PT680365E

PT680365E - Activacao de agentes fotossensibilizadores

Info

Publication number: PT680365E
Application number: PT94900024T
Authority: PT
Inventors: Anna M Richter; Elizabeth Waterfield; Julia G Leuy
Original assignee: Univ British Columbia
Priority date: 1992-11-20
Filing date: 1993-11-17
Publication date: 2000-07-31
Also published as: NO323107B1; DE69334009T2; CA2149636C; ES2148132T1; PL309033A1; DE947222T1; HK1025059A1; ZA938710B; DE69327972T2; FI952436A7; CA2149636A1; ES2143539T3; KR950704007A; NO952004L; EP0947222A2; FI952436L; HU224722B1; DK0680365T3; KR100230588B1; FI952436A0

Description

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DESCRICÃO “Activação de Agentes Fotossensibilizadores”

Campo da Invenção A presente invenção refere-se genericamente ao campo da medicina e dos farmacoterapêuticos com agentes fotossensibilizadores. Especificamente, a invenção está relacionada com a utilização de um agente de fotossensibilização para a preparação de um medicamento, para utilização num método de destruição de um tecido alvo, que compreende a administração do referido agente de fotossensibilização e a aplicação de radiação para alterar ou destruir selectivamente o tecido alvo.

Antecedentes da Invenção A terapia fotodinâmica (PDT) envolve a administração de um agente de fotossensibilização e a irradiação subsequente com luz do tecido, no qual o composto fotossensibilizador se concentrou. O tecido alvo contendo uma concentração suficientemente elevada do composto fotossensibilizador absorve selectivamente a luz que induz alteração ou destruição das células imediatamente vizinhas. A Patente U.S. 5,095,030, concedida a Levy em 10 de Março de 1992, descreve procedimentos para a administração de compostos fotossensibilizadores a animais que são subsequentemente irradiados usando fontes luminosas externas. Por exemplo, o Exemplo 5 desta patente descreve a injecção subcutânea de ratinhos com células de tumor P815 que crescem até um tumor palpável. Os compostos fotossensibilizadores são então injectados. Os animais são então mantidos no escuro durante duas horas. Em seguida, os seus tumores são expostos a uma luz intensa. As taxas de sobrevivência dos animais tratados foram significativamente melhoradas, comparativamente aos controlos não tratados. De forma similar, o Exemplo 8 daquela patente descreve a utilização de um sistema de rabdomiosarcoma em ratinhos, com um protocolo similar. No entanto, neste caso, a exposição a luz começou 24 horas após a injecção. Adicionalmente, a biodistribuição de BPD-MA e BDP-MB tritiados foi determinada após injecção a tempos que variaram entre 3-168 horas. As razões tumor-pele foram favoráveis três horas após administração IV. A biodegradabilidade foi determinada com BDP-MA tritiado, injectado por via IV em ratinhos portadores de tumores P815. Os ratinhos foram sacrificados a três ou 24 horas após a injecção de BPD-MA; e os tumores, fígados e rins foram avaliados. Após 3 horas 100% do BPD-MA no tumor estava activo, mas apenas 39% estava activo às 24 horas. Tanto os fígados como os rins degradaram o BPD-MA mais rapidamente do que os tumores. 2 83 612 ΕΡ Ο 680 365 /ΡΤ

Konstron et al., (J. Neuro Oncologv (1988) 6: 185-91) injectaram derivado de hematoporfirina directamente em gliosarcomas subcutâneos de rato e irradiaram 48 horas após a injecção. Kostron relatou que a injecção directa parece ser mais segura do que a injecção parentérica. Kostron mencionou também estudos anteriores que indicam que deve haver um atraso pós-injecção de pelo menos dois dias e, preferivelmente três a quatro dias, antes da luz ser aplicada porque isso permite ao derivado de hematoporfirina concentrar-se nas células de tumor. O BPD demonstrou também uma maior afinidade para tecido de tumor, incluindo células leucémicas, do que para células normais não malignas. Jamieson et al., Leukemia Res. 14:209-19, 1990. Os fotossensibilizadores são também úteis na detecção e tratamento da placa arterosclerótica, tal como descrito nas Patentes U.S. Nos 4,521,762 e 4,577,636. O tratamento de doenças virais é revelado nas Patentes U.S. Nos 4,878,891, concedida em 7 de Novembro 1989 a Judy.; 4,925,736, concedida em 15 de Maio de 1990 a Shikowitz; e 4,935,498. O tratamento da psoríase é revelado na Patente U.S. N° 4,753,958, concedida em 28 de Junho de 1988 a Weinstein et al. O tratamento da artrite é revelado na Patente N° 5,028,994, concedida em 2 de Julho de 1991 a Carson. O tratamento da “mancha de vinho do Porto” (marca de nascença púrpura) é revelado na patente anadiana com o n° de publicação CA 2,012,175. A Patente U.S. N° 5,095,030, concedida em 10 de Março de 1992, revela e reivindica vários agentes citotóxicos, comprimento de onda-específicos, que são genericamente descritos como “porfirinas verdes”. Estes compostos são derivados de porfirina que são modificados por uma reacção de Diels-Alder para mudar efectivamente o comprimento de onda de absorção para um comprimento de onda maior. Isto resulta nalgumas propriedades favoráveis quando comparado a, por exemplo, derivado de hematoporfirina quando estes compostos são empregues em terapia fotodinâmica de um modo geral. Tal como descrito nesta patente, estes agentes citotóxicos, quando administrados sistemicamente, “rumam” para células indesejadas, em particular para células de tumor ou vírus. A irradiação subsequente com luz absorvida por estes compostos é citotóxica. O pedido pendente com o N° de Série 07/832,542 apresentado em 5 de Fevereiro de 1992 (agora publicado como EP-B1-569113) revela a preparação de lipossomas de fotossensibilizadores de porfirina.

