PT623170E - Vacinas baseadas em estreptoquinase - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "VACINAS BASEADAS EM ESTREPTOQUINASE"

Este invenção relaciona-se com uma vacinação contra a mastite bovina.

De modo a causar mastite clínica no úbere bovino, uma bactéria tem de crescer dentro da glândula a uma taxa suficiente para evitar a remoção na secreção ou tem de colonizar o tecido secretório normal ou o tecido ductular. Estirpes mais virulentas de bactérias podem resistir à morte fagocítica apesar da r presença de elevado número de leucócitos polimorfonucleares. E conhecido que certas espécies de bactérias produzem toxinas hemolíticas e/ou citolíticas que podem desempenhar um papel na patogénese da doença.

Até à data, as vacinas destinadas a proteger a glândula mamária contra a mastite clínica, têm tentado promover uma fagocitose mais eficiente e a morte das bactérias (através da produção de um anticorpo opsonizante) ou inactivando produtos tóxicos (através da produção de um anticorpo neutra-lizante). O Streptococcus uberis é uma causa comum da mastite bovina, responsável por cerca de 20% de todos os casos clínicos no Reino Unido (Bramley e Dodd, 1984). A capacidade deste organismo infectar a glândula mamária lactante está dependente da sua capacidade de crecimento na secreção e evitar a fagocitose pelos neutrófilos bovinos (Leigh et al, 1990). -2- A maioria do azoto no leite bovino está presente sob a forma de proteína (Aston, 1975) e, na ausência de proteólise, o crescimento bacteriano no leite é limitado pela falta de aminoácidos livres. Isto é realçado pela dependência dos estreptococus lácticos de proteínases caseinolíticas extracelulares para o crescimento no leite (Mills e Thomas, 1981) A capacidade das bactérias crescerem em leite mastítico é aumentada pela presença da enzima caseinolítica plasmina (Marshall e Bramley, 1984). A transformação do plasminogénio em plasmina requer activadores do plasminogénio que é sabido ocorrerem no plasma sanguíneo e nos tecidos animais (Collen, 1980). Certos estreptococus são capazes de produzir estreptoquinase que activa o plasminogénio a plasmina, mas nenhuma estreptoquinase previamente isolada é capaz de activar o plasminogénio bovino.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma vacina para utilização no tratamento ou prevenção da mastite bovina, compreendendo uma proteína activadora do plasminogénio bovino produzida por uma estirpe de Streptococcus capaz de infecção bovina e causadora de mastite, e um véiculo farmaceuticamente aceitável. São conhecidos veículos e adjuvantes, etc. para a formulação da entidade proteica numa vacina.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem, por exemplo, ser meios líquidos adequados para utilização como veículo para introdução de uma proteína num animal. Como exemplo de tal veículo temos uma solução salina. A proteína pode estar em solução ou suspendida no veículo como um sólido. A formulação da vacina pode compreender também um adjuvante para estimular a resposta imune, potenciando portanto o efeito da vacina. V. -3-

Adjuvantes convenientes para utilização na presente invenção incluem, por exemplo, hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio.

As vacinas da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio convencional para a administração de vacinas incluindo oralmente ou por injecção parentérica (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente). O tratamento pode consistir num única dose de vacina ou em várias doses ao longo de um período de tempo.

Por "tratamento ou prevenção" da doença queremos dizer a melhoria de uma doença existente ou futura a um nível útil, e incluindo a redução da inflamação até níveis úteis.

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é fornecida a utilização de uma proteína activadora do plasminogénio bovino produzida por uma estirpe de Streptococcus capaz de infecção bovina e causadora de mastite, para a manufactura de uma vacina para o tratamento ou prevenção da mastite bovina.

