PT733113E - Vacina contra a gripe - Google Patents

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PT733113E
PT733113E PT95904370T PT95904370T PT733113E PT 733113 E PT733113 E PT 733113E PT 95904370 T PT95904370 T PT 95904370T PT 95904370 T PT95904370 T PT 95904370T PT 733113 E PT733113 E PT 733113E
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recombinant
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influenza virus
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PT95904370T
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Walter Charles Fiers
Tom Maria Deroo
Willy Alfons Min Jou
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Vlaams Interuniv Inst Biotech
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Description

"VACINA CONTRA A GRIPE" ft ρχ:sw;;:í,S.:';a iipvsi&ípãa dl S té&pgdtç· :S OPuí i::fe-Cíi;±:'l.ííis;it-w de clcgc in£IitotiSÍf a um vector de expressão com 0: dxisl se ρΐίνΡί expressar c sebbsdbbúásse recombinante em íxslslas h*^p®d^iu:ASf » métodos para produzir e purificar a Sv:sur:ãm.ís:::lòssíu recombinante, a vacinas contra ± gripe p'; •cU:r£iuss'íSãíí:5 o à ut ilí za^á-O da neuraminidase recombinante de accpsb com a presente invenção. 0 vírus ínfluenza dos tipos A e B que surgem por surtos epidémicos provocam desconfcrio considerável nos indivíduos e exercem forte influência sobre a vida social e económica. Esses vírus induzem uma significativa taxa de mortalidade em pessoas idosas e em doentes com enfermidades crónicas. Durante os anos 40 (1940) que se seguiram 2 sua introdução, observou-se serem as vacinas inactivadas, baseadas em material virai cultivado em ovos de galinhas, manifestamente eficazes contra a infecção da gripe c terem resultado ίίϊ:· uma diminuição significativa da taxa de mortalidade on populações de alto riscc.
Edttí; os vírus dos canais brônquícos os vírus influenza slo porque sofrem uma significativa variação puí:igé;niçá ídexigcsdâ "drift") nos seus dois antigénics de superiluiPí ou seja, a hemaglutinina (Hli) e a :uu.:rur:'çn.:.bcle ilPb . w;s: jic .'Ui· ΐί ma -‘.i; .iiçvibi; j 1;\;· e;·': " v; cçc X·. víft'· ":i:> Cpí·1: y: ir: β V ;i".C H 5 ΐ ?iUí íX X :uí i:' i iÀ;' ?, m ,· . · t ds:- cCiSíã A ·: y ·-. ·-·' ·: >. :· y:> TC.:' > · dal P iPvdipptç atè itnxslv::· x.·
·; TC TC-NdTC ' ..•A.'·: .;·. v ' dd »·. Xjp:1/CV --ΡΧΡ .η'::. :3TC:· :C íi: t IpPlprap·;.:®; Αρρορ;®;, aotanis TC-.x .· :-.a ··: et: ÍP:Oad:--aa pg- -Χΐύ j;;i :XXí Cp-píUt: -.V • A ••«•Λ- ·>-·····'- . '8. CV vyi : ;..;y v -.· . ·:·' .'.s ύ ·- ·:·ν.·::χ :.· -U··· ·· · -A- :':>;<· -á' ·:- - ·. dw-y-í ..i. í-· . V ·;·.; X ími •·:ν·ν·: A ·::ss vtC u vv v·:; :· ç-g::yy\/ç ;:d: ÍXÍí- V ·* >-··:··^ •v .s. TC. A && catalisa a remoção dos restos terminais de ácido a:: Jdaioa: dos grupos glicosilicos pelo que os potenciais receptores da HA são destruídos (Gottschalk, 1957; Burnet Stone, 1947). Considera-se que a NA é essencial na prevenção da aglomeração dos vírus e na eficiente propagação de célula para célula (Colman and Ward, 1985).
Cada molécula de NA iUr^24Q 000) apresenta uma estrutura semelhante a um cogumelo em forma de guarda-soi que ccnsiste em quatro cadeias polípeptídicas idênticas assentes em dois dímeros que se ligam por pontes dissulfureto e que por sua vez se ligam conjuntamente por ligações não covaientes (Bucher and Kilbourne, 1972; Laver and Valentine, 1969; Varghese et al., 1983; Ward et ai., 1983). Diferentemente da HA, a NA ancora-se na membrana lipídica através de uma sequência lipofílica NA-termina: que não sofreu "splicing" (Fields et al., 1983; Block et al., 1982), a suposta "âncora" de membrana. A maior parte da estrutura total projecta-se para fora por cima da membrana e aí forma a área distai da -tiipé Çâ' " .Γ d® caixa 1:1 tt; ditada na -eia ; - e : d sd® Q:í& unia aeaàap tu t ativ X d® "pedúnculo" : "ata): alongado l ?·:·:· -y-' d ··*·· '· x-x.S-;..v.-::.y:.-;.\.· ν’ et ai-, ®a; iUtí: xpaar ci a c apea: ta aada matedtarp: p-a TCÍÃ ·-- d·'- ;·>:·-·': v-··-: .···· ·:·':>">:· >··':·'·· t ::-:-. :-.-:-1-.--. -·,.· Γ - ;S; >' ; y -d >- ·: .··.·-*·:·*; ' )' :>\:íx-.·.8; tíyy.·· 'Γ’: liai '{V'': Ϋ·' t.idO :.'í Γ i,i à ide. iidtsljMd. et :¾ ·:· ;í 1983
X 1982). r;Sv áiKtats, :P~ ' não se demonstrou até hoje » presença de ·;··' v ' " ::: :v: • Λ?··. Uivis?:-í-rote £:0¾¾¾¾ í^;;cí tép Ç00Ótòò-dhiΓΟy ·;. X :>x:>·'· '·; 'pv>í· í:; V ti t;: ttit v;.·: ... Ç; 'i ν;··.;··:: :;·· ’· v·· v ;:··· ;; :hs- :S if; pi· ti ti Client:·: h HA penea-ee que i peie hd,Sth lo i e f eeçi ··;· virai, pre jueamento das fases :íu;.·::a da Γ£.ί.; que se ligam
Pect ra li ieão mediante o bloqueamento das fases iai ·:: 1::.0: da infecção (Hirst, 1942; Kida et a-i., 1983). Normalmente os anticorpos específicos da Po não impedem a infecção inicial de uma célula-alvo (Jahiel and Kilbourne, 1966; Kilbourne et al., 1968; Johanssen et al., 1988) mas sim a propagação do vírus. ' disso, devido sos mecanismos de competição, a resposta imunológica a HA parece estar parcialmente deprimida em beneficio do antigénio HA que ocorre mais frequentemente (Johanssen et al., 1987, Kilbourne, 1976). Como resultado obtido o efeito da imunidade pela NA é geralmente dominado pelos anticorpos neutralizantes da HA. For essa razão os desenhadores de vacinas focaram a sua atenção há muito tempo quase exclusivamente sobre a HA.
Contudo, uma série de observações experimentais indica que a NA é de facto capaz de contribuir com uma parte sígnifí ca t iva no desenvolvimento de imunidade protectora contra a gripe (Schi alman et al., 1968; Johansen and Kilbc-ur ne, 1990; johar.sen et al., 1993) . bstudos fundamentais sobre o potencial oeOsPCplii 1¾¾ da NA necessitam áo ί·-·:: ·:· :: iesaile de eh' icênico muito puros em quantidades .. 1.) .··.' ·>;: t; .<:> i * '.v e .: coe recvs ccoiO :reeiç lo t;í:'kí iioPiê Picou... ktê assra ':S£ p; pç A '·" Ά.ίν h' j· n) ipç·· ; ·.·;·· peo oPiOde com ·: : Ç.·' V:·;:. ÍÁ i , ICO^; C. Si 5 -0 O £: í ;..id:p ve el ivageo oioieeoi íolc g da eplcc !i C :i P t. 0 ΐ 0: i. ti :¾ y et ai., 1966; Rott et geralmente por meio da pronase tP-et-ó al., ' ' n ammomds pmr da NA. Mather 1 loi : v ; r U 0 Ά . ' 26: 127-139} dõs ΑΪ® wrsm a pppr !\ri I,.v----5-- ' ·' em x ; a extensão em células de mím umc-mm '·.<.·. \·-· P-·: Av :A vl il A. i-:- Íiii :s ·λ· %·:·:·.· -> « ·.· ··-« > rtinim ,s lo membrana endógena e não foi precedida par uma sequência sinal, A teiioiia da NA expressa por Mather et al. 1992 associou-se portanto às membranas, mas os autores relataram também nos sobrenadantes das células infectadas uma pequena quantidade de um subproduto da NA de 50kD. No entanto, esse subproduto secundário da NA representa uma mistura indefinida e provavelmente heterogénea de produtos do clivagem imaturos ou não específicos da membrana associada à NA em toda a extensão. Consequentemente, por um lado, Mather et al. não obtiveram espécies moleculares da NA segregáveis bem definidas. Apesar de algum grau de utiiidade, esses métodos apresentam consideráveis limitações no que respeita ao rendimento e pureza. 0 objectivo da presenie invenção é consequentemente apresentar uma neuraminidase recombinante de vírus ínfluenza que possua propriedades antigér.icas correspondentes à neuraminidase natural e se apresente dobrada ("folded") do modo correcto. uma tal neuraminidase recombinante sob uma forma efectivamence isolada pode obter-se de acordo cm a presente invmoçno mmi linmtdm AAtO S™ v··': "o-olç oçl tvpií νρόόηο mmiio lo :Of lO:iaS r*« a-O: ZzmM&Tm&m D CA: &M.& AS Pm *·· ·: v :;b A: ·>· ·:··· SP ΡΡΑοΡΐ vã A ÉiPEiE&oddiiaoo** oaoapdílaonta de acordo com a presente invenção que é segregada na meio de cultura pode utilizar-se por exemplo em estudes fundamentais, e7 que se realiza a snuolnmplc:: separada com NA de modo a determinar o papel da NA em uma vacina. Contudo, na prática a NA recombinante tt 11 iz:aT'nsô:m.i provavelmente ainda em associação com a Et ae modo a aumentar o grau de paat&oipãd (percentagem da população inoculada que é eficazmente protegida cortra moo infecção) e a persistência da protecção (protecçac- contra estirpes epidémicas posteriores).
Mais especialmente a presente invenção apresenta uma neuraminidase NA2 recombinante ae vírus influenza que se pode obter mediante cultura de células hospedeiras em um meio de cultura apropriado e i solamento do produto de expressão neuramin idase a partir do meio de o titam 1 oaa impõe na prática por exemplo que o módulo de expressão recombinante piada-ola o t * soa ad i a a. a ooo; 0 trotada ea um datai v:· è O : : \ : *,s ao ορ,ρο aarvapaa:: or ^ era aos set: ::larivo:iPlí:E SapPaàtaaiaot/e i:a!l:aP'i,am ~aa odiadloã o: .Yp·: oadolraa o- .os-as lava o os recombinante.
w \ "· ·!·* ; n *·* v: c ’·' * x* ;oe, ame o tenter oá mpmBnêií íOnde pados pralsn •som pa :.t o ds r agia,.: o a ··.··: í**s •" .ρ. -ν o as -:nami n.id.s óv ae oas elae:e lalaaa:;:;pa aeaoa : t aplaco tpa -:'v •inr'? do n e:d.: r. OOí romesd 00 .a ;·. ...... -·; ·: >>·:>.>- SOIS; so:sa tsaoo la airípl aliva •o·.".':· *>. -l-dA n: :;i C .idiSmui:;: . :·>; a·· ; ·>· ·· \ ·*·-: v c\È ·: ·· ·> · :···. r ··.·'··..· -.A\:· .:>>· a.avv.c·.; ar aiEpl ® 1 :S a O o a a apoo ·;: v ti u; ' v :-:¾¾ Í.,U.;:. íOp.» . ·:ρκ·. ihãec-t-vSg ρτίϊί^Γ:Ιν®1?^:^'ΐ::.ί; na linha de cd:d l.d : v de rx^outo:? sfiv ísas pfjde οχοΜν: ser em células de levedura sosso :.:-/: :'· '''t/í Χ Οό'.;· ΟΌ X0 ν'-ΧΧ. V < - -·*·- - Λ vvéigxt-ô im diz ui-;.-· ΰxxxhz .·. ·..·.. :i d;Xxbi. li: !:S:·:.xx'.ívi:£'i:': db ae οχ/ r/X-z-bc XX XX:» neuraminidase segregável viro® i n f xvis que come •reendem uma origem de replicação, pelo menos uma parte da região eod:iíbx'x urdo de um gene da de virus influenza menos c ΡΡΐρΐίο que ρκχύί ri-c® a âncora de membrana, uma sequência sinal localizada em 5' na região codificada e a ela acoplada durante o ciclo, um promotor localizado em 5' na sequência sinal e um terminador da transcrição localizado em 3' na região codificante. Mais especialmente a presente invenção apresenta um dmotdr para utilização na expressão de uma neuraminidase NA2 segregável por vírus influenza que consiste em uma origem de replicação, a região codificante de um gene da neuraminidase NA2 de virus influenza da estirpe A/Victoria/3/75 menos a região que codifica a âncora de membrana. rara expressão em células de insecto coloca-se ui tal vector em uma célula juntamente com um bacuiovirus "wild--type" ou seu derivado. Origina-se um bacuiovirus
recombinante devido à ocorrência de uma dupla homóloga, em que se Introduz os z .. de expressão de acordo com o vector no genoma virai. Clúnsf;;.dúà a purificação da placa obbévrv/ã uma resiurva dArtxvdri de baeuldvrrbíS reccmbmantes que se ρο-Ρ-χϊ·':. utvorvso;;· para xx.íb-ur.at por exexpl-e eblalve sf9. . :¾ pop mmém
(U de eoXd em 3 de w o p.adí.; 711« i,í ífep bMbbbíO em 3 de U":·*·; v*.. í: b M bc Lebsrídvõriiir:: ’Β B; se: ddí.: sssIMsi Bi ι,ΐΐ:pis- i-d CfíU? ÍÍBídv;: 3 1.,.1,. 1: ÀBpiiseds StlSÕ-t 3 , B--lsOs ídlvBid-B-Uí-Bo r - o ϊβββββ o de λ miBSãG vi·:·:: íSigi-si SB LBBB 2 976, ® utíll íviSdiO BB::. tlillii í:2 ;i;'2i-l ::ϊ ;3 ;V íí:·: SS virus, como bob sxsci-niv c 1 ::.:-0-:,: .-.- --,: :: v- -ii í ::: B .V V: íB ;-·<Λ-ρ: ;:'d i‘:* V'%- .·.< -:>· dó;χρ\:·ν::··ν * homóloga, vim· presente j, rvv inpl ·., 0 módulo de expressão do vector, consti tuído pelos sinais de ivgvli-ç i-o da transcrição, cela sequência s.ttsBi e pela região codificante, coloca-se no genoma do vírus.
