PT811074E - Metodos e composicoes de terapia genica para o tratamento de defeitos no metabolismo lipoproteico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES DE TERAPIA GÉNICA PARA 0 TRATAMENTO DE DEFEITOS NO METABOLISMO LIPOPROTEICO"

Esta invenção foi financiada pelo National Institute of Health Grant N° DK 42193-05 e HD 29946. O governo dos Estados Unidos possui direitos nesta invenção.

Campo da invenção A presente invenção refere-se ao campo da terapia génica somática e tratamento de desordens genéticas relacionadas com o metabolismo lipoproteico.

Antecedentes da Invenção 0 metabolismo de lipidos, particularmente colesterol, envolve a interacção de um número de lipoproteinas e apolipoproteinas. Lipoproteina de muito baixa densidade (VLDL) e apolipoproteina E (apoE) são moléculas precursoras chave na produção de lipoproteina de baixa densidade (LDL) e no metabolismo geral de lipidos, incluindo colesterol. LDL é a lipoproteina principal de transporte de colesterol no plasma humano.

Os receptores de VLDL/apoE são expressos no coração, músculo esquelético, e tecido adiposo [F.M. Wittmaack et al., Endocrinol., 136(1): 340-348 (1995)] com baixos níveis de expressão no rim, placenta, pâncreas, e cérebro. Foi sugerido que este receptor desempenha um papel na incorporação de partículas de lipoproteinas ricas em triglicéridos por orgãos específicos. O ADNc codificante para o receptor de VLDL humano putativo foi recentemente clonado [M.E. Gafvels et al., Som. Cell Mol. Gsnet., 19: 557-569 (1993), aqui incorporado por 1 referência. 0 receptor para LDL está localizado em depressões revestidas na superfície das células no fígado e outros orgâos.

Como apresentado na Fig. IA, num humano normal saudável, as moléculas de apclipoproteína B48 (Apo-B48) , apolipoproteína C-II (Apo-C-II) e Apo E formam uma partícula quilomicron no plasma passando através rios intestinos, que interactua com um receptor de qui lorri cr cr. que permanece no fígado. Após metabolismo dos quilomicror. terra cus pelo receptor que permanece, o fígado produz a lipoprotoí r.a primária, VLDL, que contém Apo-E, Apo-C-II e apolipoproteína B100 (Apo B100) . VLDL é metabolizada em LDL, que se liga ao receptor de LDL no fígado através de Apo B100. O receptor de LDL r.o fígado facilita a incorporação de LDL por endocitose mediada por receptor. LDL é degradada em lisossomas, e o seu colesterol é libertado para utilização metabólica.

Defeitos no metabolismo de tais lipoproteínas e/ou receptores resultam em várias desordens metabólicas. A doença humana familiar hipcrcolesterolémia (FH) é causada em primeiro lugar por uma ou nais mutações no gene que codifica o receptor de LDL. FH é caraoterizada clinicamente por (1) uma elevada concentração de LDL; (2) deposição de colesterol derivado de LDL em tendões e pele (xantomas) e em artérias (ateromas); e (3) herança como uma característica autossómica dominante com um efeito de dosagem de gene. Indivíduos com FH desenvolvem doença coronária do coração prematura, normalmente na infância. Os heterozigóticos contabilizam cerca de 1 em 500 pessoas, colocando FH entre os erros congénitos mais comuns de metabolismo. Os heterozigóticos possuem subidas de duas vezes no colesterol do plasma (350 a 550 mg/dL) a partir do nascimento e tendem a desenvolver xantoma do tendão e aterosclerose coronária após os 20 anos de idade. Os hornozigóLicus constituem 1 pessoa num milhão e são caracterizados por hipercolesterolémia severa (650 a 1000 mg/dL), xantoma cutânea que surge durante os primeiros 4 anos de vida e doença coronária do coração que se inicia na infância e frequentemente provoca a morte antes dos 20 2 anos de idade. [J. Goldstein et ai, "Familial Hypercholesterolemia", Capitulo 48, em The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6a ed., C. R. Scrivers et al (eds) , McGraw-Hill Information Services Co., NY, NY, (1989) pp. 1215-1250].

Outra desordem metabólica é a hiperlipidemia familiar combir.adc (FCH) que foi primeiro aooociada com α hiperlipidemia em sobreviventes de enfarte do miocárdio e seus familiares. Os doentes de FCH geralmente possuem um de três fenótipos: (1) niveis elevados de VLDL, (2) níveis elevados de LDL, ou (3) aumentos nos niveis de ambas as lipoproteinas no plasma. Ao contrário da FH, a FCH surge em apenas 10 a 20 por cento dos doentes na infância, normalmente sob a forma de hipertrigliceridemia. A homozigotia para a caracteristica pode resultar em hipertrigliceridemia severa. [J. Goldstein et al, "Disorders of the Biogenesis and Secretion of Lipoproteins", Capítulo 44B em The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6a ed., C. R. Scrivers et al (eds), McGraw-Hill Information Services Co., NY, NY, (1989) pp. 1155-1156]. Esta desordem também está associada com o aparecimento de intolerância a glucose e obesidade num número de indivíduos. A anormalidade mais surpreendente da FCH é a subida acentuada do conteúdo em VLDL no plasma. A produção aumentada de VLDL leva a um teor expandido de VLDL no plasma em alguns indivíduos, mas noutros com lipólise mais eficiente resulta em níveis aumentados de LDL. A FCH caracteriza-se por uma produção excessiva de LDL, mais do que por um defeito genético no receptor de LDL. Os receptores de LDL de fibroblastos em cultura parecem ser normais em doentes com FCH. A experiência clínica sugere que a FCH seja pelo menos cinco vezes tão predominante como a FH, ocorrendo em cerca de 1 por cento da população norte americana. A predilecção em relação a doença de artéria coronária entre os doentes com esta desordem torna-a na causa metabólica conhecida mais proeminente de aterosclerose prematura [J. Goldstein et al, citado acima]. 3

Quando os receptores de LDL são deficientes como em FH (ver Fig. IB; , ou é produzido LDL em excesso devido a excesso de VLDL como em FCH, a remoção eficaz de LDL do plasma pelo fígado diminui c o r.ível de LDL aumenta na proporção inversa do número de receptores. 0 excesso de LDL no plasma é depositado em tpri Hrc π ; uru; ivos e em células de manutenção, resultando nos sintcrui;· c·.· qualquer das desordens.

Fresontoner.te, o tratamento para FH e FCH é dirigido para a diminuiçã: :r rivel de LDL no plasma através da administração de fármaeor, administração combinada de uma resina de ligação a ácido r;i.ur e um inibidor de redutase de 3-hidroxi-3-metilgiut ar; i CoA para o tratamento de FH e niacina para o tratamento ce FCH. Contudo, homozigóticos de FH com dois genes não fun--.on.iis sãc resistentes a fármacos que actuam através da estimulação do receptores de LDL. De modo semelhante, tais fármacos não são particularmente eficazes em FCH. Em homozigóticos de FH os níveis de LDL no plasma podem ser reduzidos apenas através de meios físicos ou cirúrgicos. A administração de genes receptores de LDL normais através de terapia génica utilizando um vector de adenovírus tem sido contemplada para o tratamento de FH. Os vectores de adenovírus são capazes de proporcionar níveis extremamente elevados de distribuição transgénica a virtualmente todos os tipos de células, independentemente do estado mitótico. A eficácia deste sistema na distribuição de um transgene terapêutico in vivo que complementa um desequilíbrio genético foi demonstrada em modelos animais de várias desordens [K. F. Kozarsky et al, Somatic Cell Mol. Genet., 19:449-458 (1993) ("Kozarsky I"); K. F. Kozarsky et al, J. Biol. Chem., 269:13695-13702 (1994) ("Kozarsky II); Y. Watanabe, Atherosclerosis, 36:261-268 (1986); K. Tanzawa et al, FEBS Letters, 118(1):81-84 (1980); J.L. Golasten et al New Engl. J. Med., 309:288-296 (1983); S. Ishibashi et ai, J. Clin. Invest., 92:883-893 (1993); e S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 93:1885-1893 (1994)]. A 4 utilização de vectores de

adenovírus na transdução de genes para hapatócitos in vivo foi anteriormente demonstrada em roedores e coelhos [ver, p. ex., Kozarsky II, citado acima, e S. Ishibashi et al, J. Clin. Invest., 92:883-893 (1993)].

Estudos recentes demonstraram que a introdução de um adenovírus recombinante codificando para o ADNc do receptor de LDL humano ("LDLR") nos fígados de coelhos deficientes no receptor de LDL Watanabe hiperlipidémicos hereditários (WHHL), que mimetizam a condição de FH, resultando em grandes reduções transientes no colesterol do plasma. A natureza transiente do efeito de adenovírus recombinantes na maioria das situações é atribuída ao desenvolvimento das respostas imunitárias celulares às células infectadas com virus e à sua subsequente eliminação. Os alvos antigénicos para remoção mediada por processo imunitário são proteínas virais expressas a partir do genoma virai recombinante e/ou o produto do transgene, que neste caso é a proteína receptora de LDL [Y. Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 91:4407-4411 (Maio de 1994); Y. Yang et al, Immun., 1:433-442 (Agosto de 1994)].

Adicionalmente, reinfusões repetidas do adenovírus contendo o gene de LDLR não produziram reduções de colesterol semelhantes subsequentes, devido ao desenvolvimento de anticorpos anti-adenovírus neutralizantes [Kozarsky I e Kozarsky II, citados acima; ver também Y. Yang et al, Immun., 1:433-442 (Agosto de 1994), todos aqui incorporados por referência].

Subsiste a necessidade na técnica para composições terapêuticas e estratégias de terapia génica que permitam o tratamento eficaz e/ou a prevenção de FH e de FCH, bem como outros defeitos no metabolismo das lipoproteínas.

Sumário da Invenção

Num aspecto, a invenção proporciona um vector virai recombinante compreendendo um gene do receptor de VLDL humano 5 {''VLDLR'') ligado operacionalmente a sequências reguladoras, dirigindo a sua expressão num hepatócito.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um hepatócito de mamífero que expressa um gene de VLDLR humano nele introduzido através de transdução por um vector virai de acordo com a invenção.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método para distribuição in vítro e integração estável de um gene de VLDLR numa célula de hepatócito de mamífero compreendendo introduzir na referida célula uma quantidade eficaz de um vector virai recombinante de acordo com a invenção. A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um vector de acordo com a invenção e a utilização de um tal vector no fabrico de um medicamento.

Através da utilização desta invenção, um doente possuindo uma desordem metabólica pode ser tratado administrando ao doente, através de uma via apropriada, uma quantidade eficaz de um vector de acordo com a invenção, de modo a que o referido gene de VLDLR seja integrado no cromossoma dos referidos hepatócitos do doente e o referido receptor seja expresso de forma estável in vivo numa localização no corpo em que não seja normalmente expresso.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção são descritos em mais pormenor na seguinte descrição detalhada das realizações preferidas desta.

Breve Descrição das Figuras A Fig. IA é um desenho esquemático do metabolismo de lipoproteínas de coelho e de humano normais. As apoliproteínas são referidas como B48, B100, C-II e E. LDL e VLDL estão identificadas. 6 A Fig. 1B é um desenho esquemático do metabolismo de lipoproteinas em doentes com t'h e coelhos WHHL. As abreviaturas são como descritas na Fig. IA. A Fig. 1C é um desenho esquemático do metabolismo de lipoproteinas em coelhos sujeitos a infusão com o gene de VLDLR recombinante de acordo com a invenção. A Fig. 2 é um desenho esquemático do plasmideo pAd. CWVLDLR, que contém as unidades de mapa de adenovirus 0-1 (Ad 0-1) seguidas por um intensificador/promotor de citomegalovírus (CMV enh/prom) , um gene de VLDLR humano, um sinal de poliadenilação (pA) , unidades de mapa de adenovirus 9-16 (Ad 9-16) e sequências de plasmideo do plasmideo pAT153 incluindo uma origem de replicação e gene de resistência a ampicilina. As enzimas endonucleases de restrição são representadas por designações convencionais na construção do plasmideo. A Fig. 3 é um mapa esquemático do adenovirus recombinante H5.010CMVVLDLR, no qual 0-100 representam as unidades de mapa de um adenovirus de tipo 5 (No. de Acesso ao GenBank M73260) e a minicassete CMV/VLDLR/pA de pAd. O CMVVLDLR é inserido entre as unidades de mapa de adenovirus 1 e 9, com as restantes unidades de mapa de Ad5 9-100 possuindo uma delecção no gene E3 parcial entre cerca da unidade de mapa 78,5 e cerca de 84,3. A Fig. 4A é uma representação gráfica apresentando as alterações nos níveis de colesterol do plasma em mg/dL para coelhos WHHL como uma função dos dias antes e após receber o adenovirus recombinante H5.OlOCMVlacZ. Os símbolos representam animais individuais. Ver Exemplo 3. A Fig. 4B é uma representação gráfica apresentando as alterações nos níveis de colesterol do plasma em mg/dL para coelhos WHHL como uma função dos dias antes e após receber o adenovirus recombinante H5.010CMVVLDLR. Os símbolos representam a resposta de quatro animais individuais. Ver Exemplo 3. A Fig. 5 é um gráfico de barras representando os níveis de colesterol (medidos como % pré-infusão) em murganhos sujeitos a 7 infusão com adenovírus recombinante H5.OlOCMVlacZ(lacZ), adenovírus recombinante Hb.UlOCMVVLDLR e adenovírus recombinante H5. OlOCBhLDLR. As barras a ponteado representam níveis de pré-infusão e as barras a cheio representam níveis pós-infusão. Ver Exemplo 4. A Fig. f, p nm gráfico de barras representando níveis de colesterol, especificamente os níveis das fracções de lipoproteínas de plasma (medidos como mg/fracção) em murganhos sujeitos a infusão com adenovírus recombinante H5.OlOCMVlacZ (lacZ) , adenovírus recombinante H5.010CMVLD.LR e adenovírus recombinante H5.0IOCBhLDLR. As barras a cheio representam proteínas ou fragmentos que possuem uma densidade (d)> 1,21; as barras com linhas oblíquas ascendentes representam HDL; as barras com ponteado intenso representam LDL, as barras com linhas oblíquas descendentes representam lipoproteína de densidade intermédia (IDL) , e as barras a branco representam níveis de VLDL. Ver Exemplo 4. A Fig. 7A é uma representação gráfica apresentando as alterações nos níveis de colesterol (medidos em mg/dL) como uma função de dias pré- e pós-infusão para murganhos com receptor de LDL removido, sujeitos a infusão com H5.OlOCMVlacZ. Os símbolos representam as respostas de animais individuais. Ver Exemplo 5. A Fig. 7B é uma representação gráfica apresentando as alterações nos níveis de colesterol (medidos em mg/dL) como uma função de dias pré- e pós-infusão para murganhos com receptor de LDL removido, sujeitos a infusão com H5. OlOCBhLDLR. Os símbolos são os mesmos que para a Fig. 7A. Ver Exemplo 5. A Fig. 7C é uma representação gráfica apresentando as alterações nos níveis de colesterol (medidos em mg/dL) vs. dias pré- e pós-infusão para murganhos com receptor de LDL removido, sujeitos a infusão com H5. OIOCMVVLDLR. Os símbolos são os mesmos do que para a Fig. 7A. Ver Exemplo 5. A Fig. 7D é uma representação gráfica apresentando os resultados médios ± desvio padrão das duas experiências para 8 murganhos com receptor de LDL removido, sujeitos a infusão com H5. OlOCMVLacZ (n=9) ou com H5. OlOCMVVIDLJ? (n=10) . Os níveis de colesterol médios pré-infusão foram de 870 mg/dL e 946 mg/dL, respectivamente. Os asteriscos indicam p < 0,05.

As Figs. 8A-8F são a sequência de ADN [SEQ ID NO:l] com a sequência de aminoácidos codificada [SEQ ID NO: 2 ] do gene do receptor de VLDi humano, como relatado por Gafvels et al, citado acima.

As Figs. 9Λ-9Ι sào a sequência de ADN de pAd. CMVVI.DLÍ? [SEQ ID NO: 3], na qual Ad 0-1 vai dos nucleótidos 12-364, CMV ehn/prom representa os nucleótidos 381-862; os nucleótidos 966-4107 codificam para VLDLR, pA representa os nucleótidos 4192-4390; Ad 9.2-16.1 representa os nucleótidos 4417-6880 e os nucleótidos 6881-919/ são sequências de pAT153. A Fig. 10A é um gráfico de barras ilustrando a actividade de CTL (média ± desvio padrão) medida como uma razão efector:célula alvo de 25:1.** = p < 0,005; * = p < 0,05. A Fig. 10B é um gráfico de linhas ilustrando a actividade de CTL medida contra razões variadas de efector:alvo. A Fig. 11A é um gráfico sumarizando o título de anticorpos neutralizantes presente em amostras de BAL de murganhos C57BL/6 infectados com adenovirus no dia 0 e necrotizados no dia 28 como descrito no Exemplo 9. 0 controlo representa murganhos normais ("controlo") ; CD4 mAB representa murganhos empobrecidos em células CD4+; IL-12 representa murganhos tratados com IL-12 e IFN-γ representa murganhos tratados com IFN-γ. A Fig. 11B é um gráfico sumarizando as quantidades relativas (DO405) de IgG presente em amostras de BAL. Os símbolos são como descritos na Fig. 11A. A Fig. 11C é um gráfico sumarizando as quantidades relativas (DO405) de IgA presente em amostras de BAL. Os símbolos são como descritos na Fig. 11A. 9

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção proporciona novos métodos e composições que permitem o tratamento terapêutico de desordens metabólicas, tais como FH e FCH, caracterizadas pela acumulação de LDL em plasma humano. Esta invenção proporciona a utilização de um vector virai para introduzir e expressar de forma estável um ger.e normalmente expresso em mamíferos, i.e., o gene que codifica um receptor normal para lipoproteína de muito baixa densidade (VLDLR) numa localização no corpo onde esse gene não está naturalmente presente, i.e., no fígado.

Os métodos e composições da presente invenção ultrapassam os problemas previamente identificados no tratamento de terapia génica de indivíduos deficientes no receptor de LDL. Como descrito em detalhe abaixo, através da utilização de um vector virai capaz de ter como alvo células do fígado, o gene do receptor de VLDL é introduzido e expresso com estabilidade em células do fígado. A presente invenção difere da substituição directa do gene no sentido em que a proteína do receptor de VLDL é normalmente expressa em indivíduos deficientes em receptor de LDL, p. ex. os macrófagos. Assim, a terapia génica utilizando um vector virai dirigido ao fígado contendo um gene de VLDL não resultaria na expressão de um novo produto de gene, mas antes na expressão de novo num orgão que de outra forma não expressa o produto do gene. Um aspecto importante é que o doente não produz uma resposta imunitária contra o produto do gene de VLDL expresso no fígado, porque o gene de VLDL distribuído pelo vector não é reconhecido como um antigénio estranho e não existe indução de eliminação da célula transfectada mediada por CTL. Em contraste, a eliminação de vectores virais mediada por CTL é um problema quando é administrado um gene de LDLR a um indivíduo deficiente em LDLR com FH [ver, p. ex., Kozarsky I e II, citados acima]. 10

Devido a este reconhecimento do gene de VLDLR pelo sistema imur.itario do doente como um gene conhecido, e da tendência dos hcputc ritos para possuir um longo tempo de vida em circulação, cs hepatócitos transf ectados com o vector desta invenção que expressam c gene de VLDLR tendem a ser estáveis e a expressão de VLDLF r.áo é transiente. A expressão do gcnc dc VLDLR em hepai: :s trar.sfectados ocorre durante a duração do tempo de vida r.-r-atócitos. A desordem metabólica de lipoproteinas pode «♦ : * ra* a da durante períodos mais longos sem a necessidade de re: r.: . do vector virai, limitando assim o número de exposiçc cí: virais e reacções imunitárias potenciais contra proteínas vira.s codificadas no vector.

