PT746334E

PT746334E - Composicao farmaceutica contendo activadores de plasminogeneo

Info

Publication number: PT746334E
Application number: PT95910500T
Authority: PT
Inventors: Stephan Fischer; Ulrich Kohnert; Hans-Jorg Markl; Heinrich Woog
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1994-02-21
Filing date: 1995-02-18
Publication date: 2002-02-28
Also published as: KR100356934B1; CN1141592A; FI117925B; CA2183755C; EP0746334B1; SG50567A1; CZ243196A3; HU9602284D0; NZ281607A; US5747030A; KR970701059A; DE59509580D1; FI963251L; HUT74843A; ZA951371B; SK107996A3; CZ286682B6; ATE205091T1; NO963460L; TW337997B

Description

DESCRIÇÃO

“COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO ACTIVADORES DE PLASMINOGÉNEO” A invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm activadores de plasminogénio ou os seus derivados como substâncias activas, assim como as correspondentes formas de apresentação farmacêuticas como liofilizados ou soluções injectáveis ou de infusão. O activador de plasminogénio dos tecidos humano (t-PA) possui uma grande importância terapêutica na dissolução de coágulos do sangue, por exemplo, no enfarte cardíaco. t-PA provoca a dissolução de coágulos do sangue por meio da activação de plasminogénio com obtenção de plasmina. A plasmina dissolve a fibrina, o componente principal da matriz de proteína de sangue de pessoas idosas.

Naturalmente t-PA é constituído por vários domínios funcionais F, E, Kl, K2 e P. O domínio P contém o centro proteloliticamente activo que efectua o desdobramento de plasminogénio com obtenção de plasmina. A preparação por tecnologia genética de activadores de plasminogénio (PA), especialmente de t-PA ou de diferentes muteínas de t-PA em células eucarióticas e procarióticas é já conhecida. Neste caso, sintetizam-se derivados de t-PA em células procarióticas sob a forma não glicosilada ao contrário de t-PA natural.

No sentido utilizado na presente invenção, como activadores de plasminogénio em princípio interessam especialmente os derivados de t-PA 2 preparados recombinantemente, que abrangem essencialmente os domínios das proteínas da proteína natural que são competentes para a fibrinólise dos trombos. Neste caso, podem-se utilizar também derivados do t-PA que possuem anulações ou substituições de um ou vários aminoácidos na sequência do t-PA.

De acordo com a presente invenção, utilizam-se por exemplo os seguintes activadores de plasminogénio : t-PA (por exemplo, Alteplase), LY 210825 (K2P que se obtém a partir de linhas de células do “criceto sírio”, Circ. 1990, 92, 930-940); AFE3x e AFElx (K1K2P, Blood 1988, 71, 216-219); AFEKl (K2P de células Cl27 de rato, J. Cardiovasc., Pharmacol. 1990, 16, 197209); E-6010 (Jap. Circ. J. 1989, 53, p. 918); variantes de t-PA (Thromb. Haemost., 1989, 62, p. 542); K2P e D-K2P (Thromb. Haemost., 1989, 62, p. 393); MB-1018 (FK2K2P, Thromb. Haemost., 1989, 62, p. 543); FK2P (FASEB J., 1989, 3, A1031, resumo 4791); Alx (Circulation, 1988, 4, Π-15); K1K2P (Thromb. Res., 1988, 50, 33-41); FK1K2P (J. Biol. Chem., 1988, 263, 1599-1602); variantes TNK de t-PA (WO 93/24635); bat-PA (Witt et al., Blood 1992; 79; 1213-1217 e Mullot et al., Arterioscler, Thrombos, 1992; 12, 212-221). Interessam especialmente os activadores de plasminogénio que contêm os domínios Kringel-2 (“K2”) do t-PA e/ou os domínios de serina-protease (“P”). Por exemplo, pode mencionar-se a esse respeito a muteína de t-PA “r-PA” do tipo K2P que se descreve na EP 0 382 174 (WO 90/09437). A presente invenção refere-se especialmente a activadores de plasminogénio do tipo K2P, K1K2P, FK1K2P e FK2K2P, como são descritos nas seguintes publicações : Protein Engmeenng 5(1), 93-100 (1992); DE-OS-39 23 339 1; Circ. 1990, 82, 930-940; J. Cardiovasc. Phaixnacol. 1990, 16, 197-203; Blood 1988, 71, 216-219; J. Biol. Chem. 1988, 263, 1599-1602; Thrornb. Haemost, 1989, 62, p. 543. Empregam-se especialmente activadores de plasminogénio recombinantes do tipo K2P como são descritos em EP-A-0 382 174 e em Protein Engineermg Vol. 5(1), p. 93-100 (1992). Outras t-PA-muteínas deste tipo são descritas nos seguintes pedidos de patente : US 4 970 159, EP-A-0 196 920, EP-A-0 207 589; AU 61804/86; EP-A-0 231 624; EP-A-0 289 508; JP 63133988; EP-A-0 234 051; EP-A-0 263 172; EP-A-0 241 208; EP-A-0 292 009; EP-A-0 297 066; EP-A-0 302 456; EP-A-0 379 890.

