PT712574E

PT712574E - Utilizacao de acido d,l-alfalipoico seus enantiomeros e/ou seus derivados como aditivos para eritrocitos conservados na forma liquida ou crio-conservados para concentrados de eritrocitos homologos e autologos

Info

Publication number: PT712574E
Application number: PT95117109T
Authority: PT
Inventors: Conrad Dr Frank; Henrich Prof Dr Hermann-August; Geise Dr Wolfgang; Ulrich Dr Heinz
Original assignee: Asta Medica Ag
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1995-10-31
Publication date: 2000-09-29
Also published as: DK0712574T3; EP0712574A2; GR3033668T3; US5827643A; EP0712574B1; ATE191124T1; CA2162305C; CA2162305A1; DE4439480C1; ES2145864T3; DE59508090D1; JPH08208401A; EP0712574A3

Description

ΨΙ25Μ

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE ÁCIDO D, L-ALFALIPÓlCO, SEUS ENANTIÓMEROS E/OU SEUS DERIVADOS COMO ADITIVOS PARA ERITRÓCITOS CONSERVADOS NA FORMA LÍQUIDA OU CRIO-CONSERVADOS, PARA CONCENTRADOS DE ERITRÓCITOS HOMÓLOGOS E AUTÓLOGOS" O ácido α-lipóico é designado quimicamente por ácido 1,2-ditiolano-3-pentanóico ácido 5-(1,2-ditiolan-3-il)-valeranóico ácido 5-3-(1,2-ditioanil)-pentanóico. 0 ácido α-lipóico possui um átomo de C quiral e surge em duas formas enantioméricas e aparece fisiologicamente em plantas, bactérias, bem como em organismos mamíferos. O ácido a-lipóico possui a função de uma co-enzima em complexos multienzimáticos mitocondriais, como por exemplo a piruvatodesidrogenase, a α-cetoglutaratodesidrogenase e a desidrogenase dos aminoácidos de cadeia ramificada. Em permuta de substâncias, o ácido α-lipóico pode ser convertido da forma oxidada (ponte disulfureto), na forma dihidro reduzida com dois grupos SH .livres. Ambas as formas têm uma acção antioxidativa bem marcada (por exemplo, Kuklinski et al. , Z. Geriatrie, 4, pag 224-246, 1991; Packer, Diabetologia 36, pag 1212-1213, 1993) . O par redox ácido dihidrolipóico/ácido α-lipóico possui além disso a propriedade de quelatação de metais. Recentemente, está também a ser investigada a influência do ácido α-lipóico no transporte de glucose (Bashan et al., Eínflup von Thioctasáure auf den Glukosetransport. In: Stellenwert von Antioxidantienbeim diabetes mellitus Hrsg.: Gries, F.A. e Wessel, K. Ed. pmi , pag 211-217, 1993) . Na República Federal da Alemanha o ácido 1

α-lipóico é utilizado desde 1966 como medicamento para o tratamento de doenças do fígado, intoxicações por fungos, bem como em polineuropatias periféricas. Outras utilizações estão descritas na EP 0 382 066 A2. Além disso, é conhecido que o ácido α-lipóico protege contra a hemólise, veja-se A. Constantinescu et al., J. Biol. Chem., Vol. 268, Nr. 15, pag 10906-10913, 1993.

Além disso, é descrita na US 5,250,303 A a utilização de soluções tampão para o armazenamento de eritrócitos, bem como de meios de armazenamento isentos de plasma, na US 5,248,506 A e EP 0 564 880 Al.

Os preservantes de sangue para utilização clínica são' produzidos de acordo com as directivas da BGA (Veja-se Beckanntmachung des BGA, Bundesgesundheitsblatt 2/92, directivas para a determinação de grupos sanguíneos e transfusões de sangue), as normas americanas (veja-se Standards for Blood Banks and trnasfusions Services, 14th Edition 1991, by Standards Committe American Association of Blood Banks, Virgínia).

