PT770136E

PT770136E - Método para selecção de células hospedeiras de alta expressão

Info

Publication number: PT770136E
Application number: PT95928192T
Authority: PT
Inventors: Craig W Crowley
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 2007-05-31
Also published as: IL114820A0; CA2195303A1; WO1996004391A1; JP4528940B2; JPH10503376A; AU704408B2; DK0770136T3; CA2195303C; AU3204595A; ATE353970T1; DE69535389D1; EP0770136B1; DE69535389T2; ES2282994T3; MX9700852A; US5561053A; EP0770136A1; JP2006296438A

Description

ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Método para selecção de células hospedeiras de alta expressão"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo do Invento O presente invento refere-se a um método de selecção de células hospedeiras de alta expressão, um método de produção de uma proteína de interesse a níveis elevados e um método de produção de células eucariotas possuindo múltiplas cópias de uma sequência que codifica uma proteína de interesse.

Descrição da Arte Anterior e Relacionada O estabelecimento de métodos para introdução de ADN em células hospedeiras vivas numa forma funcional proporcionou a chave para compreender muitos processos biológicos fundamentais e tornou possível a produção de importantes proteínas e outras moléculas em quantidades comercialmente úteis .

Apesar do sucesso geral de tais métodos de transferência de genes, existem vários problemas vulgares que podem limitar a eficácia com que um gene que codifica uma proteína desejada pode ser introduzido e expresso numa célula hospedeira. Um problema é conhecer quando o gene foi transferido com sucesso para células receptoras. Um segundo problema é distinguir entre as células que contêm o gene e as que sobreviveram aos procedimentos de transferência mas que não contêm o gene. Um terceiro problema é a identificação e o isolamento das células que contêm o gene e que expressam níveis elevados da proteína codificada pelo gene.

Em geral, os métodos conhecidos para introdução de genes em células eucariotas tendem a ser altamente ineficientes. Das células numa dada cultura, apenas uma pequena proporção toma e expressa o ADN exógeno adicionado e uma proporção ainda mais pequena mantém estavelmente esse ADN. 2 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ A identificação das células que incorporaram um gene de produto codificando uma proteína desejada é tipicamente alcançada através da introdução nas mesmas células de outro gene, vulgarmente referido como gene seleccionável, que codifica um marcador seleccionável. Um marcador seleccionável é uma proteína que é necessária para o crescimento ou a sobrevivência de uma célula hospedeira sob as condições de cultura particulares escolhidas, tal como uma enzima que confira resistência a um antibiótico ou outro fármaco, ou uma enzima que compense um defeito metabólico ou catabólico na célula hospedeira. Por exemplo, genes seleccionáveis vulgarmente utilizados com células eucariotas incluem os genes para a aminoglicósido-fosfotransferase (APH), higromicina-fosfotransferase (hyg), di-hidrofolato-redutase (DHFR), timidina-quinase (tk), neocinina, puromicina, glutamina-sintase e asparagina-sintase. O método de identificação de uma célula hospedeira que incorporou um gene com base na expressão pela célula hospedeira de um segundo gene incorporado codificando um marcador seleccionável é referido como co-transfectação (ou co-transfecção). Nesse método, um gene codificando um polipéptido desejado e um gene de selecção são tipicamente introduzidos na célula hospedeira simultaneamente, embora possam ser introduzidos sequencialmente. No caso de co-transfecção simultânea, o gene codificando o polipéptido desejado e o gene seleccionável podem estar presentes numa única molécula de adn ou em moléculas de adn separadas antes de serem introduzidos nas células hospedeiras. Wingler et al., Cell 16: 777, 1979. As células que incorporaram o gene codificando o polipéptido desejado são então identificadas ou isoladas através da cultura das células sob condições que preferencialmente permitem o crescimento ou a sobrevivência das células que sintetizam o marcador seleccionável codificado pelo gene seleccionável. O nível de expressão de um gene introduzido numa célula hospedeira eucariota depende de múltiplos factores, incluindo o número de cópias do gene, a eficiência da transcrição, o processamento do ARN mensageiro (ARNm), a estabilidade e a eficiência da tradução. Assim, a expressão de nível elevado 3 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ de um polipéptido desejado envolverá tipicamente a optimização de um ou mais desses factores.

Por exemplo, o nível de produção de proteína pode ser aumentado ligando covalentemente a sequência de codificação do gene a um promotor ou estimulador "forte" que dará níveis elevados de transcrição. Os promotores e estimuladores são sequências nucleotídicas que interagem especificamente com proteínas numa célula hospedeira que estão envolvidas na transcrição. Kriegler, Meth. Enzymol. 185: 512, 1990;

Maniatis et al., Science 236: 1237, 1987. Os promotores situam-se a montante da sequência de codificação de um gene e facilitam a transcrição do gene através da ARN-polimerase. Entre os promotores eucariotas que foram identificados como promotores fortes para expressão de elevado nível estão o promotor inicial de SV40, o promotor tardio principal de adenovírus, o promotor da metalotioneína I de ratinho, a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous e o promotor inicial imediato do citomegalovírus humano (CMV).

Os estimuladores estimulam a transcrição a partir de um promotor ligado. Ao contrário dos promotores, os estimuladores são activos quando colocados a jusante do local de início da transcrição ou a distâncias consideráveis do promotor, embora na prática os estimuladores se possam sobrepor fisicamente e funcionalmente aos promotores. Por exemplo, todos os promotores fortes listados acima contêm também estimuladores fortes. Bending, Genetic Engineering 7: 91 (Academic Press, 1988) . O nível de produção proteica pode também ser aumentado através do aumento do número de cópias do gene na célula hospedeira. Um método para obtenção de um elevado número de cópias de um gene é introduzir directamente na célula hospedeira múltiplas cópias do gene, por exemplo, através da utilização de um grande excesso molar do gene de produto relativamente ao gene seleccionável durante a co-transfecção. Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 537, 1990. No entanto, com este método apenas uma pequena proporção das células co-transfectadas conterá o gene de produto em elevado número de cópias. Para além disso, porque não existe um método geralmente aplicável, conveniente para distinguir tais 4 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ células da maioria das células que contêm menos cópias do gene de produto, são tipicamente necessários métodos de pesquisa trabalhosos e demorados para identificar os transfectantes de elevado número de cópias desejados.

Outro método para obtenção de elevado número de cópias do gene envolve a clonagem do gene num vector que é capaz de se replicar autonomamente na célula hospedeira. Exemplos de tais vectores incluem vectores de expressão de mamífero, derivados de vírus de Epstein-Barr ou do vírus do papiloma bovino, e vectores do plasmídeo de levedura de 2 micrómetros. Stephens & Hentschel, Biochem. J. 248: 1, 1987; Yates et al., Nature 313: 812, 1985; Beggs, Genetic Engineering 2: 175, (Academic Press, 1981).

Outro método ainda para obtenção de um elevado número de cópias do gene envolve a amplificação do gene na célula hospedeira. A amplificação génica ocorre naturalmente em células eucariotas a uma frequência relativamente baixa. Schimke, J. Biol. Chem. 263: 5989, 1988. Contudo, a amplificação génica pode também ser induzida, ou pelo menos seleccionada, através da exposição das células hospedeiras a uma pressão selectiva apropriada. Por exemplo, em muitos casos é possível introduzir um gene de produto juntamente com um gene amplificável numa célula hospedeira e subsequentemente seleccionar a amplificação do gene marcador através da exposição das células co-transfectadas a concentrações sequencialmente crescentes de um agente selectivo. Tipicamente o gene de produto será co-amplifiçado com o gene marcador sob tais condições. 0 gene amplificável mais amplamente utilizado para esse objectivo é um gene de DHFR, que codifica uma enzima di-hidrofolato-redutase. 0 agente de selecção utilizado em conjunto com um gene de DHFR é o metotrexato (Mtx) . Uma célula hospedeira é co-transfectada com um gene de produto codificando uma proteína desejada e um gene de DHFR, e os transfectantes são identificados cultivando primeiro as células em meio de cultura que contém Mtx. Uma célula hospedeira adequada quando é utilizado o gene de DHFR de tipo selvagem é a linha celular de Ovário de Hamster Chinês (CHO) deficiente na actividade de DHFR, preparada e propagada tal 5 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ como descrito por Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980. As células transfectadas são então expostas a quantidades sucessivamente maiores de Mtx. Isto conduz à síntese de múltiplas cópias do gene de DHFR, e concomitantemente, múltiplas cópias do gene de produto. Schimke, J. Biol. Chem. 263: 5989, 1988; Axel et al., Patente U.S. N.° 4399216; Axel et al., Patente U.S. N.° 4634665.

Outras referências dirigidas à co-transfecção de um gene juntamente com um marcador genético que permite a selecção e subsequente amplificação incluem Kaufman em "Genetic Engineering", ed. J. Setlow (Plenun Press, New York), Vol. 9, 1987; Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601, 1982; Ringold et al., J. Mol. Appl. Genet. 1: 165-175, 1981; Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5: 1750-1759, 1985; Kaetzel e Nilson, J. Biol. Chem. 263: 6244-6251, 1988; Hung et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 83: 261-264, 1986; Kaufman et al., EMBO J. 6: 87-93, 1987; Johnston e Kucey, Science 242: 1551-1554, 1988; Urlaube et al., Cell 33: 405-412, 1983.

Para alargar o método de amplificação de DHFR a outros tipos celulares, pode ser utilizado um gene de DHFR mutante que codifique uma proteína com sensibilidade reduzida ao metotrexato em conjunto com células hospedeiras que contêm um número normal de um gene de DHFR de tipo selvagem endógeno. Simonsen e Levinson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 2495, 1983; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 3567- 3570, 1980; Haber e Schimke, Somatíc Cell Genetics 8: 499- 508, 1982.

Alternativamente, as células hospedeiras podem ser co-transf ectadas com o gene de produto, um gene de DHFR e um gene seleccionável dominante, tal como um gene neor. Kim e

Wold, Cell 42: 129, 1985. Capon et al., Pat. U.S. N.° 4965199. Os transfectantes são identificados cultivando primeiro as células em meio de cultura contendo neomicina (ou o fármaco relacionado G418) e os transfectantes assim identificados são então seleccionados para amplificação do gene de DHFR e do gene de produto através de exposição a quantidades sucessivamente crescentes de Mtx.

Tal como será apreciado a partir desta discussão, a selecção de células hospedeiras recombinantes que expressam 6 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ elevados níveis de uma proteína desejada é geralmente um processo de múltiplos passos. No primeiro passo, são seleccionados transfectantes iniciais que incorporaram o gene de produto e o gene seleccionável. Nos passos subsequentes, os transfectantes iniciais são sujeitos a mais selecção para expressão de elevado nível do gene seleccionável e depois pesquisados aleatoriamente quanto a expressão de elevado nível do gene de produto. Para identificar células que expressam níveis elevados da proteína desejada, tem tipicamente que se pesquisar grandes quantidades de transfectantes. A maioria dos transfectantes produz menos que os níveis máximos da proteína desejada. Mais, a resistência a Mtx nos transfectantes de DHFR é conferida pelo menos em parte por graus variáveis de amplificação do gene. Schimke, Cell 37: 705-713, 1984. As inadequações da co-expressão do gene não seleccionado foram relatadas por Wold et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 5684-5688, 1979. A instabilidade do ADN amplificado é relatada por Kaufman e Schimke, Mol. Cell Biol. 1: 1069-1076, 1981; Haber e Schimke, Cell 26: 355-362, 1981; e Fedespiel et al., J. Biol. Chem. 259: 9127-9140, 1984. Vários métodos foram descritos para seleccionar directamente tais células hospedeiras recombinantes num único passo. Uma estratégia envolve a co-transfecção de células hospedeiras com um gene de produto e um gene de DHFR, e selecção das células que expressam elevados níveis de DHFR através de cultura directa em meio contendo uma elevada concentração de Mtx. Muitas das células seleccionadas desse modo expressam também o gene de produto co-transfectado a elevados níveis. Page e Sydenham, Bio/Technology 9: 64, 1991. Este método para selecção num único passo sofre de certas desvantagens que limitam a sua utilidade. As células de alta expressão obtidas através da cultura directa em meio contendo um elevado nível de um agente de selecção podem possuir fracas características de crescimento e estabilidade, limitando assim a sua utilidade para processos de produção a longo prazo. Page e Snyderman, Bio/Technology 9: 64, 1991. A selecção de um único passo para resistência de elevado nível a Mtx pode produzir células com uma enzima DHFR resistente a Mtx alterada ou células que possuam propriedades de transporte de Mtx alteradas, em vez de células contendo genes 7 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ amplificados. Haber et al., J. Biol. Chem. 256: 9501, 1981; Assaraf e Schimke, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7154, 1987.

