PT623678E

PT623678E - Hidrolase de esteres do tipo norbornano

Info

Publication number: PT623678E
Application number: PT94302834T
Authority: PT
Inventors: Bunji Kageyama; Masanori Nakae; Shigeo Yagi
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1993-04-22
Filing date: 1994-04-21
Publication date: 2002-02-28
Also published as: DE69428478D1; DK0623678T3; NZ260310A; JP3431204B2; AU5948594A; EP0623678A3; ATE206461T1; SI0623678T1; US5686285A; DE69428478T2; ES2164087T3; EP0623678B1; CA2121180C; US5484725A; EP0623678A2; AU679487B2; JPH06303972A; CA2121180A1; KR100306008B1

Description

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-1 - /<*-DESCRIÇÃO "HIDROLASE DE ÉSTERES DO TIPO NORBORNANO"

ANTECEDENTES DO INVENTO 1. Campo do Invento: O presente invento refere-se a uma nova hidrolase de ésteres do tipo norbomano que hidrolisa enantio-selectivamente um éster do tipo (±)-exo-norbonano para produzir norbomeol opticamente activo; um gene estrutural da hidrolase de ésteres do tipo norbomano; um vector de expressão incluindo o gene estrutural; um transformante incluindo o vector de expressão; e um método de produção para a hidrolase de ésteres do tipo norbomano utilizando o transformante. 2. Descrição da Técnica Relacionada: Vários métodos para preparação de norbomeol são conhecidos na técnica. Os métodos conhecidos são classificados em métodos químicos e biológicos. Por exemplo, é conhecido o seguinte método químico. Deixa-se norbomeno utilizado como material de partida reagir com um ácido orgânico para produzir um composto éster do tipo norbomano. O composto éster é quimicamente hidrolisado para produzir norbomeol. Neste método químico são produzidos simultaneamente quatro tipos de estereoisómeros de norbomeol (i.e., (+)-endo-norbomeol, (-)-endo-norbomeol, (+)-exo-norbomeol e (-)-exo-norbor-neol). Por isso, é ainda necessária uma complicada separação para se obter um norbomeol opticamente activo. -2-

É também conhecido outro método de produção dc norbomcol utilizando o seguinte método biológico. Deixa-se norbomeno utilizado como material de partida reagir com um ácido orgânico para produzir um composto éster do tipo norbonano. Deixa-se o composto éster reagir com uma enzima, ou entrar em contacto com microorganismos produtores de tal enzima, hidrolisando deste modo o composto éster para se obter norbomeol. Em relação a este método biológico, Oberhauser et al. relataram um método para produção de (-)-norbomeol a partir de acetato de (±)-norbonilo através da utilização de uma lipase derivada de Candida cylindraceae (Th. Oberhauser et al., Tetrahedron, 43: 3931-3941, 1987). O método que utiliza a lipase possui, no entanto, uma selec-tividade reduzida e o norbomeol produzido possui uma pureza óptica reduzida. A Publicação de Patente Japonesa Disponível ao Público N° 2-273196 divulga um método de resolução óptica de uma mistura racémica utilizando uma reacção de hidrólise biológica, na qual é utilizado na reacção um inibidor para inibir selectivamente a reacção de hidrólise de um dos enantió-meros. Um tal método pode ser empregue para preparar norbomeol opticamente activo. Neste método, no entanto, é necessário efectuar uma pesquisa de inibidores para se obter um inibidor que seja útil na selecção do norbomeol opticamente activo. Ainda, é necessário remover o inibidor após a reacção. Como resultado, um tal método é desvantajosamente complicado.

SUMARIO DO INVENTO A hidrolase de ésteres do tipo norbomano deste invento compreende uma sequência de aminoácidos desde Met na posição 1 até Ala na posição 388 de SEQID No: 1. O presente invento inclui uma sequência de ADN que codifica a hidrolasc dc esteres do tipo norbomano possuindo a sequência de aminoácidos acima mencionada.

Numa concretização, a sequência de ADN acima mencionada compreende uma sequência de bases desde A na posição 1 até C na posição 1164 de SEQID No: 1. O presente invento inclui um vector de expressão incluindo uma sequência de ADN que codifica a hidrolase de ésteres do tipo norbomano do invento. 0 presente invento inclui um transformante produzido através da introdução do vector de expressão acima mencionado num hospedeiro.

Numa concretização, o hospedeiro é E. coli.

Um método de produção de uma hidrolase de ésteres do tipo norbomano deste invento compreende os passos de cultura do transformante acima mencionado num meio de cultura e recuperação da hidrolase de ésteres do tipo norbomano produzida do meio de cultura.

Um método de produção para um norbomeol opticamente activo deste invento compreende o passo de permitir que um éster do tipo (±)-exo-norbomano entre em contacto com a hidrolase de ésteres do tipo norbomano acima mencionada; sendo o éster do tipo (+)-exo-norbornano representado pela Fórmula I: i •3 -4- em que R é acilo e Λ e B são hidrogénios, rcspcctivamcntç, ou onde A e B estão ausentes, resultando numa ligação dupla carbono-carbono entre os carbonos aos quais A e B estão ligados na Fórmula I.

Numa concretização, R na Fórmula I é acetilo e A e B são hidrogénios, respectivamente.

Assim, o invento aqui descrito toma possível as vantagens de (1) proporcionar uma nova hidrolase de ésteres do tipo norbomano que pode produzir norbomeol opticamente activo com uma elevada pureza; e (2) proporcionar uma sequência de ADN para codificar a hidrolase de ésteres do tipo norbomano, um vector de expressão incluindo a sequência de ADN, um transformante incluindo o vector de expressão e um método de produção para a hidrolase de ésteres do tipo norbomano utilizando o transformante.

Estas e outras vantagens do presente invento tomar-se-ão aparentes para os peritos na técnica após leitura e compreensão da seguinte descrição detalhada com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a desacetilação enantio-selectiva de acetato de (±)-exo-norbomiIo por uma hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento. A Figura 2 é um mapa de restrição de um plasmídeo pBNA21 incluindo o gene estrutural da hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento. -5-

A Figura 3 é um mapa de restrição de um plasmideo pUNA221 incluindo o gene estrutural da hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento.

DESCRICÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Os presentes inventores conduziram vários estudos para obter norbomeol opticamente activo com uma elevada pureza a partir de uma mistura racémica de compostos éster do tipo norbomano. Como resultado, verificou-se que uma estirpe de Acetobacter pasteurianus ATCC 12873 produz uma hidrolase de ésteres do tipo norbomano e que a hidrolase desacetila selectivamente acetato de (±)-exo-norbomilo tal como mostrado na Figura 1 para produzir norbomeol opticamente activo com uma elevada pureza óptica. Os presentes inventores determinaram ainda uma sequência de ADN para codificação da hidrolase de ésteres do tipo norbomano no ADN genómico da estirpe, alcançando deste modo o presente invento. O termo "norbomeol opticamente activo" tal como aqui se utiliza significa um dos compostos (+)-norbomeol e (-)-norbomeol. Um norbomeol opticamente activo preferido é (-)-norbomeol. O termo "um éster do tipo norbomano" tal como aqui se utiliza significa um éster de norbomeol ou um éster de derivados de norbomeol. O éster do tipo (±)-exo-norbomano utilizado no presente invento é representado através da Fórmula I: λ em que R c acilo; c A c B são hidrogénios, respectivamente, ou onde A e B estão ausentes, resultando numa ligação dupla carbono-carbono entre os carbonos aos quais A e B estão ligados na Fórmula I.

