PT652776E - Conjugados hepatropicos de drogas antivirais, seus transportadores e composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Conjugados hepatropicos de drogas antivirais, seus transportadores e composicoes farmaceuticas que os contem Download PDF

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Description

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DESCRICÃO “Conjugados hepatotrópicos de drogas antivirais, seus transportadores e composições farmacêuticas que os contêm” O presente invento refere-Se a compostos com actividade antiviral e, mais especificamente, a compostos conjugados de droga antiviral com transportadores que possuem actividade hepatotrópica.
No tratamento das infecções causadas por vírus, podem-se reduzir os efeitos secundários produzidos por drogas antivirais com a adopção da abordagem quimioterapêutica lisossomotrópica (Balboni PG, Minia A, Grossi MP, Barbanti-Brodano G, Mattioli A, Fiume L, “Activity of albumin conjugates of 5-fluorodeoxyuridine and cytosine arabinoside on poxviruses as a lysosomotropic approach to antiviral chemotherapy”, Nature 1976;264:181-183).
Isso consiste em conjugar a droga com uma macromolécula que é selectivamente capturada das células infectadas e daí transportada nos lisossomas.
Se, como se deseja, os enzimas do lisossoma quebram a união entre o transportador e a droga, o último resulta como estando concentrado numa forma farmacologicamente activa nas células infectadas.
As hepatite crónicas provocadas pelo vírus B (HBV) e pelo vírus C (HCV) são alvos apropriados para esta abordagem quimioterapêutica porque: (a) estes vírus desenvolvem-se especialmente nos hepatócitos; (b) os hepatócitos trazem especificamente para dentro e transportam nos lisossomas algumas glicoproteínas com resíduos de galactose que podem assim funcionar como vectores hepatotrópicos de drogas; (c) os conjugados de drogas/ glicoproteínas podem facilmente contactar com a superfície dos hepatócitos visto que as sinusoides hepáticas não constituem uma barreira para proteínas.
Seguindo esta abordagem e para reduzir os seus efeitos secundários neurotóxicos, conjugou-se a droga antiviral adenina-monofosfato de arabinósido (ara-AMP), activa contra HBV (Jacyna MR, Thomas HC, “Antiviral therapy: Hepatitis B”, Brit. Med. Buli, 1990; 46: 369-382), com asialofetuína (AF) (Fiume L.; Mattioli A, Busi C, Balboni PC, Barbanti-Brodano G, De Vries J, Altman R, Wieland Th, “Selective inhibition of Ectromelia viras DNA synthesis in hepatocytes by adenine-9-P-D-arabinofuranoside (ara-A) and adenine^-D-arabinofuranoside 5’-monophosfate (ara-AMP) conjugated to asialofetuin”,
85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ FEBS Letters, 1980; 116: 185-188) e com a albumina lactosaminada (L-SA) (Fiume L, Busi C, Mattioli A, Balboni PG, Barbanti-Brodano G, “Hepatocyte targeting of adenine-9-β-D-arabinofuranoside 5’-monophosphate (ara-AMP) coupled to lactosaminated albumin”, FEBS Lett., 1981; 129: 261-264; Fiume L., Bassi B, Busi C, Mattioli A, Spinosa G, “Drug targeting in antiviral chemotherapy. A chemically stable conjugate of 9-P-D-arabinofuranosvladenine 5’-monophosphate with lactosaminated albumin accomplishes a selective delivery of the drug to liver cells”, Biochem Pharmacoi, 1986; 35: 967-972). Em ratos, estes dois transportadores causaram ambos um alvo hepático da droga. A L-SA tem uma grande vantagem sobre a AF: de facto, os conjugados preparados com albumina lactosaminada homóloga (ou seja, da mesma espécie), quando introduzidos por via intravenosa, não induzem a formação de anticorpos (Fiume L, Mattioli A, Busi C, Spinosa G, Wieland Th, “Conjugates of adenine-9-P-D-arabinofuranoside monophosphate (ara-AMP) with lactosaminated homologous albumin are not immunogenic in the mouse”, Experientia, 1982; 38: 1087-1089; Fiume L, Busi C, Preti P, Spinosa G “Conjugates of ara-AMP with lactosaminated albumin: a study on their immunogeneticity in mouse and rat”, Câncer Drug Delivery, 1987; 4: 145-150).
Em marmotas com hepatite provocada por WHV (Ponzetto A, Fiume L, Forzani B, Song SY, Busi C, Mattioli A, Spinelli C, Marinelli M, Smedile A, Chiaberge E, Bonino F, Gervasi GB, Rapicetta M, Verme G, “Adenine arabinoside monophosphate and acyclovir monophosphate coupled to lactosaminated albumin reduce woodchuck hepatitis virus virema at doses lower than do the unconjugated drugs”, Hepatology, 1991; 14: 16-24) e em pacientes com infecção crónica provocada por HBV (Fiume L, Torrani Cerenzia MR, Bonino F, Busi C, Mattioli A, Brunetto MR, Chiaberge E, Verme G, “Inhibition of hepatitis B virus replication by vidarabine monophosphate conjugated with lactosaminated serum albumin”, Lancet 1988; 2: 13-15. Torrani Cerenzia MR, Fiume L, Busi C, Mattioli A, Di Stefano G, Gervasi GB, Brunetto MR, Piantino P, Verme G, Bonino F, “Inhibition of hepatitis B virus replication by adenine arabinoside monophosphate coupled to lactosaminated albumin. Efficacy, minimal effective dose and plasma clearance of conjugate”, J. Hepatol. 1994; 20: 307-309), o ara-AMP conjugado com o L-SA inibiu a replicação do vírus a doses 3-6 vezes menores do que as da droga livre. O conjugado com L-SA devia ser administrado por via intravenosa por causa do elevado volume necessário para a injecção, e porque pelas outras vias produzem-se anticorpos, e isto resulta numa má concordância do paciente em tratamentos de longa duração.
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Um transportador hepatotrópico de ara-AMP e de outras drogas antivirais que permitisse a administração intramuscular dos respectivos conjugados seria desta forma um progresso notável do ponto de vista terapêutico.
