PT765400E - Pesquisa de inibidores de quitinase - Google Patents

Description

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DESCR1CÃ0

"Pesquisa de inibidores de quitinase" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de pesquisa de compostos que inibem a quitinase. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à identificação de compostos antifúngicos, insecticidas e antiparasíticos para utilização na agricultura e aplicações farmacêuticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 polissacárido quitina é um componente da estrutura da parede celular da maioria dos fungos e é o componente mais abundante do esqueleto orgânico dos invertebrados, perfazendo, por exemplo, de cerca de 25 a 60% do peso seco das cutículas de insectos. A quitina consiste principalmente em polímeros lineares do amino-açúcar N-acetil-D-glucosamina, ligados em ligação 1,4—β-glicosídica. Assim, a quitina tem uma grande semelhança com a celulose, o principal polissacárido estrutural de plantas, sendo a única diferença química o facto de que na quitina o grupo hidroxilo na posição 2 é um grupo acetamido em vez de um grupo hidroxilo. Contudo, devido à sua ocorrência disseminada em fungos e artrópodes, a produção mundial total de quitina excede amplamente a da celulose.

Muitos fungos e artrópodes com paredes celulares ou exosqueletos quitinosos são prejudiciais para plantas e animais, causando um grande número de doenças incluindo, mas não se lhes limitando, ocelos do trigo, necrose da bainha do arroz, "damping off”, sarna da maçã, botrítis da pimenta, morte súbita do arroz, cercospora da beterraba sacarina, necrose precoce do tomate, ferrugem das folhas do trigo, e oídio do trigo. Espécies de fungos causam também uma miríade de micoses cutâneas e sistémicas em seres humanos e outros animais, incluindo, mas não se lhes limitando, candidíase, histoplasmose, blastomicose, pneumocistose, esporotricose e criptococose. Os insectos podem actuar como vectores de vírus que provocam encefalites arbovirais, febre amarela, e dengue, protozoários que provocam malárias, tripanossomíases, e

86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ leishmanioses, e vários helmintas prejudiciais. Os crustáceos também são portadores de alguns helmintas e tremátodos infecciosos. A maioria dos fungicidas e dos insecticidas que são utilizados para o controlo e cura destas doenças matando ou controlando os agentes seus causadores, hospedeiros intermediários, ou vectores, empregam vários modos de acção incluindo venenos físicos que sufocam ou dessecam organismos; venenos protoplasmáticos tais como arsénicos que matam por precipitação ou desactivação de proteínas, enzimas ou outros constituintes celulares; venenos respiratórios que desactivam enzimas respiratórias; e vários venenos que afectam diferentes sistemas tissulares tais como túbulos ou nervos. Evidentemente, os agentes preferidos não prejudicam a planta ou animal hospedeiros, e mais preferivelmente não têm sequer qualquer efeito sobre o hospedeiro. Devido à complexidade e interdependência de processos vitais, contudo, este objectivo não é sempre conseguido, de modo que muitos fungicidas e insecticidas exibem alguma toxicidade para o hospedeiro. Outros provocam efeitos laterais inesperados.

Uma vez que a quitina não é um constituinte usual da maioria das plantas e dos vertebrados, podem-se empregar inibidores da biossíntese de quitina como agentes antifúngicos e/ou insecticidas selectivos. Aplicados a plantas ou animais, ornamentais ou comestíveis, estes oferecem a vantagem de ter como alvo fungos ou insectos indesejáveis sem prejudicar significativamente a planta ou o animal vertebrado hospedeiros. Apesar de ter sido dada muita atenção à síntese de quitina têm havido muito poucos estudos que tenham como alvo pesquisas que explorem a degradação da quitina. A 1 -(2,6-diclorobenzoil)-3-(3,4-diclorofenil)ureia, por exemplo, tem sido sugerida como um insecticida inibidor de quitina. Os antifúngicos que se verificou que também inibiam a síntese de quitina incluem a cicomicina e a polioxina D.