Os pedidos pendentes US-A-5484803 e US-A-5736563 revelam a injecção de BPD a ratinhos para tratar células alvo de origem no sangue. Estes pedidos também revelam resultados farmacocinéticos a intervalos pós-injecção compreendidos entre 15 minutos e

83 612 ΕΡ Ο 680 365 / ΡΤ 3 duas horas. Todos os ratinhos que receberam doses de 6,32 pg/ml e foram iluminados com início 15 minutos após a injecção, morreram. No entanto, outros ratinhos injectados com doses mais pequenas de BPD ou com maiores tempos após a injecção (por exemplo uma hora), permaneceram saudáveis.

Efeitos adversos após a administração do porfímero sódico, PROTOFRIN® foram documentados por Dougherty et al., Lasers in Sure. Med. (1990) 10:485-88; e Harty et al., L Uroloav (1989) 141:1341-46. Numa série de 180 pacientes tratados com porfímero sódico, Dougherty relatou que os pacientes receberam 0,5 a 2,0 mg/kg para tratar uma variedade de cancros, mas não mencionou a dose de luz ou o intervalo pós-injecção, antes do tratamento com luz. No entanto, o intervalo pós-injecção recomendado para esta droga é de 24-48 horas. Dougherty, previne que “todos os pacientes são fotossensíveis na sequência de injecção de Photofrin”. Os pacientes tratados foram avaliados em pessoa e por meio de questionários sobre as reacções de fotossensibilidade. Os relatórios pessoais sobre as reacções pareceram ser invulgarmente baixos, dado que os pacientes podem ter evitado admitir a violação das instruções médicas para evitar a luz do sol durante um mês. Em todo o caso, quase um quarto dos pacientes referiu reacções, a maior parte das quais ocorreu no intervalo de um mês desde o tratamento. Não houve uma “relação aparente entre a fotossensibilidade e a dose de droga injectada.... apesar de poder haver uma tendência para reacções menos severas para as doses de droga mais baixas.” Além disso, o intervalo de tempò para perder fotossensibilidade pode ter sido algo inferior para o grupo de 5 mg/kg, mas não foi estatisticamente significativo. Dougherty conclui que os pacientes devem ser avisados de que a fotossensibilidade pode durar seis meses.

Harty et al., trataram 7 pacientes com cancro da bexiga com uma injecção intravenosa de 2,0 mg/kg de porfímero sódico PHOTOFRIN (um paciente recebeu 2/3 da dose adequada), seguida 72 horas mais tarde por exposição a energia de densidade de 100 J/cm . “Seis pacientes apresentaram fototoxicidade na pele e em cada caso isto ocorreu no espaço de 10 dias após a administração [da droga]. Quatro casos foram classificados como moderados, consistindo em eritema e edema das mãos e face e não requereram tratamento. Em 2 pacientes a fototoxicidade foi de severidade moderada, consistindo em queimaduras de segundo grau das mãos e face e requereram terapia tópica.” Cinco pacientes apresentaram sintomas irritativos da bexiga que estavam associados a perda de músculo liso e à sua substituição por tecido fibroso. O que é necessário é a utilização de um agente de fotossensibilização para a preparação de um medicamento, num método melhorado para a administração de terapia fotodinâmica, para evitar efeitos secundários adversos tais como a destruição de tecido 4 83 612 ΕΡ Ο 680 365 / ΡΤ normal e reacções de fotossensibilidade. Um método melhorado de terapia utilizará também uma dose de luz mais baixa, de forma que o tratamento possa ser administrado mais rápida e eficientemente. Quando a fonte de luz emite a uma potência limitada, um método melhorado permitirá períodos de tratamento com luz mais curtos e o tratamento de um maior número de pacientes com a mesma fonte de luz. Outro melhoramento será uma menor dose de agente de fotossensibilização, a qual diminuirá o custo do tratamento e ajudará também a evitar efeitos secundários.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, é proporcionada a utilização de um agente de fotossensibilização, para a preparação de um medicamento para utilização numa terapia para destruir ou alterar uma área de neovascularização num animal, animal esse que compreende ambas uma área de neovascularização e tecido normal circundante da neovascularização, a referida terapia sendo definida pelos passos de: (a) administração ao referido animal de uma quantidade eficaz de um agente de fotossensibilização; e (b) administração à referida área de neovascularização de uma quantidade eficaz de luz de um comprimento de onda que condiga com o comprimento de onda de excitação do referido agente de fotossensibilização, em que a referida luz é administrada à referida área de neovascularização antes do referido agente de fotossensibilização ter permeado o referido tecido normal.

