JPH08208401A - 赤血球−液状貯蔵物及び赤血球−凍結貯蔵用の添加剤、赤血球濃縮物の製法及び赤血球−凍結貯蔵物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液貯蔵方法 【解決手段】 赤血球液状貯蔵又は赤血球凍結貯蔵の前
に、赤血球濃縮物に、Ｄ，Ｌ−α−リポ酸及び／又はこ
れらの鏡像異性体及び／又はこれらの誘導体からなる添
加剤を添加する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】α−リポ酸は、化学的には、
１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸、５−(１，２−
ジチオラン−３−イル)−吉草酸、５−３−(１，２−ジ
チオアニル)−ペンタン酸と称される。このα−リポ酸
は、１個のキラルＣ−原子を有し、かつ２種の鏡像異性
体形を現わし、かつ生理学的に植物中で、細菌中で並び
に哺乳動物中で産出される。これは、ミトコンドリア多
酵素複合体、例えば、ピルベートデヒドロゲナーゼ、α
−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ及び分枝鎖アミノ
酸のデヒドロゲナーゼ中で補酵素の機能を有する。物質
代謝においてα−リポ酸は、酸化された形(ジスルフィ
ド橋)から、２個の遊離のＳＨ−基を有する還元された
ジヒドロ形に移行されうる。この両方の形は、著しい抗
酸化作用を有する（例えば、Kuklinski et al., 1991;
Packer, 1993）。レドックス対であるジヒドロリポ酸／
α−リポ酸は、更に、金属キレート化特性を有する。近
年、α−リポ酸のグルコース輸送への影響も研究されて
いる(Bashan et al., 1993)。ドイツ連邦共和国におい
ては、α−リポ酸は、１９６６から肝疾患の治療のため
に、菌中毒の際に、並びに末梢ポリニューロパシーのた
めの薬剤として使用されている。

【０００２】

【従来の技術】臨床適用のための血液貯蔵物は、ＢＧＡ
ガイドライン（Richtlinien des BGA；ＢＧＡの公表
物、Bundesgesundheitsblatt 2/92, Richtlinien zur B
lutgruppenbestimmung und Bluttransfusion 参照)、米
国ガイドライン(AmerikanischenGuideline; Standards
for Blood banks and Transfusion services, 14th Edi
tion 1991, by Standards Committe, American Assosia
tion Of Blood Banks, Virginia参照）に従い製造され
る。

【０００３】多様な血液貯蔵物の種類は、様々な会合の
合意によるガイドライン(Arzneimittelbrief, 1994参
照)により、次のように記載される: １．細胞含有血液−及び血液成分貯蔵物、例えば：血液
貯蔵物、新鮮血液貯蔵物、赤血球濃縮物、精製赤血球濃
縮物、白血球微含赤血球濃縮物、白血球不含赤血球濃縮
物、凍結冷却貯蔵赤血球濃縮物、血小板多含血漿、血小
板濃縮物、白血球濃縮物 ２．血漿及び血漿分画物：この場合、該当しない 赤血球濃縮物は、血漿が充分に除去された血液貯蔵物で
ある。今日、これらは、例えば、急性失血及び慢性貧血
の際の赤血球代替のための標準製剤である(Welch, G.,
et al., 1992)。精製赤血球濃縮物は、白血球微含（貯
蔵物あたり、＜１．２×１０⁹）であり、かつＩｇＡ−
欠乏症候群及びＩｇＡ−抗体を有する患者の際に、補体
−関与による自己免疫溶血性貧血の際に、かつ発作性夜
間性血色素尿の際に（まれに）使用される。凍結貯蔵さ
れた血液貯蔵物は、解凍及び凍結保護剤の除去の後に白
血球不含とみなされ、かつ赤血球濃縮物と同様に適用さ
れる。