Em uma outra forma de realização da presente ... , utiliza-se um segundo vector de acordo com a mesma invenção. Um tal vector destina-se à utilização em leveduras e compreende por exemplo uma origem de replicação, a região codificante de um gene da neuraminidase NA2 de vírus influenza estirpe A/Victoria/3/~75 menos as regiões que codificam respectivamente a âncora de membrana e a parte do pedúnculo ("stalk") de uma sequência sinal localizada em 5' na região codificada e aí acoplada no ciclo, um promotor Localizado em 5' na sequência sinal e um terminador de transcrição localizado em 3' na região codificante.
As sequências, promotora e terminadora, são preferivelmente homólogas e originam-se na Levedura metilotrófica ri chia pastoris, como sequências do gene álcool oxídase I. Ά sequência sinal é por exeipis o sinal dis i.d;, ».·:>·> ··’·.”:· ·:· '· · · ,>V>\ ei:>· g, v',nW',v;..P :d -u V i. O vi ÍM ·:ό·ίϊ.Ι:.;ό;ίί:ί íd;: £ :L .-
Ghent í η·: 'vio;·, i-cdl CGXIi O de admissão do
NA2. Consequentemente a presente invenção f. .:-..t tr-, diz respeito a uma vacina contra a gripe ("anti-influenza") na qual se inclui a neuraminidase recombinante.
Além disso a presente invenção ainda diz respeito a um método de fabrico de neuraminidase recombinante e a un método de purificação da mesma. A sigla "NAs" referida nas presentes memória descritiva e reivindicações significa neuraminidase (recombinante) segregável. A sigla "pNA" refere-se a neuraminidase natural tratada com pronase. "NA" significa neuraminidase. A presente invenção será esclarecida com maior detalhe em referência aos exemplos descritos seguidamente na presente memória descritiva os quais têm apenas por objectivo fins explicativos e não implicam qualquer limitação no âmbito da me sma invenção. .EXESS&O 1 FPEiFiaç» % -pá- «patroa» Mm %MQmmxwmm m vté&$ limem
Materiais e métodos 1. Construção de um gene que codifica uma neuraminidase que é segregada e a sua integração em um sistema de expressão de baculovírus a. Plasmídeos 0 plasmídeo \ . ' é un derivado de pBR322 que contém U;":*: cópia de un gene de neuraminidase de vírus influenza A/Victoria/3/75(FBX2) (Van Rompuy et ai., 1982). pSV51 e ambos pSV23m e pSV24m são respectivamente os vectores de substituição último e inicial de SV40 e estão descritos an outros locais (Huylebroeck et al., 1988). pSRS-8 è um plasmídeo baseado em pPLa2311 que contém a sequência inicial de um gene da « ' :' a (HA) do tipo A/Victoria/3/75 (H3N2) (Huylebroeck et al., 1988). 0 vector transportador pVL941 de baculovírus foi desenhado por Luckow e Summers (1989) . b. Subclonagem da sequência peptídica sinal HA (prv-preHA)_
:O.·· do pt ΟΟΟΡ CÁO di f ío» itdtnt. «s â idi «ot ís a ra.. ao partiM.;. rao poaidana iíodidS:.;·: áB BA. pioaapa.·* c. Construção de uma sequência quimérica que codifica NA que pode ser segregada: pATIVNAs. ata ί pV€/Í i toa ratl e í't tct· :---0-7 com atónita l.aaaa
Ba/31. Ά essa mistura ligaram-se Ixgantes Hindlll, seguida por CÁ... oo.-io.oa com Hindlll. Seleccionou-se um fragmento de NA de 1 500 bp e clonou-se no único sitio de restrição Hindlll de pSV23m .· (poVÁÁciCiitMAJ . Flasmídeos com o "insert" virado para a esquerda digeriram-se subsequentemente com Fnudll en Sall e recuperou-se o fragmento 1291 bp que continha um gene de NA menos a sequência âncora membranar. incubou-se posteriormente plVpreHA com pstl e Pvull e reteve--se o fragmento 661 bp com a sequência sinal da NA. Finalmente fundiram-se ambos os fragmentos por ligação cega ("blunt") de Pvull-Fnudll e inseriram—se no fragmento 2253 bp Sall/Pstl de pAT153, originando pATIVNAs. Esse plasmídeo transporta a sequência que codifica o péptido sinal da HA incluindo os primeircs poucos aminoácidcs da HA madura, seguida imediatamente pela sequência sem o péptido sinai/âncora de membrana da NA e por uma parte da região que codifica o pedúnculo ("stalk"). Ά ligação dos fragmentos da HA e da IA resulta em uma hs-irt substituição de um ammoacido (Gly por Ala), que corresponde â posição 5 da HA madura. Com ba-aa oa loPooiodp&a puç:-,.kic:hd:i cot bbr-ô Cao at: -si.. > cisão;: a vao b;-.:tcp.iV et al., (1982), apresentam-se na fig. 2. as epupoela* Pt cm atoa da tiDd a dat aoaoaaoeidaa PdgttPcidPt ao sitio da· á.Ágaçla nas NAs. d. Integração de HAs em im vector transportador de baculovírus. '·ΰ' :·:· :..· ·*.\ϊϊ:><·3··· ί:ζΆψ^πί:ό 1¾¾) PnrÃU,:rt.h:« i de de fr&gfténid t:.Qd:iíi!,d:d nota poli-hedrina, permite --tfpe" após descendentes purificação Smith (1987).
Vtc Ii€ã t: Xrm:nn.)Ί d* p«TiVS.âs ar ) „ ' „ ao fragmento 62 4 bp plVidt;!:, Posteriormente inseriram-se una ebpis 1647 bp PamSX que ePtiam um gare de NAs c o da dVAQ no ur':Ièr sítio de restrição de sAAMii da orientação relativa ao promotor resultando em piei i Vide, Essa rónatrtçiís recombinação homóloga ss ADN de AcNPV -'diM- cotransrecção de células Sf 9. Isolaram-se recombínantes de vírus por técnicas de em placa como descrito per Summers and 2. Cultura de células de insecto - produção de NAs
Tendo em vista â cultura regular conservaram-se células de insecto Sf9 como monocamadas celulares confluentes em meio TC100 com 10% de scro fetai de vitela e 50 pg/M de gentamicina. Para a ínfecção com o baculovírus recombinante transferiram-se as culturas para suspensões de 200 ml o desenvolvendo-se em frascos cilíndricos de 850 cm (25 rpm). Infecoaram-se seguidamente as células em suspensão no final da sua fase (2x106 células /ml) com datiulotiirus :í:^Pí:::'nfc.i.n.d:hfíí sjs uma 1GI (:^uliiplicdà:s<is de ínfecção", Irto â .et dt ta V. Ί e a.) Peeis:::' : m; i.è . ·1Χ t 111· dl PPl :·.:··, :· marre: Puis diiea; tfís A mio. ler·:'.:·; . % .l, 0 . Λ c.l; ; 1111 Λ Λ x, l;-':v a'·'!; 2. \À ,'.ηΐι 1;- ; ; λ ui v.i u fa\A:1; Si.lfl: 1..
Purificaram-se aa St; rta:Ps 3. Cultura de vírus influenza X-47 x estirpe X-47 de utlii cdu-Ad momo funtu vara s pt^p&tMÇBQ ds \.i n-atucai de &/vaõt:oç:1:ã::0/7 5 após atatateesta com íe^mííiS, a vUucís .t~uv’ assa.ρ5.-..P·.voo-ou na cavidade do saco vitelínico de ovos de delmdo contendo um xmbztiú com 11 dias. Após dois dias de incubação à temperatura de 25,5 °C arrefeceram-se os ovos durante a noite à temperatura de 4 a! e cclheu-se o fluido do tato vitelínico para processamento posterior. 4. Sistemas tampão
Habitualmente utilizaram-se os tampões seguintes: tampão A: 20 tè! de dietanolaraina/HCl pH 8,5; tampão B: 50 de NaAc, pH 5,5; tampãc C: 10 mM de NaP, pH 7,4, 150 mM de NaCl;
Os tampões A e C contêm alem disso 4% de buimròl (excepto se indicado de outro 'i j e 2 mM de CaCi?. 5. Purificação de NAs a. Fraccionamento com sulfato de amónio.
IvSí-Ó íí nm ;d J. - f! il< 1 T ;í;:i-v'1 AuA :j. .d 70:0-0707· PfiXtViiiulíí çítm&iz&nt® m ; --v · ΧίΟνχ: ·.. 1 iiflCi b« Afc ^dx:': c:tx; íxtl>d:ili.;:t:'.:n :f;· i::: y. y. ·;: 7. V 7. U 0 7:77'- a t .···:··.·* Λ·' ··ν .·χ :χ.-.····;'·:·· ;···: ·χ· .···:·.·:>·.'! .· ·:-y %···: :·. .·:· -xwxx·" d· ... ·.>. ;íy .>·.·..· «v. ϊ*: Γ - í :v x·' S :·“:· & ·..· ... >.·.-·ν·.li· •1 fKlyUU CÚlUíiOVfi 1U U'i y: S. - O Oy f 7 t tStígÚ * ··. ·:·:· ·?···:·:··!·.:·:···>'· ·:·η x ύ x\ ο-νοΟ·:·: sy-χ.χ ··.· -x-. x··-..:·:- ·-:··· ·-·:-· :· p:: ui tzãlimtmz t 7 . «iiít |:utLdui:Viiip ttdud ·*'··:>·· *' '·· xx::;: ννχ-χό ··.·:···.·; X-· ·:·χ.χ. ·.·.· o x- '.χ..·χχ·.;;...ν-:'..,· :: ··: ϊχ:·ίχϊίΐ xz u dr ss àú~ Éçlxxãês o úê HoK:-.. xw v,.:.. ·· .;:y>-':.v. x'· .·.-·... ·.·. ... ·. .· :u ;; ;···: : > ’ ' Ç 7 .· v 0 .1 1::00:: TCi tf 00777 •••xx-x ·:·> '??:·.:-x :· ·: x .·'·· ·:·>. ·>··:·.·:·.·: '.d: ··;;· · · ::-'.·:::·χ:>:· :· : .·:·. ··.·:· :·>· ·:
'· (i O 6 7; ι 1 ? 6 0 lliaa 111: 201 '1 7:::.:-¾ 1! :11:¾¾¾ S::::>l:.·::} Θ1:1: :y + 20 kOí de ídail ss 1.1a 60 ο 11 k/ll do -:70.:.1.1¾¾ :::.:1.:::.1:110.., O prôditu 1::11:1:1,11.1:111¾¾ iil-aiilad di a-drti (iil -:::-1:7: 'i ] : 2 5 kd} 1:-:7 iiii.!:®! ii i:i:ii;i iiíSpal íd.:!::·;:: iii 24 horas, tendo-se alterado 1 tampão tiêi vezes sucessivas. Eliminaram-se os componentes :11,::0::::-1:101:::1:11 00-:,.0 ::::1:1-0:::-.:.1-100:::10:0 20 OOGxç durante 15 minutos. b. Crornatografia de troca anióniea em Q-Sepharose
Primeiramente suplementou-se a solução submetida a diálise até 4% de butanci e colocou-se depois em uma coluna de Q-Sepharose plpSoolO cm) que se equilibrou com tampão A + 20 oin de NaCl a uma velocidade dos fluxos superficiais de 25 ml/hora. JI061 lavagem da coluna com o mesmo tampão realizou-se a eluição com um gradiente de concentração linear de NaCl em xis tampão de lavagem a 250 mM (250 ml; 25 ml/hora) . Identificaram-se as fracções correspondentes a cada 2,5 ml que contêm NAs mediante avaliação da actividade enzimática e das concentrações por ELISA. A partir da coluna obteve-se por eluição a actividade da NA sob a forma de um único pico. e. Crornatografia de afinidade em ácido oxâmico-agarose A uiiliiiplo dessa matriz de afinidade estã di:.si:r.lt:l •V. Λ···.·; ·; ;-> d d-6 .-1::.: .···· :i .-· •c- ma -1- ,x· :·» :v ··.·>. ·.,·· ii : di vírus :. 1:. i: uili : · . ,, 1.: ti de m niiieiii.11 dl-iii.iiiiill and 1971; 71:1:1--:·,. ' ; ] 1 1111 -mi correcto la : iis 1/.1::111(¾01 ui. : ic-a 1? iid í l l l v 1 111 11. :::::11:.1: recomendadas do reagente l-ssapSo,
Colherara-se as activas após a separação da Q- ''':Ιί·5ΐ&:Ί·:?;.Γί:ΐ«·ίί; e s:s me®®®:» cm vcdcics ipiai de 200 rh; cc UcAc pH 5,S. F*ste:PÍ*ríSè.Pt:í:i hpl.0hepsgp;-sp as f t&pçpéc:; iidhj/rag ppore uma colutis de iochic: N- íig-va.ígirmfépil; sueiíp4cí>·· -agarose {£·* 5x5 cm) equilibrada em tampão B, 100 mM de NaCi. Posteriormente lavou-se a DOlodo asm o t _ , - izado rs equilíbrio e desíonizou-se ("was desalted") com tampão B.