Na Fórmula I, o acilo é um acilo alifático, cicloalquilcarbonilo ou arilcarbonilo. O acilo alifático possui 2 a 10 átomos de carbono e de preferência 2 a 7 átomos de carbono. O acilo alifático inclui formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoílo e haxanoílo e é de preferência formilo, acetilo, propionilo ou isobutirilo. O cicloalquilcarbonilo possui de preferência 4 a 10 átomos de carbono sendo preferível 4 a 7 átomos de carbono. O cicloalquilcarbonilo inclui ciclopropanocarbonilo, ciclobutanocarbonilo, ciclopentanocarbo-nilo e ciclohexanocarbonilo. O arilcarbonilo possui de preferência 7 a 11 átomos de carbono e inclui benzoílo, p-toluoílo e naftoílo.

Os compostos de Fórmula I estão comercialmente disponíveis ou altemativamente podem ser facilmente sintetizados quimicamente com métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um éster do tipo (±)-exo-norbomano desejado representado pela Fórmula I pode ser produzido com um elevado rendimento fazendo reagir norbomano com um ácido orgânico apropriado tal como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico e ácido láctico na presença de um catalisador ácido; ou causando uma reacção Diels-Alder entre um éster vinílico de um ácido orgânico apropriado e ciclopentadieno. A hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento é produzida a partir de bactérias do género Acetobacter, de preferência Acetobacter pasteurianus ATCC 12873. Esta estirpe está disponível na American Type Culture Collection (ATCC). -7-

(1) Condições de cultura: Não é necessário nenhum meio especial para a cultura das bactérias acima mencionadas e pode ser utilizado qualquer um dos vários tipos convencionais de meios de cultura. Por exemplo, pode ser utilizado um meio contendo glicose, peptona, extracto de levedura, vários sais e semelhantes. O pH apropriado do meio é de 5 a 9 e de preferência aproximadamente 7. A temperatura apropriada do meio é de 25 a 30°C e de preferência aproximadamente 28°C. As bactérias são cultivadas, por exemplo, aerobicamente com mistura ou agitação. A hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento é produzida intracelularmente. (2) Purificação da enzima:

Uma técnica ou uma combinação de técnicas conhecidas podem ser utilizadas para isolar e purificar a hidrolase de ésteres do tipo norbomano a partir da cultura. Por exemplo, a cultura é centrifugada para se recolher as células bacterianas daí. As células das bactérias recolhidas são rompidas e o resultante é centrifugado novamente para obter um sobrenadante como uma solução enzimática bruta. A solução enzimática bruta é purificada através de um método apropriado para obter a hidrolase de ésteres do tipo norbomano. Por exemplo, a solução enzimática bruta é sujeita a uma cromatografia em DEAE-Sepharose e depois a electroforese em gel de poliacrilamida para isolar uma banda que exiba uma actividade enzimática, obtendo-se assim, a hidrolase de ésteres do tipo norbomano. (3) Medição da actividade enzimática: A hidrolase de ésteres do tipo norbomano reage com p- -8- nitrofcnilacctato, para além do éster do tipo exo-norbomano, como substrato para produzir um material colorido, p-nitrofenol. Uma vez que o p-nitrofenol pode ser detectado espectrofotometricamente, a actividade enzimática da hidrolase de ésteres do tipo norbomano é medida através do seguinte método de p-nitrofenilacetato no qual o p-nitrofenilacetato (pNFA) é utilizado como substrato. Método de p-nitrofenilacetato: é adicionada uma solução enzimática a um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) incluindo 0,02% de p-nitrofenilacetato e cloreto de magnésio 5 mM de forma a alcançar um volume final de 3 ml. A reacção é conduzida a uma temperatura de 30°C durante 20 minutos. A absorvância do p-nitrofenol libertado para a mistura reaccional através da reacção enzimática é medida a 400 nm. A quantidade de enzima que produz 1 pmole de p-nitrofenol durante 1 minuto é definida como 1 unidade (U). (4) Propriedades da enzima:

As propriedades enzimáticas e propriedades químicas proteicas da hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento são como se segue: (a) Acção enzimática e especificidade do substrato:

Deixou-se que vários géneros de ésteres do tipo (±)-exo-norbor-nano compreendendo respectivamente formilo, acetilo, propionilo, n-butirilo ou isobutirilo como o R acilo na Fórmula I entrassem em contacto com uma solução enzimática, respectivamente como substrato. Cada um dos produtos obtidos foi extraído com um volume igual de clorofórmio. O extracto foi analisado através de cromatografia gasosa utilizando uma coluna para resolução óptica (produzida por J&W Scientific). Foi produzido selectivamente (-)-norbomeol em todos os extractos. Tal como se toma evidente a partir deste resultado, a enzima é uma -9- hidrolasc que hidrolisa cnantio-sclcctivamente o éster do tipo (-L)-exo-iiorbomano para produzir um norbomeol opticamente activo, í.e., (-)-norbomeol. Em pormenor, em relação à Figura 1, acetato de (+)-(1 S,2S,4R)-exo-norbomilo é hidrolisado para o (-)-norbomeol correspondente através da utilização da presente enzima. O (-)-norbomeol obtido pode ser convertido em (+)-d-norcânfora através de oxidação. O restante acetato de (-)-(lR,2S,4S)-exo-norbomilo pode ser hidrolisado para o (+)-norbomeol correspondente através da utilização de um alcáli. O (+)-norbomeol obtido pode ser convertido em (-)-d-norcânfora através de oxidação. (b) pH óptimo e intervalo de pH estável: A medição da actividade enzimática descrita no ponto 3 foi efectuada a vários valores de pH através da utilização de p-nitrofenilacetato como substrato. Como resultado, verificou-se que o pH óptimo para a reacção era de aproximadamente 8.

Deixou-se a enzima repousar durante 1 hora a uma temperatura de 30°C a vários valores de pH. Depois, a actividade da enzima a cada valor de pH foi medida através do método descrito no ponto 3. Os resultados revelaram que o intervalo de pH estável da enzima é de aproximadamente 6 a 8. (c) Temperatura óptima e estabilidade térmica: A actividade enzimática da presente enzima foi medida através do método descrito no ponto 3 a várias temperaturas. Os resultados revelaram que a temperatura óptima era de aproximadamente 50°C.