Outro método envolve a utilização de vectores de expressão de ARNm policistrónico contendo um gene de produto na extremidade 5' da região transcrita e um gene seleccionável na extremidade 3'. Como a tradução do gene seleccionável na extremidade 3' do ARNm policistrónico é ineficiente, tais vectores exibem tradução preferencial do gene de produto e requerem níveis elevados de ARNm policistrónico para sobreviver à selecção. Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 487, 1990; Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 537, 1990; Kaufman et al., EMBO J. 6: 187, 1987. Assim, as células que expressam elevados níveis do produto proteico desejado podem ser obtidas num único passo através de cultura dos transfectantes iniciais em meio contendo um agente de selecção apropriado para utilizar com o gene seleccionável particular. Contudo, a utilidade destes vectores é variável devido à influência imprevisível do enquadramento de leitura do produto a montante na tradução do marcador seleccionável e devido ao enquadramento de leitura a montante ser por vezes suprimido durante a amplificação com metotrexato (Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159: 601-621, 1982; Levinson, "Methods in Enzymology", San Diego; Academic Press, Inc., 1990). Os últimos vectores incorporaram um local de início da tradução interno derivado dos membros da família dos picornavírus que se situa entre o gene de produto e o gene seleccionável (Pelletier et al., Nature 334: 320, 1988; Jang et al., J.

Virol. 63: 1651, 1989).

Um terceiro método para selecção de um único passo envolve a utilização de uma construção de ADN com um gene seleccionável contendo um intrão dentro do qual se situa um gene codificando a proteína de interesse. Ver Patente U.S. N.° 5043270 e Abrams et al., J. Biol. Chem. 264(24): 14016-14021, 1989. Ainda noutro método de selecção de um único passo, as células hospedeiras são co-transfectadas com um gene seleccionável modificado com um intrão e um gene codificando a proteína de interesse. Ver WO 92/17566, publicado a 15 de Outubro de 1992. O gene modificado com um intrão é preparado através da inserção, na região transcrita de um gene seleccionável, de um intrão com um comprimento tal 8 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ que ο intrão seja correctamente removido do correspondente precursor de ARNm a baixa eficiência, de modo a que a quantidade do marcador seleccionável produzido a partir do gene seleccionável modificado com um intrão seja substancialmente menor que a produzida a partir do gene seleccionável de partida. Estes vectores ajudam a assegurar a integridade da construção de ADN integrada, mas a ligação de transcrição não é alcançada uma vez que o gene seleccionável e o gene da proteina são conduzidos por promotores separados.

Foram descritos outros vectores de expressão de mamífero que possuem unidades de transcrição únicas. Foram construídos vectores retrovirais (Cepko et al.r Cell 37: 1053-1062, 1984) nos quais um ADNc é inserido entre os locais dador de "splicing" e aceitador de "splicing" endógenos do vírus de leucemia de murídeo de Moloney (M-MuLV) que são seguidos por um gene de resistência à neomicina. Este vector foi utilizado para expressar uma variedade de produtos génicos após infecção retroviral de vários tipos celulares.

Com as desvantagens de cima em mente, é um objectivo do presente invento aumentar o nível de homogeneidade em relação aos níveis de expressão de clones estáveis transfectados com um gene de produto de interesse, através da expressão de um marcador seleccionável (DHFR) e da proteína de interesse a partir de um único promotor. É outro objectivo proporcionar um método para selecção de células hospedeiras recombinantes estáveis que expressem elevados níveis de um produto proteico desejado, cujo método seja rápido e conveniente de realizar, e reduza o número de células transfectadas que necessita ser pesquisado. Para além disso, é um objectivo permitir que sejam rapidamente gerados elevados níveis de polipéptidos de uma e duas unidades a partir de clones ou bancos de células hospedeiras transfectantes estáveis. É um objectivo adicional proporcionar vectores de expressão que tendam para acontecimentos de integração activa (i.e. possuam uma maior tendência para gerar transformantes em que a construção de ADN é inserida numa região do genoma da célula hospedeira que resulte em elevado nível de 9 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ expressão do gene de produto) e possam acomodar uma variedade de genes de produto sem necessidade de modificação.

SUMÁRIO DO INVENTO

Assim, o presente invento refere-se a uma construção de ADN (molécula de ADN) compreendendo um local de iniciação da transcrição e um local de terminação da transcrição, um gene seleccionável que seja um gene amplificável e um gene de produto proporcionado a 3' do gene seleccionável, uma região reguladora da transcrição regulando a transcrição de ambos, o gene seleccionável e o gene de produto, o gene seleccionável posicionado dentro de um intrão definido por um local dador de "splicing" e um local aceitador de "splicing". O local dador de "splicing" compreende de preferência um local dador de "splicing" eficaz tal como aqui definido e regula deste modo a expressão do gene de produto utilizando a região reguladora da transcrição.

Noutra concretização, o presente invento proporciona um método para produzir um produto de interesse compreendendo a cultura de uma célula eucariota que foi transfectada com a construção de ADN descrita acima, de modo a expressar o gene de produto e a recuperar o produto.

Noutra concretização, o presente invento proporciona um método para produção de células eucariotas possuindo múltiplas cópias do gene de produto compreendendo a transfecção das células eucariotas com a construção de ADN descrita acima (onde o gene seleccionável é um gene amplificável), crescimento das células num meio selectivo compreendendo um agente de amplificação durante um tempo suficiente para que ocorra amplificação e selecção das células possuindo múltiplas cópias do gene de produto. De preferência, a transfecção das células é alcançada utilizando electroporação.

Após transfecção das células hospedeiras, a maioria dos transfectantes não exibe o fenótipo seleccionável característico da proteína codificada pelo gene seleccionável, mas surpreendentemente uma pequena proporção dos transfectantes exibe o fenótipo seleccionável e 10 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ verifica-se que entre esses transfectantes, a maioria expressa elevados niveis do produto desejado codificado pelo gene de produto. Assim, o presente invento proporciona um método melhorado para a selecção de células hospedeiras recombinantes expressando elevados niveis de um produto desejado, cujo método é útil com uma ampla variedade de células hospedeiras eucariotas e evita os problemas inerentes à tecnologia de selecção de células existente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1A-1D ilustram esquematicamente várias construções de ADN englobadas pelo presente invento. As setas grandes representam o gene seleccionável e o gene de produto, ο V formado pelas linhas tracejadas mostra a região do ARN precursor interno ao local dador de "splicing" 5' (SD) e ao local aceitador de "splicing" 3' (SA) que é excisado de vectores que contêm um SD funcional. A região reguladora da transcrição, o gene seleccionável, o gene de produto e o local de terminação da transcrição estão representados na Figura IA. A Figura 1B representa as construções de ADN do Exemplo 1. Estão representadas as várias sequências dadoras de "splicing", i.e., a sequência dadora de "splicing" de ras de tipo selvagem (ras WT), a sequência dadora de "splicing" de ras mutante (ras MUTANTE) e a sequência dadora de "splicing" não funcional (AGT). As sondas utilizadas para a análise "Northern blot” no Exemplo 1 são mostradas na Figura 1B. A Figura 1C representa as construções de ADN do Exemplo 2 e a Figura 1D representa a construção de ADN do Exemplo 3 utilizada para expressão de Vh de anti-lgE. A Figura 2 representa esquematicamente a construção de ADN de controlo utilizada no Exemplo 1.

As Figuras 3A-Q representam a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 1) do vector de expressão de DHFR/intrão-(ras WT SD)-tPA do Exemplo 1.

A Figura 4 é um gráfico de barras que mostra o número de colónias que se formam em meio selectivo após electroporação de ADN de minipreparações duplicados linearizados preparados em paralelo a partir dos três vectores mostrados na Figura 1B 11 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ (i.e. com a sequência dadora de "splicing" de ras de tipo selvagem [ras WT], a sequência dadora de "splicing" de ras mutante [ras MUTANTE] e a sequência dadora de "splicing" não funcional [AGT] ) e a partir do vector de controlo que tem DHFR sob o controlo do promotor SV40 e tPA sob o controlo do promotor CMV (ver Figura 2) . As células foram seleccionadas em meio isento de nucleósidos e contadas com um contador automático de colónias.

As Figuras 5A-C são gráficos de barras representando a expressão de tPA a partir de bancos estáveis e clones gerados a partir dos vectores mostrados na Figura 1B. Na Figura 5A mais de 100 clones de cada transfecção de vectores foram misturados, plaqueados em placas de 24 poços e ensaiados através de ELISA de tPA em "saturação". Na Figura 5B, vinte clones escolhidos aleatoriamente derivados de cada um dos vectores foram ensaiados através de ELISA de tPA em "saturação". Na Figura 5C, os bancos mencionados na Figura 5A (excepto o banco de AGT) foram expostos a Mtx 200 nM para seleccionar para amplificação de DHFR e depois reunidos e ensaiados quanto a expressão de tPA.

As Figuras 6A-P representam a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 2) do vector de expressão de DHFR/intrão-(ras WT SD)-TNFr-IgG do Exemplo 2.

As Figuras 7A-B são gráficos de barras representando a expressão de TNFr-IgG utilizando vectores bicistrónicos ou de controlo (ver Exemplo 2). Os vectores contendo TNFr-IgG (mas de resto idênticos aos descritos para expressão de tPA no Exemplo 1) foram construídos (ver Figura 1C), introduzidos em células dpl2.CHO através de electroporação, reunidos e ensaiados quanto à expressão de produto antes (Figura 7A) e depois (Figura 7B) sendo sujeitos a amplificação em Mtx 200 nM. A Figura 8 representa esquematicamente a construção de ADN utilizada para expressão da vL de anti-igE no Exemplo 3.

As Figuras 9A-0 representam a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 3) do vector de expressão de VH de anti-igE do Exemplo 3. 12 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

As Figuras 10A-Q representam a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 4) do vector de expressão de VL de anti-IgE do Exemplo 3. A Figura 11 é um gráfico de barras representando a expressão de anti-IgE no Exemplo 3.

Os vectores de expressão da cadeia pesada (VH) e leve (VL) foram construídos, co-electroporados em células CHO, e os clones foram seleccionados e ensaiados quanto à expressão do anticorpo. Adicionalmente, foram estabelecidos bancos e ensaiados em relação à expressão antes e depois de selecção em Mtx a 200 nM e 1 μΜ.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Definições: A "construção de ADN" aqui divulgada compreende uma molécula de adn de ocorrência não natural que pode ser proporcionada como um isolado ou integrada noutra molécula de ADN, p. ex. num vector de expressão ou no cromossoma de uma célula hospedeira eucariota. O termo "gene seleccionável" tal como aqui se utiliza refere-se a um ADN que codifica um marcador seleccionável necessário para o crescimento ou a sobrevivência de uma célula hospedeira sob as condições de cultura celular particulares escolhidas. Assim, uma célula hospedeira que é transformada com um gene seleccionável será capaz de crescer ou sobreviver sob certas condições de cultura celular em que uma célula hospedeira não transfectada não é capaz de crescer ou sobreviver. Tipicamente, um gene seleccionável conferirá resistência a um fármaco ou compensará um defeito metabólico ou catabólico na célula hospedeira. Exemplos de genes seleccionáveis são proporcionados na seguinte tabela. Ver também Kaufman, Methods in Enzymology 185: 537-566, 1990, para uma revisão destes. 13 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ TABELA. 1

Genes Seleccionáveis e seus Agentes de Selecção Agente de Selecção Gene Seleccionável Metotrexato Di-hidrofolato-redutase Cádmio Metalotioneina PALA CAD Xyl-A-ou adenosina e Adenosina-desaminase 2'-desoxicoformicina Adenina, azaserina e Adenilato-desaminase coformicina 6-Azauridina, pirazofurano UMP-sintase Ácido micofenólico IMP-5'-desidrogenase Ácido micofenólico com xantina Xantina-guanina- limitante fosforibosiltransferase Hipoxantina, aminopterina e HGPRTase mutante ou timidina- timidina (HAT) quinase mutante 5-Fluorodesoxiuridina Timidilato-sintase Múltiplos fármacos, p. ex. P-glicoproteina 170 adriamicina, vincristina ou colchicina Afidicolina Ribonucleótido-redutase Metionina sulfoximina Glutamina-sintase β-Aspartil-hidroxamato ou Asparagina-sintase Albizziin Canavanina Arginossuccinato-sintase α-Difluorometilornitina Ornitina-descarboxilase Compactina HMG-CoA-redutase Tunicamicina N-acetilglucosaminil- transferase Borrelidina Treonil-ARNt-sintase Ouabaina Na+K+-ATPase

De acordo com o presente invento, o gene seleccionável é um gene amplificável. Tal como aqui se utiliza, o termo "gene amplificável" refere-se a um gene que é amplificado (i.e. são geradas cópias adicionais do gene que sobrevivem na forma intracromossómica ou extracromossómica) sob certas condições. 0 gene amplificável codifica normalmente uma enzima (i.e. um marcador amplificável) que é necessária para o crescimento das células eucariotas sob essas condições. Por exemplo, o 14 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ gene pode codificar DHFR que é amplificado quando uma célula hospedeira transformada com esta é criada em Mtx. De acordo com Kaufman, os genes seleccionáveis da Tabela 1 acima podem também ser considerados genes amplificáveis. Um exemplo de um gene seleccionável que não é geralmente considerado como sendo um gene amplificável é o gene de resistência à neomicina (Cepko et al., supra).