Seguidamente realizou-se uma segunda fase de lavagem com templo A. Utilizando o tampão A suplementado com 1M de NaCi a uma velocidade do fluxo de 10 ml/hora eluíram-se finalmente as NAs (cclneiam-se fraeções de 2 ml). d. Cromatografia por filtração em çele Superdex 200
Utilizando concentradores Centriprep™ concentrou-se o eluato da coluna de afinidade ate 2,0 ml (Amicon; mwco: 30 kd). Cromatografou-se seguidamente o concentrado em fraeções de 1,0 ml de volume da amostra em uma coluna para filtração em gele Superdex 200 (1,5 cm x 60 cm), que se equilibrou em tampão C com 4% de butanol. Eluíu-se a colono, tifllisthdo o tampão de equilíbrio a uma velocidade do fluxo de 10 ml/hora e cclheram-se fraeções de i.O ml. Para armazenagem a longo prazo à temperatura ae 20 *o recolheram-se as fraeções semelhantes, concentraram-se, como descrito antes, e $ PP 1 omo 11 # t am ^ ti go i i o r to f tllit t A t tis glicerol até uma concentração final de 59%.
A de determinar c peso molecular das proteínas
0:0.0® COP iProp'"'on n o-00/0.00 ooo;:/® fi.it toe d/dp y χλ vò / y/h·: (443 kd) v. .:¾ /.:¾ · r i-ir .‘Ϊ; ·( .·; %' g;
6. Preparação e purificação de pNA a. Tratamento com pronase
Inicialmente purificou-se por centrifugação a uma velocidade baixa UOdííiv'».· 10 minutos;; o fluído abuiullclvo do ovos de galinha iofdíliiuiot com X-47 e submeteu~se depois a centrifugação a ISOOOxg durante i6 horas tende em vista a precipitação do vírus. Suspendeu-se novamente o precipitado virai em 10 ml ae tampão C por equivalente de 100 ovos infectados e adicionou-se prcnase at-é 2 mg/ml sem qualquer purificação posterior do vírus. Incubou-se a mistura durante 16 horas à temperatura de 20 "C ao mesmo tempo que se agitava suavemente a mão. Posteriormente eliminaram-se núcleos virais e componentes insolúveis da pronase por ultracentrifugação (100 COO x g, 1 hora) a temperatura de 4 °C. Seguidamente purificou-se por cromatografia em coluna o sobrenadante contendo as "cabeças" (heads) libertadas das NAs. b. Cromatografia de troca catiónica em S-Sepharose
As Gèçviuèsi cromatogràfiças realizaram-se à temperatura 4 °C. â v:!u;;-;:PUua ííã pNA Ututu dllMú-m-s uiUCU vr: S. íítímcuu-u-e retornar utá 50 rim « ;c;;pH 5,5, 2 ssíd d.v dbCíu * de but.uno:! o u .V. .··.· :-A :.p ΙΑχΐχΡ cl,® s lulupio Hubro uniu uud ·;Ι· ;γ··3· ú; .. liu:·· iç h;ui · ’·; 1ΐχ':*·ν V · r* ~ que -.-: psMIibuííd com tampa :>·· f \. .·>'.!·; ·:-·.·?- *>' ·; ·: SS ::/?·: Ci-í dú.qj fj ' . y; / :/ i »'<->&· q T:d .1*· mv-y-iu:; m U.lg :í;udíu mUd λ.:?·i'5uu rnvpy' í pç ,·-··· :¾ /ç : um yUpuiuçç^u 1: :yvj rd v: 500 W;.Ç de cr Cl no íssdpduv Coiheram-se as ftadCuriu íí uvicí ai •sud ivi sudu·;· e concentraram-se até ΰ ml em tubos concentradores Çitltrl íMidbí··; stíot: 30 Xil: d. Cromatografia por filtração gele Superdex 200
FllrraçlO' cm oul·:?: soldui ftcçá"iex 200 reaiizou-se de modo semelhante da pm:i í imç&P das Mão (excepto que a em KHVtaubi foi 1%) . A pfk pura armazenou-se à temperatura de -20 *C em glicerol a 50%.
7. Doseamento enzimático da NA A determinação da actividade catalítica da NA baseou-se no método de Potier et al., (1979). Resumidamente, realizaram-se ensaios enzimáticos em um volume reaccional de 100 μΐ com 200 md) de NaAc pH 6,5, 2 mM de C;c€X* e 1% de butanoi na presença de 1 de ácido 2'-(4-metilumbeliferil)--α-D-N-acetilneuramínico como substrato. Concluída a incubação à temperatura de 37 í;C durante 30 a 60 minutos interrompeu-se a reacção mediante a adição de 0,5 ml de 133 mM de glicína, 83 mM de 60 mM de NaCl pH 10,7.
Mediante a leitura da absorção a 365 nm determinou-se 4-me-tilumbeliferona livre. Definiu-se uma unidade como a quantidade de enzima que Libertou uma nmole de 4-metilambeli-ferona por minuto. 8. Técnicas imunológicas
a. Preparação de IgG policlonal anti-pNA 'jq;·’:; 'C vv ç :·ρ::ò' ç'v.;:':· 'tçfçvl;':; q ué : ::: pp··: o ή- :·ν;ν: u 53 de 500 wS-Ísí.:; p-iS.viS 222.222 22 2:22-02:5:22:: 22 22: í.22.2is 2 *22: 22 22:::2 2:222 de dQO ;.'íΟ.Γ;.’:V-T;.'.íC? pg ;::5·: pbb2/:2k22í22 ·.. 75% c!acap-iato ò« Ííieundeo 5«i,i semanas maís tarde adminístrcu-se an animal em aíibsm: as patas tr daunimins dóis teiiai-dvt tanecsaaets r ~ » fcsara a pz^p&r&çãc ;:s;s: da Içd sã-rit:i.^£=-¾ ·:? so-rD smiiidt por ΰ-'η^ηϊ^η-ίίή sobre Proteína b Sepharose í-S^isTCdbiB MB1 .
b. ELISA btvtstsibitt-bd 2.2 vida dct de una placa de mícrotitulação com IgG de coelho anti-pNA. Diluíram-se as amostras para ensaio em PBS com 1% de albumina sérica bovina. Detectou-se antigénio ligado com IgG de coelho anti-pNA biocinilada acompanhada pelo conjugado estreptavidina-fosfatase alcalina (Boehringer). Desenvolveu-se a reacção enzimática mediante incubação das placas cem p-nitrofenilfosfato (Sigma Chemical Co). Quantificaram-se os valores de absorção a 405 nm em um leitor de placas de mícrotitulação. 9. Métodos analíticos A técnica d.e SDS/PAGE realizou-se de acordo com o método de Lâ2vM2l.i (1970) sobre gele de separação a 10% (excepto se indicado de outro modo). Desnaturaram-se todas as amostras na presença de β-mercaptoetanol, excepto se indicado de outro modo. Como proteínas marcadoras utilizaram-se em 10% de geles o (94 kd), ãlbiiminb sética bovinsí (67 kd), (43 kd) , bhldrbã-s Cârbòbioa Q3 kd) e iríibd.slat da i.ticdibd (20,1 kd, e dbcctc : Dhdrdddid LKBd
FiiidrMbvsB pmmt aeles em com as rtírns 122toas medidas de :22 2522500 miosína (22 Mj f 2---222::05225522:::22:225.:2222- Π'Μ A-d2 , 222222· 22 2 22:12,2:22 2 , A CbiB^idM bíblãi 222 2::22:12:2: 2:22 22 2.2: 222:2:2-----.:2:2: Sobre geles :Λ '. .! .ϊ :Λ· ’Υ' :.;Υ:Υ: : ::S ’.· . Υ Υ Υ;':-'V :'Υ:: Υ: Υ: .·. :. .γ: ί 1981 j . Ã θθ ρίΟΡΟΡΟΟ dè.tSs::rí:.Íí:'Í.íí^-:S:íi peio mátttdo de Bradford (1976) com ie galinha ηο'οο padrão. 10. Análise de ligação cruzada A molécula l;: ligação οοόγοοίίο B-S": preparou-se na ocasião sob a forma de unos solução 1,0 H em 10 mM de Mepes, pH 7,4. Ligaram-se as proteínas em rede ("Oross-linked") mediante a adição de BS3 até uma concentração de 0,5 mM em um vodome reaccional de 30 μΐ. h incubação realizou-se durante i hora a temperatura ambiente. Posteriormente interrompeu-se a reacção com 5 μΐ de Tris 1,0 , pH 8,0. Utilizando a técnica de SDS/PAGE analisaram-se modelos de polipéptidos. 11. Análise dos hidratos de carbono em
Desnaturaiam-se amostras de proteínas (entre 0,1 gg e 1 pg) mediante fervura em 500 iM de Trís/HCl pH 8,0, 0pS% de SDS, 50 mM de β-mercaptoetanol. Concluída a adição de NA-octílglucosido ate uma concentração de 2,51 que resulta em pelo menos um excesso sete vezes superior à concentração final de SDÇ, adicionou-se NA-glicanase (aproximadamente Çpt ucidades; unidades de acordo com o fabricante) e incubou-se a mistura reaccional durante 16 horas à temperatura de 37 °C. Analisaram-se os modelos de digestão a partir da SDS/PAGE.