Preferivelmente, a quantidade eficaz do agente de fotossensibilização é aproximadamente menos de metade da dose clínica do referido agente de fotossensibilização, em terapia fotodinâmica em que o fotossensibilizador eliminou tecido normal.

Preferivelmente, o tempo entre o passo (a) e o passo (b) é inferior a um quarto do intervalo clínico para sujeição deste animal a tratamento com luz, após a administração do referido agente de fotossensibilização, em terapia fotodinâmica em que o fotossensibilizador eliminou tecido normal.

Preferivelmente, a quantidade eficaz de luz é menos do que cerca de metade da dose clínica de luz para activação do agente de fotossensibilização particular, em terapia fotodinâmica em que o fotossensibilizador eliminou tecido normal. A invenção pode ser utilizada para alvos que incluem, mas não se limitam a, tumores,

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ΕΡ Ο 680 365/PT 5 placa arterosclerótica, infecções virais localizadas, psoríase, ligações artríticas e neovascularização ou outras hipervascularizações oculares e outras.

Apesar desta invenção proporcionar a utilização de qualquer agente de fotossensibilização, preferivelmente o agente é seleccionado de entre clorinas (tais como clorina e6), bacterioclorinas, ftalocianinas, porfirinas, purpurinas, merocianinas, feoforbidos, psoralenos e pró-drogas tais como o ácido δ-aminolevulínico, que podem produzir drogas tais como a protoporfirina em tecido. Noutras concretizações, o BPD-MA, a monoaspartilclorina e6, a zinco-ftalocianina, a estano-etiopurpurina, a tetra-hidroxi-tetrafenilpurpurina e o porfímero sódico são os agentes de fotossensibilização. A invenção pode ser utilizada para um método em dois passos para a administração de terapia fotodinâmica a um animal. Em primeiro lugar, é administrado um agente de fotossensibilização a um animal, numa quantidade suficiente para produzir um efeito fotodinâmico. Em segundo lugar, após um intervalo pós-injecção de menos do que cerca de duas horas, são administrados menos do que cerca de 75 Joules/cm de luz ao animal.

Breve Descricão dos Desenhos A Figura 1 é uma representação de um rato 48 horas após uma injecção de 1 mg/kg de BPD-MA e exposição a luz de 100 Joules/cm , iniciada 15 minutos após a injecção de BPD-MA. A Figura 2 é uma representação de um rato 24 horas após uma injecção de 0,5 mg/kg de BPD-MA e exposição a luz de 75 Joules/cm2, iniciada 15 minutos após a injecção de BPD-MA. A Figura 3 é uma representação de um rato 4 dias após uma injecção de 2,0 mg/kg de BPD-MA e exposição a luz de 100 Joules/cm2, iniciada três horas após a injecção de BPD-MA. A Figura 4 é um gráfico mostrando a curva de dose-resposta de BPD-MA para doses de 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 mg/kg (formulação de lipossomas). A exposição a luz teve lugar três horas após a injecção. A Figura 5 é um gráfico mostrando a curva de dose-resposta a luz, para doses de 50, 75, 100, 125 e 150 J/cm (a 690 nm). A exposição a luz teve lugar três horas após a injecção de 2 mg/kg de BPD-MA. 6 83 612

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Breve Descrição da Invenção

Esta invenção é utilizada para um método de administração de terapia fotodinâmica. O método compreende a administração de um agente de fotossensibilização e a aplicação de radiação a pelo menos uma porção de um animal intacto a uma intensidade eficaz para alterar ou destruir selectivamente tecido alvo.

Tal como é aqui utilizado, “alvo” é aquele tecido que se pretende alterar ou destruir por este método de tratamento. O alvo absorve o agente de fotossensibilização; então quando é aplicada radiação suficiente o tecido alvo é alterado ou destruído. Os alvos incluem, mas não se limitam a, tumores, depósitos arteroscleróticos, células contendo vírus tais como as infectadas pelo vírus do papiloma (verrugas), psoríase e artrite. Também incluídas entre as células alvo estão os capilares de desenvolvimento rápido e as áreas de neovascularização, particularmente no olho. Este método melhorado pode ser usado com os tipos de tumores com os quais a terapia fotodinâmica tem sido utilizada no passado. Estes tumores geralmente estão bastante localizados à superfície do organismo através do qual a luz deve penetrar. Isto inclui vários tumores da pele, bexiga e pescoço, sarcoma de Kaposi e alguns tumores esofágicos. “Células não-alvo” são todas as células de um animal intacto que não se pretende alterar ou destruir pelo método de tratamento. Estas células não alvo incluem, mas não se limitam, aquelas de outros tecidos normais, incluindo a pele normal sobreposta. “Destruir” é utilizado para significar matar o tecido alvo desejado. “Alterar” significa modificar o tecido alvo de tal forma que interfira com a sua função. Por exemplo, North et al., observaram que após exposição de células T infectadas por vírus e tratadas com BPD a luz, se desenvolveram buracos na membrana da célula T, que aumentaram de tamanho até a membrana se decompor completamente (Blood Cells 18:129-40, 1992). Entende-se que os tecidos alvo são alterados ou destruídos mesmo se as células alvo são no final rejeitadas por macrófagos. “Agente de fotossensibilização” é um composto químico que ruma para um ou mais tipos de tecidos alvo seleccionados e que, quando contactado por radiação, absorve a luz e induz alteração ou destruição dos tecidos alvo. Virtualmente qualquer composto químico que rume para um alvo seleccionado e que absorva luz pode ser utilizado nesta invenção. Preferivelmente, o composto químico é não tóxico para o animal ao qual é administrado ou é capaz de ser formulado numa composição não tóxica. Preferivelmente, o composto químico