Do estado da técnica sabe-se que a proporção de açúcar tem uma considerável influência sobre a solubilidade e a agregação de proteínas (J. Biol. Chem. 263 (1988), 8832-8837). Assim, em EP-B-458 950 afirmou-se que por exemplo um activador de plasminogénio recombinante não glicosilado com a composição dos domínios K2P possui uma solubilidade essencialmente pior do que derivados de t-PA ligeiramente glicosilados. Activadores de plasminogénio não glicosilados como por exemplo r-PA dissolvem-se em geral apenas em pequena proporção nos tampões coirentemente utilizados para a solubilização de proteínas como por exemplo citrato de Na 50 mmol/1 de pH 6, tampão de fosfato 50 mml/1 ou solução fisiológica de NaCl. Para a utilização como substância activa terapêutica, no entanto é necessário que os activadores de plasminogénio estejam presentes em concentrações suficientemente altas, de preferência com uma concentração de até 10 mg/ml. A partir da EP-A-0 217 379 sabe-se que a solubilidade de t-PA de células procarióticas aumenta por meio de formulações neutras ou ligeiramente alcalinas de

arginina. Um inconveniente deste processo é no entanto o facto de só se conseguirem boas solubilidades de t-PA de células procarióticas com muito altas concentrações de arginina.

Outras formulações galénicas de activadores de plasminogénio ou dos seus derivados são conhecidas por meio de WO 90/01333, WO 89/050347, WO 90/08557, EP 0 297 294, EP 0 156 169 e EP 0 228 862.

Assim, em WO 90/01333 (Invitron) descreve-se a combinação de lisina, histidina, arginina com citrato para t-PA e derivados de bactérias. Utiliza-se citrato com 5 mmol/1, lisina, histidina, arginina com 150 mmol/1 a pH 6. Além disso, adiciona-se albumina

Em WO 89/050347 (Invitron) descreve-se a combinação de arginina (20 - 200 mmol/1) e citrato (20 - 80 mmol/1) a pH 5-8. WO 90/08557 (Genetics Institute) divulga uma combinação de creatmina com diversos aditivos como histidina, arginina, prolina, betaína, colina, imidazol, triptofano, citrato, eventualmente com adição de ácido glutâmico, aspártico e succínico.

Em EP 0 297 294 (Behring) divulga-se a combinação de pelo menos dois aminoácidos como lisina, omitina, arginina, ácido tranexâmico e outros aditivos a pH 5-10. EP 0 156 169 (Asahi) descreve omitina e/ou lisina eventualmente com adição de citrato, glicina ou fosfato e EP 0 228 882 (Genentech) divulga uma formulação que contém arginina com ou sem cloreto assim como com ou sem detergente.

Formulações alternativas de r-PA - em presença de lisina ou de lisina e análogos em soluções tamponizadas com ácido cítrico são também descritas em EP 0 458 950 (Boehringer Mannheim). Novos ensaios mostram, no entanto, que a solubilidade de r-PA nestas formulações ainda não é completamente suficiente. Verificou-se na realidade que a solubilidade é melhorada pela elevação da concentração de citrato; no entanto, as formulações deste tipo não são ou são apenas moderadamente compatíveis com as veias. Além disso, as elevadas concentrações de sal e a baixa temperatura de transição vítrea (Tg’) com ela ligada implicam que a liofílização destas formulações se tenha de realizar a temperaturas inferiores a cerca de -45°C e -50°C. Estas temperaturas são muitas vezes tecnicamente realizáveis apenas com um muito elevado dispêndio e necessitam elementos de controlo e vigilância dispendiosos para medir e regular as condições óptimas para a liofílização. Além disso, por consequência está ligada com um relativamente alto consumo de energia Acontece que frequentemente para a produção à escala técnica em grandes quantidades se utilizam velhas instalações de liofílização que não dispõem de técnica de medição e de regulação suficientemente complicada e em que por consequência em geral não se pode garantir uma temperatura de trabalho de cerca de -45°C. E objectivo da invenção proporcionar formulações de activadores de plasminogénio e seus derivados que sejam bem compatíveis com as veias, contenham a substância activa em concentrações suficientemente altas e garantam uma boa solubilidade da substância activa em que a estabilidade do PA no liofilizado se mantenha durante um intervalo de tempo mais largo. Além disso, é