Resultados
1. Purificação da pNA CKO:Oí::;l.éí:C::o.s 0000 ytOT' usf: fO-S ΐ o;, o doou o a o •.v >:·:·.·:·ν.· Λ.··:·'· '· .·.·:·:· ·**·:;;:· x>, ·;·>; >· ·· vy c Τ' Ç. ,·νύ·ν d';x: x Çi :C :( ··'·. õ v·· ·χ; ç:;· ·' !'·' odsi do I ó ; 0:00 0 infectados. As diferentes fases de purificação estão quadro 1. Após colheita do fluidd o: £}· £'ν;·£ ·;· ν' .:· '·.''. :¾ TT Q do vírus, : :p:Cá; TCf pronase ·.: s uma concentração de 2 e incubou-se a mistura durante 16 horas à temperatura do 20 °C. Após ultracentrifugação encontrou-se na fracção sobrenadante mais ou menos 60% da actividade de NA, Observou-se que nas referidas condições a perda de actividade se atribuiu principalmente a uma remoção incompleta dts cabeças de Nas das partículas de vírus. Concentrações elevadas de pronase, tempcs de incubação longos ou temperaturas aumentadas não reforça a recuperação porque gradualmente a NA aegradou-se mais (dados não apresentados). Posteriormente diluiu-se o material bruto da pNA e levou-se até pH 5,5. Colocou-se seguidamente sobre um trocador catiónico de S-Sepharose. Para um rendimento máximo de pNA todas as outras soluções continham 1% de butanol. A maior parte da proteína não foi rapidamente retida sobre a coluna de S-Sepharose e após o em gradiente registou-se apenas um único pico a aproximadamente 400 mM de NaCl (não apresentado). Esse material consistia em odo extremamente pura tenda em. vista que não se observaram bandas 3) . Além disso, a coloração oola praia não oootrod de modo
odçum φ.:οο.οοοΓ .•d 'À Tg:· ;'ç;·.>x.;····.:& •V: Γ; Ϊ- cít O •Τχΐ.Υχ ·; X;: X· ; ··. ; V;v. ... .. x <,v ió·,d;..· · ; ο.;;; S - '"O0:000 Οΐ’ΟΟί 0 URlâ Λ fl '1 ddoooo ·:- -vi-i ·:./ 'TÍ;T ’ i 0 >v.· T í--i* :wOoT:if;i.:ç;T 3 o a 5, T ; ;.im OC peso molecular de ssentado) , que corresponc -g· cii as fases forma de um dupleto de duas bandas, correspondente respectivamente a 5% kd e a 52 kd, em aue a última foi a mais ccmum, conforme deduzido a partir das intensidades relativas da lííiarapái pela prata. Em todas 7s probabilidades esta ambivalência deriva da digestão preferida pela pronase em dois sítios diferentes na região do pedúnculo ("stalk region"). A liqúípld cruzada com o agente químico 11 confirmou que se recuperou a pNA como uma autêntica proteína tetramérica (fig. 3B). 2. Construção e expressão de NAs
Separou-se un gene de NA de vírus infiuenza estirpe NA2 da sua âncora de membrana da NA terminal e pelo contrário acoplou-se a sequência 5' de un gene de HA de h/Vicimia/1/75 que contem un sítio de splicing de un peptido de sinal. A presente invenção tornou possível a síntese de un produto solúvel segregado. 0 gene quimérico resultante ccnsiste on uma sequência de sinal da HA incluindo os codões dos primeiros 4 „·... .:----i x terminais da HA madura, seguida imediatamente pela sequência da NA sem a parte transmembranar iMaljícácid:::;;·; I a 45). fess as sequências de ADN se localizam no mesmo ggairo de leitura ("readrng frame") nãc se ieltez iilrabaii úi &ftám3à£iM£ã extra. A ligação g o paiol: r / - n* r í Algo 2) . 11:0:-: cópia dessa s.00:::1111 § quimérica, 1::¢:::1 llllll lia::a i oiif ;r:ia rgr:r:s pz cr: rd η η qua pobd íí>s&gg:íífSi4c!í foi iívt&ipz&ási atrás de um or o m:;Zéd a pez X .·, Άζ od r iz:; -a d e s i d úl ú Air d o Αν: b Pi utilizando de PPiiilns actívidade pPLMi CCOIZO ¥ú£:::0tu: de tz&éPpúZpê·* PPÓA íiAZPPd d:U '1 :Í5 Po tp PÊ 9 ílut a 0:pdu-· né ;·:" pi;dSSZPZÍb; P no Pd: fts. qp.,. o ρζζρ PvddPzs: p;pp na zdztzPpPs ra i solúvel. PP: fíg. 4 pode observar-se ípd a actívidade das NAs no ppip Ptlriyit um nível de patamar mais sm menos 48 horas após a infecção. Uma incubação adicional nãc foi vantajosa porque a p:::pu"p:pi:r;:tçup total de proteína começou a diminuir dramaticamente, provavelmente devido ê considerável líse celular. Observou-se que a expressão pareceu ser mais importante quando a passagem intermédia entre a monocamada precursora de Sf9 e a avultada cultura da suspensão permaneceu limitada a um mínimo (dados não apresentados), Com base em diversas experiências de purificação averiguou-se que as bAP se expressaram em níveis variados desde 6 a 8 mg/I, uma capacidade de produção razoavelmente baixa, mas ainda, compara-el com rendimentos relatados para outras glicoproteínas em complexo produzidas nesse sistema (Jarvis et ai., 1990). 3. Purificação das NAs
Ontrimpu e oito horas após a infecção procedeu-se a oolhoits no sseio ΙοΙΟίΑ ροαρροο que a zrít iddddds enzimática específica do teor em proteína solúvel atingiu um pico ífíg. 4) . As áifases e a das NAs eotã-;; rd^Pbiidzoí no quadro 1. A precipitação pelo sulfato de PidiPic: no optio orato ezddn ss adtz:; psclpi do 201 a 601
b iáO bdv v uçmççddí vu:;; produtos ;;V;uv::dbvçi.s no.. r:· orou---:0 butuddOL tdé uvv concentração ó« 4%. dddsrr00---00: :¾¾¾ ,·> χοίρον de ddtiUrdl çvvmuuu ou efeito xu:: nu;. ,νοο;.rdKouíúáuel sobro ,5: çot'teço da massa das 1¾ rapesialKíítKt-e em çiteçed-eè do bppvmv concentrações de eoooçlççç,. Para evitar a faraâi de agregados iouttiiwis: e possível quo fosse nòupopâvbr; v®: ii-t οχ ον! Γ,ηαο qrpn de n i;õl:vb: cidade dm raeio. â soleçlid consistiu no f rçoc:d.fmçtiÇdd:o; posterior qpr cromatograf ia de PrOou oniédlvç ov 'd-nopt:' ;rr<:: (fíg.5). i\ ore X. vi dá do do to eluiu-se no início do gradiente salino sob a forma de um pico razoavelmente simétrico. De acordo com um ensaio Elbldb as fraeções restantes não continham material relacionado com c NA. Nessa fase extraiu-se mais ou menos 97,5% da quantidade inicial de proteína, originando um aumento da actividade especifica utilizando um factor de aproximadamente 20. Seguidamente reduziu-se o pH da solução até 5,5 pelo carregamento de uma coluna de ácido N-(p-aminofenil)oxâmico--agarose. Sabe-se de estudos anteriores que nas NAs os ácidos oxâmicos substituídos são fortes inibidores reversíveis da NA de vírus influenza (Edmond et al., 1966). A utilização de ácido N-(p-aminofenil)oxâmico-agarose como absorvente selectivo da neuraminiaase de vírus influenza ou de bactérias foi primeiramente demonstrado por Cuatrecasas e Illiano (1971) e mais tarde por 3ucher (1377). De acordo com a técnica original eluiu-se a neuraminídase com um tampão de elevado pH çdaiiCdd IDO mi 4, pH 9,1). Na nossa experiência contudo essas condições permitem apenas uma parcial « lenta p;!t::>v;l;viiv dv bud> Dvsviçâu ti incir ·"&#·£ dpopqç dÇbVdbPqodo um pH aumentado ou®: osa ç]n-v^s.d,& qbçççp ttvçáv Vi; 1 l.m... DbbXV S VV ípl iptqdP Portoto-bõ d;Ç cC;b:uno mm ΟΐϊΜ\Ζ':Ldddh vd;r;«;Lda:a::^i;V'a;..i. q* uma o víuvoí ;pç especif icamente ligada realizando u?:® tvvv de Isvvppv dálvDdoivs 1 u pH OpO na νοννννκρ;: de umu baixa concentração salina. rXvdívtixidP & :<·< <v v v *·.*:*' ’ u tutugio tarteu -ae paeaius T s utuu'.;' 'FU', sa 1 Paul:;:- SUS puuvuipudlsclçf. Te a siso -reFe ;" u ' - : - de :Ç5' :i eeTepçTda íie use: utT.ssse de dl e ate te.tf. e: pte ·:· - ·.· ·. séTé ê® ''·>·.··· Ta'" íCdesas S a as.:.? idas T Ton·' e ITT : - |)d.v ύρρ. tigse-u mm~ mm asa toe eses· .ee gseasa r ΐ’ί'Τύ T OK- : >;· 00: T ÍíS SíST Ú.SSS: :ΟθΤ A 0.ji> de elimiser vestlsies ta esuf assaatf όϊ5 ; -"ú; d;·®..Lu ccr;cen£;:ríitso eluato por ultracentrifugação e submeteu-se a filtração em gele deper-Tas: 20C (fig. 6) . A verificação a A2so produziu fr#s picos com desigual absorção que eluiram respectivamente a aproximadamente 220 ka, aproximadamente 130 kd e aproximadamente 54 kd. Os modelos de imunorreactividade do eluato avaliados por ELISA observaram-se serem uma representação fiel do perfil a Aék para eaaa um dos três picos registados, o que sugere que todo o material era especifico das NAs. A análise por SDS/PAGE das fracções de valor mais elevado ("peak") mostrou uma banda intensa na região expectável de aproximadamente 55 kd, embora se observasse uma pequena redução no peso moleeular de um número crescente de fracções (fig. 7A) . C pico de 220 kd identificou-se como NAs tetraméricas por análise de ligação cruzada com Ba% enquanto os dois picos que resultaram de uma menor dimensão molecular observaram-se serem respectivamente NAs diméricas e monoméricas, sendo a última forma ém limitado sigtòldutisdt; quantitativo (fig. 7B) . Pensa-se que devido à sua estrutura em forma de ;sfJo {"rod-like rou·.aas NAs '·> X .·>% :;..;·νν v.·,··. v· . .·. ... ; V;t ;·; ;v ··
St SSo psçs B. actuai em conparaçao com as NAs e monomêricas, tuu susis se - digno só fel ene a setis:ia.Jo» eaeslltisa axigio uma: ®:So. rat estrnmética de d lo teta.lLaaePs e.fst;tb.t.ad;a. d o::ss-b], sus a tetraméríca induza algumas alterações de locais que são essenciais para a actividade enzimâtica. lis sussrs l apresenta-se a diagrama de tlmm do processe ;.·.·! ·. .· , .v, .·!·. . va \v va !·.-.· i 4 . Propriedades das NAs A desnaturação mediante ebulição com SDS na presença ss β-mercaptoetanol induziu a áissatèiâçâG total de lAs em cadeias monoméricas com um peso molecular de 55 kd 7A) .
Considerando a scõsíxsçííõ pela prata dos geles de SDS/PAGE observaram-se as NAs tetraméricas e diméricas homogeneamente purificadas. As NAs monoméricas apresentaram-se com uma qualidade ligeiramente menor tendo em vista que eram visíveis alguns vestígios de contaminantes. Quando foram desnaturadas na ausência de um agente redutor, as S:s tetraméricas e diméricas migraram como cadeias diméricas de aproximadamente 110 kd (não apresentado). Esses resultados indicaram que os dímeros de NAs estão na verdade ligados internamente por pontes dissulfureto e podem ainda associar-se através de interacções não covalentes, por meio das quais se forma uma proteína tetraméríca que corresponde s organização estrutural de NA natural.
Tem sido repetidamente relatado que as células de insecto ssxssí um modelo de glicosilação de NA que difere q-cÃçto ao âmbito dos xr calço 1·:χχχ pelos mamíferos e por outras siõ: :·; *; Í:íí-®y Π-:ηί:: À:’:h: .1; A: qò b ÚV^· 3.Ώ.0
Hughes, 1181.; BS:tt.SXh >st hl, 1981; lureis st > 1 allj ,
í'SS?': vffiíOXSX:C SSíSíCXX' lS S S S 8 1 v SSS V S;S O CSii XX XS X 8<! OSSO riSiX
S:S recombinantes.
ivusί
com * ttUU :0:0: mu ,. 'S® gjstsj' atilicísíídíi i¥±.a.< 9) < $ :pdo ctíFlbluir-se que u φ^ΜίΖΐάκάκ tobsisa .0:1/ j';!i :11,11 :11 hl 171 n 1,1.1 ,;í :'ηΐί.ΐΐΐ : itPbbíí a associada s: ϊ:*'ΆΒηΧ.·& çcosídsrs o fig. 9A ® a 9B) , uma observação que corresponde b realizada tendo em tisr.ís outras glicoproteinas que se exprimem nesse sistema (Kuroda et al., 1986; Domingo and Trowbridge, 1988; van Drunen et al., 1991}. Também se estabeleceu ainda que as formas das has desnaturadas, enzimaticamente desçlicosiladas migram com a mesma mobilidade electroforética sem restrição da sua estrutura cligomérica original, que confirma que primeiro se sintetizaram as dibi sob a forma de um polípéptido com um comprimento de cadeia uniforme (Fig. 9B, compara colunas 3, 5 e 9) . 0 peso molecular aa cadeia polipeptídica tratada com glicanase de NA avaliou-se em 47,5 kd, que corresponde a massa teórica de 47,717 a como calculado a partir da sequência prevista de aminoácidos. Suficientemente interessãnte, o grau de glicosilação da NA parece estar ligado a capacidade de formar tetrâmeros, tendo em vista que as bandas correspondem a NAs diméricas e moncméricas glicosíladas deslocadas ligeiramente mais rapidamente no geie do que a banda derivada das «At tetraméricas glicosíladas (Fig. 9B, colunas 4 e 6 quando opostas à coluna 2; mr também fig. 7A). Na verdade sido sugerido que o hidrato de cázfecmo ligado h NA, mais esBecíalmente a cadeia de um oligossacarido que se liga a km2Qlf pode exercer una tançlo na estabilização da estrutura tetramérica mediante acesso a uma ioteraiigrp com uma SUbtMdsdlí a:Ílãtoi:t,S li;grgStu.::t ò:t al. , 11:11; lltrgbubb 0 1991).