I ι • 83 612 ΕΡ Ο 680 365 / ΡΤ 7 na sua forma fotodegradada é também não tóxico. Uma listagem compreensível de produtos químicos fotossensibilizadores pode ser encontrada em Kreimer-Bimbaum, Sem. Hematol. 26: 157-73, 1989. Os compostos fotossensibilizadores incluem, mas não se limitam a, clorinas, bacterioclorinas, ftalocianinas, porfirinas, purpurinas, merocianinas, feoforbidos, psoralenos e pró-drogas tais como o ácido δ-aminolevulínico que podem produzir drogas tais como a protoporfirina. Uma nova classe de agentes de fotossensibilização, porfacianina fotossensível e compostos do tipo porfirina expandida, específicos para um comprimento de onda, é revelada no pedido de patente U.S. N° 27301-20078.00, apresentado em 30 de Outubro de 1992 (publicado como WO 94/10172) e pode ser usada no método revelado. Os agentes de fotossensibilização preferidos são derivados de benzoporfirina (BPD), a monoaspartil-clorina e6, a zinco-ftalocianina, a estano-etiopurpurina, a tetra-hidroxi-tetrafenilporfirina e o porfímero sódico (PHOTOFRIN®). O mais preferido é o derivado de benzoporfirina monoácido anel A (BPD-MA). “Radiação” ou “luz” tal como são aqui utilizados inclui todos os comprimentos de onda. Preferivelmente, o comprimento de onda da radiação é seleccionado de forma a igualar o(s) comprimento(s) de onda que excita(m) o composto fotossensibilizador. Ainda mais preferivelmente, o comprimento de onda da radiação é igual ao comprimento de onda de excitação do composto fotossensibilizador e tem uma baixa absorção pelos tecidos não alvo e pelo resto do animal intacto. Por exemplo, o comprimento de onda preferido para o BPD-MA situa-se na gama de 685-695 nm. Uma fonte de luz preferida é uma matriz laser bombeada a árgon, sintonizada para emitir a cerca de 690 nm. São também úteis os bancos de luz, os painéis LED e o espectro completo filtrado das lâmpadas de arco. A radiação é ainda definida pela sua intensidade, duração e altura de aplicação (“timing”), no que respeita ao doseamento com o agente de fotossensibilização (intervalo pós-injecção). A intensidade deve ser suficiente para que a radiação penetre na pele e/ou alcance os tecidos alvo a ser tratados. A duração deve ser suficiente para fotoactivar agente de fotossensibilização suficiente para actuar nos tecidos alvo. Tanto a intensidade como a duração devem ser limitadas para evitar o sobretratamento do animal. O intervalo pós-injecção antes da aplicação de luz é importante porque, em geral, quanto mais cedo a luz for aplicada, após a administração do agente de fotossensibilização, 1) menor é a quantidade de luz necessária e 2) menor é a quantidade eficaz de agente de fotossensibilização. A invenção é usada para um método de tratamento de um animal, que inclui, mas não se limita a, humanos e outros mamíferos. O termo “mamíferos” inclui também animais de quinta tais como vacas, porcos e ovelhas, bem como animais de estimação ou desporto tais como cavalos, cães e gatos. 8 83 612 ΕΡ Ο 680 365 / ΡΤ

Por “animal intacto” significa-se que o animal completo, não dividido, está disponível para ser exposto a luz. Nenhuma parte do animal é removida para o tratamento com luz, em contraste com a fotoforese, na qual o sangue do animal é circulado fora do seu organismo para exposição a luz. O animal não necessita de ser exposto inteiro à luz. Apenas uma porção do animal intacto será, ou necessita ser, exposta a radiação. Para tumores discretos e outras condições que afectam um volume relativamente pequeno, é preferível aplicar a luz apenas à pele que se sobrepõe ao tumor ou outra condição. “Transcutaneamente” é aqui utilizado como significando através da pele de um animal.

Indicações típicas para este tratamento incluem a destruição de tecido de tumores em tumores sólidos, dissolução de placa arterosclerótica em vasos sanguíneos, tratamento de tumores tópicos ou doença de pele incluindo infecções pelo vírus do papiloma (por exemplo, verrugas), psoríase, artrite e condições caracterizadas por neovascularização ou hipervascularização, em particular dos olhos.