Deixou-se a enzima repousar num tampão fosfato durante 2 horas a

ρΗ 7,0 a várias temperaturas. Depois, a actividade da enzima foi medida utilizando o método descrito no ponto 3. Os resultados revelaram que a presente enzima era estável a uma temperatura de 40°C sob as condições acima mencionadas. (d) Efeito de inibidores:

Deixou-se a presente enzima repousar em tampões fosfato incluindo respectivamente vários inibidores (5 mM) a pH 7,0 durante 2 horas. Depois, a actividade da enzima foi medida através do método descrito no ponto 3. Os resultados revelaram que a presente enzima era completamente inibida por fenilmetilsulfonilfluoreto (FMSF). (e) Peso molecular: O peso molecular da presente enzima foi medido através de SDS-PAGE (electroforese em gel de SDS-poliacrilamida) utilizando um gel de gradiente (produzido por Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) e um marcador de peso molecular (produzido por Bio-Rad Lab.). O peso molecular foi calculado como sendo 43 kD. (f) Composições em aminoácidos: A presente enzima foi isolada por SDS-PAGE e transferida para uma membrana de PVDF (produzida por Millipore) através da utilização de um dispositivo de "blotting" semi-seco (produzido por Millipore). A membrana resultante foi corada com Azul Brilhante de Coomassie; e uma porção visual correspondente à presente enzima foi cortada com uma lâmina. O extracto da porção foi sujeito a uma análise de aminoácidos através de HPLC utilizando uma coluna de picomarcador (“picotag”) (produzida por Water Co., Ltd.). Os 1 - 11 - resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo. A Tabela 1 mostra também a composição em aminoácidos calculada a partir da sequência de aminoácidos determinada com base na sequência de ADN da presente enzima descrita em pormenor abaixo.

Tabela 1

Aminoácido Mole de aminoácido/mole de proteína (%) Verificado Calculado ASX 10,2 39,1 39 GLX 10,2 39,2 38 SER 4,4 17,1 22 GLY 8,2 31,4 33 HIS 2,0 7,7 12 ARG 2,8 10,8 12 THR 4,9 18,8 26 ALA 13,2 50,6 53 PRO 4,2 16,1 16 TYR 1,4 5,3 3 VAL 9,7 37,1 36 MET 2,2 8,4 8 CYS 0,0 0,0 1 ILE 5,5 21,0 17 LEU 13,3 50,9 41 PHE 3,6 13,8 11 TRP 0,0 3 LYS 4,4 16,7 17 Total 100,0 384,0 388 - 12-

f· V ',·*» s * 1 (5) Determinação da sequência de ADN que codifica a hidrolase de ésteres do tipo norbomano: A determinação da sequência de ADN de um fragmento de ADN incluindo ADN codificando a hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento é exemplificada como se segue: a sequência do fragmento de ADN pode ser determinada através de análise do ADN genómico de Acetobacter pasteurianus. (A) Clonagem através de método de bombardeamento: Células de Acetobacter pasteurianus são colhidas e tratadas com SDS. O lisado resultante é sujeito a centrifugação de equilíbrio de gradiente de densidade de cloreto de césio-brometo de etídio para obter ADN cromossómico. O ADN cromossómico é clivado com uma enzima de restrição apropriada. Cada fragmento do ADN clivado é inserido num ADN vector que foi previamente clivado com o mesmo tipo de enzima de restrição, ou inserido, através de um ligador, num vector que foi previamente clivado com uma enzima de restrição apropriada. Assim, são produzidos plasmídeos recombinantes. Um tal vector pode ser, por exemplo, pBR322 (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.). Os plasmídeos produzidos deste modo são então introduzidos em células hospedeiras. Um hospedeiro preferido é E. coli, particularmente E. coli JM109 ATCC 53323. Os plasmídeos recombinantes são introduzidos em células hospedeiras, por exemplo, de acordo com o método descrito por Hanahan, et ai, (J. Mol Biol, 116, 557-580 (1983)). (B) Selecção de um clone incluindo o gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano: - 13-

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Um clone incluindo o gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano no transformante obtido é pesquisado como se segue. O transformante é sujeito a uma cultura em placa. As colónias aí crescidas são transferidas para um papel de filtro. O papel de filtro é ensopado com uma solução de detecção de esterases que é um tampão fosfato 50 mM (pH 7,0) incluindo β-naftilacetato a 0,1% e Fast Blue BB a 0,02%. Como resultado, a cor da colónia na qual é produzida esterase é vermelho púrpura. Assim, a colónia cuja cor mudou para vermelho púrpura é seleccionada.

Tal colónia é cultivada e deixada reagir com acetato de (±)-exo-norbomilo a 1%. O produto é analisado através de cromatografia gasosa de resolução óptica utilizando o método descrito no ponto 4a. Deste modo, determina-se que o clone que produziu (-)-norbomeol é um clone que inclui o gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano. (C) Determinação da sequência de bases de uma inserção: A sequência de bases de uma inserção de um plasmídeo recombinante é determinada, por exemplo, como se segue: a inserção é clivada num local de enzima de restrição incluso e os fragmentos de ADN obtidos são respectivamente clonados com vectores apropriados para determinação da sequência. A sequência de bases de cada um dos fragmentos clonados é determinada através do método de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5467 (1977)). Assim, a sequência de bases inteira da inserção pode ser determinada. (6) Construção de um vector de expressão incluindo o gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano: - 14-

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ί Λ Ο gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento é inserido num vector apropriado tal como pUC119 e pBR322 (produzidos por Takara Shuzo Co., Ltd.) para servir como vector de expressão para expressar a hidrolase de ésteres do tipo norbomano. (7) Formação de um transformante e produção da hidrolase de ésteres do tipo norbomano: O vector de expressão acima mencionado é introduzido numa célula hospedeira tal como E. coli, levedura e célula animal para formar um transformante. Através da cultura do transformante, pode ser produzida a hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento. A hidrolase é obtida como se segue. O transformante é cultivado e a cultura é sujeita a centrifugação para se recolher as células bacterianas aí presentes. As células recolhidas são lavadas com um tampão e suspensas em, por exemplo, um volume igual de um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) para obter uma suspensão celular. As células na suspensão são rompidas mecanicamente ou através de ultra-sons. O sobrenadante da suspensão resultante é obtido por centrifugação como uma solução enzimática bruta. A hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento pode ser purificada através de vários métodos. Um exemplo dos métodos inclui o seguinte. É adicionado sulfato de amónio à solução enzimática bruta de forma a alcançar 30% de saturação. O precipitado é removido da mistura e é-lhe

adicionado mais sulfato de amónio de forma a alcançar 70% de saturação. O precipitado na mistura é recolhido. A solução dializada do precipitado recolhido é sujeita a cromatografia de troca iónica utilizando uma coluna de fluxo rápido de DEAE-Sepharose e sucessivamente filtração em gel utilizando uma coluna Sephacryl S-200 para recolher uma fracção activa. A fracção é sujeita a electroforese em gel de poliacrilamída através da utilização de um dispositivo produzido por Marysol Industries. A actividade da fracção resultante é analisada através do método descrito no ponto 5B e a porção activa é cortada. A porção é esmagada e eluída num tampão para se obter uma enzima de elevada pureza.