Tal como aqui se utiliza, "meio selectivo" refere-se a uma solução de nutrientes utilizada para crescimento de células eucariotas que tenham o gene seleccionável e por isso inclui um "agente de selecção". Meios comercialmente disponíveis tais como de Ham FIO (Sigma), Meio Essencial Mínimo ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle

Modificado por Dulbecco ([DMEM], Sigma) são soluções de nutrientes exemplares. Adicionalmente, qualquer um dos meios descritos em Ham e Wallace, Meth. Enzymol. 58: 44, 1979;

Barnes e Sato, Anal. Biochem. 102: 255, 1980; Patentes U.S. Nos 4767704, 4657866, 4927762 ou 4560655; WO 90/03430; WO 87/00195; Patente U.S. Re. 30985; ou Patente U.S. N.° 5122469) pode ser utilizado como meio de cultura. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco Gentamicma ), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes a concentrações finais no intervalo dos micromolares) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem ser incluídos nas concentrações apropriadas que seriam conhecidas dos peritos na arte. A solução de nutrientes preferida compreende soro fetal bovino. O termo "agente de selecção" refere-se a uma substância que interfere com o crescimento ou a sobrevivência de uma célula hospedeira que é deficiente num determinado gene seleccionável. Exemplos de agentes de selecção são apresentados na Tabela 1 acima. O agente de selecção compreende de preferência um "agente de amplificação" que é definido para os objectivos daqui como um agente para 15 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ amplificação de cópias do gene amplificável, tal como Mtx se o gene amplificável for DHFR. Ver a Tabela 1 para exemplos de agentes de amplificação.

Tal como aqui se utiliza, o termo "local de iniciação da transcrição" refere-se a um ácido nucleico na construção de ADN correspondente ao primeiro ácido nucleico incorporado no transcrito primário, i.e., o precursor de ARNm, cujo local é geralmente proporcionado na extremidade 5', ou adjacente a esta, da construção de adn. O termo "local de terminação da transcrição" refere-se a uma sequência de ADN, normalmente representada na extremidade 3' da construção de ADN, que faz com que a ARN-polimerase termine a transcrição.

Tal como aqui se utiliza, "região reguladora da transcrição" refere-se a uma região da construção de ADN que regula a transcrição do gene seleccionável e do gene de produto. A região reguladora da transcrição refere-se normalmente a uma sequência promotora (i.e. uma região de ADN envolvida na ligação da ARN-polimerase para iniciar a transcrição) que pode ser constitutiva ou indutível, e, opcionalmente, um estimulador (i.e. um elemento de ADN de acção em eis, normalmente de cerca de 10-300 pb, que actua num promotor para aumentar a sua transcrição).

Tal como aqui se utiliza, "gene de produto" refere-se a ADN que codifica um produto proteico ou polipeptídico desejado. Qualquer gene de produto que seja capaz de expressão numa célula hospedeira pode ser utilizado, embora os métodos do presente invento sejam particularmente adequados para obtenção de expressão de elevado nível de um gene de produto que não seja também um gene seleccionável ou amplificável. Assim, a proteína ou polipéptido codificado por um gene de produto será tipicamente um que não seja necessário para o crescimento ou a sobrevivência de uma célula hospedeira sob as condições de cultura celular particulares escolhidas. Por exemplo, genes de produto codificam adequadamente um péptido ou podem codificar uma sequência polipeptídica de aminoácidos para a qual o 16 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ comprimento da cadeia é suficiente para produzir níveis superiores de estrutura terciária e/ou quaternária.

Exemplos de polipéptidos ou proteínas bacterianas incluem, p. ex., fosfatase alcalina e β-lactamase. Exemplos de polipéptidos ou proteínas de mamífero incluem moléculas tais como renina; uma hormona do crescimento, incluindo a hormona do crescimento humana e a hormona do crescimento bovina; factor de libertação da hormona do crescimento; hormona paratiróide; hormona estimuladora da tiróide; lipoproteínas; alfa-l-anti-tripsina; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; pró-insulina; hormona estimuladora do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação tais como o factor VIIIC, factor IX, factor tecidual e o factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tais como Proteína C; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; um activador do plasminogénio, tal como uroquinase ou urina humana ou activador do plasminogénio de tipo tecidual (t-PA); bombesina; trombina; factor de crescimento hematopoiético; factor de necrose tumoral alfa e beta; encefalinase; RANTES (regulada na activação, normalmente expressa e segregada por células T) ; proteína inflamatória dos macrófagos humanos (MlP-l-alfa); uma albumina sérica tal como a albumina do soro humano; substância que inibe a muleriana; cadeia A da relaxina; cadeia B da relaxina; pró-relaxina; péptido associado à gonadotrofina de ratinho; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; ADNase; inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; integrina, proteína A ou D; factores reumatóides; um factor neurotrófico tal como o factor neurotrófico derivado do osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6) ou um factor de crescimento dos nervos tal como NGF-β; factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF); factor de crescimento de fibroblastos tal como aFGF e bFGF; factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-βΙ, tgf^2, TGF^3, TGF-βί ou TGF^5; factor de crescimento semelhante a insulina-I e -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina; proteínas CD tais como CD-3, CD-4, 17 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ CD-8 e CD-19; eritropoietina; factores osteoindutores; imunotoxinas; um proteína morfogenética do osso (BMP); um interferão tal como interferão-alfa, -beta e -gama; factores estimuladores de colónias (CSF), p. ex., M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (IL), p. ex., IL-1 a IL-10; superóxido-dismutase; receptores de células T; proteínas da superfície membranar; factor de aceleração do envelhecimento; antigénio virai tal como, por exemplo, uma porção do envelope do VIH; proteínas de transporte; receptores de domiciliação ("homing") ·, adressinas, proteínas reguladoras; anticorpos; proteínas quiméricas tais como imunoadesinas e fragmentos de qualquer um dos polipéptidos listados acima. O gene de produto de preferência não consiste numa sequência anti-sentido para inibição da expressão de um gene presente no hospedeiro. As proteínas preferidas daqui são proteínas terapêuticas tais como TGF-β, TGF-α, PDGF, EGF, FGF, IGF-I, ADNase, activadores do plasminogénio tais como t-PA, factores de coagulação tais como o factor tecidual e o factor VIII, hormonas tais como relaxina e insulina, citocinas tais como IFN-γ, proteínas quiméricas tais como a imunoadesina IgG receptora de TNF (TNFr-IgG) ou anticorpos tais como anti-IgE. O termo "intrão" tal como aqui se utiliza refere-se a uma sequência nucleotídica presente dentro da região transcrita de um gene ou dentro de um precursor de ARN mensageiro, cuja sequência nucleotídica é capaz de ser excisada, ou processada, a partir do precursor de ARN mensageiro por uma célula hospedeira antes da tradução. Os intrões adequados para utilizar no presente invento são adequadamente preparados através de qualquer um de vários métodos que são bem conhecidos na arte, tais como purificação a partir de um ácido nucleico de ocorrência natural ou de síntese de novo. Os intrões presentes em muitos genes eucariotas de ocorrência natural foram identificados e caracterizados. Mount, Nuc. Acids Res. 10: 459, 1982. Intrões artificiais compreendendo locais de processamento funcionais foram também descritos. Winey et al., Mol. Cell Biol. 9: 329, 1989; Gatermann et al.r Mol. Cell Biol. 9: 1526, 1989. Os intrões podem ser obtidos a partir de ácidos nucleicos de ocorrência natural, por exemplo, através de digestão de um 18 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ ácido nucleico de ocorrência natural com uma endonuclease de restrição adequada ou através de clonagem por PCR utilizando iniciadores complementares a sequências nas extremidades 5' e 3' do intrão. Alternativamente, intrões de sequência e comprimento definidos podem ser preparados sinteticamente utilizando vários métodos de química orgânica. Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90, 1979; Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154: 287, 1985; Froehler et al., Nuc. Acids Res. 14: 5399, 1986.

Tal como aqui se utiliza "local dador de "splicing"" ou "SD" refere-se à sequência de ADN imediatamente em torno da fronteira exão-intrão na extremidade 5' do intrão; onde o "exão" compreende o ácido nucleico a 5' do intrão. Foram caracterizados muitos locais dadores de "splicing" e Ohshima et al., J. Mol. Biol. 195: 247-259, 1987 proporciona uma revisão destes. Uma "sequência dadora de "splicing" eficiente" refere-se a uma sequência de ácido nucleico codificando um local dador de "splicing" em que a eficiência do processamento dos precursores de ARN mensageiro possuindo a sequência dadora de "splicing" está entre cerca de 80 e 99% e de preferência 90 a 95% tal como determinado através de PCR quantitativa. Exemplos de sequências dadoras de "splicing" eficientes incluem a sequência dadora de "splicing” de ras de tipo selvagem (WT) e a sequência GAC:GTAAGT do Exemplo 3. Outras sequências dadoras de "splicing" eficientes podem ser facilmente seleccionadas utilizando as técnicas para medição da eficiência de processamento aqui divulgadas.

Os termos "PCR" e "reacção em cadeia da polimerase" tal como aqui se utilizam referem-se ao método de amplificação in vitro descrito na Patente U.S. N.° 4683195 (publicado a 28 de Julho de 1987) . Em geral, o método de PCR envolve ciclos repetidos de síntese de extensão de iniciadores, utilizando dois iniciadores de ADN capazes de hibridar preferencialmente com um ácido nucleico molde compreendendo a sequência nucleotídica a amplificar. O método de PCR pode ser utilizado para clonar sequências de ADN específicas a partir de ADN genómico total, ADNc transcrito a partir de ARN celular, ADN virais ou plasmídicos. Wang e Mark, em "PCR Protocols", págs. 70-75 (Academic Press, 1990); Scharf, em "PCR

Protocols", págs. 84-98; Kawasaki e Wang, em "PCR 19 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

Tecchnology", págs. 89-97 (Stockton Press, 1989). A transcrição inversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) pode ser utilizada para analisar amostras de ARN contendo misturas de transcritos de ARNm processados e não processados. Iniciadores marcados com fluorescência desenhados para abranger o intrão são utilizados para amplificar tanto alvos processados como não processados. Os produtos de amplificação resultantes são então separados por electroforese em gel e quantificados através da medição da emissão de fluorescência da(s) banda(s) apropriada(s). É feita uma comparação para determinar a quantidade de transcritos processados e não processados presentes na amostra de ARN.

Uma sequência dadora de “splicing" preferida é uma "sequência dadora de "splicing" de consenso". As sequências nucleotidicas em torno dos locais de "splicing" do intrão, sequências que estão evolutivamente altamente conservadas, são referidas como "sequências dadoras de "splicing" de consenso". Nos ARNm dos eucariotas superiores, o local de "splicing" 5' ocorre dentro da sequência de consenso AG:GUAAGU (em que os dois pontos denotam o local de clivagem e ligação). Nos ARNm de levedura, o local de "splicing" 5' está ligado pela sequência de consenso :GUAUGU. Padgett et ai., Ann. Rev. Biochem. 55: 1119, 1986. O "local aceitador de splicing" de expressão ou "SA" refere-se à sequência imediatamente em torno da fronteira intrão-exão na extremidade 3' do intrão, onde o "exão" compreende o ácido nucleico a 3' do intrão. Muitos locais aceitadores de "splicing" foram caracterizados e Ohshima et ai., J. Mol. Biol. 195: 247-259, 1987 proporciona uma revisão destes. O local aceitador de "splicing" preferido é um local aceitador de "splicing" eficiente que se refere a uma sequência de ácido nucleico codificando um local aceitador de "splicing" em que a eficiência de processamento dos precursores de ARN mensageiro possuindo o local aceitador de "splicing" está entre cerca de 80 e 99% e de preferência 90 a 95% tal como determinado através de PCR quantitativa. O local aceitador de "splicing" pode compreender uma sequência de consenso. Nos ARNm dos eucariotas superiores, o local aceitador de "splicing” 3' ocorre dentro da sequência de 20 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ consenso (U/C) nNCAG:G. Nos ARNm de levedura, o local aceitador de "splicing" 3' liga-se à sequência de consenso (C/U)AG:. Padget et al., supra.