【０００４】最適貯蔵条件は、前記のガイドラインによ
り規定されており(Stangel W., 1988)、その際、必要最
小限の要求がここで定義されている。貯蔵期間は、製造
方法に依存しており、製造者により期限日付で記載され
る。赤血球含有血液貯蔵物の貯蔵は、温度に依存してお
り、３０〜６０分間で冷却を達成すべきであり、かつ冷
却の遅滞の場合には、約６時間で、２，３−ＤＰＧの損
失が現われる。糖分解の中間体として、２，３−ジホス
ホグリセレートが赤血球中に存在し、酸素輸送の調節の
際に重要な作用を有する。デスオキシヘモグロビン（酸
素不含）は２，３−ＤＰＧと結合し、これにより酸素親
和性は著しく低下する。肺中のアルカリ性環境下では、
２，３−ＤＰＧはヘモグロビンから解離し、これにより
Ｏ₂での負荷に関する親和性が上昇する。２，３−ＤＰ
Ｇ−含分は、古い血液貯蔵物中では低下し、これと相応
してデスオキシヘモグロビンは減少し、かつ酸素がかな
り、堅固に結合する。既に１９５４年に、酸素−解離曲
線は既に１週間後に、組織中のこれらの赤血球が新鮮な
ものと同量の酸素を遊離しない程、左にずれることが初
めて確認された。輸血の後に、この左へのずれは、２４
〜４８時間で正常化する。この左へのずれは、還元され
たグルタチオンの減少に表れるグリシド−物質代謝の拒
絶の結果として表れた。還元されたグルタチオンは、グ
ルタチオン還元酵素とＮＡＤＰＨとの共同作用下で生ず
る。その結果、前記の貯蔵の間の左へのずれは、２，３
−ＤＰＧの損失で明らかである。ＣＰＤ−血液は、ＡＣ
Ｄ−血液に比べ、解離曲線のより僅かな左へのずれを示
し；このことは、より高い２−ＤＰＧ−濃度で明らかに
なる。赤血球のＡＴＰ−濃度は、貯蔵に伴い減少し、か
つこれに並行して細胞膜の脂質損失、球状赤血球症及び
細胞の弾性率の上昇が現れる。受血生物への輸血後の赤
血球の正常な生存能力は、血液貯蔵の結果を測定しうる
重要なパラメーターである。赤血球貯蔵の値の尺度とし
て、今日、受血生物循環中で２４時間より長く生残る赤
血球のパーセントが記載される。貯蔵溶液及び貯蔵条件
に関する、現在有効な規定は、輸注された細胞の少なく
とも７０％が、２４時間後に受血生物循環中で検出可能
であるべきであると要求している。貯蔵時間に依存して
低下する赤血球の凝集即応性(Aggregationsbereitschaf
t；ルーロー−形成;Rouleau-Bildung)も、試験管中で検
出すべきである。貯蔵期間は、ＡＢＯ式及びＲｈ式血液
型には影響を及ぼさないが、貯蔵物の進行性老化に伴う
ルイス式及びＰ式血液型の反応性損失が記載されてい
る。血液貯蔵のための重要な前提は、血液凝固の阻止で
ある(Stangel W., 1988)。これは、今日では、クエン酸
ナトリウム及びクエン酸の混合物により達成されてい
る。実験は、４℃の温度で、かつ６．８〜７．２のｐＨ
で、ＡＴＰ−濃度が安定に保持されることを示した。そ
れゆえ、クエン酸で酸性にされたグルコース−クエン酸
塩溶液の導入により、血液貯蔵物の有効期限を２１日ま
で延長することができた。ｐＨ−値の安定のために、Ａ
ＣＤ−貯蔵物の場合には７．０〜７．１のｐＨ、及びＣ
ＰＤ−及びＣＰＤＡ−１−貯蔵物の場合には７．１〜
７．２のｐＨを有する貯蔵溶液（安定剤）を使用する。
臨床分野では、目下、本特許出願人の実験でも使用され
ているＣＰＤＡ₁及びＳＡＧ−Ｍが、安定剤溶液として
使用されている。