Sabe-se também que um poliaminoácido básico, a poli-L-lisina, com um terço dos grupos amino substituídos com resíduos de galactose, se administrado via intravenosa, actua como um alvo hepático de ara-AMP (Fiume L, Bassi B, Busi C, Mattioli A, Spinosa G, Faulstich H, “Galactosylated poli(L-lysine) as a hepatotropic carrier of 9-P-D-arabinofuranosyladenine 5’-monophosphate'’, FEBS Letters 1986; 203: 203-206). Para além disso, a poli-L-lisina, quando todos ou grande parte dos seus grupos E-amina estão substituídos, não forma anticorpos mesmo quando administrada por diferentes vias da injecção intravenosa (Levine BB, “Studies on antigenicity. The effect of succinylation of E-amino groups on antigenicity of benzylpenicilloyl-poli-L-lysine conjugates in random-bred and in strain 2 Guinea pig”, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1964; 116: 1127-1131; Sela M., “Immunological studies with synthetic polypeptides”, Advan Immunol., 1966; 5: 29-129).
Verificou-se agora que se na poli-L-lisina a maioria dos grupos E-amino estiverem substituídos com a galactose e com uma das drogas antivirais, conhecidas por exibirem a sua actividade contra vírus hepáticos, produzem-se três efeitos muito importantes em ratos: (i) o conjugado perde a elevada toxicidade da poli-L-lisina que distinguia os conjugados poli-L-lisina-ara-AMP com galactose (Fiume et al, FEBS Letters 1986, 203, 203-206) nos quais a maioria dos grupos E-amina permanecia não substituída; (ii) o alvo hepático da droga antiviral surge mesmo se o conjugado não for administrado via intravenosa, e particularmente, por injecção intramuscular. (iii) a administração repetida de conjugado por injecção intravenosa e intramuscular não produz anticorpos. A importância terapêutica desta propriedade será evidente se se considerar que a possibilidade de se conseguir o alvo hepático por injecção intramuscular não só envolve utilizar as suas características peculiares interessantes já previamente mencionadas em relação à abordagem lisossomotrópica (i.e., redução drástica dos efeitos secundários relevantes para a toxicidade das drogas antivirais) como também, igualmente importante, toma mais confortável para o paciente submeter-se a tratamento quimioterapêutico que, como regra na hepatite virai crónica, é de longa duração.
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Na definição preferida, selecciona-se o poliaminoácido básico entre poli-L-lisina e poli-L-omitina e as drogas de entre as conhecidas pela sua actividade contra vírus hepáticos, e particularmente entre ara-AMP, aciclovir, ribavirina, azidotimidina, e outros do género. O presente invento refere-se assim à utilização, como transportador de drogas antivirais, de um poliaminoácido com galactose, básico, caracterizando-se o dito poliaminoácido por a maioria dos grupos amino estarem substituídos com moléculas da droga e com moléculas de galactose.
Este elevado grau de substituição elimina a toxicidade aguda tanto dos poliaminoácidos básicos como dos conjugados de poli-L-lisina previamente publicados (Fiume et al., FEBS Letters 1986; 203: 203-206) nos quais se substituíram menos de 50% dos grupos E-amina pela droga e pelos resíduos de galactosilo. A preparação dos compostos conjugados em conformidade com o presente invento proporciona um procedimento em dois passos: (a) conjugação do poliaminoácido básico com droga antiviral ou com resíduos de galactose, e (b) subsequente conjugação do conjugado resultante do passo (a) com resíduos de galactose ou resíduos de drogas antivirais, respectivamente. Na definição geral anterior pode-se salientar que os dois passos de conjugação podem estar invertidos.
Como regra, a escolha é sugerida pelo peso molecular do poliaminoácido na medida em que, com pesos moleculares mais baixos, é preferível efectuar primeiro a conjugação com a droga e depois disso a conjugação com galactose.
Numa concretização preferida do processo em conformidade com o presente invento a conjugação da droga é efectuada de uma maneira conhecida por si através do imidazolato da droga antiviral na sua forma de monofosfato e realizando a conjugação a pH alcalino (Fiume L, Busi C, Di Stefano G, Mattioli A, “Coupling of antiviral nucleoside analogs to lactasaminated human albumin by using the imidazolides of their phosphoric esters”, Analyt. Biochem., 1993, 212: 407-411).
Os resíduos de galactose conjugam-se preferencialmente (passo b) por lactosaminação redutiva na presença de cianoboro-hidreto de sódio (Schwartz BA, Gray GR,
85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 5 “Proteins containing reductively aminated disaccharides Synthesis and Chemical characterization”, Arch. Biochem. Biophys. 1977; 181: 542-549).
Como exemplo não restritivo, apresentam-se os exemplos de preparação referentes à utilização de poli-L-lisina e de poli-L-omitina como transportador, e de ara-AMP, aciclovir, ribavirina e azidotimidina como drogas antivirais, entendendo-se que se seguem procedimentos semelhantes para preparar conjugados com outras drogas antivirais conhecidas.
Prepararam-se conjugados com poliaminoácidos básicos de elevado peso molecular e de baixo peso molecular. 1. Conjugados de baixo peso molecular A. Conjugados com poli-L-lisina A. 1. Preparação
Numa composição comercial (Sigma) de poli-L-lisina com um peso molecular de 1000-4000 Da e com um grau de polimerização médio de 14, retiraram-se os polímeros com um peso molecular inferior a 1800 por meio de uma filtração em gel numa coluna de Bio Gel P2® eluída com 0,2 M de NH4HCO3. Utilizaram-se os polímeros excluídos da coluna, após liofilização, para preparar os compostos apresentados no Quadro 1 que se segue.
Em todos os conjugados ligaram-se os resíduos de galactose aos grupos E-amina por lactosaminação redutiva na presença de cianoboro-hidreto de sódio (Schwartz BA, Gray GR, Arch. Biochem. Biophys. 1977; 181: 542-549).
Composto 1
Marcou-se a poli-L-lisina com [3H]formaldeído segundo o método de Jentoft e Dearbom (Jentoft N, Dearbom DG, “Protein labelling by reductive alkylation”, Methods Enzymol. 1983; 91: 570-579). A mistura reaccional continha 44 pCi de [3H]formaldeído/ml. Isolou-se a [JH]poli-L-lisina por meio de filtração em gel numa coluna de Bio Gel P2® e subsequente liofilização. 85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 6
Quadro 1
Características de conjugados de poli-lisina de baixo peso molecular
Compostos pg de Lactose mg de Composto pg de Droga mg de Composto % de grupos E-NH2 substituídos por Actividade específica (dpmxl07mg) Lactose Droga 1) [JH]poli-L-lisina 0 0 0 0 1200 2) [l4C]Lat-poli-L-lisina 721 0 92 0 860 3) [l4C]Lat-poli-L-lisina-ara-AMP 540 206 72 28 860 4) Lat-poli-L-lisina-ara-AMP 493 240 66 33 0 5) Lat-[JH]poli-L-lisina-ara-AMP 573 147 72 20 36000 6) Lat-poli-L-lisina-ara-[JH]AMP 613 176 73 22 7500 7) Lat-poli-L-lisina-[3H]ACVMP 638 81 80 12 440
Composto 2
Ligou-se a galactose a polilisina por lactosaminação redutiva na presença de cianoboro-hidreto de sódio. Dissolveram-se 20 mg de poli-L-lisina em 2 ml de um tampão 0,1 M de ácido bórico/borax (pH 8,5). Adicionaram-se 80 mg de alfa-lactose, contendo 50 pCi de [D-glucose-l-l4C]lactose (Amersham), e 50 mg de NaBHsCN. Incubou-se a mistura a 37°C durante 48 horas e isolou-se a [14C]Lat-poli-L-lisina, como para o Composto 1. Mediu-se o teor de lactose com o método de Dubois et al. (Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F, “Colorimetric method for determination of sugar and related substances”, Anal. Chem. 1956; 28: 350-356) e referiram-se ao peso seco do composto.