Tal como aqui se utiliza "cultura durante um tempo suficiente para permitir que a amplificação ocorra" refere-se ao acto de cultura fisica das células hospedeiras eucariotas que foram transformadas com a construção de ADN em meios de cultura de células contendo o agente de amplificação, até o número de cópias do gene amplificável (e de preferência também o número de cópias do gene de produto) nas células hospedeiras ter aumentado relativamente às células transformadas antes desta cultura. O termo "expressão" tal como aqui se utiliza refere-se à transcrição ou tradução que ocorre dentro de uma célula hospedeira. O nivel de expressão de um gene de produto numa célula hospedeira pode ser determinado com base na quantidade de ARNm correspondente que está presente na célula ou na quantidade da proteína codificada pelo gene de produto que é produzida pela célula. Por exemplo, o ARNm transcrito a partir de um gene de produto é desejavelmente quantificado através de hibridação "Northern". Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", págs. 7.3-7.57 (Cold Spring

Harbor Laboratory Press, 1989). A proteína codificada por um gene de produto pode ser quantificada através do ensaio da actividade biológica da proteína ou através do emprego de ensaios que sejam independentes de tal actividade, tais como "Western blotting" ou radioimunoensaio utilizando anticorpos que sejam capazes de reagir com a proteína. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", págs. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) .

Modos de Realização do Invento São proporcionados métodos e composições para aumentar a estabilidade e/ou o número de cópias de uma sequência transcrita para permitir níveis elevados de uma sequência de ARN de interesse. Em geral, os métodos do presente invento envolvem a transfecção de uma célula hospedeira eucariota com um vector de expressão compreendendo um gene de produto 21 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ codificando um polipéptido desejado e um gene seleccionável (de preferência um gene amplificável).

Os genes seleccionáveis e os genes de produto podem ser obtidos a partir de um ADN genómico, ADNc transcrito a partir de ARN celular ou através de síntese in vitro. Por exemplo, as bibliotecas são pesquisadas com sondas (tais como anticorpos ou oligonucleótidos de cerca de 20-80 bases) desenhadas para identificar o gene seleccionável ou o gene de produto (ou a(s) proteína(s) codificadas por este). A pesquisa da biblioteca de ADNc ou genómica com a sonda seleccionada pode ser conduzida utilizando procedimentos padrão tal como descrito nos capítulos 10-12 de Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Um meio alternativo para isolar o gene seleccionável ou o gene de produto é utilizar a metodologia de PCR tal como descrita na secção 14 de Sambrook et al., supra.

Um método preferido de praticar este invento é utilizar sequências oligonucleotidicas cuidadosamente seleccionadas para pesquisar bibliotecas de ADNc de vários tecidos que se sabe conterem o gene seleccionável ou o gene de produto. As sequências oligonucleotidicas seleccionadas como sondas devem ter o comprimento suficiente e serem suficientemente inequívocas de modo a minimizar os falsos positivos.

O oligonucleótido é geralmente marcado de modo a que possa ser detectado após hibridação com ADN na biblioteca a pesquisar. O método preferido de marcação é utilizar ATP o 9 marcado com P com polmucleotido-quinase, tal como e bem conhecido na arte, para radiomarcar o oligonucleótido. Contudo, podem ser utilizados outros métodos para marcar o oligonucleótido, incluindo, mas não se limitando a, biotinilação ou marcação enzimática.

Por vezes, o ADN codificando o gene seleccionável e o gene de produto é precedido por ADN codificando uma sequência sinal possuindo uma local de clivagem específico no terminal N da proteina ou polipéptido maduro. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vector de expressão ou pode ser parte do gene seleccionável ou do gene de produto que é 22 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ inserido no vector de expressão. Se for utilizada uma sequência sinal heteróloga, esta é de preferência uma que seja reconhecida e processada (i.e., clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para secreção em levedura a sequência sinal nativa pode ser substituída por, p. ex., o comando da invertase de levedura, o comando do factor alfa (incluindo os comandos do factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces, o último descrito na Pat. U.S. N.° 5010182 publicada a 23 de Abril de 1991) ou o comando da fosfatase ácida, o comando da glucoamilase de C. albicans (EP 362179 publicada a 4 de Abril de 1990) ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado a 15 de Novembro de 1990. Na expressão em células de mamífero a sequência sinal nativa da proteína de interesse é satisfatória, embora outras sequências sinal de mamífero possam ser adequadas, tais como as sequências sinal de polipéptidos segregados da mesma espécie ou de espécies aparentadas, bem como comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal de gD de herpes simples. O ADN para tal região precursora é ligado enquadrado com o gene seleccionável ou o gene de produto.

Tal como mostrado na Figura IA, o gene seleccionável é geralmente proporcionado na extremidade 5' da construção de ADN e este gene seleccionável é seguido pelo gene de produto. Portanto, a mensagem inteira (não processada) conterá DHFR como primeiro enquadramento de leitura aberto e irá portanto gerar a proteína DHFR para permitir a selecção de transfectantes estáveis. Não se espera que a mensagem inteira gere quantidades apreciáveis da proteína de interesse uma vez que o segundo AUG numa mensagem bicistrónica é um iniciador ineficiente da tradução em células de mamífero (Kozak, J. Cell Biol. 115: 887-903, 1991). O gene seleccionável é posicionado dentro de um intrão. Os intrões são sequências nucleotídicas não codificantes, normalmente presentes dentro de muitos genes eucariotas, que são removidas dos precursores de ARNm recentemente transcritos num processo de múltiplos passos colectivamente referido como processamento ("splicing").

Pensa-se que um mecanismo simples seja responsável pelo processamento dos precursores de ARNm em células de mamífero, 23 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ vegetais e levedura. Em geral, o processo de processamento requer que as extremidades 5' e 3' do intrão sejam correctamente clivadas e que as extremidades resultantes do ARNm sejam unidas com exactidão, de modo a ser produzido um ARNm maduro possuindo o enquadramento de leitura correcto para a síntese proteica. A análise de uma variedade de genes mutantes de ocorrência natural ou construídos de modo sintético mostrou que mudanças de nucleótidos em muitas das posições dentro das sequências de consenso nos locais de " splicing" 5' e 3' têm o efeito de reduzir ou abolir a síntese de ARNm maduro. Sharp, Science 235: 766, 1987;

Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55: 1119, 1986; Green,

Ann. Rev. Genet. 20: 671, 1986. Estudos mutacionais mostraram também que estruturas secundárias do ARN envolvendo locais de "splicing" podem afectar a eficiência do processamento. Solnick, Cell 43: 667, 1985; Konarska et al., Cell 42: 165, 1985. O comprimento do intrão pode também afectar a eficiência do processamento. Ao fazerem mutações de deleção de diferentes tamanhos dentro do intrão grande do gene da beta-globina de coelho, Wieringa et al. determinaram que o comprimento mínimo do intrão necessário para o processamento correcto é de cerca de 69 nucleótidos. Cell 37: 915, 1984.

Estudos semelhantes do intrão da região EIA de adenovírus mostraram que um comprimento do intrão de 79 nucleótidos permite que ocorra um processamento correcto, mas a uma eficiência reduzida. O aumento do comprimento do intrão para 91 nucleótidos restaura a eficiência normal do processamento, enquanto que a truncagem do intrão para 63 nucleótidos suprime o processamento correcto. Ulfendahl, et al., Nuc. Acids Res. 13: 6299, 1985.

Para ser útil no presente invento, o intrão tem de ter um comprimento tal que o processamento do intrão a partir do ARNm seja eficiente. A preparação de intrões de diferentes comprimentos é uma questão de rotina, envolvendo métodos bem conhecidos na arte, tais como mutagénese de síntese de novo ou de deleção in vitro de um intrão existente. Tipicamente, o intrão terá um comprimento de pelo menos cerca de 150 nucleótidos, uma vez que os intrões que são mais curtos que isto tendem a ser processados menos eficientemente. O 24 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ limite superior para ο comprimento do intrão pode ser de até 30 kb ou mais. Contudo, como proposição geral, o intrão tem geralmente menos de cerca de 10 kb de comprimento. O intrão é modificado para conter o gene seleccionável normalmente não presente dentro do intrão utilizando qualquer um dos vários métodos conhecidos para modificação de um ácido nucleico in vitro. Tipicamente, será introduzido um gene seleccionável num intrão clivando primeiro o intrão com uma endonuclease de restrição e unindo depois covalentemente os fragmentos de restrição resultantes ao gene seleccionável na orientação correcta para expressão na célula hospedeira, por exemplo através de ligação com uma enzima ADN-ligase. A construção de ADN é bicistrónica, i.e. o gene seleccionável e o gene de produto estão ambos sob o controlo da transcrição de uma única região reguladora da transcrição. Tal como mencionado acima, a região reguladora da transcrição compreende um promotor. As sequências promotoras adequadas para utilizar com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) ou outras enzimas glicoliticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; e Holland, Bíochemistry 17: 4900, 1978), tal como enolase, gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato- isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglicose-isomerase e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores indutiveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e galactose. Vectores e promotores adequados para utilizar em expressão de levedura são ainda descritos em Hitzeman et al., ΕΡ 73657A. Os estimuladores de levedura são também vantajosamente utilizados com promotores de levedura. 25 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

Sequências de controlo da expressão são conhecidas para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucariotas possuem uma região rica em AT situada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência verificada 70 a 80 bases a montante do inicio da transcrição de muitos genes é uma região CXCAAT onde X pode ser qualquer nucleótido. A transcrição do gene de produto a partir de vectores em células hospedeiras de mamifero é controlada por promotores obtidos a partir dos genomas de virus tais como o vírus do polioma, o vírus da varíola aviária (UK 2211504 publicada a 5 de Julho de 1989), adenovírus (tais como o Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma das aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e de preferência o Vírus Símio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, p. ex. o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico e do promotor normalmente associado ao gene de produto, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas das células hospedeiras.

Os promotores, inicial e tardio, do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que contém também a origem de replicação virai de SV40. Fiers et al., Nature 273: 113, 1978; Mulligan e Berg, Science 209: 1422-1427, 1980; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 7398-7402, 1981. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano (CMV) é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindiII E. Greenaway et al., Gene 18: 355-360, 1982. Um sistema para expressar ADN em hospedeiros de mamífero utilizando o vírus do papiloma bovino como vector é divulgado em u.S. 4419446. Uma modificação deste sistema é descrita em U.S. 4601978. Ver também Gray et al., Nature 295: 503-508, 1982 sobre expressão de ADNc codificando interferão imunitário em células de macaco; Reyes et al., Nature 297: 598-601, 1982 sobre expressão de ADNc de interferão β humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor da timidina-quinase do vírus de herpes simples, Canaani e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 5166-5170, 1982 sobre expressão do gene do interferão βΐ humano em células cultivadas de ratinho e de coelho, e Gorman et al., 26 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 6777-6781, 1982 sobre expressão de sequências CAT bacterianas em células de rim de macaco CV-1, fibroblastos de embrião de galinha, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa e células NIH-3T3 de ratinho utilizando a repetição terminal longa do virus de sarcoma de Rous como promotor.

De preferência, a região reguladora da transcrição em eucariotas superiores compreende uma sequência estimuladora. Os estimuladores são relativamente independentes quanto à orientação e à posição tendo sido verificados a 5' (Lainins et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 993, 1981) e a 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3: 1108, 1983) da unidade de transcrição, dentro de um intrão (Banerji et al., Cell 33: 729, 1983) bem como dentro da própria sequência de codificação (Osborne et al., Mol. Cell Biol. 4: 1293, 1984). Muitas sequências estimuladoras são agora conhecidas de muitos genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um estimulador de um vírus de uma célula eucariota. Exemplos incluem o estimulador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o estimulador do promotor inicial de citomegalovírus (CMV), o estimulador do polioma do lado tardio da origem de replicação e estimuladores de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297: 17-18, 1982 sobre elementos estimuladores para activação de promotores eucariotas. O estimulador pode ser unido no vector numa posição a 5' ou a 3' do gene de produto, mas situa-se de preferência num local a 5' do promotor. A construção de ADN possui um local de início da transcrição a seguir à região reguladora da transcrição e uma região de terminação da transcrição a seguir ao gene de produto (ver Figura IA). Estas sequências são proporcionadas na construção de ADN utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte. A construção de ADN faz normalmente parte de um vector de expressão que pode ter outros componentes tais como uma origem de replicação (i.e., uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique numa ou em mais células hospedeiras seleccionadas) e, se desejado, um ou mais genes 27 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ seleccionáveis adicionais. A construção de vectores adequados contendo as sequências de codificação e de controlo desejadas emprega técnicas de ligação padrão. Os plasmideos ou fragmentos de ADN isolados são clivados, cortados à medida e novamente ligados na forma desejada para gerar os plasmideos necessários.