Os vectcres e métodos desta invenção podem proporcionar terapia gémea útil para o tratamento e/ou suplemento de tratamentos correntes para desordens metabólicas de lipoproteir.a. A presença do gene do receptor de VLDL nos hepatócitcs t rar.sf ectados de acordo com esta invenção permite a ligação de VLDL, um percursor de LDL, do plasma no sítio do fígado, diminuindo assim a quantidade de VLDL no plasma. A diminuição de VLDL no plasma diminui consequentemente a produção de LDL do plasma.

Por exemplo, em FH, esta redução no LDL do plasma pode compensar os receptores de LDL deficientes no fígado. Em FCH, esta produção reduzida de LDL do plasma a partir de VLDL impede que os receptores de LDL normais no fígado se tornem sobrecarregados pelo excesso de LDL, e reduz o excesso de VLDL que contribui para a desordem. Compare-se, por exemplo, as representações esquemáticas na operação normal do metabolismo lipídico (Fig. IA) com o metabolismo anormal provocado por FH (Fig. 1B) e depois com o método desta invenção (Fig. 1C) . I. Partículas Virais Recombinantes corno Vectores de Terapia Génica 11

As composições desta invenção envolvem a construção de vectores de terapia gènica desejáveis, que são capazes de distribuir e integrar de forma estável um gene de receptor de VLDL funcional, normal para hepatócitos. Tais vectores de terapia génica incluem um vector de vírus seleccionado, de.se j avel mente c.om remoção de um ou mais genes virais, um minigene contendo o gene de VLDL sob o controlo de sequências de regulação, e vírus de auxílio opcionais e/ou linhas celulares recombinantes que fornecem aos vectores virais quaisquer produtos necessários de genes virais removidos.

As sequências virais utilizadas nos vectores, vírus de auxílio, se necessário, e partículas virais recombinantes, e outros componentes do vector e sequências empregues na construção dos vectores aqui descritos são obtidos a partir de fontes comerciais ou académicas baseadas em sequências anteriormente publicadas e descritas. Estes materiais virais podem também ser obtidos de um doente individual. As sequências virais e os componentes de vector podem ser gerados seguindo as técnicas e referências aqui contidas, acopladas com técnicas de clonagem molecular recombínante convencionais conhecidas e praticadas pelos especialistas na técnica. Podem ser criadas modificações de sequências de ácido nucleico existentes formando os vectores, incluindo delecções, inserções e outras mutações de sequência relatadas nesta especificação, utilizando técnicas convencionais.

Os métodos empregues para a selecção de sequências virais úteis num vector, a clonagem e construção do "minigene" de VLDLR e a sua inserção num vector virai desejável e a produção de uma partícula virai infecciosa recombínante através da utilização de vírus auxiliares e afins estão na especialidade da técnica dadas as descrições aqui fornecidas. A. Construção do "Minigene" 12

Por "minigene" entende-se a combinação do gene de VLDLR e dos outros elementos de regulação necessários para transcrever o gene e expressar o produto do gene in vivo. A sequência do receptor de VLDL humana foi fornecida [ver Gafvels et ai, citado acima; SEQ ID NOS: 1 e 2] . Geralmente, a região codificante total desta sequência do receptor é utilizada no minigene; a3 sequências 5' e 3' não traduzidas de SEQ ID NO: 1 não são essenciais para o minigene. Os genes de receptor de VLDL com origem r.outros mamíferos, p. ex., coelho, macaco, etc., também podem ser úteis nesta invenção. 0 gene receptor de VLDL (VLDLR) está operacionalmente ligado a componentes de regulação de um modo que permite a sua transcrição. Tais componentes incluem elementos de regulação convencionais necessários para dirigir a expressão do transgene VLDLR numa célula transfectada com o vector virai. Assim, o minigene contém também um promotor seleccionado que está ligado ao transgene e localizado, com outros elementos reguladores, nas sequências virais seleccionadas do vector recombinante. A selecção do promotor é um assunto de rotina e não é uma limitação desta invenção. Promotores úteis podem ser promotores constitutivos ou promotores regulados (indutíveis), que possibilitem o controlo da quantidade do transgene a ser expressa. Por exemplo, um promotor desejável é o promotor/estimulador precoce imediato do citomegalovírus [ver, por exemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)]. Outro promotor desejável inclui o promotor/estimulador LTR do vírus do sarcoma de Rous. Ainda outra sequência de promotor/estimulador é o promotor da β-actina citoplásmica de galinha [T.A. Kost et al., Nucl. Acid Res., 11(23):8287 (1983)]. Outros promotores adequados podem ser seleccionados por especialistas da técnica. O minigene pode também desejavelmente conter sequências de ácido nucleico heterólogas das sequências do vector virai incluindo sequências que fornecem sinais necessários para a poliadenilação eficiente do transcrito (poll-A ou pA) e intrões 13 com sítios de separação funcionais dadores e receptores. Uma sequência poli-A comum que é empregue nos vectores exemplificativos desta invenção é o derivado do papovavírus SV-40. A sequência poli-A é geralmente inserida no minigene a seguir às sequências do transgene e antes das sequências do vector virai. IJma sequência comum de intrão é também derivada de SV-40, e é referida como sequência T do intrão SV-40. Um minigene da presente invenção pode também conter tal intrão, desejavelmente localizado entre a sequência do promotor/estimulador e o transgene. A selecção deste e de outros elementos comuns a vectores são convencionais [ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual.", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1989) e referências nele citadas] e muitas destas sequências estão disponíveis de fontes comerciais e industriais assim como no Genbank.

Como acima mencionado, o minigene está localizado no sítio de qualquer delecção seleccionada no vector virai. Ver Exemplo 1 abaixo. B. Construção do Vector Plasmídico Virai

Embora um número de vectores virais tenham sido sugeridos para terapia génica, o vector mais desejável para este fim é um vector recombinante adenoviral ou vector adeno-associado. Os vectores de adenovírus como descrito abaixo são preferidos porque podem ser purificados em grandes quantidades e altamente concentrados, e o vírus pode fazer a transdução de genes em células que não estão em divisão. Contudo, está dentro da especialidade da técnica para outros adenovírus, ou mesmo retrovírus, vaccinia ou outros vectores de vírus a ser construídos de modo semelhante.

Os adenovírus são vírus de ADN de eucariotas que podem ser modificados para distribuir eficientemente um transgene repórter 14 ou terapêutico numa variedade de tipos de células. Os adenovirus humanos compreendem um genoma de ADN linear de dupla cadeia de aproximadamente 36 Kpb, que está dividido em 100 unidades de mapa (m.u.), cada uma das quais com 360 pb de comprimento. O ADN contém repetições terminais invertidas curtas (ITR) em cada extremidade do qenoma que são necessárias para a replicação virai. Os produtos dos genes estão organizados em regiões precoces (EI a E4) e tardias (LI a L5), com base na expressão antes ou depois da iniciação da síntese de ADN virai [ver, por exemplo, Horwitz, Virology, 2a ed., ed. B.N. Fields, Raven Press, Ltd., Nova Iorque (1990)]. Os adenovirus gerais de tipo 2 e 5 (Ad2 e Ad5, respectivamente) , nâo estão associados a doenças humanas.

Os vectores de adenovirus adequados úteis em terapia génica são bem conhecidos [ver, por exemplo, M.S. Horwitz et al., "Adenovirideae and Their Replication", Virology, segunda edição, pg. 1712, ed. B.N. Fields et ai., Raven Press Ltd., Nova Iorque (1990); M. Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155 (1992); J. F. Engelhardt et al., Human Genet. Ther., 4:759-769 (1993); Y. Yang et al., Nature Genet., 7:362-269 (1994); J. Wilson, Nature, 365:691-692 (Out. 1993); B.J. Cárter, in "Handbook of Parvovíruses", ed. P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990) . A selecção do tipo de adenovirus não é antecipada para limitar a seguinte invenção.

Os vectores de adenovirus úteis nesta invenção podem incluir as sequências de ADN de um número de tipos de adenovirus. As sequências de adenovirus úteis nos vectores aqui descritos podem ser obtidas a partir de qualquer tipo de adenovirus conhecido, incluindo os 41 tipos humanos presentemente identificados [ver, p. ex., Horwitz, citado acima] . A sequência de uma estirpe de adenovirus tipo 5 pode ser prontamente obtida a partir do Acesso da Genbank No. M73260. De modo semelhante, os adenovirus conhecidos por infectar outros animais podem também scr empregues nas construções de vectores 15 desta invenção. Uma variedade de estirpes de adenovirus estão disponíveis a partir da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ou disponíveis sob pedido a partir de uma variedade de fontes comerciais e institucionais.

Os vectores de adenovirus úteis nesta invenção incluem adenovirus reconblnant.es, deficientes, contendo opcionalmente outras mutações, p. ex. , mutações sensíveis à temperatura, delecções e vectores híbridos formados com sequências de adenoví rus/ví ru.= ^iero-associados. Os vectores adequados estão descritos na literatura publicada [ver, por exemplo, Kozarsky I e II, citados acima, e as referências aqui citadas, Patente U.S. No. 5 240 846 e os pedidos co-pendentes aqui incorporados por referência abaixe.

Vectores de adenovirus úteis para a distribuição do gene de VLDLR no fígado, sequências de ácido nucleico de adenovirus mínimas podem ser utilizadas para obter um vector, sendo nesse caso necessária a utilização de um vírus auxiliar para produzir uma partícula de vírus híbrida. Alternativamente, apenas podem ser empregues delecções seleccionadas de um ou mais genes de adenovirus para construir um vector virai. Os produtos dos genes interrompidos podem ser fornecidos utilizando uma linha celular de empacotamento seleccionada, que fornece o produto do gene em falta. 1. Adenovirus Recombinante Mínimo

Os vectores de adenovirus (Ad) desejáveis úteis na presente invenção estão descritos em detalhe no Pedido de Patente U.S. co-pendente de co-propriedade com o No. de Série 08/331 381, que c aqui incorporado por referência com a finalidade de descrever estes vectores.

Num sumário breve, o vírus Ad mínimo é uma partícula virai contendo apenas os elementos cis do adenovirus necessários para a replicação e encapsidação do virião, mas por outro lado 16 removido de todos os vírus do adenovírus. Isto é, o vector contém apenas as sequências de um adenovírus da repetição terminal invertida (ITR) em 5' e 3' com actividade cis (que funcionam como origens de replicação) e o domínio nativo 5' empacotamento/estimulador, que contém sequências necessárias para empacotar genomas de Ad lineares e elementos estimuladores para c promotor El. Esta sequência terminal (5') esquerda do genoma de Ad5 representa as pb de 1 a cerca de 360 do genoma convencional de adenovírus Ad5 publicado, também referido como as unidades de mapa 0-1 do genoma virai, e geralmente tem desde cerca de 353 até cerca de 360 nucleótidos em comprimento. Esta sequência inclui o 5' ITR (pb 1 até cerca de 103 do genoma do adenovírus) ; e o domínio empacotamento/estimulador (pb de cerca de 194 até cerca de 358 do genoma de adenovírus). As sequências de adenovírus 3' mínimas do vector de adenovírus podem incluir o terminal direito sequência ITR(3') do genoma adenoviral representando cerca de 35 353 pb para o final do genoma de adenovírus, ou unidades de mapa ~98,4-100. Esta sequência é geralmente de cerca de 580 nucleótidos de comprimento. Entre estas sequências, é inserido um minigene de VLDLR, como acima descrito. A produção de uma partícula infecciosa deste vector virai Ad mínimo envolve a assistência de um vírus auxiliar, como discutido abaixo. Um segundo tipo de vector mínimo também revelado na referência acima incorporada coloca a sequência terminal 5' de Ad num arranjo cabeça-para-cauda relativo à sequência do terminal 3' . O vector Ad mínimo co-infectado com um vírus auxiliar e/ou uma linha celular de empacotamento fornece todos os produtos de gene virai necessários para produzir uma partícula virai recombinante infecLanle contendo o minigene de VLDLR. Alternativamente, este vector pode conter sequências de genes de adenovírus adicionais, que não são então requeridos para serem fornecidos por um vírus auxiliar. 17 2. Outros Adenovírus Deficientes

Adenovírus recombinantes deficientes na replicação úteis para !-'rar:a cénica desta invenção podem ser caracterizados por conterem r.ais do que as sequências de adenovírus mínimas definidas acima. Estes outros vectores Ad podem ser caractcr: radr.s por delecções ou várias porções de regiões de genes ·. e partículas de vírus infecciosas formadas pela utilizo·'..:· cpcicnal de vírus auxiliares e/ou linhas celulares de empacotamento. Os adenovírus deficientes adequados são descritos em naicr entalhe em Kozarsky e Wilson, Curr. Opin. Genet. Devei., 3: 4 : 1 j (1993); Kozarsky I e II, citados acima, e referências cqji citadas, todos aqui incorporados por referência.

Como urr. exemple, os vectores adequados podem ser formados por delecção do todo ou de uma porção suficiente do gene Ela precoce imediato adenoviral precoce (que se estende de mu 1,3 a 4,5) e do ger.e Elb precoce tardio (que se estende de mu 4,6 a 11,2), de modo a eliminar as suas funções biológicas normais. Estes vírus desprovidos de EI de replicação deficiente são capazes de se replicarem e produzirem vírus infecciosos quando cultivados numa linha celular de complementação de rim embrionário humano transformada com adenovírus, a célula 293 [ATCC CRL 1573], contendo os genes de adenovírus Ela e Elb funcionais, que fornecem os produtos genéticos correspondentes em trans. 0 vírus resultante é capaz de infectar muitos tipos de células e pode expressar um transgene (i.e., o gene de VLDLR), mas não se consegue replicar na maioria das células que não contêm o ADN da região EI a menos que a célula seja infectada a uma multiplicidade de infecção muito elevada. A experiência vasta em animais indica que os vectores desprovidos de EI não são particularmente desejáveis para terapia génica porque são expressos baixos níveis de proteínas virais que produzem respostas imunitárias celulares destrutivas. 18

Como um exemplo preferido, o todo ou uma porção do gene precoce tardio de adenovirus E3 (que se estende de mu 76,6 a 86,2) pode ser eliminado da sequência de adenovirus que forma uma parte da construção híbrida. A função de E3 é irrelevante para a função e produção da partícula de vírus recombinante. Por exemplo, os vectores Ad podem ser construídos com um minigene terapêutico inserido na região El removida da parte estrutural do conhecido mutante Ad5 sub360 [J. Logan et al, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 81:3655-3659 (1984)]; ou a parte estrutural do mutante Ad5 dl7001 [Dr. William Wold, Washington University, St. Louis] . Ambos os vírus mutantes contêm também uma delecção na região E3 do genoma adenoviral; em sub360, de 78,5 a 84 mu e em dl7001, de 78,4 a 86 mu. 0 ciclo de vida de sub360 e dl7001 apresenta características selvagens.

Os vectores de adenovirus mais preferidos podem ser construídos possuindo uma delecção do gene El, pelo menos uma porção da região E3, e uma delecção adicional em genes de adenovirus que não El e E3 para acomodar o minigene VLDLR e/ou outras mutações que resultem em expressão reduzida de proteína adenoviral e/ou reduzida replicação adenoviral. Por exemplo, o todo ou parte do gene precoce E2a tardio do adenovirus (que se estende de mu 67,9 a 61,5) pode ser eliminado do vector de adenovirus. É também antecipado que porções dos outros genes precoces tardios E2b (que se estende de mu 29 a 14,2) e E4 (que se estende de mu 96,8 a 91,3) podem também ser eliminados do vector de adenovirus.

As delecções podem também ser feitas em qualquer dos genes tardios LI até L5, que se estendem de mu 16,45 até 99 do genoma de adenovirus. Do mesmo modo, as delecções podem ser úteis nos genes intermediários IX (que se situam entre mu 9,8 e 11,2) e IVa2 (que se situa entre 16,1 e 11,1). Outras delecções úteis podem também ser realizadas nos outros genes de adenovirus estruturais ou não estruturais. 19

Uma sequência de adenovírus para utilização na presente invenção pode conter apenas delecções de El. Alternativamente, delecções de genes inteiros ou porções eficazes na destruição da sua actividade biológica podem ser utilizadas em qualquer combinação. Por exemplo, num vector exemplificativo, a sequência de adenovírus pode conter delecções dos genes El e do gene E3, ou dos genes El, E2a e E3, ou dos genes El e E4, ou dos genes El, E2a e E4, com ou sem delecção de E3, e outras.

Os vectores podem também conter mutações adicionais em genes necessários para a replicação virai. Os vectores de adenovírus podem conter uma mutação que produz vírus sensíveis à temperatura (ts). Entre essas mutações inclui-se a incorporação da mutação de alteração de sentido sensível à temperatura na região E2a encontrada na estirpe Ad5 H5ts 125 [P. Vander Vliet et al., J. Virol.r 15:348-354 (1975)] a 62,5 mu. Uma única substituição de aminoácido (62,5 mu) na extremidade carboxílica da proteína de 72 kd (DBP) produzida a partir do gene E2a nesta estirpe produz uma proteína produto que é uma proteína de ligação ao ADN de cadeia simples e está envolvida na replicação do ADN genómico virai. A temperaturas permissivas (aproximadamente 32°C) a estirpe ts é capaz de um crescimento com um ciclo de vida completo em células HeLa, enquanto que a temperaturas não permissivas (aproximadamente 38°C), não é observada replicação do ADN virai. Adicionalmente, a temperaturas não permissivas, é observada a diminuição da proteína de 72 kd imunorreactiva em células HeLa.

Vectores exemplificativos para utilização nesta invenção, por exemplo, podem ser obtidos pela combinação de fragmentos de três construções de ADN independentes, incluindo sub360 ou dl7001, H5ts 125, e um plasmideo de ADNc com sequências Eia colocadas 5' em relação a um minigene terapêutico. Este tipo de vector é descrito, por exemplo, por J.F. Engelhardt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:6196-6200 (Junho 1994); Y. Yang et al., Nature Genet. 7:362-369 (Julho 1994) θ referências nele 20 citadas, todas as referências aqui incorporadas por referência. Devido às mutações no vector, verifica-se replicação virai reduzida, redução na proteína expressa e um aumento na persistência da expressão do transgene. Outros vectores de adenovirus preferidos contêm a mutação H5ts 125 em adição às delecções E3 de sub360 e dl 7001. O minigene contendo VLDLR como o transgene pode ser inserido em qualquer região removida do vírus Ad seleccionado.

Um vírus exemplif icativo utilizado para demonstrar esta invenção é o vector de adenovirus deficiente H5.010CMWLDLR, que contém sequências de adenovirus Ad m.u. 0-1, seguido por um minigene VLDLR, e a sequência Ad m.u. 9 a 100 com pequenas delecções em E3. Ver Fig. 3, abaixo descrita. O adenovirus recombinante foi inteiramente removido de Ela, Elb e parcialmente removido de E3. Este vector de virus recombinante é descrito em detalhe no Exemplo 1.

3. Vectores Híbridos Ad/AAV

Outro vector preferido é um vector híbrido Ad/AAV, que é objecto do Pedido de Patente co-pendente, em co-propriedade Ser. No. 08/331 384, que é aqui incorporado por referência.