Qualquer um do caldo de cultura, suspensão celular, enzima bruta e enzima purificada obtidos nos procedimentos de cima podem ser utilizados na reacção enzimática. (8) Hidrólise opticamente selectiva do éster do tipo (±)-exo- norbomano: O éster do tipo (±)-exo-norbomano é hidrolizado de forma opticamente selectiva através da utilização do caldo de cultura, suspensão celular, enzima bruta ou enzima purificada obtidos no ponto 7. Por exemplo, a reacção é conduzida num tampão misturando o éster do tipo (±)-exo-norbomano com a enzima numa das formas de cima a uma temperatura de 30°C durante 10 minutos. Depois, é adicionado clorofórmio à mistura reaccional e o substrato e produto são extraídos. O extiacto é analisado por cromatografia gasosa utilizando, por exemplo, uma coluna para resolução óptica (produzida por J&W Scientific). Assim, confirma-se que o norbomeol opticamente activo é produzido a partir da enzima em qualquer uma das formas de cima.

Exemplos O presente invento será agora descrito em mais pormenor por meio de exemplos.

Exemplo 1

Isolamento e purificação de uma hidrolase de ésteres do tipo norbomano:

Uma hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento foi produzida a partir de Acetobacter pasteurianus ATCC 12873 e foi isolada e purificada como se segue. Setenta litros de um meio (pH 7,0) contendo glicose a 0,5%, peptona a 1,0%, extracto de levedura a 1,0%, glicerina a 0,5% e carbonato de cálcio a 1,0% foram carregados num vaso fermeptador de 100 litros e esterilizados. Uma cultura-mãe de Acetobacter pasteurianus ATCC 12873, que foi previamente cultivada num meio (pH 7,0) contendo glicose a 0,5%, peptona a 1,0%, extracto de levedura a 1,0% e glicerina a 0,5%, foi inoculada nesta de forma a tomar o volume da cultura-mãe até 4% de todo o meio. A cultura foi conduzida a uma temperatura de 28°C durante 48 horas e a cultura, i.e., a suspensão celular, foi centrifugada para colher as células bacterianas nesta. As células bacterianas colhidas foram lavadas duas vezes com um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) e suspensas em 1,1 litros de um tampão fosfato 0,1 Μ. A suspensão foi tratada três vezes com um esmagador de células do tipo de pressão (produzido por Goulin Corp.; Manton-Goulin Laborátory homogenizer) para esmagar as células nesta. O resultante foi centrifugado e foi obtido o sobrenadante.

Foi adicionado sulfato de amónio ao sobrenadante de forma a alcançar 30% de saturação e a mistura foi agitada sobre gelo durante 1 hora e centrifugada para se obter o sobrenadante. Foi adicionado sulfato de amónio a este sobrenadante de forma a alcançar 70% de saturação e a mistura foi agitada sobre gelo durante 1 hora e centrifugada para recolher o precipitado. O precipitado foi dissolvido em 320 ml de um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) e a solução resultante foi dializada contra um tampão fosfato 0,01 M (pH 7,0) a 8°C de um dia para o outro.

Ao dializado, foram sucessivamente adicionados 1 litro de água destilada e 250 g de DEAE-Sepharose de fluxo rápido (produzida por Pharmacia) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. A resina de Sepharose resultante foi lavada com 2 litros de um tampão fosfato 0,01 M (pH 7,0) e foi utilizada para encher uma coluna para eluir uma fracção activa com um tampão fosfato 0,01 M (pH 7,0) contendo cloreto de sódio 0,3 Μ. A fracção eluída foi concentrada utilizando um dispositivo de ultrafiltração (produzido por Tosoh Corp.). O concentrado foi carregado numa coluna que tinha sido previamente carregada com Sephacryl S-200 (produzida por Pharmacia), equilibrada com um tampão Tris-HCl 50 mM, eluindo deste modo o concentrado com tampão Tris-HCl 50 mM. A fracção eluída foi recolhida e concentrada por ultrafiltração. A solução concentrada resultante foi sujeita a electroforese em gel de poliacrilamida a 10% utilizando um dispositivo produzido por Marysol Industries. Após a electroforese, o gel obtido foi sujeito âo método de coloração de actividade esterásica de Higerd e Spizizen (J. Bacteriol. 114, 1184-1192 (1973)) como se segue. O gel foi mergulhado em 20 ml de um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) incluindo 10 mg de β-naftilacetato e 10 mg de Fast Blue RR para detectar uma porção activa que mudava a sua cor para vermelho púrpura. A porção vermelho púrpura foi cortada do gel, finalmente esmagada e imersa em 100 ml de um tampão Tris-HCl 0,1 M a 4°C de um dia para o outro para eluir uma proteína activa. O procedimento foi repetido 10 vezes para se obter 1 litro da solução eluída. A solução eluída foi concentrada por ultrafiltração para se alcançar um volume final de 10 ml.

Exemplo 2

Medição da actividade da hidrolase de ésteres do tipo norbomano e suas propriedades: A hidrolase de ésteres do tipo norbomano reage com p-nitrofenilacetato bem como com éster do tipo exo-norbomano como substrato. A reacção com p-nitrofenilacetato produz um material colorido, p-nitrofenol. Uma vez que o p-nitrofenol pode ser detectado espectrofotometricamente, a actividade enzimática da hidrolase de ésteres do tipo norbomano foi medida através do método pNPA no qual foi utilizado p-nitrofenilacetato como substrato. Especificamente, a reacção foi conduzida a 30°C em 3 ml de uma mistura reaccional compreendendo 0,02% de p-nitrofenilacetato, um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) contendo cloreto de magnésio 5 mM, e a solução enzimática obtida no Exemplo 1. O p-nitrofenol livre foi quantificado medindo a ábsorvância a 400 nm com um espectrofotómetro. A quantidade de enzima necessária para produzir 1 pmole de p-nitrofenol durante 1 minuto foi definida como 1 unidade (U). Como resultado, verificou-se que a actividade da enzima purificada no Exemplo 1 era de 38,7 U/ml. Ainda, a quantidade de proteína medida por um estojo de ensaio proteico (produzido por Bio-Rad Lab.) era de 0,25 mg/ml. A enzima purificada foi analisada de acordo com o método de Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)) através de SDS-PAGE utilizando um gel de gradiente (produzido por Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) e um marcador de -19- -19-

peso molecular (produzido por Bio-Rad Lab.). Como resultado, a banda principal foi encontrada numa posição correspondendo a um peso molecular de 43 kD. Ainda, a enzima foi analisada por HPLC utilizando marcadores de peso molecular de HPLC (produzidos por Oriental Yeast Co., Ltd.) e uma coluna de medição de peso molecular (produzida por Waters Co., Ltd; PROTEINPAK-300). Nesta análise, a porção activa foi eluída numa posição correspondendo também a um peso molecular de 43 kD. Portanto, foi indicado que a hidrolase de ésteres do tipo norbomano existia como monómero.