objectivo da presente invenção desenvolver formulações que também sejam liofilizáveis de maneira segura à escala de produção técnica com o que se possa garantir uma boa qualidade do produto liofilizado reprodutível. O objectivo da presente invenção é atingido por meio de uma composição farmacêutica que contém um activador de plasminogénio em que como aditivos farmacêuticos a composição contém pelo menos um açúcar e ácido tramexânico. A composição está numa forma liofilizada estável em armazenagem durante um intervalo de tempo muito maior. Também a solução injectável aquosa preparada por reconstituição satisfaz o critério da elevada estabilidade de armazenagem. Isto é especialmente o caso em que o valor do pH da solução é regulado para 5,5 - 6,5. Como outros aditivos a composição farmacêutica pode conter as substâncias tampão usuais ou agentes tensioactivos (aniónicos, catiónicos ou neutros).

Por exemplo, para os activadores de plasminogénio (PA) que interessam no sentido da presente invenção utilizou-se o activador de plasminogénio K2P (BM 06.022) que foi descrito mais pormenorizadamente no pedido de patente europeia EP-A-0 382 174. Consiste no domínio Kringel 2 (K2) e no domínio de protease (P) do t-PA humano e por causa da sua expressão em células Escherichia-coli está na forma não glicosilada.

Como açúcares, as formulações de acordo com a presente invenção contêm preferivelmente monossacáridos ou dissacáridos. Como dissacáridos interessam especialmente sacarose, trealose, maltose ou lactose. Os monossacáridos são especialmente a lactose ou o correspondente amino-açúcar, como por exemplo

galactosamina. Preferivelmente utilizam-se os açúcares não redutores sacarose ou trealose. A concentração do açúcar na solução injectável aquosa monta preferivelmente a 40 - 100 mg/ml, preferivelmente está compreendida no intervalo de 50 - 70 mg/ml

Como substâncias tampão as preparações farmacêuticas podem conter as substâncias que interessam usualmente nas composições farmacêuticas para esta finalidade, que são sais de ácidos fortes e bases fracas ou de ácidos fracos e bases fortes. Como exemplos podem mencionar-se : sais de metais alcalinos de ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido málico e semelhantes. Interessam igualmente aminoácidos. Preferivelmente, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção contêm tampão de fosfato. A concentração de tampão de fosfato presente na solução aquosa injectável pronta monta especialmente a 50 - 300 mMol/1, de preferência 80 - 220 mMol/l e de maneira especialmente preferida 130 - 170 mMol/1. Como tampão de fosfato utiliza-se de preferência hidrogenofosfato de dissódio ou de dipotássio que se regula com ácido fosfórico até ao respectivo valor depH.

Como co-dissolvente, as composições de acordo com a invenção contêm ácido tranexânico (TES). A concentração de ácido tranexânico na solução aquosa injectável preparada monta de preferência a 1 - 50 mMol/1, preferivelmente 8-12 mMol/1. De maneira especialmente vantajosa utiliza-se uma concentração de 10 mMol/1. Surpreendentemente, descobriu-se que o ácido tranexânico aumenta a solubilidade de activadores de plasminogénio especialmente de activadores de plasminogénio não glicosilados em meio aquoso. Por exemplo, no caso do derivado

de activador de plasminogénio r-PA, a solubilidade aumenta de preferência pelo menos de um factor igual a 1,5 em relação a uma solução isenta de ácido tranexânico. O factor para o aumento da solubilidade de preferência está compreendido no intervalo de 2 - 3. Este efeito é sobretudo vantajoso no quadro da preparação de composições farmacêuticas liofilizadas de activadores de plasminogénio porque, devido à possibilidade do aumento de concentração do activador de plasminogénio nas soluções utilizadas, a quantidade de água a utilizar no processo de preparação pode ser nitidamente reduzida e consegue-se obter globalmente uma preparação que poupa energia e é mais favorável do ponto de vista de custos. Especialmente encurtam-se dessa forma os tempos de liofilização no processo de preparação.

Como agentes tensioactivos podem-se utilizar agentes tensioactivos não iónicos, aniónicos ou catiónicos, de preferência, no entanto utilizam-se agentes tensioactivos não iónicos, como por exemplo Tween 80® ou Tween 20®. A concentração de agente tensioactivo monta a 0,005 - 0,1 % (peso/volume), de preferência 0,01 %.

