PT512260E

PT512260E - Vectores "pur a" estaveis e suas utilizacoes

Info

Publication number: PT512260E
Application number: PT92105887T
Authority: PT
Inventors: Robert Newton Brey Iii; James Peter Fulginiti; Algis Anilionis
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1991-05-03
Filing date: 1992-04-06
Publication date: 2001-12-28
Also published as: US5919663A; EP0512260B1; AU1595992A; TW201794B; CA2067862A1; NO314043B1; ES2160573T3; JP3320095B2; DK0512260T3; AU654347B2; US5961983A; FI921940A0; EP0512260A3; KR920021701A; DE69231907T2; CA2067862C; FI111013B; KR100242798B1; ATE202800T1; JPH05192161A

Description

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DESCRICÃO "Vectores ρι/rA estáveis e suas utilizações"

Antecedentes do Invento

Os plasmídeos que se encontram na natureza estão distribuídos por células em divisão de forma a que as células filhas recebam pelo menos uma cópia. Os sistemas plasmídícos bacterianos utilizam várias estratégias para assegurar uma correcta partição dos plasmídeos para as células descendentes. A manutenção dos plasmídeos num elevado número de cópias aumenta a probabilidade das células filhas herdarem pelo menos um píasmídeo através de distribuição aleatória de forma que a probabilidade das células descendentes não herdarem plasmídeos é extremamontc baixa. Embora os sistemas dc distribuição aleatória possam teoricamente funcionar fazendo a partição dos plasmídeos pelas células em divisão, os plasmídeos que são mantidos numa única cópia ou num número de cópias reduzido por célula têm de assentar em mecanismos de partição activos. Por exemplo, os plasmídeos que são mantidos em poucas cópias ou uma cópia por célula tais como o factor F de E. coli (incF1), o profago plasmídico P1 (incY) e RI e NR1 (incF2), têm de utilizar sistemas de partição activos para manter os plasmídeos na população de células em divisão, uma vez que a distribuição aleatória de plasmídeos preveria uma taxa dc perda de 25% por geração. Adicionalmente, alguns plasmídeos de maior número de cópias assentam em recombinases específicas para um local para resolver a formação de multímeros, o que reduz funcionalmente o número de cópias de plasmídeos em células e a sua capacidade para partição aleatória através de difusão livre. O presente invento refere-se a um píasmídeo ou vector fágico específico, um hospedeiro ou uma bactéria atenuada portadora de tal píasmídeo ou vector fágico, uma composição compreendendo a referida bactéria, a utilização de tal píasmídeo para o fabrico de um medicamento e um método para selecção e manutenção de transformantes bacterianos.

Foram descritos vários sistemas activos de partição para várias famílias de plasmídeos bacterianos. Estes sistemas partilham algumas características comuns. As funções de replicação dos plasmídeos podem usualmente ser 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 2

atribuídas a regiões distintas dos plasmídeos. As regiões de replicação do plasmídeo (rep) de, por exemplo P1 ou F, podem ser mantidas independentemente nas células. Mo entanto, os plasmídeos miniF ou miniPI sem regiões de partição são instáveis e perdem-se da população a frequências previstas a partir da distribuição aleatória. O desenvolvimento de vectores plasmídicos para a expressão bacteriana de genes heterólogos para fins comerciais tem sido extensivamente documentado. Numerosos veículos de clonagem baseados em vários replicões plasmídicos foram descritos e utilizados para a produção de proteínas em E. coli e outras bactérias. No desenvolvimento de veículos de clonagem adequados para expressão de proteínas estranhas, a estratégia usual tem sido a concepção de plasmídeos de baixo peso molecular com um número de cópias elevado ou regulado. Estas estratégias conduziram por vezes à eliminação de funções de partição que de outro modo conduziriam à herança estável de plasmídeos. Os vectores de clonagem de elevado número de cópias para a construção de organismos de produção apresentam frequentemente instabilidade segregacional. A estratégia mais comum para obtenção de uma replicação e herança estáveis de plasmídeos na população hospedeira em fermentação tem sido a inclusão de determinantes de resistência a drogas no veículo de clonagem. Embora a adição de drogas ao meio de crescimento permita a selecção de células contendo o plasmídeo, a adição de antibióticos não é aceitável em muitos casos devido ao custo e possível contaminação do produto final. Várias estratégias alternativas foram desenvolvidas para alcançar uma manutenção estável de plasmídeos durante a fermentação. Por exemplo, o locus parB de R1 foi subclonado numa variedade de vectores de clonagem plasmídicos vulgares. Os plasmídeos resultantes contendo a região parB de R1 apresentaram uma maior estabilidade quando cultivados na ausência de pressão selectiva. Igualmente, a região sop de F pode estabilizar plasmídeos oricC instáveis e a par de P1 pode estabilizar um plasmídeo miniF sem as suas próprias funções de partição. A estabilidade de vectores de clonagem contendo genes do operão do triptofano foi aumentada através da adição do locus par de pSC101 e o vector de múltiplas cópias instável derivado de p15a (pACYC184) foi estabilizado pelo locus par de pSCIOT. Outras regiões de partição, tais como 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 3

uma região de partição de um plasmídeo de virulência de Salmonella typhimurium, foram também utilizadas com sucesso para estabilizar veículos de clonagem.

Embora os veículos de clonagem possam essencialmente ser estabilizados através da adição de regiões de partição de plasmídeos estáveis, os determinantes de resistência a drogas são ainda vulgarmente utilizados durante a fermentação. Os marcadores de resistência a drogas são convenientes para a introdução de plasmídeos em células bacterianas hospedeiras. Alternativamente, os plasmídeos podem ser introduzidos em células bacterianas receptoras por complementação de mutações cromossómicas do hospedeiro por genes trazidos pelo plasmídeo. Os sistemas de complementação assentam na construção de determinadas mutações cromossómicas do hospedeiro, mas podem ser utilizados com confiança para ultrapassar a inclusão de antibióticos no meio de cultura. Por exemplo, a complementação de defeitos nutricionais pode conduzir a estabilização do plasmídeo. A complementação de uma mutação cromossómica para a semialdeído aspártico-desidrogenase (asd) em Salmonella typhimurium ou a mutação da D-alanina-racemase (dal) em Bacillus subtilis, das quais, cada uma, conduz a uma biossíntese deficiente da parede celular e a lise celular, produz uma herança estável do plasmídeo na ausência de selecção em todas as células viáveis da cultura. Ambas as mutações asd e da! podem ser fenotipicamente reparadas através de suplementação com aditivos nutricionais. Por outro lado, a complementação de um gene essencial do hospedeiro, cujo defeito não pode ser superado através de suplementação nutricional, pode também estabilizar plasmídeos. Por exemplo, é necessário um gene de E. coli, ssb, para a replicação de ADN e viabilidade celular e evita a acumulação de células sem plasmídeos durante a fermentação num biorreactor quando incorporado num plasmídeo e pode ser utilizado para complementar um defeito cromossómico de ssb. De forma análoga, uma cópia trazida por um plasmídeo de valil-ARNt-sintetase estabiliza plasmídeos em E. coli contendo uma valil-ARNt-sintetase cromossómica sensível à temperatura. Os plasmídeos podem também ser estabilizados através da inclusão de um gene repressor de bacteriófagos, cuja perda conduz a indução do profago hospedeiro e morte celular.

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EP 0 512 260/PT

Sumário do Invento O presente invento proporciona um plasmídeo ou vector fágico de acordo com a reivindicação 1.

Foi desenvolvido um sistema vector plasmídico ou bacteriófago estável para selecção e manutenção, para bactérias que podem produzir produtos génicos heterólogos durante a fermentação, ou para utilização em estabilização segregacional da produção de antigénio em vacinas bacterianas vivas atenuadas. Este sistema baseia-se na complementação de uma mutação por deleção cromossómica através da expressão de um gene funcional para a adenilossuccinato-sintetase (produto do geneprvrA).

Podem ser utilizados três métodos para proporcionar um produto do gene purA funcional (adenilossuccinato-sintetase) para selecção e manutenção. Primeiro, um plasmídeo de reduzido número de cópias pode ser utilizado como vector a partir do qual a expressão do gene purA seja suficiente para complementar o defeito cromossómico de purA sem sobrecarregar a célula com uma sobre-abundância do produto proteico de purA. Um segundo método consiste em proporcionar o gene purA num plasmídeo de elevado número de cópias a partir do qual este seja ineficientemente expresso. Isto pode ser alcançado através de qualquer um de uma variedade de métodos bem conhecidos na arte para sub-regular a expressão génica, incluindo mutagénese dirigida ao local do promotor ou de sequências de ligação a ribossomas para reduzir a eficiência da transcrição e assim da expressão do gene purA. Um terceiro método consiste em proporcionar um gene purA funcional num vector de integração, tal como um plasmídeo ou bacteriófago incapaz de se replicar dentro do hospedeiro purA receptor, e deste modo seleccionar quanto a integração do vector purA.

Este sistema elimina a necessidade de seleccionar transformantes bacterianos através de resistência a antibióticos e, para aplicação a vectores de vacinas bacterianas vivas, evita a libertação de genes de resistência a drogas no ambiente e a distribuição a outros membros da flora intestinal através de mecanismos genéticos conhecidos. O presente invento é particularmente útil na selecção e manutenção de plasmídeos ou vectores de integração em estirpes de

86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 5 vacinas bacterianas vivas atenuadas, tanto no crescimento, na produção de vacinas, como nas fases de distribuição do antigénio no hospedeiro vacinado.