Acreditamos que a vacina e as suas utilizações de acordo com a presente invenção, funcionam pela inibição de um factor de um patogénio que, directa ou indirectamente causa a quebra de proteína no hospedeiro, tal que os aminoácidos livres não são gerados e o patogénio não pode então crescer suficientemente depressa para que a doença persista. O factor pode, directa ou indirectamente, activar o plasminogénio no leite de modo a provocar a proteólise das proteínas do leite. No caso da vacinação contra a mastite, o factor pode ser um estreptoquinase bacteriana capaz de activar o plasminogénio no leite. Adequadamente, pode ser uma estreptoquinase -4-

Αί jU- f/H produzida por Streptococcus uberis. No entanto, as estreptoquinases de outros estreptococus podem também activar o plasminógenio no leite, por exemplo uma estreptoquinase produzida por Streptococcus dysgalactiae é um adequado activador do plasminogénio.

Podem ser administrados no hospedeiro anticorpos contra a proteína para conferir imunidade passiva, apesar de este facto ser normalmente menos desejável do que a imunização com a vacina da invenção.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método capaz de causar proteólise no leite bovino, compreendendo a adição ao leite, de uma proteína activadora do plasminogénio produzida por uma estirpe de Streptococcus capaz de infecção bovina e causadora de mastite.

No caso de mamíferos vacinados contra a mastite, pela utilização da invenção, tais mamíferos podem ser distinguidos de mamíferos não-vacinados (mesmo daqueles que tiveram mastite) pela presença de anticorpos neutralizadores anti-estreptoquinase, uma vez que a doença normalmente não provoca uma resposta imune neutralizante, pelo menos não tanto como o que se refere à estreptoquinase. r E evidente que a vacinação contra a mastite de acordo com a presente invenção, pode ser usada em conjunção com conhecidas terapias para a mastite.

As bactérias auxotrófícas não conseguem sintetizar certos aminoácidos essenciais, tendo estes que ser fornecidos no meio para que estes organismos possam crescer. Os aminoácidos presentes no leite encontram-se sob três formas: aminoácidos livres, peptídeos não-proteícos (definidos como sendo

-5- solúveis em 12% m/v de ácido tricloroacético) e polipeptídeos e proteínas. A maior parte dos aminoácidos estão presentes sob a forma de proteínas. As bactérias podem prontamente utilizar aminoácidos livres e, em alguns casos, podem utilizar aminoácidos sob a forma de pequenos peptídeos. No entanto, de modo a obterem aminoácidos suficientes para alcançar um crescimento bacteriano de elevada densidade, ou para obterem aminoácidos que ocorrem apenas sob a forma proteica, as bactérias auxotróficas tem de possuir um sistema para a proteólise das proteínas lácteas.

Foi descoberto que o Streptococcus uberis possui requisitos muito específicos quanto a aminoácidos, tal como determinado por ensaios de crescimento em meio quimicamente definido. Estes requisitos não são preenchidos pelos aminoácidos presentes no leite bovino sob a forma livre, nem por aqueles presentes no leite bovino sob a forma de azoto não proteico (Aston, 1975). Encontra-se bem estabelecido o facto de o S. uberis crescer bem no úbere bovino: cerca de 300 unidades formadoras de colónias (ufc) inoculadas no úbere resultam em cerca de 105-107 ufc/ml no leite após 12 horas.

Acreditamos que as vacinas de acordo com a presente invenção actuam através da inibição da estreptoquinase bacteriana de tal modo que o plasminogénio do hospedeiro não é activado e portanto os aminoáciods livres não são gerados no leite e o crescimento da bactéria é consequentemente inibido suficientemente depressa de modo a que a doença não persista. A vacina pode compreender uma preparação substancialmente pura ou não-pura de estreptoquinase de Streptococcus uberis. Pode também compreender uma preparação contendo formas inactivadas de estreptoquinase. -6-