Apenas a ata tetramérica oc; Pa albarda psro as propriedades aça das d.ba.. ! ·': .:· filó aaapaaaniaaçoo i :;:.Ç iÇdlo:;: ÇÇi D.1 ÇÇÇ: CA ospçc:b:ii;c bõ aaoboldialç Õ&ççç idinÁ.ico só da pPP CU; rljll acuai dl a adros I o P; . A abpárdApÕO as loa ΐΐίίί,ϊί Pua;. PM·! COO OdO aio poíbaol-a eaccaataçal ç ·1·'·::. ν'··'1' l p:'.¾ OdD o ponto de a ' J.. t.·. :i; ; scaiMçiçPí ainda monómero tenha uma cavidade catalítica, possivelmente reflecte um papel ' - relativamente às ínteracções
funcionalidade da NA de v i r íçtcaçóÇiA A fim de verificar as propriedades antigénicas das NAS, diluiram-se duas vezes consecutivamente amostras de proteínas de concentrações iguais e ensaiaram-se utilizando uma técnica de ELISA em sanduíche baseada na IgG anti-pNA policlonal (Fig. 10). As NAs tetraméricas forneceram uma curva de titulação que se dispõe de um modo idêntico ao gráfico de referência da pNA, o que indica que ambcs possuem propriedades antigénicas idênticcs ou muito similares. Apesar da ausência de actividade enzimática demonstrável, a actividade antigénica das NAs dimérícas e monoméricas permaneceu realmente intacta, embora se possa observar uma pequena modificação ("shirt") na antigenicidade. Essa pequena diferença na antigenicidade foi igualmente evidente no perfil de filtraçao em gele (Fig. 6) em que a razão actividade mtlçznim/hm do pico tetraméríco foi ligeiramente superior. ê possível que uma série de de anticorpos geradas a estrutura tetramérica nativa não fossem capazes de se ligarem eficientemente a :¾¾¾ caçaM CíKans de um modo oTp ·-··::, por exemplo as que çác;mp.çççç: áreas de contacto ·. ::···' „ , dá nvar·' oca paio i 0 ::1:::: t Mas pç ·:, õíbçi:nçx usa série ·.:·:· : -¾ .···: i‘ ír c.y .x.
Discussão 0 principal áaçaaat.láa da presente foi a itàriata do aaafgénia Pi;:í:.iP:3^ir;si'd'3S'é áé affaaa la.i\U::aaaa soo s fornir ta títa atafalan í.a};<$ aAtatiá> tfiãí:sai á&atã 0: áãftaala ( "f tÍ<ird?’;; , * unn amante com o estabelecimento de uma técnica de
purificação a fim de obter um produto homogéneo que se pode utilizar como agente da vacinação, ã partir de um gene de NA íM estirpe dito Φ& viras iavíautata Á/Vipfconstruiu--se um gene quimera em que se substituiu a região terminal L de NA que apresenta uma sequência de sinal associada .... função âncora ae membrana, pela fracção sequência 5' de um gene de HA de vírus influenza. A construção resultante que, devido ac péptido de sinal clivável derivado da Hk, codificou efectivamente uma NA segregável (NAs) foi posteriormente incorporada em um vêctor de expressão de um baculovírus sob o regulamento de um poderoso promotor de poli-hedrina de transcrição. Concluída a infecção de células hospedeiras Sf9 de insectos segregaram-se de facto NAs no meio de cultura. Com base nos resultados de purificação avaliou-se o nível de expressão entre os valores de 6 a 8 mq/1. Demonstrou-se que no decurso da infecção pelo baculovírus a capacidade da célula hospedeira para processar proteínas por meio de secreção i dramaticamente (Jarvis e 1989). 0 sistema de pzoúOçãC como descrito é todavia aplicável a %&t-ydòs de vacinação à escala laboratorial e considera-se apropriado pwm uma considerável graduação crescente de escala "a t all.aa-ua^, í·: ·> «.·« . >»·*.· · v ·.·:·. ·.·.· ha·;; th.:;; ua.aa t tMían· : :.... :·· ; ata.: ata ! nuaía at â f iaa a auauxt::: íaíí ®ís«?íí
de eromatografia sobre uma vcirrr para fl.ltraçlo em gele
igação cruzada respectívamente comc NAs diméricas p monoméricas, em que a última forma se encontrava presente em apenas muito pequenas quantidades. Mediante a partir de seguida por caio.; ryác Mis. prata as duas tomâ-íí principais NAs tetraméricas e diméricas, obtiveram-se em aproximadamente quantidades iguais e eram homogéneas. A fim de avaliar as propriedades enzimáticas e imunológicas das £©i necessário isolar a NA natural como proteína de referência. Clivaram-se cabecas de NA de vírus X--47 A/Victoria/3/75 por tratamento com pronase e purificaram--se seguidamente por troca catiónica e cromatografia por filtração em gele. Após ligação cruzada confirmou-se que a òNA tinha retido a estrutura tetramérica da M ligada a membrana intacta. M propriedades catalíticas das NAs eram realmente marcantes visto que apenas a proteína tetramérica exibiu actividade enzimátíca. As Mâs tetraméricas tinham uma actividade especifico quase igual à da pNA. É improvável que as NAs diméricas e monoméricas fossem somente inactivas por serem proteínas desnaturadas, visto que durante a técnica de : :. .í r essas formas também se fixaram rspilMMrlg por 3 tratamento com glicanase ae :X& revelou que no todo o teor em jliááurbáá de áçbdmvo das 11·; 'ti ligeiramente inferior em íUiaeígçi;· ao da pite.* vos prápbládádá téiitítiit;snè observada para outtãs expressas ?esse sistema ίΗΐίΓοΡϊ; et al., 1986; DOdutnuu and 19ta; van tunoion l:lttut at al*·, 1991} . .1 hipoglicosilafão foi epere?;f cmántá ;sais relativamente às E&i diméricas e monomêricas.
Estudos estruturais por análise dá edf&sunáo dos ralos X indicaram que a ta ..acua de hidratos de carbono ligada a estabelece um contacto intimo com uma subunidade adjacente, o que sugere que a mesma poderá proporcionar interacções adicionais para reforçar a estrutura quaternária (Varghese et al., 1983; Varghese and Colman, 1991). f A reactívídade das Hftô tetraméricas com a IgG policlonal produzida contra pNA purificada foi realmente total, o que indica que ambas as proteínas possuem propriedades antigénicas muito similares. No caso das NAs diméricas e moncméricas foi possível observar uma pequena modificação na antigenicidade. Disto pôde concluir-se cpç poderá ser possível isolar anticorpos monoclonais que se ligam i estrutura tetrair.érica da NA de vírus infiuenza. Provavelmente um tal anticorpo poderá ter acesso a uma interacção com determinantes superficiais derivados de «ubunidadst adjacentes 3¾ em çaac alternativo, o mesmo pode reconhecer epitopos formados após rearranjos conformacionais ánianeá a do tetrâmero. klêm disso, diferenças na wsjspoáiçâá n:áá; dá dáábcváo poderiam ámaááiár oo EXEMPLO 2 SECREÇÃO DE NEm&MINIDASE RECOMBINANTE PELA PICHIA PASTORIS Introdução A fim .... ru . 'Λ,;.: ?-· como célula hospedeira além das células de insecto para a produção de neuraminidase :: ecouir.i curte de ΐΐΐόΐ influenza, construiu-se um vector de expressão que continha a parte enzimática do "chapéu" ("hat") da neuraminidase.
Materiais e método 1. vector e hospedeiro.
Para construir a cassete ae expressão utilizou-se o plasmideo pPlC9 (Invitrogen, ! de Pichia pastoris. Esse plasmídeo compreende uma origem ae replicação, um gene de resistência a ampicilina, regiões promotoras e terminadoras do álcool oxidase 1 (A0X1) de P. pastoris, o pré-pró-sina.1. dss secreção ao factor a de Sacch.arom.yces cerevisiae e o marcador H1S4 de P. pastoris.
Couò hospedeiro utilizou-se a levedura Pichia pastoris (Invitrogen). 2. Construção da cassete de expressão
Utd.) tarte? d. i':: - 41 :i g .1 d:,t iuíifddúm.tíliu-Sd
roga c. "sequência chapéu" imunogénica do gene da mnr íaue contem o centro activo sob o ponto de vista oo ttdt isolar-se como un fragmento e P.pastoris. A ivqn 15 mostra um diagrama do pò-sstó&s-v p-HCeu A Fig. 16 rspreitónt.iâ isoa vista da regido de fusão entre a ikuv.U; de sinal e a neuraminidase recombinante. 0 íflf&ApéptiticS é clivado no compartimento final do complexo de Golgi per meio da protease endógena KEX2. Extrai-se o dipéptido utilizando dipeptidil aminopeptidase do tipo 3TE13. 0 resíduo extra de tirosina não é clivado e permanece presente no N-terminal da neuraminidase recombinante, mas não é necessário.
Linearizou-se o plasmídeo resultante na posição do marcador de selecção H1S4 por meio de uma enzima de digestão Sall e transformou-se posteriormente no interior de protoplastos GTS115 (his4) da levedura P. pastoris na presença de polietilenoglicol. 0 Mlx isolado a partir dos transformantes submeteu-se a análise de Southern blot. Essa análise mostrou que o vactar de expressão integrou-se por recombinação homóloga na posição do locus his4 interno (embora deficiente). A maioria dos transformantes possui 1 a 2 cópias do plasmídeo mas os transformantes com uma elevada capacidade de secreção observou-se que possuíam cópias múltiplas gns se integraram direccionadas da cabeça para a cauda no genoma hospedeiro em a estrut' ura em ta ndem. 3 de cóoías aumentou para 25 por transformante. 3. Expressão da neuraminidase horas para 0:::::: ::00:10, ad a tilo tamponado que aiatiiaa C,::ll liá ::::v:V^.v:h:;V::';: q .. 'iq •à-ViC'·· L 1: ·Γ:.'Οΐ:·^ d oh O '0 Γ ΟύΐΐΟ d V £· íhh.';h’0' niiL 0' XluhhhiS B b- j; íç O/Ooriíai.O: o vdqaágib οι^ο1') da íi#u£'aM:íiia âae. Utilizando a S ,0 ?h 11- de aa. ιϊ3:: γ a a pl'.:ç d t 1. V,:l ·;' :S llSll :11- :¾ : •1 iv :··> Ι:ΐ;:::η:ι;ν;ν; aa áaiii;: aa ιι::ΐ:ΐί aasí-iíii da::
Essa análise aridciai·.:: que teve lugar uma muito eficiente indução.
