final de 5 x 105 CFU/ml. 10 μΐ desta suspensão bacteriana foram pré-incubados durante 15 minutos a 4°C com 4 yg dos mAb respectivos diluídos em 40 μΐ de tampão RPMI-1640 suplementado com 3% de albumina humana. Subsequentemente, adicionou-se 50 μΐ de soro humano reunido (previamente adsorvido com a estirpe de E. coli 81009) à reacção e incubou-se a 37° durante 1, 2 e 3 horas. As concentrações finais de CFU e anticorpo na reacção foram 5xl04 UFC/ml e 40 mg/ml, respectivamente, num volume total de 100 μΐ. Aliquotas de 10 μΐ foram plaqueadas em placas TSB para contagem de colónias nos pontos de tempo especificados.

Como representado na Fig. 7, ambos os mAbs testados foram capazes de diminuir significativamente o CFU ao longo do periodo de estudo de 3 horas. Em contraste, as bactérias misturadas com um mAb irrelevante ou nenhum anticorpo mostrou crescimento constante neste meio. No caso de o complemento ter sido inativado nas amostras de soro (em 30 min de incubação a 56°C), não se observou morte bacteriana por quaisquer mAbs (dados não mostrados). Estes resultados provam que ambos os mAb específicos de 025b podem desencadear o efeito bactericida mediado pelo complemento.

Lisboa, 05 de Junho de 2018

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração foi tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a este respeito a EPO declina qualquer responsabilidade.

Documentos de Pedidos de Patente citados na descrição US 6331415 B, Cabilly

Documentos que não são patente citados na descrição * POiAHO et al ka 3 Arom-muè í. Aíí;) 201», - KtHNt; LMOBERS a). Ras., 29 Oo- «sS. 3-S H) 240-21 ί««δ«ϊ SfibSf ti3. VO! 122(25. 249-OS {01721 * RQSSRS st ai ,í ÂíXwcw,-, CXímUxw jwsjv * STENltTZ ai al. fí~MS tfev . tísy 2008, 5011, vní 0M1;. 1.H[¢8061(90071 v<* ÃÍU3>. ?S8<403 [91721 * WOOD ^ORDtfís·!, .ECUS (nHm&ioi 8&v. * Λ P> aUksa; Afwroach.. Oxford Lfdverçúv Pr*»», 2001 591 f ioi;-;3Sj ϊ'13 jΪ *· Cl£M*0*»T et al j Â^knfon?)) Çh&ntiltm May .? W18B£í(&1£Y£ííei$i Btochtm

We, voi S< m. 1924-8 (88*61198161 * JADi-ÍAVsísL Ρί.0&OM£ diU 1, voí. ô{3), iRSOSO * LHO ; KWAR. ,í. 290S. foi. 101. pw»i 180*1 §8162161 * to J Afámcròbfoi Agsim. 2ÔH. vos. * KOHLER et al, ftsfcre. *m. ves. m 49S-48?

y? il}. UVJí lOOOSj [OSSíJ * SZSM&TOetas r.-M0L* ^v\," ?0Λ? w V5 * K02BOR.19,34. vo; 13,1, 39Si {0222| mi e {OOt 1) [01701 [01721 [0252} * BROBEUR et 3}, Wafwcfcrasi AfítíiKKiy DroduUia;i * «MANA eí»L toVeBbfec*,. m «A 17.. 176-100 Tesbniqiwe «‘itf Asaptoto». Muroei DeíA«, sne. pmt * K0MNE í ; UNDRCRO B MAOOEP JK ; UMD- * nurSA eS *S AA<'OfaVAK;s, J-«w 00H. vo! 1«7 8&RGAA GBÍ4SKfAJK .»tí ·Ό.^.ί!ί>1 &S í*> Ui· ii?5ÍA80 [0¾¾¾¾ Eí-5 '5«· <u ) * v, 0^'sg«( ?\ Go.LUOyt Rív Ό V UOENNCS«ME*5. JBtolÚfàtm., O&Sett&mte?2083