Resumidamente, o agente de fotossensibilização é geralmente administrado ao animal antes do animal ser submetido a tratamento com luz. Preferivelmente, o agente é administrado a um intervalo pós-injecção que é inferior a menos do que um quarto do intervalo pós-injecção usual, antes de submeter o animal a tratamento com luz.

Agentes de fotossensibilização preferidos incluem, mas não se limitam a, clorinas, bacterioclorinas, ftalocianinas, porfmnas, purpurinas, merocianinas, feoforbidos, psoralenos e pró-drogas tais como o ácido δ-aminolevulinico que podem produzir drogas tais como a protoporfirina. Mais preferidos são os derivados de benzoporfirina (BPD) e o porfímero sódico. Mais preferido de entre os derivados de benzoporfirina é o monoácido anel A (BPD-MA). Outros agentes de fotossensibilização preferidos incluem, mas não se limitam a, monoaspartil-clorina eó, zinco-ftalocianina, estano-etiopurpurina e tetra-hidroxi-tetrafenilporfirina. O agente de fotossensibilização é administrado local ou sistemicamente. O agente de fotossensibilização é administrado gastrointestinalmente ou por injecção a qual pode ser intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal. O agente de fotossensibilização pode também ser administrado entericamente ou topicamente por meio de emplastros ou implantes. O método mais preferido de administração é a injecção intravenosa.

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ΕΡ Ο 680 365/PT 9 Ο agente de fotossensibilização pode ser sintetizado como um dímero e assim absorver mais luz numa base molar. O agente de fotossensibilização pode ser administrado numa formulação seca, tais como comprimidos, cápsulas, supositórios ou emplastros. O agente de fotossensibilização pode também ser administrado numa formulação líquida, quer sozinho quer com água, ou com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como os que são revelados em Remington's Pharmaceutical Sciences. A formulação líquida pode também ser uma suspensão ou uma emulsão. Em particular, as formulações lipossomais ou lipófilas são muito preferidas. Se forem utilizadas suspensões ou emulsões, excipientes adequados incluem água, solução salina, dextrose, glicerol e semelhantes. Estas composições podem conter quantidades menores de substâncias não tóxicas auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, anti-oxidantes, agentes tampão de pH e semelhantes. A dose de agente de fotossensibilização variará com a(s) célula(s) alvo pretendida(s), com o peso do animal e com a altura do tratamento com luz. Para agentes de fotossensibilização conhecidos, a quantidade eficaz do agente de fotossensibilização necessário neste método é, aproximadamente, menos do que metade da dose clínica usual conhecida. Por exemplo, a dose clínica usual é de 2,5 mg/kg para o porfímero sódico e de 0,25 mg/kg para o BPD. A quantidade eficaz de porfímero sódico neste método é de cerca de 0,3 a 1,25 mg/kg. A quantidade eficaz de BPD neste método é de cerca de 0,01 a 0,125 mg/kg. As doses clínicas usuais para a monoaspartilclorina eó (0,1-2^5 mg/kg), para a zinco-ftalocianina (0,5-2 mg/kg), para a estano-etiopurpurina (0,5-2 mg/kg) e para a tetra-hidroxi-tetrafenilporfirina (1-5 mg/kg), são divididas por dois para uso neste método. A dose de luz administrada é também muito menor neste método do que nos métodos conhecidos para terapia fotodinâmica. Em geral, a dose de luz é menos do que cerca de metade da dose de luz dos métodos anteriores. Por exemplo, onde previamente eram usados 150 Joules/cm com BPD, o método para o qual a presente invenção é usada não requer mais do que 75 Joules/cm . Onde previamente eram usados 10-50 Joules/cm com monoaspartilclorina e6, o método para o qual a presente invenção é usada não requer mais do que cerca de metade das doses de luz previamente indicadas. A duração da exposição à radiação situa-se preferivelmente entre 5 e 30 minutos, dependendo da potência da fonte de radiação. O intervalo pós-injecção neste método varia com o agente de fotossensibilização. No entanto, o intervalo pós-injecção pode ser menor do que cerca de um quarto do intervalo pós

83 612 ΕΡ Ο 680 365 / ΡΤ 10 injecção clínica usado com os agentes de fotossensibilização conhecidos. Por exemplo, o intervalo pós-injecção clínica usual para o BPD é de cerca de 3 horas. Em contraste, o intervalo pós-injecção para o BPD no método para o qual esta invenção é usada é menos do que cerca de um quarto daquele, ou menos do que cerca de 45 minutos. O intervalo pós-injecção clínica, usual para o porfímero sódico é de 24-48 horas. Em contraste, o intervalo pós-injecção no método para o qual esta invenção é usada é menos do que cerca de 6 horas para o porfímero sódico e, preferivelmente, menos do que cerca de 4 horas.