Os diferentes meios de preservação do sangue são descritos em seguida, de acordo com diferentes directivas, provenientes de consensos obtidos em congresso. 1. Conservados de Sangue e componentes de sangue contendo células, como: conservados de sangue, conservados de sangue fresco, concentrado eritrocitário, concentrado eritrocitário lavado, concentrado eritrocitário pobre em leucócitos, concentrado eritrocitário isento de leucócitos, concentrado 2 eritrocitário ultracongelado, plasma rico em trombócitos, concentrado de trombócitos, concentrado de leucócitos 2. Plasma e fracções do plasma: sem interesse no presente caso

Os concentrados eritrocitários são conservados de sangue dos quais se removeu o plasma em quantidade significativa. Hoje em dia, estes são o preparado convencional para a substituição de eritrócitos, por exemplo, numa perda de sangue aguda ou anemia crónica (Welch, G. et al., Ann. Int. Med., 116, pag 393, 1992). Os concentrados eritrocitários lavados são pobres em leucócitos (< 1,2 x 10^ cada conservado) e são utilizados em pacientes com o sindrome de deficiência de IgA e anticorpos-IgA, na anemia auto-imune hemolitica com envolvimento do complemento e hemoglobinúria nocturna do tipo paroxismo (mais raramente). Os conservados de sangue crioconservados comportam-se, depois de concentração e remoção dos meios de protecção da congelação, como se estivessem isentos de leucócitos e dizem satisfazem às mesmas indicações que os concentrados eritrocitários.

As condições de armazenamento óptimas regem-se pelas directivas acima referidas (Stangel W., 1988), sendo as exigências mínimas necessárias aí definidas. Os tempos de armazenamento são fornecidos em função da data de validade, de acordo com o processo de fabrico do fabricante. O armazenamento de conservados de sangue que contêm eritrócitos é dependente da temperatura, devem ser refrigerados no decorrer de 30-60 minutos e apresentam uma perda de 2,3-DPG como consequência de um retardamento do arrefecimento na ordem das 6 horas. Como produto intermédio da glicólise existe nos eritrócitos o 3

2.3- difosfoglicerato e este tem uma função importante na regulação do transporte de oxigénio. A desoxihemoglobina (sem oxigénio) liga o 2,3-DPG, pelo que a afinidade para o oxigénio se reduz fortemente. Sob as condições alcalinas nos pulmões, o 2.3- DPG dissocia-se da hemoglobina, pelo que a afinidade para o carregamento com O2 aumenta. 0 conteúdo em 2,3-DPG decresce em conservados de sangue mais velhos, a desoxihemoglobina contém f correspondentemente menos quantidade deste e o oxigénio está ligado de forma mais firme. Já em 1954, se verificou, pela primeira vez, que a curva de dissociação do oxigénio logo após 1 semana se desvia para a esquerda, pelo que estes eritrócitos nos tecidos não libertam a mesma quantidade de oxigénio, como aconteceria se tivessem sido fornecidos de fresco. Após transfusão, este desvio para a esquerda retorna ao normal, no decorrer de 24-48 horas. Este desvio para a esquerda indica, como consequência da falha na troca do material glicídico, que se trata de uma diminuição do glutationo reduzido. O glutationo reduzido surge da cooperação entre a glutationo reductase e o NADPH. Em consequência, verifica-se que o desvio para a esquerda acima referido durante o armazenamento acompanha a perda do 2,3-DPG. No sangue CPD verifica-se, em comparação com o sangue ACD, um desvio para a esquerda menos acentuado da curva de dissociação; isto acompanhado de um nivel mais elevado de 2-DPG. 0 conteúdo em ATP dos eritrócitos diminui com o armazenamento e em paralelo, ocorre também a perda de lipidos da membrana celular, esferocitose e um aumento da rigidez das células. O tempo de vida normal dos eritrócitos após transferência para o organismo receptor é o parâmetro mais importante, a partir do qual o êxito do armazenamento do sangue pode ser avaliado. A unidade de medida para avaliação da conservação de eritrócitos é hoje a percentagem de eritrócitos fornecidos que sobrevivem para além de 24 horas na circulação 4