Breve Descricão das Figuras A Figura 1 apresenta a construção do plasmídeo pPX3001 contendo o gene purA de E. coli sob o controlo do promotor lacZ. A Figura 2 apresenta a construção do plasmídeo pPX3003 contendo o gene purA de E. coli e o gene que codifica a subunidade de ligação da enterotoxina sensível ao calor (LT-B) de E. coli, sob o controlo do promotor lacZ. A Figura 3 é um gráfico da percentagem de células SL5653 de S. dublin possuindo os plasmídeos purA sob condições selectivas (sem adição de adenina) e não selectivas (com adição de adenina). A Figura 4A apresenta um gel de SDS-poliacrilamida das proteínas celulares totais de culturas de SL5653/pPX3003 com crescimento em meios contendo adenina ( + ad) ou sem adenina (-ad). A Figura 4B mostra um "Western blot" das proteínas celulares totais de SL5653/pPX3003 sondado com anti-soro de cabra anti-LT-B e visualizado com proteína A marcada com HRP. A Figura 5 apresenta a construção de dois vectores plasmídicos de reduzido número de cópias. O plasmídeo pPX3005 contém a sequência completa de codificação de LT-B e um determinante de resistência à canamicina. O plasmídeo pPX3006 contém o gene purA sob o controlo do promotor lacZ. A Figura 6 apresenta a construção de três vectores plasmídicos purA contendo a sequência de codificação de LT-B (pPX3010), o gene da proteína do circunsporozoíto da malária (CS) (pPX3009) e a sequência nucleotídica que codifica uma proteína de fusão LT-B/CS (pPX3007).

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EPO 512 260/PT 6 A Figura 7 apresenta os resultados de estudos de estabilização in vivo de estirpes de Salmonella typhimurium através de complementação de purA. S. typhimurium recuperada de A: baços, B: fígados e C: placas de Peyer. A Figura 8 apresenta os resultados de estudos de estabilização in vivo de estirpes de S. typhi através de complementação de purA. S. typhi recuperada de A: fígados e B: baços.

Descrição Detalhada do Invento São descritos vectores plasmídicos estáveis para a complementação de mutações cromossómicas por deleção no locus purA. Estes vectores podem ser utilizados como meio para selecção de clones possuindo marcadores não seleccionáveis ou outros genes passageiros durante a construção do clone. Os vectores do presente invento podem também ser utilizados para a manutenção destes clones durante o crescimento para amplificação de culturas, produção de estirpes de vacinas e isolamento de produtos génicos.

Os vectores purA estáveis do presente invento proporcionam um gene purA funcional que é capaz de expressar adenilossuccinato-sintetase, reparar qualquer defeito na biossíntese de purinas e permitir o crescimento. Pelo contrário, em estirpes com um gene purA deficiente, as necessidades de purinas apenas podem ser satisfeitas através de suplementação nutricional com adenina ou adenosina extracelular. Assim, o crescimento de células possuindo o vector purA, em meio deficiente em adenina assegura a selecção e manutenção contínuas do vector plasmídico. As deleções do gene purA do hospedeiro são preferidas uma vez que estas mutações não revertem. As deleções extensas são preferíveis porque estas eliminam a homologia extensa entre o plasmídeo purA e o cromossoma, o que podia conduzir a integração cromossómica do plasmídeo e a recuperação do marcador do gene purA num duplo acontecimento de troca ("crossover") com concomitante perda do gene passageiro expresso. A utilização de um gene purA de complementação a partir de uma fonte bacteriana heteróloga reduz a frequência destes possíveis acontecimentos de recombinação homóloga indesejados.

Este sistema baseia-se na complementação de uma mutação cromossómica por deleção através de expressão de um gene funcional para a

06 194 ΕΡ 0 512 260/ΡΤ 7 adenilossuccinato-sintetase (produto do gene purA). O locus purA é especialmente importante na concepção de vectores de vacinas entéricas vivas atenuadas ds Salmonella e outras relacionadas uma vez que a presença de mutações de purA no cromossoma conduz a atenuação da virulência. In vivo, a presença de purA num vector plasmídico ou bacteriófago que codifique também para a expressão de pelo menos um imunogénio polipeptídico, evita o aparecimento de organismos sem expressão de imunogénio no hospedeiro vacinado. Quando combinado com outros loci atenuantes, tais como os que determinam necessidades auxotróficas para compostos aromáticos, purA conduz a maior atenuação da virulência. A deleção cromossómica destes genes conduz à diminuição da capacidade de replicação dentro do hospedeiro, devido à ausência de disponibilidade de purinas livres (tais como adenina ou adenosina) ou de percursores de vitaminas (tais como o ácido fólico) os quais são dependentes da biossíntese de compostos aromáticos. Assim, as Salmonella typhimurium possuindo mutações por deleção em ambos aroA e purA são ineficazes na indução de uma resposta imunitária significativa dirigida contra a bactéria, enquanto que as bactérias possuindo apenas defeitos em genes biossintéticos aromáticos (tal como aroA) são eficazes na indução de respostas imunitárias. Embora as Salmonella possuindo mutações em aroA sejam capazes de replicar até certo ponto intracelularmente, as que contêm mutações adicionais em purA são completamente incapazes de replicar dentro do hospedeiro. Proporcionando o produto de purA de E. Coli, situado num plasmídeo, uma bactéria hospedeira aro purA, a vacina complementada tem propriedades de crescimento in vivo idênticas às do mutante Aro. Vários métodos gerais para selecção e estabilização da expressão são aqui descritos utilizando veículos plasmídicos de reduzido número de cópias, veículos plasmídicos de elevado número de cópias e vectores que permitem a recuperação de acontecimentos de integração cromossómicos de uma única cópia. No caso de vectores de reduzido número de cópias, a complementação de defeitos cromossómicos em purA pode proporcionar uma estabilidade adicional a plasmídeos contendo também loci de partição funcionais.

No caso dos vectores de elevado número de cópias do presente invento o gene purA está de preferência mutado para reduzir a eficiência da expressão do produto génico e evitar assim inibição de crescimento por efeitos prejudiciais de uma sobreabundância da enzima adenilossuccinato-sintetase (purA).

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Construção de Vectores Plasmídicos purA

Foi empregue tecnologia de ADN recombinante na construção dos plasmídeos purfk. As técnicas recombinantes envolvem inserção de sequências específicas de ADN num veículo de ADN (vector) para formar uma molécula de ADN recombinante capaz de replicar numa célula hospedeira. A sequência de ADN inserida pode ser estranha ao veículo de ADN receptor, i.e., a sequência de ADN inserida e o vector de ADN são derivados de organismos que não trocam informação genética na natureza, ou a sequência de ADN inserida pode ser total ou parcialmente feita de modo sintético. Foram desenvolvidos vários métodos gerais que permitem a construção de moléculas de ADN recombinante.

Independentemente do método utilizado para a construção, a molécula de ADN recombinante tem de ser compatível com a célula hospedeira, i.e., capaz de replicação autónoma na célula hospedeira ou de se integrar estavelmente num ou mais dos cromossomas ou plasmídeos da célula hospedeira. A molécula de ADN recombinante deve de preferência ter também uma função marcadora que permita a selecção da(s) molécula(s) de ADN recombinante desejados. Adicionalmente, se todos os sinais correctos de replicação, transcrição e tradução forem correctamente dispostos no vector recombinante, o gene estranho será correctamente expresso, e.g., nas células bacterianas transformadas, no caso de plasmídeos de expressão bacteriana, ou em linhas celulares permissivas ou hospedeiros infectados com um vírus recombinante ou portadores de um plasmídeo recombinante possuindo a origem de replicação apropriada.

Diferentes sinais genéticos e acontecimentos de processamento controlam os níveis de expressão génica tais como a transcrição do ADN e a tradução do ARN mensageiro (ARNm). A transcrição do ADN está dependente da presença de um promotor, o qual é uma sequência de ADN que dirige a ligação da ARN-polimerase e deste modo promove a síntese de ARNm. A sequência de ADN de promotores eucarióticos difere das dos promotores procarióticos. Para além disso, os promotores eucarióticos e os sinais genéticos acompanhantes podem não ser reconhecidos ou podem não funcionar num sistema procariótico, e além disso, os promotores procarióticos não são reconhecidos e não funcionam em células eucarióticas.

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De forma semelhante, a tradução de ARNm em procariotas depende da presença dos sinais procarióticos oorrectos, os quais diferem dos dos eucariotas. Uma tradução eficiente de ARNm em procariotas requer um local de ligação a ribossomas chamado sequência de Shine-Dalgarno (S/D) (J. Shine e L. Dalgarno, Nature, 254: 34-38 (1975)) no ARNm. Esta sequência é uma sequência nucleotídica curta de ARNm que se localiza antes do codão de iniciação, usualmente AUG, a qual codifica a (formil-)metionina amino-terminal da proteína. As sequências S/D são complementares à extremidade 3' do ARNr 16S (ARN ribossómico) e provavelmente promovem a ligação do ARNm aos ribossomas através da formação de dúplices com o ARNr para permitir o posicionamento correcto do ribossoma. A expressão bem sucedida de um gene clonado requer suficientes transcrição de ADN, tradução do ARNm, e nalguns casos, modificação pós-tradução da proteína. Foram utilizados vectores de expressão para expressar genes sob o controlo de um promotor activo num hospedeiro adequado e para aumentar a produção proteica.