Este método é a condução de PDT eficaz com maior segurança e com menos efeitos secundários uma vez que o intervalo pós-injecção é muito mais curto e que as doses tanto do agente de fotossensibilização como de luz são metade. Em contraste, previamente pensava-se que o fotossensibilizador se distribuía inicialmente de forma não selectiva por todo o organismo e que seriam necessárias várias horas ou dias para o fotossensibilizador se acumular selectivamente no tecido alvo. Pensava-se que a distribuição selectiva ocorria gradualmente, com uma quantidade significativa de permuta entre o tecido alvo e o conjunto de moléculas fotossensibilizadoras em circulação. Assim, considerava-se essencial atrasar o tratamento com luz pós-injecção durante várias horas a dias.

No entanto, um estudo farmacocinético recente veio pôr em questão este pensamento há já longo tempo aceite. Richter et al, (Biochem. Pharmacol. (1992) 43:2349-58) relataram que o BP administrado tem dois regioisómeros em concentrações iguais. As três horas pós-injecção a razão dos isómeros no plasma muda de cerca de 1:1 para 1:0,28, devido ao metabolismo do fígado. No entanto, quando se removeu tecido de tumor 15 min e três horas após a injecção e se extraiu daí BPD, os isómeros foram encontrados em proporções essencialmente iguais (1:1,15).

Apesar de não se pretender ficar limitado por uma teoria, os inventores propõem que estes resultados sugerem a possibilidade do BPD se poder acumular rapidamente em tumores, onde pode ser imobilizado, e permitir intervalos pós-injecção mais curtos.

Previamente, assumia-se que após a injecção os fotossensibilizadores se distribuíam primeiro igualmente nos tecidos alvo e normais. Esta era a base para a assunção de que um intervalo pós injecção curto causaria extensos danos ao tecido normal, particulaimente à pele.

Contudo, tal como descrito no Exemplo 3 do pedido de patente U.S. N° 948,311, ratinhos injectados com BPD podem receber níveis relativamente elevados de luz (cerca de 150 J/cm ) nos seus dorsos rapados sem quaisquer efeitos de doença aparente, desde que a

83 612 ΕΡ Ο 680 365/ΡΤ 11 exposição tenha lugar nas duas primeiras horas pós-injecção (em oposição às três horas usuais). Amostras sanguíneas daqueles animais tratados indicam que quase 80% do BPD em circulação se toma fotolixiviado por este tratamento, indicando que a luz activou a droga. Portanto, os fotossensibilizadores podem não produzir danos generalizados aos tecidos, mesmo quando activados pela luz, desde que exista insuficiente fotossensibilizador presente nas células vizinhas.

Estes dois resultados surpreendentes encorajaram o teste de iluminação mais cedo, com doses menores, no tratamento de tumores com PDT (i.e., antes dos fotossensibilizadores permearem a pele ou outro tecido normal). A evidência experimental (apresentada em baixo) em ratinhos indica que o novo método é seguro e eficaz.

Os exemplos que se seguem pretendem demonstrar a eficácia do método e assistir na prática da invenção. Os exemplos que se seguem cobrem um agente de fotossensibilização e proporcionam meios para a selecção de outros agentes de fotossensibilização ou de novos compostos para utilização no método da invenção. Os exemplos que se seguem pretendem apenas ser exemplos e não limitar a invenção de qualquer forma.

Comentários Gerais

Os comentários gerais que se seguem sobre os Materiais e Procedimentos aplicam-se aos Exemplos 1 e 2, salvo indicação em contrário. O BPD-MA foi sintetizado como descrito nas Patentes U.S. 4,920,143 e 4,883,790. O BPD-MA foi obtido em QuadraLogic Technologies, Inc. e armazenado dissolvido em DMSO (4,5 mg/ml) a -70°C. O BPD lipossomal (4,95 mg/ml) foi preparado como descrito no pedido de patente U.S. N° 07/832,542, apresentado em 5 de Fevereiro de 1992. Utilizou-se a seguinte fórmula:

Quantidade (mg/ml·) 4,95 23,27 16,09 148,50 0,05 0,005 Q.B.

Ingrediente

BPD-MA

Dimiristoíl-fosfatídilcolina Fosfatidilglicerol de ovo Lactose ou tre-halose Palmitato de ascorbilo Hidroxitolueno butilado Água para injecção 83 612 ΕΡ Ο 680 365 / ΡΤ 12

Ο BPD lipossomal foi seco e armazenado congelado a -20°C, em alíquotas de 1 ml. O número apropriado de alíquotas foi rapidamente descongelado, imediatamente antes da utilização, e diluído com dextrose a 5% em água, para injecção a animais.

Salvo especificação em contrário, foram usados ratinhos macho DBA/2 (7-11 semanas de idade; Charles River Laboratories, St. Constant, Quebec, Canada), neste estudo. Por rapagem e depilação removeram-se os pêlos muito eficazmente das superfícies corporais apropriadas. Os ratinhos foram rapados e depilados com um depilador comercialmente disponível (Nair ), pelo menos um dia antes de serem usados nas experiências. Após a injecção, os ratinhos foram mantidos no escuro durante vários períodos de tempo, como descrito abaixo. Antes e após as experiências os ratinhos foram mantidos numa instalação para animais com 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, por dia.