Compostos 3 e 4
Conjugou-se o ara-AMP por meio do seu imidazolato (Fiume L, Busi C, Di Stefano G, Mattioli A,Analyt. Biochem. 1993; 212: 407-411).
Este procedimento é mais eficaz do que o que utiliza as carbodiimidas solúveis em água e evita as reacções químicas secundárias produzidas por estas substâncias.
Preparou-se o imidazolato de ara-AMP com o método de Lohrmann e Orgel (Lohrmann R, Orgel LE, “Preferential formation of (2’-5’)-linked intemucleotide bonds in non-enzymatic reactions”, Tetrahedron 1978; 34: 853-855). Dissolveu-se poli-L-lisina (50 mg/ml) num tampão 0,1M de NaHCCL/NaiCCh, pH 9,5. Após a adição do imidazolato de ara-AMP (75 mg/ml), ajustou-se o pH a 9,5 com HC1 e incubou-se a mistura durante 48 horas a 37°C. Isolaram-se os conjugados como Composto 1; determinou-se o teor de ara-AMP por espectro fotometria e referiu-se ao peso seco dos conjugados, que ainda se submeteram a lactosaminação (para o Composto 4 usando lactose não marcada).
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Composto 5
Marcou-se ο conjugado de poli-L-lisina/ ara-AMP, obtido como se indicou para os compostos 3 e 4, com [3H]formaldeído (100 mCi/mmol). A mistura de reacção continha 2800 pCi de [Ή]ίοιτη aldeído/ ml. Submeteu-se então o conjugado marcado a lactosaminação, como se descreveu acima. Usou-se este conjugado como antigénio na determinação de anticorpos com o método de Minden e Farr (Minden P, Farr RS, "‘The ammonium sulphate method to measure antigen-binding capacity”, Weir DM ed., Handbook ofExperimental Immunology, Blackwell, Oxford 1973).
Composto 6
Efectuou-se a conjugação de ara-AMP marcado com trítio neste composto, usando l-etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida (ECDI), uma vez que a conversão de ara-[JH]AMP no seu imidazolato causa uma perda quase total de trítio. Primeiro, submeteu-se a poli-L-lisina a lactosaminação da forma descrita acima (Composto 2), mas reduzindo o período de reacção de 48 para 24 horas a fim de substituir com o açúcar apenas 2/3 dos grupos E-amino. A seguir, conjugou-se a ara-[JH]AMP em conformidade com o procedimento acima (Fiume L, Bassi B, Busi C, Mattioli A, Spinosa G, Faultstich H, FEBS Letters 1986; 203: 203-206). Na preparação deste conjugado o primeiro passo foi a lactosaminação para reduzir o número dos grupos E-amino livres aquando da utilização do ECDI e, deste modo a possibilidade de polimerizar as moléculas de poli-L-lisina por meio deste composto.
Composto 7
Obteve-se o [JH]ACVMP usado para produzir este conjugado, por fosforilação (Yoshikawa M, Kato T, Takenishi T, “A novel method for phosphorylation of nucleosides to 5’-nucleotides”, Tetrahedron Lett. 1967; 50: 5065-5068) de [3H]ACV(com trítio na posição 2 da cadeia lateral)(NEN). Preparou-se o conjugado como para os compostos 3 e 4, com a diferença de que a incubação da poli-L-lisina com [3H]ACVMP com imizadolato ter apenas durado 6 horas.
Produziu-se o imidazolato de [3H]ACVMP com o método de Lohrman e Orgel supracitado. 85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 8
Ο produto conjugado deste invento obtido nos Exemplos anteriores sofreram determinações químico-físicas e testes biológicos destinados a encontrar a confirmação experimental das propriedades terapêuticas dos próprios compostos.
As determinações seguintes referem-se às figuras inclusas, nas quais: a Figura 1 mostra o diagrama de cromatografia em Bio Gel P 10® do Lat-poli-L-lisina-ara-AMP (Composto 4 do Quadro 1). as Figuras de 2A-2G mostram a distribuição de radioactividade no fígado (), no baço (·), no intestino (o) e no cérebro (íl) de ratos Swiss fêmea (28-30 g) nos quais se administraram os compostos do invento (Quadro 1) e os compostos não conjugados para comparação, através de injecção intramuscular, a Figura 3 mostra o diagrama de cromatografia em Bio Gel P 2 em extractos de fígado de ratos injectados com o composto 3 do Quadro 1. A.2. Observações Experimentais a) Peso molecular médio do Composto 4 A Figura 1 mostra a cromatografia do Lat-poli-L-lisina-ara-AMP (Composto 4 do Quadro 1) numa coluna de Bio Gel PIO® (1,6x92) equilibrada com azul de dextrano 2000 (volume vazio), ribonuclease (Mr 13700) e aprotinina (Mr 6500).
Puseram-se 25 mg de conjugado numa coluna com 1,6X92 cm equilibrada e eluída com NH4HCO3 0,2M. As ffacções foram de 2 ml. Determinaram-se os volumes de eluição do conjugado e dos marcadores (os últimos indicados por setas).