Podem ser utilizados vários elementos reguladores da expressão, os quais são qualquer um de vários elementos adequados de transcrição e tradução que são activos em bactérias. Por exemplo, os promotores que podem ser utilizados para dirigir a expressão da sequência génica recombinante incluem, mas não se lhes limitam, o promotor do operão da lactose de E. coli, o promotor híbrido trp-tac de UV-5 (tac) (H. DeBoer, et a/., Em Promoter Structure and Function, (1982); R.L. Rodriguez e M.J. Chamberlain, eds., Praeger Publishing, New York), os promotores à direita (PL) e á esquerda (PR) do bacteriófago lambda, promotores do bacteriófago T7, promotor do operão trp, o promotor de Ipp (promotor do gene da lipoproteína de E. coli; K. Nakamura e I. Inouye, Cell, 18: 1109-1117 (1979), etc. Outros promotores produzidos através de técnicas de ADN recombinante ou sintéticas podem também ser utilizados para proporcionar a transcrição das sequências inseridas. São também necessários sinais de iniciação específicos para uma tradução eficiente das sequências de codificação da proteína inseridas. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos em que as sequências génicas nativas que codificam o seu próprio codão de

86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ iniciação e sequências adjacentes são inseridas nos vectores de expressão apropriados, podem não ser necessários sinais de controlo da tradução adicionais. No entanto, nos casos em que os sinais de tradução nativos não estão presentes, têm de ser proporcionados sinais de controlo da tradução exógenos, incluindo o codão de iniciação ATG. O codão de iniciação tem, para além disso, de estar em fase com o enquadramento de leitura das sequências de codificação da proteína para assegurar a tradução de toda a inserção. Estes sinais de controlo da tradução exógenos e codões de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais como sintéticas.

Os métodos para a construção de vectores de expressão apropriados podem incluir técnicas de ADN recombinante e sintéticas in vitro e recombinações in vivo (recombinação genética).

Para revisões sobre a maximização da expressão génica, ver Roberts e Lauer, Meth. Enzymol, 68: 473 (1979); e W. Reznikoff e M. Gold, Maximizing Gene Expression, Plenum Press, New York (1986). A Patente U.S. N° 4237224 de Cohen e Boyer descreve a produção de plasmídeos recombinantes utilizando processos de clivagem com enzimas de restrição e união com ADN-ligase através de métodos conhecidos de ligação. Estes plasmídeos recombinantes são então introduzidos por meio de transformação e replicados em culturas unicelulares incluindo organismos procarióticos e células eucarióticas crescidas em cultura de tecidos.

Outro método para a introdução de moléculas de ADN recombinante em organismos unicelulares é descrito por Collins e Hohn na Patente U.S. N° 4304863. Este método utiliza um sistema de empacotamento/transdução com vectores bacteriófagos (cosmídeos). 0 vector de expressão compreendendo a sequência génica recombinante deve então ser transferido para uma célula hospedeira bacteriana onde pode replicar e ser expresso ou sofrer replicação condicional. Isto pode ser alcançado através de qualquer um de vários métodos conhecidos na arte incluindo, mas não se lhes limitando, transformação (p. ex., de ADN plasmídico isolado para o hospedeiro bacteriano atenuado), transdução fágica (Schmeiger, MoL Gen.

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Genetics, 119: 75 (1972)), conjugação entre espécies hospedeiras bacterianas, electroporação, etc.

Expressão em Bactérias Invasivas Atenuadas

Numa concretização preferida do presente invento, o vector de expressão compreendendo o gene purk é transferido para uma bactéria invasiva atenuada, onde é expresso, produzindo assim uma estirpe bacteriana adequada para utilização como vacina viva.

Qualquer uma de várias bactérias invasivas atenuadas pode ser utilizada como veículo para expressar o(s) gene(s) recombinante(s) de forma a que o antigénio heterólogo seja eficazmente apresentado ao sistema imunitário do hospedeiro, nas formulações de vacinas do presente invento. As bactérias mantêm as suas propriedades invasivas, mas perdem em grande parte as suas propriedades virulentas, permitindo-lhes assim multiplicar-se no hospedeiro até certo ponto, mas não o suficiente para causar doença ou desordem significativas. Exemplos de bactérias invasivas que, nas formas atenuadas, podem ser utilizadas em formulações de vacina do presente invento incluem, mas não se lhes limitam, Salmonella spp., E. coli invasiva (EIEC) e Shigella spp. Numa concretização preferida, são utilizadas bactérias invasivas que residem em tecidos linfóides tais como o baço (p. ex. Salmonella spp.). Tais bactérias podem invadir o tecido epitelial do intestino e/ou as placas de Peyer, disseminar-se através do sistema reticuloendotelial e ganhar acesso ao tecido linfóide mesentérico, fígado e baço, onde se multiplicam, ou pelo menos sobrevivem durante um tempo, e induzem imunidade humoral e mediada por células.

Podem ser obtidas bactérias invasivas atenuadas através de numerosos métodos incluindo, mas não se lhes limitando, mutagénese química, inserção genética, deleção (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) ou metodologia de ADN recombinante (T. Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), selecção laboratorial de mutações naturais, etc. Métodos para a obtenção de estirpes de Salmonella atenuadas que sejam mutantes não revertentes, não virulentos, auxotróficos, adequados para utilização como vacinas vivas são descritos nas Patentes U.S. 12 8G 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ

Nos 4550081 (concedida a 29 de Outubro de 1985), 4735801 (concedida a 5 de Abril de 1988) e 4837151 (concedida a 6 de Junho de 1989). Um método fiável paro alcançar a atenuação de Salmonel/a foi também descrito (S.K. Hoiseth e B.A.D. Stocker, Nature, 291: 238 (1981); B.A.D. Stocker et aL, Develop. Biol. Standard, 53: 47 (1982)) e pode ser utilizado numa concretização particular do presente invento.

As Salmonella atenuadas que podem ser utilizadas nas formulações de vacinas vivas do presente invento incluem, mas não se lhes limitam, as espécies listadas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 ESPÉCIES DE SALMONELLA QUE, NAS FORMAS ATENUADAS, PODEM SER UTILIZADAS NAS FORMULAÇÕES DE VACINA DO PRESENTE INVENTO* S. typhi S. typhimurium S. paratyphi A S, paratyphi B S, enteriditis (p. ex., serótipo dublin) 'Para uma descrição completa dos serótipos de Salmonella, ver Edward e Ewing, 1 986, Classification of the Enterobacteriaceae, 4a ed. Elsevier, N.Y.

Em concretizações específicas, podem ser utilizadas bactérias de Salmonella que foram atenuadas por deleção cromossómica de (um) gene(s) para a biossíntese de compostos aromáticos (aro), ou mutação no gene galE, ou que são Cya-, Crp- ou falta-lhes o plasmídeo Vir, etc. Os mutantes aro que podem ser utilizados incluem, mas não se lhes limitam, as estirpes 543Ty e 541 Ty de S. typhi, para utilização em vacinas para humanos, e S. typhimurium SL3261 e SL1479, e 5. enteriditis serótipo dublin SL1438 (também designada S. dublin) para utilização em animais. (Ver Patente U.S. N° 4550081 para uma descrição de estirpes de S. typhimurium tais como 543Ty e 541 Ty que são avirulentas em humanos em virtude de atenuação por deleção afectando os genes aroA e/ou purA (M.M. Levine, et aL, J. C/in. Invest., 79: 888 (1987)). Mutantes de S. dublin, tais como SL1438, e de S. typhimurium, tais como 13 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ SL3261, podem ser utilizados^ no desenvolvimento de sistemas modelo animais, uma vez que estas espécies são capazes de causar doenças em animais equivalentes à febre tifoide. Os mutantcs galE que podem ser utilizados incluem, mas não se lhes limitam, Salmone/la typhi estirpes Ty21a (Germanier, Bactéria Vaccines, Academic Press, NY págs. 137-165) Salmonella typhimurium G30D, etc.

Expressão de Produtos Génicos e Utilizações O presente invento refere-se também a métodos para introdução, selecção e manutenção de cópias únicas ou múltiplas de genes homólogos e/ou heterólogos, em plasmídeos de reduzido número de cópias, plasmídeos de elevado número de cópias ou integrados no cromossoma bacteriano do hospedeiro como cópias únicas ou múltiplas.

Os genes expressáveis podem ser derivados de fontes eucarióticas e podem codificar determinantes antigénicos de parasitas patogénicos, péptidos e proteínas humanos imunoactivos, hormonas, factores de crescimento, alérgenos, antigénios associados a tumores e outras proteínas. Tais genes podem ser derivados de fontes virais e podem codificar proteínas antigénicas, componentes estruturais ou enzimas envolvidos na replicação ou acoplamento virai. Os genes homólogos bem como os genes heterólogos podem ser derivados de fontes bacterianas, virais, de parasitas, fúngicas ou de mamífero e podem incluir genes que codifiquem factores de virulência de organismos patogénicos, incluindo toxinas, proteínas imunogénicas protectoras ou genes que codifiquem proteínas envolvidas na regulação ou síntese de material polissacárido antigénico e, adicionalmente, podem ser enzimas estranhas à bactéria hospedeira.

Entre os antigénios bacterianos de interesse estão os associados aos patogénios bacterianos humanos incluindo Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Nfíissaria meningiditis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhame/la catarrhalis, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Clostridium tetani. Exemplos de antigénios bacterianos específicos de interesse incluem proteínas bacterianas das quais constituem exemplos particularmente úteis as proteínas da membrana externa (p. ex., de Haemophilus influenzae, Branhame/la catarrhalis ou Neissería meningiditis), toxinas bacterianas (e.g., toxinas da tosse convulsa, toxina da difteria, toxina do tétano e exotoxina A de Pseudomonas) e proteínas de superfície bacteriana (p. ex., flagelinas, hemaglutininas e a proteína M de Streptococcus pyogenes).

Os antigénios virais de vírus patogénicos incluem, mas não se lhes limitam, vírus da imunodeficiência humana (tipos I e II), vírus da leucemia das células T humana (tipos I, II e III), vírus do sincício respiratório, vírus da hepatite A, hepatite B, hepatite C e hepatite não A e não B, vírus do herpes simples (tipos I e II), citomegalovírus, vírus da influenza, vírus da parainfluenza, poliovírus, rotavírus, coronavírus, vírus da rubéola, vírus do sarampo, vírus da varicela, vírus de Epstein-Barr, adenovírus, vírus do papiloma e vírus da febre amarela. Vários antigénios virais específicos destes vírus patogénicos incluem a proteína F (especialmente antigénios contendo o péptido F 283-315, descrito em W089/02935 intitulado "Respiratory Syncytial Virus: Vaccines and Diagnostic Assays" por Paradiso, P. et al.) e as proteínas N e G do vírus do sincício respiratório (RSV), os polipéptidos VP4 (anteriormente conhecido como VP3), VP6 e VP7 de rotavírus, glicoproteínas do envelope do vírus da imunodeficiência humana e os antigénios de superfície e pré-superfície da hepatite B e as glicoproteínas B e D do herpes.