【０００５】前記のものとは、同じ内容物の異なる濃度
により、又は僅かに異なる組成により異なるその他の安
定剤溶液も公知である(Meryman et al.,（１９９０）の
表１参照）：

【０００６】

【表１】

【０００７】この表は、この文献中に記載の溶液の組成
をまとめている。重量オスモル濃度は、ミリオスモル(m
illiosmole)で示されており、かつ非−浸透成分のみに
関し、グルコースは、赤血球中に浸透するものとみなさ
れている［１２］。

【０００８】本発明との関連で、溶液ＣＰＤＡ−１と並
んで安定剤溶液ＳＡＧ−Ｍを使用する：ｍｇ／蒸留水１
００ｍｌ、安定剤ＣＰＤＡ−１及びＳＡＧ−Ｍ使用下で
の使用赤血球濃縮物の製法図１も参照のこと： 血液貯蔵物のための出発ｐＨ値７．４２ ＮａＣｌ ８７７ グルコース無水物 ８１９ アデニン １６．９ マンニトール ５２５ このように処理された赤血球濃縮物は、可能貯蔵時間３
５日と記載されている。American Association of Bloo
d Banksによれば、赤血球濃縮物に、この貯蔵期間で８
０％未満のヘマトクリットが要求されている(Stangel
W., 1988)。

【０００９】凍結法では、赤血球−濃縮物を前記と同様
に製造し、次いで凍結保護物質（臨床適用のためにはグ
リセリン）を添加し、−１９６℃で低温凍結し、次いで
−８０℃で貯蔵する(Sputtek and Koerber in: Fuller
B.J. and Grout B.W.W.,1991;)。目下試験中である新規
開発では、ヒドロキシエチルでん粉を、凍結保護剤とし
て使用している（窒素−気相中、−１２０〜−１４０℃
で貯蔵；Langer et al., 1993及びSputtek et al.,199
2)。

【００１０】標準法により得られたヒトの給血血液を自
動的な方法で、”赤血球−濃縮物（４℃）”及び”新鮮
-凍結血漿”の２種の成分に分離する。このために使用
されるオプティプレスシステム(Optipress-System)は、
血小板と白血球とを分離する。

【００１１】手術処置もしくは緊急時の充分な供給を保
証するための血液貯蔵物の備蓄は古いが、非常に今日的
で、かつ長く満足しうるようには解決されていない問題
を有している。貯蔵された赤血球の長期間安定性もしく
は機能性と並んで、輸血後に、低酸素性及び虚血性受血
者組織が問題となる。赤血球の貯蔵の際に、機能障害か
ら血球溶解にまで至る膜脂質及び構造−もしくは機能タ
ンパク質の過酸化も起こる。

【００１２】血液の貯蔵は、その機能低下（例えば、赤
血球の酸素放出、生存期間及び流動性）となって表れる
赤血球の障害も伴う。このことは、輸血が必要な患者に
とっては非常に重要であり、かつ給血、血液確保、及び
貯蔵費用のための多くの費用を意味している。

【００１３】多様な精製工程により、かつ凍結融解法に
より、イオン−及び水分代謝のかなりの障害並びにＡＴ
Ｐ−及び２，３−ＤＰＧ−含分の減少が生ずる。これに
より溶血率の割合の上昇が生じ(Sputtek et al., 1992;
Langer et al., 1994)、かつ血液の粘弾性の悪化に至
る(Langer et al., 1993)。赤血球の機能減少及び構造
障害は、特に、例えば、マロンジアルデヒドにより測定
することができる膜脂質の過酸化に起因する(Pfafferot
et al., 1982)。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】従って、課題は、同種
及び自己(autolog)の赤血球濃縮物の貯蔵を臨床での需
要のために改良することである。