A estreptoquinase de S. uberis, ou qualquer outro factor activador do plasminogénio tido como adequado como uma vacina contra a mastite, podem ser administrados por várias vias distintas quando usados como vacina. A vacina é administrada de modo a produzir anticorpos suficientes na secreção da glândula mamária lactante para neutralizar a proteólise induzida bacteriológicamente. Este efeito irá promover a protecção da glândula mamária contra a infecção por bactérias. A estreptoquinase produzida por S. uberis é capaz de activar os plasminogénios bovinos, equinos ou ovinos. A estreptoquinase pode ser purificada a partir de filtrados de culturas de S. uberis através de precipitação com sulfato de amónio seguida por cromatografia de exclusão molecular. O S. uberis aparenta produzir uma única proteína possuidora de actividade activadora do plasminogénio. O peso molecular da molécula nativa é de aproximadamente 57 kD, enquanto que o da proteína purificada por SDS PAGE é de 29 kD. Isto sugere que a molécula nativa consiste num dímero da subunidade de 29 kD, que é dissociada durante a electroforese na presença de SDS e 2-mercaptoetanol. O peso molecular nativo é distinto do observado na estreptoquinase do estreptococus tanto do grupo Lancefield A (46,7 kD) como do grupo Lancefield C (47,2 kD). No entanto, ambas as moléculas existem como estruturas monoméricas e não são dissociadas durante a electroforese de SDS PAGE (Huang et al, 1989). A estafiloquinase, um activador do plasminogénio de Staphylococcus aureus, tem uma subunidade com peso molecular entre 23 kD (Jackson e Tang, 1982) e 15,3 kD (Sako et al, 1982) e tem sido demonstrado requererem uma estrutura dimérica para a sua actividade (Jackson et al, 1981). Tem sido demonstrado que esta molécula não activa o plasminogénio bovino, e é improvável que esteja presente em estirpes de Staphylococcus aureus que infectam a glândula bovina mamária. -7- A estreptoquinase de Streptococcus uberis apresenta alguma reacção imunológica cruzada com antisoros levantados contra a estreptoquinase de outros estreptococus, reflectindo a presença nas moléculas de locais antigénicos semelhantes.

Um outro aspecto da invenção fornece um processo para causar a proteólise no leite compreendendo a adição de uma estreptoquinase ao leite, e consequentemente a activação pela estreptoquinase do plasminogénio da proteína caseinolítica plasmina.

Os exemplos seguintes ilustram aspectos preferênciais da invenção de uma maneira não limitante, com referência aos desenhos que os acompanham, em que: A Figura 1 ilustra um perfil de eluição de proteínas filtrados de culturas de Streptococcus uberis precipitadas por sulfato de amónio; A Figura 2 ilustra a separação de proteínas precipitadas por sulfato de amónio de fracções com elevada actividade de estreptoquinase por cromatografia de exclusão molecular. Proteínas precipitadas por sulfato de amónio (1). Fracção de baixa pureza (2). Fracções de alta pureza (3). Padrões de peso molecular pré-corados (Sigma) com peso molecular nativo de 180, 116, 84, 58,48,5, 35,5, e 26,6 kD (4). A Figura 3 ilustra a hidrólise de proteínas do leite por Streptococcus uberis na presença e ausência de plasminogénio bovino. A estirpe 0140J (A e B) de Streptococcus uberis sobreposta com agarose contendo leite magro na presença (A) e ausência (B) de plasminogénio bovino.

-8- A Figura 4 ilustra a detecção de actividade caseinolítica após activação do plasminogénio com estreptoquinase de filtrado de culturas de estreptococcus Lancefield grupo C ou S. uberis. Os poços contêm uma mistura de estreptoquinase de filtrado de cultura de estreptococcus Lancefield grupo C (coluna 1), filtrado de cultura de S. uberis (coluna 2), ou tampão fosfato salino (coluna 3) e plasminogénio humano (fila H), ou de coelho, (fila R), porcino (fila P), equino (fila E), ou bovino (fila B). A fila marcada "PBS" continha tampão fosfato salino em vez de plasminogénio; e A Figura 5 ilustra a electroforese em SDS PAGE de plasminogénio bovino após incubação na presença de filtrado de cultura de S. uberis. Colunas de plasminogénio bovino na presença de 2μ1 de tampão fosfato salino (A), filtrado de cultura de S. uberis diluído 1/1000 (B), 1/100 (C), 1/10 (D) em tampão fosfato salino (PBS). As setas indicam a posição dos polipeptídeos associados à plasmina. Não foram detectadas bandas proteicas após electroforese de filtrados de cultura diluídos 1/5 em PBS. Os números indicam a posição das proteínas de peso molecular conhecido. EXEMPLO 1: Purificação de estreptoquinase a partir de filtrados de cultura A estirpe 0140J de Streptococcus uberis foi utilizada ao longo da corrente investigação. A estirpe foi originalmente isolada de um caso de mastite no "National Institute ofDairy Research, Shinfield, Reading", Inglaterra.