1905. vai 122(25.24^*58(01481 v«L 2?a (30í. 5-íC90-im P204J * HARLOW si af ANTiSODSEE A LABORATORY A-VWOAu Leio Sj^r-g Rsfi>v 1.^x;-;do«v 19S^[01$ÍÍ 102191

Claims

Reivindicações

1. Um anticorpo monoclonal isolado que compreende um local de ligação ao antigeno que reconhece especificamente 025b antigeno de cepas de E. coli resistentes a múltiplas drogas (MDR) .
2. Anticorpo da reivindicação 1, possuindo um local de ligação de um anticorpo monoclonal de comprimento total ou um seu fragmento de anticorpo compreendendo pelo menos um dominio de anticorpo que incorpora um local de ligação.
3. Anticorpo de qualquer das reivindicações 1 ou 2, possuindo uma afinidade para o antigénio de ligação 025b com um Kd inferior a 10-7 M, de preferência inferior a 10-8 M.
4. Anticorpo de qualquer das reivindicaes 1 a 3, caracterizado por a) a região variável da cadeia leve do anticorpo produzido pela célula hospedeira depositada sob o DSM 26763; e b) a região variável da cadeia pesada do anticorpo produzido pela cuia hospedeira depositada sob o DSM 26762.
5. Cassete de expressão compreendendo uma sequência codificadora que expressa a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, cuja sequência codificadora compreende - uma sequência nucleotidica que codifica a região variável da cadeia leve do anticorpo designada 8D5-1G10-LC, preparada numa célula hospedeira depositada sob o DSM 26763; e - uma sequência nucleotídica codificando a região variável da cadeia pesada do anticorpo designada 8D5-1G10-HC compreendida numa célula hospedeira depositada sob o DSM 26762.
6. Célula hospedeira compreendendo a cassete de expressão da reivindicação 5.
7. Um método para produzir um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 é cultivada ou mantido sob condições para produzir o referido anticorpo.
8. Um método para identificar um anticorpo candidato compreendendo: (a) fornecer uma amostra contendo um anticorpo ou célula produtora de anticorpos; e (b) avaliar a ligao de um anticorpo ou produzido pela amostra com o antigio 025b de uma estirpe ST131-025b: H4 e antigio 025a de uma estirpe de E. coli n MDR, em que uma reaco positiva especica entre o anticorpo e The 0 antigeno 025b relativo ao antigeno 025a identifica o anticorpo como anticorpo candidato.
9. Método para produzir um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo (a) proporcionar um anticorpo candidato identificado de acordo com a reivindicação 8; e (b) produzir um anticorpo monoclonal, ou uma forma humanizada ou humana do anticorpo candidato, ou um seu derivado possuindo a mesma especificidade de ligação ao epítopo que o anticorpo candidato.
10. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para utilização no tratamento de um individuo em risco para infecçao por E. coli MDR compreendendo administrar ao individuo uma quantidade eficaz do anticorpo para limitar a infecçao no sujeito ou melhorar uma doença resultante das referidas infecções, preferencialmente para tratamento ou profilaxia de pielonefrite, bacteremia secundária, sepsia, peritonite, meningite e pneumonia associada a ventilador.
11. Preparação farmacêutica de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo preferencialmente uma substância parentérica ou mucosa, formulação, opcionalmente contendo um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
12. Um método para determinar a infecção por E. coli num individuo causada por cepas MDR expressando LPS 025b, tais como infecções do trato urinário superior e inferior, incluindo cistite ou uretrite, pielonefrite hematogênica ou ascendente, especialmente em pacientes diabéticos, bem como com bacteremia, sepse, peritonite ou colonização intestinal, utilizando o anticorpo de qualquer das reivindicaes 1 a 4, em que a infecção determinada in vivo por contacto de uma amostra de um fluido corporal do referido individuo com o anticorpo, em que uma reacção imune especifica determina a infecção.
13. Preparação de diagnóstico de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, contendo opcionalmente o anticorpo com um marcador e/ou um reagente de diagnóstico adicional com um marcador e/ou uma fase ssólida para imobilizar pelo menos um dos anticorpos e o diagnóstico do reagente.
14. Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.