【００１５】この課題は、本発明により、α−リポ酸及
び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体を、赤血
球−液状貯蔵の際の同種かつ自己の赤血球濃縮物用の添
加剤として、又は赤血球−凍結貯蔵の際の同種かつ自己
の赤血球濃縮物用の添加剤として使用することにより解
決した。その際、α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体
及び／又はその誘導体を、４℃で赤血球−液状貯蔵する
際に同種及び自己の赤血球濃縮物に添加すること、及び
赤血球−凍結貯蔵する際に添加剤として、 ａ）−７０℃〜−９０℃（グリセリン−法）で、かつ ｂ）−１９６℃／−１４０℃の液体窒素下（気相−Ｈａ
ｅｓ法）で、同種及び自己の赤血球濃縮物に使用するこ
とも本発明の目的である。

【００１６】赤血球−凍結貯蔵する際に、Ｄ，Ｌ−α−
リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体
を、ヒドロキシエチルでん粉（ＨＡＥＳ）で処理されて
おり、かつ引き続き、融解の後に、細胞−（血液）−セ
ーバーにより後処理される同種及び自己の赤血球濃縮物
用の添加剤として使用することは、本発明の有利な態様
がもう１つの目的である。

【００１７】この付加的な方法により、細胞組織敗残物
（及び遊離ヘモグロビン）が除去され、かつ費用のかか
らない赤血球濃縮物が保証される。この有利な変法の使
用は、グリセリン法でもＨａｅｓ−法でも行うことがで
きる（上記参照）。

【００１８】本発明によれば、血液バッグ中の有利な濃
度は、Ｄ，Ｌ−α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体及
び／又はその誘導体１０ミューモル〜１ミリモルであ
り、特に有利に、１００ミューモルである。

【００１９】本発明の意味での誘導体としては、ジヒド
ロリポ酸、代謝物質、例えば、６，８−ビスノル−テト
ラリポ酸；テトラノルリポ酸及びＤ，Ｌ−α−リポ酸の
塩並びにエステル及びアミドを挙げることができる。

【００２０】安定剤ＣＰＤＡ−１及びＳＡＧ−Ｍの適用
下での使用赤血球濃縮物の本発明による製法を、図１に
模式的に示す。

【００２１】本発明の方法は、次の主要な特徴もしくは
利点を示す： １．改善された粘弾性及び上昇した２，３−ＤＰＧ−含
分に基づく赤血球機能性の改善 ２．貯蔵下での赤血球生存期間の延長 ３．貯蔵期間の延長 ４．正常な赤血球機能の回復 α−リポ酸及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘
導体を、赤血球−液状貯蔵物（４℃）の貯蔵の前に、同
種及び自己の赤血球濃縮物に、並びに−７０℃〜−９０
℃で、かつ液体窒素−１９６℃／−１４０℃（気相）で
の適用で赤血球−凍結貯蔵する際に同種及び自己の赤血
球濃縮物に添加することにより、本発明の前記の利点が
達成される。

【００２２】一方で、α−リポ酸及び／又はその鏡像異
性体及び／又はその誘導体を血液貯蔵物の貯蔵前に、本
発明により添加することにより、前記の利点が達成さ
れ、他方で、記載の方法と並んで、前記の物質の使用に
新規性がある。誘導体の概念には、本発明では、殊に、
ジヒドロリポ酸、代謝物６，８−ビスノルテトラリポ
酸；テトラリポ酸及びα−リポ酸の塩並びにそのエステ
ル及びアミドが該当する。

【００２３】

【実施例】方法 ここで得られた結果は、ヒトの赤血球を用いて達成し、
その際、血液及び血液バッグのための前記に記載の従来
技術に従い処理した。

【００２４】Ｄ，Ｌ−α−リポ酸及び／又はその鏡像異
性体及び／又はその誘導体の作用の立証．３のために、
生化学的立証方法と並んでシヌソイド振動性毛細管−流
動測定(sinusoidalen oszillierenden Kapillar-Rheome
trie)の特殊な方法を使用した(Chmiel H., 1990)。最も
新しい方法として血液の粘弾流動特性の測定を、臨床血
液流動学における赤血球の病理学的変化の測定のために
使用する(例えば、動脈梗塞疾患、卒中発作及び一般的
に末梢血管疾患で)。