As bactérias foram armazenadas a -20°C em caldo de "Todd Hewitt" (THB) contendo 25% (p/v) de glicerol. As culturas culturas foi inicialmente crescidas durante 18 horas em 10 ml de caldo de "Todd Hewitt" a 37°C. Com esta cultura (10 μΐ por 500 mL de meio) foi inoculado um meio -9- quimicamente definido (Leigh e Field, 1991) contendo hidrolisado de caseína (1% p/v) e glucose (1% p/v) e incubado a 37°C durante 18 horas. As células foram retiradas por centrifugação (10000 g; 20min.) e filtração (tamanho de poro 0,45μτη) do sobrenadante resultante. Foi adicionada azida de sódio ao filtrado da cultura a uma concentração final de 0,05% (p/v). A purificação de estreptoquinase a partir de filtrados de cultura pode também ser alcançada por um sistema de cromatografia de afinidade utilizando anticorpos monoclonais imobilizados [Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor (USA)].

Precipitação por sulfato de amónio a partir de filtrados de cultura, filtração em gel e deteccão de actividade de estreptoquinase

Foi utilizada a estirpe 0140J de Streptococcus uberis. Foi adicionada uma solução saturada de sulfato de amónio a um filtrado sem células e a uma concentração final de 38% (v/v). A mistura foi misturada a 4°C durante 20 horas e o precipitado resultante recolhido por filtração (tamanho de poro 0,45μιη). O precipitado foi redissolvido em 100 ml de água destilada contendo 0,05% (p/v) de azida de sódio e dializada durante 24 horas contra 2,0 L do mesmo diluente. O dialisado foi concentrado dez vezes numa célula agitada sob pressão (Amicon, Mass. USA) usando uma membrana com limite de exclusão de 10 kD (Filtron, Mass, USA).

Uma coluna (28 x 1000 mm) contendo Sephadex G-75 (Pharmacia, Uppsala, Suécia) com um volume de empacotamento de leito aproximado de 500 ml foi equilibrada com tampão fosfato salino (PBS) a 4°C). Foram aplicados na coluna aproximadamente 10 ml da solução de proteína precipitada por sulfato de amónio, redissolvida, dialisada e concentrada, e as proteínas foram eluídas a um -10-fluxo de 0,5-1,0 ml/min. Foram colhidas fracções (lOml) e foram ensaiados 5 μΐ de cada quanto à actividade de activação do plasminogénio bovino.

Experiências preliminares demonstraram que a actividade de estreptoquinase era precipitada a partir de filtrados de culturas sem células através de sulfato de amónio a uma concentração de 33-38% de saturação (dados não apresentados). Uma concentração de 38% de saturação foi subsequentemente usada para a precipitação de estreptoquinase a partir de filtrados de cultura sem células com 2,5L. O precipitado foi redissolvido, dialisado e concentrado antes da filtração em gel. A actividade de estreptoquinase eluiu da coluna G-75 como um único pico activo com um peso molecular aparente de aproximadamente 57 kD (Fig. 1). As fracções 21 e 22 foram juntas numa pool (estreptoquinase de alta pureza), assim como as fracções 19, 20, 23, e 24 (estreptoquinase de baixa pureza) e armazenadas a -70°C sem perda aparente de actividade.