Num mínimo, as sequências de ácidos nucleicos de adenovirus empregues no vector híbrido desta invenção são as sequências genómicas de adenovirus mínimas necessárias para empacotar ADN genómico adenoviral numa cabeça de cápsula pré-formada, como descrito acima. A sequência 5' completa de adenovirus contendo o 5'ITR e a região de empacotamento/estimulador pode ser empregue como a sequência 5' de adenovirus no vector híbrido. As sequências de adenovirus 3' do vector incluem a sequência (3')ITR do terminal direito do genoma adenoviral discutida acima. Algumas modificações destas sequências que não afectam adversamente a sua função biológica podem ser aceitáveis. 21

Também são parte dos vectores híbridos desta invenção as sequências de um vírus adeno-associado. As sequências de AAV úteis no vector híbrido são as sequências virais das quais as sequências codificando o polipéptido rep e cap são removidas. Mais especif icamente, as sequências de AAV empregues são as repetições terminais invertidas 5' e 3' de actuação cis [Ver, p. ex., B. J. Cárter, citado acima]. As sequências ITR de AAV têm cerca de 143 pb de comprimento. As sequências completas que codificam as ITRs são substancialmente utilizadas em vectores, embora se espere ser permissível para esta utilização algum grau de modificações menores destas sequências. A capacidade para modificar estas sequências ITR está dentro da especialidade da técnica. Ver, p. ex., Sambrook et al, citado acima.

Na construção do vector híbrido Ad/AAV, as sequências de AAV são flanqueadas pelas sequências de adenovirus discutidas acima. As sequências ITR de AAV 5' e 3' flanqueiam elas próprias uma sequência de minigene de VLDLR como descrito acima. Assim, a sequência formada pelo minigene VLDLR e sequências flanqueadoras de AAV 5' e 3' podem ser inseridas em qualquer sítio de delecçâo nas sequências de adenovirus do vector. Por exemplo, as sequências de AAV são inseridas desejavelmente no sítio dos genes Ela/Elb removidos do adenovirus, i.e., após a unidade de mapa 1. Em alternativa, as sequências de AAV podem ser inseridas numa delecçâo de E3, delecçâo E2a, e assim por diante. Se apenas forem utilizadas no vector as sequências de adenovirus 5'ITR/empacotamento e sequências 3'ITR, as sequências de AAV são inseridas entre elas.

Como descrito acima para as sequências de adenovirus mínimas, essas sequências genéticas não presentes na porção de adenovirus do vector híbrido devem ser fornecidas através de uma linha celular de empacotamento e/ou um adenovirus de auxílio para criar a partícula virai híbrida recombinante. A tomada deste vírus híbrido pela células é provocada pela capacidade de infecção que contribuiu para o vector, através das sequências de 22 adenovírus e de AAV. Uma vez que o vírus ou conjugado de vírus seja tomado pela célula, o transgene flanqueado pela ITR de AAV deve ser resgatado da estrutura do adenovírus mãe. 0 resgate do transgene está dependente do fornecimento da célula infectada com um gene rep de AAV. 0 gene rep de AAV pode ser fornecido ao virus híbrido através de vários métodos descritos no pedido acima incorporado. Uma realização para proporcionar proteínas rep em trans é transfectandc para a monocamada alvo de células previamente infectadas com o vector híbrido, um plasmídeo envolvido em liposoma contendo os genes que codificam para as proteínas rep de AAV de 78 kDa o 52 kDa sob o controlo do promotor P5 de AAV. Mais preferencialmente para utilização in vivo, o gene rep de AAV também pode ser distribuído como parte de um vírus híbrido. Uma realização deste conceito de partícula única é fornecido por um conjugado de pclicatião do vírus híbrido. A infecção deste conjugado de vírus modificado é realizada do mesmo modo que em relação às mesmas células alvo como indicado acima. Contudo, o conjugado de polilisina do vírus híbrido no qual foi directamente complexado um plasmídeo que codificava as proteínas rep 78 e 52, combina todas as componentes funcionais numa estrutura de partícula única. Assim, o conjugado de vírus híbrido permite a distribuição de uma partícula única para a célula, que é consideravelmente mais desejável para utilização terapêutica. Noutra realização, o vírus híbrido é modificado através da clonagem do ADNc de rep directamente para a porção do genoma do adenovírus do vector híbrido.

Estes e aspectos adicionais deste vector híbrido são fornecidos pelo pedido acima incorporado por referência. C. Produção da Partícula Virai Recombinante 1. Vírus Auxiliares/Linhas Celulares de Empacotamento 23

Dependendo do conteúdo em genes de adenovírus dos vectores plasmidicos empregues para transportar o minigene VLDLR, podem ser necessários uma linha celular de empacotamento ou um adenovírus auxiliar ou ambos para proporcionar sequências genéticas de adenovírus suficientes necessárias para produzir uma partícula virai recombinante infecciosa contendo o minigene VLDLR.

Os vírus auxiliares úteis contêm sequências genéticas de adenovírus seleccionadas que não estão presentes na construção do vector de adenovírus ou são expressas pela linha celular na qual o vector é transfectado. Um vírus auxiliar preferido é desejavelmente deficiente para a replicação e contém uma variedade de genes de adenovírus em adição às sequências modificadas descritas acima. Neste cenário, o vírus auxiliar é desejavelmente utilizado em combinação com uma linha celular de empacotamento que expressa de forma estável genes de adenovírus. Os vírus auxiliares podem também formar-se em conjugados poli-catião como descrito em Wu et al., J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); K. J. Fisher e J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (1 de Abril, 1994), e no Pedido de Patente U.S. com o No. Série 08/331 381, aqui incorporado por referência. 0 vírus auxiliar pode opcionalmente conter um segundo minigene repórter. É conhecido na técnica um número de tais genes repórteres. A presença de um gene repórter no vírus auxiliar que é diferente do transgene no vector de adenovírus permite que tanto o vector Ad como o vírus auxiliar sejam monitorizados independentemente. Este segundo repórter é utilizado para permitir a separação entre o vírus recombinante resultante e o vírus auxiliar durante a purificação. A construção das células auxiliares desejáveis está dentro da especialidade da técnica.

Como um exemplo, se a linha celular empregue para produzir o vector virai não for uma linha celular de empacotamento, e o vector contiver apenas as sequências de adenovírus mínimas 24 identificadas acima, o vírus auxiliar pode ser um vector Ad seivane.T tornecendo os genes precoces de adenovírus necessários El, Z-: e todos os restantes genes tardios, intermediários, estruturais ~ não estruturais do genoma do adenovírus. Se, nesta situaçá;., a linha celular de empacotamento é a 293, que fornece as ρν·ίίι·.„.- , a linha celular auxiliar não necessita conter o gene r . realização, se a construção do vector de adenovírus é deri·. em replicação (sem gene El e opcionalmente sem gene E3) e ::r ·: r-.r.;e a linha celular 293, não é necessário vírus auxiliar t,.·: r ί n produção do vírus híbrido. 0 E3 pode ser eliminai- d vírus auxiliar porque este produto de gene não é necessária rara a formação de uma partícula de vírus funcionar.

Preferenri a Inr.ente, para facilitar a purificação e reduzir a contaminaçac d a partícula de vector virai com o vírus auxiliar, é útil modificar as sequências de gene adenoviral nativa do vírus auxiliar que são responsáveis pelo empacotamento eficiente, de modo a interromper substancialmente ou "tornar deficiente" a função de empacotamento do vírus auxiliar ou a sua capacidade de replicação.

Um adenovírus "tornado deficiente" desejável é modificado no seu domínio de empacotamento/estimulador 5' ITR, que normalmente contém pelo menos sete sequências distintas por enquanto funcionalmente redundantes necessárias para o empacotamento eficiente ou genomas de adenovírus lineares replicados (sequências "PAC"). Dentro de uma secção de sequência de nucleótidos dos pb 194-358 do genoma de Ad5 estão localizadas cinco destas sequências PAC: PAC I ou a sua complementar nos pb 241-248 (SEQ ID NO: 4], PAC II ou a sua complementar nos pb 262-2G9 [SEQ ID NO: 5] , PAC III ou a sua complementar nos pb 304-311 [SEQ ID NO: 6], PAC IV ou a sua complementar nos pb 314-321 [SEQ ID NO: 7], e PAC V ou a sua complementar nos pb 339-346 [SEQ ID NO: 8], 25

Podem ser realizadas mutações ou delecções a uma ou a mais destas sequências PAC num virus auxiliar de adenovírus para gerar virus auxiliares tornados deficientes desejáveis. Modificações deste domínio podem incluir sequências 5' de adenovírus que contêm menos do que todas as cinco sequências PAC de adenovírus nativo, incluindo delecções de sequências PAC contíguas ou não contíguas. Uma modificação alternativa pode ser a substituição de uma ou mais das sequências PAC nativas por uma ou mais repetições de uma sequência de consenso contendo os nucleótidos mais frequentemente utilizados das cinco sequências PAC nativas. Alternativamente, esta região de adenovírus pode ser modificada através de mutações inseridas deliberadamente, que destruam uma ou mais das sequências PAC nativas. Um especialista na técnica pode manipular ainda mais as sequências PAC para alcançar de forma semelhante o efeito de reduzir a eficiência de empacotamento do vírus auxiliar até um nível desejado.

Deve ser referido que um especialista na técnica pode construir outros vírus auxiliares ou desenvolver outras linhas celulares de empacotamento para complementar as delecções do adenovírus na construção do vector e permitir a produção da partícula de vírus recombinante fornecida nesta informação. Por isso, a utilização ou descrição de qualquer vírus auxiliar particular ou célula de empacotamento não é limitante.

Na presença de outras linhas celulares de empacotamento que são capazes de fornecer proteínas adenovirais adicionalmente a El, o vírus auxiliar pode de acordo com isto ver removidos os genes que codificam para estas proteínas adenovirais. Tais vírus auxiliares sujeitos a remoções adicionais também contêm desejavelmente modificações que provocam deficiências como acima descrito.

Os conjugados de vírus auxiliares poli-catião, que podem estar associados a um plasmídeo contendo outros genes adenovirais, que não estão presentes no vírus auxiliar também 26 podem ser úteis. Os virus auxiliares acima descritos podem ser ainda ma is modificados fazendo uso da tecnologia de conjugado adenovírus-polilisina. Ver, p. ex., Wu et al., citado acima; e K. J. Fisher e J. M. Wilson, citado acima.

Utilizando esta tecnologia, um virus auxiliar contendo preferencialmente OS genes adenovirais tardios é modificado através da adição de uma sequência poli-catião distribuída em redor da cápsula do vírus auxiliar. Preferencialmente, o poli-catião é poli-iisina, que se liga em redor do vector carregado negativamente para formar uma carga positiva externa. É então construído um plasmídeo para expressar esses genes adenovirais que não estão presentes no vírus auxiliar, p. ex., os genes El, E2 e/ou E4. 0 plasmídeo associa-se ao conjugado do vírus auxiliar através das cargas na sequência de poli-lisina. Este conjugado permite que os genes de adenovírus adicionais sejam removidos do vírus auxiliar e estejam presentes num plasmídeo que não se venha a incorporar no vírus durante a produção do vector virai recombinante. Assim, o impacto da contaminação é consideravelmente diminuído. 2. Montagem da Partícula Virai e Infecção de uma Linha Celular A montagem das sequências de ADN seleccionadas do adenovírus, o AAV e os genes repórter ou genes terapêuticos e outros elementos de vector no vector híbrido e a utilização do vector· híbrido para produzir uma partícula virai híbrida utilizam técnicas convencionais. Tais técnicas incluem técnicas de clonagem convencionais de ADNc tais como as descritas em textos [Sambrook · et al., citado acima], a utilização de scqucnciao dc oligonucleótidos sobreponíveis do adenovírus e dos genomas de AAV, a reacção da polimerase em cadeia, e qualquer método adequado que proporcione a sequência nucleotídica desejada. São empregues técnicas convencionais de transfecção e co-transfecção, p. ex., técnicas de transfecção com CaPO^ 27 utilizando a linha celular de complementaçâo 293. Outros métodos convencionais empregues incluem recombinação homóloga dos genomas virais, plaqueamento de virus em camada de agar, métodos de medição de criação de sinal, e afins.

Por exemplo, após a construção e montagem do vector plasmídico desejável contendo o minigene, o vector é infectado in vitro na presença de um virus auxiliar opcional e/ou uma linha celular de empacotamento. Ocorre recombinação homóloga entre o auxiliar e o vector, o que permite que as sequências do transgene do adenovirus no vector sejam replicadas e empacotadas em cápsulas de viriões, resultando em partículas virais de vector recombinante. 0 método corrente para produzir tais partículas de vírus é baseado na transfecçâo. Resumidamente, o vírus auxiliar é utilizado para infectar células, tais como a linha celular de empacotamento humana HEK 293, que são então subsequentemente transfectadas com um vector plasmídico de adenovirus contendo um transgene VLDLR através de métodos convencionais. Cerca de 30 ou mais horas após transfecçâo as células são recolhidas, é preparado um extracto e o vector do vírus recombinante contendo o transgene VLDLR é purificado através de ultracentrifugação de densidade flutuante num gradiente de CsCl. O rendimento de transdução de partículas virais depende largamente do número de células que são transfectadas com o plasmídeo, tornando desejável a utilização de um protocolo de transfecçâo com elevada eficiência. Um tal método envolve a utilização de um adenovirus auxiliar poli-L-lisinilado como acima descrito. Um plasmídeo contendo o minigene VLDLR é então complexado directamente com uma cápsula de vírus auxiliar carregada positivamente, resultando na formação de uma partícula de transfecçâo única contendo o vector plasmídico e as funções de auxílio do vírus auxiliar. 28 II. Utilização dos Vectores de Vírus Recombinante em Terapia Génica 0 vector adenoviral recombinante resultante contendo o minigene VLDLR produzido pela cooperação do vector de adenovirus e do viiub auxiliar ou vector adenoviral e linha celular de empacotamento, como descrito acima, proporcionando assim um veículo de transferência de genes eficaz que pode distribuir o gene de VLDLR a um doente in vivo ou ex vivo e proporcionar a integração do gene numa célula de fígado.

Os vectores recombinantes acima descritos são administrados a humanos de um rr.coo convencional para terapia génica e serve como uma terapia génica alternativa ou suplementar para deficiências no receptor de LDL ou outras desordens metabólicas de lipoproteínas. Pode ser administrado a um doente um vector virai contendo o gene de VLDLR, preferencialmente suspenso numa solução biologicamente compatível ou veículo de distribuição farmaceuticamente aceitável. Um veículo adequado inclui solução salina estéril. Podem ser empregues com esta finalidade outras soluções para injecções estéreis isotónicas aquosas e não aquosas e suspensões estéreis não aquosas conhecidas como sendo veículos farmaceuticamente aceitáveis e bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Os vectores virais são administrados em quantidades suficientes para transfectar as células do fígado e proporcionar níveis de transferência e de expressão do gene de VLDLR suficientes para proporcionar um benefício terapêutico sem inconvenientes adversos ou com efeitos fisiológicos medicamente aceitáveis, que podem ser determinados pelos especialistas nas técnicas médicas. Vias de administração convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem distribuição directa para as vias do fígado, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral e outras vias de administração 29 parentérica. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado.

As dosagens do vector virai dependerão principalmente de factores tais como a condição a ser tratada, a idade, peso e altura do doente, e pode por isso variar entre os doentes. Por exemplo, nma dresagem humana terapeuticamente eficaz do vcctor virai enconr. ra-se gcralmente no intervalo entre cerca de 20 e cerca de 100 ml do solução salina contendo concentrações de cerca de 1 x 10'* até 1 x 1011 pfu/mL de vector de vírus. Uma dosagem humana preferida é estimada ser de cerca de 50 mL de solução salina a 2 x 10'° pfu/mL. A dosagem será ajustada para equilibrar o beneficio terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais adversos. Os níveis de expressão do gene de VLDLR podem ser monitorizados para determinar a frequência da dosagem de administração.

Um passo opcional do método envolve a co-administração ao doente, quer concorrentemente com, ou antes ou após a administração do vector virai, de uma quantidade adequada para um modulador imunitário, que é preferencialmente de acçâo curta. O modulador imunitário seleccionado é aqui definido como um agente capaz de inibir a formação de anticorpos de neutralização dirigidos contra produtos do vector recombinante desta invenção e/ou capazes de inibir a eliminação de linfócitos T citolíticos (CTL) das células contendo vector. O modulador imunitário pode interferir com as interacções entre os subconjuntos dos auxiliares T (THi ou TH2) e as células B para inibir a formação de anticorpo neutralizante. Alternativamente, o modulador imunitário pode ser seleccionado para inibir a interacção entre as células Tm e os CTL para reduzir a ocorrência da eliminação de CTL do vector. Mctis especificamente, o modulador imunitário interfere desejavelmente com, ou bloqueia, a função das células T CD4 .

Os moduladores imunitários para utilização na inibição da formação de anticorpos neutralizantes podem ser seiercionados 30

com base na determinação do sub-tipo de imunoglobulina de qualquer anticorpo neutralizante produzido em resposta ao vector de adenovirus contendo VLDLR. Por exemplo, se o anticorpo neutralizante é um anticorpo mediado por TH2? tal como IgA, o modulador imunitário desejavelmente suprime ou evita a interacção de Th2 com as células D. Alternativamente, 3e o anticorpo neutralizante induzido é um anticorpo mediado por THi, tal como IgG2A, o modulador imunitário desejavelmente suprime ou evita a interacção de THi com as células B. 0 anticorpo neutralizante que desenvolve uma resposta à administração de um vector virai desta invenção pode ser baseado no veículo utilizado para distribuir o vector e/ou na localização da distribuição. Por exemplo, a administração de vectores adenovirais através dos pulmões induz geralmente a produção de anticorpo neutralizante IgA. A administração de vectores adenovirais através do sangue geralmente induz anticorpo neutralizante IgGi. A determinação do anticorpo neutralizante é prontamente determinada em ensaios do vector virai seleccionado em modelos animais. Nos caos em que é desejada a redução da eliminação de CTL dos vectores virais o modulador imunitário é seleccionado quanto à sua capacidade para suprimir ou bloquear células Tm CD4 + para permitir a residência prolongada do vector virai in vitro. A selecção do modulador imunitário pode assim ser baseada no mecanismo que se pensa vir a ser interrompido ou bloqueado. Os moduladores imunitários podem ser proteínas solúveis ou proteínas que ocorrem naturalmente, incluindo citoquinas, anticorpos monoclonais. Os moduladores imunitários podem ser produtos farmacêuticos convencionais. Os moduladores imunitários aqui identificados podem ser utilizados isoiadamente ou em combinação um com o outro. Por exemplo, a ciclofosfamida e o modulador imunitário mais especifico anticorpo monoclonal anti-CD4 podem ser co-administrados. Nesse caso, a ciclofosfamida serve como um agente para bloquear a activação de TH1 e a 31 expressão estabilizada do transgene para além do período do b_oqueamento imunitário transiente.

Uri.u quuntidade ou dosagem adequadas do modulador imunitário dependerá pr imeiramente da quantidade do vector recombinante conter.oo o gene VLDLR que é inicialmente administrado ao doente p dr -ipp op modulador imunitário seleccionado. Outros factoroo securn-r.c:; íjís como a condição a ser tratada, a idade, peso, estaco coral de saúde, e estado imunitário do doente, também podem, ser ccr.s: cerados por um médico na determinação da dosagem de mcdu 1 ,tc - r .r unitário a ser distribuída ao doente.