Os antigénios fúngicos que podem ser utilizados são os derivados de fungos incluindo, mas não se lhes limitando, Candida spp. (especialmente a/bicans), Cryptococcus spp. (especialmente neoformans), Bfastomyces spp. (p. ex. dermatitidis), Histoplasma spp. (especialmente capsulatum), Coccidioides spp. (especialmente immitis), Paracoccidioides spp. (especialmente brasi/iensis) e Aspergillus spp. Exemplos de antigénios de parasitas incluem, mas não se lhes limitam, Pfasmodium spp., Eimeria spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Babesia spp., Leishmania spp., Cryptosporídia spp., Toxoplasma spp. e Pneumocystis spp. São também de interesse vários antigénios associados a doenças auto-imunes, tais como artrite reumatóide e lúpus eritematoso, antigénios tumorais, antigénios de cancro e cópias únicas ou múltiplas de genes que 15 80 194 ΕΡ 0 512 260/ΡΤ codificam hormonas, péptidos bioactivos, citóquinas, linfóquinas e factorlís de crescimento, bem como enzimas e proteínas estruturais de origem procariótica ou cucariótica, especialmente para utilização em vacinas ou fármacos.

Para proporcionar novas formulações de vacinas, os genes que codificam antigénios protectores podem ser introduzidos em bactérias atenuadas, as quais actuam como veículos de distribuição para estimulação de respostas imunitárias contra o patogénio do qual o gene expresso foi derivado. Ver Dougan e Tite, Seminars in Virology 1: 29 (1990). Os genes que codificam antigénios derivados de fontes patogénicas bacterianas, virais ou parasitárias podem ser introduzidos em Salmonella typhi atenuada para utilização como vacinas vivas em humanos, para proteger contra, por exemplo, a febre tifoide, doenças de diarreia e doenças sexualmente transmitidas incluindo a SIDA. Alternativamente, tais genes podem ser introduzidos em outras Salmonella capazes de infectar espécies animais, p. ex.. S. dublin para utilização como vacinas vivas atenuadas para gado vacum (p. ex., contra doença de embarque ou rotavírus bovino), S. choleraesuis para utilização como vacinas vivas atenuadas para suínos e S. gallinarum ou S. pullorum para utilização como vacinas vivas atenuadas para aves domésticas. Numa concretização particular, os antigénios derivados de parasitas Eimeria podem ser introduzidos em S. gallinarum atenuada para produzir uma vacina oral para a doença provocada por coccídios.

Alternativamente, os genes que codificam antigénios podem ser introduzidos noutras bactérias para serem utilizadas como veículos de distribuição de vacinas vivas. Exemplos destes podem incluir Escheríchia coli, Yersinia enteroco/itica, Shige/la flexneri, Shigefla dysenteriae, Campylobacter jejuni e Vibrio cholerae enteroinvasivas.

Adicionalmente, tais genes podem ser introduzidos em hospedeiros bacterianos para proporcionar uma produção eficiente de material antigénico para produção de vacinas. A expressão de genes nativos ou mutados derivados de patogénios bacterianos pode resultar numa maior e eficiente produção de antigénios. Por exemplo, genes que codificam toxinas, genes que codificam factores de virulência ou outras proteínas nativas ou imunogénios protectores mutados podem ser introduzidos em estirpes bacterianas homólogas ou heterólogas. hm muitos casos, os factores de virulência ou os antigénios

86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 16 protectores podem ser produzidos eficientemente apenas numa deterffíiieda bactéria hospedeira. Adicionalmente, os genes que codificam produtos envolvidos em vias biossintética3 complexas que conduzem à produção de polissacárido da superfície bacteriana ou cápsula não podem ser prontamente clonados e expressos noutras bactérias com o objectivo de produção de material antigénico para utilização em vacinas. Exemplos de tais utilizações incluem a introdução de genes que codificam toxinas mutantes de reacção cruzada de Bordetella pertussis em organismos deficientes em toxina para a produção de uma vacina para a tosse convulsa.

As bactérias que possuem os plasmídeos estáveis purk do presente invento podem ser utilizadas como vacinas vivas para eliciar uma resposta imunitária a um imunogénio num animal de sangue quente. O método compreende a administração da vacina viva ao animal de forma a que a bactéria contida na composição de vacina possa expressar o imunogénio numa dose imunologicamente eficaz capaz de eliciar uma resposta imunitária. As vacinas são úteis para prevenção de infecções microbianas. As vacinas podem ser administradas num veículo farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina fisiológica ou polióis de etanol (tais como glicerol ou propilenoglicol).

As vacinas podem ser administradas a um humano ou animal numa variedade de modos. Estes incluem as vias de administração intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral e intranasal. A quantidade de bactérias vivas atenuadas empregues numa tal vacina variará dependendo da identidade do antigénio expresso. O ajuste e a manipulação das gamas de dosagem estabelecidas está bem dentro das capacidades dos peritos na arte. Pretende-se que as vacinas vivas do presente invento sejam para utilização no tratamento de animais de sangue quente tanto imaturos como adultos e em particular humanos.

Tipicamente, os regimes de vacinação exigem a administração de antigénio durante um período de semanas ou meses de forma a estimular uma resposta imunitária "protectora". Uma resposta imunitária protectora é uma resposta imunitária suficiente para proteger o organismo imunizado contra infecção produtora por um determinado patogénio ou patogénios para os quais a vacina é dirigida. 17 80 134

EPO 512 260/PT O presente invento será ainda ilustrado através da seguinte exemplificação a qual não deve ser entendida como limitante do âmbito do presente invento:

Exemplificação

MATERIAIS E MÉTODOS

Estirpes Bacterianas e Plasmídeos

As estirpes bacterianas e os plasmídeos estão descritos na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2. Estirpes utilizadas no desenvolvimento de plasmídeos de expressão estáveis para estirpes de vacina de Salmonella designação da espécie/estirpe genótipo

Escherichia coli JM103 TX595 ΤΧ595.λΡΒ100 supE thi A(lac-proAB)hsdR4/F'[traDproAB+laci9 lacZm 15 purA::mudlac T (amp'l purA::mudlac Tr (ampr) λΡΒΙΟΟ (cmr) espécies de Salmonella S. typhimurium SL5495 zbj-908::Tn10 purAA\ 55 SL3261 hisG46 aroAOELAOl SL3261 pur hisG46 aroADEL407 CRR[zbj-908::Tn10]Tcs purAA 155 S. dublin SL5653 SVA47 aroAA 148 CRR[zbj-908::Tn10]Tcs pu/ΑΔΙ 55 S. typhi CDC10-80 tipo selvagem 679Ty aroA DEU 48 BB1333 a/O/4DEL148 aroDA9 BB1354 aroy4DEL148 aroDA9 CRR[zbj-908::Tn10]Tcs purΑΔ155

Meios e Crescimento de Bactérias

As bactérias cresceram em meio M9 suplementado com 0,5% de casaminoácidos, 0,2% de glucose, MgS04.7H20 a 0,02%, 5 μg/ml de tiamina, citrato de sódio 1 mM, 5 μg/ml de ácido nicotínico, fenilalanina, tirosina e triptofano, cada um a 30 pg/ml, 10 pg/ml de ácido 2,3-di-hidroxibenzóico, 10 pg/ml de ácido para-aminobenzóico e 1 pg/ml de adenina. As placas continham 15 g de ágar por litro. A ampicilina foi adicionada a 100 μg/ml.

Transformação e Transducão Genéticas

Os plasmídeos foram introduzidos directamente em Salmonel/a por electroporação com um Transfector BTX 100 com o eléctrodo de 0,5 mm e uma intensidade de campo de 15 kV/cm.

As construções plasmídicas resultantes da ligação de oligonucleótidos sintéticos a plasmídeos foram inseridas em estirpes laboratoriais vulgares de Escherichia coli por transformação (para detalhes, ver Maniatis et a/., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). As construções plasmídicas foram isoladas e caracterizadas primeiro em E. coli, antes da transferência para Salmone/la spp., devido às altas frequências de transformação de E. coli K-12 relativamente às de S. typhimurium. Os plasmídeos foram transferidos para S. typhimurium LT-2 LB5010, uma estirpe que é negativa quanto a restrição (mas competente quanto a modificação) para os três sistemas de restrição de Salmonella typhimurium e que contém também uma mutação em ga/E que resulta em maiores frequências de transformação (para uma descrição de sistemas de restrição de Salmonella typhimurium, ver Bulias et a!., J. BacterioL, 141: 275 (1980)).

Os plasmídeos foram então inseridos em Salmonella atenuada através de técnicas de transducão. A LB5010 contendo o plasmídeo desejado cresceu em caldo de Luria (LB) até uma densidade de 3 χ 108 células/ml, ponto em que foi adicionada D-galactose (até uma concentração final de 1 %) ao meio de crescimento para induzir a síntese de lipopolissacáridos (LPS) "liso". Após 1,5 horas de crescimento na presença de D-galactose, foi adicionado à cultura

86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 19 bacteriófago Ρ22 ΗΤ 105/1 int até uma multiplicidade de infecção de um. Após absorção do fago, as células foram imobilizadas em LB contendo 0,7% de ágar. Os fagos foram colhidos e utilizados para transduzir plasmídeos em Salmonella atenuada sensível a P22. Métodos de Electrotransferência para Deteccão de Antiqénios A síntese de proteínas recombinantes heterólogas foi detectada em células hospedeiras de estirpes de vacina de E. coli e Salmonella efectuando a transferência de amostras proteicas separadas por electroforese em gel de poliacrilamida para membranas de nitrocelulose, bloqueando com Tween-20 a 1,5% em PBS, seguido de ligação ao anticorpo em Tween-20 a 0,1%. O Φ anticorpo ligado foi detectado com Proteína A marcada com peroxidase de rábano (Kirkgaard e Perry, Gaithersburg, MD). Para detecção do antigénio LT-B, o anticorpo primário era reagente α-LT-B de cabra policlonal, parcialmente purificado através da eluição do material ligado de uma coluna de afinidade de Sepharose 4B-proteína A.