Electroforese de dodecilsulfato de sódio - poliacrilamida (SDS PAGE) e coloração de proteínas. A pureza das fracções contendo actividade de estreptoquinase que foram juntas em pool, foi determinada usando a SDS PAGE e a técnica de coloração de proteínas previamente descrita. O precipitado de sulfato de amónio redissolvido, dialisado e concentrado, continha 6 proteínas com uma gama de pesos moleculares desde 100 a 29 kD. As fracções de baixa pureza continham uma proteína de 29 kD e quantidades residuais das outras enquanto que as fracções de alta pureza continham apenas uma banda única com um peso molecular de 29 kD (Fig. 2). - 11 - EXEMPLO 2: Deteccão da activacão do plasminogénio por sobrecamada de agarose/leite magro O plasminogénio de plasma de coelho, humano, porcino, equino e bovino foi obtido da "Sigma Chemical Co". (Poole, Dorset, Reino Unido) e reconstituído em água destilada estéril até uma concentração final de 1,0 unidades.mr1. A estreptoquinase de estreptococcus Lancefield grupo C foi também obtida da Sigma, reconstituída a uma concentração de 1,0 mg.ml'1 em tampão fosfato salino (pH 7,4). O plasminogénio e a estreptoquinase foram armazenados a -70°C e descongelados apenas uma vez antes de cada utilização.

Culturas crescidas em THB durante a noite foram plaqueadas em gelose de "Todd Hewitt" e incubadas a 37°C durante 18 horas. As placas com colónias isoladas foram sobrepostas com uma sobrecamada de 10 ml de agarose fundida (10μg/ml) contendo NaCl (150 mM), Tris/HCl (50 mM, pH 8,1), leite magro Oxoid (1% v/v) e plasminogénio bovino (10μg.mΓ1) e incubadas a 37°C. Os controlos foram feitos usando sobrecamadas idênticas às de cima exceptuando a ausência de plasminogénio.

Todas as cinco estirpes de S. uberis (0140J, EF20, ST 10, C216, C197C) produziram zonas de actividade caseinolítica nas sobrecamadas de leite magro, plasminogénio bovino e agarose no espaço de 4 horas e a 37°C(Fig 3A). Podem no entanto existir algumas estirpes de S. uberis que não produzem esta actividade: estas apresentarão provavelmente uma virulência reduzida na glândula bovina mamária. Não foram detectadas zonas à volta das colónias isoladas nas sobrecamadas na ausência do plasminogénio bovino (Fig 3B). -12- EXEMPLO 3: Activacão do plasminogénio e detecção de plasmina

Iguais volumes de plasminogénio (1,0 unidades.ml'1, de uma variedade de espécie mamífera) e filtrados de cultura de S. uberis ou estreptoquinase (lpg.ml*1) de estreptococcus do Grupo C "Lancefield", foram misturados e incubados a 37°C durante 45 min. após os quais foram analisados 10 μΐ quanto á presença de plasmina através da detecção de actividade caseinolítica. A actividade foi detectada por difusão a partir de poços abertos na agarose de leite magro (uma vez que as sobrecamadas não continham plasminogénio) depois de incubação a 37°C durante 24 horas (Fig. 4).

Filtrados de culturas de S. uberis activavam o plasminogénio bovino e equino, mas a actividade com este último apenas se tomava aparente depois de incubação da agarose de leite magro durante cerca de 18 horas, enquanto que no caso do plasminogénio bovino a incubação era de 2 horas. Isto sugere ou uma reduzida actividade da estreptoquinase de S. uberis para este substrato ou uma pobre actividade da molécula de plasmina resultante sobre as proteínas de leite bovino. Os filtrados de culturas de S. uberis não foram capazes de activar o plasminogénio humano, de coelho ou de porco. Em contraste, a estreptoquinase de estreptococus do Grupo C "Lancefield", activou o plasminogénio humano e apresentou actividade residual relativamente ao plasminogénio equino, mas nenhuma quanto ao plasma de coelho, bovino, ou porcino. Nem o filtrado de cultura de S. uberis, nem a estreptoquinase de estreptococcus do Gmpo C "Lancefield", apresentaram qualquer actividade caseinolítica na ausência de plasminogénio.