sanguínea do receptor. As regras actualmente vigentes para as soluções de conservação e condições de armazenamento impõem que pelo menos 70% das células transfusadas possam ser encontradas após 24 horas na circulação do receptor. Deverá ser também demonstrada in vitro uma menor capacidade de agregação dos eritrócitos (formação de "Rouleau"), dependendo do tempo de armazenamento. Apesar de o tempo de armazenamento não ter nenhuma influência nas características ABO e Rh dos grupo sanguíneos, está descrita uma perda de reactividade das características de Lewis e P dos grupos sanguíneos, com o envelhecimento do conservado. Um pressuposto importante para a conservação do sangue é o impedimento da coagulação do sangue (Stangel, W. in Trnasfuzionsmedizin, Mueller-Eckehardt C. (Hrsg.) Springer Verlag, pag 204-229, 1988). Isto é hoje conseguido através de uma mistura de citrato de sódio e ácido cítrico. Algumas investigações demonstram que a uma temperatura de 4 °C e a um pH entre 6,8 e 7,2 o nível de. ATP permanece estável. Assim, com a introdução de uma solução de citrato de glucose acidificada com ácido cítrico, foi possível prolongar o tempo de validade de um conservado de sangue até 21 dias. Para estabilidade' do valor de pH utilizam-se soluções conservantes (estabilizadores), que apresentam um pH de 7,0-7,1 em conservados ACD e um pH de 7,1-7,2 em conservados CPD e CPDA-1. No âmbito clínico utilizam-se actualmente CPDAi e SAG-M como soluções estabilizadoras, que também foram utilizadas nas experiências realizadas pelos requerentes desta patente.

Conhecem-se outras soluções estabilizadoras que se distinguem das acima descritas , por apresentarem diferentes concentrações dos mesmos produtos que contêm ou uma composição ligeiramente diferente (veja-se Tab. 1 de: Meryman et al. , in: 5

Smit sibinga C. Th., Das P.C., Meryraan Η. T. (eds) Kluwer Academic Publishers, Dodrecht, pag 111-117, 1990):

Composição das soluções de suspensão de glóbulos vermelhos, mM CPDA-1 ADSOL Nutricell ARC6 ARC9C ARC8 NaCl 154,0 70,1 *· Adenina 2,0 2,0 2,2 2,0 2,0 2,0 Glucose 161,0 11,0 55,0 110,0 177, 0 138,0 Manitol 41,2 citrato de Na 89, 6 20,0 17, 9 27,2 33,3 ácido cítrico 15,6 2,0 NaH2P04 16,1 20,0 14,7 3,26 Na2HP04 25,8 20,0 11,6 NH4C1 50,0 PH 5,7 5, 5 5,8 7,1 7,5 7,4 Osmolalidade 323 342 244 199 121 126

Esta tabela resume a composição das soluções referidas no texto. A osmolalidade é apresentada em miliosmoles e refere-se apenas aos õonstituintes não penetrantes, assumindo-se que a glucose penetra na célula [12].

Além da solução CPDA-1 está relacionada com a presente invenção, a aplicação da solução estabilizadora SAG-M : mg/100 ml, veja-se também Fig. 1. Processo para a produção dos concentrados eritrocitários aqui utilizados com aplicação dos estabilizadores CPDA-1 e SAG-M: 6

valor de partida para o pH de 7, 42 conservados de sangue NaCl 877 Anidrido de glucose 819 Adenina 6,9 Manitol 525

Para os concentrados eritrocitários tratados deste modo, é possível alcançar um tempo de armazenamento de 35 dias. Para os concentrados eritrocitários, para este tempo de armazenamento exige-se um hematócrito inferior a 80%, pela American Association of Blood Banks (Stangel, W. in: Trnasfusionsmedizin, Mueller-Eckhardt C. (Hrsg.); Springer verlag, S. 204-229, 1988) .

Pelo processo-crio, os concentrados eritrocitários são produzidos como acima descrito, e em seguida adicionados com substâncias crioprotectoras (glicerina para utilização clinica), ultracongelados a -196°C e em seguida armazenados a -80°C' (Sputtek, A. and Kõrber, C.: Criopreservation of red blood cells, platelets, lymphccytes and stem cells. In : Fuller, B.J. and Grout, B.W.W., Clinicai applications of cryobiology. CRC Press, Inc. , int. Standards Book Number 0-8493-5429-3, p. 95-135, 1991) . Num novo desenvolvimento que se encontra neste momento em avaliação, utiliza-se goma hidroxiletilo como crioprotector (armazenamento em azoto na fase gasosa a -120 a -140°C (Langer et al. , in: Klinische Mikrozirkulation und Hãmorheoologie. Hrsg.: H. Landgraf, F. Jung, A.M. Ehrly, Backwell Wissenschaft Berlin, pag 233-239, 1993 e Sputek et al., Infusionstherapie 19, pag 269-275, 1992). 7