Geralmente, em vectores de clonagem a origem de replicação é uma que permite que o vector se replique independentemente do adn cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. Tais sequências são bem conhecidas. A origem de replicação do plasmideo 2μ é adequada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV) são úteis para clonagem de vectores em células de mamifero. Geralmente, o componente origem de replicação não é necessário para vectores de expressão em mamífero (pode tipicamente ser utilizada a origem de SV40 apenas porque contém o promotor inicial). A maioria dos vectores de expressão são vectores "vaivém", i.e., são capazes de se replicarem em pelo menos uma classe de organismos para podem ser transfectados para outro organismo para expressão. Por exemplo, um vector é clonado em E. coli e depois o mesmo vector é transfectado para células de levedura ou de mamífero para expressão apesar de não ser capaz de se replicar independentemente do cromossoma da célula hospedeira.

Para que a análise confirme as sequências correctas em plasmideos construídos, os plasmideos dos transformantes são preparados, analisados através de restrição e/ou sequenciados através do método de Messing et al., Nuc. Acids Res. 9: 309, 1981 ou através do método de Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499, 1980. O vector de expressão possuindo a construção de ADN preparada tal como discutido acima é transformado numa célula hospedeira eucariota. Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão dos vectores daqui são células de levedura ou de eucariotas superiores. 28 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

Micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para vectores contendo o gene de produto. Saccharomyces cerevisiae, ou o vulgar fermento de padeiro, é o mais vulgarmente utilizado entre os microrganismos hospedeiros eucariotas inferiores. Contudo, vários outros géneros, espécies e estirpes estão vulgarmente disponíveis e são úteis aqui, tais como S. pombe (Beach e Nurse, Nature 290: 140, 1981), Kluveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737, 1983), Yarrowia (EP 402226), Pichia pastoris (EP 183070), Trichoderma reesia (EP 244234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 5259-5263, 1979) e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-289, 1983; Tilburn et al., Gene 26: 205-221, 1983; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474, 1984) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. 4: 475-479, 1985) .

As células hospedeiras adequadas para a expressão do gene de produto são derivadas de organismos multicelulares. Tais células hospedeiras são capazes de processamento complexo e de actividades de glicosilação. Em principio, qualquer cultura de células eucariotas superiores é operacional, seja de cultura de vertebrado ou de invertebrado. Exemplos de células de invertebrado incluem células vegetais e de insecto. Numerosas estirpes de baculovirus e variantes e correspondentes células hospedeiras de insecto permissivas de hospedeiros tais como células hospedeiras de Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas. Ver, p. ex., Luckow et al., Bio/Technology 6: 47-55, 1988; Miller et al., em "Genetic Engineering", Setlow, J.K. et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), págs. 277-279; e Maeda et al., Nature 315: 592-594, 1985. Uma variedade de tais estirpes virais está publicamente disponível, p. ex., a variante L-l de NPV de Autographa californica e a estirpe Bm-5 de npv de Bombyx mori, e tais virus podem ser utilizados como os virus daqui de acordo com o presente invento, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. 29 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco podem ser utilizadas como hospedeiros. Tipicamente, as células vegetais são transfectadas através de incubação com certas estirpes da bactéria Agrobacterium tumefaciens, que foram previamente manipuladas para conterem o gene de produto. Durante a incubação da cultura de células vegetais com A. tumefaciens, o gene de produto é transferido para a célula vegetal hospedeira de modo a que esta seja transfectada e, sob as condições apropriadas, expressará o gene de produto. Adicionalmente, estão disponíveis sequências reguladoras e sinal compatíveis com células vegetais, tais como as sequências do promotor e sinal de poliadenilação da nopalina-sintase. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 561, 1982. Adicionalmente, segmentos de ADN isolados a partir da região a montante do gene 780 de T-DNA são capazes de activar ou aumentar os níveis de transcrição de genes expressáveis em plantas em tecidos vegetais contendo ADN recombinante. EP 321196 publicada a 21 de Junho de 1989.

Contudo, o interesse tem sido maior em células de vertebrado e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina nos últimos anos ("Tissue Culture", Academic Press, Kruse e Patterson, editores, 1973) . Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linha de rim CVl de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59, 1977; células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980); células dpl2.CHO (EP 307247 publicada a 15 de Março de 1989); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células de rim de macaco (CVl ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (HEP G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals. N. Y. Acad. Sei. 30 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ 383: 44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (HEP G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou de clonagem acima descritos deste invento e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir os promotores, seleccionar os transformantes ou amplificar os genes codificando as sequências desejadas. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células vegetais, tal como descrito por Shaw et ai., Gene 23: 315, 1983 e WO 89/05859 publicada a 29 de Junho de 1989. Para células de mamífero sem tais paredes celulares, pode ser utilizado o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb,

Virology 52: 456-457, 1978. Os aspectos gerais de transformações de sistemas de células hospedeiras de mamífero foram descritos por Axel em U.S. 4399216 publicada a 16 de Agosto de 1983. As transformações para levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de van Solingen et ai., J. Bact. 130: 946, 1977 e Hsiao et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 3829, 1979. No entanto, outros métodos para introdução de ADN em células tais como através de injecção nuclear ou através de fusão de protoplastos podem também ser utilizados.

Na concretização preferida o adn é introduzido nas células hospedeiras utilizando electroporação. Ver Andreason, J. Tiss. Cult. Meth. 15: 56-62, 1993, para uma revisão das técnicas de electroporação úteis para a prática do invento presentemente reivindicado. Descobriu-se que as técnicas de electroporação para introdução da construção de ADN nas células hospedeiras eram preferíveis às técnicas de precipitação com fosfato de cálcio por as últimas poderem fazer com que o ADN se quebre e forme concatâmeros.

As células hospedeiras de mamífero, utilizadas para expressar o gene de produto daqui, podem ser cultivadas numa variedade de meios tal como discutido na secção de definições acima. Os meios contêm o agente de selecção utilizado para selecção de células hospedeiras transformadas que tomaram a 31 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ construção de ADN (como um elemento intra- ou extra-cromossómico). Para alcançar selecção das células eucariotas transformadas, as células hospedeiras podem ser criadas em placas de cultura de células e as colónias individuais que expressam o gene seleccionável (e assim o gene de produto) podem ser isoladas e criadas em meio de crescimento até os nutrientes se esgotarem. As células hospedeiras são então analisadas quanto à transcrição e/ou transformação tal como discutido abaixo. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão aparentes aos vulgares peritos na arte. A amplificação e/ou expressão do gene pode ser medida numa amostra directamente, por exemplo, através de "Southern blotting" convencional, "Northern blotting” para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 5201-5205, 1980), “dot blotting" (análise de ADN) ou hibridação in situ, utilizando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas sequências aqui proporcionadas. Podem-se empregar vários marcadores, mais vulgarmente radioisótopos, particularmente 32P. Contudo, podem também ser empregues outras técnicas, tais como nucleótidos modificados com biotina para introdução num polinucleótido. A biotina serve então como local para ligação a avidina ou a anticorpos, que podem ser marcados com uma ampla variedade de marcadores, tais como radionuclidos, fluorescentes, enzimas ou semelhantes. Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que possam reconhecer dúplices específicos, incluindo dúplices de ADN, dúplices de ARN e dúplices híbridos de ADN-ARN ou dúplices de ADN-proteína. Os anticorpos podem por sua vez ser marcados e o ensaio pode ser realizado quando o dúplex se liga a uma superfície, de modo a que após a formação do dúplex na superfície, a presença do anticorpo ligado ao dúplex possa ser detectada. A expressão do gene pode, alternativamente, ser medida através de métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de secções de tecido e ensaio da cultura celular ou de fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Com técnicas de coloração imuno-histoquímicas, é preparada uma amostra celular, 32 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ tipicamente através de desidratação e fixação, seguido de reacção com anticorpos marcados específicos para o produto do gene acoplado, onde os marcadores são habitualmente detectáveis visualmente, tais como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes e semelhantes. Uma técnica de coloração particularmente sensível adequada para utilizar no presente invento é descrita por Hsu et ai., Am. J. Clin. Path. 75: 734-738, 1980.

Na concretização preferida, o ARNm é analisado através de PCR quantitativa (para determinar a eficiência do processamento) e a expressão proteica é medida utilizando ELISA tal como descrito no Exemplo 1 aqui. O produto de interesse é de preferência recuperado a partir do meio de cultura como um polipéptido segregado, embora possa também ser recuperado a partir de lisados de células hospedeiras quando expresso directamente sem um sinal secretor. Quando o gene de produto é expresso numa célula recombinante diferente de uma de origem humana, o produto de interesse é completamente isento de proteínas ou polipéptidos de origem humana. Contudo, é necessário purificar o produto de interesse de proteínas ou polipéptidos de células recombinantes para obter preparações que sejam substancialmente homogéneas ao produto de interesse. Como primeiro passo, o meio de cultura ou lisado é centrifugado para remover restos celulares particulados. O produto de interesse é a partir daí purificado de proteínas e polipéptidos solúveis contaminantes, por exemplo, através de fraccionamento em colunas de imunoafinidade ou de permuta iónica; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; electroforese em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; cromatografia em colunas de plasminogénio para ligar o produto de interesse e colunas de proteína A-Sepharose para remover contaminantes tais como igG. 33 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para ilustração e não se pretende que limitem o presente invento de modo algum. EXEMPLO 1

Produção de tPA utilizando os vectores de expressão bicistrónicos

Procurou-se aumentar o nivel de homogeneidade em relação aos níveis de expressão de clones estáveis através da expressão de um marcador seleccionável (tal como DHFR) e da proteína de interesse a partir de um único promotor. Estes vectores dirigem a maior parte do transcrito para a expressão do produto ao mesmo tempo que o ligam a uma razão fixa à expressão de DHFR através de processamento alternativo.

Foram construídos vectores que derivaram do vector pRK (Suva et al., Science 231: 893-896, 1987) que contém um intrão entre o promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV) e o ADNc que codifica o polipéptido de interesse. O intrão de pRK tem 139 nucleótidos de comprimento, possui um local dador de "splicing" derivado do gene inicial imediato de citomegalovírus (CMVIE) e um local aceitador de "splicing" de um gene da região variável da cadeia pesada (VH) de IgG (Eaton et al., Biochem. 25: 8343, 1986).

Os vectores de DHFR/intrão foram construídos através da inserção de um ligante EcoRV no local BSTX1 presente no intrão de pRK7. Foi inserido um fragmento de 830 pares de bases contendo um fragmento codificando DHFR de ratinho para obter vectores de expressão do intrão de DHFR que difiram apenas na sequência que compreende o local dador de "splicing". Essas sequências foram alteradas através de mutagénese por PCR de sobreposição para obter sequências que coincidem com os locais dadores de "splicing" verificados entre os exões 3 e 4 dos genes Ras normal e mutante. Foi também utilizada PCR para destruir o local dador de "splicing".

Um fragmento de ADNc de DHFR de ratinho (Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 2495-2499, 1983) foi 34 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ inserido no intrão deste vector 59 nucleótidos a jusante do local dador de “splicing". O local dador de "splicing" deste vector foi alterado através de mutagénese para alterar a razão de mensagem processada para não processada em células transfectadas. Foi anteriormente mostrado que a mudança de um único nucleótido (G para A) converteu um local dador de "splicing" relativamente eficiente verificado no gene ras normal num local de "splicing" ineficiente (Cohen et al., Nature 334: 119-124, 1988). Este efeito foi demonstrado no contexto do gene ras e confirmado quando estas sequências foram transferidas para construções de hormona do crescimento humana (Cohen et al., Cell 58: 461-472, 1989).

Adicionalmente, um local de "splicing" 5' não funcional (GT para CA) foi construído como controlo (ÚGT). Um poliligante foi inserido 35 nucleótidos a jusante do local de "splicing" a 3' para aceitar o ADNc de interesse. Um vector contendo tPA (Pennica et al., Nature 301: 214-221, 1983) foi linearizado a jusante do local de poliadenilação antes de ser introduzido em células CHO (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 7161, 1984).

Os ADN plasmidicos que continham DHFR/intrão, tPA e (a) ras de tipo selvagem (ras WT), i.e. Figura 3 (SEQ ID NO: 1), (b) ras mutante ou (c) local dador de "splicing" não funcional (AGT) foram introduzidos em células CHO DHFR menos através de electroporação. Os vectores do intrão foram cada um linearizados a jusante do local de poliadenilação através de tratamento com endonucleases de restrição. O vector de controlo foi linearizado a jusante do segundo local de poliadenilação. Os ADN foram precipitados com etanol após extraeção com fenol/clorofórmio e foram ressuspensos em 20 μΐ de Tris/EDTA 1/10. Depois, 10 pg de ADN foram incubados com 107 células CHO.dpl2 (EP 307247 publicada a 15 de Março de 1989) em 1 ml de PBS em gelo durante 10 minutos antes de electroporação a 400 volts e 330 pf utilizando um BRL Cell Porator.