Sendo, assim, a actividade de estreptoquinase presente em filtrados de culturas de S. uberis difere daquela isolada a partir dos estreptococus do - 13-

Grupo E "Lancefield" e para a qual há relatos de que activa o plasminogénio porcino (Ellis e Armstrong, 1971); os filtrados de culturas de S. uberis não conseguiram activar esta molécula. (Fig. 4). Difere também de actividades similares de S. equismilis e S. pyogenes, os quais ambos activam o plasminogénio humano mas não o bovino (Castellino 1979, Wulf e Mertz 1969), enquanto que a estreptoquinase de S. uberis activa o plasminogénio bovino mas não o humano. Este constirtui o primeiro relato da presença de actividade activadora de plasminogénio em S. uberis e o primeiro relato de uma estreptoquinase que activa o plasminogénio bovino. EXEMPLO 4; Conversão do plasminogénio em plasmina e deteccão por electroforese em gel de pollacrilamida e coloração de proteínas O plasminogénio bovino (0,005 unidades num volume de 5 μΐ) foi misturado com 2 μΐ de filtrados de culturas de S. uberis e incubado a 37°C durante lh. As amostras foram misturadas com igual volume de tampão-amostra contendo dodecilsulfato de sódio (0,01% p/v) e 2-mercaptoetanol (0,2% v/v) e aquecido a 65°C durante 5 min. As proteínas foram separadas por electroforese (Laemmli 1970) e detectadas pelo procedimento de coloração de Oakley et al (1980) (Fig. 5). O plasminogénio utilizado durante esta investigação continha proteínas contaminantes. Os fornecedores reinvindicam que a contaminação de plasmina é inferior a 5% da conteúdo total de proteína (Sigma Chemical Co, Poole, Reino Unido). O plasminogénio bovino tinha um peso molecular aparente de 91,2 kD o que é concordante como peso molecular calculado com base na sequência de aminoácidos desta proteína (Schaller et al 1985). A activação do plasminogénio foi alcançada após 60 min. por diluição de 1/10 em filtrado de cultura de S. uberis (Fig. 5). Isto resultou na perda da banda de proteína com 91,2 -14- kD juntamente com a de outra proteína (48,5 kD). Não é claro se o desaparecimento da proteína de 48,5 kD foi o resultado da acção do filtrado de cultura ou se é resultado da actividade da plasmina. O desaparecimento destas duas proteínas coincidiu com a formação de três polipeptídeos mais pequenos com pesos moleculares aparentes de 56,2, 28,8, e 25,4 kD. É previsível que a activação do plasminogénio bovino pela uroquinase (um activador do plasminogénio de origem humana) resulte na formação de apenas dois polipeptídeos com pesos moleculares de 53,7 e 25,4 kD (Schaller et al 1985). Estes correspondem provavelmente às proteínas de 56,2 e 25,4 kD, respectivamente. O polipeptídeo previsto de 53,7 kD contém dois potenciais locais de glicosilação (Schaller et al 1985), o que pode justificar a discrepância entre os valores previstos e os observados. Isto sugere que a estreptoquinase de S. uberis actua de modo semelhante à da uroquinase durante a activação da molécula do plasminogénio bovino.

Visto que não foram observadas bandas de proteína a seguir à electroforese do filtrado de cultura numa concentração duas vezes superior à utilizada para conseguir activação de plasminogénio total, a presença de um polipeptídeo adicional (28,8 kD) não pode ser explicada simplesmente pela presençã de proteínas bacterianas. O total cumulativo dos pesos moleculares dos três polipeptídeos observado a seguir à activação de plasminogénio durante a investigação mostra uma discrepância significativa relativamente ao do plasminogénio bivino. Uma possível explicação para esta observação é o facto de o polipeptídeo de 28,8 kD ser um produto da degradação da proteína de 48,5 kD, que é um contaminante da preparação de plasminogénio e é consumida durante a activação. A determinação dos pesos moleculares dos produtos de activação do plasminogénio purificado pela activação da estreptoquinase de S. uberis irá resolver esta discrepância. EXEMPLO 5: Produção de anticorpos monoclonais para a estreptoauinase de S. uberis

Vacinação de ratinhos A estreptoquinase purificada (10pg) foi misturada com adjuvante incompleto de Freund e injectado subcutaneamente em ratinhos Balb/c. Este procedimento foi repetido após um intervalo de aproximadamente 21 dias. A produção de um anticorpo específico foi monitorizada 10 dias depois da segunda injecção, tal como abaixo descrito. Aproximadamente um mês depois da segunda injecção e 4 dias antes da fusão de células do baço (ver abaixo) a produção de anticorpos foi desencadeada pela adminitração intravenosa de 10 \ag de estreptoquinase purificada e suspendida em tampão fosfato salino (PBS; pH 7,2).