Usou-se uma matriz de laser bombeada a árgon, cuja fonte de potência foi obtida em SpectraPhysics (Series 2000, Mountain View, CA) e cuja matriz de laser bombeada a árgon de 5W foi obtida de Coherent (Model 599, Paio Alto, CA), para fornecer um feixe colunado de luz, possuindo um comprimento de onda de 690 (± 3) nm. O laser de árgon era pretendido na pele para irradiar o tumor. O tempo de exposição a luz foi variado para dar diferentes doses de luz, tais como 50, 75 e 100 Joules/cm .

Exemplo 1

Estudo Piloto de Intervalos Pós-inieccão mais Curtos

Utilizaram-se ratinhos DBA/2 (peso 22 ± 1 g) neste estudo. Em primeiro lugar, os ratinhos foram injectados no flanco com células de tumor M-l (rabdomiosarcoma de murino) e deixaram-se crescer os tumores até cerca de 5 mm de diâmetro, de acordo com o protocolo de Richter et al., Br. J. Câncer (1991) 63:87-93. Os ratinhos foram injectados com BPD-MA lipossomal e mantidos no escuro durante 15 minutos antes da exposição a luz. Os ratinhos foram então tratados com o laser. A Figura 1 é uma representação de uma fotografia que foi tirada 48 horas após o rato ter sido tratado com 1 mg/kg de BPD-MA e 100 J/cm2 de luz. Este rato estava vivo e apresentava-se em descanso deitado de lado. O seu dorso tinha ainda a aparência rapada e apresentava uma grande escara de forma crescente que tinha aproximadamente o tamanho da sua orelha. Esta escara estava localizada sobre o flanco do rato no local de onde o tumor tinha sido erradicado. O tumor não era palpável.

83 612 ΕΡ Ο 680 365/ΡΤ A Figura 2 é uma representação de uma fotografia que foi tirada ao fim de 24 horas após o tratamento com 0,5 mg/kg de BPD-MA e 75 J/cm2 de luz. Este rato estava vivo e apresentava-se em descanso deitado de lado. O seu dorso tinha ainda a aparência rapada e apresentava uma pequena área inflamada na borda, ou corada de escuro, localizada sobre o flanco do rato no local de onde o tumor tinha sido erradicado. Não havia escara. O tumor não era palpável. A Figura 2 mostra que após apenas 24 horas, a pele normal circundante do tumor estava apenas ligeiramente inflamada.

Ambos os animais foram seguidos durante duas semanas. Os tumores não voltaram a crescer; e observava-se uma área de pele, plana, a sarar. A Figura 3 é uma representação de uma fotografia que foi tirada ao fim de 4 dias após o tratamento de um rato com um tumor M-l. O tratamento foi algo diferente dos dois regimes anteriores. Este rato foi tratado com 2 mg/kg de BPD-MA e irradiado com 100 Joules/cm de luz, administrada três horas após a injecção. Este rato estava vivo e apresentava-se em descanso deitado de lado. O seu dorso tinha ainda a aparência rapada e apresentava uma grande escara de forma crescente que tinha aproximadamente o tamanho da sua orelha. Esta escara estava localizada sobre o flanco do rato no local de onde o tumor tinha sido erradicado. O tumor não era palpável.

Uma comparação da Figura 3 com as Figuras 1 e 2 demonstra graficamente a redução nos danos na pele, quando o intervalo pós-injecção é encurtado, e as doses de BPD-MA e luz são reduzidas.

Exemplo 2

Estudo da Gama de Dose

Prepararam-se ratinhos DBA/2 adicionais com células de tumor M-l como descrito acima. Deixaram-se crescer os tumores até cerca de 5 mm de diâmetro. Então, os ratinhos foram injectados com uma de duas doses diferentes de BPD-MA (0,5 e 1,0 mg/kg), expostos a uma de três doses de luz diferentes (50, 75 e 100 J/cm ) e expostos a luz a um de três intervalos pós-injecção diferentes (1, 15 e 30 minutos). Durante os intervalos de 15 e 30 minutos pós-injecção, os ratinhos foram mantidos no escuro. A Tabela 1 mostra o número de animais que não apresentavam tumores, a cada período de observação, para cada droga e para cada intervalo pós-injecção. Muitos dos animais tinham começado o teste recentemente. Apenas alguns animais estavam a ser 83 612 ΕΡ Ο 680 365/ΡΤ 14

tratados há tempo suficiente para serem seguidos até ao dia 14. Desses, a maior parte não exibia tumores.

Tabela 1 Resultados de Teste ínterim para o estudo de gama de dose - variação de tempo Tratamento Tempo pós-injecção (min) Resultados (# sem tumores) # de Ratinhos Dose de Droga (mg/kg) Dose de Luz (J/cm2) Dia 7 Dia 14 0,5 50 1 3 n/a 3 0,5 50 15 2 n/a 2 0,5 50 30 0 0 2 0,5 75 1 2* n/a 2 0,5 75 15 2 2 2 0,5 75 30 n/a n/a n/a 0,5 100 1 3 n/a 3 0,5 100 15 5 2 5 0,5 100 30 2 n/a 2 1,0 50 1 4 n/a 4 1,0 50 15 4 4 4 1,0 50 30 4 4 5 1,0 75 15 5 4 5 1,0 75 30 4 n/a 5 1,0 100 15 4 4 4 NOTA: (*): Observações no Dia 2 após exposição n/a: os animais não foram testados ou os animais não estiveram em estudo durante tempo suficiente para alcançar a data de observação. * λ A dose de 0,5 mg/kg de BPD-MA e 50 J/cm administrada 30 minutos após injecção, todos os ratinhos desenvolveram tumores. Três de cinco ratinhos administrados com 0,5 mg/kg de BPD-MA e 100 J/cm2 administrado 15 minutos após injecção tinham também desenvolvido tumores no dia 14, apesar de todos estarem livres de tumores no dia 7.