As células regressaram ao gelo durante 10 minutos antes de serem plaqueadas em meio não selectivo. Após 24 horas as células foram alimentadas com meio isento de nucleósidos para seleccionar os clones DHFR+ estáveis que foram reunidos. Os clones DHFR+ reunidos foram lisados e foram preparados ARNm. 35 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ

Para preparar ο ARNm, ο ARN foi extraído de 5χ107 células que foram criadas a partir de bancos de mais de 200 clones derivados da transfecção estável dos três vectores, cuja construção essencial é mostrada na Figura 1B, e de células CHO não transfectadas. O ARN foi purificado sobre celulase oligo-DT (Collaborative Biomedical Products). 10 pg de ARNm foram então sujeitos a "Northern blotting" o que envolveu correr o ARNm num gel de agarose a 1,2%, formaldeído a 6,6% e transferi-lo para um filtro de nylon (membrana Stratagene Duralon-UV), pré-hibridada, sondada e lavada de acordo com as instruções do fabricante. O filtro foi sondado sequencialmente utilizando sondas (mostradas na Figura 1B) que detectariam (a) a mensagem inteira, (b) a mensagem inteira e a processada ou (c) beta-actina. A sondagem com a sonda longa mostrou que o vector que contém o local dador de "splicing" eficiente (i.e. ras WT) gera predominantemente um ARNm do tamanho previsto para o produto processado enquanto que os outros dois vectores deram origem primeiramente a um ARNm que corresponde em tamanho à mensagem não processada. A sonda de DHFR detectou apenas a mensagem inteira e demonstrou que o vector derivado do local dador de "splicing" de ras WT gera muito pouca mensagem inteira com a qual confere um fenótipo positivo para DHFR. A Figura 4 mostra o número de colónias positivas para DHFR obtidas após electroporações em duplicado com os três vectores do intrão descritos acima e de um vector convencional que possui um promotor de CMV a dirigir tPA e um promotor de SV40 a dirigir DHFR (ver Figura 2). O aumento no número de colónias é proporcional ao aumento da mensagem inteira que se acumula com a modificação dos locais dadores de "splicing". O vector convencional gera eficientemente colónias e não varia significativamente da construção de AGT. O nível de expressão de tPA foi determinado, semeando células em 1 ml de F12:DMEM (50:50, com FBS a 5%) em placas de 24 poços quase até à confluência. O crescimento das células continuou até os meios se esgotarem. Os meios foram então ensaiados através de ELISA quanto à produção de tPA. Resumidamente, o anticorpo anti-tPA foi revestido nos poços de uma placa de microtítulo de ELISA, foram adicionadas 36 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ amostras dos meios aos poços seguido de lavagem. A ligação do antigénio (tPA) foi então quantificada, utilizando anticorpo anti-tPA marcado com peroxidase de rábano (HRPO). A Figura 5A representa os títulos da proteína tPA segregada após reunião dos clones de cada grupo mostrado na Figura 4. Ao mesmo tempo que o número de colónias aumentou com um enfraquecimento da função do dador de "splicing", o inverso foi observado em relação à expressão de tPA. Os níveis de expressão são consistentes com os produtos de ARN que são observados; quanto mais a mensagem bicistrónica é processada maior quantidade de mensagem conterá tPA como primeiro enquadramento de leitura aberto resultando em maior expressão de tPA. Uma mutação de GT para CA no local dador de "splicing" resulta numa abundância de colónias positivas para DHFR que expressam níveis indetectáveis de tPA, resultando possivelmente de utilização ineficiente do segundo AUG. Muito importante, a Figura 5A mostra também que os níveis de expressão obtidos a partir de um dos vectores bicistrónicos (com ras wt SD) foi cerca de três vezes superior ao obtido com o vector de controlo contendo um promotor/estimulador de CMV dirigindo tPA, promotor/estimulador de SV40 controlando DHFR e sinais de poliadenilação de SV40 controlando a expressão de tPA e DHFR.

Adicionalmente, a homogeneidade da expressão nos bancos foi investigada. A Figura 5B mostra que todos os 20 clones gerados pelos vectores bicistrónicos derivados do local dador de "splicing" de ras WT expressam níveis detectáveis de tPA enquanto que apenas 4 dos 20 clones gerados pelo vector de controlo expressam tPA. Nenhum dos clones transfectados com o vector de não processamento (ÚGT) expressou níveis de tPA detectáveis por ELISA. Esta descoberta é consistente com as observações anteriores de que relativamente poucos clones gerados por vectores convencionais produzem níveis úteis de proteína. A expressão de tPA foi aumentada após a amplificação em metotrexato dos bancos. A Figura 5C mostra que 2 dos bancos derivados do vector bicistrónico (i.e. com locais ras WT e ras MUTANTE SD) aumentaram marcadamente na expressão (8,4 e 7,7 vezes), enquanto que o banco gerado pelo vector 37 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ convencional aumentou apenas ligeiramente (2,8 vezes) quando cada um foi sujeito a Mtx 200 nM. Um aumento global de 9 vezes foi obtido utilizando o melhor bicistrónico (ras WT SD) versus o vector convencional após amplificação. O crescimento do banco amplificado de maior expressão em meio de produção rico em nutrientes rendeu títulos de 4,2 pg/ml de tPA.

Mostrou-se que a manipulação da sequência dadora de "splicing" altera a razão de mensagem processada para inteira e o número de colónias que se formam em meio selectivo. Mostrou-se também que os vectores de expressão bicistrónicos geram clones que expressam elevados níveis de proteínas recombinantes. Surpreendentemente, foi possível isolar grandes expressores que tinham o local dador de "splicing" de ras WT eficiente através de selecção de células DHFR+ apesar da eficiência com que o gene de DHFR foi processado a partir dos precursores de ARN formados nestas células. EXEMPLO 2

Produção de TNFr-IgG utilizando os vectores de expressão bicistrónicos

Para provar a aplicabilidade geral desta abordagem, foi avaliado um segundo produto no sistema de vector bicistrónico contendo, como ADN de interesse, uma imunoadesina (TNFr-IgG) capaz de se ligar ao factor de necrose tumoral (TNF) (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535-10539, 1991). As experiências descritas no Exemplo 1 acima foram essencialmente repetidas excepto que o gene de produto codificava a imunoadesina TNFr-IgG. Os ADN plasmídicos que continham um ADNc de TNFr-IgG e (a) ras WT, i.e. Figura 6 (SEQ ID NO: 2), (b) ras mutante ou (c) local dador de "splicing" não funcional (ÚGT) foram introduzidos nas células dpl2.CHO tal como discutido para o Exemplo 1. Ver Figura 1C para uma ilustração das construções de ADN.

Descobriu-se que o número de colónias positivas para DHFR geradas por três destes vectores era semelhante ao observado com as construções de tPA. A expressão de TNFr-IgG foi também proporcional à observada com as construções de tPA (Figura 7A) . A amplificação dos bancos a partir de duas das 38 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ construções mostrou um aumento marcado na expressão da imunoadesina (9,6 e 6,8 vezes) (Figura 7B). O melhor destes bancos amplificados expressou 9,5 pg/ml quando criado em meio de produção rico em nutrientes.

Assim, mostrou-se novamente que os vectores de expressão bicistrónicos geram clones que expressam elevados niveis de proteínas recombinantes. Para além disso, ao contrário das expectativas, descobriu-se que o isolamento de células hospedeiras DHFR+ que expressam produto em grande quantidade era possível utilizando um local dador de "splícing” eficiente (i.e. o local dador de "splícing" de ras WT). EXEMPLO 3

Produção de anticorpo utilizando o vector de expressão bicistrónico A utilidade deste sistema para expressão de anticorpos foi avaliada testando a produção de um anticorpo dirigido contra IgE (Presta et al., Journal of Immunology 151: 2623-2632, 1993) . Mais, a flexibilidade do sistema em relação ao início da transcrição foi testada através da substituição do promotor/estimulador de CMV presente nos vectores anteriores pelo promotor/estimulador derivado da região inicial do vírus SV40 (Griffin, B. Structure and Genomic Orqanization of SV40 and Polyoma Virus, em J. Tooze (ed.) "DNA Tumor Viruses", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). A cadeia pesada do anticorpo foi inserida a jusante de DHFR tal como descrito nas construções de tPA e TNFr-lgG iniciais. Adicionalmente, foi modificada uma nova sequência do local dador de "splícing" (GAC:GTAAGT) no vector que coincide com o local dador de "splícing" de consenso mais infimamente que os locais dadores de "splícing” presentes nos vectores testados nos Exemplos 1 e 2. O vector de expressão resultante é mostrado nas Figuras 1D e 9.

Descobriu-se que este vector produzia menos colónias que os vectores anteriormente testados e produzia predominantemente um produto de ARN processado. Foi construído um segundo vector para ter a cadeia leve do anticorpo sob o controlo do promotor/estimulador e poli-A de 39 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ SV40 e ο gene de resistência à higromicina B sob o controlo do promotor/estimulador de CMV e poli-A de SV40. Estes vectores foram linearizados em locais HpaI únicos a jusante do sinal poli-A, misturados a uma razão de vector da cadeia leve para vector da cadeia pesada de 10:3 e electroporados para células CHO utilizando um protocolo optimizado (tal como discutido nos Exemplos 1 e 2). A Figura 11 mostra os niveis de anticorpo expresso pelos clones e bancos após selecção em higromicina B seguido de selecção para expressão de DHFR. Todos os 20 clones analisados expressaram elevados niveis de anticorpo quando criados em meio rico e variaram uns dos outros em apenas um factor de quatro. Um banco de clones produtores de anticorpos foi gerado e ensaiado pouco depois de ser estabelecido. Esse banco foi criado continuamente durante 6 semanas sem uma diminuição significativa da produtividade demonstrando que a sua estabilidade era suficiente para gerar quantidades de gramas de proteína a partir da sua cultura em larga escala. O banco foi sujeito a amplificação em metotrexato a 200 nM e 1 μΜ e alcançou um aumento de mais de 2 vezes no título de anticorpo. O banco resistente a Mtx 1 μΜ alcançou um título de 41 mg/1 quando criado sob condições óptimas em cultura em suspensão. A estrutura do anticorpo expresso foi examinada. As proteínas expressas pelo banco resistente a metotrexato 200 nM e por um clone de expressão bem caracterizado gerado por vectores convencionais (Presta et al., 1993, supra) foram metabolicamente marcadas com cisteína e metionina-S35. Em particular, foram metabolicamente marcadas placas de 35 mm de células confluentes com metionina-S35 e cisteína-S35 (Amersham) a 50 μΟί cada em F12:DMEM isento de soro e isento de cisteína e metionina. Após uma hora, foram adicionados meios de produção ricos em nutrientes e as proteínas marcadas foram deixadas a "caçar" o meio durante mais seis horas. As proteínas foram corridas num gel de SDS-PAGE a 12% (NOVEX) não reduzidas ou após redução com β-mercaptoetanol. Os géis secos foram expostos a película durante 16 horas. As células CHO de controlo foram também marcadas. 40 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ A maior parte da proteína de anticorpo é segregada com um peso molecular de cerca de 155 quilodaltons, consistente com uma molécula de anticorpo correctamente ligada com dissulfuretos com 2 cadeias leves e 2 pesadas. Após redução, o peso molecular muda para 2 proteínas aproximadamente igualmente abundantes de 22,5 e 55 quilodaltons. A proteína gerada a partir do banco é indistinta do anticorpo produzido pelo clone de expressão bem caracterizado, sem aumento aparente da cadeia pesada ou leve livre expressa pelo banco.

CONCLUSÃO O sistema de expressão eficiente aqui descrito utiliza vectores consistindo em elementos promotores/estimuladores seguidos de um intrão contendo a sequência de codificação do marcador seleccionável, seguida do ADNc de interesse e de um sinal de poliadenilação. Várias sequências do local dador de "splicing" foram testadas quanto ao seu efeito no número de colónias e na expressão do ADNc de interesse. Foram utilizados um local dador de "splicing” não funcional, locais dadores de “splicing" verificados num intrão entre os exões 3 e 4 das formas mutante (mutante ras) e normal (ras WT) do gene Ras de Harvey e outro local SD eficiente (ver Exemplo 3). Os vectores foram desenhados para dirigir a expressão de transcritos primários bicistrónicos. Dentro de uma célula transfectada alguns dos transcritos permanecem inteiros enquanto que os restantes são processados para excisar a sequência de codificação de DHFR. Quando o local dador de "splicing" é enfraquecido ou destruído observa-se um aumento do número de colónias.

Os níveis de expressão mostram o padrão inverso, com os locais dadores de "splicing" mais eficientes a gerarem os maiores níveis de tPA, imunoadesina TNFr ou VH de anti-IgE. A homogeneidade da expressão dos clones gerados pelos vectores do intrão de DHFR e dos locais dadores de "splicing" de ras foi comparada com a dos clones gerados a partir de um vector convencional com um promotor/estimulador separado e um sinal de poliadenilação para cada DHFR e tPA. O vector do 41 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ intrão de DHFR dá origem a colónias que são muito mais homogéneas em relação à expressão que as geradas pelo vector convencional. Os clones que não expressam derivados do vector convencional podem ser o resultado de quebras no dominio de tPA ou de TNFr-lgG do plasmideo durante a integração no genoma ou o resultado de metilação de elementos do promotor (Busslinger et ai., Cell 34: 197-206, 1983; Watt et ai., Genes and Development 2: 1136-1143, 1988) dirigindo a expressão de tPA ou TNFr-lgG. O silenciamento do promotor através de metilação ou de quebras nos vectores do intrão de DHFR torná-los-ia muito provavelmente incapazes de conferir um fenótipo positivo para DHFR.