Produção e cultivo de células de hibridoma

Os baços foram retirados de ratinhos vacinados e as fusões levadas a cabo de acordo com métodos normalizados (Galfre et al, 1977). As células submetidas a fusão foram ressuspendidas em meio HAT [RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) contendo 10% (v/v) de soro bovino fetal, 0,1 mM hipoxantina, 0,016 mM timidina e 40 μΜ aminopterina (Sigma, Poole, Reino Unido)]. As células foram então dispensadas a uma concentração de 2x106 células/ml em microplacas de 24 poços (lml/poço) que tinham sido previamente inoculadas com lml de meio HAT contendo 2x104 macrófagos murínicos. As placas foram incubadas a 37°C na presença de 5% C02 até as colónias de hibridoma serem claramente visíveis, sendo então os sobrenadantes analisados quanto à presença de anticorpos específicos para a estreptoquinase. As colónias cujo sobrenadante apresentou anticorpos específicos -16-contra a estreptoquinase foram crescidas e os sobrenadantes analisados quanto à actividade anti-estreptoquinase como anteriormente, e as culturas que apresentaram actividade foram clonadas duas vezes através de limitaçáo da diluição. O fluido ascítico foi preparado por injecção intraperitoneal (I.P.) de ratinhos Balb/c com 2-4x106 células clonadas de hibridoma. Os ratinhos tinham sido injectados intraperitonealmente com 0,5ml de "Pristane" (uma marca registada da Aldrich Chemical Co. Gillingham, Reino Unido) uma semana antes deste procedimento.

Detecção de anticorpos murínicos específicos para a estreptoquinase A estreptoquinase purificada e liofilizada foi redissolvida em tampão de carbonato de sódio (pH 9,6) com uma concentração de 1 pg/ml, tendo sido adicionados 100 μΐ aos poços de fundo plano de uma microplaca de 96 poços [Flow labs (Linbro), Virgínia, USA)]. A estreptoquinase foi ligada aos poços por incubação a 4°C durante 18h. A estreptoquinase não ligada foi retirada dos poços através de lavagem com excesso de tampão de ELISA (tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,2, contendo Tween-20, 0,05% v/v). As soluções que continham o anticorpo foram adicionadas aos poços apropriados permitindo que reagissem com a estreptoquinase ligada durante lh a 37°C. O anticorpo não ligado foi removido por lavagem com tampão de ELISA, como anteriormente. O anticorpo ligado foi detectado por adição de anticorpo específico para imunoglobulinas murínicas, conjugado com peroxidase de rabanete (HRP), seguido de incubação durante 1 h a 37°C e de remoção do conjugado não ligado através de lavagem com tampão de ELISA. Este procedimento foi seguido através da detecção colorimétrica da HRP ligada, pela adição de 100μ1 de tampão citrato (24,3 ml de ácido cítrico 0,05M e 25,7ml de Na2HP04 0,1M) contendo O- fenilaminodiamina (0,34 mg/ml) e peróxido de hidrogénio (0,03%, v/v). O desenvolvimento da cor decorreu durante aproximadamente 20 min. e foi parado pela adição de um igual volume de ácido sulfurico 1M. A cor foi medida espectrofotometricamente a um comprimento de onda de 492 nm, tendo a presença do anticorpo específico sido determinada através da comparação do desenvolvimento da cor nos poços controlo (poços que não continham estreptoquinase e outros aos quais não tinha sido adicionada a solução contendo o anticorpo).

Deteccão da actividade neutralizadora de estreptoquinase

Os anticorpos monoclonais (mAbs) foram diluídos em PBS (pH 7,2), e cada diluição misturada com um igual volume de estreptoquinase (0,5 μg/ml). As misturas foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 min. após os quais, 20 μΐ de cada uma das diluições de cada mAb foram colocados num poço feito numa película de agarose (1% p/v em PBS) contendo leite magro Oxoid (1% p/v) e 10'3 unidades/ml de plasminogénio bovino (Sigma).