Com o método de Whitaker (Whitaker JR, “Determination of molecular weights of proteins by gel filtration on sephadex”, Analyt. Chem. 1963; 35: 1950-1953), calculou-se que o peso molecular médio de conjugado é 9100, correspondendo a um transportador com 19 resíduos de Usina e um peso molecular médio de 2400. b) Distribuição dos compostos nos órgãos
Como já foi mencionado, as Figuras 2A-2G mostram a distribuição de radioactividade nos órgãos de ratos, após a injecção intramuscular de: A, [3H]poli-L-lisina (24 μg/g); B, [14C]Lat-poli-lisina (24 .ug/g); C, ara-[3H]AMP (5 .ug/g); D, [l4C]Lat-poli-L-lisina-ara-AMP (24 pg/g); E, Lat-poli-L-lisina-ara-[3H]AMP (28 pg/g,
85 796 ΕΡ Ο 652 776 ί ΡΤ correspondendo a 5 pg/g de ara-[3H]AMP; F, [JH]ACVMP (4 pg/g); G, Lat-poli-L-lisina-[3H]ACVMP (50 pg/g, correspondendo a 4pg/g de [3H]ACVMP). Injectaram-se todos os compostos num volume de 10 pl/ animal nos músculos posteriores da pema usando uma micro-seringa Hamilton de 25 pl.
Calculou-se a contribuição para a radioactividade concedida pelo plasma contido nos órgãos (Fiume L, Busi C, Mattioli A., “Lactosaminated human serum as hepatotropic drug carrier - Rate of uptake by mouse liver”, FEBS Letters 1982; 146: 42-46) e submeteu-se a substracto.
Cada dado representa a média dos resultados obtidos em 2-3 animais. O erro padrão variou de 0,1 a 2% dos valores médios.
Como se ilustrou após a administração de [JH]poli-L-lisina (2A), ara-['H]AMP (2C) e [JH]ACVMP (2F), as quantidades de radioactividade em fígado, baço, intestinos e cérebro são praticamente equivalentes. E, como alternativa, após injecção de [14C]Lat-poli-L-lisina (2B) e de conjugados da Lat-poli-L-lisina com ara-AMP e ACVMP, marcados na lactose (2D) ou nas drogas (2E, 2G), os níveis de radioactividade no fígado são superiores aos dos outros órgãos.
As percentagens de radioactividade medidas em 1 g de fígado após administração de ara-[JH]AMP e [3H]ACVMP (2C, 2F) são semelhantes às calculadas após injecção de uma dose igual dessas drogas conjugadas com a Lat-poli-L-lisina (2E, 2G).
Em rins, os níveis de radioactividade atingem os mesmos valores que em fígado uma hora após a injecção dos conjugados marcados (Composto 3 no Quadro 1) ou de 1,5-2 vezes superiores (Compostos 6 e 7). Nos tempos subsequentes, os níveis de radioactividade de rins são iguais ou inferiores quando comparados com os de fígado. Os elevados níveis de radioactividade em rins podem ser explicados pela observação que vários polipéptidos, após a filtração glomerular, são endocitados pelas células dos túbulos proximais dos rins (Maack Th, Johnson V, Kau ST, Figueiredo J, Sigulem D, “Renal fíltration, transport and metabolism of low molecular weight proteins”, Kidney Int. 1979; 16: 251-270). A penetração nas células renais não deve ter nenhum efeito no índice quimioterapêutico dos conjugados de Lat-poli-L-lisina/drogas antivirais. De facto, tirando o aciclovir que tem tendência a precipitar nos túbulos dos rins (Balfour HH, “Acyclovir and other chemotherapy for herpes group virai infections”, Ann. Rev. Med. 1984; 35: 279-291), os nucleósidos antivirais não são particularmente tóxicos para as células deste órgão.
85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 10 c) Digestão de Composto 3 no fígado A ruptura da ligação entre ara-AMP e os grupos E-amino da poli-L-lisina com galactose nas células hepáticas foi demonstrada por investigações anteriores (Fiume L, Bassi B, Bongini A, “Conjugates of 9-P-D-ara-binofuranosyl-adenine 5’-monophosphate (ara-AMP) with lactosaminated albumin: characterization of the drug-carrier bonds”, Pharm. Acta Helv. 1988; 63 137-139). A Figura 3 mostra os perfis cromatográficos em Bio Gel P 2 dos extractos de fígado de ratos, 2 e 6 horas após a injecçào intramuscular de [l4C]Lat-poli-L-lisina-ara-AMP (24 _ug/g).
Ratos Swiss fêmea de 28-30 g receberam por injecçào intramuscular o conjugado (24 pg/g num volume total de 10 μΐ).
Após 3 (□) ou 6 (·) horas, sacrificaram-se os ratos (dois animais de cada vez) e homogeneizaram-se os fígados com 4 volumes de água fria; adicionaram-se imediatamente 5 volumes de ácido perclórico e após centrifugação neutralizaram-se os sobrenadantes com KOH.
Após 2 horas no frio, centrifugou-se o perclorato de potássio e secaram-se os sobrenadantes por congelação.
Dissolveu-se novamente o material seco por congelação em 2 ml de EDO e, após centrifugação para clarificar a solução, submeteu-se 1 ml a cromatografia numa coluna (1,6x92 cm) de Bio Gel P 2, equilibrada e eluída com NH4HCO3 0,2M. A radioactividade presente nas fracções, onde eluiram as moléculas incluídas no gel e possuindo dimensões maiores do que as de lactose, demonstra que a poli-L-lisina se fragmenta no fígado, mesmo que os seus grupos E-amino estejam ainda ligados ao açúcar. O símbolo O na figura refere-se ao perfil cromatográfico do extracto de um fígado homogeneizado obtido de dois ratos não tratados e ao qual se adiciona o conjugado (14 pg/ml) mesmo antes da precipitação com ácido perclórico.
d) Produção de anticorpos em ratos tratados com Composto A
Doze ratos Swiss fêmea (28-30 g de peso no inicio do teste) receberam o conjugado N.° 4 (Quadro 1) administrado nos músculos posteriores da pema durante cinco dias por
85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 11 semana, durante quatro semanas consecutivas (dose diária unitária = 700 pg/animal em 10 μΐ de NaCl a 0,9 %).
Retirou-se sangue do plexus retro-orbital dos ratos com anestesia de éter uma semana após a última injecção.
Dosearam-se os anticorpos em 50 μΐ de soro e em triplicado por meio do método de precipitação com sulfato de amónio, em conformidade com o procedimento de Minden e Farr.
Usou-se como antigénio o conjugado 5 (Quadro l).
Na presença de 50 μΐ de soro de 5 ratos não tratados, o dmp precipitado foi 78=11 (EP). Na presença de 10 μΐ de um soro de rato capaz de ligar o ara-A(938 pmoles de ara-A ligado por 1 ml de soro) ou o ara-AMP conjugado com o L-HSA (Fiume L, Bassi B, Busi C, Mattioli A, Wieland Th, “A study on the pharmacokinetics in mouse of adenine-9-P-D-arabinofúranoside 5-monophosphate conjugated with lactosaminated albumin”, Experientia 1985; 41, 1326-1328), o dmp precipitado foi de 1599±21.