Verificou-se que os bancos gerados pelos vectores do intrão de DHFR podiam ser amplificados em metotrexato e aumentariam a expressão num factor de 8,4 (tPA) ou 9,8 (TNFr-lgG) . Os bancos de vectores convencionais aumentaram apenas 2,8 e 3,0 vezes para tPA e TNFr-lgG quando amplificados de modo semelhante. Os bancos amplificados resultaram em níveis de tPA 9 vezes maiores e níveis de TNFr-lgG 15 vezes maiores quando comparados com os bancos amplificados do vector convencional.

Sem estar limitado por qualquer teoria, é provável que o aumento da expressão dos bancos resistentes ao metotrexato derivados dos vectores bicistrónicos seja provavelmente devido à ligação na transcrição de DHFR com o produto; quando as células são seleccionadas para maior expressão de DHFR sobre-expressam consistentemente o produto. As abordagens convencionais não têm o marcador seleccionável nem ligação da expressão do ADNc e portanto a amplificação em metotrexato gera frequentemente sobre-expressão de DHFR sem o aumento concomitante na expressão do produto.

Outros aumentos de 4 e 6,3 vezes na expressão foram obtidos quando bancos amplificados de tPA e TNFr-lgG foram transferidos dos meios utilizados para as selecções e amplificações para um meio de produção rico em nutrientes.

No Exemplo 3, o vector de expressão tinha um local dador de "splicing" que coincide mais intimamente com a sequência dadora de "splicing” de consenso e tinha a cadeia pesada de 42 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ um anticorpo anti-IgE humanizado inserida a jusante. Este vector foi linearizado e co-electroporado com um segundo vector linearizado que expressa o gene de resistência à higromicina e a cadeia leve do anticorpo sob o controlo do seu próprio promotor/estimulador e sinais poli-A. Foi utilizado um excesso de vector de expressão da cadeia leve em relação ao vector de expressão bicistrónico da cadeia pesada para tender a favor da expressão da cadeia leve. Clones e um banco foram gerados após selecções de higromicina B e DHFR. Verificou-se que os clones expressam elevados níveis de anticorpo relativamente consistentes, tal como o banco. O banco de 1 μΜ alcançou um título de 41 mg/1 quando criado sob condições óptimas em cultura em suspensão. O anticorpo anti-IgE foi avaliado através de marcação metabólica seguida de SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras e verificou-se que era indistinguível da proteína expressa por uma linha celular clonal altamente caracterizada. De particular importância é a descoberta de que não se observa nenhuma cadeia leve livre no banco relativamente ao clone.

Foi desenvolvido um sistema de expressão estável para células CHO que produz rapidamente elevados níveis de proteínas recombinantes e com menos esforço que o requerido por outros sistemas de expressão. 0 sistema vector gera clones estáveis que expressam consistentemente elevados níveis reduzindo deste modo o número de clones que tem de ser pesquisado para obter uma linha clonal altamente produtiva. Alternativamente, foram utilizados bancos para gerar de modo conveniente níveis moderados a elevados de proteína. Esta abordagem pode ser particularmente útil quando se pretende expressar e comparar várias proteínas aparentadas.

Sem estar limitado por esta teoria, é possível que os vectores que possuem locais dadores de " splicing" muito eficientes gerem clones muito produtivos porque permanece muito pouco transcrito não processado que apenas acontecimentos de integração que conduzam à criação de elevados níveis de ARN produzem suficiente proteína DHFR para dar origem a colónias em meio selectivo. O elevado nível de mensagem processada de tais clones é então traduzido em 43 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ quantidades abundantes da proteína de interesse. Os bancos de clones produzidos concorrentemente através da introdução de vectores convencionais expressaram níveis baixos de proteína e eram instáveis em relação à expressão a longo prazo, e a expressão não pode ser apreciavelmente aumentada quando as células foram sujeitas a amplificação em metotrexato. O sistema aqui desenvolvido é versátil porque permite que elevados níveis de polipéptidos simples e de múltiplas subunidades sejam rapidamente gerados a partir de clones ou bancos de transfectantes estáveis. Este sistema de expressão combina as vantagens dos sistemas de expressão transiente (criação rápida e de trabalho não intensivo de quantidades de proteína de investigação) com o desenvolvimento concorrente de linhas celulares de produção estável altamente produtivas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: GENENTECH, INC.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODO PARA SELECÇÃO DE CÉLULAS

HOSPEDEIRAS DE ALTA EXPRESSÃO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Genentech, Inc. (B) RUA: 460 Point San Bruno Blvd (C) CIDADE: South San Francisco (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 94080 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete de 5,25 polegadas, 360 Kb

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: patin (Genentech) (iv) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/286740 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 05-AGOSTO-1994 44 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ (νίίί) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Wendy M. Lee (B) NÚMERO DE REGISTRO: 00,000

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 798PCT ((x) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 415/225-1994 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7360 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGTTATTAAT AGTAATCAAT 50 TACGGGGTCA TTAGTTCATA GCCCATATAT GGAGTTCCGC GTTACATAAC 100 TTACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCTGACCGC CCAACGACCC CCGCCCATTG ISO ACGTCAATAA TGACGTATGT TCCCATAGTA ACGCCAATAG GGACTTTCCA 200 TTGACGTCAA TGGGTGGAGT ATTTACGGTA AACTGCCCAC TTGGCAGTAC 2 50 45 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ ATGAAGTGTA TCATATGCCA AGTACGCCCC CTATTGACGT CAATGACGGT 300 AAATGGCCCG CCTGGCATTA TGCCCAGTAC ATGACCTTAT GGGACTTTCC 350 TACTTGGCAG TACATCTACG TATTAGTCAT CGCTATTACC ATGGTGATGC 400 GGTTTTGGCA GTACATCAAT GGGCGTGGAT AGCGGTTTGA CTCACGGGGA 450 TTTCCAAGTC TCCACCCCAT TGACGTCAAT GGGAGTTTGT TTTGGCACCA 500 AAATCAACGG GACTTTCCAA 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AATGGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA CGCATCTGTG CGGTATTTCA 3600 CACCGCATAC GTCAAAGCAA CCATAGTACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA 3650 AGCGCGGCGG GTGTGÕTGGT TACGCGCAGC GTGACCGCTA CACTTGCCAG 3700 CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT CTCGCCACGT 3750 TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC TTTAGGGTTC 3800 CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG ATTTGGGTGA 3850 TGGTTCACGT AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA 3900 CGTTGGAGTC CACGTTCTTT AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA 3 950 61 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ ACACTCAACC CTATCTCGGG CTATTCTTTT GATTTATAAG GGATTTTGCC 4000 GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT GATTTAACAA AAATTTAACG 4050 CGAATTTTAA CAAAATATTA ACGTTTACAA TTTTATGGTG CACTCTCAGT 4100 ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAACTCCGCT ATCGCTACGT 4150 GACTGGGTCA TGGCTGCGGC CCGACACCCG CCAACACCCG CTGACGCGCC 4200 CTGACGGGCT TGTCTGCTCC CGGCATCCGC TTACAGACAA GCTGTGACCG 4250 TCXCCGGGAG CTGCATGTGT CAGAGGTTTT CACCGTCATC ACCGAAACGC 4300 GCGAGGCAGT ATTCTTGAAG ACGAAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT 43 50 ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT 4400 TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT 445 0 TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA 4500 ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT GTCGCCCTTA 4 550 TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA CCCAGAAACG 4600 CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA 4650 CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG 4700 AAGAACGTTT TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG 4750 GTATTATCCC GTGATGACGC CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA 4800 ΓΤΔΤΤΓΤΓϋΓ: linTGlirTTGr! τΤΛΒ^ΤΛΓΤη ΛΓ’Γ'ΛΓ’ΤΓ’ΛΓί. ΠΑΑΑΑΠΓΑΤΓ 4050 TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC CATAACCATG 4900 AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA 4950 GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG 5000 ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC 5050 ACCACGATGC CAGCAGCAAT GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG 5100 62 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA ATTAATAGAC TGGATGGAGG 5150 CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC GGCTGGCTGG 5200 TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT 5250 TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA 5300 CGACGGGGAG TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG 5350 ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC 5400 ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT 5450 AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG 5500 TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 5550 TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC 5600 CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT 5650 TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT 5700 TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC 5750 CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC 5800 GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA 5850 GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG 5900 AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCATTGAGAA 5950

1 1 UMVJMMMlTUUla UHUAUU 1/tl L %.U\Jl/U4ULOV3 OUUU CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT 6050 GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA 6100 TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 6150 CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT 620 0 TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT 6250 63 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC 6300 AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG 6350 CGCGTTGGCC GATTCATTAA TCCAGCTGGC ACGACAGGTT TCCCGACTGG 6400 AAAGCGGGCA GTGASCGCAA CGCAAnAAT GTGAGTiACC tCAlíCATtA 6450 GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA 6500 TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC 6550 GAATTAA 6557 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7305 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGTTATTAAT 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CCACAGGTGT CCACTCCCAG GTCCAACTGC 900 ACCTCGGTTC TAAGCTTATC GATATGAAAA AGCCTGAACT CACCGCGACG 950 TCTGTCGAGA AGTTTCTGAT CGAAAAGTTC GACAGCGTCT CCGACCTGAT 1000 GCAGCTCTCG GAGGGCGAAG AATCTCGTGC TTTCAGCTTC GATGTAGGAG 1050 GGCGTGGATA TGTCCTGCGG GTAAAXAGCT GCGCCGATGG TTTCTACAAA 1100 GATCGTTATG TTTATCGGCA CTTTGCATCG GCCGCGCTCC CGATTCCGGA 1150 AGTGCTTGAC ATTGGGGAAT TCAGCGAGAG CCTGACCTAT TGCATCTCCC 1200 GCCGTGCACA GGGTGTCACG TTGCAACACC TGCCTGAAAC CGAACTGCCC 1250 GCTGTTCTGC AGCCGGTCGC GGAGGCCATG GATGCGATCG CTGCGGCCGA 1300 TCTTAGCCAG ACGAGCGGGT TCGGCCCATT CGGACCGCAA GGAATCGGTC 1350 AATACACTAC ATGGCGTGAT TTCATATGCG CGATTGCTGA TCCCCATGTG 1400 TATCACTGGC AAACTGTGAT GGACGACACC GTCAGTGCGT CCGTCGCGCA 1450 GGCTCTCGAT GAGCTGATGC TTTGGGCCGÂ GGACTGCCCC GAAGtCCGGC 1500 ACCTCGTGCA CGCGGATTTC GGCTCCAACA ATGTCCTGAC GGACAATGGC 1550 CGCATAACAG CGGTCATTGA CTGGAGCGAG GCGATGTTCG GGGATTCCCA 1600 ATACGAGGTC GCCAACATCT TCTTCTGGAG GCCGTGGTTG GCTTGTATGG 16 50 AGCAGCAGAC GTACTTCGAG CGGAGGCATC CGGAGCTTGC AGGATCGCCG 1700 CGGCTCCGGG CGTATATGCT CCGCATTGGT CTTGACCAAC TCTATCAGAG 1750 65ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ CTTGGTTGAC GGCAATTTCG ATGATGCAGC TTGGGCGCAG GGTCGATGCG 1800 ACGCAATCGT CCGATCCGGA GCCGGGACTG TCGGGCGTAC ACAAATCGCC 1850 CGCAGAAGCG CGGCCGTCTG GACCGATGGC TGTGTAGAAG TACTCGCCGA 1900 TAGTGGAAAC CGACGCCCCA GCACTCGTCC GAGGGCAAAG GAATAGAGTA 1950 GATGCCGACC GAAGGATCCC CGGGGAATTC AATCGATGGC CGCCATGGCC 2000 CAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA 2050 CAAATTTCAC AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTT5 2100 TCCAAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC TGGATCGATC GGGAATTAAT 2150 TCGGCGCAGC ACCATGGCCT GAAATAACCT CTGAAAGAGG AACTTGGTTA 2200 GGTACCTTCT GAGGCGGAAA GAACCAGCTG TGGAATGTGT GTCAGTTAGG 2250 GTGTGGAAAG TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC 2300 ATCTCAATTA GTCAGCAACC AGGTGTGGAA AGTCCCCAGG CTCCCCAGCA 2350 GGCAGAAGTA TGCAAAGCAT GCATCTCAAT TAGTCAGCAA CCATAGTCCC 2400 GCCCCTAACT CCGCCCATCC CGCCCCTAAC TCCGCCCAGT TCCGCCCATT 2450 CTCCGCCCCA TGGCTGACTA ΑΤΤΤΤΤΤΤΤΑ TTTATGCAGA GGCCGAGGCC 2500 GCCTCGGCCT CTGAGCTATT CCAGAAGTAG TGAGGAGGCT TTTTTGGAGG 2550 CCTAGGCTTT TGCAAAAAGC TAGCTTATCC GGCCGGGAAC GGTGCATTGG 2600 AACGCGGATT CCCCGTGCCA AGAGTCAGGT AAGTACCGCC TATAGAGTCT 2650 ATAGGCCCAC CCCCTTGGCT TCGTTAGAAC GCGGCTACAA TTAATACATA 2700 ACCTTTTGGA TCGATCCTAC TGACACTGAC ATCCACTTTT TCTTTTTCTC 2750 CACAGGTGTC CACTCCCAGG TCCAACTGCA CCTCGGTTCG CGAAGCTAGC 2800 TTGGGCTGCA TCGATTGAAT TCCACCATGG GATGGTCATG TATCATCCTT 2850 TTTCTAGTAG CAACTGCAAC TGGAGTACAT TCAGATATCC AGCTGACCCA 2900 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ 6 6 GTCCCCGAGC TCCCTGTCCG CCTCTGTGGG CGATAGGGTC ACCATCACCT 2950 GCCGTGCCAG TCAGAGCGTC GATTACGATG GTGATAGCTA CATGAACTGG 3000 TATCAACAGA AACCAGGAAA AGCTCCGAAA CTACTGATTT ACGCGGCCTC 3050 GTACCTGGAG TCTGGAGTCC CTTCTCGCTT CTCTGGATCC GGTTCTGGGA 3100 CGGATTTCAC TCTGACCATC AGCAGTCTGC AGCCGGAAGA CTTCGCAACT 3150 TATTACTGTC AGCAAAGTCA CGAGGATCCG TACACATTTG GACAGGGTAC 32 00 CAAGGTGGAG ATCAAACGAA CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC 3250 CGCCATCTGA TGAGCAGTTG AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG 3300 CTGAATAACT TCTATCCCAG AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA 3 350 CGCCCTCCAA TCGGGTAACT CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA 3400 AGGACAGCAC CTACAGCCTC AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC 3450 TACGAGAAAC ACAAAGTCTA CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG 3500 CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT TCAACAGGGG AGAGTGTTAA GCTTCGATGG 3550 CCGCCATGGC CCAACTTGTT TATTGCAGCT TATAATGGTT ACAAATAAAG 3600 CAATAGCATC ACAAATTTCA CAAATAAAGC ATTTTTTTCA CTGCATTCTA 3650 GTTGTGGTTT GTCCAAACTC ATCAATGTAT CTTATCATGT CTGGATCGAT 3700 CGGGAATTAA TTCGGCGCAG CACCATGGCC TGAAATAACC TCTGAAAGAG 3750 GAACTTGGTT AGGTACCTTC TGAGGCGGAA AGAACCAGCT GTGGAATGTG 3800 TGTCAGTTAG GGTGTGGAAA GTCCCCAGGC TCCCCAGCAG GCAGAAGTAT 3850 GCAAAGCATG CATCTCAATT AGTCAGCAAC CAGGTGTGGA AAGTCCCCAG 3900 GCTCCCCAGC AGGCAGAAGT ATGCAAAGCA TGCATCTCAA TTAGTCAGCA 3950 ACCATAGTCC CGCCCCTAAC TCCGCCCATC CCGCCCCTAA CTCCGCCCAG 4000 ATTTATGCAG 4050