Análise com Enzimas de Restrição A electroforese em gel horizontal de ADN foi efectuada utilizando métodos Standard (Maniatis, et a!., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, NY). As enzimas de restrição foram adquiridas a Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) e New England Biolabs Inc. (Beverly, MA). •

Testes de Estabilidade !n Vitro

Os testes de estabilidade para estirpes contendo plasmídeos foram efectuados utilizando diluições de 1:1000 de culturas de um dia para o outro em meio M9 suplementado como acima descrito. As diluições foram plaqueadas em duplicado sobre meios selectivos e não selectivos para determinar a retenção de plasmídeo. Adicionalmente, colónias de placas não selectivas foram replicadas utilizando um RepliPlate FMC (Rockland, ME) sobre placas selectivas para verificar a retenção de plasmídeo.

86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 20

Imunização de Ratinhos

Os inóculos foram postos a crescer em meio M9 suplementado tal como acima descrito até uma densidade de 3 χ 108 organismos/ml tal como determinado por um Colorímetro Klett-Sommerson. As células foram sedimentadas em peletes a 5000 rpm durante 1 5 min a 4°C e ressuspensas em bicarbonato de sódio a 1,5% (p/v) até 2 χ 1010 organismos/ml (Klett 100) para inoculação intragástrica (i.g.) e em solução salina tamponada com fosfato pH 7,2 até 1 χ 107 organismos/ml para inoculação intravenosa (i.v.) e intraperitoneal (i.p.). Foram utilizados rotineiramente ratinhos fêmea BALB/c de seis semanas de idade (Jackson Laboratories). Foram-lhes negadas comida e água durante 4 horas antes da inoculação i.g. e devolvidas 30 min após a inoculação. Foram administrados i.g. 1 χ 1010 organismos/ml (0,5 ml de inoculo) utilizando uma agulha de intubação Perfektum (18G χ 2"). Foram utilizados 1x10® organismos/ml (0,1 ml) para as inoculações i.v. e i.p.

Recolha de Espécimes

Os ratinhos foram sacrificados a vários tempos após a inoculação. O fígado, o baço e 3 placas de Peyer foram removidos de cada animal, colocados em sacos estéreis individuais e homogeneizados durante 30 s com um misturador Stomacher Modelo 80 (A.J. Seward, London) utilizando 5 ml de PBS (pH 7,2) para cada amostra de fígado e 2 ml para cada amostra de baço e de placas de Peyer.

Colonização Bacteriana e Estabilidade Plasmídica

Os homogeneizados de órgãos foram plaqueados em meio M9 selectivo e não selectivo suplementado tal como acima descrito para determinar a retenção de plasmídeos. As colónias que cresceram em placas não selectivas foram replicadas sobre ágar SS (Difco, Detroit, Michigan) e sobre placas selectivas para verificar a percentagem de colónias contendo plasmídeos. 21 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ

RESULTADOS

Complementacão de auxotrofia para purA em E. coli e Salmonella 0 produto do gene purA, adenilossuccinato-sintetase (EC 6.3.4.4) catalisa a síntese de adenilossuccinato a partir de inosina-monofosfato (IMP). Esta enzima catalisa o primeiro passo obrigatório na síntese de adenina-monofosfato (AMP) e está também envolvida em vias de recuperação e na interconversão de nucleótidos. Os mutantes de E. coli e de outras bactérias entéricas Íntimamente relacionadas deficientes no gene estrutural para a adenilossuccinato-sintetase (purA) dependem de adenina exógena ou adenosina, fornecida nutricionalmente, para crescerem. 0 gene para purA de E. coli está contido dentro de um fragmento de enzima de restrição Kpn\ de 3,2 quilo-pares de bases no plasmídeo pJS76 (Wolfe, S.A. e J.M. Smith, "Nucleotide sequence and analysis of the purA gene encoding adenylsuccinate synthetase of Escherichia coli K12”, J. Biol. Chem. 263: 19147-19153 (1988)). Para a construção de plasmídeos que complementem as auxotrofias para purA de E. coli ou Salmonella, o plasmídeo pJS76 (obtido de John M. Smith, Seattle Biomedical Research Institute), foi utilizado como fonte do produto do gene purA de E. coli. Inicialmente, o gene purA foi inserido em pUC19 através de ligação de um fragmento Acc\ de 1,75 quilo-pares de bases de extremidades lisas com o fragmento Dra\-Sma\ de pUC19, tal como esquematizado na Figura 1. 0 plasmídeo pPX3001 foi recuperado em E. coli TX595 através de selecção de colónias independentes de adenina. Esta construção inicial, pPX3001, reteve essencialmente a origem de replicação do vector pUC inicial e substituiu o gene da β-lactamase por purA, enquanto reteve ao mesmo tempo vários locais de clonagem úteis para posterior modificação do plasmídeo. Este plasmídeo complementou eficazmente o defeito do gene purA em E. coli TX595 e resultou num fenótipo de plasmídeo de elevado número de cópias característico dos plasmídeos pUC. O plasmídeo pPX3001 foi ainda modificado para conter um produto génico expresso adicional. O gene para a subunidade atóxica da toxina enterotoxigénica lábil de E. coli (LT-B) num EcoH\-Hind\\\ de 600 pares de bases de extremidades lisas foi clonado em pPX3001, utilizando um local BamH\ de

06 194

EPO 512 260/PT 22 extremidades lisas, tal como mostrado na Figura 2. Esta construção plasmídica, pPX3003, foi recuperada através da transformação de E. coli TX595 e selecção de clones independentes de adenina que expressavam a proteína reconhecida em manchas de colónias por anticorpos policlonais anti-LT-B.

Para examinar a estabilidade do vector purA, o plasmídeo pPX3001, e o plasmídeo de expressão de LT-B derivado pPX3003, foram transformados em S. dublin SL5653 ou em S. typhimurium BB1231, derivados de estirpes de vacina de Salmonella possuindo mutações por deleção no gene purA. Os transformantes de Salmonella foram examinados quanto à presença dos plasmídeos antecipados através de análise do ADN e, no caso de pPX3003, quanto à expressão de LT-B. Isolados adequados de cada estirpe foram examinados quanto à retenção de plasmídeo após passagem in vitro sob condições selectivas e não selectivas. Tal como demonstrado na Figura 3, as colónias contendo plasmídeos cresceram inicialmente sob condições selectivas, e.g., em meio definido sem adenina, em culturas de um dia para o outro. As amostras em culturas de um dia para o outro foram lavadas e diluídas em meio fresco com ou sem suplementação de adenina. Após 10 gerações de crescimento, as culturas foram transferidas para um meio fresco semelhante. A cada aumento de 10 gerações, foram retiradas amostras das culturas, diluídas e plaqueadas sobre meio de ágar selectivo e não selectivo. A proporção de colónias capazes de crescer em meios não suplementados representa a porção da população da cultura que contém um plasmídeo complementador de purA. Em meio não suplementado, 100% das colónias contêm plasmídeos complementadores de purA, enquanto que apenas uma pequena percentagem das colónias resultantes de passagem sob suplementação de adenina (condições não selectivas) contém plasmídeos após 40 gerações de crescimento. Ainda, em culturas de SL5653 contendo o plasmídeo de expressão de LT-B pPX3003, a expressão de LT-B e antigenicidade é mantida na cultura que cresceu sob condições selectivas, mas perde-se sob condições não selectivas. Após 40 gerações, cada uma das colónias de pPX3003/SL5653 que cresceram sob condições selectivas, que surge em ágar selectivo, expressa LT-B indicando ausência de segregação de purA e expressão de LT-B. (Ver Tabela 3 e Figura 4). 23 86 194

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Tabela 3. Manutenção de plasmídeos de expressão de médio e de elevado número de cópias durante a cultura de Salmoneffa sob condições de cultura selectivae c não sclectivas

Designação do plasmídeo derivado de marcador/gene expresso estirpe hospe deira Condições de selecção % de colónias contendo plasmídeos gerações de crescimento1 10 20 30 40 80 PUC Amp SL3261 + amp 100 100 100 100 100 -amp 50 63 50 43 n.d. pPX100 pUC8 AmpILl-B SL3261 + amp 100 100 100 100 100 -amp 58 n.d. 71 41 n.d. pPX1601 pBR322 Amp/CS-LT-B SL3261 + amp 100 100 100 100 100 -amp 100 100 85 54 33 PPX3001 pUC8 purA SL5653 -ade 100 100 100 100 100 -i-ade 92 46 11 4 n.d. pPX3003 pUC8 purAIU-B SL5653 -ade 100 100 100 100 100 -fade 48 10 6 1 n.d. 1 o teor de plasmídeos foi avaliado através da enumeração de colónias a partir de diluições das culturas com meio, com e sem selecção; n.d. = não determinado

Estes resultados indicam que o gene purA expresso transportado por um plasmídeo pUC de elevado número de cópias funciona estabilizando os plasmídeos na ausência de suplementação exógena de adenina. Embora a complementação de purA tenha estabilizado um plasmídeo de expressão de LT-B In vitro, não é provável que determinados plasmídeos, pPX3001 e pPX3003, sejam optimamente úteis numa vacina de Salmonella viva, uma vez que uma combinação de purA e/ou expressão de LT-B per se na configuração de cima retarda a taxa de crescimento da Salmonella hospedeira. Num meio de sais definido (M9) contendo casaminoácidos, pPX3001/SL5653 e pPX3003/SL5653 tiveram um tempo de duplicação de 1 hora, enquanto que SL5653 a crescer no mesmo meio suplementado com adenina teve um tempo de duplicação de aproximadamente 30 minutos. Embora a diminuição da taxa de crescimento resultasse em maior atenuação das bactérias após alimentação oral, é também provável que uma menor capacidade para estabelecer uma infecção transiente no animal hospedeiro resultasse numa menor imunogenicidade. Assim, embora os plasmídeos sejam estabilizados por complementação da deleção cromossómica de purA, a sobre-expressão do antigénio candidato hiper-atenua a estirpe da vacina. 24 3G 194

EPO 512 260/PT É bem conhecido que os vectores plasmídicos pUC de elevado número de cópias são estáveis em estirpes de E. coli e Salmonella. A instabilidade observada dos derivados purA dos plasmídeos pUC é provavelmente devida à expressão de elevados níveis do produto do gene purA (observado na forma de uma proteína de 40 kdalton em SDS-PAGE). Os vectores do presente invento superam esta sobre-expressão prejudicial do gene purA através de um de dois métodos: primeiro, através da utilização de plasmídeos de reduzido número de cópias para reduzir o número de cópias do gene purA e deste modo a sua expressão; e em segundo lugar, através da utilização de plasmídeos de elevado número de cópias portador de um gene purA que seja expresso ineficientemente.