Na presença dos soros dos doze ratos tratados com o conjugado Lat-poli-L-lisina-ara-aMP, o dmp precipitado variou de um mínimo de 41=5 a um máximo de 80±6 dpm.
Este resultado mostrou que nenhum dos ratos tratados produziu anticorpos doseáveis com o método usado, cuja sensibilidade era cerca de 0,5 pg/ IgG/ ml de soro. e) Toxicidade aguda de Composto 4
Administrou-se o conjugado Lat-poli-L-lisina-ara-AMP (N° 4), dissolvido em NaCl a 0,9%, a ratos Swiss fêmea de 28-30 g por via intravenosa (5 animais) ou subcutânea (5 animais) com uma única injecção de 0,4 ml/ animal e numa dose de 1,3 mg/g. Não apresentou evidência de qualquer toxicidade. A dose injectada foi 50 vezes maior, quando comparada com a administrada por injecção intramuscular nas experiências de distribuição do conjugado nos órgãos (Figura 2). 85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 12
Ο LD50 para os ratos Swiss fêmea da poli-L-lisina utilizada para produzir este conjugado, injectado por via intravenosa, na forma de sal de ácido clorídrico, resultou estar entre 30 e 60 pg/g. f) Solubilidade do Composto 4
Administrou-se em pacientes com hepatite B crónica ara-AMP não conjugado a doses de 2,5 ou 5 mg/lkg com duas injecções por dia. O conjugado Lat-poli-L-lisina-ara-AMP (N° 4) dissolve-se facilmente numa solução fisiológica a uma concentração de 400 mg/ml.
Pode-se portanto administrar 24 mg/kg, dose que corresponde a 5 mg/kg de ara-AMP, a um paciente de 70 Kg de peso, num volume inferior a 5 ml. B. Conjugado com noli-L-orinitina B.l. Preparação
Composto 8
Preparou-se este composto usando uma poli-L-omitina HBr (Sigma) com um peso molecular de 5300-7600. Marcou-se a poli-L-omitina (25 mg) com [JH]formaldeido (100 mCi/mmol) (NEN) de acordo com Jentoft e Dearbon (Methods Enzymol. 1983, 91: 570-579). A mistura reaccional continha 98 pCi (3H)formaldeído/ ml. Isolou-se [JH]poli-L-omitina da mistura de reacção por filtração em gel numa coluna de Bio Gel P2 eluída com NH4HCO3 0,5M e a seguir liofilizou-se. Acoplou-se o imidazolato de ara-AMP ao polímero marcado usando 0 procedimento seguido para os Compostos 3 e 4.
Para a subsequente lactosaminação, dissolveram-se 10 mg de [3H]poli-L-omitina-ara-AMP em 1 ml de tampão 0,1 M de borax/NaOH, pH 10, junto com 80 mg de α-lactose e 50 mg de NaBH3CN. Incubou-se a solução durante 72 horas a 37°C. Recuperou-se o conjugado submetido a lactosaminação (Lat-[3H]poli-L-omitina-ara-AMP) por filtração em gel numa coluna de Bio Gel P2 eluída com NH4HCO3 0,5M e a seguir liofilizou-se. 1 mg de composto (actividade específica 668 dmp/pg) continha 134 μg de ara-AMP (determinado por espectrofotometria) e 604 pg de lactose (medida de acordo com Dubois et ai, Anal. Chem. 1956; 28: 350-356). Cerca de 90% dos grupos E-amino do polímero estavam substituídos: 17% com a droga, 73% com lactose. 85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 13
Β.2. Observações experimentais a) Distribuição de Composto 8 ao órgão A Figura 4 mostra a distribuição no órgão de radioactividade em ratos após injecção intramuscular de Lat-[3H]poli-L-ornitina-ara-AMP (36,5 pg/g, correspondendo a 5μg/g de ara-AMP). O procedimento experimental foi como o descrito para as experiências semelhantes com os conjugados Lat-poli-L-lisina. Os níveis de radioactividade em fígado foram maiores do que nos outros órgãos. Os valores de radioactividade no rim foram 3-4 vezes maiores do que no baço, intestino e cérebro. II. Conjugados de elevado peso molecular
Em pacientes com hepatite virai, a remoção das moléculas terminais de galactosilo é muito mais lenta do que em ratos, ratazanas e humanos normais, provavelmente devido a uma penetração mais lenta nos hepatócitos (Marshall JS, Williams S, Jones P, “Serum desialylated glycoproteins in patients with hepatobiliary dysfunctions”, J. Lab. Clin. Med. 1978; 92: 30-37; Torrani Cerenzia MR et al., J. Hep atol. 1994; 20: 307-309). Como consequência, espera-se que a eliminação renal dos conjugados preparados com poliaminoácidos com baixo peso molecular nesses pacientes seja ainda maior do que a medida em ratos.
Para ultrapassar esta desvantagem, preparámos conjugados usando uma poli-L-lisina de elevado peso molecular. Também, nestes conjugados substituiu-se a maioria dos grupos E-amina de poli-L-lisina por moléculas de droga e de galactose.
Observou-se que: 1) Os conjugados de elevado peso molecular penetravam de forma específica também em células de fígado após administração intramuscular. 2) A perda renal desses conjugados é muito baixa e, consequentemente, a percentagem de dose injectada que entra nos hepatócitos é superior à medida após a administração de conjugados de peso molecular baixo. 3) Os conjugados de elevado peso molecular são também desprovidos de toxicidade aguda e, após administração repetida por via intramuscular ou intravenosa, não induzem anticorpos.
85 796 ΕΡ Ο 652 776 ί ΡΤ 4) Devido à sua elevada solubilidade (mais de 150 mg/ml) e elevada carga de droga, podia-se administrar uma dose farmacologicamente activa num pequeno volume, com boa compatibilidade com a via intramuscular. II. 1. Preparação
Prepararam-se estes conjugados usando uma poli-L-lisina HBr com um peso molecular de 30-70.000 e um grau de polimerização de 145-335 (Sigma). Como na preparação de conjugados de poli-L-lisina de baixo peso molecular acoplaram-se drogas via imidazolato dos seus ésteres fosfóricos e ligou-se lactose por aminação redutiva na presença de NaBHjCN. Contudo, modificou-se o procedimento: aumentou-se o pH, a temperatura, a duração do tempo de reacção, assim como a concentração de imidazolato no passo de conjugação da droga. Para além disso, efectuou-se a lactosaminação antes de se acoplar a droga uma vez que, a pH elevado, a poli-L-lisina de elevado peso molecular precipitava a menos que uma parte dos grupos E-ΝΉ? estivessem substituídos com resíduos de galactose.