Para uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção em forma aquosa é apropriado um valor de pH compreendido entre 5,5 - 6,5, de preferência é utilizado um valor de pH de 5,8 - 6,2.

As composições de acordo com a presente invenção contêm a substância activa numa concentração de até 10 mg/ml, preferivelmente de 3 - 5 mg/ml.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são utilizadas como soluções injectáveis ou de infusão. Isto pode realizar-se proporcionando uma solução já pronta para injectar que possui a composição de acordo com a invenção. E no entanto também possível proporcionar a composição farmacêutica sob a forma de liofílizados. Estes são em seguida reconstituídos de maneira em si conhecida com obtenção de composições ou soluções (por exemplo, com água) para fins injectáveis. Como meio injectável para as composições de acordo com a invenção utiliza-se preferivelmente água, que eventualmente pode conter aditivos isotónicos como por exemplo uma concentração fisiológica de NaCl. São objecto da invenção também o processo para a preparação de uma composição farmacêutica que contém activadores de plasminogénio ou os seus derivados com o valor de pH de 5,5 a 6,5 assim como a sua utilização para a preparação das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção. É além disso objecto da invenção a utilização de uma determinada mistura de substâncias auxiliares farmacêuticas que consistem em excipientes do grupo formado por açúcar e ácido tramexânico para a estabilização durante longo intervalo de tempo dos activadores de plasminogénio. Especialmente vantajosa é em especial uma combinação das substâncias auxiliares açúcar, tampão de fosfato, ácido tranexânico e tensioactivos para se obter uma boa estabilidade de armazenagem.

Ensaios de estabilidade mostram que as composições de acordo com a invenção sob a forma de soluções são estáveis a 4°C pelo menos durante 30 dias. A estabilidade da substância activa nos liofílizados de acordo com a presente invenção monta a cerca de 2 até 5 anos a 4°C. Actua vantajosamente especialmente o facto de que as composições de medicamentos também apresentem uma estabilidade térmica maior característica em condições térmicas mais elevadas que as toma insensíveis

em relação a oscilações de temperatura que por exemplo podem surgir em regiões de climas mais quentes da Terra especialmente no caso de uma interrupção da cadeia de frio. Por causa dos trajectos de venda muitas vezes longos de formas de apresentação farmacêuticas desde o fabricante de medicamentos até ao consumidor final nos diversos países pode não se excluir que as composições estejam guardadas sem cuidados também durante um maior período de tempo que origina uma perda da actividade da proteína e, por consequência, põe em questão o êxito terapêutico do tratamento num caso extremo. As formas de apresentação de acordo com a invenção são no entanto consideravelmente insensíveis em relação a estas oscilações de temperatura. Em ensaios provisórios de estabilidade pôde verificar-se que, em composições mesmo a uma temperatura de 35°C durante um intervalo de tempo de 30 dias, não se pôde detectar influência digna de nota relativamente à estabilidade da proteína É por consequência possível prever que as composições em armazenagem em condições convenientes à temperatura de frigorífico possam possuir uma estabilidade de 2 a 5 anos.

As composições de acordo com a presente invenção têm, além disso, a vantagem de a temperatura de transição vítrea (Tg’) da solução congelada para a preparação dos liofilizados ser relativamente alta e ficar compreendida entre -33°C e -40°C de modo que a reprodutibilidade da qualidade do produto dos liofilizados é garantida com suficiente segurança na produção à escala industrial. A relativamente elevada temperatura de transição vítrea é especialmente vantajosa porque nos aumentos de temperatura exigidos tecnicamente ou imprevistos durante os muitas vezes muito longos tempos de liofilização é garantidamente menor o risco de uma descongelação inadvertida das soluções congeladas. Em muitos casos em que a temperatura de transição vítrea é inferior a -40°C e esta temperatura durante o processo de liofilização não é ultrapassada, o que se realiza especialmente em instalações de liofilização técnicas que trabalham a temperaturas nas proximidades de -45°C, a ultrapassagem indesejada da temperatura de transição vítrea pode originar alterações inconvenientes da solução congelada. Então, não se pode garantir tuna qualidade suficientemente boa do produto. Nesse caso, especialmente em liofilizados que contêm proteína pode verificar-se uma perda da actividade da proteína ou a formação de agregados. Uma outra vantagem das composições de acordo com a presente invenção com uma temperatura de transição vítrea de -33°C a -40°C consiste no facto de que o consumo de energia necessário para o processo de liofilização é minimizado porque o processo de liofilização não deve realizar-se necessariamente a temperaturas inferiores a -50°C.