Uma analise do sobrenadante celular pelo método ae Western mostrou que uma neuraminidase recombínante ;io:o::. um peso molecular aproximado de 70 kDa foi ai segregada (ver fig. 17). 0 produto segregado foi desglicosilado com PNGase F. Esse processo produziu um "núcleo" como produto com a dimensão aguardada de 43 kDa. Dependendo do número de cópias observou-se que o rendimento no meio da neuraminidase recombínante oscilou entre 1 e 1,5 mg/1. EXEMPLO 3
Materiais e métodos 1. Animais
80S ímiísls tiss toDi e safi-listo osticódldo acesso ad lalvtalas alimentos e à água. 2, Vlrss lus sato opas! íS-íí st. assa tasa .l o suas. o por Dr. A Douglas and Dr. J, Skehel (MCR Laboratories, Hl 11 Hill, London). Os vírus laboratoriais X-31 e X-47 possuem uma oo&poeiooo ooiiiaériic-a HSS2 e derivam de rearranjos genéticos ; 3 de A/FF./8/34 (H1N1) com respectivamente eiltíeb.::dleilli DalDiD e Afdí ò:todliS/i;;/ 7S (H3N2). As duas descendências virais adaptaram-se ambas mediante uma série de passagens através dos pulmões de tal modo que provocaram a morte dos murganhos. 3. NA (NAs) recombinante segregavel
Administrou-se NA de vírus influenza A/Victcria/3/75 sob a forma de proteína recombinante purificada produzida por um sistema de expressão de baculovírus em células de insecto, como descrito no Exemplo 1. A preparação de NAs purificadas que se utilizaram nas experiências de imunização descritas na presente memória descritiva continha uma mistura de moléculas tetraméricas e diméricas em uma solução salina tamponada com um fosfato (PBS). 4. Adjuvantes
Com base em um estudo de 3 muni ta ti-o coa HA recombinante do virei® de 1. ní lua ή to íam se A- a is úé a t é f i t a· .i íio 1 hors or o a adjuvantes ar a a r a i a doe'.. Do a cardo
com as do ••hd 'iiti ii. ·; ; K
λ ·;;ν: tríí-Mi-sse-êí 6~õ:imco:ia.tõ êíilSíí^lM......t V£à^lyf > μ— ϊ ~&.ςίύζ r:" t Sigosâ ΰόο-ηΐ»! 5. Protocolo de imunização
Injectaram-se murganhos por via subcutânea a intervalos de três sema-as com três dcses com o volume de 200 μΐ de ] pg de NAs cada. Tendo em vista a primeira imunização emulsionaram-se as NAs em metade da quantidade de uma dose normal para murganhos de Ribi (correspondente a 25 pg de MPLA, 25 μ:;; de TDM, 2 μΐ de esqualeno e 0,1% de Tween 80). Administraram-se reforços ("booster") sob a forma de injectáveis adicionando 25 pg de MPLA e 25 pg de MCP as NA#» Aos animais de controlo administrou-se adjuvante dissolvido em PBS. 6. Imunização passiva
Três semanas após a administração de uma terceira imunização colheu-se sangue do murganho dador por punção cardíaca e reuniram-se preparações séricas dos murganhos correspondentemente tratados. Ao murganho receptor administrou-se uma única injecção intraperitoneal â® 400 μ! de soro imunitário ou de controlo. 7. Estimulação pelo vírus influenza μ ::: ínOSplt? St Ut: ·ίΐί í; Si ·ίΐ· É S i .C Q 1 ΪΡΪϊί 0 .S SÇÚttÇ
atentamente a evolução da iivffípmu determinando a t-rmstíúvàtur.íí rsctal o o d* :a<ur'uiTvdç:ylscdõ de 10 dias. 8. Processo serológico
Um dlá antes do inicio áo. procedimento de vacinação (sorc pré-imunitário) e duas mmsn#® após cada imunização colheram-se amostras de sangue da artéria aa cauda. Realizando técnicas ELISA analisaram-se amostras séricas individuais quanto aos anticorpos específicos da NA. Revestiram-se placas de microtitulaçãc (Nunc Maxisorp) com \ purificadas (50 ng/cavidade) e diluíram-se os soros em grupos de 1/5. A ligação de anticorpos específicos quantificou-se adicionando anticorpos anti-IgG murina de coelho conjugados com fosfatase alcalina (Sigma Chemical
Co.), seguindo-se a incubação das placas com solução substrato de p-nitrofenol (Sigma Chemical Yo.). Em um leitor de placas de microtitulação determinaram-se os valores da DO a 435 nm. 0 titulo de anticorpos contra NA exprimiu-se sob a forma de recíproco da diluição sérica como números logarítmicos ("logs") resultantes de uma absorção de 0,05 mais elevada do que a das cavidades de controlo (tratadas com soro pré-írnunitário) .
Resultados 1. Desenho do estudo
S:::' V !;. ο Vau 7 V.';· X-4 7 serviram ·: ;:a:: :: -j. -ç- p: >·: Χ-31 {p 0.0* 11 èΠόνΑΓ'' ) PoàtsSr l :..·· i^;iapl:®:dos a murganhos. Em um:· caso alternativo dadores sérícos para experiências de 2. Respostas serológicas A aiaapaçhvi 0·:: ai oohphg hôr-trâ: Hla foi Aogiaiíaa por ELISA no soro de -:m« selecção ao acaso de 12 animais vacinados e de 12 animais Se controlo (1 animal de cada gaiola) (fig. 11) . A utili zação da técnica de imunização cor-tra NAs em murganhos causou um aumento estacionário no soro de anticorpos contra Ilha A primeira injecção de reforço ("booster") aaumoy um aumento rias quantidades dos anticorpos contra · de aproximadamente três "logs", enquanto uma segunda injecção de reforço resultou mas em um outro aumento do titulo dos anticorpos contra as NAS aproximadamente quíntuplo. Nos murganhos de controlo uma única administração do adjuvante não resultou na produção significativa d.e anticorpos específicos que reagiram com as NAs. 3. Protecção homovariante com NAs
Três semanas após ilóilidpg: e de canta i.Sh.r IVÇã 0 ·.?·.>. £v Di·;:··;; 12i. Todos os murganhos ataii: l ,.λ ί-j avAJ.ianohí atas aaaáa aà? peso corporal as primeira a vacinação examinaram-se murganhos aa.o quanto a imunidade mediante da; vírus X-47 homovariante Hl (fig. ahhtroio adoevígrap: gravemente, como corporal e
No quarto dia após a rtàscaâo a vdhl.aa·:;: rtaipa paaeiara taãaa os ar: y. .
Todos os transitoriamente e até um qmu muito modesto, mitivih m sobreviveram d iofttçlo··
XnhAXActgozu-sií târ^éé st nhnitP-vtS:'--á cctiAtcpti r o mesmo r - dt iMmí$.iaêê pzoimtmz s e um::* terceira iitovitdeât, possivelmente por meio de compensação utilizando doses mais elevadas de NAs e/ou η.® Búíhmq* Esses ensaios tinham basicamente o mesmo desenho experimentai. Apesar dos murganhos imunizados desse dAdt exibirem geralmente uma boa resistência, alguns casos individuais adoeceram gravemente e uma série de vacinados morreram ocasionaimente, apesar da percentagem de sobreviventes ser raramente inferior a 80%. No entanto o nível da imunidade protectora alcançada através de três imunizações verificou-se ser superior em toda a linha. 4. Protecção heterovariante com NAs
Examinaram-se grupas paralelos de murganhos vacinados e de controlo quanto a imunidade com 20 P.L>® do vírus X-31 heterovariante NA que apresenta uma NA que esta separada das W>b derivadas de A/Victoria/3/7 5 por 7 anos de "drift" antigénico (variações antigénicas minor que geralmente sáo muI:i:::Xtu pontuais) (fig. 13). Como observado igualmente para estudo dê imunização contra X-47, as consequências da infecção nc grupo de controlo foram dramáticas. Os animais de controlo começaram lego a morrer 5 aias após a infecção. A mortalidade atingiu c tusv no 8" dia, depois do que restou «bttiít cm Kpbrçvivinv®. dttgsvhts iPahitiáòs por meio de N.tj SíMbinsiK 100¾ de sobreviventes ipêt a itl tiçic· gçXi Alt tiiivitl ant» i h Πx i.ttT Zt IaiLÍ., Lu·:; ..v: w: ;:v ι viv o r ::· çççv-dv ílittih uvucMk, t vcihl dv iiívit: t V X boi :iVi pouco maís pronunciado mas iookm; os murganhos a recuperar a pohhor do 6° dia. 5. Imunidade protectora pode obter-se por transferência passiva de soro imunitário contra NAs A fim e determinar se f-zmm os mecanismos de defesa humoral os mecanismos principalmente responsáveis por provocarem imunidade protectora, avaliou-se a protecçâo dos animais por imunização passiva. Com este objectivo imunizaram-se murganhos dadores de acordo com uma técnica pidiid. â colheita de sangue nesses animais proporcionou uma media de aproximadamente 400 μΐ de soro por indivíduo. Após reunir ("pooling") por um lado o soro controlo e por outro o soro imunitário injectaram-se os murganhos receptores por via intraperitoneal com uma única dose de 400 μΐ de soro. Antes da estimulação ("challenge") com 20 Ρΐρρ de vírus X-47 adaptado interpolou-se um período de 24 horas para permitir a propagação sistemática de moléculas anticorpo nos murganhos. Enquanto animais aos quais se tinha administrado soro controlo desenvolveram posteriormente hipotermia aguda e sofreram grave perda de peso conduzindo em última análise á morte, a administração de soro IsurtitátlP contra NAs protegeu os murganhos até essenciaímente o mesmo grau como se demonstrou relativamente aos animais activamente ífíf il4'i« Consequentemente pode concluir-se que os anticorpos pré-circulantes contra a NA são capazes de e suficientes para proporcionar total.
Discussão 2 contra HA, ao mesmo tempo que se ignorou ν.·γχ·.ν.·.. adu:.;<: ova : ο-: o.o í dn-,1 ·; do NA no contributo ou.;: r o i b.u'·; \ou·. , A bitubcà-b teve origem em parte na observação que apenas sõtioorpos; caostiss bd no oigortm a í;t> ÍOCn:agí:bctb -ariòa.u.l:s,s: virais ( Hl rói., 1212; 2:θνοόφό:;:::ό: ···:. al., 1964; Kida ar al., iffih enquanto anticorpos contra a d.A não pareciam serem capazes de impedir uma Inbtcvãq btlsiária sobre uma grande sequência de concentrações (Jahiei and Kilbourne, 1966; Kilbourne et al., 1968; Johansson, 1989). Essa tolerância provavelmente reflecte a última função desempenhada pelas NAs no cicio de vida de um vírus influenza os vírus recém-formados de se agregarem à superfície da célula infectada (Colman and Ward, 1985; Brown and Laver, 1968). Além disso observou-se que a NA, em contraste com a HA, era o composto menos importante do envelope influenza, um facto que poderá contribuir ainda pàra o efeito de não neutralização dos anticorpos contra a ífb (Schuiman et al., 1968). Essa diferença na presença molar afecta igualmente as respostas relativas do anticorpo contra antíçénios individuais. Repetida superapresentação de HA em relação a NA devido a confrontações sucessivas com o vírus influenza completo poderá resultar na supressão da produção de anticorpos contra NA, provavelmente como uma consequência da ajuda enfraquecida de células T específicas de NA (Kilbourne, 1976 ; Johansson et ai,,; Ibfb; Kilbourne 0t cLl · f 1987; Johansson et al., 1987). A fio ; de estudar a protectora contra NA é portanto necessário ba;a o.l;v:çl d ·· ; v r ioçç" em que se elimina a interferência na no:oir a bKOpóO de boi .ic:o.rp o o contra R e > n - a lói;piróv da só .opobt. a < ;·;· · ·: · >··:· ··. <y ·;.- b a ΜΆ através da J pelos antigêní os HA e NA, mxxúmmx xiêmnxxsx foram ou baseadas no ve-futoi · Schuiman et ·.·.; . , 1968;
NA do and
alternativo da administração em associaçao de uma série definida de estirpes de influenza com antigénios HA e NA diférentãfí sob o ρ-οοοο de viotu mmm.0:::000r:um uáott «1 Sb, .0 rí-s^i; 1976). 7':-.".:.udu os ibonAbaboí; :.¾ presente memória descrit. iva demonstram utra imunização protectora per meio de ums pddtçrnm NA recombinante purificada. Um gene de NA de virus .i-â/3fl% (H3N2) transformou-se em um gene que codifica (NAs) puf meio à& substituição da rsatiãts que codifica a âncora de membrana pela acçao da sequência de sinal ce um gene de hemaglutinina de vírus ínfluenza (ver exemplo 1). Técnicas in vitro estabeleceram já que anticorpos contra NA podem suprimir de um modo eficiente o rendimento de vírus que se desenvolveram mediante inibição da libertação e da propagação de partículas virais (Jahiel and Kilbourne, 1968; Kilbourne et ai., 1968). Retiraram-se conclusões similares de animais imunizades com NA avaliando títulos virais reduzidos nos pulmões e desenvolvimento reduzido de lesões pulmonares (11, 12, 13). ApPPPf de se ter dedicõdo considerável atenção ao efeito da imunidade contra a NA respeitante à replicação virai nos pplpfpiíp era questionável se a imunização com proteína pura de NA poderia prevenir os sintomas clínicos da doença ou poderia melhorar as hipóteses de sobrevivência após uma iniffgíuíiç potencíalmente letal pelo vírus inf luenza. A essa quuvtlP não se apresentou ainda qualquer resposta satisfatória. Os resultados apresentados na presente memória descritiva demonstram contudo nitidamente que ou pode conseguir protecção total conrra ums J.ni*epiô normalmente
.>V ν·:; X;;·!;· >··;· ÍT>- <> ϊ ' $ X; · .¾ >; ^ — j4pP • - A: ; Sy.y v •,y-
Ai; ^αί&ιΜ &(:>>: cé .U::1aa nçífί::;χ::ι; :: :::0:¾¾ tantÀS :s ms* Axpeti.Ânci As as; na presente nnmA ri® dtstAÍ'titAa· imunízaram-se murganhos com três doses de 1 pg de NAs que se administraram a intervalos de três semanas. Os ãntASAis vacinados foram capazes de sobreviver completamente a uma infecção letal de vírus influenza, ss; que o vírus expressou NA homo- ou heterovariante. Devido à eievadã dose do vírus da infecção foi muito marcante como animais apropriadamente imunizados permaneceram sem sintomas clínicos da doença como indicado por alterações na temperatura e no peso corporal. É importante notar que os adjuvantes que se administraram em associação com NAs possuem todos propriedades capazes de provocar uma reacção e especialmente uma reacção imunológica ("reactogenic properties"), de forma que o processo de imunização descrito na presente memória descritiva aplica-se directamente na vacinação humana. As vacinas de acordo com a presente invenção são além do mais relevantes para cutros mamíferos e para aves. A transferência passiva de soro de murganhos que foram imunizados com NAs para murganhos receptores não tratados deu origem a iguais níveis de prctecção, o que indica que o efeito protector da imunização contra NAr se pode explicar na base de anticorpos circulantes csnt.ra as mesmas NAs.
se possa fazer uma a
d Brownlee, ípií&pu no mesmo ano a csti:rdv M.dbi. ntM a ragito da de . as variantes de NA, nos amínoácídos observam-se em 28 posições, a maioria localizada sobre a superfície da molécula. E provável que a vacina de acordo com a presente invenção também possa proporcionar protecção contra variantes do eliminadas ainda em maior quantidade. Além disso é concebível que mediante modificação genética de im gene da NA se possam arranjar variações na sua estrutura antigénica. Isso pela presente invenção torna-se possível por exemplo para preparar associações ("cocktails") de versões diferentes de NA, por meio das quais se pode obter uma prolongada protecção contra diferentes estirpes de vírus influenza.