【００２５】粘弾性の測定のために、動的流動実験を実
施し、その際、時間に依存して、変形及び剪断応力を測
定する（シヌソイド振動性剪断実験）。非線状粘弾性液
体としての血液は、剪断の振幅が上昇する際にη’及び
η”の減少を示す。

【００２６】この場合に「例」で記載の測定のために、
振動性毛細管−流動計、ＯＣＲ−Ｄ(A. Paar, Graz, Au
stria)を使用し、その際、この方法は、円形の断面を有
するガラス毛細管を通る容積流動率及び圧力勾配の同時
の測定に基づく。この粘弾性は、弾性変形（エネルギー
蓄積）と粘性変形（エネルギー消耗）を区別することが
できる。η”の上昇値は、強い凝集物形成及び微小循環
中の血流の妨害をもたらす凝集体の形成を伴う増加性弾
性の赤血球（柔軟性に乏しい）の形成を伴う硬直した細
胞を示す。これらの特性は、細胞膜の状態及び前記のル
ーロー−形成をもたらす「橋かけ」−機構と結び付いて
いる。より高い剪断率でのη’の減少は、赤血球の方向
及び伸長の変更並びにエネルギー消耗の減少により生じ
うる。η’は、ヘマトクリット及び血漿粘度のみではな
く、凝集特性及び膜の弾性特性にも依存する。

【００２７】ここで使用の物質の作用は、血液貯蔵物中
で次のように明らかである： Ａ 赤血球濃縮物 １．貯蔵期間が延びるにつれて対照血液は、粘稠性にな
っていくが、老化による血液粘度の上昇（動的成分
ｎ’）は、ほぼ完全に抑制された。前記の物質の粘度
は、１５日後の値で停止したままであった（対照との差
は、１０％以上であり、これは、老化による悪化の１０
０％の補償に相当する）。

【００２８】２．血液粘度の弾性成分（ｎ”）は、血液
細胞の弾性特性を記載している。血液貯蔵物が古くなる
につれて、血液粘度の弾性成分は高まり、これは、全体
の粘度を高める。このパラメーターでは、対照物との比
較差は２０％であり、かつ老化による細胞流動性の悪化
は、完全に補償された。これにより、α−リポ酸の細胞
と結びついた作用が、重要であることが分かる。

【００２９】３．２，３−ＤＰＧ（ジホスホグリセレー
ト）の上昇は５０日後で、５０％。 ４．ここで使用されるα−リポ酸の添加は、他の適用で
の薬剤としての１０年に及ぶ使用で、その良好な認容性
が証明されている。貯蔵条件下での酸化ストレスに対す
る保護のための他の物質は、より僅かな効果を有するの
みであり、かつ輸血後の患者の副作用と結び付いている
(Knight J.A. et al., 1992)。α−リポ酸の既に公知で
ある抗酸化作用は、全ての形で、マロンジアルデヒドの
約２０％の還元をもたらした（損害の半減）。

【００３０】Ｂ 凍結貯蔵物 １．対照物群での赤血球の凝集能(Erythrozytenaggreab
ilitaet)の値は、解凍及び再懸濁の後に、液体貯蔵１５
日後のそれに相応した。本発明の前記の物質の添加によ
り、凍結貯蔵された物質で、著しくより高い値（約３３
％）即ち正常範囲への一致を達成した。マロンジアルデ
ヒド−及び粘弾性−作用は、Ａと同様である。

【００３１】新規発明の利点 −貯蔵もしくは老化による細胞構造及び構造に関する機
能（血液粘度及び細胞流動性）の変化を回避することが
できるか、もしくはほぼ回避することができる。この作
用は、前記の物質を可能な限り早期（貯蔵前）に、かつ
損害の発生前に使用すると（前処理;Priming）、更によ
り明らかになる。

【００３２】−更に、このような前処理−効果は、自己
血漿中での再懸濁及びインキュベーション（再輸血のシ
ミュレーション）の間にも効果を保持することが明らか
である。