Ger-i 1 r.or.·. ·:, por exemplo, uma dosagem humana terapeut icamonto oiicaz de um modulador imunitário de citoquina, p. ex., 11-12 ou γ-IFN encontra-se geralmente no intervalo entre cerca de 0,5 μα até cerca de 5 mg por cerca de 1 x 107 pfu/mL de vector de vírus. Podem ser determinadas várias dosagens por um especialista na técnica para equilibrar o beneficio terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais. A. Anticcrpos Mor.oclonais e Proteínas Solúveis

Preferencialmente, o método de inibição de uma resposta imunitária adversa ao vector de terapia génica envolve a inactivação específica de células CD4+. Preferencialmente, tais anticorpos blooueadores são "humanizados" para evitar que o receptor desencadeie uma resposta imunitária contra o anticorpo bloqueador. Um "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo possuindo as suas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e/ou outras porções das suas regiões estruturais do domínio variável da cadeia leve e/ou pesada, derivadas de uma imunoglobulina de um dador não humano, sendo as restantes partes da molécula derivadas da imunoglobulina derivadas de uma ou mais imunoglobulinas humanas. Tais anticorpos também podem incluir anticorpos caracterizados por uma cadeia pesada humanizada associada a uma cadeia leve nao modificada de dador ou receptor, 32 ou uma cadeia leve quimérica, ou vice versa. Tal "humanização" pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, G. E. Mark e E. A. Padlan, "Chap. 4. Humanization of

Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental

Pharmacology, vol. 113, Springer-Verlag, Nova Iorque (1994), pp. 105-133, que é aqui incorporada por referência.

Outros anticorpos adequados incluem aqueles que inibem especificamente ou empobrecem células CD4+, tais como um anticorpo dirigido contra a superfície da célula CD4. Foi demonstrado pelos inventores que o empobrecimento das células CD4+ inibe a eliminação de CTL do vector virai. Tais agentes de modulação incluem, mas não estão limitados a anticorpos de células anti-T, tais como anti-OKT3+ [ver. p. ex. , Patente U.S. No. 4 658 019; Pedido de Patente Europeia No. 501 233, publicado em 2 de Setembro de 1992] . Ver Exemplo 2 abaixo, que emprega o anticorpo comercialmente disponível GK1.5 (No de Acesso ATCC TIB207) para empobrecer as células CD4+.

Alternativamente, qualquer agente que interfira com ou bloqueie as interacções necessárias para a activação de células B por células TH/ e assim a produção de anticorpos neutralizantes, é útil como um modulador imunitário de acordo com estes métodos. Por exemplo, a activação de células B por células T requer que ocorram certas interacções [F. H. Durie et al, Immunol. Today, 15(9):406-410 (1994)], tais como a ligação do ligando CD40 na célula T auxiliar ao antigénio CD40 na célula B, e a ligação dos ligandos CD28 e/ou CTLA4 na célula T do antigénio B7 na célula B. Sem ambas as interacções a célula B não pode ser activada para induzir a produção do anticorpo neutralizante. A interacção ligando CD40 (CD40L)-CD40 é um ponto desejável para bloquear a resposta imunitária para vectores de terapia génica devido à sua actividade de largo espectro tanto na activação e função de células T auxiliares como na ausência de redundância na sua via de sinalização. Um método corrente 33 preferido da presente invenção envolve assim o bloqueamento transiente da interacção de CD40L com CD40 no momento da administração do vector adenoviral. Isto pode ser conseguido por tratamento com um agente que bloqueia o ligando CD40 na célula TH e interfere com a ligação normal do ligando CD40 na célula T auxiliar com o antigén-io Γ.Π4Ω na célula B. 0 bloqueamento da interacção CD40L-CD40 impede a activação das células auxiliares T que contribui para problemas com a estabilização e readministraçâo do transgene.

Assim, um anticorpo contra o ligando CD40 (anti-CD40L) [disponível na Bristol-Myers Squibb Co; ver, p. ex. pedido de patente Europeia 555 880, publicada em 18 de Agosto de 1993] ou uma molécula solúvel de CD40 pode ser um modulador imunitário seleccionado neste método.

Alternativamente, um agente que bloqueia os ligandos CD28 e/ou CTLA4 presentes nas células T auxiliares interfere com a ligação normal desses ligandos com o antigénio B7 na célula B. Assim, uma forma solúvel de B7 ou um anticorpo contra CD28 ou CTLA4, p. ex. , CTLA4-Ig [disponível da Bristol-Myers Squibb Co; ver p. ex., pedido de patente Europeia 606 217, publicado a 20 de Julho, 1994] pode ser o modulador imunitário seleccionado no método desta invenção. Este método possui vantagens maiores do que a administração de citoquinas abaixo descrita para impedir a activação de Ύη2ι porque se dirige tanto a respostas imunitárias celulares como humorais a antigénios estranhos. B. Citoquinas

Ainda podem ser empregues nesta invenção outros moduladores imunitários que inibem a função da célula Th·

Assim, numa realização, pode ser administrado um modulador imunitário que inibe selectivamente a função do sub-conjunto THi de células T auxiliares CD4+, no momento da administração primária do vector virai. Um tal modulador imunitário é a 34 interleuquina-4 (IL-4). A IL-4 aumenta a actividade específica de antigénio de células TH2 à custa da função da célula THi [ver, p. ex., Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 83:5894-5898 (1986); Patente dos Estados Unidos No. 5 017 691] . É previsível que outros moduladores que possam inibir a função da célula THi também sejam úteis nos métodos desta invenção.

Noutra realização, o modulador imunitário pode ser uma citoquina que impeça a activação do sub-conjunto TH2 de células auxiliares T. 0 sucesso deste método depende da contribuição relativa que os isotipos Ig dependentes de TH2 desempenham na neutralização de vírus, cujo perfil pode ser afectado pela estirpe, a espécie do animal bem como pelo modo da distribuição do vírus e o orgão alvo.

Um modulador imunitário desejável que inibe selectivamente a função do sub-conjunto TH2 de células T CD4+ no momento da administração primária do vector virai inclui a interleuquina-12 (IL-12). A IL-12 aumenta a actividade específica do antigénio de células THi à custa da função da célula TH2 [ver, p. ex., Pedido de Patente Europeia No. 441 900; P. Scott, Science, 260: 496-497 (1993); R. Manetti et al, J. Exp. Med., 177: 1199 (1993); A. D'Andrea et al., J. Exp. Med., 176:1387 (1982)]. A IL-12 para utilização neste método é preferencialmente sob a forma de proteína. A IL-12 humana pode ser produzida de forma recombinante utilizando técnicas conhecidas ou pode ser obtida comercialmente. Alternativamente, pode ser projectada num vector virai (que opcionalmente pode ser o mesmo que o utilizado para expressar o transgene) e expressa numa célula alvo in vivo ou ex vivo. A ablação específica para TH2 com IL-12 é particularmente eficaz em terapias genicas dirigidas ao pulmão em que IgA é a principal fonte de anticorpo neutralizante. Em terapia génica dirigida ao fígado tanto células THi como TH2 contribuem para a produção de anticorpos específicos para o vírus. Contudo, a 35 quantidade total de anticorpo neutralizante pode ser diminuída com IL-12.

Outro modulador imunitário seleccionado que realiza uma função semelhante é o interferão gama (IFN-γ) [S. C. Morris et al., J. Tizmunol., 152:1047-1056 (1994); F. P. Heinzel et al. , J. Exp. Med., 177: 1505 (1993)]. Crê-se que IFN-γ medeie muitos dos efeitos bio-óçicos de IL-12 através da secreção de macrófagos activados e células T auxiliares. O IFN-γ também inibe parcialmer.te a activação de TH2 estimulada por IL-4. O IFN-γ também pode sor obtido a partir de uma variedade de fontes comerciais.

Alternativamente, ele pode ser construído num vector virai e expresso numa célula alvo in vivo ou ex vivo utilizando técnicas de engenharia genética conhecidas.

Preferencialmente, tais moduladores imunitários de citoquina estão sob a forma de proteínas humanas recombinantes. Estas proteínas podem ser produzidas por métodos existentes na técnica. Péptidos activos, fragmentos, subunidades ou análogos dos moduladores imunitários conhecidos aqui descritos, tais como IL-12 ou interferão gama, que partilham a função inibidora de TH2 destas proteínas, também serão úteis neste método quando os anticorpos neutralizantes são mediados por TH2· C. Outros Produtos Farmacêuticos

Também podem ser utilizados nos métodos da invenção outros moduladores imunitários ou agentes que inibem não especificamente a função imunitária, i.e., a ciclosporina A ou ciclofosfamida. Por exemplo, foi demonstrado que um percurso curto de ciclofosfamida interrompe com sucesso a activação tanto de células T auxiliares CD4 como de CD8 para a proteína da cápsula de adenovírus no momento da distribuição de vírus ao fígado. Como um resultado, a expressão do transgene foi prolongada e, a doses mais elevadas, foi impedida a formação do 36 anticorpo neutralizante, permitindo a readministração do vector ser bem sucedida. No pulmão a cilcofosfamida impediu a formação de anticorpos neutralizantes a todas as doses e estabilizou a expressão do transgene a uma dose elevada. D. Administração do Modulador Imunitário A arir r-,-.càc opcional do modulador imunitário seleccionaoc : :·· sor repetida durante o tratamento com o vector de adenovírus recomoinante contendo o gene de VLDLR humano durante o per. o ir, de tempo em que o gene de VLDLR é expresso (como monitor: caco por p. ex., níveis de LDL) , ou com cada reforço do vector recombinante.

Assim, as cor-posições e métodos desta invenção proporcionam um tratamento desejável para defeitos no metabolismo de LDL, proporcionando expressão estável do gene de VLDLR em hepatócitos humanos e a capacidade para re-administrar o vector como desejado sem induzir uma resposta imunitária indesejável no doente.

Os seguintes exemplos ilustram a construção e teste dos vectores virais e das inserções do gene receptor de VLDL da presente invenção e a utilização destes no tratamento de desordens metabólicas. Foi construído um adenovírus recombinante exemplificativo codificado o receptor de VLDL humano como descrito no Exemplo 1 abaixo. Estes exemplos são apenas ilustrativos e não limitam o âmbito da presente invenção.

Exemplo 1 - Construção e Purificação de H5.010CMVVLDLR 0 ADNc para o receptor para a lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) humano [Μ. E. Gafvels et al., citado acima: SEQ ID NO: 1] foi inserido na região de sítios de ligação múltiplos do plasmideo pRc/CMV (obtido de Invitrogen Corp.). 0 plasmídeo rooultante, pRc/CMVVLDLR foi digerido com as enzimas de 37 restrição SnaBI e Not I e foi isolado o fragmento de 4 kb contendo o promotor imediato-precoce de citomegalovírus (CMV) e o ADNc do receptor de VLDL. 0 plasmídeo pAd, CMVlacZ [Kozarsky II, citado acima] foi digerido com SnaBI e NotI para remover o promotor de CMV e o ΑΠΝγ do lacZ q foi isolada a estrutura de 5,6 kb. Os dois fragmentos foram ligados para gerar pAd. CMVVLDLR (Figs. 2 e 9; SEQ ID NO: 3]. 0 pAd.CMVVLDXJR foi linearizado com NheI e co- transfectado em células 293 com ADN sub360 (derivado do adenovirus tipo 5), que foi digerido com Xbal e Ciai como anteriormente descrito [K. F. Kozarsky I e II citados acima].

Os adenovirus resultantes recombinantes, designados H5. OlOCMVVLDLjR contêm a sequência de cerca do nucleótido 12 até cerca do 4390 de pAd.CMVVLDLR e as unidades de mapa de Ad.5 de 9-100 com uma pequena delecção no gene E3 (ver No. Acesso ao GenBank M73260 e discussão da Fig. 3) . Este adenovirus recombinante foi isolado após dois ciclos de purificação de placas. 0 H5.010CMVVLDLR foi cultivado em células 293 e purificado por dois ciclos de centrifugação de densidade em cloreto de césio como anteriormente descrito [K. F. Kozarsky I e II citado acima]. O cloreto de césio foi removido fazendo passar o virus através de uma coluna de dessalinizaçâo BioRad 10DG equilibrada com solução salina tamponada com fosfato.

Para experiências em coelhos o vírus foi utilizado purificado de fresco; para experiências em murganho o vírus foi utilizado fresco ou após ter sido adicionado glicerol de purificação em coluna para uma concentração final de 10% (v/v) e o vírus ter sido armazenado a -70°C até utilização.

Como descrito nos exemplos seguintes este vector de adenovirus recombinante foi introduzido nos fígados de coelhos WHHL e nos fígados dos murganhos com o receptor de LDL interrompido, para determinar a função in vivo do receptor de VLDL e para determinar a sua utilidade como uma terapia génica alternativa ou suplementar para deficiência do receptor de LDL. 38

Excmp T c

Outros Adenovíius Recombinantes 0 Π5. OlCCMVlacZ codificando o gene lacZ sob o controlo do estinulador/promotor de CMV e ο H5. OlOCBhIDLjR codificando para o ADNc: do receotor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) humano sob c centrei o do promotor de β-actina de galinha aumentado por CMV, icram preparados como anteriormente descrito [K. F. Kozarr f.y I o citados acima].

Exempi :> 1 - Eiiitcs da Expressão Hepática do Receptor de VLDL no Coelho WHHL 0 H5.01OCMWVLDLR ou H5.OlOCMVlacZ (codificando para a β-galactosidade) , obtidos como descrito nos Exemplos 1 e 2 foram utilizados para ir.fusão intravenosa em coelhos WHHL [Camm Research] como se segue. Os coelhos foram sujeitos a infusão com 7,5 x IO12 partículas de qualquer dos adenovirus recombinantes através de uma veia marginal da orelha no dia 0. Adicionalmente, dois coelhos New Zealand White (NZW) [Hazleton, Inc.] foram sujeitos a infusão com cada um dos vírus e sacrificados no dia 5 após infusão para documentar a extensão da transferência do gene no fígado.

Os coelhos foram mantidos no ciclo de 12 horas de luz/escuridão sob uma dieta de ração do laboratório Purina, fornecida em cada dia aproximadamente às 11:00. As amostras venosas foram obtidas através de uma veia marginal da orelha aproximadamente às 10:00 nos dias indicados. A. Análises de Plasma

As amostras de plasma foram analisadas quanto ao colesterol total utilizando o Cholesterol HP kit and Precise standards (Boehringer Mannhcim) . ResumidamenLe, a análise por 1’PLC foi 39 realizada em 50 μΐ de plasma de murganhos individuais ajustados para um volume de 250 μΒ em tampão de coluna de FPLC (EDTA a 1 mM, NaCl a 154 mM, pH 8,0). As amostras diluídas (200 μΐ,) foram aplicadas em duas colunas de Superose (Pharmacia) em série a uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min, e foram recolhidas fracções de 1 mL·. O conteúdo em colesterol foi analisado num ensaio em microplaca em amostras de 100 μΐ,. Foram adicionados às amostras 100 μΙ- de uma solução preparada de fresco contendo PIPES a 50 mM, pH 6,9, HDCBS a 7,8 g/L, 4-AAT a 0,51 g/L, ácido eólico a 1,27 g/L, Triton X-100 a 0,245%, KC1 a 7,31 g/L e foram suplementadas com oxidase de colesterol 1,22 U/mL, esterase de colesterol a 7,64 U/mL e peroxidase a 245 U/mL, incubadas durante a noite à temperatura ambiente, e foi determinada a D.O. a 490 nm.

Os níveis de colesterol do plasma foram avaliados em cada um dos coelhos WHHL antes e após terem recebido o adenovírus recombinante. A Fig. 4A demonstra que os coelhos sujeitos a infusão com H5.OlOCMVlacZ não apresentavam alterações significativas nos níveis de colesterol. Contudo, após a infusão com H5.010CMVVLDLP os níveis de colesterol baixaram, com decréscimos máximos que variaram entre 140 e 420 mg/dL (Fig. 4B) . Isto demonstra que a expressão do receptor de VLDL resulta em níveis de colesterol diminuídos em coelhos deficientes no receptor de LDL. B. Análise Histoquímica

Foram embebidas em parafina porções de fígado, seccionadas e coradas c.om hematoxilina e eosina. Algumas porções foram congeladas frescas, seccionadas, fixadas em glutaraldeído, coradas com X-gal e levemente contracoradas com hematoxilina. Algumas secções congeladas frescas foram fixadas em metanol e depois coradas quer com um anticorpo polielonal anti-β- 40 galactosidase (5 linha-3 linha), um anticorpo policlonal anti-receptor de LDL humano, ou com um anticorpo policlonal anti-receptor VLDL, seguido por um anticorpo anti-coelho conjugado com isotiocianato de fluoresceína (Jackson Immunoresearch) como ar.teriormente descrito [K. F. Kozarsky I e II citados acima] . A coloração com Óleo Vermelho 0 fon realizada em secções congeladas frescas fixadas durante 1 minuto em formaldeído a 37%, depois lavadas e coradas em Óleo Vermelho 0 (3 partes de Óleo Vermelho 0 a 0,5% em álcool isopropílico/2 partes de água) durante 10 minutos. Os cortes foram contracorados em hematoxilina e montados em solução aquosa. A análise de imunofluorescência dos coelhos sujeitos a infusão mostrou que aproximadamente 50% dos hepatócitos do coelho sujeito a infusão com H5.OlOCMVlacZ expressaram β-galactosidase, o tecido do fígado do coelho sujeito a infusão com H5.010CMVVLDI/JR tinha uma percentagem de hepatócitos ligeiramente superior expressando o receptor de VLDLR. De acordo com a análise por transferência de Northern apresentando pouca ou nenhuma expressão de ARNm do receptor de VLDL [Μ. E. Gafvels et al, citado acima], o fígado do coelho sujeito a infusão com lacZ não apresentou reactividade com o anticorpo anti-receptor de VLDL.

Exemplo 4 - Efeitos da Expressão Hepática de Curta Duração do Receptor de VLDL em Murganhos com o Receptor de LDL Interrompido

Murganhos C57BL/6 e murganhos com o receptor de LDL interrompido (Jackson Labs) foram sujeitos a infusão intravenosa com 0,5 a 1,0 x 1010 partículas de adenovírus recombinante através da veia da cauda e os níveis de colesterol foram monitorizados antes e após infusão.

Especificamente, três murganhos foram sujeitos cada um a infusão quer com H5.OlOCMVlacZ, H5.010CMVVLDLR, ou H5. OlOCBhLPUR (codificando O ADNc. do receptor de LDL humano) . E3te último 41 vírus foi incluído como um controlo para confirmar resultados publicados [Kozarsky i e II citados acimaj . Foram obtidas amostras de plasma por sangria retro-orbital utilizando tubos capilares heparinizados. Os murganhos com o receptor de LDL interrompido foram mantidos numa dieta rica em colesterol composta de ração de murganho Purina snplpmentada com 1,25% de colesterol, 7,5% de manteiga de cacau, 7,5% de caseína, e 0,5% de colato (1,25% de colesterol na dieta) durante pelo menos 3 semanas imediatamente a seguir ao desmame antes de serem iniciadas as experiências. Os murganhos foram sacrificados no dia 5 após a infusão.

Os tecidos do fígado foram analisados por imunofluorescência quanto a expressão do transgene por técnicas descritas no Exemplo 3, e os níveis de colesterol no plasma foram medidos de modo semelhante ao descrito. Para o fraccionamento de lipoproteínas, foram misturados os triplicados de plasma de murganhos com o receptor de LDL interrompido, sujeitos a centrifugação de densidade, as fracções foram recolhidas, e o conteúdo em colesterol foi determinado por meios convencionais. A análise por imunof luorescência revelou níveis moderados de expressão de β-galactosidase em murganhos sujeitos a infusão com H5.OlOCMVlacZ, e níveis superiores de expressão de receptor de LDL humano e de receptor de VLDL em murganhos sujeitos a infusão com H5 . OlOCBhiDLR e H5.010CMVVADI/R, respectivamente.