Figuras A Figura 1 mostra a estratégia para a construção de un gene segregável de NA e a sua integração em un vector de transporte de baculovírus. Indicam-se apenas os sítios de restrição relevantes. As linhas finas contínuas ("single línes"; representam sequências bacterianas plasmídiais, enquanto as zonas mais densas indicam sequências específicas de HA icuntiiVoaUÍ ("full") ] ou específicas de NA tracejado ('td:çié#-d:WU - A sequência de sinal de HA está indicada com um .. - a traço s.bípivs ("single .. · ", A lóquir:c: t df um a âpó duplo. v .v; :.;i. :>; 11 .;i".:: .N.r-.ldli.u, ;v. d ii d·-.0. <‘> cu.:. ia ati dl ou úã I luda DU v-x v.·'···:·*·;· ···..*··. h: :···:· ·: v' X V.··.·.·. ·.·«· \ Λ .·.< ·. .V Λ V.· :: *·· ·»* XÍxX λ··./·..··:; <"·'*: Ho ADNc e a auquêncl.a de UtlnUUtvldUS oius reauiâim·: f ianqnuadh ateu da aatid dá liga: X -Λ - OU 0 çlpt i. dd; da õinol da 22-. a a 11. com u acu únuo·.... de datdzcucD de dl. removida.
A Fi$ux« 21 mostra HA não processada 00¾ detalhe, a sítio de restrição da peptidase de sinal entre Maig e ? (linha vertical tracejada). 0 segmento terminal da NA utilizado para a secreção das NAs designa-se com um seta.
Na Figura 29 apresenta-se um Bsé da r%giÈc "stalk" ("região do pedúnculo") da NA. A sequência Irdncasfâ envolvida na construção de NAs designa-se com uma seta.
Na Figura 2C mostra-se como se constrói a sequência de aâd a partir de A e B. Apresentada na presente figura em detalhe encontra-se a região de fusão entre as sequências específicas de HA e de MA. As d.l:S provavelmente começam com os quatro aminoácidos da HA madura no terminal da NA seguidos por uri códão mutado (sublinhado com uma linha tracejada) .
Na Figura 3 apresentam-se as análises em SDS/PAGE da pNA purificada. A Figura ?A diz respeito a analises de amostras de proteínas colhidas em fases diferentes durante & purificação da pNA. A coluna 1 mostra as proteínas marcadoras; a cdlubá 2 o íiud.id:l2d. dítico da pFA (1 pg; bandas da pNA ir'!:t.riorts aos níveis detectáveis); a thhiins 3 mostra um 'htsbX',f (1 ug) 1 a coluna 4 $ i;';! .T)1 í s 1Γ. d · dx 0 u pgi tlà Fipuíl 13 Di 7,51 dl 1 μα d: :· :>;· al ;i: ') : fu 1 •Dt ;···'^. d·: .d Xdd; X·' £<<<< i ''m-dí•'di.'i di :ΐ·1νV' í: 1 d ;x;j,):.--)1 dl FilF, A et! li ri ai :: /írtúuvaar; s ct:l.o.na 2 a cdl ipds o ar;
Bandas rede ©' :;;U:\©;mAA:A'©A:©'d - aproximadamente 105 kd (trímero) e aproximadamente 210 kd CS. £ λ aparecem »'*.· <- -1· ‘;.;Ò'k·'' A 3 ©.©t 1 i s p: · g; m-Ar t©ratoral '...-: 33 i-A is.· ò. ãi· V 2·· da©© XO-.A ·ν·'ν ·.-·- -Ç; 5 (Γ': vy. ·... ·.. ,c. v u.· ·'.-:- ·.··· 3 ©u© • detecta no mm!© de ;;·····-;>": -d·.:. :··;'·;© . ,;.s v. ··.;.· f ©©mo ddrldddd dte nivdi d© actividade ©AAiAiti ©A (O) s da concentração total de proteínas (0), após inoculação de células Sf9 com báculovírus recombinante.
Na Figura 5 apresenta-se a cromatografia de troca aniónica sobre Q-Sepharose. Após dissolução e diâlld© do precipitado pelo pAA© dlCg (20 a 60%), colocou-se a solução (97,5 mg de proteína, 117 000 U) sobre uma coluna de Q-Sepharose. Ant©© de se realizar a eluição com um gradiente linear de NaCl (---) até uma concentração de 250 mM que se adicionaram ao tampão inicial, eliminou-se por lavagem o material não ligado. A concentração da proteína do eluato foi seguida por determinação a hm- H · Colheram-se fracções de 2,5 ml e analisaram-se quanto a actividade enzimática (o) e quanto â antigenicidade em um ensaio ELISA (A). A Figura 6 mostra a filtração em gel de NAs sobre Saperdex 200. O eluato, após a separação do ácido N-(p-amíno-da agarose (2,63 mg proteína, 49 100 U) , ©©©csnbtbd·"©© até 2,3 ml e cromatografou-se posteriormente em u·:.©: s ©el©©« de amostra de 1,V ml sobre uma coluna dup-v t-ltx 233 ar qu© © ©é©©d© ss rsAli©:©© 2 itii ;©©!©©©© ©du flumbd ddPsrlibiáis da 10 ©ρ/ααοα, A f 2 ( ό©Α©1©©&8ϊ&ΑΑΑ! iMiguidíâ a.;A. jmáta::.··.·;© fracções individuais i',±P mi)
d.. dà dd O unaà :sC;:tÂtd.dãd® ©o©imâfica (O-) ©©m :t©A© â ©©©igèrdçA (Δ) . At Betas inditaA os yoXiusms d© ; á% calibração (ver texro) : 443 kd (1), 203 kd (2), ISO kd ;3?k 67 kd (4) e 29 kd (5) . iigiifi; 1:111:1:.:1.Síí: 111; ui; .a da fracção c '-d cl ;.
Cada coluna corresponde ao dl 1::11.:.1: ífe fdllClddlo 111 iolS iildkllliíl mostra c modelo de SIlddFdSl· após desnaturação de amostras de 10 ç.l (adicionou-se β-mercaptoetanol) . As colunas A e B indicam proteínas marcadoras, lia Figura 7B as amostras de proteínas ligaram-se em rede com BS’ e separaram-se posteriormente por electroforese sobre um gele em gradiente de 5,0% até 7,5% na presença de SDS mas sob condições não redutoras. As fracções 57 e 68 mostram um volume das amostras de 10 dlí as fracções 70 a 77 mostram um volume das amostras de 25 1 . As NAs tetraméricas originam bandas a aproximadamente 220 kd (tetrâmero) e a aproximadamente 110 kd (dímero). As NAs diméricas e monoméricas permanecem visíveis sob a forma de bandas de aproximadamente HOkd e de aproximadamente 55 kd respectivamente.
Apresentados na Figura 8 estão os resultados de SDS/PAGE de amostras de proteínas colhidas durante diferentes fases da técnica de purificação das NAs. A coluna 1 mostra as proteínas marcadoras; a coluna 2 o meio bruto (5 yg) ; a coluna 3 o precipitado (5 pg) pelo Π:^ΐρι#0:; (20 a 60)%; a coluna 4 o "pool (2,5 yg) da Q-Sepharose; a coluna 5 o "pool" após a scpcr AÇâo li ÁCC ilVt.tg 0 fcMd N- (p- imi Cl: :S ov.l i; íts 6 s 'ólidld.'" das C: CCC NAs v ;·:·;:·>·'· ·:·:·:·,;:k <· : -*·:·; s-.'<·:·: :v. a-, ;--.-C·;·; c-, ··.·.' lV ••XiX :c.v ···· ::· v ,;· X’ o · >>- ·:·' ,-···· 4::/.:. ' 7 ,-cc .s·. s, x. ;-:aç;ic:í-.p pg) gs lis ;: lipílt::· 200. ÁX Fig pypiy x;çi: j. 1 pi;:’'- i XiXXXp-1·:. ·;! -iX2 Xy-ç! :dχ X 2.·;'·( 1 b/iátiiC; . 1.;.::: 2·:·::ϊ ά x>;*0 X ói pOpç «: :ΧνΡΚ·:·· çXçdc jp^pXQy'-' ·:.? partir da digestão ocí.NA-glicanase e de SS/Sffi. A sumi&is NA-glícanase ê visível 3ã kd. 1-i Figura 9Δ a coluna 1 mostra proteínas marcadoras; a cccIuaa 2 pNA não digerida >' *·: Y:· ·:·< :* V Α'Λ;·!: .· s i 3 .v.c λ v ·:·:···> ,·.ν '· y-:- ivA'1 7 c r ·:· :· iii com NA-glicanase. ás Figura 9B aS OO- ( ir;': O 7 β 8 SiAiliS? í; as proteínas marcadoras; a coluna 2 as IA» i - y/ y <-·- y.· %-·- x ... A-: .y. Cuti- ίϊ não digeridas; a coluna 3 as NAs is: 1í:,ucA;::: oío tratadas com NA- -glicanase; a coluna 4 NAs diméricas não digeridas; a coluna 5 NAs diméricas tratadas com Na-glicanase; a cs&ms 6 NAs monoméricas não digeridas; a coluna 7 A A o AòTviiiriCAi ~patadas com NA-glicanase. A Figura 10 ilustra a identidade aproximada antigénica entre 11 § e pNA. Levaram-se amostras de pNA e de Mfe; até concentrações iguais de proteína e diluíram-se depcis em série de 1 para 2 em um ensaio ELISA. A figura mostra a curva sigmóide da antigenicidade avaliada relativamente a antígénios específicos. A pNA referência e indicada por o; as NAs tetraméricas por 0; as Ms diméricas por □ e as NAs monoméricas por A. A Figura 11 ilustra a resposta dos antirorpos contra as IAs , Catorze dias após cada uma das imunizações (designadas por meio de uma seta), colheram-se amostras de sangue dos murganhos e avalíou-se a presença de anticorpos contra as flAs em um ensaio ELISA (ver texto relativamente aos detalhes experimentais). Barras sombreadas a cheio e barras sombreadas a traço representam os títulos séricos médios |'± D.F. [ΑΙΑ D.) ] «n .1 f ...·Λ 1 c vatLhAdtt e cá: controlo £ C; Apto £ 17 A SÁ Aí: s . A "igura 11 vscáscxáí : A· ; T em (S; e (C) ; o eomtcolos [- >·:ν· : 1: ; * C: =Cj ] 20 DL5C de c:c::ccccç^:c7a:ccsíf cj X-47 adaptado Á;cr::pcnhC:, 7i::ccc:;pa:ch0:t;'o:'e a d* irÁmsiAíiCí e determinando a registando a taxa de o dííSíítijrst'it-ra. rectal ;/B:) e "data BBd.AtzA ΓβΡβορζοβ 11; mm tolos determinação médios ±S.D. ί +D.P.). „ .· „ )B:) 2 peso ouorparul (C) doo murganhos aos detalhes experimentais), Os Balogt qno em. tiiuifinu :· oçumjBs ?: t ddt) trttutt'). tom valores 1 Figura li ilustra a protecção heterovariante.