Somers et ai., no Journal of Antibiotics, Volume XL, N°12, Maio de 1987 ("Methods for the detection and quantification of chitinase inhibitors in fermentation broths; Isolation and insect life cicie effect of A82516", páginas 1751 et seq.) descrevem um método de pesquisa de inibidores de quitinase em caldos de fermentação em bruto como um meio para identificar novas pistas de insecticidas. Somers descreve a utilização de produtos da degradação da quitina acoplados a pigmento violeta brilhante 5R, Remazol, solúveis, libertados do

86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ substrato azureto de quitina insolúvel, por hidrólise com quitinase de Steptomyces griseus. O método de Somers detecta inibidores desta reacção por medição da diminuição da absorvância (570 nm) do filtrado. É um objectivo da presente invenção proporcionar um teste de pesquisa para a identificação de agentes que exibem potencial actividade fungicida e insecticida para uma vasta variedade de utilizações agrícolas, médicas e farmacêuticas. Este e outros objectivos são atingidos pela presente invenção, que é dirigida a um método de pesquisa de compostos úteis como agentes antifúngicos, insecticidas e antiparasíticos. 0 método preferido utiliza células que compreendem um gene CTS de Saccharomyces cerevisiae, transportado por um plasmídeo, que permite a super-expressão de quitinase. Os compostos que inibem uma acção hidrolítica sobre metilumbeliferiltriacetilquitotriose, mas que não são tóxicos para as células, são detectados por diminuição na conversão de substrato. A presente invenção permite a pesquisa de grandes volumes de produtos químicos e de fermentações quanto a inibidores de quitinase para aplicações como insecticidas, antiparasíticos e fungicidas.

DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A identificação da maior parte dos produtos químicos agrícolas e farmacêuticos resultou, pelo menos em parte, da pesquisa de bibliotecas de produtos químicos ou de produtos naturais. São bem conhecidos dos peritos na arte, e foram descritos, vários sistemas de pesquisa que empregam células de mamífero ou células de levedura.

Na prática da presente invenção, incubam-se amostras de teste na presença de culturas de quaisquer espécies de fungos que produzam quitina, tais como fungos unicelulares. Um método preferido emprega a levedura de padeiro comum, a Saccharomyces cerevisiae, porque esta é prontamente disponível e fácil de cultivar.

Um método preferido compreende a adição de uma amostra de teste a uma cultura de Saccharomyces cerevisiae. A amostra de teste é introduzida num disco ou num poço de uma placa de cultura num ensaio de difusão Standard utilizando meios solidificados, ou é introduzida em um de uma série de

86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ tubos ou frascos de cultura de tecidos equivalentes num ensaio de turbidez Standard utilizando meios líquidos. A cultura é incubada durante um tempo e sob condições suficientes para se observar inibição do crescimento das células de levedura numa cultura ou área da placa de cultura, correspondentes. A magnitude do crescimento da cultura que contém ou está rodeada pela amostra de teste é comparada com a magnitude do crescimento na cultura ou área da cultura que não contêm amostra de teste. A magnitude da toxicidade da amostra de teste é determinada observando se o crescimento na presença de amostra de teste é substancialmente igual ao crescimento na sua ausência. A presente invenção baseia-se na expressão de quitinase na superfície celular das leveduras e na detecção de actividade enzimática com um substrato por observação da magnitude da conversão do substrato.

Qualquer tipo de substrato para a quitinase que permita uma fácil detecção da actividade enzimática pode ser empregue, incluindo substratos fluorescentes, pigmentos coloridos e substratos turvos que ficam límpidos quando expostos à actividade da enzima. Os exemplos de substratos incluem: quitina coloidal, glicolquitina, 3,4-dinitrofenil-tetra-N-acetilquitotetraósido, 4-metil-umbeliferil-di-N-acetilquitobiósido, 4-metil-umbeliferil-tri-N- acetilquitotriósido, ou 4-metil-umbeliferil-tetra-N-acetilquitotetraósido.