Os níveis de colesterol diminuíram levemente no controlo, murganhos sujeitos a infusão com H5. OlOCMVlacZ (Fig.5), provavelmente devido a efeitos da infusão de adenovírus recombinante não relacionados com o transgene, que podem resultar em hepatotoxicidade em murganhos [Y. Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91: 4407-4411 (Maio de 1994)]. No entanto, em contraste com a diminuição observada nos murganhos controlo, os níveis de colesterol caíram significativamente para 50% dos valores pré-infusão nos murganhos sujeitos a infusão com 42 Η5.OlOCBhLDLR no dia 5 após a infusão. Os níveis de colesterol nos murganhos sujeitos a infusão com H5.010CMVVLDLR também diminuíram, para aproximadamente 60% dos valores pré-infusão. A análise posterior das lipoproteínas do plasma mostrou que nos murganhos tratados com H5.OlOCBhLDIR, os níveis de LDL evidenciaram-se, com decréscimos adicionais nas fracções IDL e VLDL (Fig. 6). Os murganhos sujeitos a infusão com H5.010CMVVIDIR apresentaram um maior decréscimo na fracção VLDL com menos decréscimo em LDL.

Em conjunto estes resultados indicam que a expressão hepática do receptor de VLDL resulta numa remoção aumentada de VLDL do plasma, resultando em decréscimos nas quantidades de lipoproteínas para as quais VLDL é o precursor (isto é, IDL e LDL), e uma queda geral no colesterol total do plasma.

Exemplo 5 - Efeitos da Expressão Hepática de Longo Termo do Receptor de VLDL em Murganhos com o Receptor de LDL Interrompido

De modo a obter níveis de colesterol mais próximos dos observados em doentes FH e coelhos WHHL, murganhos com o receptor de LDL interrompido (Jackson Labs) foram mantidos numa dieta rica em colesterol composta por ração de murganho Purina suplementada com colesterol a 0,2%, óleo de coco a 10%, e colato a 0,05% (0,2% de colesterol na dieta). Os níveis de colesterol nestes murganhos variou desde 930 a 1550 mg/dL, enquanto os murganhos numa dieta de 1,25% de colesterol (Exemplo 4) possuíam níveis de 1900 a 3100 mg/dL. O vírus descongelou imediatamente antes da sua utilização e foi diluído com PBS a uma concentração de lxlO12 partículas/mL. Cada um de três murganhos foi sujeito a infusão intravenosamente com 0,1 mL de vírus contendo lxlO11 partículas de um adenovírus recombinante com EI removido codificando para β-galactosidase (H5.OlOCMVlacZ) ou receptor LDL humano (H5.OlOCBhLDLR) , e os lipidos do soro foram seguidos ao longo do tempo. Nos dias 43 indicados, os murganhos foram anestesiados com metoxiflurano e o sangue ioi coihido em tubos capilares heparinizados por punção retro-orbital da veia plexus. A coloração imunofluorescente mostrou que a maior parte dos hepatócitos expressava o produto do transgene, seja β-galactosidase, rcceptor de LDL humano, ou receptor de VLDL. A coloração cor. heratcxilina e eosina de secções do fígado revelou morfologia ess-nc: nrente normal no murganho sujeito a infusão com H5.01OCMV! irZ. Kc entanto, para ambos os murganhos sujeitos a infusão cor. Ki. 010C3hL£LR e H5. OIOCMVVLDLR, os hepatócitos pareciam possj:r vacúoios internos. Quando o tecido foi analisado com coloração com óleo Vermelho O, uma coloração para lípidos neutros, o fígado de animais sujeitos a infusão com o receptor apresentou claramente a acumulação de grandes gotas de lípido quando comparado com o do controlo sujeito a infusão com H5.OlOCMVlacZ. Isto sugeriu que a expressão a curto termo de níveis elevados do receptor de LDL ou receptor de VLDL nestes murganhos deficientes em receptor de LDL resultou numa acumulação intracelular de lípidos.

Para confirmar as actividades biológicas dos produtos transgénicos, o colesterol do plasma foi seguido antes e depois da administração de adenovírus recombinante. A Fig.7A mostra que os níveis de colesterol no soro nos murganhos sujeitos a infusão com H5.OlOCMVlacZ demonstraram uma flutuação característica mas não significativa ao longo do tempo, reflectida em alterações menores de todas as fraeções de lipoproteínas (HDL, IDL/VLDL, e LDL) . Em contraste, murganhos sujeitos a infusão com H5.OlOCBhLDLR possuem um decréscimo grande mas não transiente em colesterol (ver, Fig. 7B) . Particularmente, estes murganhos demonstraram grandes decréscimos de colesterol no plasma que duraram aproximadamente 2 semanas. Os níveis de colesterol diminuíram 3 vezes (de 966 para 353 mg/dL) e 7 vezes (de 1554 a 219 mg/dL) e voltaram à linha de base 3 semanas após a infusão. 0 decréscimo no colesterol do soro é reflectida na diminuição 44

coordenada de LDL no soro. Este efeito não específico da inlecçâo de adenovirus quando não são administrados de forma coordenada imunomoduladores foi previamente descrita e é provavelmente devida a alterações na função hepática que ocorrem como resultado de inflamação associada. Murganhos sujeitos a infusão com H5.010CMW.DrJR apresentaram grandes decrcscimoo no colesterol do plasma que são semelhantes em magnitude aos observados em murganhos sujeitos a infusão com H5. OlOCBhLULR (Fig. 7C) , com decréscimos máximos de mais de 4 vezes (de 1186 a 288 mg/dL e de 1453 a 299 mg/dL) . Surpreendentemente, os níveis de colesterol no plasma não voltaram à linha de base 3 semanas após a infusão. A alteração nos níveis de colesterol do plasma nos murganhos sujeitos a infusão com H5.OlOCMVVI/DiR (Fig. 7D) foram estatisticamente significativos (p<0,05) ao longo de 9 semanas a seguir à infusão (a própria duração da experiência). O soro de murganhos individuais foi analisado por FPLC para determinar os efeitos da expressão do receptor de VLDL nas fracções de lipoproteína. No dia 3 após a infusão, não eram detectáveis as fracções VLDL e LDL; ao longo do tempo, a fracção LDL recuperou ligeiramente, embora mesmo às 10 semanas após infusão, a altura do pico de LDL era ligeiramente inferior do que a altura do pico de HDL. VLDL permaneceu não detectável apesar de diferenças menores poderem escapar à detecção devido às limitações de sensibilidade do ensaio de colesterol. Os picos de LDL espelharam os níveis de colesterol total no plasma, e confirmaram que o abaixamento prolongado do colesterol do plasma era acompanhado por decréscimos sustentados dos níveis de VLDL e LDL. Estes resultados sugerem que a expressão do receptor de VLDL no fígado é uma terapia eficaz para hipercolesterolémia.

Ao mesmo tempo da infu3ão em murganhos com o xeceptor de LDL interrompido, foram sujeitos a infusão murganhos normais C57B1/6 com cada um dos adenovirus recombinantes. Estes murganhos foram sacrificados a vários tempos após a infusão, e os tecidos do fígado foram colhidos para análise directa da 45 expressão do transgene utilizando histoquímica de X-gal para deter.fi,· ^ expressão de β-galactosidase e imunofluorescência realizada para medir a expressão do receptor de LDL. Os tecidos coir.:c:s trás dias após a infusão do virus demonstraram tanto a expresr :' β-galactosidase como do receptor de LDL humano em polc r~ -.~s ?0'-- doo hcpatócitos. ~~ d a experiência, o sinal especifico do vector foi subsr ->· . .mente maior do que o observado em animais antes da transt : . > dc gene ou após infusão com idênticas quantidades de um o :· r :v. r::s expressando um gene irrelevante. Para lacZ e receptc: .:·· 1VL, a expressão do transgene diminuiu para níveis não de·.* · r.veis pelo dia 21 e estava associada com o desenvei v.r*:.*.c de um infiltrado mononuclear autolimitado no fígado qa·. cpreser.tou pico no dia 10. O infiltrado consistia numa int^amação portal e lobular, acompanhada pela presença de corpos apópticos. A extensão da patologia foi indistinguível entre os murganhos sujeitos a infusão com lacZ ou receptor de LDL. 0 tempo de duração da expressão do receptor de LDL é consistente com a grande diminuição inicial do colesterol no plasma e subsequente retorno à linha de base.

Em contraste, dois murganhos sujeitos a infusão com H5.OlOCMVyiDIR expressavam o receptor de VLDL a níveis elevados. A percentagem de hepatócitos pode ter decrescido ligeiramente quando comparada com os murganhos do dia 5. Estes resultados sugerem que o decréscimo sustentado dos níveis de colesterol no plasma nos murganhos sujeitos a infusão com H5.010CMVVLDLR foi devido a expressão sustentada do receptor de VLDL.

Exemplo 6 - Estudos de "Turnover"

Para caracterizar adicionalmente os efeitos da expressão hepática do receptor de VLDL no metabolismo lipoproteico, foram efectuados estudos de "turnover" como se segue. 46

Murganhos com o receptor de LDL interrompido foram sujeitos α infusão com adenovirus recombinante após 3 semanas de dieta rica em colesterol como descrito no exemplo 4. Três ratos foram injectados cada um com os adenovirus lacZ e receptor de VLDL; um murganho foi injectado com o adenovirus do receptor de LDL. No dia 5 após a infusão, os murganhos foram injectados através da veia da cauda com aproximadamente 8xl06 cpm de LDL humano marcado com 125I, e l,6xl05 cpm de VLDL humano marcado com 131I num volume total de 0,2 mL. Foi obtida uma amostra de sangue 1 minuto após a injecção dos marcados radioactivamente, e designada como amostra "tempo zero". O sangue foi colhido em tubos capilares heparinizados nos tempos indicados, e a radioactividade que permanecia foi determinada utilizando um contador gama. A infusão do adenovirus do receptor de LDL levou a uma eliminação acelerada de LDL quando comparada com a infusão do adenovirus de lacZ, consistente com um estudo prévio em murganhos com o receptor de LDL interrompido [S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., 92: 883-893 (1993)]. Do mesmo modo, a eliminação de VLDL foi acelerada em animais tratados com o receptor de LDL quando comparada com murganhos sujeitos a infusão com lacZ. O "turnover" de LDL em murganhos sujeitos a infusão com o receptor de VLDL foi indistinguível de murganhos sujeitos a infusão com lacZ, consistente com resultados in vitro que indicam que LDL não é um ligando para o receptor de VLDL [T. Yamamoto et al., Trends in Cardiovascular Medicine, 3: 144-148 (1993) ; F. Batley et al., J. Biol. Chem., 269: 23268-23273 (1994) ]. A eliminação de VLDL em murganhos sujeitos a infusão com o receptor de VLDL foi ligeiramente mais rápida do que a de murganhos sujeitos a infusão com lacZ, mas significativamente mais lenta do que em murganhos sujeitos a infusão com o receptor de LDL.

Como acima discutido, o "turnover" de VLDL era murganhos sujeitos a infusão com o adenovirus do receptor de VLDL foi 47 significativamente mais rápido do que em murganhos sujeitos a infusão com o lacZ embora a magnitude deste efeito fosse muito menor do que a observada em animais tratados com o vírus do receptor de LDL. Isto sugere que a eliminação de VLDL em circulação mediada pelo receptor de VLDL pode não ser a única via que leva à diminuição de VLDL no soro. Um potencial mecanismo é secreção-recaptura, que ocorre com a incorporação hepática de quilomicrons que permaneceram [T. Willnow & J. Herz, J. Mol. Med., 73: 213-220 (1995); H. Shimano et al. , J. Clin. Invest., 93: 2215-2223 (1994)], e resultará em decréscimo de secreção de VLDL e reduzidos níveis de VLDL no plasma. Um segundo mecanismo pode envolver a interacção do receptor de VLDL com a proteína associada ao receptor (RAP) [Battey, citado acima; H. Mokuno et al., J. Biol. Chem. 269: 13238-13243 (1994)] que interage com uma variedade de receptores dentro da célula, aparentemente para evitar a ligação do ligando antes do receptor atingir a superfície da célula [G. Bu et al., EMBO J., 14: 2269-2280 (1995)]. É possível que os elevados níveis de receptor de VLDL expresso nos fígados de murganhos sujeitos a infusão com adenovírus ultrapasse a RAP disponível, de modo a que o receptor de VLDL se ligue a ligando sintetizado de novo (apoE, seja livre ou em associação com lípido) na célula, e evitando a sua secreção no plasma. Os efeitos da expressão hepática do receptor de VLDL no colesterol total do plasma assim como nos níveis de colesterol em lipoproteína demonstram que o receptor de VLDL pode desempenhar um papel mais importante no metabolismo in vivo.

Exemplo 7 - Estabilidade da Expressão do Receptor de VLDL

Esta experiência ilustra a persistência relativa de transgenes em murganhos. 48

Murganhos com o receptor de LDL interrompido foram injectados intravenosamente no dia 0 com lxlO11 partículas de H5 . OlOCMVlacZ, H5.OlOCBhLDLR, ou H5.010CMVVXDLR. Os murganhos foram sacrificados nos dias indicados após injecção (3, 10 ou 21), e secções do fígado congeladas de fresco foram coradas com X-gul para dctcctar a cxprcooão do gene lacZ, e com anticorpo anti-receptor de LDL ou anticorpo anti-receptor de VLDL, seguido por um segundo anticorpo conjugado com fluoresceína para detectar o receptor de LDL e o receptor de VLDL, respectivamente. A análise do fígado colhido 3 dias após infusão do vírus revelou proteína do receptor de VLDL em >80% dos hepatócitos; o sinal fluorescente brilhante, que se localizou no perímetro da célula estava ausente antes do gene ser transferido e em tecidos de animais infectados com adenovírus contendo lacZ ou receptor de LDL. A expressão da proteína do receptor de VLDL foi notavelmente estável com proteína recombinante detectada em aproximadamente 5 a 10% de hepatócitos de tecido colhido 105 dias depois da infusão do vírus. Isto está surpreendentemente em contraste com os resultados obtidos pelo lacZ e receptor de LDL do adenovírus, em que a expressão do transgene se extinguiu a níveis não detectáveis em três semanas de transferência de gene. A expressão do receptor de VLDL permaneceu detectável durante a duração da experiência (22 semanas) . O ADN genómico foi isolado de fígado de rato, digerido com .EcoRI, e sujeito a transferência de Southern [K. Kozarski et al., J.Biol.Chem., 269:13695-13702 (1994)] para monitorizar a presença ao longo do tempo de sequências de ADN adenoviral. As sequências de adenovírus foram detectadas utilizando o kit Genius de Boehringer Mannheim, seguido por detecçâo por quimioluminescência. Em murganhos C57BL/6 sujeitos a infecção com o adenovírus lacZ, o ADN virai diminuiu rapidamente com o tempo, estacionando a níveis quase não detectáveis (0,05 cópias por célula) até au dia 70 após a infusão. Os murganhos sujeitos 49 a infusão com o receptor VLDL tinham níveis de ADN ligeiramente mais altos, mas um tempo semelhante de perda de sequências de adenovírus. Estudos adicionais de hibridação de ADN mostraram que a maioria do ADN de adenovírus inicialmente deixado no fígado não é integrado no genoma do murganho (resultados não apresentados), no entanto, este ensaio não pode excluir algum nível de integração. A análise histopatológica do tecido do fígado de murganhos sujeitos a infusão com o receptor VLDL do vírus revelou inflamação e células apoptóticas em pontos de tempo mais iniciais. A duração e a extensão das observações patológicas eram indistinguíveis de tecidos de fígado de murganhos sujeitos a infusão com vírus do lacZ e do receptor de LDL. Às 15 e 22 semanas após a infusão, no entanto, tecido de fígado de murganho sujeito a infusão com receptor de VLDL apresentou acumulações discerníveis de lípidos neutrais, como demonstrado por coloração com hematoxilina e eosina assim como com óleo vermelho 0. Foram observadas alterações semelhantes pouco frequentes em murganhos com o receptor de LDL interrompido sujeitos a infusão com PBS, receptor de VLDL e/ou adenovírus lacZ. Não foram observadas acumulações de lípidos em fígados de murganhos normais C57BL/6 sujeitos a infusão com o vírus do receptor de VLDL, apesar da expressão do transgene a longo prazo ser indistinguível da observada em murganhos com o receptor de LDL interrompido. Isto indica que a expressão do receptor de VLDL por si só não é suficiente para as alterações na acumulação de lípidos observada em murganhos com o receptor de LDL interrompido; em vez disso, existe alguma acumulação de lípido em murganhos com o receptor de VLDL interrompido que foram mantidos numa dieta rica em colesterol durante >18 semanao, que é acelerada por expressão prolongada do receptor de VLDL.

Amostras de plasma de murganhos sujeitos a infusão com o receptor de VLDL de adenovírus foram analisados quanto à presença de anticorpos dirigidos contra a proteína receptor de 50 VLDL. Apenas um murganho em doze produziu anticorpos contra o receptor de VLDL apesar da presença de um elevado nível de

anticorpos contra as proteínas da cápsula do adenovírus em cada animal que recebeu o vírus. Animais sujeitos a infusão com o receptor de VLDL do adenovírus desencadearam uma resposta de CTL contra as proteínas do adenovírus indistinguível da obtida de animais sujeitos a infusão seja com adenovírus do lacZ ou do receptor de LLi.. roles murganhos, no entanto, não desencadearam uma resposta c·.· CTL contra a proteína do receptor de VLDL.

Assim, o deser.v:vimento de uma resposta de CTL ao transgene após a infusão cie adenovírus recombinante é dependente da antigenicidade cc trar.saone específico no animal tratado.

Exemplo 8: Resposta Imunitária Humoral e Celular Contra

Adenovírus e Transeenes A. Resposta Imunitária Humoral

Dois murganhos com o receptor de LDL interrompido (K020 e K027) ou dois murganhos normais C57BL/6 foram injectados através da veia da cauda com lxlO11 partículas de H5. OlOCBhLDLR no dia 0 e foram colhidas amostras de soro antes da injecção (pre), e nos dias 10, 24, 39, 52 e 70 depois da injecção para os murganhos interrompidos e no dia 21 para os murganhos C57BL/6. Foram realizadas transferências de Western como previamente descrito [K. Kozarsky et al., J. Biol. Chem. 269: 13695-13702 (1994); K. Kozarsky et al., Som. Cell and Molec. Genet., 19: 449-458 (1993)]. Para detectar anticorpos anti-adenovírus, foi utilizado adenovírus purificado como antigénio. O controlo positivo (+) foi anti-soro de coelho isolado após infusão intravenosa de H5. OlOCBhLDLR purificado. 0 controlo negativo (-) foi soro pré-imunizado de coelho. As transferências de Western com β-galactosidase foram efectuadas utilizando proteína purificada 51 (Sigma), com um anticorpo monoclonal específico para β-galactosidase (Sigma) como um controlo positivo.

Anticorpos dirigidos contra o receptor de LDL humano foram detectados utilizando lisados preparados de células 24-23, uma linha de células 3T3 que foi sujeita a transdução com retrovírus codificando para o rcccptor de LDL humano. Para a detecçao de anticorpos anti-receptor de VLDL, foi preparado um lisado a partir de células HeLa dois dias após a infecção com H5.010 CMVVLDLR.

Todos os murganhos sujeitos a infusão com lxlO11 partículas de adenovírus recombinante desenvolveram anticorpos contra proteínas da cápsula de adenovírus, com as bandas maiores a corresponder a hexon, penton e fibra. Todos os murganhos sujeitos a infusão com H5.OlOCBhLDLR desenvolveram anticorpos contra a proteína do receptor de LDL humano com os murganhos com o receptor de LDL interrompido desenvolvendo consistentemente um mais elevado título de anticorpos do que os murganhos C57BL/6. Os anticorpos dos murganhos com o receptor de LDL interrompido reagiram de forma cruzada com proteína do receptor de LDL de murganho, enquanto anticorpos de murganhos C57BL/6 (que expressam o receptor LDL normal de murganho) não reagem.