Estimularam-se vacinados [---em (A); V em ;\Bu e (C) ] e controlos [- em (A) ; * em |Β·| e tíil ] com 20 DL50 do vírus X-31 heterovariante, adaptado a murganhos. Rcompanhou-se a evolução da Infecção registando a taxa de sobrevivência (A) e determinando a temperatura rectal (B) e o peso corporal (C) dos murganhos (ver texto relativamente aos detalhes experimentais). Os "data points" transmitem valores médios 2S.D. ( 2D.P.) . A Figura 14 mostra a protecção por imunização passiva. Submeteram-se grupos de murganhos a imunização passiva utilizando injecção intraperitoneal de soro imunitário contra HM 1------ em (A); V em (B) e (C) ] ou de soro controlo [- em A ; · em (Bi e C . Vinte e quatro horas mais tarde administraram-se aos mesmos grupos uma estimulação de 20 de vírus X-47 adaptado a murganhos íver texto relativamente aos detalhes experimentais). A taxa de sobrevivência, as temperaturas rectais e o peso corporal estão apresentados respectivamente em (A), (B) ρ (C). Os "data points" indicam o vai« tádis I S . D. ( P. ) . islnBs ;> só '.P · ç,.' . do a P t ·; :t um; 5. .!-·· piidB que 11 ·;·. sfc terminador, o - ·:: AÍ tu de um gere d;" factor a de Saccharomyces cerevisiae. Atrás do em rtr.d® S: gCvC-CC '·ίλ. S : ; gv p g C U ::¾ Ç ;:j t d A i dS;· 2:^8¾¾ è ;'St. td :·. ./ . . sinal de e a recombinante do ''Qhsptd" Phat") da rrrrr-xrr:·:: ::c "KEX2" indica onde c pró--péptído é cindido o compartimento final do complexo de Golgi pela protease endógena KEX-2. 0 dipéptido 2 é removida por uma dipeptidil amínopeptidase do tipo STE 13. 0 resto tircsina não pz^vêm. da neuraminídase mas não é removidc. A prolina seguinte corresponde à posição 79 da ΐϊΡ'νϊΟãSltriíiSsií;' ifc í' « A Figura 17 representa un ensaio de Western blot on 12,5% de gele de políaerílamída com 5 amostras de transformantes individuais em un meio. A coluna 1 contém a amostra de uma estirpe de E pastoris não transformada em um meio. Em cada coluna coloca-se o material proteico de 1 ml do meio de cultura precipitado por TCA.
Quadro 1: Purificação da pNA
Este quadro diz respeito a uma única experiência de pwtifIcdçfe característica (ver texto para mais detalhes). 0 toltPss mpâ-t £ ilcxmçJ:·;:; cm gelP cnPejdém 200 representa um U ?0ί: ÍI- Í^SSíÍÍííí dí!; d;M: Síí;;.:;· pMdlidS Pdd ti® IãS^OÍCí
Este quadro contém e única experiência de purificação característica (ver texto para mais detalhes). Os volumes especificados após filtração em Superdex 200 mostram "pools" de fracções de NAs colhidas em dois ensaios cromatográficos.
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Claims (21)

  1. Reivindicações ί, Νίί·χ:.r:xs:· .:¾¾¾ -¾¾¾ izúm «ftcíiwisMS :S!j* « OÍAte útilLz-m$4oi .si í; 0¾¾¾¾¾¾¾.). simecto í-iís ís?íi ds t s .? ·.·: ^¾.¾¾¾ >· : ·>..:··:.:· de eêldXai;; hospedeiras que se transformam por meio de um vector de expressão de neuraminidase eu se infectam com um vírus que se transforma com um vector de expressão de neuraminidase, em que o vector de expressão compreende pelo menos uma parte da região codificante de um gene da neuraminidase de um vírus influenza som excepção da região que codifica a "âncora" de membrana precedida no ciclo por una sequência sinal clivável; e b)o isolamento do produto de expressão neuraminidase, do meio de cultura para utilização em uma vacina contra vírus influenza ("anti-influenza").
  2. 2. Neuraminidase recombinante sob uma forma efectivamente isolada de acordo com a reivindicação a qual é a neuraminidase NA2 recombinante de vírus Fnfluenza, em que se infectãm as referidas células hospedeiras com um vírus que é transformado por dupla recombinação homóloga do seu genoma com o vector de expressão recombinante pAc2IVNAs (LMBP 2976), para utilização em 0.¾¾ vacina contra ã gripe ("anti--influenza").
    4. ^âa£a.mi:'b.i.i3'ÃSS iaoiaaa/a de virus influenza de acordo 000 uma çUitlásr das reivindicações S. ou ?., para utilização ser v«0:1.:0¾ contra vírus influenza do tipo Μ2. 5. fea&tó/oidâis® οοοοοχί.ice ar.® d® vives influenza de acordo com mss qualquer dae reivindicações 1. â 4., caracterizada pelo facto de as células hospedeiras provirem de um organismo 000ar ; ·:.··' i iof® C :bár.· 6. £l#o:oâSiinixdíOt recombinante de vírus influenza de acordo com a :o:d.viinrvr.pvo .!,> 2., 4. ou 5., caracterizada pelo facto de as células hospedeiras serem células de insectos. Neuraminidase recombinante de vírus influenza de acordo com a reivindicação 6., caracterizada pelo facto de as células de insectos serem células de insectos sf9.
  3. 8. Neuraminidase recombinante de vírus influenza de acordo com a reivindicação l,f 3., 4. ou 5., caracterizada pelo facto de as células hospedeiras serem células de levedura, por exemplo de Saccharomyces spec. Ou Pichia spec.
  4. 9. Vector de expressão de uma neuraminidase segregável por virus influenza que compreende: idípilç m&nas uma parte da região codificante de um gene de Tt«ãrstd.:nidatí;· de virxm· ivf.i v®v va com cxcoçoõo J® re-g i a gigç codifica a âncora de membrana; ai; ieiutocli: V . cg .]ç Cii.iViiJi çil··: v ::t:····; -i ¢: 0. N<. ia ® avúíplad® rç oç.a® ['P" u im ;oroií;rtir ievsV ον®®® ;i: tf *-"ϊ d: 1 > * 10. VoPtor de acorcc com a reivindicação :-:u , para. a expressão de ama neuramínidase segregável por ri ruã ioíiypiPS, que é s Pòiri;;ai.ÍP..raãsP: aiã.2 SíSgrõgãPPi por yiryP iOi aãOíKs 'ã-srT.O.r :: .v:.vr qaa; ·όί'>Π:ϋ'.;::ΟΟΟ.Οό : a)a região codificante de s® gene de neuramínidase M&2 do claros líym.ucnPá estirpe â/7iatPri.P/r^.iÍã roa; excepção da região quê codifica a âncora de membrana; bíPmP sequência sinal localizada em 5' da região codificada e acoplada na mesmâ durante o ciclo; c) um promotor localizado em 5' da sequência sinal; e d) um termmador da transcrição localizado em 3' da re-; gião codificante.
  5. 11. Vector de acordo com a reivindicação 9. ou 10., caracterizado pelo facto da sequência sinal ter origem no gene da hemaglutinina de virus ínfluenza NA2 A/Victoria/3/75 (H3N2) .
  6. 12. Vector de acordo com a reivindicação 9., 10. ou 11., caracterizado pelo facto de o promotor ser o promotor poli--hidrina.
  7. 13. Vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 9. a 12., caracterizado pelo facto do terminadoi da transcrição ter origem em oV4d e/ou em um gene de poli-hidrina. st 4 s - · o li.., em que o vector é c gylcilIVNAs com o mkiòry de admissão
  8. 15. Vector de acordo com o reivindicação i., para de uma neuraminidase aogràgáonal por vírud Ιηίΐηοτ levedura, que compreende: âncora de membrana e ainda com excepção da região que codifica peie menos uma p-curpld do ^ ' part") da neuraminidase; bjuma sequência sinal localizada em l··* da região codificada e acoplada na mesma durante o ciclo; c)um promotor localizado em 5' da sequência sinal; e d;um terminador da transcrição localizado em 3' da re-; giáo codiflcante.
  9. 16. Vector de acordo com a reivindicação 15., para expressão em uma levedura de neuraminidase segregavei por vírus influenza, que é uma neuraminidase NA2 segregável por vírus influenza, em que a referida região codificante pertence a um gene da neuraminidase de vírus influenza da estirpe S com excepção das regiões que codificam respectivamente a âncora de membrana e pelo monos uma porção do pedúnculo ("stalk part") da neuraminidase.
  10. 17. Vector de acordo com a reivindicação 15. ou 16., caracterizado pelo facto da sequência sinal ser uma pré-pró- sinal do factor a de BãaahãtOMyms cerevisiae. 18. ’ .·: 1 caracterizado pelo facto de o promotor ser c 1 b álcool
  11. 19. Vector de acordo com uma fosl 00000 duas r&ivi tdi ;ò:v:bV a 18., caracterizado pelo facto do o turraiíUidc transcrição ter origem em um gana és luitrcl rrimnm& Fiririis: pastoris. 20 Vector de ecordo ume das reivindicações 15. a 18. , em que o vector d o s com c número de .vi dê: tÀõtiv· do dit|ò6:vittí rAVF 3223. 21 • Vcicilld que compreende a neuraminidase recomb i n ant e de acordo com uma qualquer das rei .vindicações I. a 8.. 22 Vacina de acordo com a reivindicação 21., em que a neuraminidase recombínante é a neuraminidase NA2 recombinante de vírus influenza de acordo com uma qualquer das reivindicações 2. a 8..
  12. 23. Utilização de uma neuraminidase recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1. a 8. para a preparação de éma vacina contra virus influenza.
  13. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 23., em que a neuraminidase recombinante é a neuraminidase NA2 recombinante de vírus infiuentu de acordo com as reivindicações 2. a 8., pura a preparação du uma vacttnu contra vírus do tipo NA2.
  14. 25. Processo de fabrico de uma neuraminidase recombinante de tvxdt ocrs:,::irou fases de: uma sequência sinal e a eiu acoplada dtatvtío o ciclo a influenza com excepção da região que codifica a âncora de mombrrhK e eventualmente da togilo que codifica o SiMtãiinmtò deltall: psrt:"'} da iót* ta tt-ÍVilcit· da taqtáíttisís td-tPsóttssi e terminadora apropriadas ; ae ama célula hospedeira com o vector de expressão assim obtido; da célula hospedeira trãnsformada em um meio de cultura sob condições que possibilitam a expressão da neuraminidase recombinante; e d)isolamento da neuraminidase recombinante a partir do meio de cultura.
  15. 26. Crocesso de fabrico de uma neuraminidase recombinante de vírus influenza que consiste nas fases de: a) construção de um vector que compreende um módulo de expressão constituído por uma sequência sinal e a ela acoplada durante o ciclo a região codificante de um gene de neuraminidase de vírus influenza com excepção da região que codifica a âncora de membrana, isso na oCdMiçS-ô de sequências promotora e terminãdora apropriadas para transcrição; b) colocação do módulo de expressão do vector no genoma de um vírus através de uma dupla recombinação homóloga; c.) ínfecção de uma célula hospedeira com o vd.rud transformado assim obtido; Sij: Ptu/oPtis da .ta .i.t ÓM.11 ítrS Íí::0::t cortòí ft neuraminidase r e) i úà he·· hospedeira infectada em um meio de o ' ” de meio de cultura.
  16. 27. Processo de acordo com o o :cíi:pv nái "·.*vdo 26., para £:nbP:PPO de ama de adruo ipfi:pap pan qua é uma neuraminidase Sc recombinante de vírus po.í.h.P.mma.;í em qmi « referida ao qpfíp da ΆΖ de virors inf Xpoarua da esti rpe ?:/V'iar:::.odia/;í:in'5 com excáp-çac; dia região que cox:a.:íicu a Anc-ora á& pvabdiaoq a o referido adn;o d 00: baoá.ia:dd.ai;a ''aiicá-dqqoe^ (do tipo selvagem) ou um baculovírus derivado do primeiro.
  17. 28. Processo de acordo com a reivindicação 27., para o fabrico de uma neuraminidase NA2 recombinante de vírus influenza, em que 0 referido vector que compreende um módulo de expressão é o pAc21VNAs com o numero de admissão do depósito LMBP 2976.
  18. 29. Processo de acordo com a reivindicação 25., para o fabrico de uma neuraminidase recombinante de vírus infiuenza, que é uma neuraminidase NA2 recombinante de vírus influenza, em que a referida regíãc codificante pertence ao gene da neuraminidase NA2 de vírus influenza da estirpe ri&/d/7S com excepção da região que codifica a âncora de membrana e da região que codifica o pedúnculo ("stalk part") da neuraminidase.
  19. 30. Processo de acordo com a reivindicação 25., para o fabrico de uma neuramini· -5 recombinante de vírus influenza, qqa? ê ρϊορ neuraminidase d:d.2 rocdasMíbadiq de Pitus Infltas."®, ¥íb que o referido POPtor cia ΑϊψΓίοΑοϊΙο i o piP)llVdA.íl:s opca o :;T;i:Pd'PP do âàáissto da Cd-Pcuai ;PC! LMBP 32i22d a a altPaiíi. addUiiPS hospedeira d a cdiuMa pastoris. 31. urívaosn·,:·;:: de acordo coar ouso íb.iadppaa:o das ediviódiódçqéi; .p;p par.a p pssbpipo da; uma oais/pao.iniémm recombinante de 25. em que c referido Lrcdzarouc o da
    menos um qráfico.
  20. 32. Processo de acordo com a 01., caracterizado pelo facto do tratamento cromatográfico consistir em uma £ de troca aniônica seguida por uma passagem ao longo de una coltsna de matriz de afinidade e em uma filtração em gele.
  21. 33. Processo de acordo com a reivindicação - .,caracterizado pelo facto do tratamento cromatográfico consistir em uma cromatografia de troca aniônica em Q-Sepharose seguida per uma passagem ao longo de uma cal uns de ácido N-(p-aminofe-nii)oxâmico-agarose e em uma filtração em gele Superdex 230. de 2007 Lisboa, 30 de
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