Podem ser empregues no método da presente invenção, como culturas, quaisquer tipos de meios solidificados ou líquidos que suportem o crescimento e a reprodução de S. cerevisiae. São conhecidos dos peritos numerosos meios para leveduras, e estes incluem, por exemplo, dextrose sintética (SD) para leveduras contendo glucose, vitaminas, minerais, e água. Os meios preferidos são solidificados por adição de ágar ou gelatina; são especialmente preferidos os meios solidificados com ágar. O crescimento em culturas solidificadas é normalmente observado visualmente na forma de áreas turvas de crescimento em torno de discos ou poços na placa de cultura. O crescimento em culturas líquidas é observado visualmente, mas normalmente é determinado por espectrofotometria na forma de aumento de densidade óptica (OD) a cerca de 550 a 650 nm.

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Uma distinta vantagem da invenção é a sua velocidade e simplicidade. A levedura de padeiro é prontamente disponível e é barata. Utilizando meios solidificados em placas de cultura, o protocolo é extremamente simples. Podem facilmente ser analisadas muitas amostras num curto período de tempo.

Outra vantagem da invenção é o facto de que são necessárias para o teste apenas pequenas quantidades de agentes químicos ou bioquímicos. Num ensaio Standard, por exemplo, que emprega meios solidificados numa placa, pode-se aplicar uma amostra de teste de produto químico ou bioquímico tão pequena quanto 20 pg num disco ou num poço.

Numa concretização preferida da presente invenção, a pesquisa baseia-se na expressão de quitinase em excesso na superfície das células e na detecção directa da actividade enzimática com um substrato fluorescente. Esta concretização é conseguida utilizando células de levedura transformadas com um plasmídeo portador do gene da quitinase. As células de levedura transformadas são dispersas e crescidas em ágar, é aplicado o substrato e a magnitude da reacção é ensaiada por observação da placa sob iluminação ultravioleta.

Numa concretização preferida da invenção, o substrato fluorescente é 4-metil-umbeliferil-tri-N-acetilquitotrióxido (MUC).

Numa concretização preferida da invenção, o gene da quitinase é transportado no plasmídeo pCT21 que é essencialmente o mesmo que o plasmídeo pCT3 (Kuranda, M. J. e Robbins, P. W., (1987) Proc. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 84, 2585-2589) com a excepção de que as sequências do vector compreendem o bem conhecido e disponível no comércio YEp24 em vez do YEAp24 descrito. O pCT21 super-expressa quitinase, 4-25 vezes mais que as células do tipo selvagem que não possuem o plasmídeo.

Numa concretização particularmente preferida, a presente invenção compreende uma pesquisa primária e uma pesquisa secundária que aumenta tanto a sensibilidade como a especificidade da invenção. Um perito na arte deve entender que a presente invenção pode ser posta em prática utilizando apenas a pesquisa primária, apenas a pesquisa secundária ou uma combinação da pesquisa primária e da pesquisa secundária. Um perito na arte também deve ter

86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ em conta que a pesquisa primária pode ser posta em prática após a pesquisa secundária, dependendo do objectivo último da invenção.

As pesquisas Standard, in vitro and in vivo, de identificação de fungicidas e insecticidas são empregues como testes terciários para dar prioridade a agentes activos das presentes pesquisa primária e pesquisa secundária. Estas pesquisas in vitro testam as amostras quanto à sua capacidade para inibir o crescimento de fungos fitopatogénicos seleccionados cultivados em ágar nutriente (ou insectos). Estes incluem fungos causadores de ocelos do trigo (Pseudocercosporella herpotrichoides), necrose da bainha do arroz (Rhizoctonia sofani) e "damping o ff" (Fusarium oxysporum); todos sintetizam paredes celulares contendo quitina.