Ο sangue de dadores humanos obtido por meio de métodos convencionais é separado por processos automáticos em ambos os componentes "concentrado eritrocitário (4°C)" e "fresh-frozen plasma". O sistema Optipress para isso utilizado, separa trombócitos e leucócitos. A necessidade de fazer estoques de conservados de sangue para garantir um fornecimento suficiente no âmbito de uma intervenção cirúrgica ou em caso de emergência, acarreta problemas antigos e não obstante bem actuais e desde há muito não resolvidos de forma satisfatória. A par da estabilidade a longo prazo ou funcionalidade dos eritrócitos conservados, tem também grande significado após transfusão a hipóxia e isquémia do organismo receptor. Ao fazer a conservação dos eritrócitos surge também a peroxidação de lipidos de membrana e proteínas estruturais ou funcionais, que levam desde perturbações na funcionalidade até à hemólise. 0 armazenamento do sangue acarreta assim uma danificação dos cropúsculos vermelhos do sangue, que conduz a uma degradação dà sua funcionalidade (por exemplo, libertação do oxigénio, tempo de vida e fluidez dos eritrócitos) . Isto é de grande significado para os pacientes, .que necessitam de uma transfusão de sangue e significa um esforço maior para o fornecimento de sangue, para a recolha de sangue e para os custos da armazenamento.

Devido aos vários passos de lavagem e através do processo de congelação-descongelação surgem perturbações consideráveis nos teores de iões e água , bem como uma redução no teor de ATP e 2,3-DPG. Segue-se daqui um aumento da taxa de hemólise (Sputek et al., Infusionstherapie 19, pag 279-282, 1992; Langer 8

et al., Infusionstherapie, 1994) e uma degradação da viscoelasticidade do sangue (Langer et al., in: Klinische Mikrozirkulation und Hàmorheologie. Eds: H. Landgraf, F. Jung, A.M. Ehrly, Backwell Wissenchaft Berlin, pag 233-239, 1993). As restrições funcionais dos eritrócitos e perturbações estruturais devem-se, entre outros factores, à peroxidação de lipidos de membrana, que podem ser, por exemplo medidas por meio do malondialdeido. (Pfafferot et al., Blood, 59, pag 12-15, 1982)

Constitui assim um objectivo, melhorar a conservação de concentrados eritrocitários homólogos e autólogos, para utilização clinica.

Este objectivo será alcançado, de acordo com a invenção, através da utilização de ácido α-lipóico e/ou dos seus enantiómeros e/ou dos seus derivados como aditivo para a conservação liquida de eritrócitos ou como aditivo em concentrados eritrocitários homólogos e autólogos. Assim, são objecto da invenção, tanto o aditivo para a conservação liquida de eritrócitos a 4°C para concentrados eritrocitários homólogos e autólogos, como a utilização de ácido α-lipóico e/ou dos seus enantiómeros e/ou dos seus derivados como aditivo para a conservação de eritrócitos, para concentrados eritrocitários homólogos e autólogos a) para a utilização a -70°C a -90°C (método-glicerina) e b) em azoto liquido -196°C/-140°C (método de Haes, fase gasosa)

Constitui um outro objecto de uma configuração vantajosa da invenção, que quando se utiliza ácido D, L-a-lipóico e/ou os,^ seus enantiómeros e/ou os seus derivados como aditivo para a 9

conservação de eritrócitos para concentrados eritrocitários homólogos e autólogos, estes sejam tratados com goma hidroxietilo (HAES) e em seguida, após descongelamento, tratados ainda com um Cell-(Blood)-Saver.

Com estes processos adicionais, os detritos celulares (bem como a hemoglobina livre) são removidos, garantindo-se assim um concentrado eritrocitário de muito boa qualidade. A aplicação desta versão vantajosa pode ser realizada quer pelo método de glicerina, quer pelo método de Haes (veja-se acima)

De acordo com a invenção, o saco de sangue contém preferencialmente uma concentração de 10 μΜ a 1 mM de ácido D, L-a-lipóico e/ou dos seus enantiómeros e/ou dos seus derivados, preferindo-se especialmente 100 μΜ.