【００３３】−前記の物質の作用は、長い貯蔵期間（６
０日間）を経てもその反応性を保持し、かつ凍結融解法
の後にも保持される。

【００３４】２，３−ＤＰＧの上昇、改良された粘弾
性、添加剤として非毒性。

【００３５】−従来技術による血液貯蔵物は、約３５日
後に廃棄すべきであるので（給血血液の量制限）、血液
のより長い貯蔵の可能性は、ヒトへの供給を改善する。
これにより、献血は軽減され、かつ関連病院の血液供給
が改善される（費用の減少）。

【００３６】−生理学的物質としてのα−リポ酸の認容
性 例ケース１： 赤血球−濃縮物（従来技術参照）ケース２： 凍結貯蔵された赤血球（従来技術参照）

【図面の簡単な説明】

【図１】安定剤の使用下での本発明の赤血球濃縮物の製
法を示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘルマン−アウグスト ヘンリヒ ドイツ連邦共和国 ヴュルツブルク シュ タインバッハタール 44 (72)発明者 ヴォルフガング ガイゼ ドイツ連邦共和国 ディプバッハ ベルク トハイマー シュトラーセ ２ (72)発明者 ハインツ ウルリヒ ドイツ連邦共和国 ニーデルンベルク バ イエルンシュトラーセ ２

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 赤血球−液状貯蔵する際の同種及び自己
   の赤血球−濃縮物用の、又は赤血球−凍結貯蔵する際の
   同種及び自己の赤血球−濃縮物用のＤ，Ｌ−α−リポ酸
   及び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体からな
   る添加剤。
2. 【請求項２】 ４℃で赤血球−液状貯蔵する際の同種及
   び自己の赤血球−濃縮物用のＤ，Ｌ−α−リポ酸及び／
   又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体からなる添加
   剤。
3. 【請求項３】 ａ）−７０℃〜−９０℃（グリセリン
   法）で、及び ｂ）−１９６℃／−１４０℃の液体窒素下（気相Ｈａｅ
   ｓ法）で使用するための、赤血球−凍結貯蔵する際の同
   種及び自己の赤血球−濃縮物用のＤ，Ｌ−α−リポ酸及
   び／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体からなる
   添加剤。
4. 【請求項４】 誘導体は、ジヒドロリポ酸、代謝物質、
   例えば、(６，８−ビスノル−テトラリポ酸；テトラノ
   ルリポ酸及びＤ，Ｌ−α−リポ酸の塩並びにそのアミド
   及びエステルである、請求項１から３に記載の添加剤。
5. 【請求項５】 Ｄ，Ｌ−α−リポ酸及び／又はその鏡像
   異性体及び／又はその誘導体の添加をチューブ系中へ、
   又は直接、図１によるバッグ中へ行うことによる、ＣＰ
   ＤＡ−１及びＳＡＧ−Ｍ並びに異なる組成のその他の安
   定剤の使用下での赤血球濃縮物の製法。
6. 【請求項６】 ヒドロキシエチルでん粉（ＨＡＥＳ）を
   用いての処理及び解凍後に行われる細胞−（血液）−セ
   ーバーを用いての後処理による同種及び自己の赤血球−
   濃縮物用のＤ，Ｌ−α−リポ酸及び／又はこれらの鏡像
   異性体及び／又はこれらの誘導体のいずれかを添加剤と
   して含有する赤血球−凍結貯蔵物の製法。
7. 【請求項７】 血液バッグ中のＤ，Ｌ−α−リポ酸及び
   ／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体の濃度は、
   １０ミューモル〜１ミリモルである、請求項１から４に
   記載の添加剤。
8. 【請求項８】 血液バッグ中のＤ，Ｌ−α−リポ酸及び
   ／又はその鏡像異性体及び／又はその誘導体の濃度は、
   １０ミューモル〜１ミリモルである、請求項５又は６に
   記載の製法。