Isto sugere que o receptor VLDL, embora tenha sido utilizada a sequência de humano e não de murganho, não era imunogénica nestes murganhos. As sequências de aminoácido dos receptores de LDL humanos e de murganho são aproximadamente idênticas em 7 8%, enquanto os receptores de VLDL humano e de murganho são > 94% idênticos. Esta semelhança de sequências aumentada contribui provavelmente para a ausência de desenvolvimento de anticorpos contra o receptor de VLDL humano apesar do elevado nível de expressão no figado de murganho como resultado da infusão de H5.010CMVVLDLR.

Estes resultados demonstram que os animais podem produzir uma resposta imunitária humoral específica para o produto do transgene assim como para as proteínas virais codificadas pelo 52 adenovírus injectado. Proporciona também evidência indirecta de activação ^pecif ica pelo antigénio de células T auxiliares, que é norr. -'.r-'-n*.e necessária para o desenvolvimento de células B, madura', socretoras de anticorpos. B. Rerç::;js Imunitárias Celulares

Er*.·· estudo analisou animais após infusão com o adenovírus de re · ·. · - : de LDL para activação de CTLs tanto para antigénios virais - ~ p^ra o produto do transgene, receptor de LDL humano.

Os ensaios foram realizados como descrito em Y. Yang et al., Ir.r.ur.ity, 1: 433-442 (1994). As células alvo expressando proteí c- vaccinia recombinante foram produzidas por infecção com vaccir.:a recomoinante produzido como se segue. 0 ADNc do receptor oe YLDL (no plasmídeo pRC/CMV) foi subclonado no sítio HindIII de B.uescript KS+. 0 ADNc de CFTR [J. R. Riordan et al., Science, 245: 1066-1073 (1989) foi clonado no sítio PstI de Bluescript K3+ (Scratagene) . 0 ADNc do receptor de LDL no vector pUC19 [T. Yamamoto et al., Cell, 39: 27-38 (1984)] foi excisado com as enzimas de restrição HindIII e Sac 1 e ligado nos sítios

HindiII e Saci de Bluescript KS+. Cada um dos ADNc foi então excisado utilizando as enzimas Sacll e Kpnl e clonado nos sítios Sacll e Kpr.l de uma forma modificada do vector de expressão de vaccinia pSCll [3. Chakrabarti et al., Molec. Cell Biol., 5: 3403-3409 (1985)]. A vaccinia recombinante controlo, VRG, expressa uma glicoproteína do vírus da raiva e foi preparada como descrito em T. Wiktor et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 7194-7198 (1984).

Foram detectados CTLs para alvos específicos num ensaio convencional de libertação de 51crómio (51Cr) cm que células alvo compatíveis com MHC foram infectadas com adenovírus recombinante ou vírus vaccinia que expressam produtos de gene únicos relevantes. A Fig. 10 apresenta um exemplo de um ensaio de libertação de 51Cr em que a % de lise específica é medida como 53 uma função do aumento da proporção efector alvo (Fig. 10B) , assim como um sumário dos dados cumulativos (Fig. 10A) . Os esplenócitos de murganhos C57BL/6 sujeitos a infusão com adenovirus recombinante contendo receptor de LDL humano ou CFTR humano foram avaliados quanto à sua capacidade de lisar alvos infectados com adenovirus recombinante, para medir actividadc contra proteínas virais, ou com vírus vaccinia contendo receptor de LDL, para medir a actividade contra a proteína do receptor de LDL. A actividade citolítica foi demonstrada com linfócitos de animais infectados com o vírus do receptor de LDL para atingir células infectadas com o mesmo vírus. Não foi detectada citólise para simular alvos infectados apoiando a especificidade do ensaio. Estas mesmas células efectoras demonstraram actividade citolítica significativa contra alvos infectados com o vírus vaccinia do receptor de LDL que não estava presente quando infectadas com um vaccinia controlo. Estas experiências forneceram evidência forte para a presença de CTL activada contra o receptor de LDL humano em murganhos C57BL/6 após terapia génica.

Exemplo 9 - Melhoramento da Transferência de Genes Mediada por Adenovirus durante a Segunda Administração com IL-12 e IFN-τ em Pulmão de Murganho

Os adenovirus recombinantes H5. OlOCMVlacZ e H5.010CBALP (gene da fosfatase alcalina expresso a partir do promotor melhorado da β-actina de CMV na estrutura de sub360) foram utilizados neste exemplo. Cada vírus semelhante expressa um gene repórter diferente cuja expressão pode ser discriminada da do primeiro gene repórter.

Murganhos fêmea C57B1/6 (6~8 semanas de idade) foram infectados com suspensões de H5.010CBALP (lxlO9 pfu em 50 μΕ de PBS) através da traqueia no dia 0 e do mesmo modo com HD.OlOCMVlacZ no dia 28. Um grupo desses murganhos foi utilizado 54 como controlo. Outro grupo de murganhos foi precisamente empobrecido em células CD4+por injecção i.p. de anticorpo contra células CD4+ (GK1.5; ATCC N° TIB207, diluição de ascites 1:10) na altura do inicio da terapia génica (dias -3, 0, e +3) . Um terceiro grupo de murganhos foi injectado com IL-12 (1 μg intratraqueal ou 2 μgr injecções i.p.) na altura da primeira administração do vírus (dias 0 e +1) . Um quarto grupo de murganhos foi injectado com interferão gama (1 μg intratraqueal ou 2 pg, injecções i.p.) na altura da primeira administração do virus (dias 9 e +1).

Quando os murganhos foram subsequentemente eutanizados e necropsiados aos dias 3, 28, ou 31, os tecidos do pulmão foram preparados para criossecções, enquanto a lavagem bronquial alveolar (BAL) e nódulos linfáticos mediastinais (MLN) foram colhidos para ensaios imunológicos. A. Criossecções

Os tecidos de pulmão foram avaliados quanto à expressão da fosfatase alcalina por coloração histoquímica seguindo os procedimentos de Y. Yang et al., acima citado. A instilação de vírus com fosfatase alcalina (109 pfu) na via aérea de todos os grupos de murganhos C57B1/6 resultou num elevado nivel de expressão do transgene na maior parte das vias de condução de ar que diminui para níveis indetectáveis pelo dia 28. A perda da expressão do transgene mostrou ser devida a eliminação mediada por CTL dos hepatócitos geneticamente modificados [Y. Yang et al., acima citado].

Nos murganhos controlo, não foi detectada expressão do gene três dias após a segunda administração do vírus, isto é, no dia 31. A administração de vírus aos animais empobrecidos em células CD4+ foi associada a elevados níveis de expressão do 55 transgene que era estável durante um mês. A expressão do segundo vírus toi detectada no dia 31. 0 elevado nível inicial de transferência de genes diminuiu depois de cerca de um mês nos murganhos tratados com IL-12; no entanto, em contraste com o controlo, o nível elevado de transferência de genes para as células epitcliaio da via aérea foi conseguido quando o vírus foi re-administrado a animais tratados com IL-12 no dia 28, como verificado nos resultados de dia 31.

Os animais tratados com interferão gama foram virtualmente indistiguíveis dos animais tratados com IL-12 uma vez que foi conseguida transferência de gene eficiente após uma segunda administração do vírus.

B. Ensaios Imunológicos - MNL

Linfócitos de MLN do grupo controlo e do grupo tratado com IL-12 dos murganhos C57B1/6 colhidos 28 dias após administração de H5.010CBALP foram re-estimulados in vitro com H5.OlOCMVlacZ inactivado por UV a 10 partículas/ célula durante 24 horas. Os sobrenadantes isentos de células foram ensaiados quanto à presença de IL-2 ou IL-4 em células HT-2 (uma linha de células dependente de IL-2 ou IL-4) [Y. Yang et ai., citado acima]. A presença de IFN-γ no mesmo sobrenadante da cultura de linfócitos foi medida em células L929 como descrito [Y. Yang et ai., citado acima]. O índice de estimulação (S.I.) foi calculado dividindo a cpm de 3H-timidina incorporada por células HT-2 cultivadas em sobrenadantes de linfócitos re-estimulados com vírus pela incorporada por células HT-2 cultivadas em sobrenadantes de linfócitos incubados em meio sem antigénio.

Os resultados são apresentados na Tabela 1 abaixo. 56

Tabela 1

Inccr poração de 3H-timidina (cpm±DP) litro IFN-γ (IU/ml)d Meio HO 510CMVlacZ S. I. C57B1/6 175±40 2084+66 11,91 80 Anii-IL.2 ΐ i; 5 0 0 0) 523±81 2,98 Anti-IL·'. ( 1:5000) 1545133 8,83 C57 21 £ • 1112 247134 5203128 21,07 160 Anti-:LL ,-.:5000) 776150 3, 14 Anti-i: ·; ; ·. : 5 0 00) 4608152 18,66 A est.imulação de linfócitos de nódulos linfáticos regionais com ambos os adenovírus recombinantes levou à secreção de citoquinas especificas para a activação dos subconjuntos de células T auxiliares TH1 (i.e., IL-2 e IFN-γ) e TH2 (i.e., IL-4) (Tabela 1) . A análise de linfócitos de animais tratados com IL-12 estimulados in vitro com vírus revelou uma secreção aumentada de IL-2 e IFN-γ e uma diminuição relativa na produção de IL-4 quando comparada com animais que não receberam IL-12 (i.e., a proporção IL-2/IL-4 foi aumentada de 3 para 6 quando é utilizado IL-12; Tabela 1) .

C. Ensaios Imunológicos - BAL

Amostras de BAL obtidas de animais 28 dias após a primeira exposição ao vírus recombinante foram avaliadas quanto à neutralização de anticorpos contra adenovírus e isotipos de anticorpos anti-adenovirus como se segue. Os mesmos quatro grupos de murganhos C57B1/6, isto é, controlo, empobrecidos para CD4 + , tratados com IL-12 e tratados com IFN-γ, foram infectados com H5.010CBALP. A neutralização de anticorpos foi medida em diluições seriadas de amostras de BAL (100 μί) que foram misturadas com H5.OlOCMVlacZ (lxlO6 pfu em 20 μί) , incubadas durante 1 hora a 37°C, e aplicadas a 80% de células HeLa 57 confluentes em placas de 96 poços (2xl04 células por poço) . Após 60 minutos de incubação a 37°C, foram adicionados a cada poço 100 μΐϋ de DMEM contendo FBS a 20%. As células foram fixadas e coradas para a expressão de β-galactosidase no dia seguinte.

Todas as células foram positivas para lacZ na ausência de anticorpos ar.t i-adenoviiais . 0 isotipc ao anticorpo especifico para adenovirus foi determinado em r·utilizando o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA,· . Resumidamente, placas de 96 poços foram revestidas com ICC μΐ de PBS contendo 5xl09 partículas de H5.OlOCMVlacZ durante 18 horas a 4°C. Os poços foram lavados 5 vezes com PBS. Após bloquear com 200 μΤ de BSA a 2% em PBS, as placas foram lavadas uma vez com PBS e incubadas com amostras BAL diluídas 1:10 durante 90 minutos a 4°C. Seguidamente, os poços foram extensivamente lavados e de novo cheios com 100 μΙ* de anti-IgG ou IgA de murganho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) diluído de 1:1000. As placas foram incubadas, subsequentemente lavadas 5 vezes, e foram adicionados 100 μΐϋ da solução de substrato (fosfato de p-nitrofenilo, PNPP) em cada poço. A conversão do substrato foi interrompida pela adição de 50 μL de EDTA a 0,1 M. As placas foram lidas a 405 nm.

Os resultados são graficamente apresentados nas Figs. 11A a 11C, que sumarizam o título de anticorpos neutralizantes, e as quantidades relativas (DO^os) de IgG e IgA presente em amostras BAL. O título de anticorpos neutralizantes para cada amostra foi reportado como a maior diluição com menos de 50% de células coradas de azul.

Como demonstrado na primeira barra das Figs. 11A a 11C, as cifoquinas identificadas na Tabela 1 acima foram associadas nos murganhos controlo com o aparecimento de anticorpos contra proteínas de adenovirus em BAL de ambos os isotipos IgG e IgA que eram capazes de neutralizar o vector recombinante Ad5 humano num ensaio in vitro até uma diluição de 1:800. 58

Como apresentado na segunda barra dos gráficos das Figs. 11A a lic, υ empobrecimento transiente de células CD4+ inibiu a formação de anticorpo neutralizante (Fig. 11A) e anticorpo IgA especifico para vírus (Fig. 11C) em 80 vezes, permitindo assim que ocorresse uma transferência de gene eficiente após uma segunda administração de virus. Ά Fig. 11B apresenta uma ligeira inibição também de IgG.

Mais importante, como apresentado na terceira barra dos três gráficos, IL-12 bloqueia selectivamente a expressão de IgA especifica para o antigénio (Fig. 11C), sem impacto significativo na formação de IgG (Fig. 11B) . Isto foi concordante com uma redução de 32 vezes do anticorpo neutralizante (Fig. 11A) .

Os animais tratados com interferão gama (quarta barra das Figs. 11A a 11B) foram virtualmente indistinguíveis dos animais tratados com IL-12 na medida em que a IgA específica de vírus (Fig. 11C) e anticorpo neutralizante (Fig. 11A) diminuíram quando comparado com os animais controlo não tratados com citoquina, mas não na extensão obtida com os tratados com IL-12.

Estes estudos demonstraram que a inibição da função CD4+ na altura da primeira exposição ao vírus é suficiente para evitar a formação de anticorpos bloqueantes. A redução concordante de anticorpo neutralizante com IgA anti-viral sugere que a imunoglobulina do subtipo IgA é em primeiro lugar responsável pelo bloqueio da transferência de genes. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Trustees of University of Pennsylvania Wilson, James, M.

Kozarsky, Karen, F. 59

Strauss, Jerome F. (i i i TÍTULO DA INVENÇÃO: Métodos e Composições de Terapia Gér.ica para o Tratamento de Defeitos no Metabolismo Lipoproteico NUMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 :. v endereço para correspondência: iA; ENDEREÇADO: Howson and Howson 1:-! EUA: Spring House Corporate Cntr., PO Box 457 'C> CIDADE: Spring House iD; ESTADO: Pensilvânia

;E> PAIS: EUA 'Γ) CÓDIGO POSTAL: 19477

(v) FORMATO DE LEITURA EM COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin Release #1.0,

Versão #1.30

(vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DO FICHEIRO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERTOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/393 734 (B) DATA DE FICHEIRO: 24-FEV-1995 60 (vii) ADVOGADO/AGENTE DE INFORMAÇÃO: (A) NOME: Bak, Mary E. (B) NÚMERO DE REGISTO: 31 215 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE REGISTO: GHVPHOO9CIP1.PCT (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 215-540-9200 (B) TELEFAX: 215-540-5818 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3656 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍ ST ICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÕES 392..3010 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: 61 CTCTGCGGGC CGCGGGTGCG GGTCGTCGCT ACCGGCTCTC TCCGTTCTGT GCTCTCTTCT 60 GCTCTCGGCT CCCCACCCCC TCTCCCTTCC CTCCTCTCCC CTTGCCTCCC CTCCTCTGCA 120 C-CGCCTGCAT TATTTTCTGC CCGCAGCTCG GCTTGCACTG CTGCTGCAGC CCGGGGAGGT 180 GoC I'GGGTGG GTGGGGAGGA GACTGTGCAA GTTGTAGGGG AGGGGGTGCC CTCTTCTTCC 240 CCGCTCCCTT CCCCAGCCAA GTGGTTCCCC TCCTTCTCCC CCTTTCCCCT CCCAGCCCCC 300 ACCTTCTTCC TCTTTCGGAA GGGCTGGTAA CTTGTCGTGC GGAGCGAACG GCGGCGGCGG 360 CGGGGGCGGC GGCACCATCC AGGCGGGCAC C ATG GGC ACG TCC GCG Met Gly Thr Ser Ala 1 5 CTC TGG Leu Trp 412 2 GCC GTC TGG CTG CTG CTC GCG CTG TGC TGG GCG CCC CGG GAG AGC GGC 4 60 Ala Vai Tro 1Ò Leu Leu Leu Ala Leu 15 Cys Trp Ala Pro Arg 20 Glu Ser Gly GCC ACC GGA ACC GGG AGA AAA GCC AAA TGT GAA CCC TCC CAA TTC CAG 508 Ala 25 Thr Gly Thr Gly Arg 30 Lys Ala Lys Cys Glu 35 Pro Ser Gin Phe Gin TGC ACA AAT GGT CGC TGT AAT ACG CTG TTG TGG AAA TGT GAT GGG GAT 556 Cys 40 Thr Asn Gly Arg Cys 45 Ile Thr Leu Leu Trp 50 Lys Cys Asp Gly Asp 55 GAA GAC TGT GTT GAC GGC AGT GAT GAA AAG AAC TGT GTA AAG AAG ACG 604 Glu Asp Cys Vai Asp Gly 60 Ser Asp Glu Lys 65 Asn Cys Vai Lys Lys 70 Thr TGT GCT GAA TCT GAC TTC GTG TGC AAC AAT GGC CAG TGT GTT CCC AGC 652 Cys Ala Glu Ser 75 Asp Phe Vai Cys Asn 80 Asn Gly Gin Cys Vai 85 Pro Ser CGA TGG AAG TGT GAT GGA GAT CCT GAC TGC GAA CAT GGT TC A GAT GAA 700 Arg Trp Lys 90 Cys Asp Gly Asp Pro 95 Asp Cys Glu Asp Gly 100 Ser Asp Glu AGG CCA GAA CAG TGC CAT ATG AGA ACA TGC CGC ATA CAT GAA ATC AGC 748 Ser Pro 105 Glu Gin Cys His Met 110 Arg Thr Cys Arg Ile 115 His Glu Ile Ser TGT GGC GCC CAT TCT ACT CAG TGT ATC CCA GTG TCC TGG AGA TGT GAT 796 Cys 120 Gly Ala His Ser Thr 125 Gin Cys Ile Pro Vai 130 Ser Trp Arg Cys Asp 135 GGT GAA AAT GAT TGT GAC AGT GGA GAA GAT GAA GAA AAC TGT GGC AAT 884 Gly Glu Asn Asp Cys 140 Asp Ser Gly Glu Asp 145 Glu Glu Asn Cys Gly 150 Asn ATA ACA TGT AGT CCC GAC GAG TTC ACC TGC TCC AGT GGC CGC TGC ATC 892 Ile Thr Cys Ser 155 Pro Asp Glu Phe Thr 160 Cys Ser Ser Gly Arg 165 Cys Ile 940r\