Em pesquisas in vivo, são utilizados vários fungos fitopatogénicos para infectar plantas tratadas com compostos de teste. Os compostos activos bloqueiam ou reduzem o aparecimento de sintomas da doença. São empregues na pesquisa vários modelos de infecções de plantas e estes incluem fungos contendo quitina que provocam sarna da maçã (Venturia inaequalis), botrítis da pimenta (Botrytis cincerea), morte súbita do arroz (Pyricu/air oryzae), cercospora da beterraba sacarina (Cercospora betico/a), necrose precoce do tomate (.Alternaria solani), ferrugem das folhas do trigo (Puccinia recôndita tritici), e oídio do trigo (Erysiphe graminis tritici). Os compostos de teste mais potentes nestes ensaios são activos na gama dos 10 ppm.

Os exemplos que se seguem são apresentados para adicionalmente ilustrar e explicar a presente invenção e não devem ser considerados como limitantes em qualquer aspecto.

Exemplos

Exemplo 1 - PREPARAÇÃO DE EXTRACTOS DE LEVEDURA (Extracto de auitinase)

Inoculam-se 200 ml e crescem-se EC18-4B pCT para pesquisa primária. Centrifuga-se a cultura a 300 rpm durante 10 min. Verte-se o sobrenadante, volta-se a centrifugar 1 min e remove-se o sobrenadante restante. Ressuspendem-se as células em 4x1 ml de tampão (Mes 25 mM -digitonina a

86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ 7 0,1% -2-mercaptoetanol a 0,1%, ρΗ 6,3, para a quitinase; citrato de Na 0,1 M, pH 5,0 para a glucanase) num tubo de centrífuga com tampa de rosca. Adicionam-se contas de vidro de aproximadamente 0,5 mm imediatamente abaixo do menisco e submete-se a vórtex vigoroso ou colocam-se num Mini-Bead-Beater durante aproximadamente 2 minutos. Remove-se o líquido, lavam-se as contas com 0,5ml de tampão, adiciona-se a lavagem ao resto do extracto. Centrifuga-se a 10 000 rpm durante 2 minutos. Remove-se o sobrenadante, mede-se o seu volume e adiciona-se 1/2 do volume de glicerol e submete-se a vórtex suave. Armazena-se em alíquotas a -80°C (os extractos são depois testados no ensaio enzimático apropriado para assegurar suficiente actividade e linearidade ao longo do tempo. O padrão é 5 iil e 45 minutos) a 30°C.

Exemplo 2 - ENSAIO ENZIMÁTICO PRIMÁRIO IN VITRO

Crescem-se as células até à fase estacionária (durante a noite) em SD mais suplementos sem ágar e sem cloranfenicol. As necessidades de uracilo são fornecidas pelo plasmídeo contendo o gene da quitinase, pCT21. Para reter o plasmídeo NÃO deve ser adicionado uracilo. As células podem ser armazenadas durante uma semana ou mais após a sua suspensão no meio de ágar e decantar a placa. Para pesquisa em grande escala, de alta capacidade, adiciona-se glicerol estéril (15% do volume final) à culturas frescas, em fase estacionária, e armazena-se a -80°C em alíquotas apropriadas para o volume da placa de teste.

Quando se utilizam células congeladas, deixam-se descongelar até à temperatura ambiente e submetem-se a vórtex. Adicionam-se as células a 1:50 a SD mais suplementos (com cloranfenicol quando se testam e produtos naturais) que tenha sido fundido e arrefecido a cerca de 50°C. Deixa-se solidificar e aplicam-se os compostos com um Clonemaster, ou poços talhados e adicionam-se as fermentações roboticamente. O controlo positivo é alosamidina (1,25 pg).

Deixam-se as células crescer 24 horas a 30°C.

Funde-se a sobrecamada de ágar de ensaio, arrefece-se a cerca de 50°C, e adiciona-se MUC. Mistura-se bem e aplica-se à placa situada numa superfície 86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ 8

nivelada para uma distribuição homogénea do ágar mole. Uma placa quadrada grande que leva 1 50 ml de ágar requer 330 ml de sobrecamada.