Plasmídeos de Expressão de Reduzido Número de Cópias e Genes Integrados Expressos

Os resultados de cima sugerem que a expressão génica moldada para ser neutra para as propriedades de crescimento in vivo de uma estirpe de vacina de Salmonella viva, combinada com estabilidade genética, deviam produzir uma configuração de vacina imunogénica máxima. Os níveis apropriados de expressão génica podem estar inerentemente relacionados com as propriedades do antigénio expresso bem como com o nível a que este é expresso na estirpe de vacina de Salmonella. Os vários factores que podem influenciar a tolerância da estirpe bacteriana hospedeira à expressão do antigénio incluem a localização intracelular do antigénio, o nível de expressão e a estabilidade do antigénio ao processamento proteolítico. Alguns deste factores podem por sua vez ser influenciados por sinais de transcrição e tradução tais como a força do promotor, a eficiência do recrutamento de ribossomas e o número de cópias do gene.

Para criar uma situação na qual a expressão de LT-B foi estabilizada por complementação de purA e moldada para ser neutra para o crescimento de uma estirpe de vacina de Salmonella, foi examinado o efeito do número de cópias do gene na expressão de LT-B e a tolerância do hospedeiro Salmonella. Isto foi examinado sob várias condições, uma em que um promotor lac que controlava o LT-B foi expresso num vector plasmídico de reduzido número de cópias e uma em que o LT-B foi expresso como uma única cópia cromossómica. 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 25

Para construir um plasmídeo de expressão de LT-B de reduzido número de cópias, o plasmídeo pGD103 (R.A. Deich et a/., (1988) J. Bacteríof. 170: 489-498), foi digerido com £coRI e Hinc\\\ e um fragmento de ADN £coRI-/?sal contendo toda a sequência de codificação de LT-B foi clonado no vector para produzir pPX3005, um plasmídeo que expressa LT-B contendo também um determinante de resistência à canamicina (ver Figura 5). 0 plasmídeo pPX3005 foi transformado por electroporação em S. typhimurium SL3261. O crescimento de SL3261 possuindo pPX3005 foi comparado com o de SL3261 contendo o plasmídeo progenitor e com o do próprio SL3261. Em meio M9 contendo 0,5% de casaminoácidos não foi observada nenhuma diferença na taxa de crescimento entre as três estirpes, cada uma com tempos de duplicação de aproximadamente 45 minutos. Este resultado sugeria que o nível de expressão de LT-B nesta configuração era neutro para as propriedades de crescimento do hospedeiro SL3261.

Um integrante cromossómico de LT-B foi obtido do seguinte modo: um plasmídeo contendo uma repetição invertida de 31 bases derivada das extremidades finais de Tn10 e o gene de transposão expresso de Tn10 sob o controlo do promotor tac localizado fora das sequências repetidas invertidas foi utilizado para criar um transposão que expressasse LT-B. Um fragmento de enzima de restrição HaeII de 800 pares de bases, portador da região do promotor lac e o gene estrutural para LT-B foi clonado no vector do transposão, contendo também um determinante de resistência à canamicina. Nesta configuração, o gene para LT-B e resistência à canamicina foram flanqueados pelas sequências repetidas invertidas. Para criar um vector suicida para utilização em estirpes de Sa/monella, o transposão portador de LT-B e resistência à canamicina foi cruzado para um derivado de λgt11 de forma a ser construída uma partícula fágica híbrida portador do transposão com LT-B e a transposase de Tn10. Transposões descritos por Herrero et al., J. Bacteriol. 172: 6537-67 (1990). O fago λ modificado portador do transposão com LT-B foi utilizado para infectar Salmonella LB5010/F112, portador de um receptor do fago λ expresso. Uma vez que o ADN do fago λ não replica em Salmonella, os clones seleccionados para resistência à canamicina resultam da transposição do transposão modificado para o cromossoma. Foram obtidos vários isolados independentes; todos expressavam o antigénio LT-B. Vários dos isolados de S. typhimurium LB5010 foram mantidos e os lisados do fago P22 neles propagados foram utilizados para transduzir a cassete de expressão localizada 26 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ cromossomicamente para a estirpe de vacina de Sa/monella SL3261. Verificou-se que dois integrantes cromossómicos de LT-B SL3261 independentes, resultantes de transdução de dois alelos separados, localizados em loci diferentes no cromossoma de Salmonel/a, eram estáveis in vitro e in vivo.

Construção de um Vector de ourk de Reduzido Número de Cópias O plasmídeo pGD103 foi modificado para conter o gene purA de E. coli e vários locais de clonagem únicos. 0 fragmento Acc\ de 1,7 quilo-pares de bases de pJS76 foi inserido nos locais Xmn\-Xho\ de pGD103, para produzir pPX3006 (Ver Figura 5). Neste plasmídeo, o determinante de resistência à canamicina foi inteiramente substituído por purA, criando um vector com locais BamYW, Sma\, Pst\ e SaiI únicos.

Vector de purA de Reduzido Número de Cópias Contendo Cassetes de Expressão com Promotor PL O plasmídeo pPX3006 foi utilizado como vector para construir vários plasmídeos de reduzido número de cópias que expressassem produtos génicos sob o controlo do forte promotor PL de λ. Espera-se que certos produtos génicos cuja transcrição é regulada pelo promotor PL sejam produzidos na célula bacteriana hospedeira a níveis elevados em comparação com genes sob o controlo de promotores mais fracos tais como o promotor lac. Ainda, porque se sabe que as estirpes de Salmonella não são lisogénicas para o bacteriófago λ, a expressão de proteínas promovidas pelo promotor PL em plasmídeos será constitutiva. Combinadas com a estabilização através de complementação de purA, tais configurações possivelmente superarão os reduzidos níveis de expressão génica associados ao reduzido número de cópias do plasmídeo vector, pPX3006, e aumentarão a imunogenicidade das estirpes de Salmonella recombinantes vivas atenuadas.

Várias versões do gene da proteína do circunsporozoíto de Plasmodium berghei (CS) foram estabilizadas em pPX3006. O gene de CS tem sido considerado como um dos principais imunogénios do revestimento do esporozoíto da malária e, como tal, é um candidato para uma abordagem de subunidades para uma vacina da malária. As estruturas de vários genes de CS foram elucidadas, revelando que todos têm uma estrutura global semelhante. A 27 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ única característica marcante de cada uma é que estas contêm um Réptido centrai repetido, constituindo até um terço da proteína. As regiões repetidas são imunodominantes, uma vez que o grosso dos anticorpos anti-esporozoíto são dirigidos contra estas regiões. Embora os anticorpos para as regiões repetidas tenham sido implicados na protecção contra o estádio de esporozoíto da maiária, os anticorpos sozinhos são insuficientes para se alcançar uma protecção contra a infecção do esporozoíto. É provável que a protecção contra o estádio de esporozoíto dos parasitas da malária envolva não apenas uma resposta humoral, mas também uma forte resposta das células T. Muito provavelmente a activação de linfócitos T citotóxicos que reconheçam porções da proteína CS e outras proteínas do esporozoíto em desenvolvimento à superfície dos hepatócitos infectados com o esporozoíto é necessária para a protecção. Assim, vacinas concebidas para estimular especificamente essas respostas, ou em conjunto com respostas humorais, são necessárias em vacinas eficazes contra a malária. A estimulação da imunidade celular ao nível das células T citotóxicas pode ser alcançada através de distribuição do antigénio pelas células que apresentam o antigénio de uma forma tal que seja provável que este seja processado por uma via interna de processamento. A apresentação dos antigénios através de vias internas pode resultar de preferência na expressão à superfície do antigénio em associação com MHC restrito à classe I, normalmente associado a estimulação de células T citotóxicas CD8±. A expressão da proteína CS de P. berghei e P. falciparum em Salmonella atenuada e a subsequente imunização oral resultou na indução de células T citotóxicas CD + específicas que reconhecem péptidos destas proteínas CS. Ainda, a imunização oral de ratinhos com construções da proteína CS de P. berghei resultou numa protecção significativa contra o desafio com o esporozoíto, normalmente apenas alcançada através de vacinação de animais com esporozoítos inactivados com raios gama.

