PT789593E - Veículos para administração à base de levedura - Google Patents

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Richard C Duke
Donald Bellgrau
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Description

Esta invenção foi realizada, pelo menos em parte, com o apoio do governo, sob concessão N° AI 74747 pelos National Institutes of Health. 0 governo tem certos direitos a esta invenção.
Campo da Invenção A presente invenção é dirigida a veículos para administração à base de levedura e à sua utilização para administrar uma variedade de compostos a uma variedade de tipos de células. Os veículos de levedura da presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, como veículos para administração de fármaco, veículos para administração de gene ou veículos imunomodulatórios.
Antecedentes da Invenção
As vacinas são uma das medidas com a melhor relação custo-benefício disponíveis na indústria da assistência médica. Permanece, no entanto, uma urgente necessidade de desenvolver vacinas e adjuvantes seguros e eficazes para uma variedade de doenças, incluindo aquelas devidas a infecção por agentes patogénicos, cancros, defeitos genéticos e outros distúrbios do sistema imunológico. Rabinovich et al.f 1994, Science 265, 1401-1404, por exemplo, declara que há ainda uma necessidade para vacinas seguras e termoestáveis que possam ser administradas por via oral e que apenas necessitem ser administradas poucas vezes, preferencialmente, nos primeiros anos da vida. São também preferidas as combinações de vacinas que podem proteger os indivíduos contra mais de uma doença, bem como as vacinas que não 1 necessitam de um adjuvante e que podem induzir uma imunidade mucosal. Até a presente data, muito poucas vacinas, ou nenhumas, satisfazem estes critérios.
As vacinas de subunidades, cujo desenvolvimento foi possibilitado pela tecnologia do ADN recombinante, têm sido decepcionantes até a presente data uma vez que as mesmas apresentam apenas uma imunogenicidade limitada. Um exemplo é o recente teste clinico de várias vacinas de subunidades contra o HIV (virus da imunodeficiência humana) que foi interrompido devido a não apenas à eficácia limitada das vacinas como também porque, em alguns casos, os indivíduos imunizados apresentaram uma progressão acelerada da doença quando os mesmos foram subsequentemente expostos ao HIV; Ver, por exemplo, Cohen, 1994, Science 264, 1839; e Cohen, 1994, Science 264, 1660. Uma desvantagem das vacinas de subunidades, como as de vírus mortos e as vacinas recombinantes de vírus vivo, é que embora pareçam estimular uma forte resposta imunológica humoral, as mesmas não conseguem induzir uma imunidade celular protectora. Uma conclusão importante na Conferência Internacional da SIDA de 1994 foi que permanece uma necessidade de uma resposta citotóxica mediada por célula T para evitar, ou reduzir, a infectividade do HIV, o que, até a presente data falta nas vacinas na clínica. Além disso, as vacinas contra o HIV testadas até o momento não conseguiram provocar imunidade nas superfícies mucosais, onde ocorre a infecção primária do HIV.
Além disso, os únicos adjuvantes aprovados para utilização nos Estados Unidos são os sais de alumínio, hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, nenhum dos quais estimula a imunidade mediada por célula. Além disso, as formulações de sal de alumínio não podem ser congeladas nem liofilizadas e, tais adjuvantes não são eficazes com todos os antigénios. A levedura tem sido utilizada na produção de vacinas de subunidades de proteína, incluindo algumas daquelas testadas nos testes de vacina contra o HIV acima mencionados. A levedura também tem sido alimentada a animais antes da imunização para tentar sensibilizar a resposta imunológica de uma maneira não específica (isto é, para estimular a fagocitose bem como a produção de complemento e interferão). Os resultados foram ambíguos, e tais protocolos não geraram imunidade celular protectora; Ver, por exemplo, Fattal-German et al., 1992, Dev. Biol. Stand. 77, 115-120; Bizzini et al., 1990, FEMS Microbiol. Immunol. 2, 155-167.
Para além das vacinas, muitas terapêuticas de gene e fármaco requerem veículos de administração eficazes e específicos para assegurar o maior benefício possível. A falta de um veículo de administração adequado é um importante obstáculo à aplicação da terapêutica génica e limita, de forma significativa, o potencial terapêutico de muitos fármacos. Por exemplo, relatos recentes indicaram que os vectores adenovírus, que estão actualmente a ser testados em clínica para aplicações em terapêutica génica, estão a estimular respostas imunológicas e inflamatórias indesejáveis e não parecem estar a integrar-se de uma maneira desejada; ver, por exemplo Engelhardt et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 1217-1229 e referências aqui citadas.
Como tal, permanece uma necessidade de composições que modulem eficazmente a imunidade, seja para estimular uma resposta imunológica, tal como no caso de uma vacina, seja para suprimir uma resposta imunológica indesejável, tal como uma resposta autoimune ou uma resposta inflamatória excessiva. Permanece também a necessidade de veículos para a administração melhorada de gene e fármaco. A presente invenção inclui a surpreendente verificação de que os compostos transportados por levedura desencadeiam uma imunidade mediada por célula, sem a necessidade de um adjuvante. Como tal, a presente invenção inclui vacinas à base de levedura que satisfazem os critérios citados nas secções dos antecedentes. Isto é, os veículos de levedura da presente invenção compreendendo levedura não patogénica que transporta, pelo menos, um composto capaz de modular uma resposta imune: a) são eficazes na estimulação da imunidade mediada por células, bem como a imunidade humoral; b) são seguros; c) têm vida útil prolongada (isto é, são estáveis em armazenagem durante longos períodos de tempo); d) podem ser administrados por via oral; e) requerem muito poucas, ou nenhumas, imunizações de reforço; f) podem ser combinações de vacinas uma vez que as mesmas podem ser modificadas para transportar compostos múltiplos; g) não requerem um adjuvante; e h) podem induzir imunidade nas superfícies mucosais.
De acordo com a presente invenção, é proporcionada a utilização na preparação de uma vacina para modulação de uma resposta imunológica mediada por célula ou uma resposta imunológica humoral num animal, um veículo de levedura seleccionado de um microrganismo de levedura, um esferoplasto de 4 levedura, um citoplasto de levedura, a referida levedura transportando, pelo menos, um composto heterólogo compreendendo um antigénio ou uma citocina ou uma combinação destes.
Os veículos de levedura podem administrar compostos a um tipo de célula gue é capaz de adsorver levedura ou podem ser modificados para administrar compostos, de forma selectiva, a tipos desejados de células.
Os compostos heterólogos preferidos para incluir em veículos de levedura da presente invenção incluem moléculas de ácido nucleico, péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, compostos protectores inorgânicos, outros compostos protectores orgânicos e misturas de tais compostos. Os veículos de levedura da presente invenção podem incluir compostos heterólogos que protegem organismos contra uma variedade de doenças, dependendo da natureza do composto, incluindo defeitos genéticos, doenças provocadas por agentes infecciosos e outros distúrbios metabólicos.
Os veículos de levedura preferidos da presente invenção são capazes de modular a resposta imunológica de um organismo. Tais veículos de levedura podem ser concebidos tanto para estimular uma resposta imunológica protectora como para suprimir uma resposta imunológica prejudicial. Tais veículos de levedura são particularmente úteis porque os mesmos estimulam as respostas imunológicas mediadas por célula, bem como as respostas imunológicas humorais.
Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 inclui gráficos que representam a proliferação in vitro de células T isoladas de murganhos administrados com os veículos de levedura da presente invenção. A Fig. 2 representa um ensaio de imunotransferência Western de soros isolados de murganhos administrados com os veículos de levedura da presente invenção. A Fig. 3 inclui gráficos que representam a morte selectiva por células T citotóxicas geradas de murganhos administrados com os veículos de levedura da presente invenção.
Descrição Pormenorizada da Invenção A presente invenção inclui veículos de administração à base de levedura (também aqui referidos como veículos de levedura) e a sua utilização para a administração in vivo, ex vivo e/ou in vitro de compostos a células. Um aspecto surpreendente da presente invenção é que os veículos de levedura são veículos de administração particularmente úteis com certas vantagens não compartilhadas por outros veículos de administração e os inventores não estão cientes de qualquer utilização de levedura como veículos de administração antes da presente invenção.
Os veículos de administração à base de levedura da presente invenção têm inúmeros vantagens, incluindo, mas não limitadas à facilidade de manipulação utilizando técnicas genéticas clássicas e/ou recombinantes, a capacidade de dirigir os compostos para células que naturalmente adsorvem células de levedura e a capacidade de modificar geneticamente a levedura para dirigir os compostos a outros tipos desejados de células. Numa forma de realização preferida, tais veículos de levedura são capazes de ligar-se e fundir-se com o tipo desejado de célula para formar sincícios, administrando, deste modo, o composto de uma maneira eficaz a uma elevada percentagem de células alvo. As estirpes de leveduras não patogénicas também representam veículos de administração seguros e inúmeras estirpes de levedura, incluindo a Saccharomyces cerevisiae, foram consideradas pela "Food and Drug Administration" dos 6
Estados Unidos como sendo GRAS (isto é, geralmente reconhecidas como seguras) para utilização em produtos alimentares. Os veiculos de levedura da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de vias, conforme discutido em pormenor adiante, incluindo por via oral.
Os veiculos de levedura são também vantajosos pelo facto de poderem transportar um ou mais compostos e poderem ser geneticamente modificados para transportar um ou mais moléculas de ácido nucleico capazes de efectuar terapêutica génica e/ou de codificar uma ou mais proteínas e/ou moléculas de ARN. Um veículo de levedura pode transportar um composto no interior do veículo de levedura, na superfície da membrana da levedura, pela extensão da membrana da levedura, no interior do periplasma da levedura e combinações destes. Como tal, pelo menos um pouco do composto permanece associado com o veículo de levedura, pelo menos até que o veículo alcance o seu alvo, ou local de acção (por exemplo, a corrente sanguínea, os tecidos intersticiais, ou uma célula), altura em que é também possível que um composto transportado pelo veículo de levedura possa, pelo menos em parte, ser libertado (por exemplo, vazar) do veículo.
Uma vantagem particularmente surpreendente, bem como muito significativa, de um veículo de levedura da presente invenção é que, quando utilizado numa forma de realização para modular (isto é, regular) a resposta imunológica, a administração a um animal do veículo de levedura transportador de antigénio induz o animal a produzir uma resposta imunológica mediada por células, bem como uma resposta imunológica humoral contra aquele antigénio, aparentemente também sem causar efeitos secundários. Tal propriedade tem sido muito procurada sem um grande sucesso utilizando microrganismos mortos (por exemplo, bactérias ou vírus), vacinas de subunidade, vacinas transportadas em veiculos virais ou bacterianos e vacinas que incluem um adjuvante. Sem querer estar ligado por teoria, crê-se que a porção de levedura 3 do veículo de levedura actua como um adjuvante para estimular a imunidade em resposta ao antigénio e que, pelo facto da levedura estar, de facto, a transportar o antigénio, a levedura é capaz de afectar MHC de classe I (conforme demonstrado, por exemplo, pela produção de células T citotóxicas que podem atingir o antigénio), bem como imunidade mediada por MHC de classe II (conforme demonstrado, por exemplo, pela produção de anticorpo) contra o antigénio. Deve-se observar que, conforme aqui utilizado, um antigénio refere-se a qualquer composto que seja capaz de produzir uma resposta imunológica quando administrado a um organismo, de preferência levando a uma resposta protectora. Os antigénios podem incluir imunogénios e toleragénios.
Além disso, os veículos de levedura da presente invenção, aparentemente, não provocam efeitos secundários significativos tais como os que acompanham outros adjuvantes. Mesmos os murganhos imunodeficientes (por exemplo, SCID) que são administrados com um veículo de levedura da presente invenção compreendendo um gene de HIV gpl60 inserido numa estirpe de levedura S. cerevisiae não são afectados de forma adversa pelo veículo de levedura. Esta verificação é particularmente relevante para a utilização de veículos de levedura da presente invenção para proteger contra doença os indivíduos imunodeficientes, bem como os imunocompetentes.
Além disso, conforme será discutido em pormenor adiante, os veículos de levedura da presente invenção podem modular uma resposta imunológica não só para estimular (isto é, induzir, produzir e/ou aumentar) uma resposta imunológica protectora, mas também para suprimir (isto é, reduzir, inibir, bloquear) uma resposta imunológica superactiva ou prejudicial. Dependendo de como são modificados, os veículos de levedura da presente invenção também podem, de preferência, intensificar, ou ampliar, a imunidade mediada por célula comparada com a imunidade humoral ou vice-versa. 8
Deve ser entendido que o termo "uma" ou "umas" entidade refere-se a uma ou mais entidades. Como tal, os termos "uma" (ou "umas"), "uma ou mais" e "pelo menos uma", podem ser utilizados aqui de forma intermutável. De acordo com a presente invenção, um composto é transportado pela porção de levedura do veiculo, uma caracteristica que é também aqui referida como o veiculo de levedura transporta o composto. 0 composto transportado pelo veiculo de levedura (mais especificamente, pela porção de levedura) é heterólogo à porção da levedura do veiculo, o que significa que o composto é derivado de uma espécie ou subespécie de levedura ou outro organismo que é diferente da estirpe (isto é, espécies, subespécies) de levedura utilizada na produção da porção de levedura do veiculo. Tal composto compreende um antigénio e/ou uma citocina não encontrados naturalmente na estirpe de levedura utilizada na produção do veiculo e, numa forma de realização preferida, pode ser uma molécula de ácido nucleico que é heteróloga à estirpe de levedura utilizada na produção do veiculo, e/ou um composto codificado por tal molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de ARN ou uma proteína).
Conforme aqui utilizado, um veículo de levedura da presente invenção inclui tanto uma porção de levedura como um composto que é transportado pela porção de levedura. Uma porção de levedura de um veículo de levedura da presente invenção refere-se a qualquer estirpe de levedura ou derivado e compreende um microrganismo de levedura (isto é, uma célula de levedura tendo todos os seus componentes incluindo uma parede celular), um esferoplasto de levedura (isto é, uma células de levedura sem uma parede celular), um citoplasto de levedura (isto é, uma célula de levedura sem uma parede celular e núcleo) ou um fantasma de levedura (isto é, uma de levedura sem uma parede celular, núcleo e citoplasma). Os fantasmas de levedura são produzidos, tipicamente, libertando uma célula permeabilizada ou lisada e podem, mas não necessitam conter, pelo menos, alguns dos organelos daquela célula.
Qualquer estirpe de levedura pode ser utilizada para produzir um veiculo de levedura da presente invenção. A levedura é um microrganismo unicelular que pertence a uma de três classes: Ascomycetes, Basidiomycetes e Fungi Imperfecti, Embora as estirpes de levedura patogénica, ou os seus mutantes não patogénicos, tenham sido utilizadas no passado com adjuvantes ou como modificadoras da resposta biológica e possam ser utilizadas de acordo com a presente invenção, as estirpes não patogénicas de levedura são preferidas. Os géneros preferidos de estirpes de levedura incluem Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula,
Schizosaccharomyces e Yarrowia, com Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia e Schizosaccharomyces sendo os mais preferidos e com Saccharomyces sendo particularmente preferido. As espécies de estirpes de levedura preferidas incluem Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cari sbergensis, Candida albicans,
Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anómala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe, e Yarrowia lipolytica. Deve também ser entendido que inúmeras destas espécies incluem uma variedade de subespécies, tipos, subtipos, etc., que devem ser incluídos nas espécies acima mencionadas. As espécies de levedura mais preferidas incluem S. cerevisiae, C. albicans, H. polymorpha, P. pastoris e S. pombe. S. cerevisiae é particularmente preferida pelo facto da mesma ser relativamente fácil de manipular e por ser GRAS. Uma forma de realização da presente invenção é uma estripe de levedura que é capaz de replicar plasmídeos num número de cópias particularmente elevado, tal como uma estirpe de círculo [cir°] de S. cerevisiae.
Uma doença pode referir-se a qualquer desvio da saúde normal de qualquer parte de um animal e, como tal, pode incluir estados em que os sintomas da doença são evidentes bem como os estados em que ocorreu um desvio (por exemplo, infecção, mutação genética, etc.) mas os sintomas ainda não são evidentes. Os veículos da presente invenção são particularmente úteis como veículos para administrar compostos para combater uma ou mais doenças a afligir um animal. Exemplos de doenças contra as quais proteger um animal incluem, mas não se limitam a infecção, defeitos genéticos e outros distúrbios metabólicos. Tais classes de doenças podem levar ao crescimento anormal de células (por exemplo, neoplasia benigna ou maligna, síndromas hiperplásticas), processos degenerativos e/ou defeitos imunológicos, bem como a inúmeros outros distúrbios.
Um agente infeccioso pode ser qualquer agente que pode infectar um animal e provocar doença. Tal doença pode desenvolver-se rapidamente ou depois de um período de tempo prolongado. Os agentes infecciosos adequados contra os quais proteger os animais utilizando os veículos de levedura da presente invenção incluem, mas não se limitam a viróides, priões, vírus, bactérias, fungos (incluindo levedura), protozoários (por exemplo, amebas, flagelados e esporozoários), helmintos e ectoparasitas. Encontra-se no âmbito da presente invenção proteger um animal contra um ou mais de um agente infeccioso. Deve também ser entendido que, embora alguns agentes infecciosos não tenham sido classificados de forma definitiva num destes grupos, tais agentes infecciosos estão também incluídos na presente invenção.
Os veículos de levedura preferidos são capazes de proteger um animal contra infecção por agentes infecciosos que causam danos, por exemplo, aos sistemas auditivo, dérmico, entérico, imunológico, neurológico, oral/dental, reprodutivo, respiratório e/ou urinário dos animais. Tais agentes infecciosos incluem, mas il não se limitam a adenovírus, arenavírus, bunyavírus, coronavirus, hepadnavirus, herpes vírus, mixo vírus, vírus oncogénicos, ortomixovírus, papovavírus, paramixo vírus, parvovírus, picornavírus, vírus da varíola, vírus da raiva, reovírus, rabdovírus, vírus da rubéola, togavírus, vírus de plantas, Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dírofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Toxoplasma e Vibriocholeiae bem como outros agentes infecciosos que provocam infecções oportunísticas em animais que são imunodeficientes ou, então, irnunossuprimidos. Os agentes infecciosos adicionais preferidos incluem outros microrganismos prejudiciais encontrados em água salobra, contaminantes de alimentos e feridas.
Os vírus preferidos contra os quais proteger os animais utilizando os veículos de levedura da presente invenção incluem os vírus Coxsackie, citomegalovírus, vírus Epstein-Barr, flavivírus, vírus da hepatite, vírus do herpes, vírus da influenza, vírus do sarampo, vírus da parotidite, vírus do papiloma, vírus da parainfluenza, parvovírus, vírus da raiva, virus respiratório sincicial, retrovírus e vírus da varicela.
Os vírus mais preferidos são os retrovírus, vírus do herpes e vírus da hepatite com os vírus da leucemia, linfotrópicos sarcoma e os lentivírus sendo ainda mais preferidos, como são outros vírus da imunodeficiência ou de tumores. Os vírus linfotrópicos particularmente preferidos contra os quais proteger os animais incluem os vírus T-linfotrópicos, tais como os vírus linfotrópicos da célula T humana (HTLVs, tais como o HTLV-I e o HTLV-11), os vírus da leucemia bovina (BLVS) e os vírus da leucemia felina (FLVs). Os lentivírus particularmente preferidos incluem os vírus da imunodeficiência humana (HIV), dos símios (SIV), felina (FIV) e canina (CIV), com o HIV-1 e o HIV-2 sendo ainda mais preferidos.
Os veículos de levedura da presente invenção são capazes de transferir uma molécula de ácido nucleico que compreende um gene, ou uma porção do mesmo, para um tipo de célula apropriado a fim de corrigir um defeito genético. Conforme aqui utilizado, os defeitos genéticos incluem as mutações que afectam a linha germinal, bem como as mutações somáticas que causam muitas formas de cancro, bem como as doenças autoimunes e outros distúrbios imuno-defeituosos. Os veículos de levedura da presente invenção podem ser utilizados para corrigir qualquer defeito genético utilizando a propensão natural da levedura para certos tipos de células e/ou, conforme apropriado, dirigindo os veículos de levedura para tipos adicionais de células. Os defeitos genéticos contra os quais proteger os animais incluem, mas não se limitam a distúrbios dos factores sanguíneos, cancros ligados a um defeito genético (incluindo activação do oncogene, perda da função do gene supressor de tumor), fibrose cística, doença de Gaucher, hemoglobinopatias (tais como a talassemia e a anemia das células falciformes), hipercolesterolemia, síndroma de Lesch Nyham, distrofia muscular, distúrbios da sinalização de proteína, doença de Tay Sachs e combinações de tais defeitos (isto é, misturas ou combinações dos mesmos). Conforme aqui utilizado, a terapêutica génica inclui métodos para "ligar" a expressão de genes desejados, bem como métodos para "desligar" a expressão de genes prejudiciais. Como tal, a terapêutica génica inclui a introdução de regiões reguladoras e/ou regiões de codificação para tipos de células desejadas a fim de corrigir defeitos genéticos resultantes da desregulação da expressão de genes bem como da perda das regiões de codificação funcional.
As doenças adicionais contra as quais proteger um animal utilizando um veículo de levedura da presente invenção incluem, mas não se limitam a alergias, anemias, doenças autoimunes (por exemplo, diabetes, esclerose múltipla, artrite reumatóide), cancros, doenças cardiovasculares, doenças de enxerto versus hospedeiro (GVHD), distúrbios hematopoiéticos, doenças por imunodeficiências, doenças imunoproliferativas, distúrbios imunossupressores, doenças inflamatórias, icterícia, distúrbios mielossupressores, rejeição de aloenxertos ou xenoenxertos, choque séptico, outros defeitos imunológicos e combinações destes. Muitas destas doenças podem ser agudas ou crónicas. Exemplos de doenças em particular, contra as quais os animais podem ser protegidos utilizando os veículos de levedura da presente invenção estão aqui descritas. Deve ser entendido que estes exemplos são pretendidos apenas como tal e não limitam a ampla variedade de doenças contra as quais os veículos de levedura apropriadamente concebidos da presente invenção podem proteger os animais.
Deve ser entendido que quando se utiliza veículos de levedura viva, é importante seleccionar compostos heterólogos que não danificam a levedura de forma substancial. A transformação de uma molécula de ácido nucleico numa célula de levedura pode ser conseguida por qualquer método por meio do qual uma molécula de ácido nucleico pode ser inserida dentro da célula. As técnicas de transformação incluem, mas não se limitam a transfecção, electroporação, microinjecção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplasto. As moléculas de ácido nucleico transformadas podem ser integradas num cromossoma de levedura ou mantida em vectores extracromossomais utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Exemplos de veículos de levedura que transportam tais moléculas de ácido nucleico estão descritos aqui em pormenor.
Conforme aqui utilizado, um péptido compreende uma sequência de aminoácido menor ou igual a cerca de 30 aminoácidos, enquanto uma proteína compreende uma sequência de aminoácido de mais de cerca de 30 aminoácidos; as proteínas podem ser multiméricas. Os 14 péptidos e as proteínas podem ser derivatizados seja naturalmente seja sinteticamente; tais modificações podem incluir, mas não se limitam a glicosilação, fosforilação, acetilação, miristilação, prenilação, palmitoilação, amidação e/ou a adição de glicerofosfatidil inositol. Os péptidos e as proteínas podem ser inseridos directamente dentro dos veículos de levedura da presente invenção por meio de métodos conhecidos dos especialistas na técnica, tais como electroporação, fusão de lipossoma ou banho de sonicação, ou podem ser produzidos por moléculas de ácido nucleico transformadas em veículos de levedura conforme aqui descrito. Os péptidos e as proteínas podem ser de inúmeros tipos, incluindo, mas não limitadas a anticorpos, enzimas, proteínas reguladoras e toxinas.
Deve ser entendido que os veículos de levedura carregados incluem veículos de levedura dentro dos quais são inseridas moléculas de ácido nucleico, péptidos e/ou proteínas utilizando técnicas conhecidas, tais como aquelas descritas acima.
Os antigénios preferidos para serem incluídos nos veículos de levedura da presente invenção incluem antigénios virais, moléculas de superfície celular de mamífero, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénios de protozoários, antigénios de helmintos, antigénios de ectoparasita e/ou antigénio do cancro. Os compostos particularmente preferidos para serem incluídos nos veículos de levedura da presente invenção incluem os antigénios virais, antigénios do cancro, receptores de superfície de célula de mamífero e ligandos de tais receptores, bem como moléculas de ácido nucleico que codificam tais compostos e/ou oligonucleótidos que bloqueiam a produção de tais compostos.
Os compostos preferidos para incluir em tais veículos de levedura são os antigénios virais, tais como as proteínas de superfície e/ou as proteínas de núcleo virai (incluindo as /5 proteínas estruturais e não estruturais), e/ou moléculas de ácido nucleico que codificam tais antigénios e/ou oligonucleótidos capazes de bloquear a produção de tais antigénios. Os antigénios particularmente preferidos (ou moléculas de ácido nucleico correspondentes aos mesmos) incluem os vírus da imunodeficiência e/ou tumores, mais preferencialmente, os do HIV (por exemplo, HIV-1 ou HIV-2), HTLV (por exemplo, HTLV-1 ou HTLV-11), FIV ou FLV.
Exemplos de antigénios virais a serem utilizados nos veículos de levedura da presente invenção incluem, mas não se limitam a env, gag, rev, tar, tat, proteínas do nucleocapsid e transcriptase reversa de vírus da imunodeficiência (por exemplo, HIV, FIV); antigénio de superfície e antigénio de núcleo HBV; antigénios HCV; proteínas do nucleocapsid da influenza; proteínas do nucleocapsid da parainfluenza; proteínas do papiloma humano do tipo 16E6 e E7; vírus Epstein-Barr LMP-1, LMP-2 e EBNA-2; herpes LAA e glicoproteína D; bem como proteínas semelhantes de outros vírus.
Exemplos de antigénio do cancro a serem utilizados em veículos de levedura da presente invenção incluem, mas não se limitam a MAGF, PSA, CEA, HER2/nev, MARTI, BCR-abl, e formas oncogénicas mutantes de p53, ras, myc e RB-1.
Exemplos de moléculas de superfície celular de mamífero a serem utilizados em veículos de levedura da presente invenção incluem antigénios MHC, anticorpos e receptores de células T bem como receptores e os seus ligandos, tais como Fas e ligando Fas, ICAM-1, LFA-1, NCAM, selectina P e VCAM.
Outros compostos antigénicos preferidos para incluir os veículos de levedura da presente invenção incluem os compostos que são antigénios derivados de agentes infecciosos preferidos e adequados, conforme descrito acima, bem como os compostos que estão ligados a doenças adicionais, conforme descrito acima, 16 tais como os antigénios tumorais. Os compostos adicionais preferidos são os compostos (incluindo compostos proteináceos) que são capazes de suprimir uma resposta imunológica indesejada ou prejudicial, tal como a que é provocada, por exemplo, por alergénios, antigénio autoimunes, agentes inflamatórios, antigénios envolvidos em GVHD, certos cancros, antigénios de choques sépticos e antigénio envolvidos em rejeições de transplantes. Tais compostos incluem, mas não se limitam a anti-histaminas, ciclosporina, corticosteróides, FK506, péptidos correspondentes a receptores de célula T envolvidos na produção de uma resposta imunológica prejudicial, ligandos Fas (isto é, compostos que se ligam a receptores celulares Fas, induzindo, deste modo, a apoptose), complexos MHC adequados apresentados de tal maneira a efectuar a tolerização ou anergia, receptores de célula T e antigénios autoimunes, preferencialmente em combinação com um modificador de resposta biológica capaz de intensificar ou suprimir a imunidade celular e/ou humoral. Incluídos também como compostos preferidos são as moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer dos compostos acima mencionados que são proteináceos.
Conforme aqui utilizado, os compostos que podem modular uma resposta imunológica são os compostos que, particularmente quando administrados como parte de um veiculo de levedura, são capazes de regular uma resposta imunológica a fim de estimular uma resposta imunológica desejada (isto é, protectora), ou suprimir uma resposta imunológica que é prejudicial (isto é, nociva, perniciosa) ao organismo. A modulação também inclui a capacidade de permutar entre respostas imunológicas humorais primárias. Os veículos de levedura são bem adequados para serem utilizados para modular uma resposta imunológica, particularmente à luz da descoberta pelos inventores de que os veículos de levedura da presente invenção são capazes de estimular a imunidade mediada por células bem como a humoral. Embora ainda seja desconhecido porquê os compostos de antigénio transportados por veículos de levedura são processados pela via à base de MHC de classe I, a identificação de veículos de levedura como sendo capazes de estimular a imunidade mediada por célula é bastante vantajosa.
Os veículos de levedura da presente invenção também incluem compostos modificadores da resposta biológica, ou a capacidade de produzir tais modificadores (isto é, portando genes que codificam tais modificadores). Os preferidos são os veículos de levedura que incluem, pelo menos, um antigénio e, pelo menos, um composto modificador da resposta biológica. Os modificadores de resposta biológica são compostos que podem modular as respostas imunológicas. Certos modificadores da resposta biológica podem estimular uma resposta imunológica protectora, ao passo que outros podem suprimir uma resposta imunológica prejudicial. Certos modificadores da resposta biológica, preferencialmente, intensificam uma resposta imunológica mediada por célula, ao passo que outros, preferencialmente, intensificam uma resposta imunológica humoral (isto é, podem estimular uma resposta imunológica na qual há um nível aumentado de imunidade celular comparado com o de imunidade humoral, ou vice-versa). Há inúmeros métodos conhecidos dos especialistas na técnica para medir a estimulação ou supressão das respostas imunológicas, bem como para diferenciar as respostas imunológicas celulares das respostas imunológicas humorais.
Os modificadores de resposta biológica adequados incluem citocinas e outros moduladores do crescimento, tais como, mas não limitados a interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 1 - O ) , interleucina 12 L - 2 interferão gama (IFN-gama) factor de crescimento I do tipo insulina (IGF-I), e/ou factor de crescimento de transformação beta (TGF-β). a capacidade de um veículo de levedura em expressar (isto é, produzir) e, preferencialmente, segregar, IL-2, IL-12 e/ou IFN-gama, preferencialmente, intensifica a imunidade mediada por célula, ao passo que a capacidade de um veículo de levedura em expressar, e, preferencialmente, segregar, IL-4, IL-5 e/ou IL-10, preferencialmente, intensifica a imunidade humoral.
Uma vantagem da presente invenção é que os veículos de levedura da presente invenção podem atingir os tipos de células desejados administrando, deste modo, os compostos, essencialmente, apenas a um subconjunto seleccionado de todos os tipos de célula. Isto é, os veículos de levedura podem administrar os seus compostos a um tipo de célula desejado, mas, essencialmente não a outro tipo de célula, com base, por exemplo, na capacidade do veículo de levedura de reconhecer as moléculas da superfície da célula que estão presentes no tipo de célula desejado (isto é, o tipo de célula atingido), mas estão essencialmente não ausentes dos outros tipos de célula (isto é, os tipos de célula não atingidos). Isto é, o veículo de levedura é capaz de reconhecer, de forma selectiva, o tipo de célula seleccionado. Numa forma de realização, confia-se na capacidade inerente das células de levedura de serem adsorvidas por certos tipos de células para administrar os compostos transportados por veículos de levedura da presente invenção a estes tipos de células. Conforme utilizado aqui, o termo adsorver refere-se à capacidade de um certo tipo de célula de tomar os veículos de levedura da presente invenção por meio, por exemplo, da endocitose ou fagocitose. Numa outra forma de realização, os veículos de levedura são geneticamente modificados para dirigir compostos para uma variedade de tipos de células adicionais.
Conforme aqui utilizado, um tipo de célula refere-se a uma classe de células (por exemplo, linfócitos, células musculares, células epiteliais, etc.) e pode incluir células únicas, agregados de células, tecidos e órgãos. 0 composto, que é transportado pela porção de levedura do veículo, é heterólogo à porção de levedura. É descrita, até aqui, uma variedade de compostos adequados e preferidos.
Salvo se forem modificados para fazer de outra forma, os veiculos de levedura da presente invenção podem administrar compostos a tipos de células que naturalmente adsorvem a levedura. Os tipos de células naturalmente atingidos por levedura, incluem, mas não se limitam a células da linhagem granulocitica-monocitica, linfócitos B e línfócitos T. Exemplos de células da linhagem granulocitica-monocitica incluem, mas não se limitam a células dendriticas, histiócitos, células de Kupffer, células de Langerhans, outros macrófagos (incluindo alveolar e livre de baço e macrófagos fixos), microglia, neutrófilos, osteoclastos e células reticulo-endoteliais. Estes veiculos de levedura são particularmente preferidos para a estimulação da imunidade mucosal, uma vez que estes veiculos são capazes de atingir células localizadas nas regiões epiteliais de um animal. Como tal, estes veiculos de levedura são particularmente adequados para proteger animais contra doenças que afectam os tecidos epiteliais, tais como as infecções virais e cancros epiteliais, incluindo, mas não limitado ao cancro do cólon e certos cancros do pulmão.
Os veiculos de levedura adicionais da presente invenção são modificados para administrar compostos a um ou mais tipos de célula. Tais veiculos de levedura incluem um componente heterólogo posicionado na membrana externa do veiculo de levedura (isto é, totalmente na membrana externa do veiculo de levedura ou, pelo menos parcialmente incorporado no interior da membrana) de tal maneira que o componente é capaz de atingir (isto é, administrar de forma selectiva) o veiculo de levedura ao(s) dado(s) tipo(s) de célula(s). Tais componentes são de uma espécie ou tipo que é diferente das espécies ou subespécies de levedura utilizadas na produção do veiculo. Um componente heterólogo preferido é um parceiro de ligação de um elemento (tal como um receptor, antigénio, ou outra entidade de superfície de célula), posicionada na superfície do dado tipo de célula que vai ser seleccionado para administração. 20
Preferencialmente, tal elemento é ausente, ou encontrado apenas em pequenas quantidades, em tipos de células que não são seleccionadas para administração.
Os tipos de células preferidos para atingir utilizando os veículos de levedura contendo componentes heterólogos da presente invenção incluem células do tecido conjuntivo, células dendríticas, células endoteliais, células epiteliais, células de origem granulocítica-monocítica, células estaminais hematopoiéticas, hepatócitos, linfócitos, mioblastos, neurónios, neutrófilos, pneumócitos, timócitos e combinações destas. As células epiteliais preferidas para atingir incluem as células epiteliais genitais, intestinais, do rim, mucosais e pulmonares. Os linfócitos preferidos para atingir incluem os linfócitos B e os linfócitos T. Os tipos de células particularmente preferidos para atingir incluem as células que expressam os marcadores de célula CD4 ou CD8 nas suas superfícies celulares, com as células que expressam CD4 sendo ainda mais preferidas. As células que têm os marcadores celulares CD4 incluem as células T auxiliares, macrófagos e células retículo-endoteliais; as células que têm os marcadores celulares CD8 incluem as células T citotóxicas.
Os componentes heterólogos adequados para incluir nos veículos de levedura da presente invenção incluem, mas não se limitam a anticorpos que se ligam, de forma selectiva, aos elementos encontrados na superfície de certos tipos de células asialoglicoproteínas (glicoproteínas que não têm os grupos ácido siãlico), proteínas do complemento c3d, ligandos Fas, fusogénios, receptores de células T* outros receptores, ligandos dos receptores (por exemplo, antigénios, citocinas e factores de crescimento), transferrinas, proteínas virais de superfície (por exemplo, proteínas virais que permitem que os vírus infectem as suas respectivas células hospedeiras), outras proteínas de superfície de células e misturas destas. Os componentes heterólogos preferidos incluem anticorpos, ligandos Fas, %í ligandos dos receptores, e proteínas virais de superfície, com os ligandos Fas e as proteínas virais de superfície sendo particularmente preferidas.
Numa forma de realização preferida, um veículo de levedura tendo um componente heterólogo que se dirige para um tipo de células seleccionado é capaz de produzir (isto é, expressar) aquele componente e de posicionar o componente na membrana externa do veículo de uma maneira adequada para dirigir o veículo para um tipo de células desejado. Tal veículo de levedura é um veículo que é transformado com uma molécula de ácido nucleico que codifica o componente. A molécula de ácido nucleico fica situada no veículo de levedura, de tal maneira que o componente pode ser expresso pelo veículo de levedura; por exemplo, a molécula de ácido nucleico é operacionalmente ligada (isto é, junta) a uma sequência de controlo de transcrição. Os métodos para expressar as moléculas heterólogas de ácido nucleico nos veículos de levedura estão aqui descritos.
Um veículo de levedura preferido da presente invenção é capaz de fundir-se com o tipo de célula ao qual um composto transportado pelo veículo está a ser administrado, efectuando, deste modo, uma administração particularmente eficaz do composto ao tipo de célula. Tal veículo de levedura inclui um componente heterólogo capaz de efectuar a fusão com a membrana da célula do tipo de célula seleccionada. Conforme utilizado aqui, a fusão de um veículo de levedura com uma célula seleccionada refere-se à capacidade da membrana da célula da levedura de fundir-se com a membrana do tipo de célula seleccionada, levando à formação de sincícios. Conforme utilizado aqui, um sincício é uma massa multinucleada de protoplasma produzida pela fusão de células. Inúmeras proteínas virais de superfície (incluindo aquelas dos vírus da imunodeficiência, tais como o HIV, vírus da influenza, poliovírus e adenovírus) e outros fusogénios (tais como os envolvidos na fusão entre ovos e esperma) demonstraram serem capazes de efectuar a fusão entre duas membranas (isto é, entre as membranas de células de mamíferos e virai ou entre membranas de células de mamíferos) . Por exemplo, um veículo de levedura que produz um componente heterólogo HIV gpilO/gpll na sua superfície é capaz de fundir com um linfócito T CD4+. Encontra-se no âmbito da presente invenção aumentar o número de componentes heterólogos que podem ser utilizados na produção de veículos de levedura capazes de fundir com um dado tipo de célula produzindo um complexo entre um componente heterólogo que, por si só, não pode fundir, e um componente capaz de induzir a fusão, tal como prendendo a transferrina i proteína do HIV gp41.
Numa forma de realização, uma estirpe de levedura é geneticamente modificada para atingir células naturalmente seleccionadas por outras estirpes de levedura ou para fazer vacinas contra certas estirpes patogénicas de levedura. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico que codificam os antigénios da Candida ou Chlamydia podem ser geneticamente modificados numa estirpe S. cerevisiae de tal modo que os antigénios da Candida ou Chlamydia são expressos e incorporados à membrana da S. cerevisiae. 0 veículo de levedura resultante quando administrado a um animal é capaz de estimular uma resposta imunológica protectora, incluindo uma resposta irnunológica mediada por célula, bem como uma resposta imunológica humoral, contra, respectivamente, a infecção por Candida ou Chlamydia.
Os veículos de levedura da presente invenção podem ser produzidos por meio da utilização de métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Os veículos de levedura podem ser carregados com compostos utilizando uma variedade de técnicas adequadas para o(s) composto(s) a ser(em) carregado(s) . Por exemplo, conforme descrito aqui anteriormente, compostos inorgânicos e vários compostos orgânicos podem ser inseridos 13 dentro de veículos de levedura por meio de difusão e/ou de transporte activo. Os péptidos e as proteínas podem ser carregados em veículos de levedura por fusão de lipossoma, electroporação ou banho de sonicação.
Os veículos de levedura preferidos da presente invenção são veículos de levedura geneticamente modificados (isto é, produzidos de forma recombinante). Tais veículos são transformados com um ou mais ácidos nucleicos capazes de codificar o ARN, compostos de péptido ou proteína da presente invenção. Os veículos de levedura também podem ser transformados com moléculas de ácido nucleico que codificam enzimas e/ou outros factores permitindo, deste modo, que tais veículos produzam outros compostos da presente invenção (por exemplo, antibióticos ou vitaminas). Certos veículos de levedura da presente invenção são transformados com uma molécula de ácido nucleico que codifica um composto a ser administrado a um certo organismo e com uma molécula de ácido nucleico que codifica um componente heterólogo capaz de dirigir o veículo a um certo tipo de célula. Numa forma de realização, o composto e o componente heterólogo são a mesma proteína (por exemplo, uma vacina de antigénio de superfície virai dirigida a um tipo de célula susceptível a infecção por tal tipo de vírus). A transformação das porções de levedura de um veículo de levedura pode ser conseguida utilizando técnicas conhecidas, exemplos das quis estão aqui descritos. Os veículos de levedura capazes de produzir compostos e componentes heterólogos incluem os microrganismos de levedura intactos e os esferoplastos de levedura. Podem também ser produzidos veículos de citoplastos de levedura e fantasma de levedura, de forma recombinante, pela transformação de microrganismos de levedura intactos ou esferoplastos de levedura com moléculas de ácido nucleico desejadas, produzindo ARN, compostos de péptido ou proteína na mesma e manipulando adicionalmente os microrganismos ou os esferoplastos utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica para produzir veículos de citoplastos ou fantasmas contendo os compostos desejados.
As moléculas de ácido nucleico transformadas em veículos de levedura da presente invenção podem incluir um ou mais genes ou porções destes. Tais moléculas de ácido nucleico podem compreender regiões de codificação parciais ou totais, regiões reguladoras ou combinações destas, bem como regiões que, quando transcritas, são capazes de interferir com a produção de proteína. Uma vantagem das estirpes da levedura é a sua capacidade de transportar várias moléculas de ácido nucleico e de serem capazes de produzir vários ARN heterólogos e/ou compostos de proteína. Como tal, os veículos de levedura da presente invenção podem ser concebidos para proteger um animal contra mais de uma doença ou para transportar mais de um composto para outras utilizações. Um número preferido de compostos a serem produzidos por um veiculo de levedura da presente invenção varia de cerca de um a cerca de 5, com cerca de 2 a cerca de 5 compostos sendo mais preferidos. Particularmente preferido ê um veículo de levedura que inclui as seguintes classes de genes: um gene que codifica uma vacina, um gene que codifica um modificador de resposta biológica e um gene que codifica um componente heterólogo adequado para atingir um tipo de célula desejado.
Um péptido ou proteína codificado por uma molécula de ácido nucleico no interior de um veículo de levedura pode ser uma proteína completa ou pode ser uma proteína funcionalmente equivalente na qual os aminoácidos foram deletados (por exemplo, uma versão truncada da proteína), inseridos, invertidos, substituídos e/ou derivatizados (por exemplo, acetilados, glicosilados, fosforilados, preso por uma âncora de glicetofosfatidil inositol (GPI)), de tal modo que a proteína modificada tem uma função biológica substancialmente semelhante 25 à da proteína natural. As modificações podem ser conseguidas por meio de métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a modificações directas à proteína ou modificações ao gene que codifica a proteína utilizando, por exemplo, técnicas de ADN clássicas ou recombinantes para realizar a mutagénese aleatória ou direccionada. As proteínas funcionalmente equivalentes podem ser seleccionadas utilizando ensaios montados para medir a actividade biológica da proteína. A expressão de um ARN, composto de péptido ou proteína num veículo de levedura da presente invenção é conseguida utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Em resumo, uma molécula de ácido nucleico que codifica um composto desejado é inserida num vector de expressão de tal maneira que a molécula de ácido nucleico é unida operativamente a uma sequência de controlo de transcrição a fim de ser capaz de efectuar a expressão constitutiva ou regulada da molécula de ácido nucleico quando transformada numa célula de levedura hospedeira. As moléculas de ácido nucleico que codificam um ou mais compostos podem estar num ou mais vectores de expressão operativamente ligados a uma ou mais sequências de controlo de transcrição.
Uma molécula recombinante neste contexto, refere-se a uma molécula de ácido nucleico operativamente ligada a pelo menos uma sequência de controlo de transcrição num vector de expressão. Um vector de expressão, neste contexto, refere-se a um vector de ADN ou ARN que é capaz de transformar uma célula hospedeira e de efectuar a expressão da molécula de ácido nucleico operativamente ligada. Preferencialmente, tais vectores também podem ser replicados no interior da célula hospedeira, a um número alto ou baixo de cópias, dependendo das suas características inerentes.
As sequências de controlo de transcrição, que podem controlar a quantidade de proteína produzida, incluem as sequências que controlam a iniciação, o alonqamento e a terminação da transcrição. As sequências de controlo da transcrição particularmente importantes são aquelas que controlam a iniciação da transcrição, tais como as sequências promotoras e de activação a montante. Qualquer promotor de levedura adequado pode ser utilizado na presente invenção e uma variedade de tais promotores são conhecidos dos especialistas na técnica. Os promotores preferidos para a expressão em Saccharomyces cerevisiae incluem, mas não se limitam a promotores de genes que codificam as seguintes proteínas de levedura: álcool desidrogenase I (ADH1) ou II (ADH2) , fosfoglicerato cinase (PGK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; também referida como TDH3, para triose fosfato desidrogenase), galactocinase (GAL1), galactose-l-fosfato uridil-transferase (GAL7), UDP-galactose epimerase (gálio), citocromo Ci (CYC1) e fosfatase ácida (PH05), com os promotores híbridos sendo mais preferidos, e o promotor que é induzido quando as concentrações de glucose nas células estão baixas (por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 0,2 porcento), sendo ainda mais preferidos. Do mesmo modo, são conhecidas várias sequências de activação a montante (UASs), também referidas como intensificadoras. As sequências de activação a montante preferidas para a expressão em Saccharomyces cerevisiae incluem, mas não se limitam aos genes de UASs que codificam as seguintes proteínas: CYC1, ADH2, GAL1, GAL7 e GAL10, bem como outras UASs activadas pelo produto do gene GAL4, sendo particularmente preferida a ADH2 UAS. Uma vez que a ADH2 UAS é activada pelo produto do gene ARI, é preferível sobre-expressar o gene ADR1 quando um gene heterólogo está operativamente ligado à ADH2 UAS. As sequências de terminação de transcrição preferidas para a expressão em Saccharomyces cerevisiae incluem as sequências de terminação do factor a, GAPDH e genes CYC1.
As sequências de controlo de transcrição preferidas para expressar genes em levedura metiltrópica incluem as regiões de controlo de transcrição dos genes que codificam a álcool oxidase e a formato desidrogenase.
As moléculas de ácido nucleico utilizadas na presente invenção também podem incluir sequências de secreção endógenas ou heterólogas bem como sequências de ancoragem transmembranares, conforme apropriado. Por exemplo, é preferido segregar compostos modificadores da resposta biológica, ao passo que é preferido ancorar componentes heterólogos na membrana do veiculo de levedura. A selecção e a utilização de tais sequências pode ser conseguida utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica.
As condições efectivas para a produção de veículos de levedura recombinantes da presente invenção incluem um meio eficaz no qual uma estirpe de levedura pode ser cultivada. Um meio eficaz é, tipicamente, um meio aquoso compreendendo fontes de hidratos de carbono assimiláveis, azoto e fosfato, bem como sais apropriados, minerais, metais e outros nutrientes, tais como vitaminas e factores de crescimento. 0 meio pode compreender nutrientes complexos ou pode ser um meio mínimo definido. As estirpes de levedura da presente invenção podem ser cultivadas numa variedade de recipientes, incluindo, mas não limitados a bio-reactores, tubos de ensaio, placas de microtitulação e placas de petri. A cultura é levada a cabo a uma temperatura, pH e teor de oxigénio apropriados para a estirpe de levedura. Tais condições de cultura enquadram-se com a perícia de alguém com conhecimento corrente da técnica (ver, por exemplo, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego).
Os veículos de levedura podem ser recuperados por meio de métodos conhecidos dos especialistas na técnica, incluindo os 1% métodos aqui descritos. Os veículos de levedura podem ser formulados em composições da presente invenção utilizando vários métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, as composições contendo veículo de levedura podem ser secas por liofilização ou por exposição a azoto líquido ou gelo seco. As composições que compreendem veículos de levedura também podem ser preparadas embalando a levedura num bolo ou num comprimido, tal como é feito para a levedura utilizada em operações de cozedura ou de produção de cerveja. A fim de administrar um veículo de levedura a um animal, pode-se utilizar composições secas para administração por via oral. Os veículos de levedura também podem ser misturados com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como um tampão isotónico que seja tolerado pelo animal a ser administrado com o veículo. Exemplos de tais excipientes incluem água, soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank. e outras soluções salinas aquosas fisiologicamente equilibradas. Os veículos não aquosos, tais como óleos fixos, óleo de sésamo, oleato de etilo ou triglicéridos também podem ser utilizados. Outras formulações úteis incluem suspensões contendo agentes intensificadores de viscosidade, tais como carboximetilcelulose sódica, sorbitol ou dextrano. Os excipientes também podem conter quantidades mínimas de aditivos, tais como substâncias que intensificam a isotonicidade e a estabilidade química. Exemplos de tampões incluem tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão Tris, enquanto exemplos de conservantes incluem timerosal, m- ou o-cresol, formalina e álcool benzílico. As formulações padrão tanto podem ser líquidos como sólidos injectáveis que podem ser retomados num líquido adequado ou como uma suspensão ou solução para injecção. Deste modo, numa formulação não líquida, o excipiente pode compreender, por exemplo, dextrose, albumina do soro humano, e/ou conservantes, aos quais água ou soro fisiológico estéreis podem ser adicionados antes da administração.
Uma vantagem em particular da presente invenção é que os veículos de levedura não necessitam ser administrados com um imunopotenciador, tal como um adjuvante ou um transportador, uma vez que a porção de levedura do próprio veiculo parece funcionar como tal. Esta caracteristica, no entanto, não elimina a utilização de imunopotenciadores em composições da presente invenção.
Os adjuvantes são, tipicamente, substâncias que, de um modo geral, intensificam a resposta imunológica de um animal contra um antigénio especifico. Os adjuvantes adequados incluem, mas não se limitam a adjuvante de Freund; outros componentes de parede celular bacteriana; sais à base de alumínio; sais à base de cálcio; sílica; polinucleótidos; toxóides; proteínas do soro; proteínas de revestimento virai; outras preparações derivadas de bactérias; interferão gama; adjuvantes de copolímero em bloco, tais como o adjuvante de Hunter Titermax (CytRx™, Inc. Norcross, GA) ; adjuvantes Ribi (disponível da Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT); e saponinas e os seus derivados, tais como Quil A (disponível da Superfos Biosector A/S, Dinamarca).
Os transportadores são, tipicamente, compostos que aumentam a meia-vida de uma composição terapêutica no animal tratado. Os transportadores adequados incluem, mas não se limitam a formulações poliméricas de libertação controlada, lipossomas, óleos, ésteres e glicóis. A vacina ou composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada a um animal, tanto in vivo como ex vivo, ou pode ser administrada a células in vitro. Conforme aqui utilizado, a administração in vivo refere-se à administração de uma composição compreendendo um veículo de levedura directamente a um animal. Tal administração pode ser sistémica, mucosal e/ou proximal ao local do tipo de célula a ser atingida. Exemplos de 30 vias para administrar o veiculo de levedura in vivo incluem as vias auricular, bronquial, genital, inalatória, nasal, ocular, oral, parentérica, rectal, tópica, transdérmica e uretral. A administração auricular pode incluir gotas para os ouvidos, a administração nasal pode incluir gotas para o nariz e a administração ocular podem incluir gotas para os olhos. A administração oral pode incluir sólidos e líquidos que podem ser tomados pela boca. A administração parentérica pode incluir as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar, intravenosa, subcutânea, cateter atrial e cateter venal. A administração oral é preferida, particularmente uma vez que a administração oral é útil no desenvolvimento da imunidade mucosal e uma vez que as composições que compreendem os veículos de levedura podem ser facilmente preparadas para administração oral, por exemplo, como comprimidos ou cápsulas, bem como sendo formuladas em alimentos e produtos de bebida. Outras vias de administração que modulam a imunidade mucosal são também preferidas, particularmente no tratamento de infecções virais, cancros epiteliais, distúrbios imunossupressores e outras doenças que afectam a região epitelial. Tais vias incluem as vias bronquial, intradérmica, intramuscular, nasal, outras vias inalatórias, rectal, subcutânea, tópica, transdérmica, vaginal e uretral. A administração ex vivo de um veículo de levedura refere-se a um método que inclui os passos de pôr em contacto uma população de células removidas de um animal com ima composição compreendendo um veículo de levedura da presente invenção sob condições tais que o veículo de levedura é adsorvido pelos tipos de células seleccionadas e devolvendo as células contactadas ao animal. Tal método de administração é particularmente útil no tratamento de células envolvidas na hematopoiese e na resposta imunológica, bem como no tratamento de tumores. A administração in vitro de um veiculo de levedura refere-se a administração de um veiculo de levedura da presente invenção a uma população de células (que também pode incluir tecidos ou órgãos) em cultura. Tal método é particularmente útil para determinar se um veiculo de levedura especifico será eficaz in vivo ou ex vivo e em projectos de investigação. As células que são tratadas in vitro podem ser mantidas em cultura ou transferidas para um animal.
Os métodos para preparar e administrar as composições por meio destas vias são bem conhecidos dos especialistas na técnica. As composições da presente invenção são administradas de uma maneira eficaz que depende da utilização da composição. Por exemplo, a fim de proteger um animal contra doença, uma composição da presente invenção é administrada ao animal de uma maneira eficaz, de tal modo que a composição seja capaz de proteger aquele animal contra aquela doença. As composições da presente invenção podem ser administradas a animais ou plantas antes da doença, a fim de evitar a doença e/ou podem ser administradas a animais depois do aparecimento da doença, a fim de tratar a doença. Por exemplo, os veículos de levedura da presente invenção podem ser utilizados como agentes preventivos (profiláticos) e/ou como agentes imunoterapêuticos.
Os protocolos aceitáveis para administrar as composições de uma maneira eficaz incluem o tamanho da dose individual, o número de doses, a frequência da administração da dose e o modo de administração. A determinação de tais protocolos pode ser efectuada pelos especialistas na técnica. Uma dose individual adequada é uma dose que é capaz de administrar, de forma efectiva, um composto sendo transportado pelo veículo de levedura a um dado tipo de células quando administrado uma ou mais vezes durante um período de tempo adequado. Por exemplo, uma dose individual preferida de um veículo de levedura da presente invenção é de cerca de 1 x IO3 a cerca de 5 x 107
3 Z equivalentes de células de levedura por quilograma de peso corporal do organismo a ser administrado com a composição. Os "reforços" de uma composição de veiculo de levedura são administrados, de preferência, quando o composto transportado pelo veiculo de levedura já não funciona eficazmente. Por exemplo, se uma resposta imunológica de um organismo já não está a ser eficazmente modulada, podem ser administradas uma ou mais doses adicionais de uma composição da presente invenção capazes de modular a resposta imunológica desejada. Tais composições podem ser administradas de cerca de 2 semanas a vários anos depois da administração original. Um esquema preferido de administração é um em que de cerca de 1 x 105 a cerca de 5 x IO7 equivalentes de células de uma composição por kg de peso corporal de um organismo são administrados de cerca de uma a cerca de 4 vezes durante um período de tempo de cerca de 1 mês a cerca de 6 meses. Exemplos de métodos para administrar os veículos de levedura da presente invenção a animais estão proporcionados na secção de Exemplos.
Uma composição que é capaz de efectuar terapêutica génica inclui um veículo de levedura que é geneticamente modificado para efectuar uma terapêutica génica estável no tipo de célula direccionado, por exemplo, sendo capaz de efectuar a integração do gene no genoma hospedeiro, mantendo a célula fundida como um heterocarion, ou utilizando outros mecanismos para manter o gene, de forma estável, no tipo de célula tratado. Tal composição é administrada a um organismo in vivo ou ex vivo utilizando técnicas tais como aquelas desenvolvidas para outros veículos de administração de gene. Os veículos de administração de levedura são vantajosos pelo facto de poderem formar sincícios com as células para as quais estão a transferir o gene desejado para efectuar a terapêutica génica e podem ser dirigidos a tipos de células em particular, conforme aqui descrito. Por exemplo, um defeito genético que leva à fibrose cística pode ser corrigido utilizando um veículo de levedura que 33 transporta um gene CFTR funcional (regulador de condutância transmembranar em fibrose cística) que é dirigido a células terminalmente diferenciadas posicionadas próximas à camada externa do pulmão. Deve também ser observado que os genes que codificam a proteínas que são segregadas em fluidos corporais não necessitam ser dirigidas a um tipo de células específico.
As composições de veículo de levedura da presente invenção podem ser administradas a qualquer animal adequado, incluindo qualquer animal susceptível a qualquer doença da qual um veículo de levedura da presente invenção pode ser concebido para proteger o animal. Os animais preferidos para tratar incluem os vertebrados e artrópodes, sendo mais preferidos os mamíferos, anfíbios, aves, peixes e insectos. Os animais ainda mais preferidos para tratar incluem os seres humanos, primatas, animais domésticos (isto é, animais de estimação) e animais importantes do ponto de vista agrícola (isto é, animais de criação) sendo particularmente preferidos os seres humanos, símios, gatos, gado, cães, furões, gorilas, murganhos, macacos, porcos, coelhos, ratos e ovelhas.
De acordo com uma outra forma de realização da presente invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo: (a) um veículo de levedura seleccionado de um microrganismo de levedura, um esferoplasto de levedura, um citoplasto de levedura ou um fantasma de levedura, o referido veículo de levedura compreendendo, pelo menos, um composto heterólogo compreendendo um antigénio ou uma citocina ou uma combinações destes; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável para administração a um animal.
Tal composição pode ser utilizada na administração do composto a um organismo ou a células em cultura utilizando os métodos aqui descritos.
De preferência, o veiculo de levedura compreende ainda um componente heterólogo posicionado na membrana externa do veículo de levedura, de tal maneira que o componente é capaz de dirigir o veículo de levedura a um dado tipo de célula. Os componentes heterólogos adequados estão aqui descritos. Tais veículos de levedura podem incluir mais de um componente heterólogo e/ou mais de um composto heterólogo. Tais composições também podem incluir outros membros, incluindo, mas não limitado a um excipiente, adjuvante e/ou transportador, exemplos do quais estão aqui descritos.
De preferência, o(s) componente(s) heterólogo(s) e o(s) composto(s) heterólogo(s) são, cada um, produzidos pelo veículo de levedura. Tal veiculo de levedura é transformado com molécula(s) de ácido nucleico que codificam um componente heterólogo e um composto heterólogo, de tal maneira que a levedura é capaz de expressar o componente heterólogo e o composto heterólogo (que pode ser um ARN ou composto de proteína) . Outro veículo de levedura preferido é um veículo de levedura capaz de expressar um componente heterólogo e que também está a transportar uma molécula de ácido nucleico capaz de efectuar a terapêutica génica (isto é, o veículo de administração de gene). A composição, de preferência, inclui um veículo de levedura que transporta, pelo menos, dois compostos heterólogos capazes de proteger um animal contra uma doença. Os compostos adequados estão aqui descritos. Tais composições também podem incluir outros membros, tais como excipientes, adjuvantes e transportadores. Os veículos de levedura também podem incluir componentes heterólogos capazes de dirigir os veículos para 35 certos tipos de célula. Os veículos de levedura incluídos nesta forma de realização incluem os veículos de levedura transformados que são capazes de produzir um ou mais dos compostos heterólogos.
De preferência, pelo menos um dos compostos heterólogos é um composto capaz de modular uma resposta imunológica, tal como um composto capaz de estimular uma resposta imunológica ou um composto capaz de suprimir uma resposta imunológica. Uma forma de realização preferida é um veículo de levedura que transporta um antigénio e um modificador de resposta biológica. Outra forma de realização preferida é um veículo de levedura que transporta um antigénio, um modificador de resposta biológica e um componente heterólogo capazes de dirigir o veículo de levedura para um dado tipo de célula.
Uma forma de realização da presente invenção é um veículo de levedura compreendendo uma estirpe de levedura capaz de produzir uma proteína precursora heteróloga tendo um sítio de processamento de aminoácido dibásico, em que a estirpe de levedura é capaz de processar correctamente a proteína precursora em, pelo menos, uma proteína de clivagem. Exemplos de tais proteínas precursoras incluem várias proteínas precursoras de hormonas e proteínas precursoras de proteína de envelope virai que requerem clivagem por uma endoprotease de aminoácido dibásico como um passo no processo de maturação. Exemplos de tais proteínas precursoras (incluindo, mas não limitado a proteínas precursoras de vírus da imunodeficiência, vírus linfotrópicos, vírus da hepatite e vírus do herpes) estão descritos no Pedido de Patente dos Estados Unidos de Número de Série 081088.322, ibid. A levedura produz uma proteína chamada endoprotease Kex2 que foi apresentada no Pedido de Patente dos Estados Unidos de Número de Série 08/088.322, ibid., por ser capaz de efectuar a clivagem de proteínas precursoras heterólogas tendo um sítio de processamento de aminoácido dibásico. Como tal, uma estirpe de levedura capaz de expressar uma proteína precursora de envelope virai pode efectuar a clivagem de tal proteína precursora e expressar a(s) proteína(s) de envelope madura(s) na membrana da levedura. Os veículos de levedura da presente invenção capazes de produzir uma proteína precursora heteróloga também podem ser geneticamente modificados para produzir uma endoprotease Kex2 heteróloga, tais como as proteases que naturalmente clivam a proteína precursora heteróloga. Tais veículos de levedura podem, mas não necessitam ser modificados para não mais produzir uma endoprotease Kex2 de levedura funcional. Os pormenores relativos à produção de tais veículos de levedura estão descritos no Pedido de Patente dos Estados Unidos de Número de Série 08/088.322, ibid. Utilizados de acordo com a invenção, tais veículos de levedura podem estimular uma resposta imunológica contra agentes infecciosos.
Um exemplo da capacidade de um veículo de levedura da invenção de provocar uma resposta imunológica é como a seguir. Um veículo de levedura transformado com uma proteína precursora virai de superfície, tal como com HIV gpl60, quando administrado a um animal provoca tanto uma resposta mediada por células como uma resposta humoral contra as proteínas de envelope HIV sem ter de incluir um adjuvante. Tanto as respostas proliferativas da célula T (indicativa da iniciação da célula T auxiliar) como a actividade da célula T citotóxica CD8+ potente (indicativa da imunidade mediada por célula) são observadas, suportando o conceito de que os veículos de levedura são capazes de levar à apresentação de antigénios tanto através da via do MHC de classe I como de classe II. Os veículos de levedura particularmente preferidos para serem utilizados para proteger um animal contra a infecção do HIV incluem AFY435-gpl60-SF2(c), uma célula intacta de S. cerevisiae modificada para expressar a proteína de envelope precursora gpl60 do HIV-1Sf2 e AFY435-gpl60-SF(s) , um esferoplasto normalmente equivalente a AFY435-gpl60-SF2(c). Os pormenores desta forma de realização estão descritos na secção de Exemplos.
Outra forma de realização da presente invenção é um veiculo de levedura que é capaz de estimular uma resposta imunológica para matar células de cancro. Tal veiculo de levedura contém (e, de preferência, expressa) proteínas, ou os seus péptidos, que são encontradas, substancialmente, apenas sobre ou dentro de células de cancro, incluindo proteínas que provocam o cancro pelo facto de terem sofrido mutação (por exemplo, ras) . Quando administrado a um animal, tal veículo de levedura induz uma resposta imunológica que inclui a produção de células T citotóxicas capazes de matar as células que expressam as proteínas correspondentes às proteínas ou os seus péptidos transportados pelo veículo de levedura, isto é, as célula de cancro.
Certos veículos de levedura da presente invenção são particularmente úteis na supressão ou redução de respostas irnunológicas nocivas. Numa forma de realização, um veículo de levedura da presente invenção expressa na superfície da sua membrana péptidos apropriados correspondentes aos receptores de célula T presentes nas células envolvidas na produção de uma resposta imunológica nociva num animal. A administração de tal veículo de levedura ao animal resulta na produção de células T citotóxicas dirigidas contra as células que expressam os receptores de célula T, suprimindo, deste modo, as respostas irnunológicas geradas por tais células. Os métodos para identificar os péptidos apropriados e a utilização de outros veículos de administração para produzir tal resposta estão descritos em, por exemplo, Bourdette et al.f 1994, J. Immunol. 152, 2510-2519 e Chou et al., 1994, J. Immunol. 152, 2520-2529. Os veículos de levedura são particularmente úteis para tal abordagem, devido à sua capacidade de gerar uma forte resposta mediada por célula, bem como uma resposta humoral. Uma abordagem semelhante pode ser tomada para reduzir respostas imunológicas nocivas ou sem efeito induzidas por parasitas, tumores ou vírus a fim de enganar o sistema imunológico do indivíduo doente; isto é, utilizando um veículo de levedura capaz de induzir uma resposta de célula T citotóxica contra as células T ou células B envolvidas na produção de anticorpos nocivos e/ou não protectores.
Noutra forma de realização, um veículo de levedura da presente invenção expressa sobre a membrana da sua célula um ligando Fas e, como tal, é capaz de matar as células que expressam uma molécula chamada Fas (CD95) . A Fas é uma glicoproteína que é encontrada em certos tipos de célula, incluindo linfócitos T activados e células de cancro, incluindo células de leucemia e de linfoma; ver, por exemplo, Suda et al., 1993, Cell 75, 1169-1178. A utilização de levedura como veículo de administração para ligandos Fas com a finalidade de matar tipos de células alvo é vantajoso, uma vez que, por exemplo, os ligandos Fas podem estar presentes de uma maneira semelhante a como os mesmos estão presentes naturalmente, que é aparentemente agregados sobre a membrana de uma célula, tal como sobre uma célula T citotóxica.
Outra forma de realização da presente invenção é um veículo de levedura que expressa moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) sobre a membrana das suas células. Encontra-se no âmbito da presente invenção ter veículos de levedura que transportam moléculas vazias do MHC que podem ser carregadas in vitro, bem como moléculas do MHC complexadas a péptidos, utilizando, por exemplo, técnicas semelhantes àquelas utilizadas para expressar moléculas do MHC vazias e complexadas em baculovírus; ver, por exemplo, Stern et ai., 1992, Cell 68, 465-477. Tais veículos de levedura podem ser utilizados para modular respostas imunológicas, tais como para deletar ou 39 desactivar as células T envolvidas em respostas autoimunes e outras respostas imunológicas nocivas.
Os seguintes resultados experimentais são proporcionados com a finalidade de ilustração e não pretendem limitar o âmbito da invenção.
Exemplos
As técnicas de biologia celular e molecular utilizadas nos seguintes exemplos são conhecidas dos especialistas na técnica e estão descritas, por exemplo, em Sambrook et al.r Molecular Cloning: A Laboratorial Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989; e Guthrie et al. (eds.), ibid.
Exemplo 1
Este Exemplo descreve a produção de certos veículos de levedura da presente invenção. A S. cerevisiae AFY435-gpl60-SF2, também designada S. cerevisiae GPY60:pa/env, foi produzida conforme descrito no Exemplo 1 do Pedido de Patente dos Estados Unidos de Número de Série 08/088.322, ibid. Em resumo, o gene de envelope (env) que codifica a proteína de envelope precursora gpl60 (cerca de 825 aminoácidos) do (Sanchez-Pescador et al., 1985, Science 227, 484-492) foi ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica um sinal de factor-a e segmento líder de cerca de 86 aminoácidos para formar um fragmento a-líder/gene-env (α/env) em que a sequência de sinal do gene env foi substituída por um sinal de factor-a e sequências líderes de uma maneira semelhante ao método por meio do qual o gene do factor de crescimento epidérmico foi unido ao sinal e factor-a de sequências líderes em Brake et M,it: 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 81, 4642-4646. 0 segmento do factor-a, também designado como F-a líder, também incluía um sítio de processamento de aminoácido dibásico no seu término carboxilo. O gene da fusão α/env estava ligado operativamente a um promotor de S. cerevisiae e sequências de terminação de transcrição do factor-a e unido com outras sequências de vector de expressão de transporte de levedura para formar as moléculas recombinantes ρα/env, também designadas pBS8. A molécula recombinante ρα/env contém levedura (2 μ) e sequências de controlo de replicação bacteriana, bem como um gene bacteriano que codifica a resistência à. ampicilina (Amp) e genes de levedura auxotrófico leu2~d e prototrófico URA3. A molécula recombinante ρα/env foi transformada em várias estirpes de S. cerevisiae, incluindo a estirpe GPY60, uma Mata pep4::URA3 prb leu2 his4 ura3 trpl que está descrita em Baker et ai., 1988, Cell 54, 335-344. A estirpe transformada é designada S. cerevisiae ou S. cerevisiae AFY435-gpl60-SF2. Um veículo de levedura compreendendo a célula de levedura intacta AFY435-gpl60-SF2 foi designado < Um veículo de levedura compreendendo um esferoplasto de AFY435-gp!60-SF2 foi designado > 0 Exemplo 1 do Pedido de Patente dos Estados Unidos de Número de Série 08/088.322, ibid. também demonstra (a) que a S. cerevisiae AFY435-gpl60-SF2 produziu a proteína de envelope precursora do HIV-1 gpl60 e foi capaz de processar gpl60 em gpl20 e gp41 in vivo de uma forma semelhante àquela pela qual as células de mamíferos processam gpl60, e (b) que a S. cerevisiae AFY435-gpl60-SF2 expressou, pelo menos uma porção das proteínas clivadas gp!20 e gp41 sobre a superfície da sua célula.
Exemplo 2
Este exemplo demonstra que os veículos de levedura da presente invenção são capazes de estimular as respostas imunológicas mediadas por célula bem como as respostas imunológicas humorais em animais. A. Veículos de levedura Células intactas e esferoplastos de veículos de levedura S. cerevisiae modificados para expressar a proteína de envelope precursora gpl60 do HIV-1SF2 foram testados em murganhos para verificar a sua capacidade de estimular a imunidade mediada por célula e/ou humoral contra o HIV. Especificamente, foram testados os veículos de levedura S. cerevisiae AFY435-gpl60-SF2(c) e S. cerevisiae AFY435-gpl60-SF2(s) (produzidos conforme descrito no Exemplo ii, bem como o foram os seguintes controlos: vector(c)-AFY433 de células intactas de S. cerevisiae e vector(s)-AFY433 de esferoplasto de S. cerevisiae que eram semelhantes a AFY435-gpl60-SF2(c) e AFY435-gpl60-SF2(s), respectivamente, excepto por o vector(c)-AFY433 e o vector(s)-AFY433 terem sido transformados só com vector, em vez de com vector contendo gpl60. B. Administração de veículos de levedura a animais e recuperação de células do baço e gânglio linfático.
Cinco grupos de dois murganhos ÍMh/ç foram, cada um deles, injectados por via intraperitoneal uma vez por semana, por um total de três semanas, com 100 microlitros (/xL) de injecção tampão (1,4 M Sorbitol, 5 mM de cloreto de magnésio, 10 mM Tris, pH 7,4) contendo o seguinte: para o Grupo 1 (murganhos 1 e 2) , nada; para o Grupo 2 (murganhos 3 e 4) cerca de 2 x 107 de células vector (c) -AFY433; para o Grupo 3 (murganhos 5 e 6) , cerca de 2 x 107 de esferoplastos vector (s)-AFY433; para o Grupo 4 (murganhos 7 e 8) cerca de 2 x 107 de células AFY435-gpl60-SF2(c); e para o grupo 5 (murganhos 9 e 10), cerca de 2 x 107 de esferoplastos AFY435-gpl60-SF2(s) . Catorze dias depois da sua terceira imunização, todos os murganhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono.
Obteve-se sangue dos murganhos por meio de punção cardíaca e o mesmo foi deixado a coagular à temperatura ambiente. 0 soro foi utilizado para análise de imunotransferência Western e análise de imunoprecipitação.
As células do baço e do gânglio linfático (LN) mesentérico foram obtidas sob condições assépticas e as suspensões de célula única foram obtidas pressionando suavemente os órgãos através de telas de malha de nylon. As células do baço e do gânglio linfático de murganhos individuais foram reunidas e ressuspensas em meio de cultura de tecido TCM (RPMI 1640 (disponível da Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com 7,5% de soro fetal bovino, L-glutamina, L-piruvato, vitaminas, aminoácidos não essenciais, gentamicina e 2-mercapoetanol) . Não houve diferença evidente na recuperação das células de qualquer dos murganhos, conforme apresentado na Tabela 1.
Tabela 1. Recuperação de células de murganhos injectadas com levedura ou esferoplastos.
Murganho Tratamento j Baço + LN (1Q6) | Placas pós Ig ϊ i 1, 2 Não injectado 184 & 302 j 32 & 26 3, 4 Levedura-Vector AFY 433 306 & 324 I 20 & 20 5, S Esfero-Vector AFY 433 240 & 330 23 & 27 7, 8 Levedura-AFY435-gpl60-SF2 282 & 315 20 & 20 IS \ i.......... ------------ ------------------------------------ 252 S 224 SI & 26
As células do gânglio linfático e do baço foram divididas igualmente em três grupos. 0 primeiro grupo foi lavado e ressuspenso em solução fosfato-salina tamponizada de Dulbecco (disponível da Life Technologies) e colocadas em placas de petri às quais imunoglobulinas anti-murganho de cabra tinham sido adsorvidas. Depois da incubação em gelo durante cerca de 30 minutos, as células não aderentes (cerca de 90% das células T) foram removidas suavemente, lavadas e ressuspensas em TCM para utilização em ensaios de proliferação de células T como células de gânglio linfático e baço enriquecidas com célula T. A recuperação de tais células está indicada na Tabela 1 na coluna intitulada "Placas pós Ig". O segundo grupo de células foi gama-irradiado (2000R) para utilização em ensaios de proliferação de células T como células irradiadas. O terceiro grupo de células foi deixado sem tratamento para a geração de línfócitos T citotóxicos (CTL).
Em todas as experiências, os dados foram calculados como a média ± D.P. para determinações em triplicata para cada ponto de amostra. Para os ensaios de proliferação, os dados são expressos como um índice de estimulação 1 . em que um I.E. de 100 é equivalente à proliferação observada com células T obtidas de murganhos não imunizados. Deste modo, um I.E. de 150 representa uma resposta que é 50% acima do antecedente. Para os ensaios de CTL, os dados são expressos como citólise corrigida que leva em consideração os antecedentes ou a morte espontânea. C. Infecção de células com vírus vaccinia recombinante
Cerca de 1 x 106 células P815 de leucemia de murganho foram incubadas de um dia para o outro em TCM com cerca de 1 x 106 unidades formadoras de placa (pfu) de vírus vaccinia recombinante que expressam β-galactosidase (Vac-lac) ou com cerca de 1 x 106 pfu de vírus vaccinia recombinante que expressam HIV ghl60-SF2 (Vac-SF2; disponível do Dr. D. Kuritzkes, Centro de
Ciências da Saúde da Universidade do Colorado, Denver, CO), para produzir células infectadas designadas P815-Vac-lac e P815-Vac-SF2, respectivamente. Do mesmo modo, cerca de 1 x l6 células BC10ME fibroblastos de murganho foram incubadas de um dia para o outro em TCM com cerca de 1 x 106 pfu de virus vaccinia recombinante que expressam β-galactosidase (Vac-lac) ou com cerca de 1 x 106 pfu de virus vaccinia recombinante que expressam HIV ghl60-SF2 (Vac-SF2) para produzir células infectadas designadas BClOME-Vac-lac e BC10ME-Vac-SF2, respectivamente. As células infectadas foram aglomeradas por centrifugação e ressupensas em TCM. Para os ensaios de proliferação, as células BC10ME infectadas foram aquecidas a 50 °C durante 30 minutos para desactivar qualquer virus vivo e para proporcionar uma fonte de lisato celular contendo antigénio. Para os ensaios CTL, as células P815 infectadas foram marcadas citoplasmicamente com 10 μΟί de e diluídas para 5 x em TCM. D. Estimulação de uma resposta imunológica humoral
Os ensaios de proliferação de célula T para detectar a estimulação da resposta imunológica humoral em murganhos administrados com veículos de levedura que expressam a gpl60 da presente invenção foram conduzidos como a seguir. As células de gânglio linfático e baço enriquecidas com células T produzidas conforme descrito no Exemplo 2B, foram diluídas para 4 x 106 células/mL em TCM. As células de gânglio linfático e baço irradiadas, não fraccionadas, produzidas como descrito no Exemplo 2B, foram diluídas para 4 x 106 células/mL em TCM. As células T enriquecidas e as células irradiadas do mesmo murganho foram misturadas 1:1, de tal modo que a concentração final de cada tipo de célula era de cerca de 2 x 106 células/mL. 100 μύ das misturas de células T foram colocadas em poços individuais de placas de fundo redondo de 96 poços que continham, cada, 100 /xL das concentrações de antigénios ou mitogénios em TCM, conforme indicado na Tabela 2.
Tabela 2. Antigénios ou mitogénios utilizados no ensaio
Tubo Antigénio ou mitogénio Tubo Antigénio ou mitogénio A Nenhum I Levedura-433 (S π B 2Cll-anti-CD3 (0,2 μg/mL) J Levedura-433 (1 ;s: HffMà c H57-anti-TCR (1,0 ^g/mL) K Esfero-433 (5 x 106/mL) D Concanavalina A (5 μg/tnL) L Esfero-433 (1 x 106/mL) E gpl20-IIIb (1 μg/πlL) M Levedura-435env (5 x 106/mL) F gpl20-IIIb (1 pgfte*} - aquecido N Levedura-435env (1 x loVmL) G Lisatos celulares de BCIOME-Vac- lac- aquecidos 50°C, 30' O Esfero-435env (5 x Lisatos celulares de HBC10ME-Vac-SF2 - aquecidos 50°C, 30' FEiílisxo-ílSssív Ϊ1 x loVsalã
Os ensaios foram realizados em triplicata e a proliferação das células T foi avaliada por incorporação de timidina; nos dias 3 e 6, 25 μΙ* de (40 ^Ci/mL) foram adicionados a cada poço. Cerca de 18 horas mais tarde, os poços foram colhidos em filtros de fibra de vidro e contados num contador de cintilação.
Os resultados dos ensaios de proliferação de célula T estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3: Dados de proliferação dos Dia 3 e Dia 6 onde o indice de estimulação (I.E.) de antecedente para os poços sem qualquer estimulo = 100
Dados do dia 3 Murganhos não inj ectado Murganhos de controlo de vector Murganhos SF2 Estimulo 1 2 4 5 6 7 8 9 10 Antí-CD3 1781 3438 1756 1909 1725 2728 2720 1467 1626 Ãntí-TCR 737 692 342 295 575 578 1229 231 451 Con A 8641 8931 13548 15809 7967 11885 10255 9551 9184 Proteína gpl20~IIIb 138 62 83 102 100 90 81 99 105 Proteína gpl20-IIIh (50°C; 30’) 155 84 64 78 80 198 186 122 166 Lisato celular BClOME-Vac-lac m m 7¾ US Si Md '» 1# ...víaíI.·:' vKSlsii: M Sfà àA-í: S3S :uí3 <;Μ SM .....m..... ......m....... \ SM W ........... Levedura (1 χ IO5,· 50°C; 30') m i:u MS Esfero (5 X 105; 50°C; 30’) . wr dd· sd? . £*.«·*>·:·% u -y id·.· 39-3 i.n iv dM: A-L-i dd » iS·; S ir - Sôi! 110 215 557 360 703 575 749 381 619 Levedura (1 x 10J; 50°C; 30') 79 225 291 227 346 411 461 208 278 Esfero (5 X 101; 50°C; 30') 76 115 397 468 527 654 732 336 502 Esfero (5 X IO5; 50°C; 301) 112 213 297 210 379 385 480 149 352
Dado6 do dia 6
Murganhos não · Murganhos de controlo
Murganhos SF2
injectados e vector Estímulo :......!......1.......2....... 4 i 5 I 7 1 8 í 9 • 10 Aiiti-CT>3 217 359 445 823 í 5 273 416 I 161 786 .................... 206 Anti-TCR 280 493 264 219 S 458 564 | 380 737 362 Con A 277 861 363 1525 ^ 628 897 l 412 1648 337 Proteína gpl2G-IIIb 73 106 91 ÍÍÕ ; 97 115 | 159 180 102 Proteína gpl20-XIIb (50°C; 30’) 88 107 ................. 108 128 S 166 173 ? 290 201 203 Lisato celular BClOME-Vac-lac 104 85 95 195 : 117 134 f 100 227 99 ; Lisato celular BC10ME-Vac-SF2 99 73 99 217 ; 109 248 í 313 j 218 289 5_. - Levedura-vector (5 X 105; 50°C; 30’) 137 ................ 101 931 510 ; 762 850 ; 822 1737 : 1238 Levedura (1 X IO5; 50°C; 30') Π ·' Si* «.! Mi ! « *M m Esfero (5 χ 105; 50°C; 30') ss? SM U:.': : SM Si 4 5 tís SSM LsisC :.d, dMi)· S? " 1SS: ................ ?::iS sa ! 33¾. 3'Si j -¾ SSi. m .;íS^s8Ui-:av :-s.eíiv;:: β X :.1:.: 1888),: l í ') n* .....is# «** ! SSS: [ :;:u:s. :iss4. .................... •24.S :; X i.Ç: SSPSd si·' í n* 13SÍ i Wt iSS~ I 7-K: Sid : Esfero ¢5 χ 105; 50°C; 30') -i# A'yv 1 : iiT- MS | u-m SS3S Esfero (5 χ IO5; 50°C; 30') MS MS uss 1 Md li rm SM 1 :MSS SSS MS
Nos dados de proliferação apresentados na Tabela 3, é importante observar que todos os murganhos responderam de um modo semelhante aos estímulos mitogénicos proporcionados pelos anticorpos anti-CD3 e anti-TCR e concanavalina A. Estes mitogénios foram incluídos no ensaio para estimar se o mesmo número de células T responsivas de cada murganho foram adicionadas às culturas. A falta de resposta a qualquer estímulo nos poços contendo células de murganho 3 por razões desconhecidas.
Alguns dos resultados dos ensaios de proliferação de célula T estão também representados na Fig. 1. A Fig. M representa os resultados da proliferação de célula T no dia 3 em resposta à proteína gpl20 da estirpe Illb de HIV (isto é, a proteína gpl20-Illb). A Fig. 1B representa os resultados da proliferação de célula T no dia 3 em resposta a lisatos de células BC10ME infectadas com Vac-SF2. A Fig. 1C representa os resultados da proliferação de célula T no dia 6 em resposta à proteína 912 ΟΙ Ilb. A Fig. 1D representa os resultados da proliferação de célula T no dia 6 em resposta aos lisatos das células BC10ME infectadas com Vac-SF2. A Fig. 1E representa os resultados da proliferação de célula T no dia 3 em resposta à levedura controlo de vector AFY433 intacta (isto é, vector(c)-AFY433 de células intactas de S. cerevisiae). A Fig. 1F representa os resultados da proliferação de célula T no dia 6 em resposta à levedura de controlo de vector AFY433.
As células T de murganhos imunizados com levedura intacta viva que expressa HIV gpl60-SF2 (murganhos 7 e 8) ou com esferoplastos que expressam HIV gpl60-SF2 (murganhos 9 e 10) proliferaram em resposta a gpl20, ao passo que as células T de animais não imunizados (murganhos 1 e 2) ou de animais imunizados com levedura de controlo intacta viva (murganhos 3 e 4) ou esferoplastos (murganhos 5 e 6) não proliferaram em resposta a gpl2Q; ver a Tabela 3 e as Figs. IA até 1D. As células T isoladas dos murganhos 7, 8, 9 e 10 responderam ao HIV ghpl60 seja na forma de proteína purificada (ver a Tabela 3 e as Figs. 1.¾ e 1C) ou como lisatos de células infectadas com um vírus vaccinia recombinante que codifica gpl60-SF2 (ver a Tabela 3 e as Figs. 1B e 1D) . As respostas foram observadas tanto no dia 3 como no dia 6 . Deve-se notar, em particular, que mesmo os murganhos tendo sido imunizados contra a gp!60 derivada da estirpe SF2 de HIV, as suas células T apresentaram uma resposta baixa mas significativa à proteína gpl20 isolada da estirpe HIV Illb.
Os resultados apresentados nas Figs. 1E e 1F indicam que as células T isoladas de cada um dos murganhos imunizados (isto é, os murganhos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10) responderam à levedura controlo de vector AFY433 intacta de uma forma dependente da dose. A resposta do dia 6 foi muito alta. Tais células T também responderam ao vector(s)-AFY433 bem como aos veículos de levedura AFY435-gpl60-SF2(c) e AFY435-gpl60-SF2(s) ; ver a Tabela 3. A resposta imunológica como um todo gerada pelos murganhos em resposta a serem administrados com vector (c) -AFY433, vector(S)-AFY433, AFY435-gpl60-SF2(c) e AFY435-gpl60-SF2(s) foi determinada por análise de imunotransferência Western do soro colhido de cada um dos murganhos, utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Os resultados estão apresentados na Fig. 2. Em resumo, as vias 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21 representam as vias de um gel que foram carregadas, cada uma delas, com cerca de 100 μg de proteína de lisatos de levedura AFY435-gpl60-SF2; ao passo que as vias 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20 representam as vias de um gel que foram carregadas com cerca de 100 ^g de lisatos de levedura de vector-AFY433. As vias numeradas foram submetidas a imunotransferência com amostras de soro dos seguintes murganhos: a via 1, do murganho 1; as vias 2 e 3, do murganho 2; as vias 4 e 5, do murganho 3; as vias 6 e 7 do murganho 4; as vias 8 e 9, do murganho 5; as vias 10 e 11, do murganho 6; as vias 12 e 13, do murganho 7; as vias 14 e 15, do murganho 8; as vias 16 e 17, do murganho 9; e as vias 18 e 19, do murganho 10. As vias 20 e 21 foram submetidas a imunotransferência com antisoro colhido de um coelho imunizado com uma proteína de fusão gpl20. Este estudo indicou que os murganhos imunizados fizeram anticorpos contra uma variedade de proteínas derivadas de levedura e que o padrão das proteínas reconhecido pelo soro de murganho era dependente de se os murganhos tinham sido imunizados com levedura intacta ou com esferoplastos. As respostas imunológicas humorais geradas pelos murganhos 7, 8 9 e 10 em resposta a gpl60 não puderem ser distinguidas neste ensaio de imunotransferência Western devido à alta actividade de fundo dos antisoros gerados em resposta a outros antigénios de levedura e, devido à abundância relativamente baixa de gpl60 recuperada dos lisatos de levedura nesta experiência. Em resumo, os veículos de levedura introduzidos sistemicamente nos murganhos estimularam uma vigorosa resposta imunológica contra as proteínas do veiculo de levedura, incluindo a produção de células T capazes de proliferar em resposta à proteína heteróloga transportada pelo veículo de levedura. E. Estimulação de uma resposta imunológica mediada por célula
Foram conduzidos ensaios CTL para detectar a estimulação da resposta imunológica mediada por célula em murganhos administrados com os veículos de levedura que expressam a gpl60 da presente invenção. Os ensaios CTL foram gerados por métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Em resumo, cerca de 40 x 106 células não fraccionadas, não irradiadas do baço e gânglio linfático foram colocadas em frascos contendo cerca de 1 x 107 de
JitYCB-fpi'SQ-SF3 Cc) mais cerca de 1 χ 107 de de veículos de levedura num total de 10 mL de TCM e cultivadas por 7 dias. Os frascos foram organizados em duplicada com um tendo 5% de sobrenadantes livres de célula de células de baço de rato estimulada por concanavalina A (CAS) como fonte de factores de crescimento de célula T no início do período de cultura. No dia 5, adicionou-se 5% de CAS a todos os frascos. Os CTL foram colhidos por centrifugação por gradiente de densidade Ficoll-Hypaque e ressuspensos em TCM para utilização. 0 ensaio CTL foi conduzido de acordo com técnicas padrão. Em resumo, os CTL foram diluídos a concentrações de cerca de 2 x 107 células/mL e cerca de 1 χ 107 células/mL em TCM. 100 μΙ> de CTL e 100 μΏ de células alvo marcadas com 51Cr foram misturadas, em triplicata, em placas com fundo em v de 96 poços. A citólíse foi determinada pela libertação de crómio radioactivo das células alvo depois de 4 horas de incubação a 37°C.
Os CTL foram testados em cinco populações de célula alvo: P815, P815-Vac-Lac, P815-Vac-SF2, BC10ME e BC10ME-gpl60-IIIb (células BC10ME transfectadas modificadas para expressar gpl60~ Illb) . Os valores percentuais de lise foram obtidos para cada combinação de células alvo CTL em duas proporções de efector:alvo (E:T). Utilizando métodos padrão para os ensaios CTL, os dados foram corrigidos para lise não específica em P815-Vac-lac para P815Vac-SF2 e em BC10ME para BC10ME-gpl60-IIIb. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Dados do ensaio CTL P815-Vac-SF2 -axrfc % de lise Corrigida % de lise Corrigida Murganho: CAS Alvo 40:1 20:1 Alvo 40:1 20:1 1 «is •S -4 dia 1 Q •: $ 2 dia 5 I "1: •is -3 dia 1 :~íi ã , & Ί Γ>4 sá íid tx dia 1 3ld ssd ís4. 4 dia 5 :»d sxl dia 1 0 * -§ -S 5 dia 5 λ-;· sd. M ftil dia 1 £& Kít nd M 6 dia 5 V ·· Λ -4 ··$ • i ••s i._________;__ dia 1 p ..7 * 7 dia 5 m • e -s dia 1 %% n .· «í 8 dia 5 m 7 IS 5 dia 1 u m 1? 9 dia 5 -ê -3: •i dia 1 13 ·.$ s ··? ^ dia 5 1:9 17 IS ú dia 1 M ss 11
Os CTL gerados de murganhos imunizados com veículos de levedura -SFâXc) e foram capazes de matar as células alvo que expressam gpl6Q-SF2 e, num grau menor, as células que expressam gpl60-IIIb. A morte apresentou uma resposta à dose em termos da proporção E: T em que na proporção mais alta de E:T, foram mortas mais células alvo. A morte de células P815-Vac-SF2 por CTL gerado de murganhos imunizados com veículos de levedura AFY435-gpl60-SF2(c) e AFY435-gpl60-SF2(s) está ilustrada na Fig. 3. As Figs. 3A e 3B apresentam os resultados de ensaios separados em que CAS foi adicionado, respectivamente no dia 5 e no dia 1. Não há dados apresentados para o CTL derivado dos murganhos 3 e 5, uma vez que muito poucas células destes frascos foram recuperadas. No entanto, os dados são convincentes de que a levedura intacta e/ou os esferoplastos derivados da levedura expressam uma proteína heteróloga que pode ser utilizada para iniciar as células T in vitro e in vivo para matar as células que expressam a proteína heteróloga.
Os resultados obtidos no estudo controlado correlacionam-se com os resultados obtidos em experiências piloto anteriores. Nos ensaios anteriores, CTL gerado de murganhos imunizados tanto com veículos de levedura AFY435-gpl60-SF2(c) como com AFY435-gpl60-SF2(s) foram capazes de matar células P815-Vac-SF2, ao passo que CTL derivado de murganhos não imunizados não foram. Tanto no estudo piloto como no controlado, os graus de mortalidade eram semelhantes e, parece que os animais injectados com a levedura intacta deram origem a CTL mais forte do que os murganhos injectados com esferoplastos. F. Os resultados registados neste Exemplo indicam que os veículos de levedura da presente invenção podem iniciar células T de murganho para responder a uma proteína heteróloga. Por exemplo: (a) As células T isoladas de um baço e gânglios linfáticos de murganhos injectados por via intraperitoneal com veículos de levedura que expressam a proteína de envelope de HIV gpl60~SR2 proliferaram in vitro em resposta a extractos de células infectadas com um vírus vaccinia recombinante que codifica gpl60-SF2. As células T derivadas de murganhos não imunizados ou de murganhos que tinham sido imunizados com levedura recombinante contendo vector ADN mas não ADN que codifica gpl60-SF2 não proliferaram em resposta a tais extractos de células. (b) As células de baço e gânglio linfático de murganhos imunizados com veículos de levedura que expressam a proteína de envelope de HIV gpl60-SR2 continham células T citotóxicas precursoras que, depois de estimulação in vitro, podiam matar, especificamente, as células infectadas com um vírus vaccinia recombinante que codifica gpl60~SF2. As células T derivadas de murganhos não imunizados ou de murganhos que tinham sido imunizados com levedura recombinante contendo vector ADN mas não ADN que codifica gpl60-SF2 não contêm precursores CTL iniciados por gpl60-SF2. (c) As células T dos murganhos imunizados com veículos de levedura que expressam a proteína de envelope de HIV gpl60-SF2 também proliferaram, num grau menor, mas significativo, em resposta à proteína gpl20 purificada derivada de uma clade de HIV diferente, Illb (LAI). 0 CTL derivado destes animais também apresentou reactividade cruzada demonstrável em relação a células que expressam a gpl20-IIIb. Estes resultados sugerem que os veículos de levedura que expressam uma proteína gpl60 de HIV podem induzir a imunidade reactiva cruzada às proteínas gpl60 de outros isolados de HIV. (d) Os murganhos injectados com esferoplastos derivados de levedura AFY435-gpl60-SF2 intacta também responderam em proliferação e ensaios citotóxicos a gpl60-SF2 bem como à proteína gpl20-IIIb sugerindo que os esferoplastos poderiam ser utilizados para a imunização em vez da levedura intacta. (e) A imunização com a levedura intacta ou esferoplastos não requer a administração de um adjuvante. Os murganhos injectados por via intraperitoneal com a levedura intacta ou esferoplastos não apresentaram quaisquer efeitos adversos mesmo depois de injecções repetidas.
Em resumo, não apenas foram induzidas as respostas proliferativas das células T (indicativo de iniciação de célula T auxiliar) mas a actividade do CTL (indicativo de imunidade mediada por célula) foi também induzida. A iniciação da actividade do CTL sugere um trato único da levedura pelo sistema imunológico (demonstrado pela levedura intacta e esferoplastos) que resultam na apresentação de antigénio tanto por meio da classe II (a células T auxiliares) como classe I (a precursores de CTL) . A iniciação de ambos os tipos de células T ocorreu na ausência de adjuvantes sugerindo que os veículos de levedura podem funcionar como os seus próprios adjuvantes. Além disso, os murganhos imunizados não apresentaram reacções típicas de adjuvantes (isto é, efeitos secundários indesejáveis) depois da injecção de levedura intacta ou esferoplastos, demonstrando a segurança dos veículos de levedura da presente invenção.
Exemplo 3
Este exemplo demonstra que um veículo de levedura da presente invenção é seguro, mesmo num animal imunocompremetido, tal como num murganho SCID que é deficiente tanto em linfócitos T como B.
Dois murganhos CB(disponíveis da Jackson Labs, Bar Harbor, ME) foram injectados por via intrapenitoneal com cerca de 2 x 1Q7 de em 100 μΐ* de injecção tampão.
Dois murganhos CB.1755^ adicionais foram injectados por via intrapenitoneal com cerca de 2 x 107 de AFY435-gpl60-SF2 (c) em 100 μΐι de injecção tampão. Os murganhos imunizados não exibiram reacções adversas no local da injecção ou alterações da saúde como um todo por um período de 10 dias durante os quais os murganhos foram monitorizados diariamente.
No dia 10 depois da injecção, os murganhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono. A lavagem peritoneal foi realizada utilizando 5 mL de PBS estéril (solução salina tamponizada com fosfato) . Cerca de 200 juL da lavagem de cada murganho foram aplicados a placas de petri separadas contendo meio rico (por exemplo, meio dextrose batata levedura) ou meio definido selectivo para o crescimento de levedura. As placas de petri foram incubadas à temperatura ambiente por 7 dias, tempo durante o gual não foi observado o crescimento de levedura. As placas de controlo contendo amostras das preparações de levedura utilizadas para as injecções apresentaram crescimento indicando gue os murganhos tinham sido injectados com levedura viva.
Exemplo 4
Este exemplo demonstra gue um veiculo de levedura da presente invenção é seguro e estimula a proliferação de células T especificas para antigénio em grandes animais primatas. A. Vacinação de primata Macaco
Nove macacos rabo-de-porco (Macaca nemestrina) foram vacinados de acordo com um esquema em que pares de macacos rabo-de-porco foram injectados semanalmente durante três semanas com 10 milhões ou 50 milhões de levedura recombinante que expressa ou não expressa a glicoproteína gpl60-SF2 do HIV. Um Único macaco serviu como controlo não injectado. O protocolo de vacinação utilizado está apresentado na Tabela 5. As vacinações foram realizadas de acordo com os protocolos descritos na Exemplo 3. As vacinações foram administradas por via peritoneal no Dia 1. As vacinas foram administradas lA por via intramuscular e lA por via subcutânea no braço direito, no Dia 8. As vacinas foram administradas XA por via intramuscular e lA por via subcutânea no braço esquerdo, no Dia 15. Não foram observadas reacções adversas no local das injecções.
Tabela 5. Protocolo de vacinação em macacos rabo-de-porco
Macaco N° Sexo Vacina 1 F 1X10' levedura recombinante viva, intacta c/s expressão de HIV gp 160-SF2 2 M lllõ levedura recarbinante viva, intacta c/s expressão de HIV gp 160-SF2 3 M 5x10' levedura recombinante viva, intacta c/s expressão de HIV gp 160-SF2 4 F 5x10' levedura recarbinante viva, intacta c/s expressão de HIV gp 160-SF2 5 F 1X10^ levedura recombinante viva, intacta c/ expressão de HIV gp 160-SF2 6 F 5xl07 levedura recombinante viva, intacta c/ expressão de HIV gp 160-SF2 7 M 5x10' levedura recombinante viva, intacta c/ expressão de HIV gp 160-SF2 8 M ΪΧίίΓ levedura recarbinante viva, intacta c/ expressão de HIV gp 160-SF2 9 F Não injectado B. Isolamento de linfócitos de Macaco
Foram colhidos aproximadamente 7 mL de sangue periférico de cada macaco no momento de cada imunização. Deixou-se 2 mL coagular para se obter soro para utilização em análises ELISA e imunotransferência Western a fim de detectar a presença de anticorpos anti-gpl60-SF2. Os 5 mL restantes foram utilizados para o isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) para a proliferação de células T e ensaios CTL. Os 5 mL de sangue foram imediatamente misturados com heparina livre de conservante, diluída 1:1 com meio de cultura de tecido (TCM) consistindo em RPMI 1640 suplementado com 7,5% de soro fetal bovino desactivado por calor, L-glutamina, L-piruvato, aminoácidos não essenciais, vitaminas, gentamicina e 2-mercaptoetanol. As células diluídas foram, cuidadosamente, postas em camadas sobre 95% de Histiopaque 1077:5% de RPMI 1640. As PBMCs foram removidas da interface, lavadas duas vezes e ressuspensas em TCM para utilização em ensaios in vitro.
Cerca de 69 dias depois da última vacinação, os animais foram sacrificados, quando foram colhidos sangue, gânglios linfáticos auxiliares e baço. Aproximadamente 50 mL de sangue foram obtidos de cada animal e os gânglios linfáticos auxiliares e o baço foram colhidos. As suspensões das células foram preparadas a partir dos baços e gânglios linfáticos cortando os órgãos em pequenos pedaços seguido pela homogeneização utilizando um homogeneizador Dounce. As células mononucleares foram isoladas conforme descrito imediatamente acima. Todas as manipulações das células foram realizadas na presença de heparina livre de conservante para evitar a coagulação.
C. Ensaio de Proliferação de Célula T
Os ensaios de proliferação de célula T foram realizados utilizando isolado de PBMC de cada animal de acordo com o método descrito no Exemplo 2. Os sobrenadantes das células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de macaco, estimulados por 24 horas na presença de 5 de concanavalina A (Con A), foram utilizados como fonte de factores de crescimento de célula T para as células T de macaco no ensaio de proliferação de célula T.
As PBMC, células de gânglio linfático e baço obtidas dos animais antes da primeira vacinação responderam vigorosamente aos estímulos mitogénicos (índices de estimulação >50 em resposta a Con A e PHA) e responderam (I.E. <5) à levedura recombinante tratada com calor com/sem expressão de HIV gpl60-SF2 ("levedura-") ou levedura recombinante c/expressão de HIV gpl60-SF2 ("levedura01') (dados não apresentados). Cerca de duas semanas depois da primeira vacinação, as células isoladas dos recipientes de vacina demonstraram claramente uma resposta proliferativa aumentada numa maneira dependente da dose (com base em números crescentes de levedura administrada) para levedura viva ou aquecida, em comparação com o macaco n” 9 que não tinha sido vacinado. Os linfócitos isolados de macaco foram incubados por dois ou quatro dias na presença de factores de crescimento de células T. Os resultados destes ensaios de proliferação realizados depois do sacrifício utilizando populações de PBMC de macaco, células de gânglio linfático e baço estão apresentados na Tabela 6. Os dados são apresentados como índices de estimulação ± D.P. com a proliferação de fundo utilizada para calcular os valores de I.E. apresentada como contagens por minuto + D.P.
Tabela 6. Resultados do ensaio de Proliferação
Dia 2 Náo vacinado Vacinado ccm vectcr Vacinado con vector Y Vacinado con vector Y And gemo N° 9 BírMC N° 9 I» N° 9 SPL n° 2 nvr N° 2 SPL N° 3 BEMC N° 3 I&$ N° 3 SPL £ íççíç:-;· : ÍS>: -¾ : :+v 4 iíl Nada (Antecede nte) 704 d 336 140 i 8 137 t 50 156 i 18 1039 ± 51 168 + 33 118 17 223+13 242 :v 44 1201 ± 92 162 ± 28 ijeveaura SF-2 (2 0,6 i 0,1 0,9 S: 0,1 0,8 i 0,0 0,9 i 0,2 1/3 ± 0,1 0,7 + 0,0 1,1 i 0,9 ± 1,7 ± 0,5 1/1 ± 1,6 ;v 0,6 SF-2 (0,2 1—1 o +-I o 0,2’ 1/4 _i 0,3 1,3 z 0,3 1,1 ± 0,2 “ ' 1,1 ± 1,1 ± ],4 + 0,1 1,1 ± 0,4 SF2-£5£i _ (2 0,4 :¾ 0,1 0,8 í 0,3 aλ i 0,1 0,7 i 0,1 1,3 ϊ 0,2 0,8 ;> 0,1 1,3 + 0,6 1,1 A 0,1 1,0 ± 0,2 5. + 0,8""" 0,2 SF2 (0,2 + 0,2 0,9 ± 0,2 0,8 + 0,2 0,8 i 0,3 1,2 i 0,2 0,8 v 0,2 1,2 ± 0,3 1,5 a 0,1 1,9 ± 0,6 0,9 ± 1,6 + FeLV (2 + y\' ·-·: a 0,8 z 0,8 ± 0,5 ± 0,1 1,1 ± »,·£ + 0,C 0,9 í: 1,1 ± C/l 1,6 + 0,3 1/2 ± 0,5 0,7 Levedura FeLV (0,2 0,6 + 0,1 0,9 * 0,1 1,1 i 0,1 0,8 + 0,2 1/1 s 0,4 0,8 ± 0,2 1,3 ± :: 1,2 + 'λι' i 0,2 1,6 ± 2, + i 0,9 Hl VAX-d ^ (500.000) 0,8 ± 0,1 0,9 ± 1,0 i 0,4 0,8 + 0,1 3,8 ± 1,3+0,4 3,2 i 0,4 10,5 S: 2,5 7,3 ± 1,1 12,6 + 7,5 + ; C-,6 HIVAX-1 (50.000) 0,6 ± 0,2 1,6 ± 1,1 + 1,0 i 0,3 3,9 ± 3,7 ± 0,9 2,1 ± 0,4 15,0 $ 1,7 5,5 + 1,4 4,91 0,2' 4,6 + . £1 í HlVAX-1 _ (5.000) 0,9 S: 0,1 1,2 ± 0,3 1,0 r; 0,8 i 0,1 3,2 ; 1,6 ± 0,3 1,4 -1,0 6,7 i + í ; 1,0 2,3 + 1,0 0,7 ± | 0,2 ! Con A !2 «g.%.5 16,6 ± 4,7 89,2 i 45,2 69,9 ± 30,7 22,0 ± 23,0 ± 2,6 125,1 ± 22,2 174,4 t 29,9 94,0 + 8,1 170,7 + 23,6 45,3 + Ί a Λ ! 96,6* 1 Con A 3,6 ± 0,7 4,1 ± 0,1 4,4 + 2,9 8,3 ± 3,3 7,2 ± 1,6 34,0 + 7,9 12,4 ± 4,2 7,2 + 2,2 9,7 + 0,2 5,7 £ 2,2 21,3 £ i 13,2 I
Dia 2 Vacinado com HIVAX-1 Vacinado com HIVAX-1 Vacinado com HIVAX-1 Vacinado com HIVAX-1 Antigéxxio N" 5 BMC ND 5 LN N° 5 SPL N" 6 LN N° 6 SPL N” 7 BMC N° 7 LN N° 7 SPL 8 BPMC N" 8 I» Nada (Antecedente) 367 & 44 503 ± 67 169 + 34 148 + 19 156 t 23 465 ,v 29 318 ± 52 205 + 60 426 ± 59 205 ± 60 Levedura SP-2 (2 X , 4 + 0,0 1,5 + 0,0 2,0 ± L , .1 1,3 ± 0,3 1,3 ± 1,1 + 0,1 1,0 ± 0,2 2,0 + 0,0 0,2 Levedura SF-2 1,1 ± 0,4 8,0 ± 0,2 1,1 ± 1,0 ± Ó,4~ 0,7 ± 0,3 1,0 4 0,9 ± 0,2 λ a; í £ § ;£ SF2-CH0 (2 1,7 ± 1,4 + 0,1 2,2 ± 1,3 + 1,4 ± 0,3 1,3 ± 0,1 1,8 + 0,3 0,1 1,5 ± 0,1 SF2-CH0 (0,2 vV ’·' l'' 's'ÍA' 0,8 + 1,1 ± 1,2^ + 1,4 4 0,2 0,8 ± 0,1 1,0 4; S4.-4 0,9 ± 1,0 ± 1,1 + 3·<.·5 ± 0,0 Levedura FeLV (2 0,8 ± i":; 'S 0,7 ± 0,0 1,4 + 1,2 + 0,1 0,1 ± 0,7 ± 0,4 0,6 ± 0,1 1.1 t 0,1 0·; s ± 0,2 1,1 ± Levedura FeLV Í;v,.-ç- ??£·>: 1,0 ± 0,0 0,8 + 1,0 ± 0,1 1,2 + Λ. Vj 0,1 + 1,1 ± 0,6 ± 0,1 5-,S ± 0,2 0,9 f, HIVAX-1 (500.000) 6,6 ± ! sí 4,0 ± 0,7 3,6 i 0,1 8,6 + 10,6 ± ,§ 3,4 + 0,8 2,5 ± 3,6 + 4,3 ± 0,8 >2 5 :¾ HIVAX-1 (50.000) 5,8 + 2,3 2,7 ± 2,6 ± 3,7 ± ;v£ s 2,3 ± 2,9 ± 0,1 1,9 + 1,3 3,8 ± 0,4 3,9 ± 0,7 3,$ <: HIVAX-1 (5.000) 2,9 ± 1.·$ 2,0 i 1 ,3 ± 0/3 6,1 ± 1,8 + 1,6 ± 3,6 + 1,4 1,4 & 0.5 SV1 + 0,9 Iv-S Ccn A (2 33,7 ± 7,6 44,2 + 32,6 ± 2,0 67,1 ± 13,0 71,9 ± 21,8 40,5 + 5,0 67,7 ± 38,3 102,0 ± 30,7 69,7 ± 2,8 102,0 ± 30,7 Con A v vJ« Vi »$:*£>' ' 3,6 * 0,4 6,8 ± 3,5 7,8 ± 0,2 32,9 + 4,6 11,0 + 0,8 5,6 ± 0,9 22,1 + 10,6 8,8 ± 1. .§ 8,8 + 1,5 1,5
Dia 4 Não vacinado Vacinado com vector Y Vacinado com vector Y Vacinado com vector Y Antigénio N° 9 BMC Mc 9 LN N° 9 SPL N° 2 BMC N° 2 SPL N° 3 BMC N° 3 m N° 3 SPL N11 4 BPMC N° 4 LN W 4 SPL Nada (Antecedente) 272 ± 57 318 ± 13 300 + 51 256 + 327 312 ± 135 233 ± 6 276 ± 52 727 ± 108 708 + 157 4965 ± 879 998 + 461 Levedura SF-2 (2 j£í>’.'V\s'sv,í 1,0 ± í vi 1,1 ± 0,1 0,7 ± 0,1 1,1 ± 0,2 0,8 ± 0,2 1,0 + 0,3 1,2 ± 0,0 0,9 ± 0,1 1,4 ± 0,1 0,9 ± 0,2 1,1 + 0,3 Levedura SF-2 0,7 ± 0,0 1,0 ± 0,1 0,9 ± Λ. t. 1,8 + I'. > 0,7 + 0,2 1,2 ± 0,2 1 ,3 ± 0,1 1,0 ± 0,8 ± 0,1 1,0 ± 0,1 1,5 + 0,4 SF2-MO (2 5¾¾/.«&·! 1,3 ± 0,8 + 0,7 ± 1,4 + 1,3 i; 0,8 + <V v; 1,2 ± 1,1 ± ç<, ^ 0,7 + 0,9 ± 0,1 0,4 + 0,0 SF2-MO 0,8 ± 1,1 ± 0,0 1,1 ± 0,1 1,6 ± 0,2 1,4 + 0,7 1,1 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,1 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,9 ± 0,0 0,8 + LeveduraFeLV (2 ^ ο í>Xv:>' 0,8 + 0,3 1,1 t 0,2 1, 0 ± 0,2 1,1 ± 0,1 1,6 + 0,4" 1,0 ± 0,2 1,2 + 0,0 1,1 + 0,8 0,9 ± 0,2 1,1 ± 0,1 0,7 ± 0,1 LeveduraFeLV (0:.:¾ 0,7 ± 0,3 0,8 ± 0,0 í...í: ± j\ v 1,6 ± 0,7 ± 1,2 ± 1,4 + 0,3 1,4 ± 0,1 0,6 + 0,2 0,9 + 0,1 SvS ± 0,2 HIVAX-1 (500.000) 1,8 + S ,· í 1,1 v S, 1 1,0 ± '· 0,9 ± 0,1 1,7 ± 0,2 2,5 ± 2,8 ± 2,7 ± D,íí 16,6 ± 0,8 2,5 ± 0,1 12,2 + ssimK-i (50.000) 1,7 + 0,6 + 0,0 1,3 ± ;; 1 1,1 + 0,2 1,8 ± 2,2 + y *5 2,3 ± 2,4 + 8,1 + 1,5 ± 0,0 4,6 ± HIVAX-1 ¢5.000) 1, 7: ± 0,4 0,6 + 0,7 + 0,2 0,2 1,9 ± 1,2 + 0,2 1,3 + 0,2 1,3 ± 2,6 ± 0,9 ± 2,0 ± Con A (2 (¾¾¾) 39,4 ± 3,2 10,7 ;S 9,9 ± 1,7 5,3 ± 0,9 3,5 7: 0,9 2C,3 ± 2, 0 25,2 + 4,6 3,4 ± 20,9 í 3,9 5,2 + 0,7 26,2 + 5,7 Con A (0,5 íKfLKÍ-ç 4,6 ± £:. 7 1 ,5 ± V N 4,0 i 1,7 4,9 ± 2,6 ± ; , ·$ 9,6 ± 5,0 3,1 ± 1,3 1,0 ± Μ V 3,2 ± •1. § S+.S 6,4 + 2·; >$
Dia 2 Vacinado ccm HIVAX-1 Vacinado com HTVAX-l Antigénio N° 5 bem: N° 5 LN N° 5 SPL N° 7 ehvc N° 8 LN N° 8 SPL Nada (Antecedente) 1107 í 534 415 ± 42 297 ± 50 620 ± 182 937 ± 339 289 s 48 Levedura SF-2 (2 fiaíssy 2,4 í « · 2,7 ± 1,2 2,7 ;5 0,8 2,7 ± 0,3 2,7 ± 1,3 4,7 i- 1,1 Levedura SF-2 (0,2 ftg/íSÍ,) 2,5 + 0,1 1,9 ± 0,2 2,4 4 0,4 2,1 4 1,0 2,6 s 1,1 2,5 ± 0,0 SF2- MO (2 lí® ± 0,3 3*5 ± 0,5 2,9 * 0,2 2,3 ± 0,0 3,9 + 0,9 2,6 s 0,4 SF2-CHO (0,2 •l j ^ ± 0,4 2,2 + 1,0 1,2 ± 0,3 1,3 + 0,2 4,2 + 0,6 2,1 * 0,2 Levedura FeLV (2 1,1 + 0,-4 1,7 ± 0,2 2,3 ± 0,1 0,9 ± 0,5 1,5 ± 0,2 1,3 ± 0,4 Levedura FeLV (8,-sg/tó 1,3 á: 0,3 1,4 £ 0,3 1,1 ís 0 1,0 + 0,2 1,3 ± 0,3 0,7 :i: 0,1 HTVAX-l (500.000) 3,9 ± 6,9 ± 0,5 8,6 á 0,2 8,0 ± 0,8 5,5 ± 0,3 14;3 i 2,2 F0VAX-1 (50.000) 2,7 & £-> 5,0 1,2 4,7 ± 0,9 4,1 ± 0,2 3,1 S- 0,2 10,0 í 1,4 Hivax-i (5.000) 5.;a; + 1,5 ± 0,3 4,3 ± 1,0 1,5 ± 1,2 3,2 ± 0,9 3,5 ΐ; 1,2 Con A (2 19,4 ϊ 3,1 36,1 6,1 30,7 + 4,7 5,8 .i 2,2 3,1 ± 0,5 32,8 * 9,5 Con A (0,5 2,3 s 0,8 7,6 ± 2,6 6,5 ;S 0,8 4,0 ± 1,0 7,1 íe 0,7 7,1 s 1,9
Conforme observado nos dados da Tabela 6, aos 69 dias depois da vacinação final, as populações de PBMC, células de gânglio linfático e baço isoladas dos macacos vacinados com a levedura- ou a levedura', cada uma reteve a capacidade de responder aos antigénios da levedura de uma maneira dependente da dose. Principalmente, as populações de linfócitos de macacos vacinados com levedura' mas não com levedura-, também responderam a gpl20-SF2 purificada (levedura e derivado de CHO), indicando, deste modo, que a proliferação de células T observada era especifica para o antigénio. Deste modo, os resultados indicam que tanto a levedura- de controlo como a levedura* induzem a resposta da célula T em macacos. No entanto, apenas a levedura' induz uma resposta de célula T específica para gpl20-SF2. Em conjunto, os resultados confirmam a segurança e a eficácia dos veículos de levedura da presente invenção em estudos em animais grandes utilizando primatas.
Estas experiências demonstram a segurança dos veículos de levedura da presente invenção mesmo em animais imunodeficientes.
Embora várias formas de realização da presente invenção tenham sido descritas em pormenor, é evidente que modificações e adaptações destas formas de realização ocorrerão aos especialistas na técnica.
Lisboa, 7 de Setembro de 2007.

Claims (36)

1. Utilização de um veiculo de levedura na produção de uma vacina para a modulação de uma resposta imunológica mediada por células ou uma resposta imunológica humoral num animal, o veiculo de levedura caracterizado por ser seleccionado de um microrganismo de levedura, um esferoplasto de levedura, um citoplasto de levedura ou um fantasma de levedura, o referido veiculo transportando, pelo menos, um composto heterólogo compreendendo um antigénio ou uma citocina ou uma combinação destes.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido veiculo de levedura ser transformado com uma molécula de ácido nucleico que codifica o referido composto heterólogo e, em que o referido veiculo de levedura expressou o referido composto heterólogo.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido veiculo de levedura ter sido carregado com o referido composto heterólogo.
4. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido veículo de levedura transportar, pelo menos, dois compostos heterólogos.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido veículo de levedura ser transformado com moléculas de ácido nucleico que codificam os referidos compostos heterólogos e, em que a referida levedura expressou os referidos compostos heterólogos.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por um dos referidos compostos compreender uma citocina.
7. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por o referido composto heterólogo ser um antigénio.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o referido antigénio compreender um ou mais dos seguintes: um antigénio virai, uma molécula de superfície celular de mamífero, um antigénio bacteriano, um antigénio fúngico, um antigénio de protozoário, um antigénio de helminto, um antigénio de ectoparasita ou um antigénio do cancro.
9 . Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por o referido veículo de levedura ser seleccionado de um microrganismo de levedura, um esferoplasto de levedura ou um citoplasto de levedura.
10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por o referido veículo de levedura ser um microrganismo de levedura.
11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o referido veículo de levedura ser de uma levedura não patogénica.
12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o referido veiculo de levedura ser de uma levedura do género Saccharomyces, Candida, Ilansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.
13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por o referido veículo de levedura ser uma levedura do género Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia ou Schizosaccharomyces .
14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por o referido veiculo de levedura ser uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, ou Schizosaccharomyces pombe.
15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por o referido veiculo de levedura ser uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae.
16. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o referido veículo de levedura compreender ainda um componente heterólogo sobre a membrana externa do referido veículo de levedura, de tal maneira que o referido componente é capaz de dirigir o referido veículo de levedura para um dado tipo de célula, em que o referido componente heterólogo compreende um ou mais dos seguintes: um anticorpo, uma proteína de superfície de célula, um ligando Fas, um ligando de receptor ou uma proteína de superfície virai.
17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o referido veículo de levedura ser transformado com uma molécula de ácido nucleico que codifica o referido componente heterólogo e, em que a referida levedura expressou o referido componente heterólogo.
18. Utilização de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o referido tipo de célula compreender células seleccionadas de uma ou mais das seguintes: células conjuntivas, células dendríticas, células endoteliais, células epiteliais, células de origem granulocítica, células estaminais hematopoiéticas, linfócitos, miócitos, neutrófilos, pneumócitos ou timócitos.
19. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o referido veiculo de levedura ser capaz de fundir com uma células à qual o referido composto está a ser administrado.
20. Utilização de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por a referida célula compreender células conjuntivas, células dendríticas, células endoteliais, células epiteliais, células de origem granulocitica, células estaminais hematopoiéticas, linfócitos, miócitos, neutrófilos, pneumócitos, timócitos ou misturas destas.
21. Utilização de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por a referida célula compreender células seleccionadas de uma ou mais das seguintes: estirpe granulocítico-monocítica, linfócitos B ou linfócitos T. 221 Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o referido veiculo de levedura ser seleccionado de uma microrganismo de levedura ou um esferoplasto de levedura, em que o referido veiculo de levedura expressou uma proteína precursora heteróloga tendo um sitio de processamento de aminoácido básico e, em que o referido veiculo de levedura é capaz de processar correctamente a referida proteína precursora numa proteína e clivagem.
23. Utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por o referido veículo de levedura compreender uma estirpe de levedura deficiente da endoprotease Kcx2 capaz de produzir uma endoprotease processadora de aminoácido dibásico heterólogo capaz de clivar a referida proteína precursora.
24. Utilização de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por o referido veiculo de levedura ser de levedura da espécie S. cerevisiae.
25. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por a referida vacina ser para obter uma resposta imunológica contra uma doença causada por um agente infeccioso.
26. Utilização de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por o referido agente infeccioso ser seleccionado de um ou mais dos seguintes: viróides, priões, vírus, bactérias, fungos, protozoários, helmintos e ectoparasitas.
27. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada por a referida vacina ser para modular uma resposta imunológica contra uma ou mais das seguintes: alergias, anemias, doenças autoimunes, cancros, doenças cardiovasculares, distúrbios hematopoiéticos, doenças por imunodeficiências, doenças imunoproliferativas, doenças imunosupressoras, doenças inflamatórias ou rejeição de transplantes.
28. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, em que a referida vacina estimula uma resposta imunológica mediada por célula.
29. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada por a referida vacina estimular uma resposta imunológica humoral.
30. Composição farmacêutica caracterizada por compreender: (a) um veiculo de levedura seleccionado de um microrganismo de levedura, um esferoplasto de levedura, um citoplasto de levedura ou um fantasma de levedura, o 5 referido veículo de levedura compreendendo, pelo menos, um composto heterólogo compreendendo um antigénio ou uma citocina ou uma combinações destes; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável para administração a um animal.
31. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 30, caracterizada por o referido veículo de levedura ser transformado com uma molécula de ácido nucleico que codifica o referido composto heterólogo e, em que 0 referido veículo de levedura expressou o referido composto heterólogo.
32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 30, caracterizada por o referido veículo de levedura ter sido carregado com o referido composto heterólogo.
33. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizada por o referido veículo de levedura transportar, pelo menos, dois compostos heterólogos.
34. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada por o referido composto ser um antigénio seleccionado de um dos seguintes: um antigénio virai, uma molécula de superfície celular de mamífero, um antigénio bacteriano, um antigénio fúngico, um antigénio de protozoário, um antigénio de helminto, um antigénio de ectoparasita ou um antigénio do cancro.
35. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizada por o referido veículo de levedura ser de uma levedura do género Saccharomyces, Candida, Ilansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces ou Yarrowia. 6
36. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizada por o referido veiculo de levedura ser uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, e/ou Schizosaccharomyces pombe.
37. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 36, caracterizada por o referido veiculo de levedura compreender ainda um componente heterólogo sobre a membrana externa do referido veiculo de levedura, de tal maneira que o referido componente é capaz de dirigir o referido veiculo de levedura para um dado tipo de célula, em que o referido componente heterólogo compreende um ou mais dos seguintes: um anticorpo, uma proteína de superfície de célula, um ligando Fas, um ligando de receptor ou uma proteína de superfície virai. Lisboa, 7 de Setembro de 2007.
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