Verificou-se que as principais propriedades da enzima eram como se segue: (1) Temperatura de reacção apropriada e pH óptimo: A medição da actividade enzimática acima mencionada foi efectuada utilizando p-nitrofenilacetato como substrato a vários valores de pH. Como resultado, verificou-se que o pH óptimo era de aproximadamente 8. Depois, a medição da actividade enzimática foi também efectuada a várias temperaturas para se verificar que a temperatura de reacção apropriada era de aproximadamente 50°C. (2) Estabilidade ao calor e intervalo de pH estável:

Deixou-se repousar 1 ml da solução enzimática incluindo um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) durante 2 horas a várias temperaturas e depois sujeitou-se à medição de actividade enzimática acima mencionada. Como resultado, verificou-se que a enzima era estável a uma temperatura de até 40°C sob as condições acima mencionadas. Para além disso, deixou-se repousar 1 ml da solução enzimática incluindo um tampão 0,1 M a vários valores de pH a 30°C

durante 1 hora e sujeitou-se depois à medição de actividade. Como resultado, verificou-se que a enzima era estável num intervalo de pH de 6 a 8. (3) Efeito de inibidores: A medição de actividade acima mencionada foi efectuada em relação a 0,5 ml da solução enzimática de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) contendo 5 mM de um dos seguintes inibidores: ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), N-tosil-L-fenilalanil-clorometilcetona (TPCK), N-tosil-L-lisil-clorometilcetona (TLCK), di-isopropil-fluorofosfato (DFP), N-etilmaleimida e ácido iodoacético. Deixou-se repousar as soluções enzimáticas, incluindo os respectivos inibidores, a 30°C durante 2 horas. Como resultado, verificou-se que a presente enzima era çompletamente inibida por PMSF. (4) Estabilidade em solventes: A medição da actividade foi efectuada em relação a 0,2 ml da solução enzimática de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0) contendo um dos seguintes solventes a uma concentração de 30%: etanol, metanol, acetonitrilo, acetona, dimetilsulfóxido (DMSO), Ν,Ν-dimetilformamida, 1,4-dioxano, acetato de etilo e triclorometano. Deixou-se repousar as soluções enzimáticas incluindo os respectivos solventes a 30°C durante 1 hora. Como resultado, a presente enzima exibiu 80% ou mais de actividade em metanol, DMSO ou acetato de etilo a uma concentração de 30%. (5) Hidrólise opticamente selectiva do éster do tipo norbomano:

Deixou-se a enzima purificada obtida no Exemplo 1 entrar em -21 - .3

/'ΐ

contacto com vários tipos de ésteres do tipo (±)-exo-norbomano incluindo respectivamente formilo, acetilo, propionilo, n-butirilo e isobutirilo como o acilo R na fórmula I. A reacção foi conduzida a 30°C durante 30 minutos. O resultante foi extraído com um volume igual de clorofórmio. O extracto foi analisado por cromatografia gasosa utilizando uma coluna para resolução óptica (produzida por J&W Scientífic). Tal como é aparente a partir dos resultados mostrados na Tabela 2, (-)-norbomeol foi produzido enantio-selectivamente a partir de qualquer um dos ésteres.

Tabela 2

Acilo R na Fórmula I de éster do tipo norbomano

Norbomeol produzido (mg/ml) isómero (-) isómero (+)

Formilo 1,49 0,15 Acetilo 2,48 0,19 Propionilo 3,39 0,45 n-butirilo 2,30 0,29 isobutirilo 2,76 0,69

Exemplo 3

Clonagem do gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano a partir de Acetobacter pasteunanus: (1) Clonagem pelo método de bombardeamento: Células de Acetobacter pasteurianus num meio de cultura foram colhidas e tratadas com SDS a 1% para obter um lisado. O lisado foi sujeito a -22- Â

ι I

% ’Λ centrifugação em gradiente de densidade de equilíbrio de cloreto de césio-brometo de etídio, obtendo-se deste modo ADN cromossómico purificado. Foram adicionadas aproximadamente 100 unidades de uma enzima de restrição BamHl a 10 pg do ADN e a reacção foi conduzida a 37°C durante 120 minutos. A mistura resultante foi incubada a 70°C durante 5 minutos para inactivar a enzima de restrição e foi efectuada precipitação com etanql para recolher o ADN. Os fragmentos de ADN obtidos, clivados com a enzima de restrição BamHl, foram dissolvidos em 10 μΐ de tampão TE de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) incluindo EDTA 1 mM.

Um vector pBR322 (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.) foi utilizado como vector de clonagem. Foram adicionadas aproximadamente 50 unidades de enzima de restrição BamHl a 5 μg do vector pBR322 e a reacção foi conduzida a uma temperatura de 37°C durante 2 horas. A mistura reaccional foi precipitada com etanol para recolher o ADN. O ADN recolhido foi dissolvido num tampão (pH 8,0) incluindo 50 mM de Tris-HCl e 1 mM de cloreto de magnésio. Foram-lhe adicionadas aproximadamente 20 unidades de fosfatase alcalina bacteriana (BAP) e a reacção foi conduzida a 37°C durante 1 hora. A mistura reaccional resultante foi extraída com um volume igual de uma solução de fenol. Foi adicionado etanol à camada aquosa obtida para precipitar o ADN. O ADN recolhido foi dissolvido em 10 μΐ de tampão TE.

Foram misturados 5 μΐ da solução obtida incluindo os fragmentos do cromossoma de Acetobacter pasteurianus, clivado com a enzima de restrição BamHl, com 1 μΐ de uma solução incluindo o vector pBR322 clivado e desfosforilado com a enzima de restrição BamHl e BAP. A ligação foi alcançada com um estojo comercialmente disponível (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.; DNA Ligation Kit) para produzir um ADN recombinante. Utilizando o ADN recombinante, E. c.oli JM109 ATCC 53323 foi transformada de acordo com o método de Hanahan et ah, (J. Mol BioL, 166, 557-580 (1983)). O transformante foi cultivado num meio de agar L (pH 7,3) (i.e., um meio incluindo bactotriptona a 1%, extracto de levedura a 0,5%, cloreto de sódio a 0,5% e agar a 1,8%) incluindo 50 pg/ml de ampicilina, onde se formaram colónias do transformante. (2) Selecção do clone: O método de coloração de actividade do Exemplo 1 foi utilizado para seleccionar uma colónia possuindo uma actividade esterásica de entre as colónias formadas no ponto 1 acima. Especificamente, as colónias formadas no meio de agar L foram replicadas para um papel de filtro. O papel de filtro foi embebido com uma solução de detecção de esterases que é um tampão fosfato 50 mM (pH 7,0) incluindo β-naftilacetato a 0,1% e Fast Blue BB a 0,02% para se obter uma colónia vermelho púrpura exibindo actividade esterásica. Através deste procedimento, foram detectadas 17 colónias vermelho púrpura e isoladas a partir de aproximadamente 7800 colónias.

Uma tal colónia positiva foi cultivada de um dia para o outro utilizando 5 ml de um caldo L incluindo 50 pg/ml de ampicilina para reagir com acetato de exo-norbomilo a 1%. Como resultado, foi produzido norbomeol. Deste modo, confirmou-se que a estirpe que forma a colónia positiva era um clone incluindo o gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano. A partir da célula da estirpe que produz a hidrolase, foram isolados plasmídeos através do método de Bimboim et al. (Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979)). Os plasmídeos foram clivados com as enzimas de restrição BamHl, EcoRI, HinãUl e Pstl. Os plasmídeos recombinantes resultantes foram analisados por electroforese em gel de agarose. Como resultado, verificou-se que um fragmento de 4,5 kb estava inserido na mesma direcção erii todos os plasmídeos. Um dos plasmídeos foi designado pBNA21. -24- i-t.