Exemplos de derivados no âmbito da invenção são o ácido dihidrolipóico, metabolitos como o ácido (6,8-bisnor- tetralipóico); ácido tetranorlipóico e os seus sais, bem como ésteres e amidas do ácido D,L-a-lipóico. A produção dos concentrados eritrocitários utilizados de acordo com a invenção com aplicação dos estabilizadores CPDA-1 e SAG-M é apresentada de forma esquemática na Fig. 1. O processo de acordo com a invenção apresentam as seguintes características ou vantagens:

1. Melhoria da funcionalidade dos eritrócitos dada a melhor-., viscoelasticidade e maior conteúdo em 2,3-DPG 10

2. Prolongamento do tempo de vida dos eritrócitos em armazenamento 3. Prolongamento do tempo de armazenamento 4. Reconstituição das funções normais dos eritrócitos

Através da adição de ácido α-lipóico e/ou dos seus enantiómeros e/ou dos seus derivados para armazenamento de eritrócitos conservados líquidos (a 4°C) para concentrados eritrocitários homólogos e autólogos bem como para eritrócitos crio-conservados para aplicação a -70°C a -90°C e em azoto líquido a -196°C/-140°C (fase gasosa) para concentrados eritrocitários homólogos e autólogos, conseguem-se obter as vantagens da invenção, acima referidas.

Por um lado, através da adição, de acordo com a invenção, de ácido α-lipóico e/ou dos seus enantiómeros e/ou dos seus derivados para armazenamento de conservados de sangue consegue-se obter a vantagem acima referida, por outro lado existe a inovação em relação aos processos descritos, da utilização do material acima descrito. Dentro do conjunto de derivados de acordo com a invenção incluem-se, em particular, o ácido dihidrolipóico, metabolitos (ácido 6,8-bisnortetralipóico; ácido tetralipóico) e os sais de ácido α-lipóico, bem como os seus ésteres e amidas. Métodos

Os resultados aqui alcançados são obtidos com eritrócitos humanos, que foram produzidos de acordo com o estado da técnica^ acima descrito para o sangue e sacos de sangue. 1!

Para demonstração da eficácia do ácido D,L-a-lipóico e/ou dos seus enantiómeros e/ou dos seus derivados, utilizam-se juntamente com processos de avaliação bioquímica os métodos específicos da reometria capilar oscilante sinusoidal (Chmiel H. et ai., Biorheology, 27, pag 883-894 (1990). Para a medição do comportamento fluido viscoelástico do sangue utiliza-se como um dos processos mais modernos, a determinação dá transformação patológica dos eritrócitos na hemoreologia clínica (por exemplo, na doença de estrangulamento arterial, apoplexia e em doenças genéricas dos vasos periféricos).

Para a determinação da viscoelasticidade realizam-se experiências reológicas dinâmicas, nas quais se medem a deformação e a resistência ao rasgamento em função do tempo (ensaio do rasgamento oscilante sinusoidal). 0 sangue como fluido viscoelásti t~< —* a. w nau linear apresenta uma diminuição de η' e η" com o aumento da amplitude do rasgamento.

Para as medições aqui realizadas sob o título "exemplos", utiliza-se o reómetro capilar oscilante, OCR-D (A Paar, Graz, Áustria), em que o método depende da determinação simultânea do caudal volumétrico e do gradiente de pressão ao longo de um capilar de vidro com corte transversal circular. A viscoelasticidade pode assim ser distinguida entre deformação êiâstica (armazenamento de energia) e viscosa (consumo de energia). O valor aumentado de η" descreve uma formação mais forte de agregados e células mais rígidas com formação de eritrócitos crescentemente mais elásticos (menos flexíveis), com formação de agregados, que originam perturbações no fluxo sanguíneo na microcirculação. Estas propriedades estão associadas com a composição da membrana celular e com os^ mecanismos de "bridging", que se desenvolvem através da 12

formação de "Rouleau" acima referida. A dimunuiçâo de η' com maiores taxas de rasgamento pode derivar de diferentes orientações e prolongamento dos entrocitos, bem como cie uma diminuição do consumo de energia. 0 η' não é só dependente do hematócrito e .viscosidade do plasma, mas também da percentagem de agregação e das propriedade elásticas da membrana. 0 efeito das substâncias aqui utilizadas mostra-se nos conservados de sangue, do seguinte modo: A concentrado eritroeitário 1. 0 aumento da viscosidade do sangue condicionada pelo envelhecimento (componente dinâmico μ' ) é quase completamente

reprimido; enquanto que o sangue controlo com o aumento do tempo de armazenamento se torna cada vez mais espesso. A viscoelasticidade do material acima referido permanece no valor encontrado, o qual se manteve durante 15 dias (a diferença para o controlo pode ir até 10% ou mais, o que corresponde a uma compensação de 100% do agravamento provocado pelo envelhecimento) 2. A componente elástica da viscosidade do sangue (μ") descreve as propriedades elásticas das células sanguíneas. Com o aumento da idade do conservado de sangue, aumenta o componente elástico da viscosidade do sangue, o que tem por consequência um aumento da viscosidade total. Nestes parâmetros, as diferenças relativas ao controlo mantiveram-se em 20%, sendo a degradação da fluidez celular devida ao envelhecimento foi completamente compensado. Assim torna-se significativo, o efeito do ácido-a-lipóico ligado às células. 13