Embora a protecção contra o desafio com o esporozoíto tenha sido documentada através de vacinação com Salmonella expressando a proteína CS, a protecção foi incompleta, sugerindo que não ocorreu indução adequada de imunidade. Ainda, isto sugere que factores que se relacionam com a expressão da proteína CS na estirpe de vacina de Salmonella atenuada podem ser manipulados para uma maior imunogenicidade. Tais factores incluem, tal como acima mencionado, sinais reguladores de genes, presumivelmente afectando o nível de expressão proteica, estabilidade da proteína expressa e estabilidade

86 194

EPO 512 260/PT 28 genética da proteína expressa. Se, durante o curso da infecção transiente pela Sa/monella atenuada, uma proporção significativa das bactérias imunizadoras perder o plasmídeo devido a segregação, não ocorrerá uma imunização eficaz.

Para avaliar a estabilização das construções de proteína CS através de complementação de purA, foi inserida uma construção da proteína CS de comprimento completo no local BamYW de pPX3006. Esta construção contém toda a sequência de codificação do gene da proteína CS de P. berghei (ANKA) expressa a partir do promotor PL e foi designada pPX3009 (Figura 6). Uma segunda construção contendo uma proteína CS truncada (pPX1601) expressa a partir do promotor PL como proteína de fusão com os 30 primeiros aminoácidos de LT-B foi inserida no local BamH\ de pPX3006. Esta construção contém uma proteína de fusão LT-B com uma porção expressa da proteína CS sem 60 aminoácidos do terminal amino e 30 aminoácidos do terminal carboxi. Esta construção foi designada pPX3007 (Figura 6). Ambas as construções foram transformadas para S. typhimurium BB1231 (ApurA), através de selecção quanto a independência relativamente a purinas. Quando a expressão foi comparada com os seus plasmídeos progenitores cognatos de maior número de cópias (derivados de pBR322), não foram observadas quaisquer diferenças nos níveis de expressão em SL3261, sugerindo que a expressão génica não estava associada ao número de cópias do gene.

Uma terceira cassete de expressão controlada por promotor foi examinada quanto à estabilização por complementação de purA. A sequência de codificação para LT-B (num fragmento EcoR\-Hind\\\ de 590 pares de bases, com extremidades alisadas por acção da enzima de Klenow) foi inserida no local Hpa\ de pPLX (Pharmacia Molecular Biologicals, Piscataway, NJ) para produzir pPX1602. A sequência de codificação de LT-B, agora localizada num fragmento BamHl de 1,7 quilo-pares de bases, foi inserida no local BamH\ de pPX3006 para produzir pPX3010 (Figura 6). Este plasmídeo foi transformado em BB1231. A expressão do antigénio LT-B foi comparada em diferentes pontos do ciclo de crescimento de Salmonella e foi comparada entre formas génicas integradas, formas plasmídicas de elevado número de cópias e formas plasmídicas de reduzido número de cópias. A expressão génica máxima foi observada em culturas de bactérias de um dia para o outro. O nível de expressão estava relacionado com o número de cópias do gene quando a expressão de LT-B era controlada pelo promotor lac. A expressão foi maior em culturas contendo 29 EPO 512 260/PT ρΡΧΙΟΟ, seguida por pPX3005; sendo a menor expressão observada em culturas de 3Ι3261λ3. No entanto, a expressão de LT-B a partir de pPX3010 excedeu o observada em culturas de pPX100, demonstrando que o forte promotor PL superou os efeitos do número de cópias do gene na expressão de antigénio LT-B.

Estabilidade ín Vitro de Cassetes de Expressão de Reduzido Número de Cópias e Integrantes Cromossómicas

Estirpes de S. typhimurium SL3261 portador de cassetes de expressão em derivados de pBR322, pUC ou pSC101 foram comparadas quanto à estabilidade por cultura na ausência de selecção. Tal como observado na Tabela 3, os plasmídeos vector pUC ou os plasmídeos de expressão baseados em plasmídeos pUC, eram drasticamente instáveis por cultura in vitro sem selecção com ampicilina. Para além disso, um plasmídeo (pPX1601) derivado de pBR322 expressando uma proteína de fusão CS/LT-B de P. berghei truncada (descrita acima) apresentou uma perda significativa a partir de culturas passadas na ausência de ampicilina.

Quando qualquer uma destas cassetes de expressão foi clonada em pGD103 ou no seu derivado purA (pPX3006), foi observada 100% de retenção dos plasmídeos de expressão até 80 gerações. Este resultado indica que os plasmídeos baseados no replicão pSC101 são inerentemente estáveis em S. typhimurium. Ainda, que o gene purA de E. coli é eficaz a substituir determinantes de resistência a drogas normalmente associados a plasmídeos de clonagem (Ver Tabela 4). 30 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ

Tabela 4.

Manutenção de plasmídeos de expressão de reduzido n cópias contendo parB durante a cultura de Salmonella typhimurium sob condições de cultura selectivas e não selectivas

Designação do plasmídeo derivado de marcador/gene expresso estirpe hospe deira Condições de selecção % de colónias contendo plasmídeos gerações de crescimento1 10 20 30 40 80 pGD103 PSC101 Kan SL3261 + kan 100 100 100 100 100 -kan 100 100 100 100 100 PPX3005 pGD103 Kan/LT-B SL3261 + kan 100 100 100 100 100 -kan 100 100 100 100 100 PPX3006 pGD103 purA/LT-B SL3261 -ade 100 100 100 100 100 pur -l-ade 100 100 100 100 100 PPX3007 ΡΡΧ3006 purA/LT-B CS SL3261 -ade 100 100 100 100 100 pur -l-ade 100 100 100 100 100 PPX3009 ΡΡΧ3006 purA/CS SL3261 -ade 100 100 100 100 100 pur + ade 100 100 100 100 100 PPX3010 ΡΡΧ3006 purA/LT-B SL3261 -ade 100 100 100 100 100 pur + ade 100 100 100 100 100 1o teor em plasmídeos foi avaliado através da contagem de colónias a partir de diluições da culturas em meio com e sem selecção; n.d. = não determinado

Os vectores plasmídicos contendo as regiões de partição e funções associadas a pSC101 são estáveis em E. coli e Salmonella sob as condições de cultura descontínua. Embora a região par de pSC101 seja retida em pGD103 e nos derivados purA aqui descritos, as funções de partição sozinhas podem não ser suficientes para permitir uma estabilização eficaz do plasmídeo durante a fermentação das estirpes de vacina recombinantes durante a produção (Nilsson e Skogman 1986. Biotechnology 4: 901-903). A complementação plasmídica de uma mutação por deleção de purA no cromossoma combinada com a retenção das funções de partição permite uma estabilidade eficaz durante o crescimento em descontínuo, crescimento sob condições limitantes de nutrientes e durante a fermentação. 31 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ

Estabilização in Vivo de Estirpes de Vacina de Salmoneila tvohimuríum através de Complementacão de purA

Para examinar a estabilização de plasmídeos pSC101 através de complementacão de purA sob condições de vacinação, foram imunizados oralmente ratinhos com SL3261, BB1231 (SL3261ApurA) e pPX3006/BB1231. Foram obtidas amostras de órgãos e foram examinadas quanto à presença de organismos imunizantes até 30 dias após a ingestão oral das bactérias. Tal como pode ser observado na Figura 7, BB1231 podia ser cultivada a partir de amostras de baço, fígado e placas de Peyer a níveis muito baixos apenas 2 dias após a inoculação, enquanto que SL3261 e BB1231 complementada podiam ser recuperadas em amostras de tecido durante várias semanas. A estirpe de vacina complementada produziu características de crescimento in vivo semelhantes, se não idênticas dentro da variação estatística, a SL3261. Isto indica que a complementacão de purA restabelece eficazmente a deleção cromossómica de purA para comportamento pur+ e é eficazmente neutra para as propriedades de invasão e replicação bacteriana da estirpe de vacina.

Os plasmídeos baseados em pSC101 são também estabilizados in vivo. Tal como mostrado na Tabela 5, em apoio aos dados de estabilidade in vitro, os plasmídeos baseados em pSC101, quer adicionalmente estabilizados através de complementacão de purA ou não, são completamente estáveis em amostras de órgãos obtidas até 29 dias após a inoculação. Para os animais imunizados com plasmídeos de expressão de LT-B, todos os isolados caracterizados como contendo plasmídeos também expressavam o antigénio. Pelo contrário, uma minoria dos organismos recuperados a partir de animais imunizados com vector pUC ou pPX100 continham plasmídeos, de forma que nenhum organismo contendo plasmídeo pode ser cultivado a partir de amostras de órgãos 1 5 dias após a inoculação. Adicionalmente, os animais que receberam uma forma integrada do gene de LT-B também apresentaram 100% de retenção da expressão (de resistência à canamicina e LT-B). 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 32

!Λ (Λ α5 Ο. ιόJ5 ο Π3 Η

Dia 29 % com plasmídeo na O na o O o 100 00 L 100 100 na na 100 100 100 drogaR o O o O O O 00 o 00 o o r* total o CD o _ 00 O 03 o o r* Dia 15 % com plasmídeo 100 na CNi Q o na na 100 00 í 100 100 100 100 100 100 drogaR T“ o 00 O o o o 103 102 40 CO 30 00 43 29 total o 158 59 44 o o 103 102 40 CO 30 00 43 29 Dia 10 % com plasmídeo 100 na 001 100 o o 100 00 L 100 100 00 L 100 100 100 100 drogaR C\J o co O o 612 370 456 009 218 436 28 o O CO 480 total CS o x_ co 36 360 612 370 456 009 218 436 | 28 300 480 Animal # % #2 #3 CS *fc #3 CS CO CS #3 #2 CO Bactérias imunizantes, 109 p.o. PUC8/SL3261 (controlo de vector) pPX100/SL3261 (pUC LT-B) PGD103/SL3261 (vector derivado de (SC101) PPX3005/SL3261 (pGD103 LT-B) 3261λ3 (integrante de LT-B) 33 86 '194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ

Estabilização da Expressão Génica em Estirpes de Vacina de S. typhí

Embora as estirpes atenuadas dc S. typhimurium e S, dublin possam ser utilizadas para avaliar a imunogenicidade em modelos animais ou pudessem ser desenvolvidas em vacinas recombinantes para utilização veterinária, estas não são idealmente úteis em aplicações humanas para programas de vacinação contra a febre tifoide ou como vectores para distribuição de antigénios heterólogos ao sistema imunitário humano. Para demonstrar a utilidade da complementação de purA em S. typhi atenuada, foram transformados pPX3006 e pPX3010 por electroporação numa S. typhi aroA candidata BB1354 (679Ty ApurA). A presença de plasmídeo foi verificada e a expressão de LT-B em transformantes com pPX3010 foi confirmada por análise de "Western blot". As duas estirpes foram examinadas quanto às propriedades de crescimento: os tempos de duplicação para os transformantes contendo plasmídeos foram semelhantes aos do progenitor não transformado. As duas estirpes contendo plasmídeos foram examinadas quanto à estabilidade dos plasmídeos in vitro através de passagem na ausência e na presença de adenina. Ambos os plasmídeos eram 100% estáveis durante até 80 gerações, com e sem selecção.