TTCCGCCCAT TCTCCGCCCC ATGGCTGACT 67ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ AGGCCGAGGC CGCCTCGGCC TCTGAGCTAT TCCAGAAGTA GTGAGGAGGC 4100 TTTTTTGGAG GCCTAGGCTT TTGCAAAAAG CTGTTAACAG CTTGGCACTG 4150 GCCGTCGTTT TACAACGTCG TGACTGGGAA AACCCTGGCG TTACCCAACT 4200 TAATCGCCTT GCAGCACATC CCCCCTTCGC CAGCTGGCGT AATAGCGAAG 4250 AGGCCCGCAC CGATCGCCCT TCCCAACAGT TGCGTAGCCT GAATGGCGAA 4300 TGGCGCCTGA TGCGGTATTT TCTCCTTACG CATCTGTGCG GTATTTCACA 4350 CCGCATACGT CAAAGCAACC ATAGTACGCG CCCTGTAGCG GCGCATTAAG 4400 CGCGGCGGGT GTGGTGGTTA CGCGCAGCGT GACCGCTACA CTTGCCAGCG 4450 CCCTAGCGCC CGCTCCTTTC GCTTTCTTCC CTTCCTTTCT CGCCACGTTC 4500 GCCGGCTTTC CCCGTCAAGC TCTAAATCGG GGGCTCCCTT TAGGGTTCCG 4550 ATTTAGTGCT TTACGGCACC TCGACCCCAA AAAACTTGAT TTGGGTGATG 4600 GTTCACGTAG TGGGCCATCG CCCTGATAGA CGGTTTTTCG CCCTTTGACG 4650 TTGGAGTCCA CGTTCTTTAA TAGTGGACTC TTGTTCCAAA CTGGAACAAC 4700 ACTCAACCCT ATCTCGGGCT ATTCTTTTGA TTTATAAGGG ATTTTGCCGA 4750 TTTCGGCCTA TTGGTTAAAA AATGAGCTGA TTTAACAAAA ATTTAACGCG 4S00 AATTTTAACA AAATATTAAC GTTTACAATT TTATGGTGCA CTCTCAGTAC 4850 AATCTGCTCT GATGCCGCAT AGTTAAGCCA ACTCCGCTAT CGCTACGTGA 4900 CTGGGTCATG GCTGCGCCCC GACACCCGCC AACACCCGCT GACGCGCCCT 4950 GACGGGCTTG TCTGCTCCCG GCATCCGCTT ACAGACAAGC TGTGACCGTC 5000 TCCGGGAGCT GCATGTGTCA GAGGTTTTCA CCGTCATCAC CGAAACGCGC 5050 GAGGCAGTAT TCTTGAAGAC GAAAGGGCCT CGTGATACGC CTATTTTTAT 5100 AGGTTAATGT CATGATAATA ATGGTTTCTT AGACGTCAGG TGGCACTTTT 5150 CGGGGAAATG TGCGCGGAAC CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC 5200 68 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ AAATATGTAT CCGCTCATGA GACAATAACC CTGATAAATG CTTCAATAAT 5250 ATTGAAAAAG GAAGAGTATG AGTATTCAAC ATTTCCGTGT CGCCCTTATT 5300 CCCTTTTTTG CGGCATTTTG CCTTCCTGXT TTTGCTCACC CAGAAACGCT 5350 GGTGAAAGTA AAAGATGCTG AAGATCAGTT GGGTGCACGA GTGGGTTACA 5400 TCGAACTGGA TCTCAACAGC GGTAAGATCC TTGAGAGTTT TCGCCCCGAA 5450 GAACGTTTTC CAATGATGAG CACTTTTAAA GTTCTGCTAT GTGGCGCGGT 5500 ATTATCCCGT GATGACGCCG GGCAAGAGCA ACTCGGTCGC CGCATACACT 5550 ATTCTCAGAA TGACTTGGTX GAGTACTCAC CAGTCACAGA AAAGCATCTT 5600 ACGGATGGCA TGACAGTAAG AGAATTATGC AGTGCTGCCA TAACCATGAG 5650 TGATAACACT GCGGCCAACT TACTTCTGAC AACGATCGGA GGACCGAAGG 5700 AGCTAACCGC TTTTTTGCAC AACATGGGGG ATCATGTAAC TCGCCTTGAT 5750 CGTTGGGAAC CGGAGCTGAA TGAAGCCATA CCAAACGACG AGCGTGACAC 5Β00 CACGATGCCA GCAGCAATGG CAACAACGTT GCGCAAACTA TTAACTGGCG 5850 AACTACTTAC TCTAGCTTCC CGGCAACAAT TAATAGACTG GATGGAGGCG 5900 GATAAAGTTG CAGGACCACT TCTGCGCTCG GCCCTTCCGG CTGGCTGGTT 5950 TATTGCTGAT AAATCTGGAG CCGGTGAGCG TGGGTCTCGC GGTATCATTG 6 000 CAGCACTGGG GCCAGATGGT AAGCCCTCCC GTATCGTAGT TATCTACACG 6050 ACGGGGAGTC AGGCAACTAT GGATGAACGA AATAGACAGA TCGCTGAGAT 6100 AGGTGCCTCA CTGATTAAGC ATTGGTAACT GTCAGACCAA GTTTACTCAT 6150 ATATACTTTA GATTGATTTA AAACTTCAXT ΤΤΤΑΑΊΤΤΑΑ AAGGATCTAG 6200 GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT AACGTGAGTT 6250 TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT 6300 GAGATCCTTT TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA 6350 69 ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ CCGCTACCAG CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT 6400 TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA GATACCAAAT ACTGTCCTTC 6450 TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT AGCACCGCCT 6500 ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG CCAGTGGCGA 6550 TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG 6600 CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG 6650 CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC ATTGAGAAAG 6700 CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG GTAAGCGGCA 6750 GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG AAACGCCTGG 6800 TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG AGCGTCGATT 6850 TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACO 6900 CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATGTTC 6 950 TTTCCTGCGT TATCCCCTGA TTCTGTGGAT AACCGTATTA CCGCCTTTGA 7000 GTGAGCTGAT ACCGCTCGCC GCAGCCGAAC GACCGAGCGC AGCGAGTCAG 7050 TGAGCGAGGA AGCGGAAGAG CGCCCAATAC GCAAACCGCC TCTCCCCGCG 7100 CGTTGGCCGA TTCATTAATC CAGCTGGCAC GACAGGTTTC CCGACTGGAA 7150 AGCGGGCAGT GAGCGCAACG CAATTAATGT GAGTTACCTC ACTCATTAGG 7200 CACCCCAGGC TTTACACTTT ATGCTTCCGG CTCGTATGTT GTGTGGAATT 7250 GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGCTATGACC ATGATTACGA 7300 ΑΤΤΑΑ 7305

Lisboa

Claims

ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Construção de ADN compreendendo um local de início da transcrição, um local de terminação da transcrição, um gene seleccionável, um gene de produto proporcionado a 3' do gene seleccionável, uma região reguladora da transcrição a regular a transcrição de ambos, o gene seleccionável e o gene de produto, estando o gene seleccionável posicionado dentro de um intrão possuindo um local dador de "splicing" a 5' do intrão, em que o local da sequência dadora de "splicing" regula a expressão do gene de produto utilizando a região reguladora da transcrição e o gene seleccionável é um gene amplificável.
2. Construção de ADN de acordo com a reivindicação 1, em que o local dador de "splicing" compreende uma sequência dadora de "splicing" de consenso.
3. Construção de ADN de acordo com a reivindicação 1, em que o local dador de "splicing" compreende a sequência GACGTAAGT.
4. Construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o gene amplificável é DHFR.
5. Construção de ADN de acordo com a reivindicação 1, em que a região reguladora da transcrição compreende um promotor e um estimulador.
6. Vector compreendendo a construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
7. Vector de acordo com a reivindicação 6 que é capaz de replicar num hospedeiro eucariota.
8. Célula hospedeira eucariota compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7.
9. Célula hospedeira eucariota compreendendo a construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
10. Célula hospedeira eucariota compreendendo a construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 integrada num cromossoma da célula hospedeira. ΕΡ Ο 770 136 /ΡΤ 2/2
11. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10 que é uma célula de mamífero.
12. Método para produção de um produto de interesse compreendendo a cultura da célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 de modo a expressar o gene de produto, e a recuperação do produto a partir da cultura de células hospedeiras.
13. Método de acordo com a reivindicação 13 compreendendo a recuperação do produto a partir do meio de cultura.
14. Método para produção de um produto de interesse compreendendo a cultura da célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 de modo a expressar o gene de produto num meio selectivo compreendendo um agente de amplificação durante tempo suficiente para permitir que ocorra a amplificação, e a recuperação do produto.
15. Método para produção de células eucariotas possuindo múltiplas cópias de um gene de produto compreendendo a transformação de células eucariotas com a construção de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o crescimento das células num meio selectivo compreendendo um agente de amplificação durante um tempo suficiente para que ocorra a amplificação, e a selecção das células possuindo múltiplas cópias do gene de produto.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a construção de ADN é introduzida nas células eucariotas através de electroporação.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda a cultura das células seleccionadas de modo a expressar o gene de produto, e a recuperação a partir das células seleccionadas do produto de interesse. Lisboa,