Composto 9
Efectuou-se a lactosaminação redutiva de grupos E-NEL, dissolvendo 200 mg de poli-L-lisina em 20 ml de tampão 0,4M de fosfato de potássio pH 7, junto com 800 mg de α-lactose e 500 mg de NaBHoCN. Após incubação a 37°C durante 24 h, aumentou-se para 8 o pH com KOH 5M e deixou-se a solução a 37°C ainda durante 6 h.
Diafiltrou-se a Lat-poli-L-lisina com NaCl a 0,9% e concentrou-se para 100 mg/ml.
Doseou-se a lactose pelo método do ácido fenol-sulfúrico de Debois et al. {Anal. Chem. 1956; 28: 350-356) usando galactose como padrão; determinou-se a poli-lisina medindo o azoto em conformidade com Kjeldahl. Diluiu-se 2 ml de solução de Lat-poli-L-lisina (=200 mg) com 2 ml de tampão carbonato de sódio 1M, pH 11. Dissolveram-se 800 mg de imidazolato de ara-AMP, sintetizado em conformidade com Lohrmann e Orgel (Tetrahedron, 1978; 34: 853-855) e re-ajustou-se o pH a 11 com NaOH 5M.
Após incubação a 50°C durante 96 h, diafiltrou-se o conjugado com NaCl a 0,9%.
Efectuou-se a caracterização química do complexo testando por espectrofotometia a droga acoplada e doseando a lactose da forma descrita. Deduziu-se a interferência de ara-AMP na análise calorimétrica. Calculou-se o teor de poli-L-lisina do conjugado a partir
85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 15 da quantidade de lactose, sabendo a razão do peso de lactose/ poli-L-lisina determinada antes de se acoplar a droga (ver acima). Isto foi possível porque a ligação entre o açúcar e os grupos E-NH2 da lisina não se rompeu durante a conjugação da droga, como verificámos experimentalmente. Concentrou-se o conjugado em salino (NaCl a 0,9%) para 150 mg/ml e liofilizou-se após arrefecimento até cerca de -80° C. Calculou-se a concentração de conjugado sem levar em conta os contra-iões.
Antes de utilização, dissolveu-se lat-poli-L-lisina-ara-AMP com água a uma concentração de 150 mg/ml. Dissolveu-se facilmente, uma vez que 0 arrefecimento era rápido.
Quando necessário, diluiu-se 0 conjugado com NaCl a 0,9%. . Composto 10
Antes de se acoplar com ara-AMP, marcou-se a Lat-poli-L-lisina com [3H]formaldeído (NEN), em conformidade com Jentoft e Dearbon (Methods Enzymol., 1983; 91: 570-579). A mistura reaccional continha 78 ,uCi de [3H]formaldeído/ml. Após a diafiltração com NaCl a 0,9%, conjugou-se a Lat[JH]poli-L-lisina com ara-AMP, como se descreveu acima.
Composto 11
Primeiro, submeteu-se ribavirina (RIBV) (1 -β-D-riboftiranosil-1,2,4-triazolo-3-carboxamida) a fosforilação (RIBVMP, em conformidade com Allen LB, Boswell KH, Khwaja TA, Meyer RB, Sidwell RW, Witkowski JT, “Sinthesis and antiviral activity of some phosphates of the broad-spectrum antiviral nucleoside, Ι-β-D-Ribofuranosyl-l,2,4-triazole-3-carboxamide (Ribavirin)”, J. Med. Chem. 1978; 21: 742-746).
Converteu-se então o sal de piridínio do derivado fosforilado no imidazolato (Lohrmann e Orgel, Tetrahedron 1978; 34: 853-855), que se acoplou a Lat-[JH]poli-L-lisina da forma descrita para o conjugado com ara-AMP. Neste conjugado, testou-se o RIBVMP acoplado doseando o fosfato orgânico em conformidade com Ames BN (“Assay of organic phosphate. Total phosphate and phosphatases”, Methods Enzymol. 1966; 8: 115-118).
Devido a uma forte interferência de RIBV com o teste calorimétrico do açúcar, não pudémos dosear a lactose da forma descrita para o Lat-poli-L-lisina-ara-AMP e desta forma determinámos o teor de Lat-[3H]poli-L-lisina do conjugado contando a radioactividade.
85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ
Composto 12
Submeteu-se 3’-azido-3-[2-l4C]desoxitimidina ([14C]AZT) a fosforilação (Moravek) em conformidade com Yoshikawa et al. (Tetrahedron Lett 1967; 50: 5065-5068). Converteu-se o sal de piridínio do derivado fosforilado no seu imidazolato e subsequentemente agrupou-se a Lat-poli-L-lisina. Efectuou-se o agrupamento da forma descrita para o Composto 9, mas no meio reaccional a razão da quantidade de imidazolase de droga para a do polímero foi 2,7 em vez de 4. Efectuou-se a caracterização química deste conjugado da forma descrita para o Composto 9.
Composto 13
Preparou-se este conjugado da forma descrita para o Composto 9, mas interrompeu-se a lactosaminação de poli-L-lisina após as primeiras 24 h. Para além disso, a razão da quantidade de imidazolato de ara-AMP para a do polímero foi de 4,6 em vez de 4. Substituíram-se 30% dos grupos E-amina do polímero com resíduos galactosilo e 64% com ara-AMP. II.2. Observações experimentais a) Pesos moleculares médios do Composto 9
Determinaram-se por cromatografia de permeação, usando equipamento de HPLC (Waters) com duas colunas Protein-Pak® (125 e 300 SW) ligadas em série. Dissolveu-se o Composto 9 (80 pg) em 20 μΐ de fase móvel (125 mM de Na2SC>4 + 2 mM de NaH2P04.H20 para pH 6,0 com NaOH 1 N, filtrado e desgaseificado) e submeteu-se a cromatografia com as seguintes condições. Caudal: 0,9 ml/mm; detecção: UV a 260 nm; 0,1 unidades de absorvância por escala completa (AUFS). Calibraram-se as colunas com aprotinina (Mr 6.500), ARNase (Mr 13.700), HSA (Mr 69.000) e IgG (Mr 158.000), Determinou-se o peso molecular ponderai médio e o peso molecular numérico médio usando o suporte lógico GPC 745/745 B de Waters. Verificou-se serem respectivamente de 140.339 e 72.419. A cromatografia de permeação em gel do Composto 9 é apresentado na Figura 5. b) Distribuição de compostos em órgãos O procedimento experimental foi como o descrito para experiências semelhantes com conjugados de peso molecular baixo. Apresentam-se os resultados na Fig. 6.