TCC AGG AAC TTT GTA TGC AAT GGC CAG GAT GAC TGC AGC GAT GGC AGT Ser Arg Asn 170 Phe Vai Cys Α3Π Cly 175 Gin Asp Asp Cys Sor 180 Asp Gly Ser GAT GAG CTG GAC TGT GCC CCG CCA ACC TGT GGC GCC CAT GAG TTC CAG Asp ias Glu Leu Asp Cys Ala Pro 190 Pro Thr Cys Gly Ala 195 His Glu Phe Gin TGC AGC ACC TCC TCC TGC ATC CCC ATC AGC TGG GTA TGC GAC GAT GAT Cys 200 Cer Thr Scr Ser Cys 205 n p Pro Tle Ser Trp 210 Vai Cys Asp Asp Asp 21b GCA GAC TGC TCC GAC CAA TCT GAT GAG TCC CTG GAG CAG TGT GGC CGT Ala Asp Cys Ser Asp 220 Gin Ser Asp Glu Ser 225 Leu Glu Gin Cys Gly Arg 230 CAG CCA GTC ATA CAC ACC AAG TGT CCA GCC AGC GAA ATC CAG TGC GGC Gin Pro Vai Ile 235 His Thr Lys Cys Pro 240 Ala Ser Glu Ile Gin 245 Cys Gly TCT GGC GAG TGC ATC CAT AAG AAG TGG CGA TGT GAT GGG GAC CCT GAC Ser Gly Glu 250 Cys Ile His Lys Lys 255 Trp Arg Cys Asp Gly 260 Asp Pro Asp TGC AAG GAT GGC AGT GAT GAG GTC AAC TGT CCC TCT CGA ACT TGC CGA Cys Lys 265 Asp Gly Ser Asp Glu 270 Vai Asn Cys Pro Ser 275 Arg Thr Cys Arg CCT GAC CAA TTT GAA TGT GAG GAT GGC AGC TGC ATC CAT GGC AGC AGG Pro 280 Asp Gin Phe Glu Cys 285 Glu Asp Gly Ser Cys 290 Ile His Gly Ser Arg 295 CAG TGT AAT GGT ATC CGA GAC TGT GTC GAT GGT TCC GAT GAA GTC AAC Gin Cys Asn Gly Ile Arg Asp Cys Vai Asp Gly Ser Asp Glu Vai Asn 300 305 310 TGC AAA AAT GTC AAT CAG TGC TTG GGC CCT GGA AAA TTC AAG TGC AGA Cys Lys Asn Vai Asn Gin Cys Leu Gly Pro Gly Lys Phe Lys Cys Arg 315 320 325 AGT GGA GAA TGC ATA GAT ATC AGC AAA GTA TGT AAC CAG GAG CAG GAC Ser Gly Glu Cys Ile Asp Ile Ser Lys Vai Cys Asn Gin Glu Gin Asp 330 335 340 TGC AGG GAC TGG AGT GAT GAG CCC CTG AAA GAG TGT CAT ATA AAC GAA Cys Arg Asp Trp Ser Asp Glu Pro Leu Lys Glu Cys His Ile Asn Glu 345 350 355 TGC TTG GTA AAT AAT GGT GGA TGT TCT CAT ATC TGC AAA GAC CTA GTT Cys Leu Vai Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Ile Cys Lys Asp Leu Vai 360 365 370 375 ATA GGC TAC GAG TGT GAC TGT GCA GCT GGG TTT GAA CTG ATA GAT AGG Ile Gly Tyr Glu Cys Asp Cys Ala Ala Gly Phe Glu Leu Ile Asp Arg 380 385 390 AAA ACC TGT GGA GAT ATT GAT GAA TGC CAA AAT CCA GGA ATC TGC AGT Lys Thr Cys Gly Asp Ile Asp Glu Cys Gin Asn Pro Gly Ile Cys Ser 395 400 405 988 1036 1084 1132 1180 1228 1276 1324 1372 1420 1468 1516 1564 1612 i 63 CAA ATT TGT ATC AAC TTA AAA Gin Tl p Cys 410 Ile Asn Leu Lys GCC TAT CAA ATG GAT CTT GCT Ala Tyr 425 Gin Met Asp Leu Ala 430 GAG CCA AGT CTG ATC TTC ACT Glu 440 Pro Ser Leu Ile Phe 445 Thr TTA GAG AGC t V *J* i GAA TAT ATC Leu Glu Arg Lys Glu 4 60 Tyr Ile GTG GCT CTC GAI GCT GAC ATT Vai Ala Leu As D 4 75 Ai a Asp Ile CTA AGC CAA mAG GCT ATC TTC Leu Ser Glri 490 Lys Ala lie Phe AGA CAT GTT AAA ATG ATC GAC Arg His 505 Vai Lys Met Ile Asp 510 GTT GAT TGG GTG TAC AAG ACC Vai 520 Asp Trp Vai Tyr Lys 5z5 Thr ACT ATT TCA GTA GCT ACC CTA Thr Ile Ser Vai Ala 540 Thr Leu AAC TCT GAC TTG CGA GAG CCT Asn Ser Asp Leu 555 Arg Glu Pro GGC TTT GTT TAC TGG TCA GAC Gly Phe Vai 570 Tyr Trp Ser Asp GCA GGA ATG AAT GGA TTC GAT Ala Gly 585 Met Asn Gly Phe Asp 590 CAG TGG CCT AAC GGA ATT ACA Gin 600 Trp Pro Asn Gly Ile 605 Thr TGG CTT GAT TCT AAG TTG CAC Trp Leu Asp Ser Lys 620 Leu His CAA GAT CGT AGG ATA GTA CTA Gin Asp Arg Arg 635 Ile Vai Leu CTT GCA CTA ACA ATA TTT GAC Leu Ala Leu Thr Ile Phe Glu GGC GGT TAC AAG TGT GAA Gly Gly Tyr Lys Cys Glu 415 420 ACT GGC GTG TGC AAG GCA Thr Gly Vai Cys Lys Ala 435 AAT CGA AGA GAC ATC AGG Asn Arg Arg Asp Ile Arg 450 CAA CTA GTT GAA CAG CTA Gin Leu Vai Glu Gin Leu 465 GCT GCC CAG AAA CTA TTC Ala Ala Gin Lys Leu Phe 480 AGT GCC TCA ATT GAT GAC Ser Ala Ser Ile Asp Asp 4 95 500 .AAT GTC TAT AAT CCT GCA Asn Vai Tyr Asn Pro Ala 515 ATC TAC TGG ACT CAT GCG Ile Tyr Trp Thr 530 Asp Ala GAT GGA ACC AAG AGG AAG Asp Gly Thr Lys Arg Lys 545 GCC TCC ATA GCT GTG GAC Ala Ser Ile Ala Vai Asp 560 TGG GGT GAA CCA GCT AAA Trp Gly Glu Pro Ala Lys 575 580 AGA CGT CCA CTG GTG ACA Arg Arg Pro Leu Vai Thr 595 CTT GAC CTT ATA AAA AGT Leu Asp Leu Ile Lys Ser 610 ATG TTA TCC AGC GTG GAC Met Leu Ser Ser Vai Asp 625 AAG TCT CTG GAG TTC CTA Lys Ser Leu Glu Phe Leu 640 GAT CGT GTC TAC TGG ATA Asp Arg Vai Tyr Trp Ile 655 660 TGT AGT CGT 1660

Cys Ser Arg CTA GGC AAA 1708

Vai Gly Lys AAG ATT GGC 1756

Lys Ile Gly 400 AGA AAC ACT 1804

Arg Asn Thr 470 TGG GCC GAT 1852

Trp Ala Asp 485 AAG GTT GGT 1900

Lys Vai Gly GCC ATT GCT 1948

Ala Ile Ala GCT TCT AAG 1996

Ala Ser Lys 535 TTC CTG TTT 2044

Phe Leu Phe 550 CCA CTG TCT 2092

Pro Leu Ser 565 ATA GAA AAA 2140

Ile Glu Lys GCG GAT ATC 2188

Ala Asp Ile CGC CTC TAT 2236

Arg Leu Tyr 615 TTG AAT GGC 2284

Leu Asn Gly 630 GCT CAT CCT 2332

Ala His Pro 645 GAT GGG GAA 2380

Asp Gly Glu 64 650 AAT GAA GCA GTC TAT GGT GCC AAT AAA TTC ACT GGA TCA GAG CAT GCC 2428 Asn Glu 665 Ala Vai Tyr Gly Ala 670 Asn Lys Phe Thr Gly 675 Ser Glu Hi r Ala ACT CTA GTC AAC AAC CTG AAT GAT GCC CAA GAC ATC ATT GTC TAT CAT 2476 Thr 680 Leu Vai Asn Asn Leu 685 Asn Asp Ala Gin Asp 690 Ile Ile Vai Tyr His 695 GM CTT GTA CAG CCA TCA GGT AAA AAT TGG TGT GAA GAA GAC ATG GAG 2524 Glu T.<=>n Va i. Gin Pro "10 Sor Gly Lys Asn Trp /05 Cys Glu Glu Asp Met 710 Glu AAT GGA GGA TG7 n · · 7A~ CTA TGC CTG CCA GCA CCA CAG ATT AAT GAT 2572 Asn Gly Gly Cys 7:5 Lí - J Leu Cys Leu 720 Pro Ala Pro Gin Ile 725 Asn Asp CAC TCT CCA ΑΛΛ ta : ACC TGT 'J cc TGT CCC AGT GGG TAC AAT GTA GAG 2620 His Ser Pro 730 Lys . . * I Cys Ser 735 Cys Pro Ser Gly Tyr 740 Asn Vai Glu GAA AAT GGC CGA GA.: TC-7 CAA ACT ACT GCA ACT ACT GTG ACT TAC AGT 2668 Glu Asn 7 4 5 Gly Arg - G1 n 7 50 Ser Thr Ala Thr Thr 755 Vai Thr Tyr Ser GAG ACA AAA GAT ACG AAC ACA ACA ΟΛΑ ATT TCA GCA ACT AGT GGA CTA 2716 Glu 760 Thr Lys Asp Tnr Asn 7 6 5 Thr Thr Glu Ile Ser 770 Ala Thr Ser Gly Leu 775 GTT CCT GGA GGG ATC AAT GTG ACC ACA GCA GTA TCA GAG GTC AGT GTT 2764 Vai Pro Gly Gly Ile 78C Asn Vai Thr Thr Ala 795 Vai Ser Glu Vai Ser 7 90 Vai CCC CCA AAA GGG ACT TCT GCC GCA TC-G GCC ATT CTT CCT CTC TTG CTC 2812 Pro Pro Lys Gly 795 Tr.r Ser Ala Ala Trp 800 Ala Ile Leu Pro Leu 805 Leu leu TTA GTG ATG GCA GCA GTA GGT GGC TAC TTG ATG TGG CGG AAT TGG CAA 2860 Leu Vai Met 810 Ala Ala Vai Gly Gly 815 Tyr Leu Met Trp Arg 820 Asn Trp Gin CAC AAG AAC ATG AAA AGC ATG AAC TTT GAC AAT CCT GTG TAC TTG AAA 2908 His Lys 825 Asn Met Lys Ser Met 830 Asn Phe Asp Asn Pro 835 Vai Tyr Leu Lys ACC ACT GAA GAG GAC CTC TCC ATA GAC ATT GGT AGA CAC AGT GCT TCT 2956 Thr 840 Thr Glu Glu Asp Leu 845 Ser Ile Asp Ile Gly 850 Arg His Ser Ala Ser 855 GTT GGA CAC ACG TAC CCA GCA ATA TCA GTT GTA AGC ACA GAT GAT GAT 3004 Vai Gly His Thr Tyr 860 Pro Ala Ile Ser Vai 865 Vai Ser Thr Asp Asp 870 Asp CTA GCT TGACTTCTGT GACAAATGTT GACCTTTGAG GTCTAAACAA ATAATACCCC Leu Ala 3060 CGTCGGAATG GTAACCGAGC CAGCAGCTGA AGTCTCTTTT TCTTCCTCTC GGCTGGAAGA 3120 ACATCAAGAT ACCTTTGCGT GGATCAAGCT TGCTGTACTT GACCGTTTTT ATATTACTTT 3180 TGTAAATATT CTTGTCCACA TTCTACTTCA GCTTTGGATG TGGTTACCGA GTATCTGTAA 3240 CCCTTGAATT TCTAGACAGT ATTGCCACCT CTGGCCAAAT ATGCACTTTC CCTAGAAAGC 3300 65 CATATTCCAG CAGTGAAACT TGTGCTATAG TGTATACCAC CTGTACATAC ATTGTATAGG 3360 CCATCTGTAA ATATCCCAGA GAACAATCAC TATTCTTAAG CACTTTGAAA ATATTTCTAT 3420 GTAAA7TATT GTAAACTTTT TCAATGGTTG GGACAATGGC AATAGGACAA AACGGGTTAC 3480 TAAGATGAAA TTGCCAAAAA AATTTATAAA CTAATTTTGG TACGTATGAA TGATATCTTT 3540 GACCTCAATC CAGGTTTGCA AAGAOTGAGT GTTCAAACTA CTGTACATTT TTTTTCAAGT 3600 GCTAAAAAAT TAAACCAAGC AGCTTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 3656 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 873 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: 66

Met C! y Thr Har Ala Leu Trp Ala Vai Trp Leu Leu Leu Ala Leu Cys 1 5 10 15 Trp A.:'. i G i u Ser Gly Ala Thr Gly Thr Gly Arg Lys Ala Lys 25 30 Cys Cl- ; r 31 r: Phe Gin Cys Thr Asn Gly Arg Cys Ile Thr Leu "i ‘ 40 45 T.pi; • - ► , r. C\\- Asp Gly Asp Glu Asp Cys Vai Asp Gly Ser Asp Glu 55 60 Lys Asr. Ly.s Lys Thr Cys Ala Glu Ser Asp Phe Vai Cys Asn 65 70 75 80 Asn Gly Z . -·, r 1 s Pro Ser Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp Pro Asp b ϋ 90 95 Cys Glu Asr ; v v Asp Glu Ser Pro Glu Gin Cys His Met Arg Thr :.. 105 110 Cys Arg 11 '·. ·. f. 01 u 1 1 e Ser Cys Gly Ala His Ser Thr Gin Cys Ile . i * 120 125 Pro Vai Ser 7rp A r Cys Asp Gly Glu Asn Asp Cys Asp Ser Gly Glu 130 135 140 Asp Glu Glu A.cr. Cys Gi v Asn Ile Thr Cys Ser Pro Asp Glu Phe Thr 145 ; só 155 160 Cys Ser Ser Gly Arg Cys I le Ser Arg Asn Phe Vai Cys Asn Gly Gin 1 63 170 175 Asp Asp Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Leu Asp Cys Ala Pro Pro Thr 180 185 190 Cys Gly Ala His Glu Phe Gin Cys Ser Thr Ser Ser Cys Ile Pro Ile 195 200 205 Ser Trp Vai Cys Asp Asp Asp Ala Asp Cys Ser Asp Gin Ser Asp Glu 210 215 220 Ser Leu Glu Gin Cys Gly Arg Gin Pro Vai Ile His Thr Lys Cys Pro 225 230 235 240 Ala Ser Glu Ile Gin Cys Gly Ser Gly Glu Cys Ile His Lys Lys Trp 245 250 255 Arg Cys Asp Gly Asp Pro Asp Cys Lys Asp Gly Ser Asp Glu Vai Asn 260 265 270 Cys Pro Ser Arg Thr Cys Arg Pro Asp Gin Phe Glu Cys Glu Asp Gly 275 280 285 Ser Cys Ile His Gly Ser Arg Gin Cys Asn Gly Ile Arg Asp Cys Vai 290 295 300 Asp Gly Ser Asp Glu Vai Asn Cys Lys Asn Vai Asn Gin Cys Leu Gly 305 310 315 320 67

Pro Gly Lys Phe Lys Cys Arg Ser Gly Glu Cys Ile Asp Ile Ser Lys 325 330 335

Vai Cys Asn Gin Glu Gin Asp Cys Arg Asp Trp Ser Asp Glu Pro Leu 340 345 350

Lys Glu Cys His Ile Asn Glu Cys Leu Vai Asn Asn Gly Gly Cys Ser 355 360 365

His Ile Cys Lys Asp Leu Vai Ile Gly Tyr Glu Cys Asp Cys Ala Ala 370 375 380

Gly Phe Glu Leu Ile Asp Arg Lys Thr Cys Gly Asp Ile Asp Glu Cys 385 390 395 400

Gin Asn Pro Gly Ile Cys Ser Gin Ile Cys Ile Asn Leu Lys Gly Gly 405 410 415

Tyr Lys Cys Glu Cys Ser Arg Ala Tyr Gin Met Asp Leu Ala Thr Gly 420 425 430

Vai Cys Lys Ala Vai Gly Lys Glu Pro Ser Leu Ile Phe Thr Asn Arg 435 440 445

Arg Asp Ile Arg Lys Ile Gly Leu Glu Arg Lyz Glu Tyr Ile Gin Leu 450 455 460

Vai Glu Gin Leu Arg Asn Thr Vai Ala Leu Asp Ala Asp Ile Ala Ala 465 470 475 480

Gin Lys Leu Phe Trp Ala Asp Leu Ser Gin Lys Ala Ile Phe Ser Ala 485 490 495

Ser Ile Asp Asp Lys Vai Gly Arg His Vai Lys Met Ile Asp Asn Vai 500 505 510

Tyr Asn Pro Ala Ala Ile Ala Vai Asp Trp Vai Tyr Lys Thr Ile Tyr 515 520 525

Trp Thr Asp Ala Ala Ser Lys Thr 530 535

Thr Lys Arg Lys Phe Leu Phe Asn 545 550

Ile Ala Vai Asp Pro Leu Ser Gly 505

Glu Pro Ala Lys Ile Glu Lys Ala 580

Pro Leu Vai Thr Ala Asp Ile Gin 595 600

Ile Ser Vai Ala Thr Leu Asp Gly 540

Ser Asp Leu Arg Glu Pro Ala Ser 555 560

Phe Vai Tyr Trp Ser Asp Trp Gly 570 575

Gly Met Asn Gly Phe Asp Arg Arg 585 590

Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp 605 68

Leu Ile Lys Ser Arg Leu Tyr Trp Leu Asp Ser Lys Leu His Met Leu 610 615 620 Ser Ser Vai Asp Leu Asn Gly Gin Asp Arg Arg Ile Vai Leu Lys Ser 025 630 635 640 Leu OlU Phe Leu Ala His Pro Leu Ala Leu Thr Ile Phe Glu Asp Arg 645 650 655 Vai Tyr Trp Ile Asp Gly Glu Asn Glu Ala Vai Tyr Gly Ala Asn Lys 660 665 670 Phe Thr Gly Ser Glu His Ala Thr Leu Vai Asn Asn Leu Asn Asp Ala 675 680 685 Gin Asp Ile Ile Vai Tyr His Glu Leu Vai Gin Pro Ser Gly Lys Asn 690 695 700 Trp Cys Glu Glu Asp Met Glu Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Leu Cys Leu 705 710 715 720 Pro Ala Pro Gin Ile Asn Asp His Ser Pro Lys Tyr Thr Cys Ser Cys 725 730 735 Pro Ser Gly Tyr Asn Vai Glu Glu Asn Gly Arg Asp Cys Gin Ser Thr 740 745 750 Ala Thr Thr Vai Thr Tyr Ser Glu Thr Lys Asp Thr Asn Thr Thr Glu 755 760 765 Ile Ser Ala Thr Ser Gly Leu Vai Pro Gly Gly Ile Asn Vai Thr Thr 770 775 780

Ala Vai 785

Ala Ile

Ser Glu Vai Ser Vai Pro Pro Lys Gly Thr Ser Ala Ala Trp 790 795 800 Leu Pro Leu Leu Leu Leu Vai Met Ala Ala Vai Gly Gly Tyr 805 810 815