Para comparação, são apresentadas as Figuras 4 e 5. A Figura 4 sumariza os resultados de um teste envolvendo o mesmo modelo rato-tumor, em que foram administradas quatro doses diferentes de BPD-MA (0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 mg/kg). A exposição de luz foi de 150 J/cm2, administrada após um intervalo pós-injecção de três horas no escuro. Sob este regime, que é similar aos regimes clínicos usuais, o único grupo que estava 50% livre de tumores ao fim de 14 dias era o grupo de ratinhos que tinha recebido 2,0 mg/kg. Esta dose era pelo menos dupla das doses eficazes mostradas na Tabela 1. 15 83 612

ΕΡ Ο 680 365/PT A Figura 5 sumariza os resultados de um teste envolvendo o mesmo modelo rato-tumor em que foram usadas cinco exposições de luz diferentes (50, 75, 100, 125 e 150 J/cm2), três horas após injecção de 2 mg/kg de BPD-MA. Sob este regime, que é similar aos regimes clínicos usuais, 75% dos ratinhos que receberam 150 J/cm2 e 50% dos ratinhos que receberam 125 J/cm2 estavam livres de tumores ao fim de 14 dias. Estas doses de luz foram significativamente maiores do que as menores doses eficazes mostradas na Tabela 1.

Esta invenção foi descrita por meio de uma descrição directa e de exemplos. Como notado acima, os exemplos pretendem apenas ser exemplos e não limitar a invenção de forma alguma. Adicionalmente, um perito nesta arte ao rever o fascículo e as reivindicações que se seguem apreciará que existem equivalentes aos aspectos da invenção reivindicados. Os inventores desejam abranger esses equivalentes no âmbito das reivindicações, definindo as reivindicações a invenção.

Lisboa, -5. Mftl 2000

Por THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA - O AGENTE OFICIAL -

EWG.e flMTÓNIO JOAO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rh· das Flores, 74 - 4.° 1BQO LISBOA

Claims

83 612 ΕΡ Ο 680 365 / ΡΤ REIVINDICAÇÕES 1 - Utilização de um agente de fotossensibilização para a preparação de um medicamento para utilização numa terapia para destruir ou alterar uma área de neovascularização num animal, animal esse que compreende ambas uma área de neovascularização e tecido normal circundante da neovascularização, a referida terapia sendo definida pelos passos de: (a) administração ao referido animal de uma quantidade eficaz de um agente de fotossensibilização; e (b) administração à referida área de neovascularização de uma quantidade eficaz de luz de um comprimento de onda que condiga com o comprimento de onda de excitação do referido agente de fotossensibilização, em que a referida luz é administrada à referida área de neovascularização antes do referido agente de fotossensibilização ter permeado o referido tecido normal.
2 - Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a terapia é ainda definida por o tempo entre o passo (a) e o passo (b) ser inferior a um quarto do intervalo clínico para sujeição deste animal a tratamento com luz, após administração do referido agente de fotossensibilização, em terapia fotodinâmica em que o fotossensibilizador eliminou tecido normal.
3 - Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a terapia é ainda definida por a quantidade eficaz de agente de fotossensibilização ser aproximadamente menos do que metade da dose clínica do referido agente de fotossensibilização, em terapia fotodinâmica em que o fotossensibilizador eliminou tecido noimal.
4 - Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a terapia é ainda definida por a quantidade eficaz de luz ser menor do que cerca de metade da dose clínica de luz para activação do agente de fotossensibilização, em terapia fotodinâmica em que o fotossensibilizador eliminou tecido normal.
5 - Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o agente de fotossensibilização é seleccionado de entre o grupo constituído por uma clorina, uma bacterioclorina, uma ftalocianina, uma porfirina, uma purpurina, uma merocianina, um feoforbido e um psoraleno. 83 612 ΕΡ Ο 680 365/ΡΤ 2/2
6 - Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o fotossensibilizador é uma porfirina.
7 - Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a porfirina é BPD ou porfimero sódico.
8 - Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a porfirina é BPD-MA.
9 - Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a terapia é ainda definida por o animal ser um mamífero.
10 - Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que a terapia é ainda definida por o mamífero ser um humano. Lisboa, -5. MM Por THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA - O AGENTE OFICIAL -

Ag. 0{. Pr. Ind. Ru· das Flores, 74 - 4,° 1SQO LISBOA EMC.· \^HTÓNI0 JOÀL $A CliríHA FERkEIRAj