85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 17
Os conjugados de ara-AMP e RIBVMP eram radioactivos no transportador, ao passo que o conjugado de AZTMP foi marcado na porção da droga.
Após administração por via intramuscular dos conjugados marcados no transportador (Fig 6, gráficos A e C) a radioactividade era elevada no fígado e baixa no baço, intestino e cérebro. As percentagens de dmp injectada recuperadas nos rins foram 10-20 vezes mais baixas do que as medidas após administração por via i.m. dos complexos preparados com poli-L-lisina de baixo peso molecular. Visto a acumulação renal de proteínas ser uma consequência da sua filtração glomerular (Maack TH, Johnson V, Kau ST, Figueiredo J, Sigulem D, “Renal filtration, transport, and metabolism of low-molecular weight proteins: A review”, Kidney Int. 1979; 16: 251-270), o presente resultado indica que, conforme o esperado, apenas pequenas quantidades dos conjugados de elevado peso molecular passaram através dos glomérulos pelo menos após administração intramuscular (ver abaixo).
Em ratos injectados via intramuscular com Lat-poli-L-lisina-[l4C]AZTMP o nível de radioactividade no fígado foi de 2,5 a 6 vezes maior do que em rins, baço e intestino (Figura 6, gráfico D). A diferença entre a quantidade de radioactividade em fígado e noutros órgãos foi menos marcada do que em animais administrados com os conjugados marcados no transportador (Figura 6, gráficos A, C). Este resultado deveu-se provavelmente a uma libertação parcial da droga (e/ou seus metabolitos) das células hepáticas para a corrente sanguínea após a clivagem intracelular da ligação droga-transportador. Observou-se uma libertação semelhante da droga das células hepáticas na corrente sanguínea após administração de outros conjugados hepatotrópicos de droga/transportador (Fiume L, Busi C, Corzani S, Di Stefano G, Gervasi GB, Mattioli A, “Organ distribution of a conjugate of adenine arabinoside monophosphate with lacrosaminated albumin in the rat”, J. Hepatol. 1994, no prelo; Fiume L, Mattioli A, Balboni PG, Tognon M, Barbanti-Brodano G, De Vries J and Wieland Th, “Enhanced inhibition of virus DNA synthesis in hepatocytes by trifluorothymidine coupled to asialofetuin”, FEBSLett 1979; 103: 47-51).
Quando se injectou nos ratos [,4C]AZTMP livre por via intramuscular, a radioactividade distribuiu-se igualmente no fígado, baço e intestino com maiores valores nos rins (Fig. 6, Gráfico E). A velocidade de acumulação e decaimento de radioactividade após a administração de [l4C]AZTMP livre ou acoplada foi diferente. Após injecção da droga livre, acumulou-se radioactividade nos tecidos durante os primeiros 15 minutos e depois decaiu rapidamente; após injecção da droga conjugada a radioactividade em fígado aumentou até 4-5 h. Após 1-2 h as quantidades de radioactividade em fígado foram superiores em animais injectados com [l4C]AZTMP conjugado, à dose de 2 μg/g, do que nas administradas com a droga livre a 5 pg/g. 18 85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ
Em ratos injectados com Lat-[3H]poli-L-lisina-ara-AMP por via intravenosa (Fig. 6, gráfico B), o conjugado acumulou-se rapidamente no fígado, e nesses animais os valores de radioactividade nos rins foram superiores aos dos que receberam o mesmo conjugado por via intramuscular (Fig. 6, Gráfico A). Isto pode ser explicado considerando que: (i) rol de moléculas de conjugado tinha um peso molecular menor do que o de HSA (Fig 5); (ii) existe uma relação directa entre a concentração de plasma e a filtração glomerular de proteínas pequenas (Maack TH et cil. Kidney Int 1979; 16: 251-270); (iii) as concentrações de conjugado no plasma que eram constantemente baixas (inferiores a 0,9 pg/ml) a seguir a administração por via intramuscular atingiram valores elevados após a injecção intravenosa (104 pg/ml a 3 min). c) Experiências de tolerância e imunogenicidade
Estas realizaram-se usando o Composto 9. O conjugado administrado por via intravenosa (i.v.) a 5 ratos a uma dose de 1,5 g/Kg não causou qualquer sinal conhecido de sofrimento. 1,5 g de Lat-poli-L-lisina-ara-AMP continham 480 mg de droga (ver quadro 2), uma dose 300 vezes superior aquela à qual o ara-AMP, quando conjugada a L-HSA, inibe o desenvolvimento do virus em pacientes infectados por HBV. Em ratos a LD50 de poli-L-lisina usada para preparar 0 conjugado, dado por via i.v. na forma de sal de HC1, foi entre 15 a 30 mg/Kg. Para estudar se a Lat-poli-L-lisina-ara-AMP dissolvida em salino à concentração de 150 mg/ml pode danificar os tecidos no local da administração, efectuou-se uma primeira experiência de irritação ocular em 6 coelhos, colocando 0,1 ml da solução no saco conjuntivo. Não se observaram alterações no olho em qualquer animal.
Observaram-se ao microscópio óptico secções semi-delgadas de fígado de ratos e ratazanas que receberam Lat-poli-L-lisina-ara-AMP administrada segundo diferentes planos (ver Quadro 3). Em nenhum dos animais se encontraram alterações nas células parenquimais ou sinusoidais do fígado. A acumulação em lisossomas secundários de moléculas não completamente digeridas (dissacáridos, péptidos) que não podem atravessar a membrana do lisossoma resulta numa rápida turgescência desses organelos que ao microscópio de luz aparecem como vacúolos citoplasmáticos. Observaram-se esses vacúolos nas células hepáticas de ratos e ratazanas 24 h após uma única administração de L-HSA-ara-AMP, a doses 5/10 vezes maiores do que as activas em pacientes infectados por HBV (Fiume L, Betts CM, Busi C, Corzani S, Derenzini M, Di Stefano G, Mattioli A, ‘The pathogenesis of
85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 19 vacuoles produced in rat and mouse liver cells by a conjugate of adenine arabinoside monophosphate with lactosaminated albumin”, J. Hepatol. 1992; 15: 314-322). A ausência de vacúolos nas células de fígado de ratos e ratazanas após a administração de doses elevadas de Lat-poli-L-lisina-ara-AMP deu prova indirecta de uma rápida digestão deste conjugado em produtos capazes de atravessar a membrana do lisossoma.