/*> . ... ,«í*.>5«SVft*S

(3) Preparação do mapa de restrição do plasmídeo e minimização do plasmídeo: O plasmídeo recombinante pBNA21 foi clivado com várias enzimas de restrição para construir um mapa de restrição. O mapa de restrição resultante é mostrado na Figura 2. As abreviaturas utilizadas nesta figura indicam locais a ser clivados com as seguintes enzimas de restrição:

E: EcóBl H: Hindi II EV: EcoRV B: BamHI P: Pstl Nc: Ncol Af: Afill S: SalI

Ainda, para determinar a localização do gene que codifica a hidrolase de ésteres do tipo norbomano, foram preparadas deleções e mutações por mudança de enquadramento de um fragmento de ÁDN exógeno de 4,5 kb através da utilização das enzimas de restrição ΒαηϊΆΙ, Hindlll, Afill, Ncol e SalL Os fragmentos de ADN resultantes foram analisados através do método de coloração de actividade esterásica do ponto 2 para verificar se estes tinham ou não actividade enzimática da hidrolase de ésteres do tipo norbomano. Como resultado, verificou-se que apenas o plasmídeo no qual foi deletado um fragmento Aflll-SaR de 2,4 kb não exibia a actividade. Este resultado revelou que o gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento se situava numa região de 2,1 kb entre Áflll e BamHI que corresponde ao fragmento Aflil-Sall de 2,4 kb excluindo 0,3 kb entre ΒαηϊΆΙ e SaR derivadas do vector.

I -25- I -25-

Depois, o plasmídeo pBNA21 foi clivado com a enzima de restrição Aflll, as extremidades tomadas cegas com a polimerase de ADN T4 e depois clivado com a enzima de restrição Bamtíl. A mistura reaccional resultante foi sujeita a electroforese em gel de agarose para obter um fragmento de ADN de 2,1 kb utilizando de um estojo comercialmente disponível (produzido por BIO101; GENECLEAN).

Um vector pUC119 (produzido por Takara Shuzo Co., Ltd.) foi clivado nos locais de clivagem BamUl e Hincll que existem num local de multiclonagem do gene lacZ no vector. O fragmento de ADN de 2,1 kb foi ligado com o fragmento do vector resultante de forma a que o fragmento ficasse alinhado na mesma direcção que a do promotor lac do vector pUCl 19. Uma vez que o local de clivagem Aflll de extremidades cegas foi ligado ao local de clivagem Hincll, o local de clivagem Aflll foi regenerado. E. coli JM109 foi transformada utilizando o plasmídeo recombinante obtido e o transformante resultante foi cultivado para formar colónias possuindo a actividade da hidrolase de ésteres do tipo norbomano. O plasmídeo recombinante produzido deste modo foi designado pUNA221. O mapa de restrição de pUNA221 é mostrado na Figura 3.

Exemplo 4

Determinação da sequência de bases do gene da hidrolase de ésteres do tipo norbomano e identificação do gene estrutural da hidrolase de ésteres do tipo norbomano: A sequência de bases de ADN do fragmento Aflll-BamHl de 2,1 kb no plasmídeo recombinante pUNA221 produzido no Exemplo 3 foi determinada através do método de Sanger et ai (Proc. Natl. Acad. Set USA, 74, 5463-5467

(1977)). Como resultado, encontrou-se um enquadramento de leitura aberto (ORF) codificando uma proteína que compreende 388 aminoácidos incluindo a metionina que corresponde ao codão de iniciação ATG. 0 fragmento Aflll-BanúU de 2,1 kb foi então clivado com uma enzima de restrição Hinfl para obter um fragmento de 1,5 kb incluindo o ORF que se considerava como codificando a hidrolase de ésteres do tipo norbomano. O fragmento obtido foi inserido num plasmídeo pUCl 19 no local de clivagem Hincll na mesma direcção que a do promotor lac, produzindo deste modo um plasmídeo pUNA-Hf. E. coli JM109 foi transformada utilizando o plasmídeo pUNA-Hf. Quando o transformante obtido foi analisado através do método de coloração de actividade descrito no ponto 2 do Exemplo 3, a cor da colónia mudou para vermelho púrpura por exibir actividade esterásica. Depois o transformante foi misturado com uma mistura de acetato de (±)-exo-norbomilo a 1% e deixou-se repousar a 30°C durante 10 minutos. A mistura resultante foi analisada através do método descrito no passo 5 do Exemplo 2. Como resultado, verificou-se que foram produzidos 1,68 mg/ml de (-)-exo-norbomeol e 0,15 mg/ml de (+)-exo-norbomeol. Assim, a selectividade óptica foi confirmada como sendo tão alta como a da enzima derivada de Acetobacter pasteurianus obtida no Exemplo 1.

Exemplo 5

Expressão da hidrolase de ésteres do tipo norbomano em E. coli: (1) Expressão da hidrolase de ésteres do tipo norbomano O plasmídeo pUNA-Hf obtido no Exemplo 4 foi introduzido em E. coli JM103 ATCC 39403 para produzir um transformante JM103/pUNA-Hf. -27- -27-

0 transformante JM103/pUNA-Hf, que foi previamente cultivado num caldo L incluindo 50 pg/ml de ampicilina, foi inoculado em 50 ml do mesmo meio num balão de 500 ml de forma a que o tamanho do inoculo do transformante fosse 1% de todo o meio, e foi cultivado a 37°C com agitação. Quando a DOóóo era de 0,2, foi-lhe adicionado isopropil-p-D-galactopiranósido (IPTG) 1 mM. A cultura foi continuada e 6 horas após a adição de IPTG, foi obtido o caldo de cultura. O caldo de cultura foi congelado de um dia para o outro e derretido para ser utilizado como espécimen para uma medição de actividade. A medição de actividade através do método de pNPA foi de 68 unidades por 1 ml de caldo de cultura. Como controlo, uma estirpe incluindo o plasmídeo pUC119 sozinho foi cultivada do mesmo modo que acima. A actividade do controlo foi de 0,2 unidades por 1 ml de solução de cultura. (2) Desacetilação opticamente selectiva de acetato de exo-norbomilo: O acetato de (±)-exo-norbomilo utilizado como substrato foi desacetilado de forma opticamente selectiva por E. coli JM103 incluindo o plasmídeo pUNA-Hf como se segue. As células bacterianas foram recolhidas a partir do caldo de cultura de E. coli JM103/pUNA-Hf tal como acima mencionado por centrifugação e suspensas num volume igual de um tampão fosfato 0,1 M (pH 7,0). Depois, foi adicionado acetato de (±)-exo-norbomilo a 1% a 1,5 ml da suspensão obtida e a reacção foi conduzida a 30°C durante 15 minutos. A mistura reaccional resultante foi analisada através do método descrito no ponto 5 do Exemplo 2. Como resultado, verificou-se que foram produzidos 1,91 mg/ml de (-)-exo-norbomeol e 0,15 mg/ml de (+)-exo-norbomeol.