As estirpes de S. typhi 679Ty, BB1354 e pPX3006/BB1354 foram comparadas quanto à capacidade para persistirem dentro de tecidos profundos após inoculação parentérica. S. typhi no seu estado natural não é um patogénio para ratinhos e não infecta ratinhos oralmente. Quando pPX3006/BB1354 ou 679Ty (107 bactérias por animal) foram utilizadas para inocular ratinhos, os organismos foram recuperados a partir de fígados e baços durante até 10 dias após a inoculação. Por outro lado, BB1354 (107 organismos por animal) era recuperável apenas a níveis muito baixos durante vários dias, demonstrando uma capacidade limitada destas estirpes para crescerem em tecidos animais. Ainda, a complementação da deleção cromossómica de purA com o gene purA no plasmídeo pPX3006 também complementa a capacidade da deleção para persistir em tecidos (Ver Figura 8).

Os resultados in vivo e in vitro em estirpes de S. typhimurium e 5. typhi aroA purA demonstram claramente a capacidade do gene purA de E. coli transportado no plasmídeo para complementar defeitos cromossómicos nestas estirpes. Mais significativamente, a complementação do defeito de purA num vector plasmídico estável de reduzidas cópias é neutra para o comportamento

86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 34 de crescimento in vivo das bactérias da vacina. Isto sugere fortemente que bactérias recombinantes que utilizam complementação de purA devem permitir uma expressão estável dc ontigénios heterólogos úteis em inoculação oral.

Gene purA como Marcador para Integração Cromossómica

Para criar meios mais versáteis para manipular o gene purA de E. co/i, o fragmento Acc\ de 1,7 quilo-pares de bases contendo purA foi adaptado com vários ligantes para conter locais de restrição simétricos únicos. Um ligante continha um único local de restrição para Sa/I; o gene purA ligado com Sal\ foi clonado no local Sal\ de pUC18. Este plasmídeo foi subsequentemente utilizado como fonte do gene purA flanqueado por locais SaiI únicos.

Foi construído um transposão modificado para conter tanto o gene purA como o de LT-B (controlado por PL) do seguinte modo. Foi primeiro construído o fago λ112 através da subclonagem do fragmento BamH\ contendo o promotor PL e o gene estrutural de LT-B de pPX1602 num plasmídeo de transposição no qual as 31 repetições invertidas de Tn10 flanqueavam um determinante de resistência à canamicina. O plasmídeo resultante, designado pPX1584, continha LT-B e resistência à canamicina flanqueados por repetições invertidas. A cassete transponível foi cruzada num derivado de λgt11 através de recombinação homóloga entre as extremidades de Tn10. A capacidade do transposão para produzir acontecimentos de transposição foi avaliada pela transdução de LB5010/F112. A expressão de LT-B foi verificada em isolados independentes. 0 gene purA de E. coli ligado com Sa/I foi utilizado para substituir o determinante de resistência à canamicina de λΐ 12 através de subclonagem directa da peça no local Xho\ de λ112 e selecção de lisogénios purA+ em E. coli TX595. O fago modificado contém o gene purA e LT-B e é utilizado para transduzir S. typhimurium LB5010 ApurA/F112 ou S. typhi aro A Apí/rA/F112 para independência relativamente a purinas. Tais transductantes surgem invariavelmente a partir da transposição de purA e LT-B para localizações aleatórias no cromossoma de Sa/monc/ia.

Depósitos das Estirpes

As seguintes estirpes foram depositadas na ATCC, Rockville, Maryland, ao abrigo das disposições do Tratado de Budapeste: 35 86 194 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ

Estirpe N° de acesso ATCC Data do Depósito S. typhimurium BB1231 (aroApurA) 55107 29 de Outubro de 1990 S. typhimurium pPX3005/BB1231 68451 29 de Outubro de 1990 S. typhimurium pPX3006/BB1 231 68452 29 de Outubro de 1990 S. typhimurium pPX3010/BB1231 68453 29 de Outubro de 1990 S. typhimurium pPX3009/BB1231 - 3 de Maio de 1991 S. typhi BB1354 - 3 de Maio de 1991

Lisboa, C...

Por AMERICAN CYANAMID COMPANY - O AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4,° 1200-195 LISBOA

Claims

86 184 ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES ,

1. Vcctor plasmídico ou fágico quo não contém um determinante de resistência a antibiótico, que foi estabilizado através da inserção de ADN contendo o gene purk que codifica a adenilossuccinato-sintetase, sendo o referido vector um vector plasmídico de reduzido número de cópias, ou um plasmídeo de elevado número de cópias em que o gene purk é regulado negativamente.

2. Vector de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda uma sequência nucleotídica que codifica pelo menos um outro antigénio ou fragmento deste.

3. Vector de acordo com a reivindicação 2, em que o antigénio é um antigénio virai seleccionado a partir do grupo que consiste em vírus da imunodeficiência (tipos I e II), vírus dos linfócitos T humanos (tipos I, II e lll), vírus do sincício respiratório, vírus da hepatite A, hepatite B, hepatite C e hepatite não A e não B, vírus do herpes simples (tipos I e II), citomegalovírus, vírus da influenza, vírus parainfluenza, poliovírus, rotavírus, coronavírus, vírus da rubéola, vírus do sarampo, vírus da varicela, vírus de Epstein-Barr, adenovírus, vírus do papiloma e vírus da febre amarela, um antigénio bacteriano seleccionado a partir do grupo que consiste em Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningiditis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamel/a catarrhaiis, Vibrio cho/erae, Corynebacterium diphtheriae, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphy/ococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Clostridium tetani, antigénio fúngico ou de parasitários de um animal de sangue quente ou um patogénio humano.

4. Vector de acordo com a reivindicação 1 o qual é um vector plasmídico estável de reduzido número de cópias seleccionado a partir do grupo que consiste em pPX3005 (ATCC 68451), pPX3006 (ATCC 68452), pPX3009 (ATCC 68612) e pPX3010 (ATCC 68453).

5. Hospedeiro bacteriano que é portador do plasmídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4.

6. Bactéria atenuada que é portadora de um vector plasmídico estável que não contém um locus de resistência a antibióticos, contendo o plasmídeo um gene purA heterólogo que codifica a adenilossuccinato-sintetase e pelo menos um outro gene que codifica um produto génico heterólogo, em que o vector é um vector plasmídico de reduzido número de cópias, ou um plasmídeo de elevado número de cópias no qual o gene purA é regulado negativamente.

06 194 ΕΡ 0 512 260/ΡΤ 2/3

7. Bactéria de acordo com a reivindicação 6 a qual possui uma mutação cromossómica no gene purA e opcionalmente uma mutação cromossómica num ou mais genes funcionais na biossíntese de compostos aromáticos ou no metabolismo da galactose.

8. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-7, em que o produto génico é de origem virai, bacteriana, fúngica ou parasitária de um patogénio de animal de sangue quente ou humano.

9. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-8 a qual é uma bactéria enteroinvasiva do género Salmonefla, Shigella, Yersinia, Escherichia, Vi brio e Campylobacter.

10. Composição compreendendo a bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-9 e um veículo farmaceuticamente aceitável e um adjuvante opcional.

11. Plasmídeo, bactéria ou composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-10, em que o plasmídeo compreendendo um gene que codifica um antigénio é um epítopo de uma proteína do circunsporozoíto da malária que é expresso como parte da proteína de fusão que compreende o epítopo do circunsporozoíto e a subunidade B da enterotoxina sensível ao calor de E. coii ou uma porção proteica desta, que combinada com o epítopo do circunsporozoíto produz uma proteína de fusão imunoactiva.

12. Utilização de uma dose imunologicamente eficaz de um plasmídeo, bactéria ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11 para o fabrico de um medicamento para eliciar uma resposta imunitária contra um antigénio num hospedeiro de sangue quente. ΕΡ Ο 512 260/ΡΤ 3/3

, 13. Método para selecção e manutenção de transformantes bacterianos de interesse utilizando meios de selecção que não antibióticos, compreendendo inserção de um vector purA estável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em bactérias hospedeiras que são deficientes no gene purA, o crescimento selectivo das bactérias em meio deficiente em adenina e a selecção das colónias bacterianas contendo o plasmídeo de purA que aí cresceram.

14. Vector plasmídico ou fágico de acordo com a reivindicação 1, o qual não contém um locus de resistência a antibióticos, sendo o plasmídeo ou fago portador de um gene purA cuja inserção pode ser seleccionada através de crescimento independente de purinas.

15. Vector, bactéria ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, 6-9 e 13 em que o plasmídeo é um plasmídeo de reduzido número de cópias compreendendo ainda toei funcionais de partição (p.ex. parB). Lisboa, 2.Í t.;i. d-Λ Por AMERICAN CYANAMID COMPANY - O AGENTE OFICIAL - o ADJUNTO