No caso da presente invenção, podem-se então obter de maneira especial temperaturas de transição vítrea relativamente elevadas para as soluções congeladas se como tampão de fosfato para a liofilização das soluções necessárias se utilizar um sal de potássio como por exemplo hidrogenofosfato de dipotássio ou di-hidrogenofosfato de potássio. Interessa especialmente no caso de hidrogenofosfato de dipotássio uma concentração de 20 - 40 mg/ml, preferivelmente de 20 - 30 mg/ml. O aumento da temperatura de transição vítrea pode ser reforçado pela adição de sacarose. Nesse caso, a sacarose é adicionada de preferência numa concentração de 60-90 mg/ml, em especial de 20-30 mg/ml. De maneira especialmente preferida utiliza-se uma solução que contém aproximadamente 26 mg/ml de hidrogenofosfato

de dipotássio (KjHPO-ι x 12 HaO) e aproximadamente 70 mg/ml de sacarose O pH da solução é de preferência regulado com ácido fosfórico a 85 % (aproximadamente 12 mg/ml) para um valor de 6. Além disso, a solução contém cerca de 0,5 - 5 mg/ml, preferivelmente 1-2 mg/ml de ácido tranexânico, especialmente cerca de 1,6 mg/ml. Além disso podem ainda ser contidos agentes tensioactivos como por exemplo Tween 80® que preferivelmente é utilizado numa concentração de 0,01 - 0,3 mg/ml, em especial cerca de 0,1 mg/ml.

Uma outra vantagem dos liofilizados de acordo com a presente invenção consiste no facto de possuírem um relativamente pequeno teor de humidade residual depois de realizada a liofilização. A humidade residual em geral possui valores inferiores a 5 %, de preferência compreendidos entre 0,5 e 4 %, em especial 1 - 3 %. Usualmente os valores para os liofilizados são superiores a 6 %. A pequena humidade residual faz com que a composição possua uma melhor estabilidade de armazenagem. Composições com teores residuais de humidade maiores originam frequentemente a instabilidade da proteína que se pode reconhecer por perda de actividade biológica ou por formação de agregados.

Uma outra vantagem das composições de acordo com a invenção consiste no facto de, na preparação dos liofilizados, por causa do aumento de solubilidade provocado pela adição de ácido tranexâmico de activadores de plasminogénio não glicosados, em especial no caso da muteína do tipo K2P, K1K2P ou P, ser possível partir de menores volumes (por exemplo, de cerca de 5 ml por forma de apresentação individual) das soluções a congelar de modo que o tempo de liofilização em relação às soluções até agora utilizadas para a preparação de liofiíizados (por exemplo, cerca de 10 ml por unidade de apresentação) é nitidamente encurtado. Preferivelmente parte-se de soluções que contêm a substância activa numa concentração aproximadamente duas vezes mais alta em comparação com as formas de apresentação aquosas prontas para injecção de modo que em vez das soluções até agora utilizadas de 10 ml de soluções aquosas se podem utilizar 5 ml de soluções aquosas.

Ensaios para a compatibilidade com as veias mostram uma muito boa compatibilidade das composições de acordo com a presente invenção.

Os seguintes exemplos de realização devem esclarecer a invenção, sem limitar o âmbito:

Exemplo 1 :

Turvacão das composições de acordo com a presente invenção depois de esforço mecânico / medição da difusão da luz

Regulou-se r-PA (BM 06.022) para uma concentração de proteína (Cp^) igual a 6 mg/ml (ultrafíltração através de uma membrana YM 10) e dialisou-se com o tampão indicado. Em seguida, regularam-se as amostras para Cp,.,* = 4 mg/ml e a) deixaram-se inalteradas, b) guardaram-se com 0,01 % de Tween 80® e c) com 0,01 % de Tween 20® . A aplicação de esforço das amostras realizou-se respectivamente durante 10 segundos num Whirl Mix (Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik VF2, número máximo de rotações). Em seguida, incubaram-se as amostras à temperatura ambiente durante 2 minutos.

A difusão da luz das amostras não carregadas e das amostras carregadas foi medida fluorimetricamente a 25°C (largura da banda : Ex. 360 nm, Em. : 360 nm; Ex.-largura da banda : 3 nm; Em.-largura da banda : 10 nm, intervalo de medição : 10 s durante 3 minutos). Determinou-se respectivamente o valor da difusão das amostras corrigida relativamente à fluorescência do tampão.