Exemplos da utilização do norbomeol opticamente activo

produzido a partir da hidrolase de ésteres do tipo norbomano do preseute invento serão agora descritos como Exemplos de Referência.

Exemplo de Referência 1

Através da utilização de úma hidrolase de ésteres do tipo norbomano obtida no Exemplo 1, foi produzido (-)-(lS,2S,4R)-exo-norbomeol de acordo com o método do ponto 5 no Exemplo 2. Depois, foram dissolvidos 2,8 g (0,025 moles) do (-)-(lS,2S,4R)-exo-norbomeol obtido em 56 ml de cloreto de metileno e foram-lhe adicionados 8,1 g (1,5 moles) de clorocromato de piridínio (PCC) e 1 g de seiva molecular 4A. A reacção foi conduzida a uma temperatura de 25°C a 30°C durante 1 hora. Depois, a mistura reaccional foi diluída com 56 ml de tolueno e o resultante foi deixado passar através de uma coluna de 28 g de sílica-gel para remover materiais insolúveis. O eluato foi concentrado e seco para dar (+)-norcânfora bruta como um pó numa linha branco cristal. A (+)-norcânfora obtida foi dissolvida em 45 ml de tetrahidrofurano e a solução resultante foi adicionada gota a gota a uma solução de 30 ml de tetrahidrofurano incluindo 1,1 moles de di-isopropilamida de lítio (LDA) a uma temperatura de -10°C a -15°C. A reacção foi conduzida à mesma temperatura durante 20 minutos e foram-lhe adicionados gota a gota 3,3 g (razão molar de 1,1) de brometo de alilo a 0°C ou menos. Depois, a reacção foi conduzida à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura reaccional foi vertida para 70 ml de água gelada e a mistura resultante foi tomada acídica com uma solução diluída de ácido clorídrico. A solução acídica foi extraída duas vezes com 50 ml de tolueno. A camada combinada de tolueno foi lavada com água e o solvente foi removido em vácuo para dar (+)-exo-3-(2-propenil)-biciclo[2,2,l]heptan-2-ona bruta como um resíduo oleoso. O resíduo foi destilado em vácuo para se obter uma fracção possuindo um ponto de ebulição de 92°C-103°C a 10-12 mmHg. Rendimento: 3,07 g (82%). Pureza química (GC): 98,6%. Endo-isómero: 0,4%.

Pureza óptica (HPLC): 90% ee. Rotação específica [a]25D + 84,6° (C = 1,0, CHC13).

Exemplo de Referência 2

Foi efectuado um procedimento semelhante ao do Exemplo 5 em larga escala e foi obtida uma mistura reaccional incluindo uma quantidade maior de (-)-(lS,2S,4R)-exo-norbomeol e uma quantidade menor de (+)-(1 S,2S,4R)-exo-norbomeol. Um procedimento semelhante ao descrito no Exemplo de Referência 1 foi repetido com a utilização desta mistura. Assim, foi obtida uma (+)-exo-3-(2-propenil)-biciclo[2,2,l]heptan-2-ona bruta. O produto bruto foi destilado em vácuo para se obter uma fracção possuindo um ponto de ebulição de 74°C-86°C a 3-4 mmHg que é uma (+)-exo-3-(2-propenil)-biciclo[2,2,l]heptan-2-ona purificada. Rendimento: 1,38 g (78%). Pureza química (GC): 98,8%. Endo-isómero: 0,9%. Pureza óptica (HPLC): 98% ee. Rotação específica [a] D + 89° (C = 1,286, CHCI3). IR (Película) 3060, 1740, 1640, 1460, 1440, 1310, 1090 cm'1. 1HRMN (CDC13) δ 1,30-2,00 (m, 8H), 2,5-2,6 (m, 3H) δ 4,90-5,20 (m, 2H), 5,7-5,9 (m, 1H).

Os compostos obtidos nos Exemplos de Referência podem ser utilizados para produzir um antagonista do receptor TXA2 que seja útil como medicamento através do método descrito por exemplo, em J. Med. Chem.. 31(9), 1847-1854(1988).

Tal como acima descrito, o presente invento proporciona uma hidrolase de ésteres do tipo norbomano que hidrolisa enantio-selectivamente um éster do tipo (±)-exo-norbomano para produzir norbomeol opticamente activo; um gene estrutural da hidrolase de ésteres do tipo norbomano derivado de Acetobacter pasteurianus; um vector de expressão incluindo o gene estrutural; -30- /<v- um transformante incluindo o vector de expressão; e um método de produção da hidrolase de ésteres do tipo norbomano utilizando o transformante. O norbomeol opticamente activo produzido através da reacção da hidrolase de ésteres do tipo norbomano do presente invento com um éster do tipo (±)-exo-norbomano pode ser sintetizado numa (+)-exo-3-(2-propenil)-biciclo[2,2,l]heptan-2-ona, a partir da qual pode ser produzido um antagonista do receptor TXA2 clinicamente útil.

-31 -

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE:

A) NOME: SffiONOGI & CO., LTD RUA: 3-1-8, Dpsho-machi, Chuo-ku, Osaka-shi C) CIDADE: Osaíca PAIS: Japão CODIGO POSTAL (ZIP): nenhum (ii) TÍTULO DO INVENTO: "HIDROLASE DE ÉSTERES DO TIPO NORBORNANO" (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 1 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OP,ERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LOGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (v) DADOS ÃCTUAIS DO PEDIDO: (A) NUMERO DO PEDIDO: EP 94302834.0 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1167 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (vi) FONTE DE ORIGEM: (A) ORGANISMO: Acetobacter pasteurianus (B) ESTIRPE: ATCC 12873 (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: sequência de codificação (B) LQCALIZAÇÃO: 1 A 1164 „ (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: através de semelhança com uma sequência conhecida ou com um consenso estabelecido ATG TCC AAC ACC ATT ACA GCA CTC ACC ATG CCC AAG TTC GGT TTG GCC 49 Met Ser Asn Thr Ile Thr Ala Leu Thr Met Pro Lys Phé Gly Leu Ala 1 ATG ACA GAA GGC 5 AAG CTG GCA TCA 10 TGG ACA GTA TCT GTT GGC 15 CAG AGC 96 Met Thr Glu Gly Lys Leu Ala Ser Trp Thr Vai Ser Vai Gly Gin Ser GTG CAG CAG 20 GGT GAT GAA CTG GCG 25 GAT ATT GAA ACC ACC 30 AAA ATT ACC 144 Vai Gin Gin Gly Asp Glu Leu Ala Asp He Glu Thr Thr Lys Ile Thr AGC AGT 35 TAT GAA AGC CCC GCC 40 GCA GGT GTG CTG 45 CGC AAA CAG GTG GCC 192 Ser Ser Tyr Glu Ser Pro Ala Ala Gly Vai Leu Arg Lys Gin Vai Ala GAG 50 GCG GGG GAA ACC CTG 55 CCC GTG GGC GCA CTG 60 ATT GGT GTT TTG GCA 240 Glu Ala Gly Glu Thr Leu Pro Vai Gly Ala Leu Ile Gly Vai Leu Ala 65 GAT GCC GAA ACG CCA 70 GAT GTG GAT ATT GAA 75 GCC TTT ATÇ AAA AAC so TTT 288 Asp Ala Glu Thr Pro Asp Vai Asp Ile Glu Ala Phe Ile Lys Asn Phe CA7 GCA GAA AAC 35 CCA CAG GAT GCG OO GCT GCA ACA GAA GAT GCC 95 GCC 336 His Ala Glu Asn Pro Gin Asp Ala Ala Ala T«U v Glu Asp Ala Ser Ala -32- 100 103 110 GGG GAA CCC AAG CAG GTT ACG GTA GGC GAA CAC ACG CTA AAT 6TG CGT 384