Quando as placas arrefecem, colocam-se de novo a 30°C e classificam-se após cerca de duas horas.

Alternativamente, o MUC pode ser adicionado directamente ao SD mais suplementos ao mesmo tempo que as células são adicionadas. Neste caso, não é necessária a sobrecamada de ágar de ensaio.

Usando óculos de protecção contra os UV, colocam-se as placas num transiluminador de UV (sem tampa, com o ágar voltado para baixo) e observa-se o nível de fluorescência azul em torno dos poços. Marcam-se os poços com fluorescência diminuída (em comparação com a alosamidina). À luz normal, determina-se se a diminuição de fluorescência se deve a inibição do crescimento. Classifica-se como positivo um composto que diminui a fluorescência mas não inibe o crescimento.

Para imitar a inibição da quitinase, aplicam-se várias soluções de pH elevado (que se sabe inibir a quitinase) para discos de filtração e colocam-se sobre o ágar. Obtém-se boa fluorescência após aplicação da sobrecamada de substrato, e observa-se uma zona de inibição apenas com as soluções mais fortemente alcalinas testadas (e.g. NaOH 10M). Outro material concebido para imitar fermentações e os potenciais compostos interferentes (proteases [e.g. 10 mg/ml] Proteinase K, tripsina), capacidade tampão) verificou-se não causarem um sinal falso positivo. Agentes antimicrobianos de teste são desnecessários nesta pesquisa uma vez que antifúngicos e outros compostos que inibem o crescimento de forma não específica são classificados como negativos. Sabe-se que a alosamidina, um análogo do substrato natural, quitina, inibe as quitinases de Bombyx mori e Saccharomyces, mas não as quitinases de plantas (e.g. a enzima de inhame). A alosamidina é muito claramente positiva a cerca de 1,25-2,5 pg por aplicação. Contudo, o composto mais recentemente identificado, desmetilalosamidina, mostrou ser 100 vezes mais activo do que a alosamidina e deve ser observável a 0,0125 pg por aplicação (500 ng/ml). A aplicação do composto numa concentração elevada em DMSO sobre a superfície do ágar como se faz para outras pesquisas em placas de grande volume funciona tão bem como a aplicação de discos de filtração. Os melhores resultados para 86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ 9

placas "com poços" obtêm-se aplicando os compostos em 25 μΙ no poço. Numa experiência de reconstrução "repicaram-se" 10 caldos de fermentação, aleatoriamente escolhidos, com 5 pg de alosamidina em 25 μΙ e aplicam-se a uma placa de pesquisa primária. Todos os 10 poços são claramente positivos, enquanto que os mesmos caldos sem a alosamidina são negativos. O ensaio secundário é muito mais sensível. A alosamidina inibe a quitinase para aproximadamente o nível de 50% a uma concentração final de 100 ng/ml no ensaio. Não é detectável qualquer inibição de glucanase. A pesquisa é testada com trinta e quatro compostos de teste Standard que representam vários modos de acção bem como com setenta e seis compostos que compreendem um painel de antibióticos Standard, como descritos nas Tabelas 1 e 2. Todos eram negativos, tal como o são o fermanatião 44D048, a aristeromicina, o diflubenzurão (dimilin) e os conhecidos inibidores de quitina-sintase, polioxina e nicomicina.

Na pesquisa de um banco de produtos químicos consideraram-se aproximadamente 0,03% dos compostos como positivos na pesquisa primária. Após processamento de mais de 20 000 produtos químicos, nenhum passou a pesquisa secundária. Para produtos naturais a pesquisa primária resulta em 0,9% de activos, mas em mais de 15 000 ensaios apenas 2 (0,013%) passaram a pesquisa secundária. 10 86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ

Tabela 1

Painel de Fungicidas Standard Composto Alvo amfotericina B cerulenina haloprogina cetoconazolo miconazolo diniconazolo econazolo fenarimolo tridemorf tolnaftato U18666A ciclo-heximida polioxina D nicomicina nocodazolo membrana plasmática (polieno) biossíntese de ácidos gordos respiração biossíntese de ergosterol(lanosterol-14a-desmetilase biossíntese de ergosteroldanosterol-14a-desmetilase) biossíntese de ergosterol(lanosterol-14a-desmetilase) biossíntese de ergosterol(lanosterol-14a-desmetilase) biossíntese de ergosterol(esterol-d14-reductase) biossíntese de ergosterol(esterol-d14-reductase) biossíntese de ergosterol(esqualeno-mono-oxigenase) biossíntese de ergosterol(esqualeno-ciclase) biossíntese de proteínas biossíntese de quitina (parede celular) biossíntese de quitina (parede celular) microtúbulo benomilo microtúbulo maneb metalaxilo múltiplos alvos biossíntese de ARNr vinclozolina canamicina peroxidação de lípidos mitocôndria tunicamicina carboxina cianobutarato biossíntese de glicoproteínas succinato-desidrogenase microtúbulo (plantas) antimicina glifosato fosfinotricina aminotriazolo sulfometurão metílico metilpendimetalina respiração herbicida (biossíntese de aminoácidos aromáticos) herbicida (biossíntese de glutamina) herbicida (biossíntese de histidina) herbicida (biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada) herbicida (microtúbulo)

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Tabela 2

Painel de antibióticos Standard pimaricina (tenecetina) estreptogramina ("tipo") monazomicina nistatina aspartocina bacitracina clavicina citrinina avoparcina isoquinociclina neutramicina A1 531 leucomicina A0341a angustmicina A & C gliotoxina ácido giberélico puromicina puromicina aminonucleósido BM1 23a etamicina mocimicina neomicina viomicina netropsina lincomicina picromicina A9537 AN272a levomicina AM374 antiprozoína BL580 zeta ácido actitiázico hamicina carbomicina frenolicina ácido fusarínico BL580a tilosina declomicina tetra-hidroespiramicina ácido úsnico geldanamicina Z122AO BM782a B02964 complexo cloranfenicol A8363 actinomicina BM123a AD97 fenazina a paromomicina estreptomicina A4825 B02964 complexo nucleocidina nonactina valinomicina C19004 complexo avilamicina V214W V214X vancomicina ristocetina relomicina C08078a blastocidina S 4-desdimetilamino-4-metilamino-anidro-tetraciclina

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Exemplo 3 - ENSAIO ENZIMÁTICO SECUNDÁRIO IN VITRO

Os agentes activos da pesquisa primária são conduzidos à pesquisa secundária que demora cerca de 2 horas para realizar o ensaio de várias dúzias de amostras, incluindo a preparação e a análise. Esta consiste em dois ensaios in vitro com enzimas diferentes: glucanase e quitinase (o alvo). Caldos que inibem a quitinase mas não a glucanase nestes testes são considerados positivos. Aqueles que apresentam um diferencial absoluto para estas enzimas são pistas de primeira prioridade. Caldos que apresentam uma inibição superior ao dobro da inibição da quitinase versus a glucanase devem ser seguidos com prioridade secundária.

Para cada positivo na pesquisa primária são realizados dois ensaios enzimáticos em poços de uma placa de microtítulo. Para cada conjunto de ensaios, faz-se uma Mistura de tampão, substrato e água, e adiciona-se caldo de fermentação e enzima:

Quitinase: Mistura = citrato de Na 1 M: 1 /4 de MUC: água, 5:10:20 Por ensaio:

Mistura 35 μΙ Caldo ou água (controlo) 10 μΙ Extracto de quitinase 5 μΙ

Incuba-se durante 45 min a 30°C, depois adicionam-se 100 μΙ de glicina -NaOH, mistura-se.