Resultado : Foi possível verificar que sem adição de detergentes sob carga mecânica se verifica um considerável aumento da difusão da luz das amostras. O aumento pode ser suprimido o mais concretamente possível pela adição de detergentes. Relativamente à exactidão das medidas não se reconheceu qualquer diferença entre Tween 80® e Tween 20®

Soluções tampão utilizadas

A) 150 mM de Na2HP04/H3P04, pH 6,0 10 mM de TES 50 mg/ml de sacarose a) sem detergente b) com 0,01 % de Tween 80® c) com 0,01 % de Tween 20® B) 150 mM de NajHPOVHjPO^ pH 6,0 10 mM de TEs 50 mg/ml de tre-halose a) sem detergente b) com 0,01 % de Tween 80® c) com 0,01 % de Tween 20®

C) 150 mM de K2HPO4/H3PO4, pH 6,0 lOmMdeTES 50 mg/ml de sacarose a) sem detergente b) com 0,01 % de Tween 80® c) com 0,01 % de Tween 20® D) 150 mM de K2HP04/H3P04, pH 6,0 10 mM de TES 50 mg/ml de tre-halose a) sem detergente b) com 0,01 % de Tween 80® c) com 0,01 % de Tween 20®

Exemplo 2 :

Armazenagem de r-PA (BM 06.0221 em formulações que contêm TES / sacarose de acordo com a invenção // congelação e descongelação repetidas várias vezes

Dialisou-se r-PA com os tampões indicados no Quadro 1 (sem Tween 80), regulou-se a Cprot = 4 mg/ml, guardou-se com Tween 80® a C = 0,01 %, dividiu-se em porções e filtrou-se para esterilização. Congelaram-se respectivamente nove amostras a -20 e a -70°C. Ao fim dos dias indicados no quadro descongelaram--se todas as amostras até se obter os controlos (15 mm a 25°C no banho maria). Analisou-se respectivamente uma amostra (Cpr<* e actividade amidolítica). As restantes amostras foram novamente congeladas a -20 ou -70°C. Depois do fim da

série, determinou-se a actividade do controlo não submetido a congelação.

Resultado : Como os valores do Quadro 1 demonstram, pode congelar-se e descongelar-se r-PA pelo menos 8 vezes sem perda de actividade.

Quadro 1

Na2HP04/H3P04 150 mM, pH 6,0 TES 10 mM Sacarose a 50 mg/ml ...... Tween 80® a 0,01 % -20°C -70°C Dia Cprot [mg/ml] AA [MU/ml] Cprot [mg/ml] AA [MU/ml] 0 4,1 3,1 4,1 3,1 1 4,5 3,1 4,6 3,0 2 4,6 3,2 4,8 3,1 3 4,3 3,1 4,0 3,0 4 4,8 3,1 4,7 3,1 5 4,1 3,3 4,1 3,2 6 4,2 3,0 4,2 3,1 7 4,1 3,1 4,3 3,2 8 4,0 2,9 4,3 3,1 Controlo 4,3 3,0 4,3 3,1 Controlo : Amostra não tratada ensaiada AA: Actividade amidolítica Cp^ : Concentração de proteína

Exemnlo 3 ·

Comparação da estabilidade de r-PA em solução, de diferentes formulações a C^, = 4 mg/ml

Concentrou-se r-PA (BM 06.022) por meio de uma membrana Amicon YM 10 até 5 mg/ml e dialisou-se com os tampões indicados no Quadro 2 (sem Tween 80®). Regularam-se os dialisados a Cp** = 4 mg/ml, guardaram-se com Tween 80® a C = 0,01 %, dividiram-se em porções e armazenaram-se a - 20 e 4°C. Depois de 7, 14, 20 e 30 dias determinaram-se a actividade amidolítica e a concentração de proteína das amostras carregadas.

Resultado : As amostras armazenadas a -20 e 4°C mantiveram-se inalteradas durante 30 dias.

Quadro 2

Na2HP04/H3P04 150 mM, pH 6,0 TES 10 mM Tre-halose a 50 mg/ml Tween 80® a 0,01 % -20°C +4°C Dia Cprot [mg/ml] AA [MU/ml] Cprot [mg/ml] AA [UM/ml] 0 3,9 2,1 7 3,9 2,3 3,97 2,4 14 3,9 2,3 3,98 2,4 20 3,9 2,3 3,9 2,4 30 3,9 2,3 3,9 2,4 AA : Actividade amidolítica Ci-n* : Concentração de proteína

Exemnlo 4 :

Comparação da estabilidade de r-PA em solução de diversas formulações a Cp..- - 6 mg/ml

Dialisou-se r-PA (BM 06.022) contra o tampão mencionado abaixo e regulou-se a Cp^ = 6 mg/ml por concentração através de uma membrana Amicon YM 10. As amostras foram embaladas em porções de 1 ml e armazenadas a - 20 e 4°C durante 30 dias. Depois de 1, 2, 5, 9, 15 e 29 dias foram determinados respectivamente a actividade e o teor de proteína.