Para estudar a imunogenicidade da Lat-poli-L-lisina-ara-AMP, vinte e quatro ratos receberam o conjugado durante cinco dias por semana, durante quatro semanas consecutivas (única dose diária - 200 pg/animal). Injectou-se por via intramuscular em doze ratos enquanto que nos outros se administrou por via intravenosa. Uma semana após a última injecção tirou-se sangue aos ratos e mediram-se os anticorpos contra o conjugado como se descreveu para os conjugados de baixo peso molecular. Nenhum dos animais produziu anticorpos em quantidades detectáveis pelo nosso ensaio (sensibilidade de cerca de 0,5 pg IgG/ml de soro).
Dos dados experimentais anteriores surge como mais provavelmente provado que os conjugados de poli-L-lisina com galactose de nucleósidos antivirais, nos quais a maior parte dos grupos E-amina do homopolímero estão substituídos por resíduos de galactose e pelas drogas, administrados por injecção intramuscular, realizam um alvo hepático de drogas sem produzirem anticorpos.
Eles não possuem a toxicidade aguda da poli-L-lisina usada na sua preparação.
Em comparação com os conjugados com a albumina lactosaminada, que necessitam de ser injectados por via intravenosa uma vez que em contrário são imunogénicos, os conjugados munidos de poli-L-lisina com galactose são potencialmente capazes, na infecção provocada pelo vírus da hepatite, de melhorar a concordância do paciente com a administração prolongada do agente antiviral.
Como foi já mencionado, o precedente referiu-se aos conjugados onde o transportador era poli-L-lisina ou poli-L-omitina; as propriedades químico-físicas e comportamento biológico verificados experimentalmente tomaram aceitável a idêntica utilização como transportadores dos outros poliaminoácidos.
Estes outros conjugados estão, desta forma, dentro do âmbito do invento, assim como a utilização desses poliaminoácidos como transportadores para a preparação de conjugados hepatotrópicos com compostos antivirais, dos quais a administração seria de contrário 20 85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ seriamente comprometida por fenómenos secundários não favoráveis induzidos pela elevada toxicidade para outros órgãos diferentes do fígado.
Quadro 2
CARACTERISTICAS DE CONJUGADOS DE POLI-L-LISINA DE ELEVADO PESO MOLECULAR
Compostos Lactose (lis) Composto (mg) Drosa Cus) Composto (mg) % de grupos E-NEL substituídos por (dpm/pg) Lactose Droga 9) Lat-poli-L-lisina-ara-AMP 385 330 48 43 0 10) Lat-LHJpoli-L-lisina-ara-AMP 352 312 44 41 2910 11) Lat-[JH]poli-L-lisina-RIBVMP 396 299 46 39 2504 12) Lat-poli-L-lisina-[l4C]AZTMP 371 219 45 26 466 13) Lat-poli-L-lisina-ara-AMP 210 440 31 64 0
Quadro 3 PLANOS DE ADMINISTRAÇAO DE Lac-Poli(L-Lys)-ara-AMP A RATOS E RATAZANAS PARA OS ESTUDOS MICROSCÓPICOS DE CÉLULAS DO FÍGADO Animal Dose diária (pg/g) Via de injecção Dias de administração 6 Intramuscular 20 Ratos 30 Intravenosa 1 60 Intravenosa 1 6 Intramuscular 7 Ratazanas 30 Intramuscular 7 60 intravenosa 1 Mataram-se os animais 24 h após a última injecção. Fixaram-se as amostras de fígado e tingiram-se secções semi-delgadas como o descrito em (Fiume L., Betts M.C.. Busi C.. Corzani S., Derenzini M., Di Stefano G., Mattioli A., J. Hepatol. 1992; 15: 314-322).
Lisboa, 11. !H 2000
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Claims (15)

  1. 85 796 ΕΡ Ο 652 776 ί ΡΤ REIVINDICAÇÕES 1. Conjugados de um poliaminoácido básico com resíduos de galactose ou lactose e resíduos de droga antiviral, caracterizados pelo facto de a maioria dos grupos amina do dito poliaminoácido básico estarem substituídos com resíduos de galactose ou lactose e resíduos de droga antiviral.
  2. 2. Conjugados de acordo com a reivindicação 1. caracterizados pelo facto de pelo menos 12% dos ditos grupos amina estarem substituídos com resíduos de droga antiviral.
  3. 3. Conjugados de acordo com a reivindicação 1. caracterizados pelo facto de pelo menos 31% dos ditos grupos amina estarem substituídos com resíduos de galactose ou lactose.
  4. 4. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto de pelo menos 71 % dos ditos grupos amina estarem substituídos com resíduos de droga antiviral e resíduos de galactose ou lactose.
  5. 5. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto dos resíduos de lactose se ligarem aos grupos amina por lactosaminação redutiva.
  6. 6. Conjugados de acordo com a reivindicação 1. caracterizados pelo facto do referido poliaminoácido básico ser seleccionado a partir de poli-L-lisina e poli-L-omitina.
  7. 7. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto da dita droga antiviral ser seleccionada de adenina-P-arabinósido (ara-AMP), aciclovir, ribavirina e azidotimidina.
  8. 8. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 que é Lat-poli-L-lisina-ara-AMP.
  9. 9. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 que é Lat-poli-L-lisina-ara-ACVMP.
  10. 10. Utilização de conjugados de acordo com as reivindicações de 1-9 como transportadores hepatotrópicos de drogas antivirais.
  11. 11. Utilização de conjugados de acordo com as reivindicações de 1-9 para o fabrico de composições farmacêuticas possuindo actividade antivirais. 85 796 ΕΡ Ο 652 776 / ΡΤ 2/2
  12. 12. Composição farmacêutica que se caracteriza por conter como material activo pelo menos um dos conjugados de acordo com as reivindicações de 1-9.
  13. 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por estar numa forma adequada para administração parentérica ou intramuscular.
  14. 14. Processo para preparar conjugados de acordo com as reivindicações de 1-9, caracterizado pelos passos de: a) conjugação do poliaminoácido básico numa maneira por si muito conhecida com a droga antiviral, e b) lactosaminação numa maneira por si conhecida do poliaminoácido básico por meio de lactosaminação redutiva com cianoboro-hidreto.
  15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a conjugação da droga ser conseguida numa maneira por si conhecida por meio do imidazolato da droga e efectuando a conjugação num meio tamponizado a pH alcalino. Lisboa, li;· C?·’”'·· Por LABORATORIBALDACCI Spa -O AGENTE OFTOAL-
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