3. Aumento de 2,3-DPG (difosfoglicerato) para cerca de 50% após 50 dias 4. A utilização do ácido α-lipóico aqui utilizado tem, desde há décadas, aplicação como medicamento noutras indicações, sendo muito bem tolerado. Outras substâncias para protecção do stress oxidativo sob condições de armazenamento, f' são menos eficazes e apresentam efeitos secundários em pacientes, após transfusão de sangue (Knight, J.A. et al. Transfusion, 32, pag 354-357 (1992) . O efeito antioxidativo já conhecido do ácido α-lipóico tem como consequência, em todas as suas formas, uma redução de aproximadamente 20% do malonaldeido. (redução do dano para metade) B Crioconservados 1. O valor da agregabil idade dos eritrócitos no grupo controlo correspondiam, depois de concentração e resuspensâo aos conservados líquidos, após 15 dias. Através da adição do material dos requerentes, acima referido, o material crioconservado apresenta um valor significativamente maior (33%), conseguindo-se portanto uma equivalência na zona normal. O efeito no malonaldeido e viscoelastícidade é o mesmo que em A.

Vantagens do novo desenvolvimento - As alterações dos requisitos de armazenamento ou envelhecimento das estruturas celulares e funções relacionadas com a estrutura (viscosidade do sangue e fluidez celular) podem diminuir ou diminuir enormemente. O efeito é ainda mais notável 14 quando o material acima referido for utilizado o mais cedo possível (antes do armazenamento) e portanto antes de se verificar o dano ("priming"). - Mostrou-se ainda que este efeito de "priming" continua a existir, mesmo durante a resuspensão e incubação em plasma autólogo (= simulação da re-transfusão). - O efeito do material acima referido mantém a sua reactividade ao longo de tempos de armazenamento longos (60 dias) e mesmo após um processo de congelamento-descongelamento O aumento de 2,3-DPG melhora a viscoelasticidade, como aditivo não tóxico - A possibilidade de armazenar o sangue por mais tempo melhora o fornecimento à população, pois os conservados de sangue de acordo com o estaco da técnica têm que ser desprezados após aproximadamente 35 dias (quantidade limitada de sangue disponível). Assim, os bancos de sangue são aliviados e hospitais deles dependentes são melhor abastecidos (redução dos custos). - A tolerância do ácido α-lipóico como substância fisiológica Exemplos

Caso 1: concentrado eritocitário (veja-se acima)

Caso 2: eritrócitos crioconservados (veja-se acima)

Lisboa, 14 de Junho de 2000 O AGENTE OFICIAL DA^RQPRIEDADE INDUSTRIAL·

Claims

f REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o armazenamento de eritrócitos, que compreende os passos de: a) tratamento dos eritrócitos com ácido D,L-a-lipóico e/ou os seus enantiómeros e/ou os seus derivados e b) armazenamento dos eritrócitos tratados de acordo com o passo a)
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o armazenamento é realizado a 4°C 3’. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que se adiciona aos eritrócitos glicerol numa quantidade adequada para a crioprotecção dos eritrócitos, obtidos de acordo com o passo a) , antes do armazenamento, e o armazenamento é realizado a -70°C a -90°C.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que se adiciona aos eritrócitos hidroxietil amido numa quantidade adequada para a crioprotecção dos eritrócitos, obtidos de acordo com o passo a), antes do armazenamento, e o armazenamento é realizado a -140°C a -196°C.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o tratamento e armazenamento são feitos num saco de sangue e o ácido D,L-a-lipóico e/ou os seus enantiómeros e/ou os seus derivados são adicionados ao saco de sangue numa concentração de 10 μΜ a 1 mM, 1
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que derivados são ácido dihidrolipóico, ácido 6 bisnortetralipóico; ácido tetranorlipóico e os sais ácido D,L-a-lipóico e as suas amidas e ésteres. Lisboa, 14 de Junho de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL os ,8- de 2