Quadro 3

Na2HP04/H3P04 200 mM, pH 6,0 TES 10 mM Sacarose a 50 mg/ml Tween 80® a 0,01 % -20°C +4°C Dia Cprot [mg/ml] AA [MU/ml] Cprot [mg/ml] AA [MU/ml] 0 6,0 3,3 6,0 3,3 1 5,7 3,3 5,7 3,6 2 5,8 3,3 5,9 3,4 5 5,9 3,2 6,0 3,6 9 6,0 3,3 5,9 3,7 15 5,8 3,5 5,9 3,5 29 5,9 3,6 5,9 3,8 AA : Actividade amidolítica Cprot: Concentração de proteína

Quadro 4

Na2HP04/H3P04 150 mM, pH 6,0 TES 10 mM Sacarose a 50 mg/ml Tween 80® a 0,01 % -20°C +4°C Dia Cpn* [mg/ml] AA [MU/ml] Cprot [mg/ml] AA [MU/ml] 0 5,9 3,5 5,9 3,5 1 5,5 3,5 5,6 3,4 2 5,6 3,4 5,5 3,5 5 6,0 3,5 6,2 3,6 9 6,0 3,3 6,0 3,3 15 6,0 3,6 5,9 3,1 29 5,9 3,5 6,0 3,6 AA: Actividade amidolítica Cprot: Concentração de proteína

Resultado : A partir dos valores indicados nos Quadros conclui-se que a substância activa BM 06.022 nas formulações mencionadas é estável a -20°C e 4°C pelo menos durante 29 dias.

Exemplo 5 :

Solubilidade de r-PA nas formulações de acordo com a invenção

Concentrou-se r-PA (BM 06.022) a 6 mg/ml através de YM 10 e dialisou-sc contra o tampão mencionado em baixo. Concentraram-se os dialisados por meio de uma membrana Amicon YM 10 durante o tempo necessário para se formar uma turvação. Depois da centrifugação das amostras, os sobrenadantes foram armazenados a 4°C durante 5 dias. No princípio e no fim da armazenagem, determinaram-se a actividade amidolítica e Cpn*.

Quadro 5

Na2HP04/H3P04 150 mM, pH 6,0 TES 10 mM Sacarose a 50 mg/ml Tween 80® a 0,01 % Dia Cprot [mg/ml] AA [MU/ml] 0 10,2 4,8 5 10,2 4,9 AA: Actividade amidolítica Cprot: Concentração de proteína

Resultado : A solubilidade de r-PA monta a cerca de 10 mg/ml. À concentração máxima de proteína, a amostra pode armazenar-se a 4°C sem alteração da actividade amidolítica pelo menos até 5 dias.

Exemplo 6

Preparação de formas de apresentação líquidas

Prepararam-se as seguintes formas de apresentação como soluções antes da liofilização:

Composição das soluções antes da liofilização

Solução A : BM 06.022 4 mg/ml Na2HP04 x 12 H20 53,72 mg/ml H3P04 85 % 11,3 mg/ml Acido tranexâmico 1,6 mg/ml Sacarose 50 mg/ml Tween 80®, pH 6,0 0,1 mg/ml

Solução B : BM 06.022 4 mg/ml k2hpo4 26,2 mg/ml H3P04 85 % 11,6 mg/ml Acido tranexâmico 1,6 mg/ml Sacarose 70 mg/ml Tween 80®, pH 6,0 0,1 mg/ml

Preparação dos liofilizados

Depois da filtração para esterilização, embalam-se alíquotas de 5 ml em fiascos de vidro de 20 ml. A liofilização realiza-se como se descreve seguidamente : Os fiascos de vidro cheios são colocados num secador de liofilização e congelados a temperaturas compreendidas entre -40 e -50°C de temperatura das placas durante 10 horas à pressão atmosférica. Em seguida, na câmara aplica-se um valor de vácuo de p = 0,01 a 0,1 mbar. Regula-se em seguida a temperatura das placas de tal modo que a temperatura do produto em qualquer momento esteja sempre garantidamente abaixo da temperatura de transição vítrea. Depois de toda a quantidade de gelo ter sido sublimada, aumenta-se a temperatura das placas para um valor de 20 - 40°C e em seguida efectua-se uma post-secagem em vácuo. Determinou-se a humidade residual de acordo com o processo usual (determinação de acordo com o método de Karl Fischer) e na solução A monta a 6 % e na solução B monta a 3 %. A armazenagem dos liofílizados para ensaios de estabilidade realiza-se a temperaturas de 4°C (temperatura de frigorífico), 20°C (temperatura ambiente) e 35°C. A estabilidade dos liofílizados depois de um tempo de armazenagem de 4 a 12 semanas é satisfeita nas temperaturas indicadas como se deduz a partir dos ensaios analíticos relativamente à actividade amidolítica e à concentração de proteína.