Os poços que continham o mAb e a estreptoquinase foram comparados com poços controlo aos quais tinha sido adicionada estreptoquinase e um igual volume de PBS (positivos) e com os poços em que tinha sido apenas adicionado o mAb (negativos). A capacidade dos mAbs em neutralizar a estreptoquinase é expressa como a menor concentração em que é alcançada a inibição total de 0,5 ug/ml (Tabela 1).

Tabela 1: Compração da actividade dos anticorpos monoclonais específicos neutralizadores da estreptoquinase. vi -18- ANTICORPO MONOCLONAL CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA (Fusão n°. Código n°) (pg/ml) F429.EC3 22 F429.FG8 100 F449.ED1 >140 F449.DC2 23 F450.DA3 >100 EXEMPLO 6: Produção de anticorpos monoclonais contra a estreptoquinase de S. uberis

Vacinação de coelhos e deteccão de um anticorpo específico A estreptoquinase purificada (5C^g) foi misturada com o adjuvante incompleto de Freund, e injectada subcutaneamente em coelhos brancos da Nova Zelândia. Este procedimento foi repetido em duas outras ocasiões às cinco e às oito semanas após a injecção inicial. A produção do anticorpo específico foi monitorizada em vários tempos depois da injecção tal como descrito para os anticorpos murínicos no Exemplo 5, exceptuando o facto de o anticorpo conjugado com a peroxidase de rabanete utilizado neste exemplo ser específico para imunoglobulinas de coelho.

Deteccão de actividade neutralizadora de estreptoquinase A capacidade da imunoglobulina purificada a partir do soro policlonal, utilizando a proteína G imobilizada (MAB TRAP Pharmacia, Uppsala, Suécia), de neutralizar a actividade da estreptoquinase foi determinada exactamente como o descrito no Exemplo 5 para os anticorpos monoclonais específicos. O anticorpo monoclonal neutralizou a actividade da estreptoquinase de S. uberis mas não aquela de S. equisimilis que foi obtida da Sigma Chemical Co. (Poole, Dorset, Reino Unido). Ι$4.Φ

REFERÊNCIAS

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Lisboa, 20 de Agosto de 2001

ALBERTO CANELAS

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma vacina para utilização no tratamento ou prevenção da mastite bovina, compreendendo uma proteína activadora do plasminogénio bovino produzida por uma estirpe de Streptococcus infecciosa do bovino e causadora de mastite e um veículo farmaceuticamente aceitável.
2. 2. A vacina de acordo com a reinvindicação 1, em que a estirpe de Streptococcus é Streptococcus uberis.
3. 3. Uma composição vacinai para utilização no tratamento e prevenção da mastite bovina compreendendo uma proteína activadora do plasminogénio bovino produzida por uma estirpe de Streptococcus infecciosa do bovino e causadora de mastite e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. 4. A composição vacinai de acordo com a reinvindicação 3, em que a estirpe de Streptococcus é Streptococcus uberis.
5. 5. A utilização de uma proteína activadora do plasminogénio bovino produzida por uma estirpe de Streptococcus infecciosa do bovino e causadora de mastite, na produção de uma vacina para tratar ou prevenir a mastite bovina.
6. 6. A utilização de acordo com a reinvidicação 5, em que a estirpe de Streptococcus é Streptococcus uberis. -2-
7. 7. Uma proteína activadora do plasminogénio bovino isolada e produzida por Streptococcus uberis, e possuindo um peso molecular aproximado de 29 kD como determinado por SDS-PAGE.
8. 8. Um anticorpo especificamente reactivo contra a proteína activadora do plasminogénio bovino isolada da reinvindicação 7.
9. 9. Um método de causar a proteólise no leite bovino, compreendendo a adição ao leite de uma proteína activadora do plasminogénio bovino produzida por uma estirpe de Streptococcus infecciosa do bovino e causadora de mastite.
10. 10. O método de acordo com a reinvindicação 9, em que a estirpe de Streptococcus é Streptococcus uberis. Lisboa, 20 de Agosto de 2001 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1Í00 LISBOA