Gly Glu Pro Lys Gin Vai Thr Vai Gly Glu His Thr Leu Asn Vai Arg 115 120 125 GAT GTT GGC ACG CAG GAG GGC ACG CCC ATT GTG CTG GTG CAC GGT TTT 432

Asp Vai Gly Thr Gin Glu Gly Thr Pro Ile Vai Leu Vai His Gly Phe 130 135 140 GGC GGA GAT ATC AGC AAC TGG CTG CTC ACA CAG GAT.GCC TTG GCC GCA 480

Gly Gly Asp Ile Ser Asn Trp Leu Leu Thr Gin Asp Ala Leu Ala Ala 145 150 155 160 GAA AGG CGC GTA ATT GCG TTT GAT CTG CCG GGG CAT GGG GCT TCC TCT 528

Glu Arg Arg Vai Ile Ala Phe Asp Leu Pro Gly His Gly Ala Ser Ser 165 170 175 AAA AAC GTG GGC ACA GGC ACG CTG GCG TTT TTG GCC GGT GTG GTA AGC 576

Lys Asn Vai Gly Thr Gly Thr Leu Ala Phe Leu Ala Gly Vai Vai Ser 180 1S5 190 GAA TTG CTG CAA ACC CTT AAA ATA GAA AAA GCC CAT GTG GTG GGC CAT 624

Glu Leu Leu Gin Thr Leu Lys Ile Glu Lys Ala His Vai Vai Gly His 195 200 205 TCT TTG GGG GGC GGC ATT GCC CTG ACC CTG CTG CGA GAT CAC CCT GAT 672

Ser Leu Gly Gly Gly Ile Ala Leu Thr Leu Leu Arg Asp His Pro Asp 210 215 220 AG GTT GCC AGC CTG AAC CTT TTG GCC CCA GCC GGG TTG GGT AAG GAT 720

Gin Vai Ala Ser Leu Asn Leu Leu Ala Pro Ala Gly Leu Gly Lys Asp 225 230 235 240 GTG AAT GCA GAT TTT ATC AGC GCA TTT GTG GAT AGT GAA AGC AGC CGC 768

Vai Asn Ala Asp Phe Ile Ser Ala Phe Vai Asp Ser Glu Ser Ser Arg 245 250 255 GAT ATG AAG GCT GTT TTG CAA ATG CTG GTG TAT AAC AAA GCC CTA GTG 816

Asp Met Lys Ala Vai Leu Gin Met Leu Vai Tyr Asn Lys Ala Leu Vai 260 265 270 GGC CGT AAG ATG GTG GAT GCC GTG CTG CGT GCA CGT AGG CTA GAT GGC 864

Gly Arg Lys Met Vai Asp Ala Vai Leu Arg Ala Arg Arg Leu Asp Gly 275 280 285 GCG CGG GAT GCC CTG CAC GTT ATT GCT AAA GCG TGC TTC CCC AAC GGG 912

Ala Arg Asp Ala Leu His Vai Ile Ala Lys Ala Cys Phe Pro Asn Gly 290 295 300 CAT CAG GCG GAT GAT CTG CAC TCG GTG CTA GCT GGG GCG GAA ACA CCT 960

His Gin Ala Asp Asp Leu His Ser Vai Leu Ala Gly Ala Glu Thr Pro 305 310 315 320 ACC CAG ATT TTC TGG GGC AAG GAA GAT GAA ATT CTT TCT GTC TCC AAC 1008

Thr Gin Ile Phe Trp Gly Lys Glu Asp Glu Ile Leu Ser Vai Ser Asn 325 330 335 ICC GCT GGC CTG CCA GAT GTC ATC CCC GTG ACA GTG TAT GAA GAA ACA 1056

Ala Ala Gly Leu Pro Asp Vai Ile Pro Vai Thr Vai Tyr Glu Glu Thr 340 345 350 GGC CAT CTG CCG CAG CTT GAA CAT GCA ACA GAT GTG AAC AAA GCC ATT 1104

Gly His Leu Pro Gin Leu Glu His Ala Thr Asp Vai Asri Lys Ala Ile 355 360 365 GCC CTG TTT GTA AAA GAC CCC GAA GCC GCG CTG AGC ATG GCC CGG ATG 1152

Ala Leu Phe Vai Lys Asp Pro Glu Ala Ala Leu Ser Met Ala Arg Met 370 375 380 GAC GCG ACA GCC TAA 1167

Asp Ala Thr Ala 385

Lisboa, 16 de Novembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1500 IISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Hidrolase de ésteres do tipo norbomano compreendendo uma sequência de aminoácidos desde Met na posição 1 até Ala na posição 388 de SEQIDNo:!.
2. Sequência de ADN codificando a hidrolase de ésteres do tipo norbomano da reivindicação 1.
3. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 2 compreendendo uma sequência de bases desde A na posição 1 até C na posição 1164 de SEQID No: 1.
4. Vector de expressão incluindo uma sequência de ADN que codifica a hidrolase de ésteres do tipo norbomano da reivindicação 1.
5. Transformante produzido pela introdução do vector de expressão da reivindicação 4 num hospedeiro.
6. Transformante de acordo com a reivindicação 5, em que o hospedeiro é E. coli.
7. Método de produção de uma hidrolase de ésteres do tipo norbomano compreendendo os passos de cultura do transformante da reivindicação 5 num meio de cultura e recuperação da hidrolase de ésteres do tipo norbomano produzida a partir da cultura.
8. Método de produção de um norbomeol opticamente activo -2- compreendendo os passos de deixar um éster do tipo (±)-exo-norbomano entrar em contacto com uma hidrolase de ésteres do tipo norbomano da reivindicação 1; sendo o éster do tipo (±)-exo-norbomano representado pela Fórmula I: -2-

em que R é acilo e A e B são hidrogénios, respectivamente, ou onde A e B estão ausentes, resultando numa ligação dupla carbono-carbono entre os carbonos aos quais A e B estão ligados na Fórmula I.
9. Método de produção de acordo com a reivindicação 8, em que R na Fórmula I é acetilo e A e B são hidrogénios, respectivamente. Lisboa, 16 de Novembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA