PT80052B - Process for preparing vectors for expressing bovine growth hormone derivatives - Google Patents
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- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Description
Descrição das Figuras:
Figuras 1-4 - Ilustração esquemática do protocolo de construção do plasmídeo pNM 579.
Figuras 1-8 - Ilustração esquemática do protocolo de construção do plasmídeo pNM 789B.
Figura 9 - Mapa dos locais de restrição dos plasmideos pCz1920 e pJR1.
Figura 10 - Mapa dos locais de restrição do plasmídeo PCL112.
Figura 11 - Gene sintético da timosina alfa 1.
Figura 12 - Protocolo de sintese do fragemento de nucleotideos T15.
Figura 13 - Protocolo de construção do plasmídeo pThDG
Figura 14 - Gene sintético da proinsulina
Figufa 15 - Protocolo de construção do plasmídeo ρΗI7 A 4^ 1
Figura 16 - Protocolo de construção do plasmídeo pHI104.
-6-
Descrição Detalhada do Invento
0 presente invento proporciona um vector de expressão de DNA recombínante seleccionável e de replicação autonoma o qual compreende:
a) um replicão "que se escapa" e
b) uma sequência activadora da transcrição e tradução que está na fase de leitura de um gene que codifica um derivado bioactivo da hormona de crescimento bovino, sendo
o referido gene.
-7(1)
f:
(2)
' (3) 5
3
(4)'· :,5 3
(5) 5
3
(6) 5
3
| ' ATG | AAA | GGG | AAT | TCT | ATG | GCC | TTC | |
| 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 I 1 | 1 1 1 | |
| ' TAC | TTT | ccc | TTA | AGA | TAC | CGG | AAG | |
| CCA | GCC | ATG | TCC | TTG | TCC | GGC | 3' | |
| 1 1 I | I 1 1 | 1 I I | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | lll. | -R-R | |
| GGT | CGG | TAC | AGG | AAC | AGG | CCG | 5' | |
| ’ ATG | GAT | GAT | AAG | TTT | CCG | GCT | ATG | |
| 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | I 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | I 1 1 | 1 1 1 | |
| ' TAC | CTA | CTA | TTC | AAA | GGC | CGA | TAC |
TCT CTG TCC GGC τ 3'
lll lll lll lll
AGA GAC AGG CCG 5',
' ATG TTT CCA GCC ATG GCT CTA
lll lll III lll lll lll lll
’ TAC AAA GGT CGG TAC CGA GAT
TCT
I I I
AGA
GGT
I I I
CCA
-R-R
3’
5 *,
• ATG TTC CCA
lll III lll
’ TAC AAG GGT
GCT ATG TCT CTA
lll lll lll lll
CGA TAC AGA GAT
TCT
I I I
AGA
GGT
lll,
CCA
R-R
3'
5',
' ATG GAT TTT CCG GCT ATG TCT
II! Ilf lll lll lll I I t lll
' TAC CTA AAA GGC CGA TAC AGA
CTG TCC
lll lll
GAC AGG
’ ATG TTT r ι ι iii
’ TAC AAA
GGC
I I I ,
CCG
CCA
I I I
GGT
| R-R' | 3 ’ 1 4 5’ | t | |
| GCT | ATG | TCT | CTA |
| 1 I I | 1 I 1 | 1 1 1 | 1 I 1 |
| CGA | TAC | AGA | GAT |
TCT
I I I
AGA
GGT
lll.
CCA
R-R
3’
5’
Η
-8-
| 5’ | ATG | GTT | TTT | CCG GCT > « 1 1 f | ATG ! 1 1 | TCT t 1 t |
| 3’ | 1 1 1 TAC | 1 « t CAA | « ι i AAA | ♦ 11 ii· GGC CGA | TAC | AGA |
| CTG | TCC | GGC | 3’ | |||
| 1 1 1 | I » « | i » «. | R-R | c « | ||
| GAC | AGG | CCG | 3 | |||
| 5' | ATG | GCT | TTT | CCG GCT til 111 | ATG 1 I 1 | TCT ι , ι |
| 3’ | t 1 t TAC | » « « CGA | t t « AAA | Γ T < i » » GGC CGA | TAC | AGA |
| CTG | TCC | GTC | 3' | |||
| t » 1 GAC | 1 1 1 AGG | 1 » « CAG | -R-R | 5’ |
em que
A é deoxiadenilo
G é deoxiguanilo.
C é deoxicitidilo
T é timidilo
R é uma sequência de DNA que codifica os aminoácidos 9 (leucina) a 191 (fenilalanina) da hormona de crescimento bovina e
R é uma sequência de DNA que codifica um sinal de paragem da tradução o qual é
| 5’ | TAA | 3' | 5' | TAG |
| 3’ | 1 1 I ATT | 5', | 3’ | ! 1 1 ATC |
| 5' 3' | TGA » 1 » ACT | 3’ 5' |
0 invento relaciona-se ainda
com novos transformantes dos vectores acima referidos, compostos, grânulos e métodos de utilização.
0 presente invento pode ser
construído por ligação independente das seguintes sequ^n-
a) 5’ CTAGAGGGTATTAATA ATG AAA GGG AAT TCT ATG
I I I I I I I I f > I I lll lll lll lll lll lll
TCCCATAATTAT TAC TTT CCC TTA AGA TAC
GCC TTC CCA GCC ATG TCC -TTG TCC GGC CTG
lll lll lll lll lll lll I I I lll lll lll
CGG AAG GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAC
TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'
lll lll lll lll I
AAA CGG TTG CGA C 5’,
b) 5’ CTAGAGGGTATTAATA ATG TTT CCA GCC ATG GCT
I I I I I I I I i I I I lll t I I lll lll lll lll
3’ TCCCATAATTAT TAC AAA GGT CGG TAC CGA
CTA TCT GGT CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'
lll lll lll lll lll lll lll lll I
GAT AGA CCA GAC AAA CGG TTG CGA C 5’
c) 5’ CTAGAGGGTATTAATA ATG TTT CCA GCT ATG TCT
I I I I I I I I I I I I lll lll lll lll III lll
3’ TCCCATAATTAT TAC AAA GGT CGA TAC AGA
CTA TCT GGT CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’
lll lll I I I I I I lll lll lll lll I
GAT AGA CCA GAC AAA CGG TTG CGA C 5',
aos fragmentos BamHi-Xbal ^10,2 kb e BamHI-HgiAI a/0,6 kb do plasmídeo pCl2101. Os plasmídeos resultantes, designados respectivamente por plasmídeos pC21920, pJR1 e pHI2, contêm 1) a sequência activadora da transcrição e tradução do gene da lipoproteina de E. coli (Nakamura and Inouye, 1979 Cell 18:1109) na fase de leitura de uma sequência codificadora de um derivado bioactivo da hormona de crescimento bovina;
2) um sinal de paragem da tradução adequadamente colocado;
e 3) um replicão "que se escapa". As células transformadas
pelos plasmídeos pCZ1420, pJR1 e pAT2 expressam respectivamente MET-LIS-GLI-ASPN-SER-MET-ALA-bGH-MET-FEN-PRO-ALA-MET
-10-
-ALA-R2 e ΜΕΤ-bGH em que
MET é metionina
LIS é lisina
GLI é glicina
ASPN é asparagina
SER é serina
ALA é alanina
FEN é fenilalanina
PRO é prolina
bGH é a sequência de aminoácidos natural da hormona de crescimento bovina começando com a fenilalanina (primeira) da terminação N.
2
R é a sequência de aminoácidos natural da hormona de crescimento bovina começando com o sexto aminoácido (leucinas) da terminação N.
Na Figura 9 dos desenhos juntos está apresentado um mapa dos locais de restrição de cada um dos plasmídeos pCZ1920 e pJR1.
Outros plasmídeos que também estejam dentro do âmbito do presente invento podem ser construídos por ligação independente das seguintes sequências de DNA adaptador
a) 5’ CGACC ATG GAT GAT AAG TTT CCG GCT ATG TCT
3 ’ ’ ’ ’ ’ ’ I I I » I I I III III III III III III
TGG TAC CTA CTA TTC AAA GGC CGA TAC AGA
CTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'
III III III III III III III lil |
GAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C 5’
c)
e)
f)
g)
b)
| 5’ | CGACA | ATG | TTC | CCA | GCT | ATG | TCT | CTA | TCT | GGT |
| 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 I | I 1 1 | 1 1 1 | 1 I 1 | r ι ι | 1 1 1 | |
| 3’ | TGT | TAC | AAG | GGT | CGA | TAC | AGA | GAT | AGA | CCA |
CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT
lll I I t lll lll lll I
GAC AAA CGG TTG CGA C
d)
| 5’ | CGACC | ATG | GAT | TTT | CCG | GCT | ATG | TCT | CTG | TCC |
| 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 1 f | 1 1 1 | I 1 1 | 1 1 1 | 1 1 1 | t ! Ϊ | 1 1 I | |
| 3' | TGG | TAC | CTA | AAA | GGC | CGA | TAC | AGA | GAC | AGG |
| GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT | 3 | 1 | ||||||||
| f f f II | 1 1 f | t t r ι | II II | f f | 1 1 I | |||||
| CCG GAC AAA CGG TTG CGA C | 5 | 1 / | ||||||||
| 5’ | CGATC | ATG | GAT | TTT | CCG | GCT | ATG | TCT | CTG | TCC |
| I 1 1 | 1 1 1 | I I 1 | 1 1 1 | I 1 I | 1 1 I | 1 1 1 | 1 1 1 | 1 I 1 | 1 1 1 | |
| TAG | TAC | CTA | AAA | GGC | CGA | TAC | AGA | GAC | AGG |
GGC r ι ι CCG
CTG ι r ι GAC
TTT
I I I AAA
GCC
I I I
CGG
AAC
I I I
TTG
GCT GTGCT
lll I CGA C
3 ' 5’,
5’
3'
5’
3'
5’
3'
CGACC
1 I I
TGG
TCT
I I I
AGA
AAC
I I I
ATG
I I I
TAC
GTT
I 1 I
CAA
TTT ι ι ι AAA
CCG
I I I
GGC
GCT
I I I
CGA
ATG
I I I
TAC
CTG
I I I
GAC
TCC
I I I
AGG
GGC
I I I
CCG
CTG
I I I
GAC
TTT
I I I
AAA
GCC
I I I
CGG
GCT
I I I
TTG CGA C
CGACC
I I I
TGG
TCT
I I I
AGA
AAC
I I I
GTGCT
ι
ATG
I I I TAC
CTG
I I I
GAC
GCT
I I I
GCT
I I I
CGA
TTT
I I I AAA
CCG
I I I
GGC
GCT
I I I
CGA
ATG
I I I
TAC
TCC
I ! I
AGG
GTC
I I I
CAG
CTG
I I I
GAC
TTT
I I I
AAA
GCC
I I I
CGG
TTG CGA C
GTGCT
I
CGATA
I I I
TAT
ATG
I I I
TAC
GAT
I I I
CTA
TTT
I 1 I AAA
CCG
I I I
GGC
GCT
I I I
CGA
ATG
I I I
TAC
TCT
I ! I
AGA
CTG
I I I
GAC
TCC GGC CTG TTT GCC
lll lll lll lll lll
AGG CCG GAC AAA CGG
AAC
I I I
TTG
GCT
I I I
CGA
GTGCT
ι
c
3’
5’
em que
A é deoxiadertlo,
G é deoxiguanilo
C é deoxicitidilo e
T é tinidilo
aos fragmentos EcoRI-BamHI 10kb e BamHI-HgiAI 0,6 kb do plasmideo pCZ101 e ao fragmento EcoRI-Cla I 0,29 kb do plasmideo pNM608. Os plasmídeos resultantes designados respectivamente por pCZ2112, pAT1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 e pCZ156, contêm 1) a sequência activadora da transcrição e tradução dogene do triptofano de E^. col i (Hallewell e Emtage, 1980, Gene 9:27) na fase de leitura de uma sequência codificadora de um derivado bioactivo da hormona de crescimento bovina, 2) um sinal de paragem da tradução adequadamente colocado; e 3) um replicão "que se escapa". As células transformadas pelos plasmídeos PCZ112, pAT1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 e pCZ156 expres sam respectivamente MET-ASP-ASP-LIS-bGH-, ΜΕΤ-bGH, MET-ASP-bGH, MET-ASP-BGH, MET-VAL-bGH, MET-ALA-FEN-PRO-ALA-MET-SER-LEU-SER-VAL-b*GH e MET-ASP-bGH, em que
MET é metionina,
ASP é ácido aspártico,
LEU é leucina,
SER é serina,
PRO é prolina,
FEN é fenilalanina,
LIS é lisina
VAL é valina
ALA é alanina
b1GH é a sequência de aminoácidos natural da hormona de crescimento bovina começando com o aminoácido 9, leucina, e
bGH é a sequência de aminoácidos natural da hormona de
-13-
crescimento bovina começando com a fenilalanina (primeira) da terminação N. Na Figura 10 dos desenhos juntos está apresentado um mapa dos locais de restrição do plasmídeo ilustrativo pCZ112.
0 material de partida, o plasmideo pCZ101, temK/10,8 kb e é construido por ligação do fragmento Xbal-BamHI td 0,6 kb do plasmídeo pNM 789B ao plasmídeo pIM-I 1-A3 digerido de modo idêntico. Este último plasmídeo, que contem a sequência activadora da trenscrição
I e da tradução do gene da lipoprotefna de E. coli assim como
um replicão "que se escapa" pode ser obtido a partir de £. coli K12 RV308/pIM-11-A3, uma estirpe depositada e fazeii do parte da colecção de culturas estoque permanentes do Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois.
A estirpe está disponível como fonte preferida e reservatório estoque do plasmídeo com o numero de acesso NRRL B-15733. 0 material de partida plasmídeo pNM789B deriva do plasmídeo pKEN111 de acordo com os passos ilustrados e descritos nas Figuras 1-8 e Exemplo 1 abaixo. 0 plasmicêo pKEN111 pode ser obtido a partir de E. coli K12 CC620/ /pKE111, uma estirpe depositada e fazendo parte da colecção
l· de culturas estoque permanentes do Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois. A estirpe está disponível como fonte preferida e reservatório estripe do plasmideo com o número de acesso NRRL B-15011. 0 plasmídeo pNM789B também contem a sequência activadora da transcrição
( e tradução do gene da lipoproteina de E.coli e ainda a
sequência codificadora, incluindo um sinal de paragem da tradução adequadamente colocado, de uma proteína de fusão compreendendo bGH e um polipeptideo de nove elementos na terminação N de bGA.. A ligação da sequência codificadora da proteína de fusão, contida no fragmento Xbal-BamHI, ao plasmídeo pIM-I1-A3 adequadamente cortado resulta no referido material de partida, o plasmídeo pCZ101.
0 material de partida plasmideo pNM608 tem<N4,6 kb e é construído por ligação do fragmento EcoRI-Clal do plasmídeo ρΗΙ7·^4 Δΐ ao plasmídeo pBR322 digerido com EcoRI-Clal 0 plasmídeo ΡΗΙ7Δ4Δ1 pode ser construído de acordo com os ensinamentos do Exemplo 5 abaixo. Devido aos múltiplos locais de restrição TC<gI no plasmídeo ρΗΙ7Δ4^1, o fragmento EcoRI-TagI pretendido pode ser obtido por subclonagem dos fragmentos EcoRI-Hpal e Hpal-TagI de ρΗΙ7Δ4Δΐ. 0 plasmídeo pNM608 contem a sequência activadora da transcrição do triptofano de E.coli e é portanto útil na construção do presente invento.
Os familiarizados com a matéria reconhecerão que os vários DNAs adaptadores descritos atrás são componentes importantes do presente invento. Estas sequências podem ser sintetizadas convencionalmente pelo método fosfotriéster modificado usando blocos de dideoxirritonucleotideos totalmente protegidos. Tais métodos de sintese são bem conhecidos na especialidade e poder ser efectuados básicamente segundo o processo de Italeura et al, 1977, Science 198:1056 e Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75:5765. Em adição, um método especialmente preferido está divulgado em Hsiung et al., 1983, Nucleic Acid Research 4:3227 e Narang et al., 1980 Methods in Enzymology 68:90.
Os adaptadores codificam uma sequência activadora da tradução e também aminoácidos correspondendo â primeira parte (região da terminação N) dos referidos compostos derivados de bGH. A restante sequência codificadora de bGH (incluindo um sinal de paragem da tradução adequadamente situado) e também uma sequência activaadora da transcrição podem ser providenciados pela ligação do fragmento adequado do plasmideo pCZ101. Tais ligações resultam nos plasmídeos ilustrativos do presente invento para expressão de derivados da hormona de crescimento bovino.
A remoção do fragmento de restrição BstEII*7900 pb do plasmídeo pCZ210 resulta no plasmídeo pCZ103. A delecção de Bst11 não afecta a região codificadora de bGH no plasmídeo pCZ101. Usando o plasmídeo pCZ103 em vez do plasmídeo pCZ101 nas construções acima descritas resulta assim em plasmídeos semelhantes mas com menos 900 pb. Os derivados de bGH expressos por estes plasmídeos deriv£ dos do pCZ103 são portanto idênticos aos derivados expressos pelas suas contrapartes derivadas do pCZIOl.
Deste modo, usando os fragmentos de restrição BamHI-Xbaltu 9,3 kb e BamHI-HgiAI <V 0,6 kb do plasmídeo pCZ103, em vez dos fragmentos de restrição BamHI-Xbal aJ 10,2 kb e BamHI-HgiAlrv 0,6 kb do plasmídeo pCZ101, nas construções acima descritas para os plasmídeos pJR1 e pAT2 resulta na construção dos plasmídeos derivados respectivamente pJR1.3 e pAT2.3. Usando os fragmentos de restrição BamHI-EcoRItJ 9,3 kb e BamHI-HgiAI 0,6 kb do plasmídeo pCZ103 em lugar dos fragmentos de restrição BamHI-EcoRI 10,2 kb e BamHI-HgiAI<u 0,6 kb do plasmídeo pCZ101, nas con£ truções acima descritas dos plasmídeos pAT1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 e pCZ156 resulta na construção dos plasmídeos derivados pAT1.3, pASP2.3, pCZ154.3, pCZ155.3 e pCZ156.3, respectivamente.
0 presente invento não está de modo algum limitado â utilização de uma sequência activadora da transcrição particular uma vez que a escolha de uma sequência especifica não ê critica para a operacional idade do pressnte invento. Sequências activadoras da transcrição que possam substituir as seqjências activadoras da lipoproteina e do triptofano atrás exemplificados incluem mas não estão limitadas às sequências activadoras da transcrição da lactose (lac) de E. coli, PL0L do bacteriófago Λ e PR0R do bacteriófago K . Em adição podem ser usadas em tandem uma ou mais sequências activadoras da transcrição ou parte
delas, como seja por exemplo as sequências activadoras da transcrição de trp e lac ou tac. Todas as sequências atrás mencionadas foram anteriormente caracterizadas e podem ser construídas tanto sintéticamente como a partir de plasmideos conhecidos.
Nas execuções especificas aqui descritas, a replicação do plasmídeo é determinada por um replicão "que se escapa" termoinduzível divulgado em Publicação da Patente GB Número 1557 774 e Uhlin et al., 1979 Gene 6:91. A temperaturas abaixo de 30aC, especialmente 25SC, o replicão mantém um número de cópias relativamente baixo de cerca de 10-15 cópias por célula. Quando a temperatura é elevada para 37SC perde-se o controle do número de cópias e os plasmideos contendo o replicão amplificam-se para 1000-2000 cópias por célula. 0 replicão "que se escapa" particular exemplificado neste caso está contido no material de partida plasmídeo pIM-I'-A3 já descrito. Os que estão fami1iraziados com a matéria compreenderão que o presente invento não está limitado à utilização de qualquer replicão "que se escapa" ou restante no número de cópias particular. Outros replicões "que se escapa" ou de elevado número de cópias induziveis podem ser obtidos por selecção apropriada ou podem ser construídos de acordo com o processo divulgado na Publicação Internacional Número W082/02901. Tais replicões podem ser usados para construir vectores de expressão que também estão dentro do âmbito do presente invento.
A clonagem de genes estranhos em vectores contendo um replicão "que se escapa" resulta, quajn do da indução e perda do controle do número de cópias, numa taxa de síntese proteica grandemente aumentada e formação concomitante de uma espécie desconhecida ou irreconhecível de grânulo proteico intracelular. Tais grânulos que estão englobados no presente inverto, são altamente homogéneos, na sua composição proteica sendo assim distintos dos agregados
nÕHTUGA’
>· - '' -Ή
e inclusões de alto peso molecular conhecidos que por vezes surgem em células hospedeiras contendo DNA recombinante. Estas últimas inclusões são heterogéneas, normalmente contendo uma série de componentes celulares, como sejam ácidos nucleicos, açucares, lipidos e peptideos e constituem apenas 10-20% de um produto proteico particular. Os grânulos do presente invento são altamente homogéneos com o produto proteico pretendido constituindo pelo menos 50% e muitas vezes excedendo 80% do grânulo.
Estas novas espécies de grânulos podem ser fácilmente isolada a partir de Iisadoscfe células e é estável em lavagens com baixas concentrações de ureia ou detergentes. A lavagem remove proteínas que se ligam inespecificamente ao grânulo. 0 isolamento, que origina material de elevada especificidade, constitue um primeiro passo útil na purificação de proteínas estranhas. Todos os passos subsequentes da purificação estão portanto simplificados. E particularmente útil o facto de os componentes da parede celular poderem ser fácilmente separadas dos grânulos .
Crê-se que a formação dos grânulos do presente invento sequestra uma proteína estranha de modo a não haver pertrubação do metabolismo celular normal e morte prematura da célula. Algumas proteínas como seja a proinsulina humana, são rápoidamente degradadas em E.coli e não se acumulam. No entanto, quando tais proteínas são codificadas por vectores contendo um replicão "que se escapa" a proteína proinsulina forma grânulos insolúveis que protegem a proteína, de outro modo instável da degradação proteoliticos. A formação da presente espécie de grânulo é assim útil não apenas para a acumulação de proteínas instáveis como também para a simplificação dos processos de isolamento e purificação dos produtos genéticos.
-180 presente invento compreende
método para produção de uma espécie de grânulo
estranho intracelular e altamente homogéneo, o
método caracterizando-se por:
ainda um proteico referido
1) transformação de uma célula competente com um vector de expressão de DNA recombinante de replicação autónoma e seleccionável o qual inclui:
a) um replicão "que se escapa" e
b) uma sequência activadora da transcrição e tra-9 dução que está na fase de leitura de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo funcional, a sequência codificadora do referido polipeptídeo funcional contendo um sinal de par^ gem da tradução situado imediatamente adjacente
e a jusante do tripleto de nucleotídeos que codi_ fica a terminação carboxilo do referido polipeptídeo funcional e
2) cultura da célula transformada em condições de crescimeq to adequadas â expressão genética e activação ou indução do referido replicão "que se escapa".
-19-
Quaisquer replicão "que se escapa" e sequência activadora da transcrição e tradução, como anteriormente aqui foi descrito, e virtualmente qualquer sequência de nucleotídeos que codifique um polipetideo funcional ou produto de genes fundidos podem ser usados para construir vectores a serem usados no método definido. Tais sequências codificadoras incluem mas não estão limitadas a sequências que codifiquem hormona de crescimento bovino (bGH), hormona de crescimento humana (bGH), pré-hormona de crescimento humana (pre-hGH), hormona de crescimento porcina (pGH), hormona de crescimento de mamíferos, hormona de crescimento aviária, factor de libertação da hormona de crescimento, cadeia A da insulina humana, cadeia B da insulina humana, proinsulina humana, pré-insulina humana, inter ferão humano e não-hurano, urocinase, activador do plasminogénio de tecido, interleuquina II, qualquer hormona polipeptidica, qualquer enzima polipeptidica e qualquer polipeptideo bioactivo de valor comercial ou para investigação.
As células transformadas que, quando cultivadas de acordo com o método acima definido, exemplificam a produção da presente espécie de grânulo incluem mas não estão limitadas a L· coli K12 RV308/pCZ1920,
E. coli k12 RV308/pJR1, E. coli K12 RV308/pASP1, E. coli k12 RV308/pCZ112, E. coli k12 RV308/pASP2, E. coli k12 RV308/pAT1, E. coli k12 RV308/pAT2, E. coli k12 RV308/pCZ215^ E. coli k12 RV308/pCZ156, E. coli k12 RV308/pJR1.3, E. coli k12 RV308/pASP1.3, E. coli k12 RV308/pASP 2.3, E. coli k12 RV308/pAT1.3, E. coli k12 RV308/pAT2.3, E. coli k12 RV308/ /PCZ154.3 e E. coli k12 RV308/pCZ156.3.
0 presente método para produção de uma especie de grânulo altamente homogéneo não está limitado â utilização dos plasmídeos já referidos codificadores da hormona de crescimento bovina ou humana. Podem também asr produzidos grânulos de proinsulina humana por cultura
das células, de acordo com o método atrás referido, que contenham vectores possuindo a sequência codificadora da proinsulina humana. Tal vector pode ser construído por ligação do fragmento Eco-RI-BamHI contendo a sequência de fusão trp LE1-proinsulina, como descrito na Figura 15, ao fragmen to maior EcoRI-BamHI de plasmideo pCZ1O1. 0 plasmideo resultante, designado por plasmideo pCZ201, pode transformar E:. col i como seja _E. col i k12 RV308, segundo métodos de transformação convencionais. Os presentes grânulos, que neste caso contêm proinsulina humana, podem então ser produzidos por cultura a 37eC dos transformantes E.coli k12 RV308/pCZ201.
0 plasmideo resultante, designado por plasnideo pCz201, pode transformar E. coli como seja E. coli k12 RV308 segundo métodos de transformação convencionais. Os presentes grânulos que neste caso contêm proinsu lina humana, podem então ser produzidos por cultura a 37-C dos transformantes E. coli k12 RV308/pCZ201.
São possíveis muitas modificações e variações das presentes sequências de DNA e plasmídeos ilustrativos. Por exemplo, a degeneração do código genético permite a substituição de nucleotídeos ao longo das regiões codificadoras dos polipeptídeos assim como a substituição do sinal de paragem da tradução TAA especificamente exemI I I
ATT
plificado pelos sinais de paragem da tradução TAG ou TGA.
I I I I I I
ACT ACT
Assim R, como aqui foi definido pode ser uma de qualquer número de sequências possíveis de DNA que codifique os aminoácidos 9 (leucina) a 191 (fenilalanina) de bGH. Tais sequências podem ser deduzidas a partir da sequência de aminoácidos conhecida de bGH e podem ser construídas seguindo processos de síntese convencionais. No
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entanto, os tripletos de nucleotídeos deverão ser escolhidos de acordo com princípios e extrapolações conhecidos revistos em Zuker e Stiegler, 1981, Nucleic Acids Research 9 (1):133 para evitar a criação de bases complementares no mRNA. As ligações de hidrogénio (emparelhamento) entre tais bases com plementares resulta em configurações pedunculadas e em ansã e enrolamentos que reduzem a eficiência da tradução. Os familiares com a matéria compreenderão que todas as modificações e variações atrás divulgadas podem ser convencionalmente sintetizadas essencialmente de acordo com os métodos de sintese já citados. Portanto, o presente invento não está de modo algum limitado às sequências de DNA e plasmídeos exemplificados
Os vectores de expressão e método deste invento podem ser aplicados a uma vasta gama de organi_s mos hospedeiros, por exemplo, organismos procarióticos gram-negativos como seja Escherichia coli, .E. coli k12, E^ coli k12 RV308, E. coli k12 HB1O1, E. coli k12 C600, E. coli k12 C600 Rk-Mk, E^. coli k12 RR1, coli k12 MM294 e similares.
Se bem que todas as execuções do presente invento sejam úteis, alguns dos vectores e transformantes são preferidos. Vectores preferidos incluem PCZ1920, pJR1, pJR1.3, pCZ112, pAT1 , pAT1.3, pAT2, pAT2.3, PASP1, pASP1.3, pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, pCZ156.3, pASP2.3 e pASP2 e transformantes preferidos incluem EN coli k12 RV308/pCZ1920, E. coli k12 RV308/pJR1, E. coli k12 RV308/ /PCZ1920, E. coli k12 RV308/pJR1 , E. coli k12 RV308/pJR1.3,
E. coli k12 RV308/pCZ112, E. coli k12 RV308/pAT1, E. coli k12 RV308/pAT1.3, E. coli k12 RV308/pAT2, E. coli k12 RV308/pAT2.3, E. coli k12 RV308/pASP1, E. coli K12 RV308/pASP 1.3, E. coli k12 RV308/pCZ154, E. coli k12 RV308/pCZ154.3,
E. coli k12 RV 308/pCZ156, E. coli k12 RV308/pCZ156.3, E.
coli k12 RV308/pASP2.3 e E. coli k12 RV308/pASP2.
Deste grupo de preferências, os plasmídeos pCZ112, pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, pCZ156.3, pASP2.3 e pASP2 e os transformantes JE. coli k12 RV308/pCZ112 E. coli k12 RV308/pCZ 154, E. odli k12 RV308/pCZ 154.3, E.coli k12 RV308/pCZ156, E. coli k12 RV308/pCZ156.3, E. coli k12 RV308/pASP2.3 e JE. coli k12 RV308/pASP2 são espeeialmente preferidos.
Os familiarizados com a matéria reconhecerão que os vectores de expressão deste invento são usados para transformar organismos hospedeiros adequados de modo a ser expresso um produto derivado da hormona de crescimento bovina usando condições de fermentação normalizadas. 0 produto, expresso sob a forma de grânulo altamente homogéneo e isolado por métodos de rotina a partir dos resultantes lisados celulares é útil para aumentar a produção de leite e para estimular de um modo geral o crescimento do gado. Modos de utilização, administração e dosagens adequadas para gado são conhecidos e divulgados na European Patent Publication 0085036, páginas 7-9 aqui incluído como referência. Os exemplos que se seguem ilustram o invento aqui divulgado. Sempre que apropriado são descritos os fundamentos e os próprios processos para a construção do invento.
EXEMPLO 1
Construção do Plasmídeo pNM789B
A. Construção do Plasmídeo pKEN021 e do seu Fragmento Xbal-BamHI
Usou-se como material de partida o fragmento5,1 kb produzido por corte do plasmídeo pKEN021 (106 na Figura 3) com Xbal-Bam HI. 0 plasmídeo pKEN021 é um derivado de pKEN111, (101 na Figura 1 e descrito em Le, et al_., 1981 J. Bait. 146:861-866 e Zwiebel etak, 1981, J. Bact. 145:654-656), o qualestá depositado em Ελ coli CC620 (Depósito NRRL N2 15011) e que possui um fragmento 2,8 kb o qual contém o gene da lipoproteina de E. coli. Uma descrição deste fragmento é fornecida por Nakamura e Inowye, 1979, Cell 18: 1109-1117. No pKEN021, a sequência de 650 pb (pares de bases) entre os locais únicos de restrição EcoRI e Sal I do pBR322 foi substituída por sequências retirada, do gene da lipoproteina de IE. coli. A sequência do gene da lipoproteina (Nakamura e Inowye, 1979) inclui um fragmento Alu I de 462 pb, a montante do primeiro Trípleto (metionina) que contém o promotor a região 5’ não traduzida e o local de ligação ao ribossoma. Um local único de restrição Xbal está situado dentro do local de ligação ao ribossoma 16 pb antes do sinal da metionina de inicio da tradução. Um local de restrição Pvu II situado 105 pb a montante do codão de terminação da tradução do gene estrutural foi alterado para um local de restrição Bam H2 através da adição de um DNA adaptador sintético (51CCGGATCCGG31, obtido da Collaborative Research). A sequência codificadora dos últimos trinta e cinco aminoácidos da lipoproteina o sinal de terminação da tradução e a seuqência correspondente â região 3‘ não traduzi do RNA mensageiro segue-se no local Bam HI. 0 plasmídeo pKEN021 também inclui cerca de 850 pb de sequências estranhas
ia
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não relacionadas com o gene da lipoproteina e situada a jusan te dele no cromossoma de ΕΞ. coli. Estas sequências foram incluídas como consequência dos métodos e locais para enzimas de restrição usados no isolamento original do gene.
Com referência âs Figuras 1, 2 e 3 o plasmideo pKEN021 deriva do pKEN111 do seguinte modo:
Cerca de 50 jug de pKEN 111 (101 ug Figura 1) são digeridos com 25 unidades da enzima de restrição Hpall em 300 jul de um tampão contendo Tris.HCl 20 mM, pH 7,4, MgClg 10 mM e p mercaproetanol 6mM a 37SC durante 2 horas. A mistura é extraj_ da duas vezes com 300 ,ul de uma mistura a 50:50 do fenol e clorofórmio e a 1ãse aquosa recuperada é então precipitada com 2,5 volumes de etanol e 0,1 volumes de acetato de sódio 3M.
O sedimento de DNA é dissolvido em 100 ,ul de tampão de electroforese e fraccionado num gel de 5 por cento de poliacrilamida (proporção de acrilamida:bis é 29:1 em todos osgéis excepto quando algo em contrãario for dito). 0 gel é corado numa solução contendo 0,5 ,ug/ml de brometo de etídio e as bandas são visualmente com luz ultravioleta de grande comprimento de onda. Uma banda de 950 pb é isolada e recuperada do gel por electroeluição num saco de diâlise. Após extracção com fenol /CHClg e precipitação com etanol, o DNA recuperado (aproximadamente 2,5 ,ug) é dissolvido em 25 jul de TEN (NaCL 10 mM, Tris.HCl 10 mM pH 7,4 e etilenodinitrilotetraacetato de sódio (EDTA) lmM, pH 8).
Cerca de 2 ,ug do fragmento Hpall de 950 pb são digeridos com a enzima de restrição Alu I em 200 yl de um tampão contendo NaCL 50 mM, Tris.HCl 6 mM e p-mercaptoetanol 6 mM durante 2 horas a 379C. 0 DNA é fraccio nado num gel de 6 por cento de poliacrilamida e o fragmento produzido Alu I de 462 pb é recuperado e purificado pelo método anteriormente descrito. 0 fragmento Alu I de 462 pb (cerca de 1 ,ug) é dissolvido em 10 ju 1 de tampão ligase do
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DNA de T4 (Tris.HCl 66 mM pH7,6 MgCl2 10 mM, ditiotreitoí 10 mM ATP 0,4 mM) contendo 150 picomoles do adapatdor EcoRI (51 GGAATTCC3’) da ColIaborative Research fosforilado e 2 unidades de ligase do DNA de T4. Após circulação a 4® C, du rante 16 horas a mistura é aquecida a 65® C durante 10 minutos e diluida para 100 ,ul com a adição de tampão EcoRI (Tris.HCL 100 mM pH 7,2, NaCl 50 mM, MgCl2 10 mM, β-mercaptoetanol 6 mM6 e 40 unidades da enzima Eco RI. Após 2 horas a 37®C a amostra é extraida convencionalmente com fenol/CHClg e precipitada com etanol. 0 DNA é então dissolvido em 20 ,ul de tampão ligase do dNA de T4 contendo 0,1 unidade de ligase do DNA de T4 e 0,1 ,ug de pBR 322 ( 102 na Figura 1) o qual foi linearizado com Eco RI e depois tratado com fosfatase alcalina. Após ligação a 4®C durante 16 horas, o DNA resultante é usado para transformar convencionalmente coli estirpe k12 HB101. Os transformantes são seleccionados em placas de agar contendo 12 jug/ml de tetraciclina e cs plasmídeos isolados a partir de colónias resistentes pelo processo de extracção alcalina rápida descrito em Birnboim e Doly, 1979, Nucleic Acids Research 7:15131523. Um plasmídeo (103 na Figura 1) contendo um fragmento Xbal-BamHI de 466 pb é seleccionado e usado como material de partida para o passo que a seguir se descreve.
Cerca de dois ,ug deste plasmídeo (103 na Figura 2) são digeridos com 2 midades da enzima HindIII em 50 ,ul de tampão HindIII (NaC160 mM, Tris:HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM e p~mercaptoetanol 6 mM) durante 1 hora a 37®C. Após extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol o DNA é dissolvido em 200 jjI de um tampão contendo NaCl 300 mM, acetato de sódio 30 mM, pH 4,25, Zn Cl2 1 mM e 200 unidades de nuclease S1 (Miles Laboratories).
Após 1 hora a 15®C, a reacção é parada por extracção com fenol/CHCl3 e precipitação com etanol. 0 DNA resultante é dissolvido em 10 yl de tampão ligase do DNA de T4 contendo 20 picomoles de adaptadores BamHI (5' CCGGATCCGG 3', da
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Collaborative Research) fosforilados e 2 unidades de ligase do DNA de T4. Após 16 horas a 49C, a mistura de reacção é aquecida a 659C durante 10 minutos para inactivar a ligase e depois diluida para 100 jul em tampão Bam HI (NaCl 150 mM Tris.HCl 20 mM, pH 8,0, MgCl2 10 mM, JJ-mercaptoefanol 6 mM) contendo 20 unidades da enzima Bam HI . Após 2 horas a 37-C, a mistura é purificada num gel de 1 por cento de agarose. 0 gel é corado e o fragmento maior (»J4,5 kb) é recuperado por eluição após congelação e depois purificado por extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol.
0 fragmento recuperado com extremidades coesivas Bam HI é dissolvido em 20 jul de tampão ligase do DNA de T4 contendo 0,1 unidade de ligase do DNA de T4. Após 16 horas a 49C, o DNA é usado para transformar E. coli HB101. Os transformantes são seleccionados por resistência â ampicilina (Apr) a 100 jug/ml e testados relativamente à sensibilidade a 10 ug/ /ml de tetraciclina (Tcs). Vários plasmídeos, preparados pelo método de Birnboim atrás descrito a partir de colónias
v» C
que são Ap Tc , são examinados quanto à ausência de um local Hind III e â presença de um único local Bam HI. Digestão sequenciada com EcoRI, Sal I dá um fragmento de 466 pb e um fragmento de 305 pb. Um plasmideo (104 na Figura 2) com estas características é seleccionado e depois modificado para converter o local EcoRI, situado a montante do promotor de 1pp num local de restrição HindIII.
Dois microgramas de plasmideo (104 na Figura 2) são digeridos em 100 4 de tampão EcoRI com 0,2 unidades de EcoRI durante 10 minutos a 379C. A reacção é parada por extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol. 0 DNA resultante é ressuspenso em 10 jjl de tampão ligase do DNA de T4 contendo 20 picomoles do adaptador HindIII (51CCAAGCTTGG31, da Collaborative Research) fosforilado e 2 unidades de ligase do DNA de T4. Após 16 horas a 49C, a mistura é aquecida durante 10 minutos a 659C diluida para 150 jjI em tampão HindIII contendo 10 unidades
da enzima HindJIϊncubada durante 2 horas a 379C e depois fraccionada num gel de 1 por cento de agarose. A banda maior (equivalente a um plasmídeo com um único corte) é recuperado e purificado convencionalmente, dissolvido em 20 ju 1 de tampão ligase de T4 contendo 0,2 unidades de ligase de T4, incubado durante 16 horas a 49C e depois usado para y transformar E.coli HB101. Os transformantes são seleccionados relativamente à resistência à ampicilina e os plasmídeos isolados analisados convencionalmente por análise com enzimas de restrição. Um plasmídeo (105 na Figura 2) com um fragmento EcoRI -HindIII de 500 pb é seleccionado e usado como vector de clonagem para a adição da região 3' do gene lpb.
Cerca de dois fig de plasmídeo
(105 na Figura 3) são digeridos em 50 ,ul de tampão de restrição Sall (NaCl 150 mM, Tris.HCI 6 mM, pH 7,9, MgCl2 6mM, B-mercaptoetanol 6mM) com 2 unidades de Sal I durante 1 hora a 379C e depois diluida para 150 ju 1 em tampão BamHI contendo 2 unidades de BamHI. Após 1 hora a 379C, adiciona-se 2,5 unidades de fosfatase alcalina e continua-se com incubação durante 1 hora a 659C. 0 material ê extraido com fenol/CHClg, precipitado com etanol, dissolvido em TEN e usado como vector de clonagem para o fragmento 3' de lpb.
Para obter o fragmento contendo a região 3' de lpb, 10 ,ug de pKEN111 (101 na Figura 3) são digeridos em 200 lul de tampão Hpa I (KC1 20 mM, Tris.HCI 10 mM, pH 7,4 MgCl2 10 mM e p-mercaptoetanol 6 mM) com 10 unidades de Hpa I durante 2 horas a 379C. Após extracção com fenol/CHCl3 e precipitação com etanol, o DNA é dissolvido em 10 jli 1 de tampão ligase do DNA de T4, contendo 20 picomoles de adaptador Sal I (5'GGTCGACC 3', da Collaborative Research) fosforilado e 2 unidades de ligase do DNA de T4 e em seguida incubado durante 16 horas a 49C. A ligase é inactivado por aquecimento a 659C durante 10 minutos. 0 material resultante é diluido para 100 ju 1 em tampão Sal I contendo 10 unidades de Sal I e incubado 1 hora a 379C e
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depois diluido para 300 yl em tampão Pvu III (NaCl 60 mM, Tris.HCl 6 mM, pH 7,5, MgCl2 6 mM, B-mercaptoetanol 6 mM) contendo 10 unidades de enzima de restrição Pvu II. Após 1 hora a 379C o DNA é fraccionado num gel de 5 por cento de pol iacrialamida. Aproximadamente 0,5 jjg de um fragmento de 950 pb foi recuperado, purificado e dissolvido em TEN. Dois décimos do micrograma do fragmento é diluido em 20 ju 1 de tampão ligase do DNA de T4 contendo 20 picomoles do adapatdor Bam Hl (51CCGGATCCGG- 3', da Col1aborative Research) fosforilado e 2 unidades de ligase do DNA de T4 e depois incubado durante 16 horas a 4SC. 0 DNA resultante é então aquecido durante 10 minutos a 655C, diluido para 100 4 em tampão Bam Hl contendo 20 unidades de Bam Hl , incubado a 379C durante 2 horas e depois fraccionado num gel de 5 por cento de poliacrialmida para remover o excesso de moléculas de adaptador. 0 fragmento resultante de 950 pb tendo extremidades coesivas Bam Hl e Sal I é purificado convencionalmente e dissolvido em 20 ,ul de tampão ligase do DNA de T4 contendo 0,2 /jg do vector de clonagem descrito anteriormente e 0,2 unidades de ligase do DNA de T4. Após incubação durante 16 horas a 49C., o DNA é usado para transformar E,. coli k12 HB101. Os plasmideos são preparados a partir de transformantes resistentes â ampicilina e convencionalmente analisados relativamente ao fragmento Sal I -Bam Hl. 0 plasmídeo desejado (5,2 kb) é designado por pKEN 021 (106 na Figura
3).
Dez microgramas de pKEN021 foram digeridos a 379C em 200 41I de tampão Xbal/Bam Hl (NaCl 150 mM, Tris.HCl 10 mM, pH 8, MgCl2, p-mercaptoetanol 6 mM) usando 10 unidades de BamHI durante 1 hora seguido de 10 unidades de Xbal durante mais uma hora a 379C. 0 DNA pretendido digerido com Xbal-BamHI foi então tratado com 2,5 unidades de fosfatase alcalina durante 1,5 horas a 659C, extraido com fenol/CHCl3, colhido por precipitação com etanol e dissolvido em 50 yl de TEN até ser usado (107 na
Figura 3).
B. Construção do Plasmídeo pNM575
0 plasmídeo ptrp ED50 ch GH 800 (108 na Figura 4), descrito em Martial et al., 1979, Science 205:602-607 foi usado como fonte de um fragmento de DNA contendo a sequência codificadora de uma parte do gene da hormona de crescimento humana. Este fragmento também pode ser construido sintéticamente (Itakura et al., 1977 e Crea et al 1978) ou pode ser obtido usando metodoliogia bem conhecida descrita por Goodman et al, 1979, Methods in Enzymology 68: :75-90, por isolamento de mRNA codificador da hormona de crescimento humana a partir de pituitárias humanas. A porção do gene da hormona de crescimento humana do plasmídeo ptrpED50 ch GH 800 contém um único local de restrição Sma I 6 pb a jusante do codão de terminação da tradução do gene. Este local foi alterado para um local BamHI usando o seguinte processo: 6 ^ig do plasmídeo foram digeridos com 6 unidades de Sma I com 200 ju 1 de tampão de restrição Sma I (Tris.HCl 15 mM), pH 8,0, MgCl2 6 mM, KC1 15 mM e p-mercaptoetanol 6 mM) durante 1,5 horas a 37SC. Após completada a digestão fez-se extracçãó com fenol/CHClg e o DNA foi recuperado por precipitação cpm etanol e depois dissolvido em 24 ju 1 de TEN. Quarenta picomoles do fragmento adaptador BamHI fosforilado (Collaborative Research) foram adicionados a 0,5 jug (0,2 picomoles final) do plasmídeo acima digerido em 16 jjl de tampão ligase contendo 2 unidades de ligase do DNA de T4. A mistura foi incubada 2 horas a 22SC, 16 horas a 4SC e depois 10 minutos a 65SC. Extremida_ des coesivas BamHI foram produzidas por digestão convencional com a enzima BamHI. A enzima corta a sequência adaptadora assim como o local BamHI situado no inicio da sequência
de cDNA clonado da hormona de crescimento humano.
Isto originou um fragmento de 691 pb com extremidades coesivas BamHI que foi separado num gel de 6 por cento de poliacrilamida e depois recuperado convencionalmente. 0 fragmento de DNA recuperado foi ligado (usando 0,2 unidades de liga, se de DNA de T4 em 20 nl de tampão nas condições já descritas) com 0,2 ng de pBR 312 digerido com BamHI e tratado com fosfatase alcalina. (102 na Figura 4). Após 16 horas a 4SC o material foi usado para transformar E.. coli estirpe JA221 (NRR1N2 B-15014) essencialmente de acordo com o processo de transformação de Wensink et al., 1974, Cell 3*315-325. Os transformantes foram seleccionados em placas de agar contendo 100 jLig/ml de ampicilina e depois os plasmídeos foram convencionalmente isolados e identificados por análise com enzimas de restrição e electroforese em gel. Os plasmideos pretendidos, designados por pNM 575 (109 na Figura 4), contêm um fragmento Bam HI de aproximadamente 700 pb e foram convencionalmente amplificados para posterior utilização.
C. Construção do Plasmídeo pNM702
A sequência de DNA da hormona
de crescimento humana madura contem um local Fnu D II dista 47 pb do primeiro nucleotideo. Vinte cinco microgramas de pNM575 foram digeridos em 250 ,ul de tampão Bam HI com 25 unidades de Bam HI a 37SC durante 1 hora. 0 fragmento de 691 pb com extremidades coesivas Bam HI foi convencionalmen te isolado a partir de um gel de 6 por cento de policarilamida e purificado. Após purificação do fragmento, um terço dele (equivalente a 8 /jg de plasmídeo) foi digerido em 100 Λΐΐ de tampão Fnu DII (NaCl 6 mM, Tris.HCl 6 mM, pH 7,4 MgCl2 6 mM, β-mercaptoetanol 6 mM) com 2,5 unidades de Fnu DII durante 1,5 horas a 37SC. Usou-se electroforese em gel de 6 por cento de poliacrilamida e processos de recuperação normalizados para isolar um fragmento de DNA de 538 pb contendo a sequência codificadora do gene seguido de um sinal de
dos 175 últimos aminoácidos paragem da tradução.
Um fragmento de DNA de cadeia
dupla (110 na Figura 5) foi sintetizado pelo método fosfotriéster para ligar a região promotora de Ipb à região codificadora da hormona de crescimento humana. 0 fragmento de DNA de cadeia dupla (110 na Figura 5) tem a seguinte sequência:
5’ CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAA~ . ι ι ι ι ι ι I I I ! I I I I « I I I I I I I I I ! I I I I I I t I I I I I I » I I | | | | |
3' TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTTCCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG 3'
I II ι ι I ι I I I II I I I l l l I I I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I |
GGTAAGGGAATAGGTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC 5’
0 fragmento foi preparado pela metodologia fosfotriêster bem conhecida pela qual foram preparados os seguintes segmentos:
1) CTAGAGGGTAT
2) TAATAATGTTCC
3) CATTGGATGAT
4) GATGATAAGTTCC
5) CAACCATTCCC
6) TTATCCAGGC
7) TTTTTGACAACG
8) CTATGCTCCG
9) CATTATTAATACCCT
10) ATGGGAA
11) CTTATCATCATCATCCA
12) GGTTGGGAA
13) GGATAAGGGAAT
14) GTCAAAAAGCCT
15) CGGAGCATAGCGTT
32Usando os segmentos atrãs preparados efectuaram-se reacções de ligação catalisados pela ligase de T4 passo por passo como se descereve abaixo:
a) 0 segmento 1 não fosforilado em 5' foi ligado ao segmento
2 fosforilado em 5' na presença de segmento 9 fosftrilado em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA 1 (Brown et al., 1979 Methods in Enzymology 68:109-151). 0 duplex foi isolado por electroforese preparativa em gel de 15% de poli_ acrilamida.
b) 0 segmento 3 fosforilado em 5' foi ligado ao segmento 4 fosforilado em 5' na presença do segmento 11 fosforilado em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex DNA 2 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.
c) 0 segmento 5 fosforilado em 5* foi ligado ao segmento 6 fosforilado em 5' na presença dos fragmentos 12 e 13 fosfori_ lados em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA
3 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.
d) 0 segmento 7 fosforilado em 5' foi ligado ao segmento, 8
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foqforilado em 5' na presença do segmento 14 fosforilado em 5‘ e do segmento 15 não fosforilado em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA 4 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.
e) Os duplexes de DNA 2, 3 e 4 foram então ligados uns aos outros com ligase de T4 para formar o duplex de DNA 5 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.
f) 0 segmento 10 fosforilado em 5' e o duplex de DNA 5 foram adicionados, na presença de ligase de T4, ao duplex de DNA
1. 0 duplex de DNA resultante (110 na Figura 5) foi purific^
do por electroforese em gel de 10% de poliacrilamida. Este
duplex de DNA foi então enzimáticamente fosforilado usando
32 cinase de polinucleotideos de T4 e / ρ- P / ATP segundo o processo já estabelecido.
0 plasmídeo de expressão pNM 702 foi construído por ligação enzimática de 0,1 picomoles (0,4 yg) do fragmento Xba Ι-Bam HI do plasmídeo pKEN021 (107 na Figura 5), 0,025 picomoles do fragmento de DNA sintético (110 na Figura 5) e 0,3 picomoles (0,08 yjg) do fragemento de 538 pb (de 109 na Figura 5) em 24 ,ul de tampão de ligação usando 1,5 unidades de ligase do DNA de T4. Após incubação durante 16 horas a 42C a mistura foi usada para transformar E. coli JA221 como anteriormente descrito. Os transformantes foram seleccionados em placas de agar contendo 100 jug/ml de ampicilina e foram cultivados convencionalmente como fonte preferida do plasmídeo de expressão pretendido.
A expressão da hormona de crescimento humana foi detectada por um processo estandard de
ensaio radioimune (Twomey et a 1 ., 1974, Clin. Chem. 20:389-391) e determinou-se ser de pelo menos 2 milhões de molécuD. Construção do Plasmideo pNM789
0 plasmideo pNM702 (111 na Figura
6) o plasmideo de expressão da hormona de crescimento humana
foi usado como material de partida para a construção, de um
plasmideo de expressão Met-Fen-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lis-bGH.
las por célula.
0 plasmideo pBP 348 (112 na Figura
6) descrito em Miller et al., 1980 J. Biol. Chem. 255:7521-7524, foi usado como fonte de dois fragmentos de DNA contendo a sequência codificadora de uma parte do gene da hormona de crescimento bovina. 0 plasmideo contem uma sequência codificadora da hormona de crescimento bovina de 831 pb clonada no local de restrição Pst I do pBR322. Como uma alternativa ao método descrito em Miller et al., 1980, a sequência da hormona de crescimento bovina pode ser construída sintéticamente (Itakura et al.., 1977 e Crea et al., 1978) ou também pode ser obtida a partir do RNA mensageiro isolado de pituitárias bovinas pelos processos de rotina descritos por Goodman et al, 1979.
As sequências codificadoras da hormona de crescimento humana e da hormona de crescimento bovina são muito semelhantes e possuem um grau de homologia elevado. Foram particularmente úteis na construção do plasmideo de expressão da hormona de crescimento bovina os fragmentos produzidos por digestão com a enzima de restrição Pvu II. 0 tamanho dos fragmentos produzidos é de 497 pb na hormona de crescimento humana 494 pb na hormona de crescimento bovina e os correspondentes locais de restrição ocor rem nas mesmas fases de leitura em ambas as sequências.
Dez microgramas de pNM702 (111
na Figura 6) foram digeridos parcialmente com 1 unidade de Pvu II em 200 ju 1 de tampão de restrição Pvu II (NaCl 60 mM, Tris.HCl 6 mM, pH 7,5 MgCl2 B-mercaptoetanol 6 mM) durante 10 minutos a 379C. Após a reacção ter parado por aquecimento a 652C durante 10 minutos o DNA foi tratado com fosfatase alcalina e os fragmentos separados num gel de um por cento de agarose. 0 fragmento de DNA linear (113 na Figura 6) com o tamanho correspondente ao DNA sem o fragmento Pvu II de 497 pb (migra ligeiramente mais depressa que o plasmídeo com um unico corte) foi convencionalmente excisado, purificado e usado na construção de um plasmídeo intermediário (114 na Figura 6).
Preparou-se um fragmento Pvu II
de 494 pb do plasmídeo pBP348 por digestão com 10 ^ig do pias mideo em 200 μΙ de tampão Pvu II contendo 10 unidades de Pvu II durante 1 hora a 37SC. Os fragmentos foram separados num gel de 6 por cento de poliacrilamida e o fragmento pretendido de 494 pb (de 112 na Figura 6) foi convencionalmente visualizado e purificado.
0 plasmídeo intermediário (114
na Figura 6) foi construído por reacção de 0,2 ,ug do fragmento Pvu II do plasmideo pNM 702 com 0,05 ,ug do fragmento de 494 pb em 20 /j1 de tampão oligase do DNA de η T4 contendo 2 unidades de ligase do DNA de T4 durante 16 horas a 4SC. Após transformação e selecção dos transformantes relativamente â resistência ã ampicilina, os plasmideos foram convencionalmente analisados quanto â presença e orientação correcta do fragmento Pvu II de 494 pb. Os plasmideos com um fragmento Pvu II de 494 pb e um fragmento Xbal-Sma I de 440 pb são seleccionados para serem usacte noutras construções.
Dez microgramas do plasmideo
intermediário (114 na Figura 7) foram digeridos com 1 unidade de Pvu II em 200 ju 1 de tampão Pvu II durante 5 minutos a 37SC. Após aquecimento a 65fC durante 10 minutos, a mistura foi separada num gel de 1 por cento de agarose e o DNA linear tendo apenas um unico corte Pvu II por molécula foi recuperado e purificado. Este material recuperado (aproximadamente 3 ,ug) foi digerido completamente com 5 unidades de Xbal e tratado com fosfatase alcalina. Os frag mentos foram separados num gel de 1 porcento de agarose e o fragmento maior (sem o fragmento de 109 pb entre Xbal e o primeiro local Pvu II na hormona de crescimento humana ou bovina) foi convencionalmente recuperada (115 na Figura
7).
A sequência de DNA dos 23 primeiros aminoácidos (69 pb) da hormona de crescimento bovina até ao primeiro local Pvu II contém 2 locais de restrição Hpa II,, o primeiro dos quais tem 23 pb a partir do primeiro nucleotideo da sequência codificadora. Um fragmento de 63 pb (116 na Figura 7) foi sintetizado pelo método fosfotriéster. Este fragmento corresponde à sequência de 19 pb a partir do local Xba I no local de ligação ao ribossoma de lpp até ao sinal de iniciação da tradução ATG seguido da sequência codificadora de Fen-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lis (24 pb) e 20 nucleotideos da sequência codificadora da hormona de crescimento bovina (a partir de Fen até ao primei ro local Hpa II). 0 fragmento possui a seguinte sequência:
Xbal
5’ CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGI I I 1 I t I I t I I I I I ! I I I I I t í I « ! I I í I » t I ι ι » ’ ι ι >
3' TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCTTCCCAGCCATGTCCTTGTC 3’ ^11
! I ! I t t I I I I I I I ! I I t I I 1
AAGGGTCGGTACAGGAACAGGC 5’
| Para produção do fragmento de prepararam-se os seguintes nove segmentos seguintes | ||
| 1) | CTAGAGGGTAT | |
| 2) | TAATAATGTTCC | |
| 3) | CATTGGATGAT | |
| 4) | GATGATAAGTTCC | |
| 5) | CAGCCATGTCCTTGTC | |
| 6) | ATGGGAACATTATTAATACCCT | |
| 7) | TTATCATCATCATCCA | |
| 8) | ATGGCTGGGAAC | |
| 9) | tGGACAAGGAC |
Usando os segmentos atrás preparados efectuaram-se reacções de ligação catalisadas pela ligase de T4 passo por passo como descrito abaixo:
a) 0 segmento 1 não fosforilado em 5' foi ligado ao sagmento 2 fosforilado em 5' na presença do segmento 6 fosforilado em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA 1 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.
b) Os segmentos 3, 4 e 5 fosforilados em 5' foram ligados na presença dos segmentos 7 e 8 fosforilados em 5' e do segmento 9 não fosforilado em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA 2 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.
c) Os duplexes 1 e 2 foram então ligados por ligase de T4 para formar um duplex de DNA (116 na Figura 7) que foi puri ficado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.
Este duplex de DNA foi então enzimáticamente fosforilado usando cinase de polinucleotideos de T4 e /γ- Ρ _7 ATP seguindo o processo já estabelecido.
0 fragmento de DNA de 46 pb que vai desde o local Hpa II acima descrito até ao local Pvu II pode ser construído sintéticamente ou obtido a partir do plasmídeo original pBP348. Assim, cem microgramas de plasmideo pBP348 foram digeridos em 400 jjl de tampão Pvu II com 50 unidades de Pvu II durante 2 horas a 37SC. Após extracção com fenol e precipitação com etanol, o DNA foi dissolvido em 400 ju 1 de tampão Pst I (NaCl 50 mM, Tris.HCI 6mM, pH 7,4, MgC12 6mM, B-mercaptoetanol 6mM) com 50 unidades de PstI durante 2 horas a 379C. Os fragmentos de DNA foram separados num gel de 6 por cento de poliacrilamida e o fragmento de 135 pb contendo a sequência de 46pb preten dida foi recuperado e purificado por processos normalizados Um terço do DNA recuperado (equivalente a 33 jug) foi submetido a digestão limitada com 1 unidade da enzima de restrição HpalI em 100 ju 1 de tampão HpalI (tris.HCl 20 mM, pH 7,4, MgCl2 7mM, B-mercaptoetanol 6 mM) durante 40 minutos a 379C. Após aquecimento a 65SC durante 10 minutos, os fragmentos de DNA correram num gel de 5 por cento de acrilamida (proporção de acrilamida:bis 19:1) juntamente com um marcador de tamanho adequado. 0 fragmento de 46 pb pretendi do originado por digestão parcial com Hpa II do fragmento de 135 pb (de 112 na Figura 7) foi purificado por processos estandardizados.
Dois décimos do micrograma do
fragmento Xbal-Pvu II do plasmídeo vector (115 na Figura 7) 3,2 picomoles do fragmento sintético de 63 pb (116 na Figura 7) e 0,5 picomoles do fragmento de 46 pb (de 112 na Figura 7) foram incubados em 10 jul de tampão de ligação com 2 unidades de ligase do DNA de T4 durante 16 horas a 4aC.
A mistura de ligação foi usada para transformar E. coli
-39ro
JA 221 e os transformantes resultantes, que portanto continham o plasmideo desejado pNM789, foram seleccionados por resistência â ampicilina. A identidade do plasmideo pNM 789 (117 na Figura 7) foi confirmada por rastreio convencional para a presença de ambos os fragmentos Pvu II de 469 pb e Xbal-Pvu II de 104 pb.
E. Construção Final do Plasmideo pNM789B
0 plasmideo pNM789 (117 na Figura
8) necessita da alteração de um codão de aminoácido para conversão completa em hormona de crescimento bovina. Isto foi conseguido por remoção do fragmento Pvu II a Bam HI de 28 pb do pNM789 e substituição por um fragmento sintético de cadeia dupla tendo a seguinte sequência (118 na Figura 8):
5’CTGTGCCTTCTAG3’
ι ι » ι ι ι ι ι ι τ ι ι ι
3,GACACGGAAGATCCTAG5,
Dez microgramas de pNM789 foram digeridos com 1 unidade de PvuII em 200 yl de tampão Pvu II durante 5 minutos a 37SC. Após aquecimento 10 minutos a 65eC, a mistura foi diluida para 300 ju 1 com a adição de tampão BamHI, totalmente digerida com 10 unidades de BamHI durante 1 hora a 37SC tratada com 5 unidades de fosfatase alcalina e incubada durante 1 hora a 659C. Os fragmentos de DNA foram separados num gel de 1 por cento de agarose e um fragmento de DNA (119 na Figura 8) de tamanho idêntico ao do plasmideo pNM789 com um único corte foi purificado convencionalmente. Dois décimos do micrograma deste fragmento foi ligado a 5 picomoles de fragmento sintético usando 2 unidades de ligase de T4 em 20 jli 1 de tampão ligase.
A ligação decorreu durante a noite a 4®C. Após transformação foram isolados vários plasmídeos e testados quanto aos fragmentos Pvu II (494 pb) e Xbal-BamHI (628 pb) adequados Os plasmídeos contendo os fragmentos acima mencionados constituem o plasmídeo pretendido pNM789B (120 na Figura 8).
EXEMPLO 2
Construção do Plasmídeo pCZ101 e de E. coli k12 RV308/pCZ101
A. Isolamento do Plasmídeo pIM-I'-A3
A bactéria E. coli k12/pIM-I'-A3 (NRRLB-15733) foi cultivada em caldo Ty (1% de triptona,
0,5% de extracto de levedura, 0,5% de cloreto de sódio, pH 7,4) com 50 jug/ml de canamicina a 25®C de acordo com processos microbiológicos convencionais. Após diluição da cultura a 1:10 em meio fresco e depois de 3 horas de incubação a 37SC cerca de 0,5 ml da cultura foram transferidos para um tubo Eppendorf de 1,5 ml e centrifugado durante cerca de 15 segundos. A menos que de outros modo indicado, todas as manipulações foram feitas à temperatura ambiente.
0 sobrenadante resultante foi cuidadosamente removido com um aspirador de ponta fina e o sedimento de células foi ressuspenso em cerca de 100 4 de solução de lisozima (2 mg/ml) recentemente preparada que continha 2 mg/ml de lisozima, glucose 50 mM, EDTA (diaminotetraacetato) 10 mM e Tris.HCl 25 mM, pH 8. Cerca de 200 ju 1 de solução de SDS (dodecilsulfato de sódio) alcalino (NaOH 0,2N, 1% de SDS) foram adicionados e o tubo foi suavemente invertido e depois mantido a 0sC até lise completa ( λ/5 minutos). Em seguida adicionou-se cerca de 150 ,ul de acetato de sódio 3M e o
conteúdo do tubo foi misturado suavemente por inversão durante alguns segundos.
0 tubo foi mantido a 0sC durante pelo menos 60 minutos e depois centrifugado durante 15 minutos para se obter um sobrenadante quase límpido. 0 sobre nadante foi transferido para um segundo tubo de centrífuga ao qual se adiciona 3 volumes de etanol frio a 100%. Após permanência do tubo durante 5 minutos em neve carbónica com etanol, o precipitado resultante foi colhido por centr fugação (5 minutos) e o sobrenadante foi removido por aspi ração. 0 sedimento colhido foi dissolvido em 100 ju 1 de TE (Tris.Hcl 10mM, pH 8,0 EDTA 1 mM) e constituiu o DNA do plasmídeo pIM-I'-A3 pretendido.
B. Digestão do PLasmideo pNM789B com Xbal-BamHI e produção do Fragmento Xbal-BamHI^0,6 kb
Cerca de 5 jug de DNA do plasmídeo pNM789B em 50 ;ul de tampão "Hi Salt" * foram incubados com 10 unidades de cada uma das enzimas de restrição BamHI Xbal a 37SC durante cerca de 1 hora. Após adição de 5 ,ul de acetato de sódio 3M pH 7,0, o DNA foi precipitado com 2 volumes de etcrol a 100%. 0 DNA digerido pretendido foi dissolvido em 100 yl de tampão TE e guardado a 0sC até ser usado.
0 tampão "Hi Salt" foi convencionalmente preparado com a seguinte composição:
NaCl 100 mM
Tris.HCl 20 mM, pH 8,0
MgCl2 10 mM
B-mercaptoetanol 5 mM
C. Digestão do Plasmídeo pIM-I1-A3 com Xbal-BamHI
A digestão pretendida foi efectua da essencialmente segundo o processo do Exemplo 2B exceptu ando a utilização do plasmídeo pIM-I1-A3 em lugar do plasmideo pNM789B. 0 DNA pretendido foi dissolvido em cerca de 100 4Jl de tampão TE e guardado a 09C até ser usado.
D. Ligação e Transformação
Cerca de 1 h9 do plasmídeo pIM-I1 A3 digerido, 1 jug do plasmídeo pNM789B digerido com XbaI-BamHI, 40 ,ul de água, 5 ,ul de ATP (5 mM) 5 jul de mistura de ligação * e 5 unidades de ligase do DNA de T4 foram incubados a 209C durante cerca de 2 horas. Após incubação a 65SC durante 2 minutos seguido de arerefecimento em gelo a mistura de ligação resultante foi usada para transformar básicamente segundo o processo de transformação de Wensink 1974, Cell 3:315, E. coli k12 RV308 em placas Ty (1% de tri ptona, 0,5% de extracto de levedura, o,5% de cloreto de sódio, 1,5% de agar, pH 7,4) contendo 50 hg/ml de canamicina. A estirpe bacteriana E. coli kl2 RV308 foi depositada e tornada parte de colecção de culturas estoque permanentes do Northern Regional Research Laboratory, Pecria, Illinois estando disponível para o publico com o numero de acesso NRRLB-15624.
Alguns dos transformantes resultantes conforme demonstrado por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al., 1982) e outros testes, continham apenas o plasmídeo pretendido >^10,8 kb. Um desses transformantes aqui designado por £. coli k12 RV308/pCZ101, foi seleccionado semeado em agar Ty contendo os antibióticos adequados e depois cultivado usando técnicas convencionais de microbiologia. As células resultantes foram usa_
das para isolar o plasmídeo pCZ1O1 essencialmente de acordo
com o processo do Exemplo 2A.
*
A mistura de ligação pode ser preparada com a seguinte composição:
Tris.HCl 500 mM, pH 7,8 Ditiotreitol 200 mM MgCl2 100 mM
EXEMPLO 3
Construção do PLasmideo pCZ1920 e de Ελ coli k12 RV308/pCZ 1920
A. Construção do Fragmento BamHI-XbalM 10,2 kb do Plasmídeo pCZ101.
0 fragmento pretendido foi construi, do essencialmente de acordo com os aisinamentos do Exemplo 2B exceptuando a utilização dc plasmídeo pCZ101 em lugar do plasmídeo pNM789B. Os fragmentos de restrição pretendidos BamHI-XbaIN 10,2 kb foram convencionalmente separados e isolados por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al., 1982) e depois dissolvidos em cerca de 100 jul de tampão TE e guardados a 09C até serem usados.
B. Construção do Fragmento BamHI-Hgi AIM 0,6 kb do Plasmideo pCZ1O1
0 fragmento pretendido foi construído basicamente segundo os ensinamentos do Exemplo 2B exceptuando a utilização do plasmideo pCZIOl e da enzima de restrição HgiAI em lugar respectivamente do plasmideo pNM789B e da enzima de restrição Xbal. Os fragmentos de restrição pretendidos BamHI-HgiAI^ 0,6kb foram convencionalmente seprados e isolados por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al., 1982) e depois dissolvidos em cerca 100 jul de tampão TE e guardado a 09C para utilização futura.
C. Construção da Sequência de DNA Adaptador
5' CTAGAGGGTATTAATA ATG AAA
„ . « » ι ι » I I I t I I I f I l f ι I
3 TCCCATAATTAT TAC TTT
ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT ’’I ’·’ ’’’ ’·’ » » » iii iii TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA
GGG AAT iii iii CCC TTA GCC AAC
III III
CGG TTG
TCT ATG GCC TTC iii iii iii III AGA TAC CGG AAG GCT GTGCT 3’
III I
CGA C 5 ’
CCA GCC
III III
GGT CGG
A sequência adaptadora pretendida foi convencionalmente sintetizada pelo método fosfotriéster modificado essencialmente segundo os ensinamentos de Itakura et al., 1979 e Grea et aj_., 1978. 0 método de sintese atrás referido está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.
D. Ligação e Transformação
Cerca de 20 picomoles do DNA adaptador do Exemplo 3C, 1 ,ug do fragmento BamHI-Xbal çJ 10,2 kb do plasmídeo pCZ101 e 0,5 ,ug do fragmento BamHI -Hgi A1 0,6 kb do plesmideo pCZ101 foram ligados e o pias mideo resultante usado para transformar E.coli k12 RV308 bâsicamente de acordo con os ensinamentos do Exemplo 2D.
Alguns dos transformantes resultantes, conforme convencionalmente demonstrado por electro fose em gel de agarose (Manic.tis et al., 1982) e outros testes, continham apenas o plasmídeo pretendidoA>10,8 kb Tal transformante, aqui designado por E.coli k12 RV308/ pCZ1920, foi seleccionado semeado em agarTy contendo os an tibióticos adequados e depois cultivado segundo técnicas convencionais de microbiologia. Por elecetroforese em gel com SDS, RIA e outros testes demonstrou-se que as células resultantes expressam niveis elevados do referido derivado MET-LIS-GLI-ASPN-SER-MET-ALA-bGH.
Devido ao plasmídeo pCZ1920 conter um replicão runaway termoinduzivel a expressão máxima do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 379C.
EXEMPLO 4
Construção do Plasmídeo pJR1 e de E.coli k12 RV308/pJR1
As construções pretendidas são feitas essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 3 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 3C pela sequência de DNA adaptador
5'
3’
CTAGAGGGTATTAATA
’ ' ’ » I I I I I t I f
TCCCATAATTAT
ATG
! ! I
TAC
TTT
I I I
AAA
CCA
I I I
GGT
GCC ι ι ι CGG
ATG
t I I
TAC
GCT CTA TCT GGT 1 ! ’ ' ' ι ι ι ι t ι r
CGA GAT AGA CCA
CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'
» » » ff» III iii III ,
GAC AAA CGG TTG CGA C 5’
A sequência adaptadora acima
especificada pode ser construída essencialmente de acordo com o processo convencional de Itakura et al.,1977 e Crea et al.,1978. 0 referido método de sintese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.
Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli k12 RV308/pJR1 são semeados em agar Ty contendo os antibióticos adequados e depois convencional, cultivados para produção e isolamento subsequente do plasmídeo pJR1. Os transformantes expressam niveis elevados do referido derivado da hormona de crescimento bovina MET-FEN-PRO-ALA-MET-ALA-R2 conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Devido ao plasmídeo pJR1 conter um replicão "que se escapa" termoinduzivel a expressão máxima do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 372C.
EXEMPLO 5
Construção do PLasmideo ρΗΙ72Χ4-Δΐ
Na Figura 15 dos desenhos juntos está apresentado um esquema parcial de construção do plasmideo ρΗΙ7Λ4â 1
A. Construção do PLasmideo pBRHtrp
0 plasmídeo pGM1 possui o operão do triptofano de E.coli contendo a delecção -Δ LE 1413 (Miozzari, et al., 1978, J. Bacteriolcgy 1457-1466) e portanto expressa uma proteína de fusão compreendendo os 6 primeiros aminoácidos do "condutor" (leader) do trp e cerca do ultimo terço do polipptideo E do trp (daqui em diante referido em conjunção como LE') assim como o polipeptídeo D do trp na sua totalidade tudo sob o controle do sistema promotor-operador do trp. E. coli k12 W3110 tna 2 trp AlO2/pGM1 foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC Ne 31622) e o pGM1 pode ser convencionalmente removido da estirpe para utilização nos processos descritos abaixos.
Cerca de 20 ng do plasmídeo foram digeridos com a enzima de restrição Pvu II a qual corta o plasmídeo em cinco locais. Os fragmentos de gene foram em seguida combinados com adaptador EcoRI (consistindo em um oligonucleotideo auto-complementar com a sequência: :pCATGAATTCATG) proporcionando um local de EcoRI. Os 20 ng de fragmentos de DNA obtidos a partir de pGM1 foram tratados com 10 unidades de ligase do DNA de T4 na presença de 200 picomoles do oligonucleotideo sintético pCATGAATTCATG fosforilado em 5' e em 20 nl de tampão ligase do DNA de T4 (Tris 20 mM, pH 7,6, ATP 0,5 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 5 mM) a 4SC durante a noite.
-48
A solução foi então aquecida 10 minutos a 709C para parar a ligação. Os adaptadores foram cortados por digestão com EcoRI e os fragmentos, agora com extremidades EcoRI, foram separados usando electroforese em gel de 5 por cento de
I poliacrilamida (daqui em diante "PAGE"). Os três fragmentos maiores foram isolados do gel corando primeiro com brometo de etidio e depois localizando os fragmentos com luz ultravioleta e retirando do gel as partes com interesse. Cada fragmento de gel, com 300 jul de TBE 0,1x, foi colocado num tubo de diálise e sujeito a electroforese a 100v duran> te uma hora em tampão TBE 0,1x (o tampão TBE contem:10,8
g de base tris, 5,5 g do ácido livre bórico, 0,09 g de Na2EDTA em 1 litro de H20). A solução aquosa foi colhida do tubo de diálise, extraida com fenol, extraida com clorofórmio e tornada 0,2M relativamente a cloreto de sódio.
0 DNA foi então recuperado em água após precipitação com etanol. Os fragmentos contendo o promotor/operador do trp com extremidades coesivas Eco RI foram identificados por inserção num plasmídeo sensível à tetraciclina que quando da inserção do promotor/operador se torna resistente à tetraciclina. Todos os isolamentos de fragmentos de DNA daqui em diante descritos neste Exemplo são feitos usando PAGE seguido do método de electroeluição descrito atrás.
-49-
B. Construção do Plasmideo pBRHtrp Expressando Resistência â Tetraciclina Sob o Controle do Promotor/Operador do trp e Identificação e Amplificação do Fragmento de DNA Contendo o Promotor/Operador do trp Isolado em "A" atrás.
0 plasmideo pBRH1, (Rodriguez, et aL, 1979 Nucleic Acids Research 6, 3287 e ATCC N2 37070) expressa resistência â ampicilina e contem o gene da resistência â tetraciclina mas não havendo um promotor que lhe esteja associado não expressa essa resistência. As células que possuem o plasmideo são portanto sensíveis à tetraciclina. Através da introdução de um sistema promotor/operador no local EcoRIo plasmideo expressará resistência à tetraciclina.
0 plasmideo pBRH1 foi digerido com EcoRI. A enzima foi removida por extracção com fenol seguida de extracção com clorofórmio e depois o DNA foi ressuspenso em água após precipitação com etanol. 0 DNA resultante foi combinado em cada um dos três fragmentos de DNA obtidos no Exemplo 5A atrás, em misturas de reacção separadas, e ligado com ligase de DNA de T4 como descrito anteriormente. 0 DNA presente na mistura de reacção foi usado para transformar E.coli k12 294 (NRRL B-15625) competente por técnicas normalizadas (Hershfield et aI.,1974 Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71:3455-3459) e as bactérias foram então semeadas em placas LB (Maniatis et al.,1982) contendo 20 jug/ml de ampicilina e 5 jug/ml de tetraciclina.
Várias colónias resistentes â tetraciclina foram seleccionadas e o DNA dos plasmideos isolado e designado por pBRHtrp. A presença do fragmento pretendido foi confirmada por análise com enzimas de restrição. 0 plasmideo pBRHtrp expressa β-lactamase, conferindo resistência â ampicilina e contem um fragmento de DNA
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que inclui o promotor/operador do trp. 0 fragmento de DNA também codifica uma primeira proteína, (designada por LE1) compreendendo uma fusão dos seus seis primeiros aminoácidos do condutor ("leader") do trp e cerca do último terço do po lipeptideo E do trp uma segunda proteína (designada D1) correspondendo a cerca da primeira metade do polipeptideo D do trp e uma terceira proteína, codificada pelo gene da resistência â tetraciclina.
C. Construção do Plasmídeo pS0M74 2
0 plasmídeo pBRHtrp foi digerido com a enzima de restrição EcoRI e o fragemento resultante isolado por PAGE e elctroeluição foi combinado com o plasmideo pSOM11 digerido com EcoRI (Itakura, et al.,1977,
Sei. 198:1056, Patente U.S. Ne 4 366 246, Publicação da Patente G.B. Ns 2007 676A). A mistura foi ligada com ligase do DNA de T4 e o DNA resultante usando para transformar E.coli k12 294 como anteriormente descrito. As bactérias transformantes foram seleccionadas em placas contendo ampicilina e as colónias resultantes resistentes à ampicilina foram testadas por hibridação de colónias (Gruenstein et al.,1975, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72:3951-3965). 0 fragmento contendo o promotor/operador do trp, isolado a
partir do pBRHtrp e depois marcado radioactivamente com
32
P, foi usado como sonda no processo acima. Por hibridação de colónias encontrou-se várias colónias positivas que foram portanto seleccionadas. 0 DNA dos plasmideos foi isolado e determinada a orientação dos fragmentos inseridos por análise de restrição usando as enzimas Bgl II e BamHI em digestão dupla. As colónias contendo o plasmídeo pretendido com o fragmento do promotor/operador do trp na orientação correcta foram cultivadas em meio LB contendo 10 Aig/ml de ampicilina. 0 plasmídeo pretendido foi designado por pS0M7A 2 e foi usado para construções subsequentes descritas abaixo.
D. Construção do Plasmídeo ptrp 24
1. Construção de um Fragmento de Gene Codificador das Regiões Distais do Polipeptídeo LE' com locais de Restrição Bg1 II e Eco RI Respectivamente nas Extremidades 5‘ e 3' da Cadeia Codificadora
0 plasmídeo pS0M7A2 foi digerido com HindIII seguido de digestão com exonuclease lambda (uma exonuclease 5' para 3‘) em condições escolhidas de modo a digerir para IS do local de restrição BglII dentro da região codificadora de LE1. Cerca de 20 ug de pS0M7 2 digerido com HindIII foi dissolvido em tampão/ 7/tampão glicina 20 mM, pH 9,6 MgCl2 1 mM, B-mercaptoetanol 1 mM). A mistura resultante foi tratada com 5 unidades da exonuclease lambda durante 60 minutos â temperatura ambiente. A mistura da reacção obtida foi então extraída com fenol extraída com clorofórmio e precipitada com etanol.
Para criar um residuo EcoRI na extremidade distai do fragmento do gene LE1 sintetizou-se um iniciador 32pCCTGTGCATGAT pelo método fosfotriéster melhorado (Crea et al.,1978) e hibridado com a extremidade de cadeia simples do fragmento do gene LE1 resultante da digestão com exonuclease lambda. A hibridação foi efectu ada por dissolução de 20 ,ug do produto da digestão do pS0M7 2 com HindIII e tratado com exonuclease lambda em 20 y 1 de H20 e por combinação com 6 jul de uma solução contendo cerca de 80 picomoles de oligonucleotideo descrito acima fosforilado em 5'.
ims
- 52-
0 fragmento sintético foi hibridado com a extremidade 3' da sequência codificadora de LE* e a restante porção de cadeia simples do fragmento LE1 foi preenchida com Polimerase I Klenow usando dATP, dTTP, dGTP e dCTP. A Polimerase I Klenow é o fragmento obtido por corte proteolitico da Polimerase I do DNA. Possui a actividade de polimerização 5'-3', a actividade de exonuclease 3'-5' mas não a activida, de de exonuclease 5'-31 da enzima parenteral (Kornberg,
1974, W.H. Freeman and Co., SFO, 98).
A mistura de reacção foi assim aquecida até 50sC e deixada arrefecer lentamente até 10BC altura em que se adicionou 4 ju 1 da enzima Klenow. Após 15 minutos de incubação â temperatura ambiente seguido de 30 minutos de incubação a 37SC, a reacção foi parada pela adição de 5 λι 1 de EDTA 0,25 molar. A mistura da reacção foi extraida com fenol, extraida com clorofórmio e precipitada com etanol. 0 DNA foi subsequentemente cortado com a enzima da restrição BglII e os fragmentos foram separados por
PAGE. Um autorradiograma de gel revelou um fragmento marca32
do com P com o comprimento esperado de aproximadamente 470 pb, o qual foi recuperado por electroeluição. Conforme sublinhado este fragmento LE' (d) tem uma terminação Bgl II e uma extremidade corre coincidindo com o principio do iniciador.
2. Construção do Plasmídeo pThbé1
0 plasmídeo pThb<1 foi construído por inserção de um gene sintetizado da timosina alfa 1 no plasmídeo pBF822 . A sintese do DNA codificador da timosina alfa 1 envolve a sintese e subsequente ligação de 16 oligonucleotideos (T1 a T^) que estão inseridos pelas setas de dois sentidos na Figura 11 dos desenhos juntos.
Um ATG para met foi inserido na terminação N e as extremidades 5' foram providas de extremidades coesivas de cadeia simples para facilitar a ligação a plasmídeos cortados com EcoRI e BamHI. Como pode ser facilmente apreciado o local BglII no centro do gene ajuda a análise dos plasmideos recombinantes.
Os oligodeoxirribonucleotideos T1 a T16 foram sintetizados pelo método fosfotriéster modificado de Itakura et al., 1977 e Crea et al.,1978. Os vários oligodeoxirribonucleotideos estão apresentados na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1
01 igonucleotideos sintéticos para o gene timosina (X. 1
Composto Sequênci a
T1 A-A-T-T-C-A-T-G-T-C
T2 T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T
T3 T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A
T g-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A
4
T_ G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A·
□
Τθ G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A
T? A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A
Τθ. A_A_G-A-T-C-T-T-T-A-G-T
Tg G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G
τ1θ A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T
Tr G.T.C_G-a-A-G-A-G-G-C-T
T12 . g-a-g-a-a-c-t-a-a-t-a-g t13 C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T
Tl4 T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C
T15 g-t-t-c-t-c-a-g-c-c-t-c
T16 G-A-T-C-C-T-A-T-T-A
Análise por HPLC
tempo de Retenção
Comprimento (min)*
| 10 | 17,4 |
| 15 | 24,3 |
| 12 | 20,3 |
| 13 | 22,0 |
| 15 | 24,8 |
| 12 | 20,1 |
| 13 | 22,6 |
| 12 | 20,2 |
| 12 | 20,4 |
| 12 | 21,1 |
| 12 | 20,5 |
| 12 | 20,4 |
| 12 | 19,9 |
| 12 | 20,5 |
| 12 | 20,2 |
| 10 | 17,2 |
A temperatura, ambiente
-55-
A sintese acima referida é exemplificada pelo processo que se segue para o fragmento T15 conforme resumido na Figura 12 dos desenhos juntos. Os diferentes fragmentos de nucleotídeos usados na sintese de T15 estão numéricamente assinalados na Figura. As abreviaturas empregues são como se segue: TPSTe, 2,4,6-triiso propilbenzenossulfoniltetrazole; BSA, ácido benzenossulfónico; TLC, cromatografado em camada fina; HPLC, cromatogra fia liquida de alta resolução; DMT, 4,4'-dimetoxitritilo; CE, 2-cianoetilo; R, p-clorofenilo; Bz, benzoilo; An, anisoilo; iBu, isobutirilo; P -piridina; AcOH ácido acético
«7
EtgN, trietilamina.
Os trideoxirribonucleotideos 4 (85 mg, 0,05 mmol) e 2 (180 mg, 0,1 mmol) totalmente protegidos foram desbloqueados nos hidroxilos 5' por tratamento com BSA a 2% em clorofórmio/metanol 7:3 (v/v) (10 e 20 ml, respectivamente) durante 10 minutos a 0eC. As reacções foram paradas por adição de bicarbonato de amónio aquoso saturado (2 ml) extraídas com clorofórmio (25 ml) e lavadas com água (2x10 ml). As fases orgânicas foram secas (sulfato de magnésio), concentradas para pequenos volumes (cerca de 5 ml) e precipitadas por adição de éter de petroleo (fracção 359-369C). Um precipitado incolor foi colhido por centrifugação e seco num excicador in vacuo para dar 6 e 8 respectivamente cada um homogéneo como demonstrado por Clc em silica gel (Merck 60 F254, clorofórmio/metanol 9:1).
Os trimeros j_ e 3 (270 mg, 0,15 mmole; 145 mg, 0,075 mmole) foram convertidos nos seus fosfodiésteres (5 e 7) por tratamento com trietilamina/ /piridina/água (1:3:1, v/v 10 ml) durante 25 minutos â temperatura ambiente. Os reagentes foram removidos por evaporação rotatória e os resíduos secos por evaporações repetidas com piridina anidra (3x10 ml). 0 trimero 8
-56V
PORTUGA!
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(0,06 mmole) e o trimero 7 foram combinados com TPSte (50 mg, 0,15 mmole) em piridina anidra (3 ml) e a mistura da reacção deixada in vacuo â temperatura ambiente durante duas horas. A análise por TLC mostrou que 95% do trimero 8 tinha sido convertido em hexamero (visualizado por detecção do grupo DMT através de vaporização com ácido sulfurico aquoso a 10% e aquecimento a 609C). A reacção foi parada pela adição de água (1 ml) e o solvente evaporado sob pressão reduzida. Após remoção da piridina por coevaporações com tolueno, o hexamero foi desbloqueado na posição 5' com BSA a 2% (8 ml) como descrito atrás para os trimeros 4 e 2_. 0 produto (10) foi purificado numa coluna de silica gel (Merck 60 H, 3,5x5 cm) por eluição com gradiente descontinuo com clorofórmio/metanol (98:2 a 95:5, v/v). As fracções contendo o produto 10 foram evaporadas até secagem.
De modo idêntico o trimero 5 foi acoplado ao 6 e o produto totalmente protegido purificado directamente em silica gel. Este ultimo composto foi desbloqueado na extremidade 3’ por trietilamina/piridina/água como descrito acima para obtenção do fragmento 9.
Finalmente os hexameros 9 e 10 foram acoplados em piridina anidra (2 ml) com TPSte (75 mg, 0,225 mmol) como agente de condensação. Depois de completada a reacção (4 horas, temperatura ambientee) a mistura foi submetida a evaporação rotatória e o residuo cromatografado em silica gel. 0 produto 11 (160 mg) foi obtido por precipitação com éter de petroleo e surgiu homogéneo em TLC. Uma parte do composto 11 (20 mg) em piridina (0,5 ml) foi completamente desbloqueada por tratamento com hidróxido de amónio aquoso (7 ml, 8 horas, 609C) e subsequente tratamento em ácido acético a 80% (15 minutos, temperatura ambiente). Após evaporação do ácido acético, o residuo sólido foi dissolvido em hidróxido de amónio aquoso a 4%
(v/v, 4 ml) e extraído com éter etilico (3x2 ml). A fase
aquosa foi concentrada para 1-2 ml e uma parte aplicada
-57-
a HPLC para purificação de 12. As fracções correspondendo ao pico principal foram reunidas (ca 2 unidades A254) e concentradas em cerca de 5 ml. Ao produto final 12 foi removido o sal em Bio-gel P-2 (1,5 χ 100 cm) por eluição com etanol aquoso a 20% seco e ressuspenso em água (200 ju 1) para dar uma solução de A25^=10. A sequência de 12 foi confirmada por análise bidimensional da sequência.
0 gene da timosina alfa 1 na
sua totalidade foi montado a partir de 16 oligonucleotideos sintéticos por métodos anteriormente descritos detalhadamente para a somatpstatina (Itakiura et al. ,1977) insulina (Goeddel et al., 1979) e hormona de crescimento (Goeddel et al., 1979 Nature 281:544). Quantidades de dez microgramas dos ol igonucleotideos T9 a T1t- foram fosforilados quanpo?
titativamente com /"(f- _7-ATP (New England Nuclear) na presença de cinase de polinucleotideos de T4 (Goeddel et al., 1979) pra dar actividades especificas de aproximadamente 1 li/mmol. Os fragmentos marcados radioactivamente foram purificados por electroforese em gel de 20% poliacrilamida/ureia 7M e as sequências dos fragmentos eluidos foram verificadas por electroforese/homocromatografia bidimensional (Jay et al., 1974, Nucleic Acids Res. 1:331) de produtos da digestão parcial com veneno de cobra, os fragmentos T1 a T1g não foram fosforilados para minimizar polimerização indesejada durante reacções de ligação subsequentes. Estes ol igonucleotideos ( 2 ,ug década) foram reunidos em quatro grupos de quatro fragmentos (ver figura 13 dos desenhos juntos) com ligase do DNA de T4 usando processos já publicados (Goeddel et al., 1979). Os produtos de reacção foram purificados por electroforese em gel num gel de 15% de poliacrilamida contendo ureia 7M (Maxam e Gilbert, 1977, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71:3455). Os quatro produtos isolados foram ligados uns aos outros e a mistura de reacção separada por electroforese em gel de 10% de poliacrilamida. Electroelui-se o DNA dentro da gama
de tamanhos do gene da timosina alfa 1 (90-105 pares de
bases).
-oe0 plasmídeo pBR322 (0,5 ,ug) foi tratado com as endonucleases de restrição BamHI e EcoRI e os fragmentos separados por electroforese em gel de poliacrilamida. 0 fragmento maior foi recuperado do gel por electroeluição e subsequentemente ligado ao DNA sintético montado (Goeddel et al.,Nature 281:544, 1979). Esta mistura foi usada para transformar E.coli k12 294. Cinco por cento da mistura de transformação foi semeada em placas LB contendo 20 ;ug/ml de ampicilina. As quatro colónias resistentes â ampicilina obtidas eram sensíveis à tetraciclina sugerindo a inserção no gene de resistência â tetraciclina. A análise dos plasmídeos destas quatro colónias mostrou que em cada caso o plasmídeo, designado por pTh ^1, continha (a) um local Bgl II não encontrado no própriopBR322 indicando assim a presença do gene da timosina alfa 1 confor me apresentado na Figura 11, e (b) um fragmento com aproximadamente 105 pares de bases produzido por corte com Baro HI/EcoRI. A via de construção para o plasmídeo pThC<1 (não desenhada â escala ) está apresentada na Figura 13 dos desenhos juntos em que as virgulas a cheio indicam grupos fosfato 51.
3. Reacção de pTh ^1 e fragmento LE1 (d) tratados
0 plasmídeo pThKl contem um gene que especifica resistência à ampicilina e um gene estrutural que especifica timosina alfa 1 clonado na sua extremidade 5' da cadeia codificadora num local Eco RI e a sua extremidade 3' num local BamHI . 0 gene da timosina contem também um local BglII. Para criar um plasmídeo capaz de aceitar o fragmento LE’ (d) preparado acima, pThOól foi digerido com EcoRI seguido de reacção com polimerase
ίι
ι -59
I klenow e dTTp e dATP para tornar cerses os resíduos Eco RI. A digestão com Bgl II do produto resultante originou um fragmento de DNA linear contendo o gene da resistência à ampicilina e na sua extremidade oposta um residuo coesivo Bgl 11 e uma extremidade cerse. 0 produto resultante poderia ser recircularizado por reacção com o fragmento LE' (d) contendo uma extremidade coesiva Bgl II e uma extremidade cerse na presença de ligase de T4 para formar o plasmídeo ptrp 24. Ao fazê-lo é recriado um local EcoRI na posição onde se deu a ligação de extremidades cerses.
E. Construção do Plasmídeo pSOM 7/12/14
A digestão sucessiva do ptrp 24 com BglII e EcoRI, seguido de PAGE e electroeluição, dá um fragmento tendo codões para o polipeptídeo LE1 (d) com uma extremidade coesiva Bgl II e uma extremidade coesiva Eco RI adjacente â terminação 3' codificadora. 0 fragmento LE1 (d) pode ser cionado num local Bgl II do plasmídeo pSOM 1Δ2 para formar uma proteína de fusão polipeptídeo LE'/somatostatina expressa sob o controle do promotor/operador do triptifano. Para o efectuar é necessário (1) digestão parcia de pS0M/l7A2 com Eco RI de modo a cortar o local Eco RI dis^ tal em relação ao promotor/operador do triptofano e (2) escolha adequada da sequência iniciadora de modo a manter a fase de leitura adequada e a recriar um local de corte Eco RI.
Assim, 16 /jg do plasmídeo
pSOM 7/12 foram diluidos em 200 ul de tampão contendo Tris 2 0 mM, pH 7,5 MgCl^ 5 mM detergente NP40 a 0,02% e NaCl 100 mM e tratados com 0,5 unidades de Eco RI.
1
Após 15 minutos a 37®C a mistura de reacção foi extraida com fenol, extraida com clorofórmio precipitada com etanol e subsequentemente digerida com Bgl II. 0 fragmento maior resultante foi isolado por PAGE seguido de electroeluição. Este fragmento contem os codões "LE1 (p)" da extremidade proximal do polipeptideo LE1, i.e. os situados a montante do local Bgl II. Este fragmento foi em seguida ligado ao fragmento acima referido LE'(d) na presença de ligase do DNA de T4 para formar o plasmídeo pSOM 724, que quando da transformação de E.coli k12 254, produziu eficazmente uma proteína de fusão consistindo no polipeptideo LE totalmente reconstituído e somatostatina sob o controle do promotor/operador de triptofano.
F. Construção de DNA linear tendo um residuo PstI na extremidade 3' e um residuo Bgl II na extremidade 5' delimitando um gene especificando resistência â tetraciclina
0 plasmídeo pBR322 foi digerido com HindIII e as projecções HindIII foram digeridas com nuclease S1. A digestão com nuclease S1 envolve o tratamento de 10 u g de pBR322 cortado com HindIII em 30 ju 1 de tampão S1 (NAC1 0,3M, ZnCl2 1 mM, acetato de sódio 25 mM, pH 4,5) com 300 unidades de nuclease S1 durante 30 minutos a 155C.
A reacção foi parada pela adição de 1 y 1 de solução de paragem da nuclease S1 30χ (base Tris 0,8 M, EDTA 50 mM). A mistura foi extraida com fenol, extraida com clorofórmio, precipitada com etanol e depois digerida com EcoRI como atrás descrito. 0 fragmento resultante obtido por PAGE seguido de electroeluição, possui uma extremidade coesiva EcoRI e uma extremidade cerse cuja
cadeia codificadora começa com o nucleotideo timidina. 0 residuo HindIII digerido com S1 começando com timidina pode ser ligado a um residuo Bgl11 tratado com a Polimerase I Klenow de modo a reconstituir o local de restrição Bgl II quando da ligação.
Portanto, o plasmideo pS0M7.á 2 preparado no Exemplo 5C, foi digerido com BglII e as extremidades coesivas BglII resultantes foram transformadas em cadeia dupla por tratamento com polimerase I Klenox usando os quatro trifosfatos de deoxinucleotideo. 0 corte do produto resultante com EcoRI seguido de PAGE e electroeluição do fragmento menor deu um fragmento de DNA linear contendo o promotor/operador do triptofano e codões para a sequência "proximal" de LE1 a montante do local Bgl II ("LE' (p)").
0 produto possuía uma extremidade EcoRI e uma extremidade de cerse resultante do preenchimento do local Bgl II.
No entanto, o local BglII é reconstituído por ligação da ex tremidade cerse com a extremidade cerse do fragmento HindIII acima digerido com S1. Assim, os dois fragmentos foram ligados na presença de ligase do DNA de T4 para formar o plasmideo pHKYIO recircularizado o qual foi amplificado por transformação de células competentes E.coli k12 Z94.
As células resistentes â tetraciclina possuindo o plasmideo recombínante pHKYIO foram seleccionados e extraído o DNA do plasmideo. Digestão com BglII e PstI seguido de isolamento por PAGE e electroeluição do fragmento maior deu o fragmento de DNA lirear pretendido tendo extremidades coesivas PstI e Bgl II. Este fragmento de DNA, assim produzido a partir de pHKYIO, contem a origem da replicação sendo deste modo um componente últil na construção do plasmideo pHI72S 4^1 em que ambos os genes codificadores da proteina de fusão com o polipeptídeo LE' do trp e da resistência â tetraciclina são controlados pelo promotor/operador do trp.
1 -62
G. Construção de DNA linear tendo o promotor/operador do trp
0 plasmídeo pS0M742dá4, preparado no Exemplo 5E, foi sujeito a digestão parcial com Eco RI seguida de digestão com PstI. 0 fragmento resultante continha o promotor/operador do trp e foi isolado por PAGE seguido de electroeluição. Foi necessária digestão parcial com Eco RI para obtenção de um fragmento cortado num local adjacente â extremidade 5' do gene da somatostatina mas não cortado no local Eco RI presente entre o gene de resistência à ampicilina e o promotor/operador do trp A resistência â ampicilina perdida por corte em PstI no gene de resistência à ampicilina pode ser recriada quando da ligação com o derivado final do DNA de pHKYIO produzido no Exemplo 5 F acima.
H. Preparação do gene sintético codificador dos 32 aminoácidos da terminação N da proinsulina
Como primeiro passo na construção do gene codificador dos 32 primeiros aminoácidos da proinsulina preparou-se uma série de 18 oligonucleotideos apresentados na Tabela 2. A sequência de nucleotídeos do gene total construído está apresentada na Figura 14.
Tabela 2
01igonucleotídeos sintéticos da proinsulina humana
Composto Sequência
| Hl | AATTCATGTT |
| H2 | CGTCAATCAGCA |
| H3 | CCTTTGTGGTTC |
| H4 | TCACCTCGTTGA |
| H5 | TTGACGAACATG |
| H6 | CAAAGGTGCTGA |
| H7 | AGGTGAGAACCA |
| H8 | AGCTTCAACG |
| BI | AGCTTTGTAC |
| B2 | CTTGTTTGCGGT |
| B3 | GAACGTGGTTTC |
| B4 | TTCTACACTCCT |
| B5' | AAGACTCGCC |
| B6 | AACAAGGTACAA |
| B7 | ACGTTCACCGCA |
| B8 | GTAGAAGAAACC |
| B9 | AGTCTTAGGAGT |
| BIO’ | GATCCGGCG |
I
-64-
Os nucleotídeos sintéticos estão apresentados entre parêntesis e descritos na Figura 14. Estes oligonucleotídeos foram sintetizados pelo método convencional de Crea et al., 1978, J. Biol. Chem 250:4592
t e Itakura et al., 1970, J. Am. Chem. Soc., 97:7327.
Alguns dos oligonucleotídeos foram usados para construir o gene da cadeia B da insulina humana anteriormente descrito por Crea, et al., 1978 e Goeddel et al.,1979. Dois oligonucleotideos B51 e B101) possuem locais de restrição Hpa II e Bam HI e Eco RI terminais. Os locais terminais
► são particularmente úteis para clonagem.
Os oito oligonucleotídeos H1-H8, usados anteriormente na construção da metade esquerda do gene da cadeia B da insulina humana (Goeddel, et a 1., 1979) contem a sequência codificadora dos aminoácidos 1-13 do gene da cadeia B e uma metionina adicional na terminação Ν. A metade direita do gene da cadeia B foi construída a partir dos oligonucleotídeos Bp B2, Bg, B^, Βθ, Βθ, By,
Βθ, Βθ e Β1θ por ligação usando a ligase do DNA de T4 b£ sicamente segundo os ensinamentos de Goeddel et al.,1979.
0 fragmento de gene resultante codifica os aminoácidos 14-13 da cadeia B da insulina humana e a primeira arginina da cadeia de ligação. Um local de restrição HpalI é incluído na sequência do gene na mesma fase de leitura e localização do local Hpa II do gene da insulina humana.
Após purificação do fragmento de gene ligado por electroforese em gel de poliacrilamida e após eluição da banda de DNA maior o fragmento foi inserido no plasmídeo pBR322 cortado com Hindi11- BamHI. 0 plasmídeo resultante designado pB3, foi inserido por transformação em E.coli k12 294.
0 plasmídeo conferiu resistência aos antibióticos ampicilina e tetraciclina e verificou-se conter a sequência de nucleotídeos pretendida.
Dois fragmentos, um fragmento
Hind III-Bam HI de 58 pares de bases do pB3 e um fragmento EcoRI-HindIII de 46 pares de bases de pBH1 (divulgado em Goeddel et al., 1979) foram ligados para produzir um fragmento tendo extremidades EcoRI e BamHI. Este fragmento foi convencionalmente ligado ao plasmideo pBR322 cortado com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI e o plasmideo resultante designado pIB3 foi então clonado em E.coli k12 294. Após expansão e isolamento convencionais, o plasmideo pIB3 foi digerido com EcoRI e Hpall para produzir um fragmento de gene sintético (Fragmento 1, Figura 15) que codifica os aminoácidos da terminação N da proinsulina precedido de uma metionina. 0 gene sintético foi isolado convencional, mente por electroforese em gel de poliacrilamida.
I. Isolamento de cDNA codificador dos 50 aminoácidos da terminação C da proinsulina humana
0 esquema para obtenção de cDNA pretendido está apresentado na Figura 16 dos desenhos juntos. De acordo com ele a sequência de DNA pCCGGATCCGGTTT^gT, que continha uma sequência de reconhecimento BamHI e um segmento 3' de ácido politimidi1ico de aproximadamente 20 residuos foi sintetizado e usado como iniciador para a transcriptase reversa de AMV na sintese do cDNA. 0 iniciador foi preparado usando transferase terminal de deoxinucleotidi_ los (Enzo Biochem., 200 unidades) com 1 junole do decanucleotj_ deo BamHI num volume de reacção de 0,6 ml contendo TTP 1,5x10“4 jjmol. A reacção foi conduzida a 37SC durante 1 hora no sistema tampão de Chang et aj_., 1978, Nature 275:
: 617.
0 tecido de insulinoma humano
foi fornecido pelo Instituto fur Diabetesforschung, Munchen
West Germany. Os fami1iarizados com a matéria sabem que o
tecido de insulinoma humano é de fácil obtenção e pode ser adquirido de uma série de fontes na comunidade médica. Isolou-se mRNA poli A (2,5 ug) do tecido de insulinoma humano essencialmente segundo o processo de Ullrich et al., 1977 Science 146:1313 e depois convertido em cDNA de cadeia dupla basicamente de acordo com os ensinamentos de Wickens et al 1978, J. Biol. Chem. 253:2483. Assim um volume de reacção de 80 ul contendo Tris.HCl 15 mM (pH 8,3 a 429C) KC1 21 mM MgCl2 8 mM, p-mercaptoetanol 30 mM, 2 mM do iniciador dCCGGATCCGGTT^gT e DNTPs 1 mM foi pré-incubado a 0sC. Após adição de transcriptase reversa de AMV a mistura foi incuba, da durante 15 minutos a 422C. 0 RNA/DNA resultante foi então desnaturado usando processos convencionais.
A cadeia de cDNA complementar foi sintetizada num volume de reacção de 150 yl contendo Tris-HCl 25 mM, pH 8,3, KC1 35 mM, MgCl2 4 mM, p-mercaptoetanol 15 mM, dNTPs 1 mM e 9 unidades de Polimerase I Klenow. A mistura foi incubada a 15QC durante 90 minutos seguido de 15 horas a 42C. A digestão com nuclease S1 foi então efectua. da durante 2 horas a 37SC usando 1000 unidades de nuclease S1 (Miles Laboratoires, Elkhart, Indiana), essencialmente de acordo com os ensinamentos de Wickens, et al.,1978. 0 cDNA de cadeia dupla (0,37 ug) foi sujeito a electroforese num gel de 8% de acrilamida e os fragmentos de DNA superiores a 500 pares de bases foram eluidos. Adicionou-se às extremidades 3' dos fragmentos resíduos oligodeoxicitidi1icos usando transferase terminal de deoxinecleotidilos substanci_ almente de acordo com o processo de Maizel, 1971, Meth. Virol 5:180. Os fragmentos de cDNA providos de caudas dC foram ein tão emparelhados com o pBR322 que tinha sido previamente digerido com a enzima de restrição PstI e depois provido de caudas com ácido deoxiguanidi1ico usando transferase terminal de deoxinucleotideos. Os plasmídeos resultantes foram usando para transformar E.coli K12 294 e as células resultantes semeadas em meio LB e TET. As colónias resisten-
tes â tetraciclina mas sensíveis â ampicilina foram isoladas e testadas relativamente aos plasmídeos possuidores de três locais de restrição Pst I. Tal padrão de restrição é indicador do gene da proinsulina, Sures et al., 1980 Science 208: :57. Um plasmídeo, designado pHI 104, possuía uma inserção de 600 pares de bases, deu o padrão de restrição Pst I esperado e continha um local Bam HI entre o poli A 3' e o poli GC introduzido durante a preparação de cDNA. Parte da sequência de nucleotideos da inserção está apresentada na Figura 14.
J. Formação de um gene codificador da proinsulina humana
0 esquema usado para formar um gene codificador da proinsulina humana está apresentado na Figura 15 dos desenhos em anexo.
0 segmento de gene sintético codificador dos primeiros 31 aminoácidos da proinsulina, fragmento 1 na Figura 15, foi recuperado a partir de 50 ,ug do plasmídeo pIB3 usando os endonucleases de restrição EcoRI e Hpall como descrito atrás. Este fragmento também contém a sequência ATG da metionina no lugar da pré-sequência da préproinsulina.
0 segmento de gene de cDNA codificador dos aminoácidos 32-86, assim como o sinal de paragem da tradução e a região 3' não traduzida do mRNA foi recuperado a partir de 40 jug do plasmídeo pHI104 por tratamento primeiro com a enzima de restrição BamHI e depois com a enzima de restrição Hpa11. Os dois fragmentos foram isolados por electroforese em gel de poliacrialamida seguido de electroeluição. Os fragmentos de gene foram ligados por tratamento com ligase do DNA de T4 em 20 ju 1 de tampão ligase a 49C durante 24 horas. A mistura foi diluída com 50 juí de
H^O, convencionalmente extraida com fenol e depois com cloro fórmio e em seguida, precipitada com etanol.
0 DNA resultante foi tratado
com as enzimas de restrição Bam Hl e Eco RI para regenerar estes locais e remover os polímeros de genes. 0 gene da proinsulina montado foi isolado por electroforese em gel de poliacrilamida e ligado (usando ligase do DNA de T4) ao plasmídeo pBR322 digerido com EcoRI e BamHI. 0 DNA resultante foi usado para transformar E.coli k12 294 e as colónias resultantes foram testadas relativamente â sensibilidade â tetraciclina e resisteficia à ampicilina. 0 plasmídeo pHI3 isolado a partir de uma dessas colónias, possuia o gene da proinsulina pretendido que foi subsequentemente caracterizado por análise da sequência de nucleotídeos.
k. Construção de um plasmídeo para expressão de uma proteína quimérica contendo a proinsulina humana
0 gene completo da proinsulina
humana, incluindo o codão da terminação N que codifica metio nina foi recuperado a partir do plasmídeo pHI3 por tratamento com as enzimas de restrição Eco RI e Bam Hl. 0 fragmento pretendido foi purificado por electroforese em gel e depois ligado (usando ligase do DNA de T4) ao plasmídeo
pS0M72Í2ô4 digerido parcialmente com Pst I-Eco RI (preparado no Exemplo 5 g) e ao maior dos fragmentos Pst I-Bgl II do plasmídeo pHKYIO (preparado no Exemplo 5 F). Assim cerca de 1 ,ug do gene completo da proinsulina humana com extremidades EcoRI e Bam Hl, 4 jug do fragmento Pstl-Eco RI (parcial) de pS0MÀ7Z2Z4 e cerca de 1 Dg do fragmen to Pst Ι-Bgl II de pHKYIO foram ligados a 42C durante 24 horas usando ligase do DNA de T4 em tampão de ligação. A mistura de DNA ligado foi usada para transformar E.coli k12 294. As colónias que cresceram em ampicilina e tetreciclina
foram seleccionadas e verificou-se conterem o plasmídeo pretendido ρΗΐΛ7Δ4 A1 e expressarem uma proteína com o peso molecular esperado para o produto da fusão LE1 do trp -proinsulina. 0 plasmídeo ρΗΙΑ744Δ1 que expressou a proteína atrás mencionada foi completamente caracterizado em relação â sequência do DNA e locais de restrição do gene incorporado e também do vector . 0 plasmídeo pH 1477 4 71 está descrito na Figura 15 dos desenhos em anexo e pode ser facilmente seleccionado devido â regeneração da resistência â ampicilina e tetrecidina.
EXEMPLO 6
Construção do plasmídeo pNM608 e de E.coli k12 RV308/pNM608
A. Construção do fragmento EcoRI-Hpa I «s?253 pb do plasmídeo ΡΗΙ7Δ 4 71
Cerca de 5 μ gde DNA do plasmídeo pH 1737 4 4Δ1, 10 jul de tampão de reacção * (10x), 80 μ 1 de água e 5 yl (6 unidades) da enzima de restrição Hpa I foram incubados a 372C durante cerca de 1 hora. A reacção terminou por incubação a 70sC durante 5 minutos. Após arrefecimento da mistura em gelo adicionaram-se 12 jul de Tris.HCl 1 M, pH 7,2, 7 41I de água e 1 yj 1 (10 unidades) da enzima de restrição EcoRI.
0 tampão de reacção (10x) para a enzima de restrição Hpal foi preparado com a seguinte composição:
Tris.HCl 100 mM, pH 7
MgCl2 100 mM
JB-mercaptoetanol 60mM
KC1 200 mM
A mistura resultante foi incubada primeiro a 379C durante 1 hora e depois a 709C durante 5 minutos. Após arrefecimento em gelo, o DNA resultante foi extraído com fenol, depois com clorofórmio: álcool isoamilico (24:1) e depois precipitado com etanol. 0 fragmento pretendido EcoRI-Hpa I253 pb foi convencionalmente separado por electroeluição em gel de poliacrialmida, recuperado por electroeluição e precipitação com EtOH e depois dissolvido em cerca de 10 jul de tampão TE e guardado a 09C para ser usado posteriormente.
B. Construção do fragmento Hpal-Tag In34 pb do plasmideo ΡΗΙΑ7Λ4Λ1
Cerca de 20 ug de DNA do plasmideo pHi Λ Δ 1 em 32 μΐ de tampão de reacção EcoRI* (5x), 124 yl de água e 4 ,ul da enzima de restrição EcoRI (20 unidades) foram incubados a 379C durante cerca de 1 hora. A reacção terminou por incubação a 709 durante 5 minutos. 0 fragmento Eco RI*J 862 pb resultante foi isolado por electroforese num gel de 6% de poliacrilamida seguido de electroeluição e precipitação com etanol. 0 fragmento foi então dissolvido em cerca de 100 jul de tampão Hpat contendo 16 unidades da enzima de restrição Hpal.
0 tampão de reacção (5x) para a enzima de restrição EcoRI foi preparado com a seguinte composição:
NaC1250 mM
Tris.HCl 500 mM, pH 7,2
MgCL2 25 mM
jP-mercaptoetanol 30 mM
Após 1,5 horas a 372C, adicionou-se 7,5 unidades da enzima de restrição Tag I, a incubação continuou durante mais 1,5 horas e os fragmentos resultantes separaram-se convencionalmente num gel de 7 72 % de poliacril amida. 0 fragmento pretendido Hpal-TagI r->34 pb foi recuperado por electroeluição e precipitação com etanol e em seguida dissolvido em 5 ju 1 de tampão TE.
C. Digestão do plasmídeo pBR322 com EcoRI-Clal
Cerca de 5 ,ug de DNA do plasmídeo pBR322, 10 y 1 de mistura de reacção Ciai * 77,5 ju 1 de água e 7,5 Dl (15 unidades) da enzima de restrição Cia I foram incubados a 37SC durante cerca de 1 hora. A reacção terminou por incubação a 702C durante 5 minutos. Após arrefecimento da mistura em gelo, adicionaram-se cerca de 12,5 ,ul de tris.HCl 1M, pH 7,2, 6,25 d1 de NaCl 1M, e 1 Dl (10 unidades) da enzima de restrição Eco RI. A mistura resultante foi incubada primeiro a 372C durante 1 hora e depois a 702C durante 5 minutos.
#
A mistura de reacção (10x) para a enzima de restrição Cia I foi preparada com a seguinte composição: Tris.Hcl 100 mM, pH 7,4
MgCl2 100 mM β-mercaptoetanol 60 mM
Após arrefecimento em gelo, o DNA resultante foi sujeito a electroforese num gel de 1% de agarose. 0 fragmento maior foi recuperado por eluição e precipitado com etanol e em seguida dissolvido em cerca de 20 jul de tampão TE e guardado a 09C até ser utilizado.
D. Ligação e Transformação
Cerca de 0,2 ,ug do fragmento
EcoRI-Hpaln 253 pb do Exemplo 6A, 0,5 ,ug do fragmento Hpal-Tagl do Exemplo 6B e 0,1 jug do produto de digestão com EcoRI-Clal do Exemplo 6C foram ligados e usados para transformar E.coli k12 RV308 essencialmente segundo os ensinamentos do Exemplo 2D.
Alguns dos transformantes resultantes, como convencionalmente mostrado por electroforese em gel de agarose (Maniatis et a 1 ., 1982) e outros testes continham apenas o plasmídeo pretendido 4,6 kb. Tal transformante aqui designado por E.coli k12 RV308/pNM608, foi seleccionado, semeado em agar Ty contendo os antibióticos adequados e depois cultivado usando técnicas de microbiologia de rotina. 0 plasmídeo pNM608 possui o fragmento EcoRI Ciai (Tag I) 287 pb do plasmídeo ρΗΐΔ7Δ4Δΐ sendo uma fonte preferida deste segmento.
73EXEMPLO 7
Construção do plasmídeo pCZ112 e de E.coli k12 RV308/pCZ112
A. Digestão do plasmídeo pNM608 com EcoRI-Clal e obtenção do fragmoto EcoRI-Tag 1^0,288 kb (o mesmo que para o fragmento EcoRI-Tag I do plasmídeo pHI -A 7 Δ4 Δ1 )
Cerca de 5 ug de DNA do plasmideo pNM608 em 50 ul de tampão "Médium Salt"*foram incubados com 10 unidades de cada uma das enzimas de restrição Eco RI e Cia I a 372C durante cerca de 1 hora.
Após adição de 5 ul de acetato de sódio 3M pH 7,0, o DNA foi precipitado com 3 volumes de etanol a 100%. 0 produto da digestão de DNA pretendido foi dissolvido em 100 ul de tampão TE e guardado a 02C até ser usado.
* 0 tampão "Médium Salt" composição:
NaCl 50 mM
Tris.HCl 100 mM, pH 7,6 MgCl^ 6 mM
p-mercaptoetanol 2 mM
foi preparado com a seguinte
-74B. Construção da sequência de DNA adaptador
| CGACC ATG | GAT GAT AAG | TTT 1 1 I AAA | CCG ι ι t GGC | GCT ATG TCT | CTG 1 1 1 GAC | |||||
| I f ! TGG | 1 1 ! TAC | 1 V 1 CTA | I f 1 CTA | f 1 1 TTC | I 1 1 CGA | ! 1 1 TAC | t I í AGA | |||
| TCC | GGC | CTG | TTT | GCC | AAC | GCT | GTGCT 3 | 1 | ||
| 1 1 1 AGG | 1 1 1 CCG | 1 1 1 GAC | ! 1 1 AAA | ι ι i CGG | 1 1 1 TTG | 1 1 1 CGA | 1 1 1 1 C | f 5 | ! |
A sequência adaptadora pretendida é sintetizada convencionalmente pelo método fosfotriéster modificado essencialmente segundo os ensinamentos de Itakura et al., 1977 e Crea et a 1 ., 1978. 0 referido método de sintese está também especificamente ilustrado no Exempfol.
C. Ligação e transformação
Cerca de 20 picomoles do DNA
adaptador do Exemplo 7B, 1 /jg do pNM608 digerido do Exemplo 7A, 0,5 yg do fragmento BamHI-EcoRIM1O,2 kb do plasmídeo pCZ101 (preparado de acordo com os ensinamentos do Exemplo 2B exceptuando a utilização da enzima de restrição EcoRI e do tampão adequado em vez da enzima de restrição BamHI e tampão) e 1 yg do fragmento BamHI -HgiAI 0,6 kb do plasmídeo pCZ101 do Exemplo 3B são ligados e o plasmídeo resultante usado para transformar E.coli k12 RV308 básicamente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 2D.
Alguns dos transformantes resultantes, conforme demonstrado convencionalmente por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al.,1982) e outros
testes, possuem apenas o plasmídeo pretendido 6J10,8 kb.
Tais transformantes, aqui designados por E.coli k12 RV308/ /pCZ112, seleccionados, semeados em agar contendo os antibi óticos adequados e depois cultivado usando técnicas de microbiologia convencionais. As células resultantes expressam niveis elevados do referido derivado MET-ASP-ASP-LIS-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel de SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZ112 possui um replicão "que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 372C.
EXEMPLO 8
Construção do plasmídeo pAT1 e de E.oal i k12 RV308/pAT1
As construções pretendidas são produzidas essencialmente segundo os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 7 pela sequência de DNA adaptador
5' CGACA ATG TTC CCA GCT ATG TCT CTA TCT GGT
III III III III III III III III III III
3' TGT TAC AAG GGT CGA TAC AGA GAT AGA CCA
CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'
III III III III III I
GAC AAA CGG TTG CGA C 5’
A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída essencialmente de acordo com o processo convencional
de Itakura et al., 1977 e Crea et al.,1978. 0 referido
método de sintese está também especificamente ilustrado
no Exemplo 1.
Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli k12 RV308/pAT1, são semeados em agar Ty contendo os antibióticos adequados e em seguida cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pAT1. Os transformantes expressam niveis elevados do referido derivado MET-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pAT1 possui um replicão "que se escapa" termoinduzivel, a expressão máxima do produto pretendido derivado de bgH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37SC.
EXEMPLO 9
Construção do plasmídeo pASP1 e de E.coli KR 308/pASP1
As construções pretendidas são feitas substancialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 7 pela sequência de DNA
5' CGACC ATG GAT TTT CCG GCT ATG TCT CTG TCC GGC CTG
III III III III III III III III III III III III
3' TGG TAC CTA AAA GGC CGA TAC AGC GAC AGG CCG GAC
TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'
iii iii iii iii ι
AAA CGG TTG CGA C 5'
A sequência adaptadora acima
especificada pode ser construída essencialmente segundo o processo convencional de Itakura et al., 1977 e Crea et al., 1978. 0 referido método de síntese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.
Os transformantes pretendidos aqui designados por E.coli k12 RV308/pASP1 são semeados em agar Ty contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pASP1. Os transformantes expressam niveis elevados do referido derivado MET-ASP-bGH, confor me demonstrado por electroforese em gel de SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pASP1 contem um replicão "que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 379C.
EXEMPLO 10
Construção do plasmídeo pASP2 e de E.coli k12 RV308/pASP2
As construções pretendidas são feitas essencialmente segundo os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 7 pela sequência de DNA
5' CQATC ATG GAT TTT CCG GCT ATG TCT CTG TCC GGC CTG
lll lll lll III lll lll lll lll lll lll I I I 11’
3' TAG TAC CTA AAA GGC CGA TAC AGA GAC AGG CCG GAC
TTT GCC AAC GCT GTGCT 3' iii iii iii iii ι
AAA CGG TTG CGA C 5’
Ά sequência adaptadora acima
especificada pode ser construída substancialmente de acordo com o processo convencional de Itakura et al.1977 e Crea et al., 1978. 0 referido método de sintese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.
Os transformantes pretendido, aqui designados por E.coli k12 RV308/pASP2 são semeados em agar Ty contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmideo pASP1. Os transformantes expressam niveis elevados do referido derivado MET-ASP-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel de SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmideo pASP2 possui um replicão "que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37eC.
EXEMPLO 11
Construção do plasmideo pAT2 e de E.coli k12 RV308/pAT2
As construções pretendidas são feitas essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 3 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 3C pela sequência de DNA adaptador
5'
3’
CTAGAGGGTATTAATA ATG TTT CCA GCT ATG rtiritiititi iii iii ιιι ιτι τ t t TCCCATAATTAT TAC AAA GGT CGA TAC
TCT CTA TCT III ιιι III AGA GAT AGA
GGT CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT
III III III
CCA GAC AAA
ιιι ιιι ιιι ι CGG TTG CGA C
3'
5'
A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída essencialmente de acordo com o processo convencional de Itakura et al., 1977 e Crea et al., 1978. 0 referido método de sintese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.
Os transformantes pretendidos, aqui designados por E. coli k12 RV308/pAt2, são semeados em agar Ty contendo os antibióticos adequados e depois convencionalmente cultivados para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pAT2. Os transformantes expressam niveis elevados do referido derivado ΜΕΤ-bGH conforme demons trado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pAT2 contem um replicão "que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 372C.
EXEMPLO 12
Construção do plasmideo pCZ154 e de E.coli k12 RV308/pCZ154
As construções pretendidas foram feitas essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 7 pela sequência de DNA adaptador
-80-
TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’
»11 » t I lll t | | ,
AAA CGG TTG CGA C 5'
A sequência adaptadora acima
especificada pode ser construida essencialmente segundo o processo convencional de Itakura et a 1 ., 1977 e Crea et al., 1978. 0 referido método de sintese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.
Os transformantes pretendidos,
aqui designados por E.coli k12 RV 308/pCZ154, foram semeados em agar Ty contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pCZ154. Os transformantes expressam niveis elevados do derivado acima mencionado MET-VAL-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZ154 possui um replicão "que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 379C.
EXEMPLO 13
Construção do plasmideo
pCZ155 e de E.coli k12
RV308/pCZ155
As construções pretendidas foram feitas substaneialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 7 pela sequência de DNA adaptador
5'
'3'
CGACC ATG GCT TTT CCG
lll lll lll lll III
TGG TAC CGA AAA GGC
GCT ATG TCT CTG TCC iii lll iii Iii iii CGA TAC AGA GAC AGG
GTC CTG
lll lll
CAG GAC
TTT GCC AAC GCT GTGCT iii r ι f iii iii ι AAA CGG TTG CGA C
3'
5'
A sequência adaptador acima especificada pode ser construída essencialmente segundo o processo convencional de Itakura et aI.,1977 e Crea et a 1., 1978. 0 referido método de sintese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.
Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli k12 RV308/pCZ155, foram semeados em agar Ty contendo os antibióticos adequados e em seguida cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmideo pCZ155. Os transformantes expressam niveis elevados do derivado acima mencionado MET-ALA-FEN-PrO-ALA-MET-SER-LEU-SER-VAL-b1GH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmideo pCZ155 possui um replicão "que se escapa" termoinduzível a expressão máxima do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca
de 37eC.
EXEMPLO 14
Construção do plasmideo pCZ156 e de E.coli k12
RV308/pCZ156
As construções pretendidas foram feitas essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptador do Exemplo 7 pela sequência de DNA adaptador
5' CGATA ATG GAT TTT CCG GCT ATG TCT CTG TCC GGC CTG' iii iii iii iii iii iii iii iii ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι
3' TAT TAC CTA AAA GGC CGA TAC AGA GAC AGG CCG GAC
TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'
I I I I I I III III I
AAA CGG TTG CGA C 5’
A sequência adaptadora acima
especificada pode ser construída essencialmente segundo o processo convencional de Itakura et al., 1977 e Crea et al., 1978. 0 referido método de sintese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.
Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli k12 RV308/pCZ156, foram semeados em agar Ty contendo os antibióticos adequados e em seguida cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmideo pCZ156. Os transformantes expressam niveis elevados do derivado acima mencionado MET-ASP-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA
e outros testes. Porque o plasmídeo pCZ156 possui um replicão "que se escapa" termoinduzivel, a expressão máxima
do produto pretendido derivado de bGH ocorre a temperaturas
de cultura de cerca de 37-C.
EXEMPLO 15
Construção do plasmídeo pCZ103 e de E.coli k12 RV308/pCZ103
Dezjjg do plasmídeo pCZ101 foram dissolvidos em 10 ju 1 de tampão de reacção Bst Ε II 10x (NaCl 1,5M, Tris.HCl 60 mM, pH 7,9; MgCl2 60 mM; p-mercaptoetanol 60 mM; e 1 mg/ml de BSA) 2 ju 1 (^20 unidades) da enzima de restrição Bst Ε II e 88 jul de H20 e a mistura de reacção resultante foi incubada a 60sC durante duas horas. Após extracções com fenol e clorofórmio, várias precipitações do DNA com etanol foram feitas a partir de uma solução de NaOac 0,25 M.
Cerca de 0,1 /jg de DNA do plasmideo pCZ101 digerido ccrn Bst Ε II foi suspenso em 1C0 μ1 de tampão ligase. Após adição de 100 unidades de ligase do DNA de T4 e incubação a 165C durante 2 horas, o DNA ligado foi usado para transformar convencionalmente E.coli k12 RV308. Os transformantes E.coli k12 RV308/pCZ103 foram seleccionados em canamicina e identificados por análise com enzimas de restrição do DNA dos seus plasmideos. 0 plasmideo pCZ103 foi isolável a partir dos transformantes essenciaj. mente segundo o processo do Exemplo 2A.
-84-
EXEMPLO 16
Construção de vectores derivados do plasmídeo pCZ103 para expressão de derivados da hormona de crescimento bovina
Uma vez que a delecção de Bst Ε II feita na construção do plasmídeo pCZ103 não afecta a sequência codificadora da proteína bGH, os plasmídeos derivados do plasmídeo pCZ103 do presente invento, expressam o mesmo derivado de bGH que as suas contrapartes derivadas do plasmídeo pCZ1O1.
Uma vez que os plasmídeos deriv£ dos de pCZ103 do presente invento foram construídos básicamente segundo os ensinamentos dos Exemplos em que foram construídas as contrapartes derivadas de pCZ1O1, é apresentada a Tabela 3 para sumarizar rápidamente a construção dos plasmídeos derivados de pCZ103. A Tabela 3 tem registado o plasmídeo derivado de pCZ103, o Exemplo correspondente ensinando a construção da contraparte derivada de pCZ101 e o tamanho do único fragmento de DNA diferente envolvido na construção.
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| Φ | φ | ΙΛ ΙΛ | Ι-Η | ιϋ ιϋ | ίϋ | ΙΛ | ·ι-1 | • rH | ίο ι ·ι-ι | |
| ε | Ρ | 1 Φ | Ο Ρ m | Η | 1 | Ρ | ε | ρ ι-ι ε | ||
| C0 φ | ο Ρ | f0 | Φ 4- | α. | ο | -Ρ | </? | 4- X ω | ||
| ίϋ | 4- | ο | -Q | [X ο | Ο | ω | ίθ | ε|<ο | ||
| Ρ | •ιΗ | ΙΛ φ | X | -Í Ο !ίϋ | ο | ΙΛ | Φ | r~H | ο ΟΗ | |
| U. | X | X XI | ε χ χχ | X | Ρ | Ο.Χ 03|Ο. |
φ
-ρ
C φ σ c ο ο ω.
I—J (/)
CL φ
ε ρ Φ Ρ X ο LU Ο
φ
•σ
ο
η
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>
ρ οο ο ο -ρ «U ΓΜ φ ο > ο.
co σι
CM 00 'd-
| 00 • | 00 • | 00 | 00 | οο | 00 | οο | ΟΟ • |
| τ— | CM | τ— | CM | <ϋ· | ιη | ιη | |
| £3£ | ί— | Ρ- | £3- | Ο- | LO | ιη | ιη |
| X | < | < | CZO | to | Τ— | ’Τ— | Τ— |
| Ο. | ο. | ο. | < | < | Μ | Μ | Μ |
| Ο. | Ο. | Ο | Ο | Ο | |||
| Ο· | Ω. | Ω. |
-86-
Os plasmídeos derivados de
pCZ103 foram usados para transformar convencionalmente E.coli k12 RV308. Os transformantes resultantes expressam os derivados de bGH acima mencionados. Porque os plasmídeos derivados de pCZ103 possuem um replicão "que se escapa" termoinduzível a expressão máxima ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37SC.
,ÚKTUGAI
9.^-
Claims (2)
1) a transformação de uma célula competente com um vector de expressão de DNA recombinante semeccionável e de replica ção autónoma o qual inclui
a) um replicão "itinerante"
b) uma sequência activadora da transcrição e tradução que estã na mesma fase de leitura de uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo funcional, a referida sequência codificadora do polipetideo funcional contendo
um sinal de paragem da tradução situado imediatamente adjacente e a jusante do tripleto de nucleotídeos que codifica
-100-
a terminação carboxilo do referido polipeptídeo funcional e
-88
ou
(5)
5'
3'
5'
3’
(6)
em que
A é deoxiacfenilo,
B é deoxiguanilo,
C é deoxicitosilo,
T é timidilo,
R é uma sequência de DNA que codifica os aminoácidos 9(leucina) a 191 (fenilalanina) da hormona de crescimento bovina 1
e R é uma sequência de DNA que codifica um sinal de paragem da tradução o qual é
2a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência activadora da transcrição ser a sequência activadora da transcrição da lactose de _E. coli PL0L do bacteriófagoX PR0R do bacteriofago V· tac, lipoproteina de J[. coli ou triptofano de E. coli.
3a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o vector ser um plasmídeo.
4a. - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a sequênciza activadora da tradução ser a sequência da lipoproteina de E. coli.
5a. - Processo de acordo com a
reivindicação 4 para a preparação do plasmideo pCZ1920 carac
terizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-Xbal /v
10,2kb do plasmideo pCZ101, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos
5' CTAGAGGGTATTAATA ATG AAA
| | | | | I | I I I I I I I l · · · · · 1 1
3' TCCCATAATTAT TAC TTT
ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT
ιιι III III J I l I » · ‘ · 1 · * 1
TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA
GGG AAT TCT ATG GCC TTC CCA GCC
III ιιι III ιιι II· · · · 1 ’ 1 1 1 ’
CCC TTA AGA TAC CGG AAG GGT CGG
GCC AAC GCT GTGCT 3'
III III ι l.l ·
CGG TTG CGA C 5'
e o fragmento BamHI-Xbal ’ν/Ο,β kb do plasmideo pCZ101.
6a. - Processo de acordo com a reivindicação 4 para a preparação do plasmideo pJR1 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento Bam-HI-Xbal 10,2kb do plasmideo pCZ1O1, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos.
5' CTAGAGGGTATTAATA ATG TTT CCA GCC ATG GCT CTA TCT GGT
l ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ιιι lil ιιι ΙΙΙ III II» III >11 II·
3' TCCCATAATTAT TAC AAA GGT CGG TAC CGA GAT AGA CCA
CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'
ιιι ιιι ιιι ιιι ιιι I
GAC AAA CGG TTG CGA C 5*
e o fragmento BamHI-Xbal /v 0,6kb do plasmideo pCZIOl.
-91-
7ã. - Processo de acordo com a
reivindicação 4, para a preparação do plasmideo pAT2 carac- , terizado por se fazer a ligação do fragmento BamHi-Xbal 10,2 kb do plasmideo pCZ101, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos.
5'
3'
CTAGAGGGTATTAATA ATG
I I I I I I I I I I I I I I I > > * *
TCCCATAATTAT TAC
TTT CCA GCT ATG
lll lll lll lll
AAA GGT CGA TAC
TCT CTA TCT GGT
lll lll lll lll
AGA GAT AGA CCA
CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’
lll lll lll lll 11' '
GAC AAA CGG TTG CGA C 5’
e o fragmento BamHi-Xbal (\j0,6 kb do plasmideo pCZ101.
83. - Processo de acordo com a reivindicação 4 para a preparação do plasmideo pJR1.3 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHi-Xbal td 9,3kb do plasmideo pCZ102, um DNA adaptador tendo a sequência de nuleotideos
5' CTAGAGGGTATTAATA ATG TTT CCA GCC ATG GCT CTA TCT GGT
ι ι I I I I I I I I I I I I I I lll lll lll lll lll j | , | | | , , , , , ,
3' TCCCATAATTAT TAC AAA GGT CGG TAC CGA GAT AGA CCA
CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3*
I I lll lll lll lll I
GAC AAA CGG TTG CGA C 5'
e o fragmento BamHi-Xbal 0,6kb do plasmideo pCZ101.
9S. - Processo de acordo com a
reivindicação 3 caracterizaso por a sequência activadora
92
da tradução ser a sequência do triptofano de E.coli.
10â. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pCZ112
I caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-Eco RIMl0,2kb do plasmídeo pCZ101, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos.
e o produto da digestão do plasmídeo NM608 com EcoRI-Clal.
11â. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pAT1 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI do plasmídeo pCZ 101«J1052kb um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos
e o produto da digestão do plasmídeo NM608 com EcoRI-Clal.
-93-
12â. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação de plasmídeo pASP1 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI
10,2kb do plasmídeo pCZ1O1 um DNA adaptador tendo a seí quência de nucleotídeos
e o produto
da digestão
do plasmídeo
NM608 com EcoRI-Clal.
135. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pASP2 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI /v 10,2kb do plasmídeo pCZ101, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos
3·
CGATC ATG GAT TTT CCG GCT ATG TCT CTG
lll iii l l I U I » » I » » · · · · · · · · ♦ ·
TA6 TAC CTA AAA GGC CGA TAC AGA GAC
TCC GGC CTG
lll lll lil
AGG CCG GAC
TTT GCC AAC GCT lll iii I « · · · · AAA CGS TTG CGA
e o produto da digestão do
GTGCT 3' ι
C 5·’
plasmídeo NM608 com EcoRíClal.
14â. - Processo de acordo com a
reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pCZ154 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI
¢^10,2 kb do plasmídeo pCZIOl, um DNA adaptador tendo a
sequência de nucleotideos
e o produto da digestão de NM608 com EcoRI-ClaI.
152. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pCZ155 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI <Ol0,2kb do plasmídeo pCZ101, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotideos
e o produto da digestão de NM608 com EcoRI-Clal.
16s. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pCZ156 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI <s)10,2 kb do plasmídeo pCZ101, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotideos
e o produto da digestão do NM608 com EcoRI-Clal.
17a. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pAT2.3 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI /C9,3kb do plasmídeo pCZ103, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotideos
e o fragmento BamHI-Xbal 0,6kb do plasmídeo pCZ1O1.
18a. - Processo de acordo com a
reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pAT1.3 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI
ί^9,3kb do plasmídeo pCZ103, um DNA adaptador tendo a sequên
cia de nucleotideos
e o produto da
digestão do
plasmideo NM608 com EcoRI-Clal.
19a. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmideo pASP1.3 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI tJ9,3kb do plasmideo pCZ103, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleótideos
5’ CGACC ATG GAT TTT CCG GCT ATG TCT CTG TCC GGC CTG
III III III III III I » I III III «II ’ · · · ' · 1 · ’
3’ TGG TAC CTA AAA GGC CGA TAC AGC 6AC AGG CCG GAC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’
III lli III III I
AAA CGG TTG CGA C 5'
e o produto da digestão do plasmideo NM608 com EcoRI-Clal.
20a. - Processo de acordo com a
reivindicação 9 para a preparação do plasmideo pASP2.3
caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI «í 9,3 kb do plasmideo pCZ103, um DNA adaptador tendo
a sequência de nucleótideos.
5'
3'
CGATC ATG GAT TTT III lll lll lll TAG TAC CTA AAA TTT GCC AAC GCT
lll lll lll lll
AAA CGG TTG CGA
e o produto
da digestão
I
C 5'
CTG TCC GGC CTG
lll lll lll II»
GAC ÁGG CCG GAC
do plasmideo NM608 com EcoRI-Clal.
212. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmideo pCZ154.3 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI «39,3 kb do plasmideo pCZ103, em DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos
5‘ CGACC ATG GTT TTT CCG
III lll lll lll lll
3* TGG TAC CAA AAA GGC
TTT GCC AAC GCT GTGCT
lll lll lll lll I
AAA CGG TTG CGA C
e o produto da digestão do plasmideo NM608 com EcoRI-Clal.
222. - Processo de acordo com a
reivindicação 9 para a preparação do plasmideo pCZ155,3
caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI fj 9,3kb do plasmideo pCZ103, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos
5’ CSACC ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTG TCC GTC CTG
III III III III III III III III III III III III
3' TGG TAC CGA AAA GGC CGA TAC AGA GAC AGG CAG GAC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’
III III III III I · *
AAA CGG TTG CGA C 5’
e o produto da digestão de NM608 com EcoRI-CIal.
23a. - Processo de acordo com a reivindicação 9 para a preparação do plasmídeo pCZ156.3 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-EcoRI fJ 9,3kb do plasmídeo pCZ103, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos
5' CGATA ATG GAT TTT CCG III III III I ι ’ · · 1
3I TAT TAC CTA AAA GGC
TTT GCC AAC GCT GTGCT III III III I·· ·
AAA CGG TTG CGA C
GCT ATG TCT CTG TCC GGC CTG
iii iii iii il· · 1 · 1,1 1,1
CGA TAC AGA GAC AGG CCG GAC
3'
5'
e o produto da digestão de NM608 com EcoRI-Clal.
24a. - Processo para a preparação de um plasmídeo adequado à utilização no processo de qualquer uma das reivindicações 8 e 17 a 23 caracterizado por se fazer o tratamento do plasmídeo pCZ1O1 com a enzima de restrição BstEII, a purificação de DNA assim obtido e a ligação do DNA purificado para produzir o plasmídeo
PCZ103.
25a. - Método para aumentar a produção de leite em vacas caracterizado por se fazer a administração às referidas vacas de um derivado da hormona de crescimento bovina codificado pelo gene incluído no vector produzido pelo processo de qulquer uma das reivindicações 1 a 23 exclusivo da hormona metionilo de crescimento bovina, numa quantidade eficaz de cerca de 0,05 a cerca de 100.000 microgramas por animal por dia.
26a. - Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por a quantidade eficaz ser de cerca de 5 a cerca de 25.000 microgramas por animal por dia.
27a. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a quantidade eficaz ser de cerca de 500 a cerca de 5000 microgramas por animal por dia.
28a. - Método para a produção
de uma especie intracelular altamente homogénea de granulo proteico, caracterizado por compreender:
2) a cultura da célula transformada em condições de crescimento adequados para expressão do gene a activação ou indução do referido replicão "itinerante".
29a. - Método de acordo com
a reivindicação 28, caracterizado por o vector de expressão de DNA recombinante ser um plasmídeo.
30a. - Método de acordo com a
reivindicação 28 ou 29 caracterizado por a sequênciaz activadora da transcrição ser a sequência activadora da transcrição do triptofano de E.coli, a sequência activadora da transcrição do lipoproteina de coli., a sequência activadora da transcrição da lactose de ji. coli, a sequência activadora da trasncrição do PL0L do bacteriófago K ou a sequência activadora da transcrição de PR0R do bacteriófago
t·
31a. - Método de acordo com a reivindicação 28, 29 ou 30 caracterizado por a sequência activadora da transcrição compreender uma ou mais sequências activadoras da transcrição de E.coli em tandem.
32a. - Método de acordo com a reivindicação 30 caracterizado por a sequência activadora da transcrição ser a sequência activadora da transcrição do triptofano de E.coli ou a sequência activadora da transcrição da lipoproteina de E.coli.
33a. - Método de acordo com
qualquer uma das reivindicações 28 a 32 caracterizado por a sequência codificadora do polipeptídeo funcional ser uma sequência que codifica a hcrmona de crescimento bovi-101na, ou hormona de crescimento humano, a hormona de pré-crescimento humano, a hormona de crescimento porcina, a hormona de crescimento de mamíferos, a hormona de crescimento a/iária a cadeia A da insulina humana, a cadeia B da insulina humana, a pro-insulina humana, a pre-pro-insulina humana, interferão, urocinase, activador do plasminogénio de tecido humana, factor de libertação da hormona de crescimento ou interleuquina II.
34a. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33 caracterizado por o plasmídeo pCZ1920, pJR1, pCZ112, pAT1, pAT2, pASP1, pASP2 PCZ201, pJR1,3, pAT1,3, pAT2,3, pASP1,3, pASp2,3, pCZ154,3 pCZ155,3, ou pCZ156,3.
35a. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34 caracterizado por a célula hospedeira transformada ser uma célula procariótica.
36a. - Método de acordo com a reivindicação 35 caracterizado por a célula transformada ser E.coli.
37a. - Método de acordo com a reivindicação 36 caracterizado por a célula transformada ser E.coli k12 RV308.
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