Glucanase: Mistura = citrato de Na 1M:MUG:água, 5:10:20 Por ensaio:

Mistura 35 μΙ Caldo ou água (controlo) 10 μΙ Extracto de quitinase 5 μΙ 13 86 003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ

Incuba-se como para a quitinase. Lêem-se ambos os ensaios num a fluorímetro (350 nm de excitação, 440 nm de emissão). Comparam-se os controlos para cada um para verificar o efeito do caldo em cada. Os caldos que inibem a quitinase pelo menos duas vezes mais do que inibem a glucanase são considerados positivos.

Lisboa, 13. nr SK&)

Por AMERICAN CYANAMID COMPANY

Claims (11)

1. 86003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES

   1. Método de pesquisa de amostras de teste quanto a inibição da biossíntese de quitina incluindo um ensaio enzimático primário in vivo e um ensaio enzimático secundário in vitro, compreendendo o referido ensaio primário os passos de: (a) adição da amostra de teste a uma cultura de leveduras que produzem quitinase, contendo a referida cultura um substrato para a quitinase; (b) incubação da referida amostra de teste na referida cultura sob condições suficientes para detectar inibição da actividade enzimática da quitinase; (c) comparação da magnitude da conversão do substrato numa área em torno da amostra de teste com a magnitude da conversão de substrato numa área sem a referida amostra de teste; (d) determinação da presença de inibição da quitinase por observação da magnitude da conversão do substrato; e compreendendo o ensaio secundário os passos de: (e) adição de uma amostra de teste que apresenta uma inibição da quitinase no referido ensaio primário a dois ensaios enzimáticos secundários, sendo os referidos ensaios enzimáticos secundários seleccionados de entre o grupo que consiste em um ensaio com de quitinase e pelo menos um outro ensaio enzimático de controlo, em que o ensaio detecta a actividade de uma enzima que não a quitinase; (f) incubação da referida amostra de teste nos referidos ensaios enzimáticos secundários sob condições suficientes para detectar inibição da quitinase e inibição do referido ensaio enzimático de controlo; (g) comparação simultânea da inibição da quitinase e da inibição da enzima de controlo; e (h) determinação de se a magnitude da inibição da quitinase é maior do que a inibição da enzima de controlo.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a cultura de leveduras superproduz quitinase.

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3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2 em que a cultura de leveduras compreende o plasmídeo pCT21.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a actividade enzimática da quitinase é detectada com um substrato fluorescente.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a actividade enzimática da quitinase é detectada com um substrato pigmento colorido.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a actividade enzimática da quitinase é detectada com uma clarificação de turbidez.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o substrato é seleccionado de entre o grupo que consiste em quitina coloidal, glicolquitina, 3,4-dinitrofenil-tetra-N-acetilquitotetraósido, 4-metilumbeliferil-di-N- acetilquitobiósido, 4-metilumbeliferil-tri-N-acetilquitotriósido e 4-metilumbeliferil-tetra-N-acetilquitotetraósido.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o substrato é 4-metilumbeliferil-tri-N-acetilquitotriósido e 4-metilumbeliferil-tetra-N-acetilquitotetraósido.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1 em que inibidores da quitinase conhecidos que são seleccionados de entre o grupo constituído por alosamidina ou desmetilalosamidina, são utilizados como controlos positivos para medir a inibição da quitinase.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o ensaio enzimático de controlo do passo (e) é o ensaio com glucanase.
11. 11. Método de pesquisa de amostras de teste quanto a degradação da quitina num ensaio enzimático primário compreendendo os passos de: t (a) adição da amostra de teste a uma cultura de leveduras que produzem quitinase, contendo a referida cultura um substrato para a quitinase; (b) incubação da referida amostra de teste na referida cultura sob condições suficientes para detectar inibição da actividade enzimática da quitinase; 86003 ΕΡ 0 765 400/ΡΤ 3/3 (c) comparação da magnitude da conversão do substrato na área em torno da amostra de teste com a magnitude da conversão de substrato na área sem a referida amostra de teste; (d) determinação da presença de inibição da quitinase por observação da magnitude da conversão do substrato. Lisboa, 13. Pt' M

    Por AMERICAN CYANAMID COMPANY - O AGENTE OFICIAL -