Leu Met Trp Arg 820 Asn Trp Gin His Lys 825 Asn Met Lys ..Ser Met 830 Asn Phe Asp Asn Pro 835 Vai Tyr Leu Lys Thr 840 Thr Glu Glu Asp Leu 845 Ser Ile Asp Ile Gly Arg His Ser Ala Ser vai Gly His Thr Tyr Pro Ala Ile Ser 850 855 860 Vai Vai Ser Thr Asp Asp Asp Leu Ala 865 870 69 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9592 pares de bases (B) TIPO: ácido nucieico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3 70 GAATTCGCTA GCATCATCAA TAATATACCT TATTTTGGAT TGAAGCCAAT ATGATAATGA 60 GGGGGTGGAG TTTGTGACGT GGCGCGGGGC GTGGGAACGG GGCGGGTGAC GTAGTAGTGT 120 GGCGGAAGTG TGATGTTGCA AGTGTGGCGG AACACATGTA AGCGACGGAT GTGGCAAAAG 180 TGACGTTTTT GGTGTGCGCC GGTGTACACA GGAAGTGACA ATTTTCGCGC GGTTTTAGGC 240 GGATGTTGTA CTAAATTTGG gcgtaaccga GTAAGATTTG GCCATTTTCG CGGGAAAACT 300 GAATAAGAGG ,'Ά G 7 G .ΆΛΑ T C TGAATAATTT TGTGTTACTC ATAGCGCGTA ATATTTGTCT 360 AGGGAGATCA \3 W w * O w. λΟ Ό T CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG 420 CCCAACGACC CCCC-GCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA 480 GGGACTTTCC AGTCACGTCA atcggtggag TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA 540 CATCAAGTGT ATCATATGCC aagtacgccc CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC 600 GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC 660 GTATTAGTCA TCGCTA7TAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA 720 TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG 780 TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG 840 CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT 900 AGAGAACCCA CTGCTTAACT GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA 960 AGCTTCTCTG CGGGCCGCGG GTGCGGGTCG TCGCTACCGG CTCTCTCCGT TCTGTGCTCT 1020 CTTCTGCTCT CGGCTCCCCA CCCCCTCTCC CTTCCCTCCT CTCCCCTTGC CTCCCCTCCT 1080 CTGCAGCGCC TGCATTATTT TCTGCCCGCA GCTCGGCTTG CACTGCTGCT GCAGCCCGGG 1140 GAGGTGGCTG GGTGGGTGGG GAGGAGACTG TGCAAGTTGT AGGGGAGGGG GTGCCCTCTT 1200 CTTCCCCGCT CCCTTCCCCA GCCAAGTGGT TCCCCTCCTT CTCCCCCTTT CCCCTCCCAC 1260 CCCCCACCTT CTTCCTCTTT CGGAAGGGCT GGTAACTTGT CGTGCGGAGC GAACGGCGGC 1320 GGCGGCGGCG GCGGCGGCAC CATCCAGGCG GGCACCATGG GCACGTCCGC GCTCTGGGCC 1380 GTCTGGCTGC TGCTCGCGCT GTGCTGGGCG CCCCGGGAGA GCGGCGCCAC CGGAACCGGG 1440 AGAAAAGCCA AATGTGAACC CTCCCAATTC CAGTGCACAA ATGGTCGCTG TATTACGCTG 1500 T T G T G GAAAT GTGATGGGGA TCAAGACTGT GTTGAGGGCA GTGATGAAAA GAACTGTGTA 1560 AAGAAGACGT GTGCTGAATC TGACTTCGTG TGCAACAATG GCCAGTGTGT TCCCAGCCGA 1620 TGGAAGTGTG ATGGAGATCC TGACTGCGAA GATGGTTCAG ATGAAAGCCC AGAACAGTGC 1680 CATATGAGAA CATGCCGCAT ACATGAAATC AGCTGTGGCG CCCATTCTAC TCAGTGTATC 1740 CCAGTGTCCT GGAGATGTGA TGGTGAAAAT GATTGTGACA GTGGAGAAGA TGAAGAAAAC 1800 71 TGTGGCAATA TAACATGTAG TCCCGACGAG TTCACCTGCT CCAGTGGCCG CTGCATCTCC 1860 AGGAACTTTG TATGCAATGG CCAGGATGAC TGCAGCGATG GCAGTGATGA GCTGGACTGT 1920 GCCCCGCCAA CCTGTGGCGC CCATGAGTTC CAGTGCAGCA CCTCCTCCTG CATCCCCATC 1980 AGCTGGGTAT GCGACGAT GA TGCAGACTGC TCCGACCAAT CTGATGAGTC CCTGGAGCAG 2040 TGTGGCCGTC AGCCAGTGAT ACACACCAAG TGTCCAGCCA GCGAAATCCA GTGCGGCTCT 2100 GGCGAGTGCA TCCA.A7 G7GC-CGATGT GATGGGGACC CTGACTGCAA GGATGGCAGT 2160 GATGAGGTCA ACT~?r~77 3 .7GAACTTGC CGACCTGACC AATTTGAATG TGAGGATGGC 2220 AGCTGCATCC atgg ;'.···. · 7AGTGTAAT GGTATCCGAC ACTGTGTCGA TGGTTCCGAT 2280 GAAGTCAACT GCA/V-.-j·.:-r: VAATCAG7GC TTGGGCCCTG GAAAATTCAA GTGCAGAAGT 2340 GGAGAATGCA TAGA. CAAAGTATGT AACCAGGAGC AGGACTGCAG GGACTGGAGT 2400 GATGAGCCCC To/v-..*-. j.*·. - . . ~/λ . ATAAAC GAATGCTTGG TAAATAATGG TGGATGTTCT 2460 CATATCTGCA AAGACC7A37 7A7AGGCTAC GAGTGTGACT GTGCAGCTGG GTTTGAACTG 2520 ATAGATAGGA AAACCTG73C /vJATATTGAT GAATGCCAAA ATCCAGGAAT CTGCAGTCAA 2580 ATTTGTATCA ACTTAAA-VJC CGGT7ACAAG TGTGAATGTA GTCGTGCCTA TCAAATGGAT 2640 CTTGCTACTG GCG i vo i ovAA G3CAGTAGGC AAAGAGCCAA GTCTGATCTT CACTAATCGA 2700 AGAGACATCA GGAAGA77-G GTTAGAGAGG AAAGAATATA TCCAACTAGT TGAACAGCTA 2760 AGAAACACTG TGGCTC73GA. 7GCTGACATT GCTGCCCAGA AACTATTCTG GGCCGATCTA 2820 AGCCAAAAGG CTATCTTCAG TGCCTCAATT GATGACAAGG TTGGTAGACA TGTTAAAATG 2880 ATCGACAATG TCTATAATCC TGCAGCCATT GCTGTTGATT GGGTGTACAA GACCATCTAC 2940 TGGACTGATG CGGCTTCTAA GACTATTTCA GTAGCTACCC TAGATGGAAC CAAGAGGAAG 3000 TTCCTGTTTA ACTCTGAC7T GCGAGAGCCT GCCTCCATAG CTGTGGACCC ACTGTCTGGC 3060 TTTGTTTACT GGTCAGACTG GGGTGAACCA GCTAAAATAG AAAAAGCAGG AATGAATGGA 3120 TTCGATAGAC GTCCACTGGT GACAGCGGAT ATCCAGTGGC CTAACGGAAT TACACTTGAC 3180 CTTATAAAAA GTCGCCTCTA TTGGCTTGAT TCTAAGTTGC ACATGTTATC CAGCGTGGAC 3240 TTGAATGGCC AAGATCGTAG GATAGTACTA AAGTCTCTGG AGTTCCTAGC TCATCCTCTT 3300 GCACTAAGAA TATTTGAGGA TCGTGTCTAC TGGATAGATG GGGAAAATGA AGCAGTCTAT 3360 GGTGCCAATA AATTCACTGG ATCAGAGCAT GCCACTCTAG TCAACAACCT GAATGATGCC 3420 CAAGACATCA TTGTCTATCA TGAACTTGTA CAGCCATCAG GTAAAAATTG GTGTGAAGAA 3480 GACATGGAGA ATGGAGGATG TGAATACCTA TGCCTGCCAG CACCACAGAT TAATGATCAC 3540 TCTCCAAAAT ATACCTGTTC CTCTCCCAGT GGGTACAATG TAGAGGAAAA TGGCCGAGAC 3600 72 TGTCAAAGTA CTGCAACTAC TGTGACTTAG AGACAAAAGA TACGAACACA ACAGAAATTT 3660 CAGCAACTAG TGGACTAGTT CCTGGAGGGA TCAATGTGAC CACAGCAGTA TCAGAGGTCA 3720 GTGTTCCCCC AAAAGGGACT TCTGCCGCAT GGGCCATTCT TCCTCTCTTG CTCTTACTGA 3780 TGGCAGCAGT AGGTGGCTAC TTGATGTGGC GGAATTGGCA ACACAAGAAC ATGAAAAGCA 3840 TGAACTTTGA GAATCCTGTG TACTTGAAAA CCACTGAAGA GGACCTCTCC ATAGACATTG 3900 GTAGACACAG TGCTTCTGTT GGACACACGT ACCCAGCAAT ATCAGTTGTA AGCACAGATG 3960 ATGATCTAGC TTGACTTCTG TGACAAATGT TGACCTTTGA GGTCTAAACA AATAATACCC 4020 CCGTCGGAAT GGTAACCGAG CCAGCAGCTG AAGTCTCTTT TTCTTCCTCT CGGCTGGAAG 4080 AACATCAAGA TACCTTTGCG TGGATCAAGC TTGGTACCGA GCTCGGATCC ACTAGTAACG 4140 GCCGCCAGTG TGCTGGAATT CTGCAGATAT CCATCACACT GGCGGCCGCG GGGATCCAGA 4200 CATGATAAGA TACATTGATG AGTTTGGACA AACCACAACT AGAATGCAGT GAAAAAAATG 4260 CTTTATTTGT GAAATTTGTG ATGCTATTGC TTTATTTGTA ACCATTATAA GCTGCAATAA 4320 ACAAGTTAAC AACAACAATT GCATTCATTT TATGTTTCAG GTTCAGGGGG AGGTGTGGGA 4380 GGTTTTTTCG GATCCTCTAG AGTCGACCTG CAGGCTGATC TGGAAGGTGC TGAGGTACGA 4440 TGAGACCCGC ACCAGGTGCA GACCCTGCGA GTGTGGCGGT AAACATATTA GGAACCAGCC 4500 TGTGATGCTG GATGTGACCG AGGAGCTGAG GCCCGATCAC TTGGTGCTGG CCTGCACCCG 4560 CGCTGAGTTT GGCTCTAGCG ATGAAGATAC AGATTGAGGT ACTGAAATGT GTGGGCGTGG 4620 CTTAAGGGTG GGAAAGAATA TATAAGGTGG GGGTCTTATG TAGTTTTGTA TCTGTTTTGC 4680 AGCAGCCGCC GCCGCCATGA GCACCAACTC GTTTGATGGA AGCATTGTGA GCTCATATTT 4740 GACAACGCGC ATGCCCCCAT GGGCCGGGGT GCGTCAGAAT GTGATGGGCT CCAGCATTGA 4800 TGGTCGCCCC GTCCTGCCCG CAAACTCTAC TACCTTGACC TACGAGACCG TGTCTGGAAC 4860 GCCGTTGGAG ACTGCAGCCT CCGCCGCCGC TTCAGCCGCT GCAGCCACCG CCCGCGGGAT 4920 TGTGACTGAC TTTGCTTTCC TGAGCCCGCT TGCAAGCAGT GCAGCTTCCC GTTCATCCGC 4980 CCGCGATGAC AAGTTGACGG CTCTTTTGGC ACAATTGGAT TCTTTGACCC GGGAACTTAA 5040 TGTCGTTTCT CAGCAGCTGT TGGATCTGCG CCAGCAGGTT TCTGCCCTGA AGGCTTCCTC 5100 CCCTCCCAAT GCGGTTTAAA ACATAAATAA AAAACCAGAC TCTGTTTGGA TTTGGATCAA 5160 GCAAGTGTCT TGCTGTCTTT ATTTAGGGGT TTTGCGCGCG CGGTAGGCCC GGGACCAGCG 5220 GTCTCGGTCG TTGAGGGTCC TGTGTATTTT TTCCAGGACG TGGTAAAGGT GACTCTGGAT 5280 GTTCAGATAC ATGGGCATAA GCCCGTCTCT GGGGTGGAGG TAGCACCACT GCAGAGCTTC 5340 ATGCTGCGGG GTGGTGTTGT AGATGATCCA CTCCTAGCAG GAGCGCTGGG GGTGGTGCCT 5400 73 AAAAATGTCT TTCAGTAGCA AGCTGATTGC CAGGGGCAGG CCCTTGGTGT AAGTGTTTAC 5460 AAAGCo1, , TA AGCTGGGATG GGTGCATACG TGGGGATATG AGATGCATCT TGGACTGTAT 5520 TTTT/V;:;g 3C7ATGTTCC CAGCCATATC CCTCCGGGGA TTCATGTTGT GCAGAACCAC 5580 CAGC/iΤΓ· TA iCCGGTGC ACTTGGGAAA TTTGTCATGT AGCTTAGAAG GAAATGCGTG 5640 GAAGAAGTTG GAGAGGCCCT TGTGACCTCC AAGATTTTCC ATGCATTCGT CCATAATGAT 5700 GGCAAT' ~ TA, "TiGGCGG CGGCCTGGGC GAAGATATTT CTGGGATCAC TAACGTCATA 5760 gttgtgtt'.' ·: AJCATGAGAT CGTCATAGGC CATTTTTACA AAGCGCGGGC GGAGGGTGCC 5820 AGACT ~CG ~ 7 A/I .*\AT GGTTC CATCCGGCCC AGGGGCGTAG TTACCCTCAC AGATTTGCAT 5880 TTCCCACGVC TTGAGTTCAG ATGGGGGGAT CATGTCTACC TGCGGGGCGA TGAAGAAAAC 5940 GGTTTCCGG. . t\\ -s TCAGCTGGGA AGAAAGCACG TTCCTGAGCA GCTGCGACTT 6000 ACCGCAG CC - CTGCGCGCCT AAATCACACC TATTACCGGG TGCAACTGGT AGTTAAGAGA 6060 GCTGCAGCTG C C TΓCATCTC TGAGCAGGGG GGCCACTTCG TTAAGCATGT CCCTGACTCG 6120 CATGTTT'! CG T TCA.l. C Av* w"*.t CCGCCAGAAG GCGCTCGCCG CCCAGCGATA GCAGTTCTTG 6180 CAAGGAAGCA CvAGTTTTTCA ACGGTTTGAG ACCGTCCGCC GTAGGCATGC TTTTGAGCGT 6240 TTGACCAAGC AGTTTCAGGC GGTCCCACAG CTCGGTCACC TGCTCTACGG CATCTCGATC 6300 CAGCATATCT CCTCGTTTCG CGGGTTGCGG CGGCTTTCGC TGTACGGCAG TAGTCGGTGC 6360 TCGTCCAGAC GGGCCAGGGT CATGTCTTTC CACGGGCGCA GGGTCCTCGT CAGCGTAGTC 6420 TGGGTCACGG TGAAGGGGTG CGCTCCGGGC TGCGCGCTGG CCAGGGTGCG CTTGAGGCTG 6480 GTCCTGCTGG TGCTGAAGCG CTGCCGGTCT TCGCCCTGCG CGTCGGCCAG GTAGCATTTG 654 0 ACCATGGTGT CATAGTCCAG CCCCTCCGCG GCGTGGCCCT TGGCGCGCAG CTTGCCCTTG 6600 GAGGAGGCGC CGCACGAGGG GCAGTGCAGA CTTTTGAGGG CGTAGAGCTT GGGCGCGAGA 6660 AATACCGATT CCGGGGAGTA GGCATCCGCG CCGCAGGCCC CGCAGACGGT CTCGCATTCC 6720 ACGAGCCAGG TGAGCTCTGG CCGTTCGGGG TCAAAAACCA GGTTTCCCCC ATGCTTTTTG 6780 ATGCGTTTCT TACCTCTGGT TTCCATGAGC CGGTGTCCAC GCTCGGTGAC GAAAAGGCTG 6840 TCCGTGTCCC CGTATACAGA CTTGAGAGGC CTGTCCTCGA CCGATGCCCT TGAGAGCCTT 6900 CAACCCAGTC AGCTCCTTCC GGTGGGCGCG GGGCATGACT ATCGTCGCCG CACTTATGAC 6960 TGTCTTCTTT ATCATGCAAC TCGTAGGACA GGTGCCGGCA GCGCTCTGGG TCATTTTCGG 7020 CGAGGACCGC TTTCGCTGGA GCGCGACGAT GATCGGCCTG TCGCTTGCGG TATTCGGAAT 7080 CTTGCACGCC CTCGCTCAAG CCTTCGTCAC TGGTCCCGCC ACCAAACGTT TCGGCGAGAA 7140 GCAGGCCATT ATCGCCGGCA TGGCGGCCGA CGCGCTGGGC TACGTCTTGC TGGCGTTCGC 7200 GACGCGAGGC TGGATGGCCT TCCCCATTAT GATTCTTCTC GCTTCCGGCG GCATCGGGAT 7260 74

t

GCCCGCGTTG CAGGCCATGC TGTCCAGGCA GGTAGATGAC GACCATCAGG

AGGATCGCTC

GATTTATGCC

ATACCTTGTC

AATGGAAGCC

TTCTTGCGGA

GCCATCTCCA

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GCGACCTGAG

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GCGCAACGTT

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GCGGCTCTTA

GCCTCGGCGA

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GCAGCCGCAC

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GTGTAGGTCG

TGCGCCTTAT

CTGGCAGCAG

TTCTTGAAGT

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GGACCGCTGA

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AAGCAGCAGA

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GCCACGGGTG

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CAAAACGTCT

TCTGGAAACG

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TTACGCGCAG

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TATCCGCCTC

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TTGGTATGGC

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CCGCAGTGTT

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TAGTAAATTT GGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla 76 (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5 AGTAAGATTT GGCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6

AGTGAAATCT GAAT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7 77

GAATAATTT GTGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8

CGTAATATTT GTCT

Lisboa, 30 de Abril de 2001

AGÇHTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

78

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vector virai recombinante compreendendo um gene de receptcr de VLDL humano operacionalmente ligado a sequências de regulação direcclonando a sua expressão num hepatócito.
2. 2. Vector de acordo com a reivindicação 1 em que o referido vector é cr. vocrcr adenoviral.
3. 3. Vector de acordo corr. a reivindicação 2 compreendendo ainda uma delecçâc em todo ou numa porção do gene adenoviral El.
4. 4. Vector de acordo com a reivindicação 3 compreendendo ainda uma delecção em todo ou numa porção do gene adenoviral E3.
5. 5. Vector de acordo com a reivindicação 1, em que o referido vector é um vector virai adeno-associado.
6. 6. Método para a distribuição in vitro de um gene de um receptor de VLDL num hepatócito compreendendo o passo de introduzir no referido hepatócito uma quantidade eficaz de um vector virai recombinante compreendendo um gene de receptor de VLDL humano operacionalmente ligado a sequências de regulação que direccionam a sua expressão no referido hepatócito.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o referido vector é um vector adenoviral.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o referido vector é um vector virai adeno-associado. 1
9. 9. Hepatócito de mamífero que expressa um receptor de VLDL humano nele introduzido por transducção do referido hepatócito por um vector virai recombinante compreendendo um gene do receptor de VLDL humano operacionalmente ligado a sequências de regulação que direccionam a sua expressão no referido hepatócito.
10. 10. Hepatócito de mamífero de acordo com a reivindicação 9, em que o referido vector é um vector adenoviral.
11. 11. Hepatócito de mamífero de acordo com a reivindicação 9, em que o referido vector é um vector virai adeno-associado.
12. 12. Composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e um vector virai, compreendendo o referido vector um gene de receptor de VLDL humano operacionalmente ligado a sequências de regulação que direccionam a sua expressão em hepatócitos.
13. 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12 em que o referido vector é um vector adenoviral.
14. 14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, em que o referido vector adenoviral compreende uma delecção em todo ou numa porção do gene adenoviral El.
15. 15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, em que o referido vector adenoviral compreende uma delecção em todo ou numa porção do gene adenoviral E3.
16. 16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12 em que o referido vector é um vector virai adeno-associado. 2
17. 17. Utilização de um vector virai recombinante de acordo quaisquer das reivindicações 1-5 no fabrico de r.t* ocuir.ento. com um

    Li í t

    » de Abril de 2001 . .V.;i.dAíJK INDUSTRIAL

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