Reconstituição dos liofílizados para a aplicação : Os liofílizados são completados até 10 ml com água para injectáveis. Isto corresponde a uma diluição pelo factor 2 em relação ao volume original da solução antes da liofilização.

Exemplo 7 :

Ensaio da compatilidade com as veias das formulações de acordo com a presente invenção

Prepararam-se duas soluções do medicamento e duas soluções de placebo com as composições indicadas no Quadro 6 e administraram-se intravenosamente a coelhos. Como quantidade de aplicação utilizou-se 0,5 ml/animal, para cada uma das quatro soluções de ensaio utilizaram-se cinco animais. 23

Quadro 6

Composição das soluções do medicamento e do placebo 1. Solução do medicamento Ensaio Número 93/1292 Ensaio Número 93/1294 BM 06.022 10 MU 10 MU Hidrogenofosfato de dipotássio 131,0 mg 131,0 mg Ácido fosfórico a 85 % 58 mg 58 mg Ácido tranexâmico 8,0 mg 5,0 mg Sacarose 250,0 mg 350,0 mg Polysorbat 80 0,5 mg 0,5 mg Água para injectáveis ad 10,0 ml ad 10,0 ml PH 6,0 6,0 Osmolaridade 320 mOsmol 351 mOsmol 1. Soluções de placebo Ensaio Número 93/1291 Ensaio Número 93/1293 Hidrogenofosfato de dipotássio 131,0 mg 131,0 mg Ácido fosfórico a 85 % 58 mg 58 mg Ácido tranexâmico 8,0 mg 8,0 mg Sacarose 250,0 mg 350,0 mg Polysorbat 80 0,5 mg 0,5 mg Água para injectáveis ad 10,0 ml ad 10,0 ml PH 6,0 6,0 Osmolaridade 322 mOsmol 343 mOsmol

Resultado : A reacção dos animais à injecção e as observações histológicas mostram que as soluções de ensaio utilizadas são todas bem compatíveis.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Preparação farmacêutica de um activador de plasminogénio que contém açúcar e ácido tranexâmico como único ácido aminocarboxílico e não contém citrato.
2. Preparações de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo facto de o açúcar ser um dissacárido, de preferência sacarose ou tre-halose.
3. Preparação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de a preparação se encontrar sob a forma de uma solução e conter 40 - 100 mg/ml, de preferência 50 - 70 mg/ml de açúcar.
4. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de a preparação se encontrar sob a forma de uma solução e conter 1-50 mmol/1, de preferência 8-12 mmol/1 de ácido tranexâmico.
5. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de a preparação conter 0,005 - 0,1 % (peso/volume), preferivelmente 0,01 % (peso/volume) de agente tensioactivo.
6. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, na qual o activador de plasminogénio é uma proteína do tipo K2P, K1K2P, FK1K2P ou 2 FK2K2P.
7. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, em que o activador de plasminogénio é t-PA ou um derivado de t-PA por anulação ou substituição de um ou vários aminoácidos.
8. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1, 2 ou 5 - 7, caractenzada pelo facto de a forma de apresentação farmacêutica ser um liofilizado.
9. Preparação de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo facto de a forma de apresentação ser uma solução aquosa e o valor do pH da solução estar compreendido entre 5,5 e 6,5.
10. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se transformar activador de plasminogénio em conjunto com um açúcar e ácido tranexâmico numa forma de apresentação farmacêutica apropriada.
11. Utilização de uma combinação das substâncias auxiliares farmacêuticas açúcar, tampão de fosfato, ácido tranexâmico e agente tensioactivo para a preparação de formas de apresentação farmacêuticas de acordo com a reivindicação 1, compatíveis com as veias. 3
12. Utilização de acordo com a reivindicação 11 para a preparação de formas de apresentação com uma estabilidade de armazenagem de pelo menos 2 anos.
13. Utilização de uma combinação das substâncias auxiliares farmacêuticas açúcar e ácido tranexâmico para a estabilização durante longos períodos de tempo de formas de apresentação farmacêuticas de acordo com a reivindicação 1, especialmente para evitar a perda da actividade biológica do activador de plasminogéneo ou para diminuir a formação de agregados nas formas de apresentação farmacêuticas que contêm um activador de plasminogénio. Lisboa, 30 de Novembro de 2001

1269-063 LISBOA